PL170067B1 - Sposób oczyszczania ludzkich immunoglobulin G,A i M - Google Patents

Abstract

Sposób oczyszczania ludzkich immunoglobulin G, A i M wytrącanych z surowicy lub 5/ plazmy ludzkiej metodami konwencjonalnymi-siarczanem amonu (końcowe stężenie 38%)lub etanolem przy stężeniu 17% w pH 5.2 (osad III wg Cohn'a), znamienny tym, że osad immunoglobulin zawiesza się w roztworze soli fizjologicznej, białka nierozpuszczalne wytrąca się przy 4% stężeniu glikolu polietylenowego 4000 i odrzuca, po czym podnosi się stężenie glikolu do 10%%·· i wytrącone immunoglobuliny G, A i M rozdziela chromatograficznie na Sepharose 4BCNsiarczan protaminy (w 0,02 molowym buforze fosforanowym o pH 7.4) na dwie frakcje - adsorbowaną zawierającą IgM oraz nieadsorbowaną bogatą w IgG i IgA, następnie IgM wyeluowany z kolumny 1 molowym roztworem chlorku sodowego sączy się przez Sephacryl S 1000 i we frakcji nieretardowanej otrzymuje oczyszczony preparat IgM, zaś IgG i IgA poddaje się chromatografii na DEAE-Sephadex'ie A-50 (w 0,017 molowym buforze fosforanowym o pH 6.5), buforem równoważącym eluuje oczyszczony preparat IgG, po czym 0,2 molowym chlorku sodowego wymywa się IgA i usuwa z niej białka balastowe przez związanie ich na SPSephadex'ie C-50 w 0,05 molowym buforze cytrynianowo-fosforanowym o pH 5.0, Białku A-Sepharose CL-4B oraz w chromatografii sitowej na Sephacrylu S 400, z którego we frakcji retardowanej otrzymuje się monomer preparatu IgA.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania ludzkich immunoglobulin G, A i M wydzielonych z plazmy lub surowicy ludzkiej metodami konwencjonalnymi przez wysalanie siarczanem amonu, frakcjonowanie etanolem, czy glikolem polietylenowym. Immunoglobulinami określa się białka pochodzenia zwierzęcego, posiadające aktywność przeciwciał tj. zdolność specyficznego łączenia się z różnorodnymi chemicznie determinantami określonego antygenu.

Immunoglobuliny stanowią 10-20% ogólnej ilości białek surowicy, ale obecne są także w płynach ustrojowych, wydzielinach i tkankach. Immunoglobuliny stanowią heterogenną mieszaninę białek różniących się sekwencją aminokwasową, masą molową, zawartością węglowodanów, co w konsekwencji różnicuje ich cechy serologiczne i właściwości fizyko-chemiczne. Według określonych cech immunoglobuliny podzielono na następujące klasy: IgG, IgA, IgM, IgE i IgD. Immunoglobulina G występująca w stężeniu około 10 mg/ml surowicy i stanowiąca większość przeciwciał krążących w ustroju posiada masę molową około 150 kg/mol i zbudowana jest z 4 łańcuchów polipeptydowych. Przeciwciała tej klasy są heterogenną mieszaniną białek, wśród których wyróżniono jeszcze kilka podklas. Immunoglobulina A znajdująca się w surowicy w stężeniu około 2 mg/ml posiada masę molową 190 kg/mol i może występować w formach polimerycznych. Immunoglobulina klasy M występująca w stężeniu około 1 mg/ml surowicy posiada masę molową 950kg/mol i jest pentamerem podjednostek strukturalnie podobnych do IgG. Immunoglobuliny klasy IgD i IgE występują w surowicy w bardzo małych stężeniach i są białkami powierzchniowymi odpowiednio - limfocytów B i skóry.

Immunoglobuliny głównie klasy IgG są stosowane w lecznictwie w przypadkach niedoborów odpornościowych oraz w profilaktyce i terapii zakażeń bakteryjno-wirusowych. Wysokooczyszczone preparaty immunoglobulin oraz swoiste dla nich przeciwciała uzyskane w drodze immunizacji zwierząt są szeroko stosowane w badaniach diagnostycznych i naukowych takich jak: turbidometria, nefelometria, immunoprecypitacja, radioimmunologia, testy immunoenzymatyczne, immunohistochemia, czy immunosorpcja.

Preparaty immunoglobulin G, A i M izoluje się z plazmy lub surowicy ludzkiej przez wytrącanie glikolem polietylenowym, siarczanem amonu lub etanolem. Do dalszego ich oczyszczania najczęściej stosuje się DEAE-Sephadex A-50, z którego poszczególne klasy immunoglobulin eluuje się wzrastającymi stężeniami soli. Doczyszczanie uzyskiwanych preparatów prowadzi się meto170 067 dami chromatografii sitowej na Sephadex'ie G-200, Sepharose 6B, swoistej sorpcji na nośniku Białko A-Sepharose CL-4B lub na immunosorbentach pozwalających wyadsorbować poszczególne immunoglobuliny swoistymi przeciwciałami związanymi ze stałym nośnikiem. (Laboratory Techmqes in Biochcmistry and Niolecular Biology, edited by R.H, Burdon and P.H. van Knrppenberg, 1985, vol. 15; RME PARKHOUSE, Msc Ph.D., Immunopunfication, British Medical Bulletin ((1984), vol. 40 no. 3, p. 297).

Metody te, często wykonawczo skomplikowane i ograniczone do laboratoryjnego użytku nie zawsze prowadzą do otrzymania homogennych immunologicznie preparatów.

Istotą wynalazku jest dobór parametrów wytrącania z roztworu immunoglobulin glikolem polietylenowym 4000 oraz zastosowanie odpowiednich buforów, siły jonowej i pH do chromatograficznego oczyszczania poszczególnych immunoglobulin na wymiennikach jonowych, sitach molekularnych i specyficznych sorbentach związanych ze stałym nośnikiem - w ustalonej kolejności - co pozwala uzyskać wysokooczyszczone, homogenne immunologicznie ludzkie preparaty IgG, IgA i IgM.

Sposób według wynalazku polega na tym, że osad immunoglobulin wytrącony z surowicy lub plazmy ludzkiej metodami konwencjonalnymi - siarczanem amonu (końcowe stężenie 38%) lub etanolem przy stężeniu 17% w pH 5,2 (osad III wg Cohn'a) zawiesza się w roztworze soli fizjologicznej, białka nierozpuszczalne wytrąca się przy 4% stężeniu glikolu polietylenowego 4000 i odrzuca, po czym podnosi się stężenie glikolu do 10% i wytrącone immunoglobuliny G, A i M rozdziela chromatograficznie na Sepharose 4BCN - siarczan protaminy (w 0,02 molowym buforze fosforanowym o pH 7,4) na dwie frakcje - adsorbowaną zawierającą IgM oraz nieadsorbowaną bogatą w IgG i IgA, następnie IgM wyeluowany z kolumny 1 molowym NaCl sączy się przez Sephacryl S 1000 i we frakcji nieretardowanej otrzymuje się oczyszczony preparat IgM, zaś IgG i IgA poddaje się chromatