JPH0723321B2 - 因子ｖｉｉｉ凝固活性蛋白質の調製 - Google Patents

因子ｖｉｉｉ凝固活性蛋白質の調製

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JPH0723321B2 JP57217928A JP21792882A JPH0723321B2 JP H0723321 B2 JPH0723321 B2 JP H0723321B2 JP 57217928 A JP57217928 A JP 57217928A JP 21792882 A JP21792882 A JP 21792882A JP H0723321 B2 JPH0723321 B2 JP H0723321B2
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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は一般に、因子VIII凝固活性蛋白質の分離と精
製に関している。さらにとくに、高純度因子VIII凝固活
性蛋白質が、血漿または濃縮液からの２段階のクロマト
グラフ吸着および濃縮法によって、フォンウィルブラン
ド因子から分離される。
血漿からの抗血友病因子の分離については、文献に発表
されている。抗血友病因子、すなわち因子VIII凝固活性
蛋白質（因子VIII）の精密な構造は、一部には、十分量
の純物質がえられず、より深い研究が不可能なために、
いまだに確認されていない。純物質の人手に制約があ
り、しかもこの因子が稀薄状態で存在するために、この
因子の治療上の利用が妨げられていた。
因子VIII凝固活性蛋白質は、血友病血漿中の凝固欠陥を
正するよう機能する。これは、血漿中でフォンウィルブ
ランド因子蛋白質と複合して循環する。フォンウィルブ
ランド因子蛋白質は、フォンウィルブランド病における
血小板機能欠陥を変化させうる。因子VIIIフォンウィル
ブランド因子複合物の凝固活性を有する部分は因子VIII
凝固活性蛋白質、因子VIII−凝固活性、または単にVII
I:Cと呼ばれる（“VIII:C"の名称は、以後、上記の凝固
活性のある因子VIII分子の部分を同定するために用いら
れる）。
因子VIIIフォンウィルブランド因子複合物のフォンウィ
ルブランド病の血小板機能欠陥を正す能力を有する他の
部分は、フォンウィルブランド因子、因子VIII関連抗
原、VIIIR:Ag、VIII:RP因子と呼ばれる（表示“VIII:R
P"は、以後因子VIII分子の血小板補正機能を同定するた
めに用いられる）。これまでに実証されているわけでは
ないが、VIII:Cが、非共有複合物としてVIII:RPと結合
している小分子の性質と挙動を示すという結論を裏付け
る徴候がある。またVIII:CおよびVIII:RPの双方が結合
している性質は適当な条件のもとで開裂して２つの断片
を生じうる単一分子でもありうるという主張についての
根拠もある。
因子VIII/フォンウィルブランド因子複合物、VIII:C、
およびVIII:RPの構造を同定する必要性およびVIII:Cに
帰せられる凝固活性の重要な薬剤価値に鑑み、因子VIII
を精製する。およびVIII:CとVIII:RPを分離し、かつ濃
縮する多くの試みが行なわれた。使用する技法は、一般
に免疫吸着法またはイオン交換クロマトグラフィのいず
れかに基いていた。このために従来使用されている技法
は、蛋白質を荷電イオン物質から損傷のない状態で着脱
させたり、または蛋白質を適切量で回収することが困難
なために、成功には制約があった。
免疫吸着クロマトグラフィを利用するVIII:CをVIII:RP
から分離する上記方法の１つが、E.G.D.Tuddenham等に
よりJOURNAL OF LABORATORY CLINICAL MEDICINE,93
巻,40頁（1979年）に“免疫吸着クロマトグラフィによ
って調製した因子VIII凝固活性の特性”の題名で発表さ
れている。報告された方法は、VIII:RPに対する多クロ
ーン抗血清（抗−VIII:RP）が結合されているアガロー
ス・ビーズを充填したクロマトグラフィ・カラムを用い
て、VIII:CをほとんどすべてのVIII:RP、およびほとん
どのその他の血漿蛋白質から分離する１段法である。因
子VIII/フォンウィルブランド因子を含む血漿が、VIII:
CとVIII:RPの双方を吸着するカラムにかけられる。その
他の不要な血漿蛋白質は、緩衝塩水溶液で洗浄すること
によってカラムから除去され、そして所望のVIII:Cが、
その後のカルシウム・イオン勾配液による溶離によって
えられる。この方法は、従来の既知の方法と比較して、
VIII:Cの純度と収車の双方の改善であると述べられてい
るが、生じた生成物はVIII:RPおよびその他の血漿蛋白
質をも含むとも延べられている。このような不純物質
は、アガロース・ビーズに結合された多クローン抗血清
を使用することに原因するものと考えられる。抗血清を
構成する免疫のグロブリンの大多数は、VIII:RPに対し
て特異でないから、VIII:RPに特異な抗体がアガロース
に結合されうる有効座数は、アガロース上の有限数の結
合座に対する抗血清の間の競合により、比較的少ない。
アミノヘキシル置換アガロースを用いるクロマトグラフ
ィ技法によって、VIII:RPとリストセチン共同因子からV
III:Cを分離するもう一つの方法がD.E.G.Austenの、BRI
TISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY,43巻,669頁（1979
年）“因子VIIIのアミノヘキシル・セファロース上での
クロマトグラフィによる分離”により報告されている。
記述の方法は、人間と豚の双方の因子VIII/フォンウィ
ルブランド因子の成分部分についての改善法であると延
べられている。しかしながら、この方法もまた、得られ
る生成物中に不純物質が存在するという欠点を示す。Tu
ddenhamらおよびAustenによる両方法において、不純物
質を含む生成物が、通常希望されるよりさらに稀薄な状
態で、生成する。
したがって、血漿または濃縮液を用いて、VIII:RPからV
III:Cを分離し、精製するための改善方法の必要性があ
ることは明らかである。したがって、この発明の目的
は、このような必要性を満すことにある。
この発明は、因子VIII/フォンウィルブラウンド因子複
合物の成分分子、即ちVIII:CおよびVIII:RPの分離およ
び凝固活性蛋白質VIII:Cの精製と濃縮に関している。こ
の方法は、２段法を用いて高純度のVIII:Cを製造する目
的を達成する。
第１段階は、血漿または市販濃縮液からの因子VIIIの免
疫吸着法である。使用する吸着剤は、例えばアガロース
・ビーズのような適当な基質に結合されたVIII:RPに特
異な単クローン抗体からなっている。VIII:C/VIII:RPが
最初に吸着されてから、基質粒子を緩衝溶液により十分
に洗浄して、非吸着蛋白質を除去する。つぎに吸着物質
を、吸着VIII:Cを溶離するために、カルシウム・イオン
を含む溶液で処理する。VIII:RP部分は、抗VIII:RPが結
合した物質に吸着されたままである。この時点で、最初
に吸着されたVIII:Cの約40〜60％が、高純度状態で回収
される。ただし、回収された凝固活性蛋白質は、きわめ
て純度は高いが、すなわち、ほとんど汚染物質を含んで
いないが、稀薄すぎるため、有意な治療的価値を有して
いない。
この方法の第２段階は、アフィニィティ・クロマトグラ
フィとして特性化される技法を用いて、回収した高純度
VIII:Cを主として濃縮することに向けられている。
この方法の第１段階からえられた約10〜20国際単位（以
下“単位”と呼称する）の効力をもつVIII:C溶液を、ア
ミノヘキシル置換アガロースを含むカラムで処理する。
つぎにカラムを緩衝溶液で洗浄し、そしてVIII:Cをカル
シウム・イオン含有溶液で溶離し、1000単位/mlを超
え、かつ血漿から160,000倍以上純化されているVIII:C
濃縮液をうる。かくて、この方法によって、予期しない
高純度の凝固活性蛋白質が、高度に濃縮され、かつ治療
上有用な状態でえられた。これまでに使用された方法で
は、いくつかの理由から、上記の顕著な結果を達成でき
ない。前述したTuddenhamらの方法は、この発明に使用
されるVIII:RPに特異で、かつ高度に選択的な単クロー
ン抗体の代りに、結合多クローン後血清を使用してい
る。その結果、VIII:RPに特異な抗体が、多少しか、一
定重量のアガロースと結合しない。この発明による方法
では、単クローン抗体がもっばら比較的不活性な基質と
結合される。Tuddenhamらの方法を使用するときは、免
疫グロブリン−アガロース・ビーズml当りVIII:RP2.6〜
6.4単位（カラムに適用した量の53.1〜82.9％に相当）
のみが除去される。これは、この発明の単クローン抗体
免疫吸着剤を使用する場合に回収されるビーズml当り1
2.5−18.8単位（すなわち、カラムに適用したVIII:RPの
90〜100％）以上と比較される。したがって、ビーズml
当りにより多くのVIII:C/VIII:RP（因子VIII/フォンウ
ィルブランド因子）を吸着する能力が、それが引続き免
疫吸着剤から溶離された時、より高濃度のVIII:Cを生ず
る。かくて、Tuddenhamらの方法による溶離液mlあたり
0.5〜1.25単位と対比して、この発明では、溶離液ml当
りVIII:C10〜20単位がえられる。
この方法によると、VIII:RPに対して高親和力を示す単
クローン抗体の選択もできる。一方、多クローン抗体を
使用すると親和力に変化をもたらす。VIII:RPの結合抗
体の親和性と、VIII:RPの溶離の間には間接的な関係が
あることを認めなければならない。かくて、VIII:RPに
対する抗体の親和性が高くなるほど、溶離液中にVIII:C
とともに存在するVIII:RPの量が減少する。この発明に
よって、特異単クローン抗体を無制限にうることもで
き、したがってまた種々のバッチの間の変動を排除でき
る。
前述したように、Austenは、VIII:CをVIII:RPから分離
するためにアミノヘキシル・アガロースを使用したこと
を報告したが、分離および精製段階に続いて、VIII:Cを
濃縮するために、このような物質が使用されたことはな
かった。これまでに、クロマトグラフィにアミノヘキシ
ル・アガロースを用いて達成された最高のVIII:C濃度
は、人間の蛋白質について溶離液ml当りに0.53単位、豚
のVIII:Cについて溶離液ml当り2.38単位であった。この
発明によれば、これより数桁大きな濃度をうることがで
きる。おそらく、さらに重要と考えられるのは、この発
明によって、これまでに報告されたより高い純度の人間
のVIII:Cがえられるという事実である（血漿の164,000
倍対17,000倍）。以後に、さらに詳細に述べるこの方法
によって、市販の濃縮液を使用すると、2,300単位/mgの
比活性を有するVIII:Cがえられる。これは血漿からの純
度の164,000倍に相当する。VIII:Cと、VIII:RPの比は血
漿中の比と比比較すると105以上である。
以下の記述によって、VIII:Cと分離、精製および濃縮
が、従来知られなかった程度の純度と濃縮度に達成され
るために、この発明の実施態様が実施され、かつ用いら
れる方法の詳細が示される。この記述は、この発明を例
示するものであるが、とくにこの発明を限定するものと
解されるべきではなく、また、当業者の知識範囲内にあ
ると考えられる変化は、この発明の範囲内に入るとみな
すものとする。
A.VIII:RPに対する単クローン抗体の調製 後に分離基質に結合されるVIII:RPに対する単クローン
抗体は、因子VIII/フォンウィルブランド因子（VIII:C/
VIII:RP複合物）の高度に精製された調製物から出発す
る段階的な方法に従って調製できる。免疫のための精製
は、血漿源からえられた物質により行なう。またポリビ
ニル板のコーテングのためのあまり純度の高くない物質
は、FACTORATE（ニューヨーク州Tuckahoe市Armour Phar
maceutical Co社製品の商標名）またはHemophil（カリ
フォルニア州Costa Mesa市Hyland Laboratories社製品
の商標名）のような市販されている抽出物からより高い
濃度で得られる。精製は、IMMUNO−ASSAYS:CLINICAL L
ABORA−TORY TECHNIQUES FOR THE 1980′s,R,M.Nak
amura.等編、Alan R.Liss,Ine.,New Yoyk、339〜349頁
（1980年）に発表されたZimmermanおよびRobertsによる
“因子VIII関連抗原”に記述されているような、寒冷沈
降物の標準アガロース−ゲル濾過によって行なわれる。
マウスに、以下の手順にしたがって血漿から得られた高
度に精製した因子VIII/フォンウィルブランド因子を注
射した。ゼロ日に、マウスに、0.05Mのトリス,0.15Mの
塩化ナトリウム、0.02％のアジ化ナトリウム、1mMのフ
ェニル・メチル弗化スルフォニル、および10単位/mlの
トレイシロール（traysylol）を含む0.1mlの緩衝溶液中
にPH7.3で蛋白質10mgを溶解（または懸濁）させ、等容
量の完全フロインドアジュバントと振盪して調製された
組成物を、腹腔内注射した。14日目に、完全フロインド
アジュバントが不完全フロインドアジュバントに替った
以外は上記と同一である物質をマウスに再び注射した。
21日目に、14日目の注射を繰返した。38日目に、マウス
に精製VIII:C/VIII:RPのみを注射した。42日目に、マウ
スの脾臓を取り出しそしてJOURNAL OF BIOLOGI−CAL
CHEMISTRY,225巻,4980〜4983頁（1980年）記載のJ.P.
Brownらによる“単クローン抗体による免疫析出法によ
り識別した正常および悪性人間細胞の蛋白質抗原”で発
表された型の標準法にしたがって融合した。標準法は、
50％ポリエチレン・グリコール1000が35％ポリエチレン
・ゲリコールに替っている程度にしか変えていない。VI
II:RPに対する抗体を産生するクローンの放射免疫測定
は次の手順により行なう。“V"字型底を備えるフレキシ
ブル型のポリビニール板を、上記の手順にしたがって市
販抽出液から精製された蛋白質濃度0.125mg/mlの因子VI
II0.1mlでコーティングする。ポリビニール板を、アル
ブミンでブロックし、緩衝液で洗浄し、そして被験クロ
ーンからの培養液で培養する。つぎにポリビニール板を
洗浄して、ラビット抗マウス1gG抗血清と反応させ、も
う一度洗浄し、そして125Iで標識した山羊抗ラビット1g
G抗血清をウェルに添加して、培養する。ポリビニール
板を再び洗浄して、つぎに乾燥し、そしてウェルを切除
して計数する。陽性のクローンを決定してから、これら
を少なくとも２回サブクローニングし、つぎにVIII:RP
に対する抗体を産生する安定なクローンを、細胞注射の
少なくとも４日前にプリスタン0.5mlにより腹腔内に前
処理してあるBalb/Cマウスの腹腔に注射する。ハイブリ
ドーマ細胞をマウス当り約５×106細胞の濃度で、牛胎
児血清のない0.5mlのDelbecco改良Eagle培地を介して注
入する。マウスを、鼓脹した時に穿刺し、そして腹水液
を約10単位/mlのヘパリン中に集める。複数のマウスか
らの腹水液をプールして、その後の単クローンIgGの分
離用の適当量を供給する。ヘパリン化した腹水液をただ
ちに使用しないときは、この腹水液は、−70℃で保存
し、そして使用直前に解凍しうる。腹水液からのIgGの
最終収量は100ml腹水液当りIgG約1gである。
VIII:Cを精製するために使用される単クローンIgGの特
異性は次のようにして判断される。即ち、まず上記の方
法でIgGを分離基質媒体と結合させ、次に（１）結合し
たIgGが血漿からVIII:RPおよびVIII:Cの両方を除去する
こと、および（２）VIII:Cがその後カルシウム・イオン
含有溶液で溶離され、一方VIII:PRは固体状態の基質と
結合している単クローンIgGと複合物を形成したまゝで
あることを明示することにより判断される。
続いて免疫吸着剤を調製するために使用される単クロー
ンIgGは、ヘパリン化してプールした腹水液から捕集直
後に分離でき、又は保存溶液の凍結部分を解凍しうる。
新鮮物質または凍結物質のいずれを使用するかに関わり
なく、溶液を４℃にたもち、その組成を下記に示す等容
量のリン酸塩緩衝塩水溶液（PBS）によって処理する。
希釈腹水は、等容量の飽和硫酸アンモニウム（SAS）を
４℃で攪拌すながら滴加することにより沈殿させる。SA
Sは、過剰の硫酸アンモニウムを水中で沸騰させ、４℃
に冷却し、不溶解結晶を濾別し、そして水酸化アンモニ
ウムによって、PHを7.0に調節して、調製する。沈殿物
とその上澄み液を少なくとも２時間攪拌して、４℃で遠
心分離する。遠心分離操作は好ましくは14,000rpmで、6
0分間行なう（30,000×ｇ）。腹水の上澄み液は、もう
２回SASで沈殿させ、そして沈殿物と上澄み液の混合物
を攪拌して、第１サイクルと同様な方法で遠心分離す
る。第３沈殿からえられるペレットは、希釈腹水液と等
容量のPBS中に再懸濁させ、そしてつぎにPBSに対して徹
底的に透析する。透析バッグ内に現われる凝固物質は、
20℃で遠心分離により除去する。透析したIgGは、これ
を室温で、水酸化アルミニウムの５％水溶液と攪拌し、
吸着後20℃で遠心分離することによって吸着させる。吸
着処理は、第１回の処理後の各処理ごとに、2.5％水酸
化アルミニウム溶液を用いて少なくともあと３回繰返
す。吸着されたIgGは、４℃にして、１回、上記のよう
にSASで再沈殿する。沈殿ペレットは、使用まで−20℃
で保存するとよい。
B. 免疫吸着剤の調製 免疫吸着剤は、結合のための単クローンIgGを調製し、
結合のための固体基質を調製し、そして前者が後者と結
合するよう両成分を反応させることによって調製され
る。
（ｉ） 結合用IgGの調製 新たに沈殿したIgGを使用することができ、または、予
め凍結した沈殿物を解凍して使用してもよい。沈殿物は
つぎにPBSに対して透析し、そしてなおPBS中にある間
に、容積とIgG濃度（A280/1.4＝mg/mlIgG）を測定す
る。IgGは、つぎに、IgG溶液50ml当り、10〜30マイクロ
リットル好ましくは20マイクロリットルの量の弗化燐酸
ジイソプロピルで処理する。生ずる溶液を室温で30分
間、フード内で攪拌し、そして処理したIgGを、使用直
前に、結合用緩衝液に対して一晩中透析する。最適と認
められる結合用緩衝液は、好ましくは水酸化ナトリウム
によりPH9に調節した0.25M炭酸水素ナトリウム溶液であ
る。
（ii） 結合用固体基質の調製 単クローン抗体は、蛋白質、とくに因子VIII自体に対し
て高度の親和性をもたないいかなる物質に結合させても
よいが、ガラス・ビーズ、アガロースおよびその誘導体
のような物質が好ましい。もっとも好ましい物質は、Se
pharose CL2B（ニュージャージー州Piseatway市Pharma
cia Fine Chemicals社製品の商標名）として知られる
ゲルとして市販されている架橋アガロースである。
好ましい免疫吸着樹脂の調製方法は、一般に、J.Porath
ら、JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY,86巻,53〜56頁（197
3年）の方法のような、文献に発表されたと同一の方法
である。最適と認められる方法は、つぎの通りである。
すなわち、約２リットル容量のSepharose CL2Bを、酸
で洗浄された２リットル容量の焼結ガラス・フィルタを
漏斗中に置く。樹脂を水で洗浄し、そして濾過して湿潤
ケーキにする。洗浄した樹脂を、磁気攪拌棒を備える大
きな（約４リットル）ガラス・ビーカ内に置く。つぎに
5Mの二塩基性燐酸カリ溶液１部と5Mの三塩基性燐酸カリ
溶液２部を混合して調製した冷燐酸カリ緩衝溶液750ml
を樹脂に添加する。冷却された水を加えて、最終容量を
３リットルとする。つぎに混合物を４℃に冷却し、磁気
攪拌板上に置いた氷−水浴中で４〜10℃に保持する。フ
ード内で臭化シアンを、磁気攪拌棒を含むストッパ付き
ガラスびん内の水300mlに添加する。溶液を生ずるま
で、混合物を迅速に攪拌する。つぎに臭化シラン溶液
を、２分間にわたって攪拌しながら、冷Sepharose混合
液に添加する。攪拌をさらに８分間続けて、つぎに４リ
ットル容量の真空フラスコに指示される冷した２リット
ル容量の焼結ガラス・フィルタに移す。臭化シアンで処
理した樹脂を、つぎに約20リットルの冷水によるか、ま
たは濾液のPHが中性となるまで洗浄する。洗浄した樹脂
をつぎに速やかに、冷結合用緩衝液で平衡化させて、つ
ぎに大型の磁気攪拌棒を備える４リットル容量のプラス
チック・ビーカに移す。
（iii） 単クローン抗体の固体基質への結合 上記にしたがって調製した固体基質樹脂は、結合用緩衝
液で平衡化されると、使用するばかりの状態になってい
るから、その後に保存してはならない。したがって、樹
脂混合物を、先に一晩中結合用緩衝液に対して透析され
たIgGと結合させる。結合させた樹脂/IgGの懸濁混合液
を、約24時間、４℃で攪拌する。上澄み結合液の希釈し
ない試料のA280を、標準として牛の血清アルブミン（BS
A）、または標準としてBSAを使用するバイオレイド（Bi
o−Rad）プロテイン アセイ（ブラッドフォード 試
薬）を用いて測定しうる。次に結合された配位子の百分
率が計算できる。上記の手順にしたがうと、この百分率
は通常約95％である。抗体に結合されない樹脂の残留活
性座は、焼結ガラス・フィルタ漏斗上で、0.1Mグリシン
を含有する冷結合用緩衝液を用いて樹脂を洗浄すること
によってブロックできる。つぎに樹脂をこの溶液中に再
懸濁させて、それぞれの結合用緩衝液中で樹脂と抗体が
結合されたときの容積に等しい最終容積にする。懸濁液
を４℃で一晩中、ゆっくりと攪拌する。つぎに樹脂を、
以下に示す組成のVIII:C緩衝液で十分に洗浄する。つぎ
に結合され、ブロックされた樹脂を、好ましくは塩化カ
ルシウムとしての0.5Mカルシウム・イオンをさらに含む
VIII:C緩衝液で予備溶離する。樹脂を再びVIII:C緩衝液
だけで洗浄し、使用するまで、４℃で、または室温で連
続的にポンプ送りされるカラム中に保存する。IgGのSEP
HAROSEに対する結合密度は、SEPHAROSE リットル当り
２〜5g、好ましくは３〜4gとする。
C. VIII:Cの分離と精製 人間および動物血漿、および市販の因子VIIIの濃縮液の
ような因子VIIIの試料調製物を、この発明で用いること
ができ、かつこの方法は、特定型の物質に限られるもの
ではない。好ましい物質、および良好な結果を示した物
質は、豚および人間の血漿、および市販されている人間
の因子VIIIの濃縮液例えば、Armour Pharmaceutical社
から発売されているFACTORATEである。以下の記述は、
豚の血漿、または例えばFACTORATEのような市販の人間
の濃縮液を用いての詳細を示すものである。
すなわち、FACTORATEを、VIII:C緩衝液25ml部を、ボト
ル当り400−500VIII:C単位を含む20ボルト（25ml/ボト
ル）のそれぞれの内容物に加えることによって戻す。混
合液を、VIII:C緩衝液によって最終容量１リットルに調
節する。0.5mlで区分された試料を分析のため除くこと
ができ、そして残余の物質を、免疫吸着カラムに、約60
ml/時の割合で一晩中加えることができる。
新鮮な状態で引出さない場合、豚の血漿は、従来の方法
でくえん酸処理して、凍結保存する。使用する場合に
は、これを35〜40℃の間、好ましくは37℃の温度で解凍
して、直接60ml/時の割合でカラムに加える。
この発明の記述は、クロマトグラフィ・カラム中の免疫
吸着剤が結合された粒子の使用に言及し、かつ主として
これらの使用を指向しているが、抗体結合樹脂粒子を、
適当な容器に入れ、そして上記にしたがって、また下記
にさらに詳述するように、戻した濃縮液、または血漿を
加えてから、バッチ方式でVIII:Cの分離を行なうこと
は、この発明の範囲内であることに注目すべきである。
クロマトグラフィ法により、この方法を実施する場合に
は、以下の実施態様が好ましい。
すなわち、樹脂を、Amicon86001（マサチュセッツ州レ
キシントン市Amicon社製品商標名）のような、蠕動ポン
プを備え、かつ流れヘッドの高いカラム内に入れる。因
子VIII源として濃縮液を使用する場合には、20ボルトの
希釈濃縮液に対して、上記にしたがって調製した樹脂約
1.5リットルを用いる。豚の血漿を使用するときは、血
漿リットルごとに150mlの樹脂を使用する。
試料をカラムに施してから、これを１リットルのVIII:C
緩衝液で洗浄し、続いて、さらに0.5MのNaClを含むVII
I:C緩衝液により第２洗浄する。因子VIIIが濃縮液とし
て与えられるときは、約20リットルの塩水緩衝液を用
い、豚の血漿を用いるときは、20床容積の緩衝液を用い
る。１リットル/hrの流速で最適の結果がえられる。
精製VIII:Cの溶離は、カルシウム・イオンを含むVIII:C
緩衝液で行なわれる。上記のTuddenbramらによって示さ
れるように、線型勾配で良好に行なえるが、この点は、
この発明の目的を達成するためには必要ない。固定され
た濃度のカルシウム・イオンを有する溶液が、きわめて
適切である。かくて、濃縮液からえられるVIII:Cが溶離
されているときは、塩化カルシウムに関して0.25〜0.5
M、好ましくは0.35MのVIII:C緩衝液が、流速450〜750ml
/時、好ましくは600ml/時として有利に使用される。VII
I:Cが豚の血漿からえられるときは、溶離は、塩化カル
シウム濃度0.35〜0.7Mの間、好ましくは0.5MのVIII:C緩
衝溶液で、かつ流速10〜30ml/時の間、好ましくは20ml/
時で行なわれる。12mlおよび3mlのフラクションを、そ
れぞれ濃縮液および豚の血漿からえられるVIII:C用に集
める。少なくとも1.0単位/mlのVIII:C活性を含むフラク
ションをプールし、そしてプールの総容量と活性を測定
する。
VIII:Cプールを最初に圧力限外濾過のような標準的な方
法によって10〜20mlに濃縮する。この目的に、50psiの
窒素圧の下におけるYM−10メンブレンを含むAmicon攪拌
セルが良好に作用することがわかった。窒素圧を解放し
てから、30分間ゆっくりと攪拌の続け、そして濃縮プー
ルの容積と活性を測定する。プールは、温度が４℃に維
持されるかぎり、短期間、例えは、一晩中保存できる。
上記した免疫吸着カラムは、流速約0.5〜１リットル／
時で3Mのチオシアン酸ナトリウム水溶液２床容量で処理
してVIII:RPを溶離すると再生できることに注目してよ
い。
D. 精製VIII:Cの濃縮 免疫吸着カラムによるVIII:RPからの分離によって回収
されたVIII:Cは、高度に精製されているが、治療上に利
用するためには、未だ稀薄すぎる。これ以上の濃縮は、
以下の方法で調製され、かつ使用されるアミノヘキシル
・アガロース・カラムを用いて行なわれる。
（ｉ） アミノヘキシル・アガロース・カラムの精製お
よび（または）調整 アミノヘキシル・アガロースは、1.6−ジアミノヘキサ
ンと反応したアガロースであって、そのそれぞれに端末
アミノ基をもつ多数の６炭素原子鎖をもつアガロース樹
脂を生ずる。このアガロース樹脂は、上記Austenによっ
て記述された方法にしたがって調製でき、または供給業
者から入手できる。この発明で、好首尾に使用された上
記物質の１つは、AH−SEPHAROSE 4B（ニュージャージ
州Piscataway市Pharmacia Fine Chemicals社製品の商
標名）の名称のもとで入手できる。
調製したものであれ、購入したものであれ、樹脂は、使
用前に調整しなければならない。これは以下のようにし
て行なわれる。容積、量、および寸法は濃縮対象物質の
量に比例して調整される。
約1gのアミノヘキシル・アガロース（AH−SEPHAROSE 4
B）を、焼結ガラス・フィルタ漏斗に入れ、攪拌しなが
ら、少なくとも200mlの0.5M塩化ナトリウムで洗浄す
る。つぎに樹脂をVIII:C緩衝液で平衡化させて、約0.9c
m径のカラムに充填する。ここで考慮される使用の型に
は、流れアダプタ付きのBio−Rad Econoカラムが極め
て適当であることがわかった。
充填カラムの床容量は約4mlである。
（ii） アミノヘキシル・アガロース・カラムへの適用
とその使用法 上記のようにして調製した濃縮プールを、前節で述べた
樹脂量およびカラム寸法を使用する場合、最終濃度100
〜200mlまで、VIII:C緩衝液で1:10に希釈する。希釈プ
ールを、流速200ml/時でカラムに適用する。
つぎにカラムを、好ましくは塩化カルシウムからのカル
シウム・イオンを含むVIII:C緩衝液で洗浄する。溶液
は、カルシウムイオンに関して、0.01M〜0.03Mの間、好
ましくは0.025Mとする。
濃縮VIII:Cの溶離は、先の洗浄段階で用いたより高濃度
のカルシウム・イオンを含む含むVIII:C緩衝液により、
流速５〜20ml/時、好ましくは10ml/時で行なう。この場
合もまた、塩化カルシウムは、0.25〜0.5Mの間、好まし
くは0.3M濃度の好ましいカルシウム・イオン源である。
1ml容積のフラクションを集め、そして下記にしたがっ
て検定する。集めたフラクションは、４℃でまたは凍結
して保存できる。豚の血漿源から得られたVIII:Cの調製
物は、貯蔵前に５〜10％の人間血清アルブミンにより安
定化される。
検定は、フラクションを、必要に応じてVIII:C緩衝液で
希釈し、そしてさらに基質へ添加する前に、フラクショ
ンを検定緩衝液で1:100に希釈して行なう。標準部分ト
ロンボプラスチン時間検定法に用いられる。
緩衝液の組成は以下のとうりである。
燐酸塩緩衝塩水溶液 燐酸ナトリウム1.6g −塩基性−水和物 燐酸ナトリウム8.4g 二塩基性無水物 塩化ナトリウム61.4 水で７リットルとする。
緩衝液のPHは7.2である。
VIII:C緩衝液 ml 0.02M イミダゾール ml 0.15M 塩化ナトリウム ml 0.10M リジン ml 0.02％ アジ化ナトリウム 緩衝液のPHは、濃塩酸で6.8に調整する。
表Ｉおよび表IIに挙げるデータは、上記したこの発表に
したがってえられた代表的なデータである。
好ましい実施態様のみが、この明細書にとくに例示さ
れ、かつ記述されているが、この発明の多数の変形およ
び変更が、上記の教示に照して、またこの発明の精神と
意図する範囲から離れることなく、付記のクレームの範
囲内で、可能であることが認められるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カ−ラル・アン・フルチヤ− アメリカ合衆国カリフオルニア州92037 ラ・ベヨラ・ラ・ジヨラ・ボ−ルエバ−ド 7543 (56)参考文献 Ｊ．Ｌａｂ，ｃｌｉｎ，Ｍｅｄ．，93, 40−53（1979) Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｖｏｌ62，Ｓ ｕｐｐｌ▲ＩＩＩ▼，第▲ＩＩＩ▼−106 頁、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．395（1980) Ｂｌｏｏｄ 58（３），530−536 （1981) 奈良医学雑誌（Ｊ．Ｎａｒａ Ｍｅｄ. Ａｓｓ．）30，199−212（1979) Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ 43，669−674 （1979) Ｂｌｏｏｄ 58（５），1000−1006 （1981)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の段階： （ａ）VIII:C/VIII:RP複合物を血漿または市販濃縮源か
    ら、VIII:RPに特異な単クローンIgG抗体を結合させた基
    質に吸着させ、 （ｂ）VIII:Cを溶離させ、 （ｃ）、段階（ｂ）で得られたVIII:Cを、VIII:Cを濃縮
    する別の吸着剤に吸着させ、 （ｄ）吸着したVIII:Cを溶離させ、そして （ｅ）高度に精製および濃縮されたVIII:Cを回収するこ
    と、 を含む因子VIII凝固活性蛋白質の調製方法。
  2. 【請求項２】段階（ｂ）および（ｄ）の各々で塩水溶液
    を溶離剤として使用する特許請求の範囲第１項に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】塩水溶液が塩化カルシウム溶液である特許
    請求の範囲第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】段階（ｂ）および（ｄ）で使用する塩化カ
    ルシウム溶液の濃度が約0.25Mないし約0.5Mの範囲であ
    る特許請求の範囲第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】段階（ａ）における基質がアガロースであ
    る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】段階（ｃ）においてアミノヘキシルアガロ
    ースを吸着剤として使用する特許請求の範囲第１項に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】段階（ｂ）および（ｄ）で塩化カルシウム
    溶液を溶離剤として使用し、塩化カルシウム溶液の濃度
    が段階（ｂ）および（ｄ）の各々において約0.25Mない
    し約0.5Mの範囲である特許請求の範囲第６項に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】基質が樹脂である特許請求の範囲第１項に
    記載の方法。
  9. 【請求項９】基質が粒子からなる特許請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  10. 【請求項１０】段階（ａ）が血漿または市販濃縮液を、
    VIII:RPに特異な単クローン抗体を結合させた吸着剤を
    含むクロマトグラフィ型カラムに通すことを含む特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】吸着剤がアガロースである特許請求の範
    囲第10項に記載の方法。
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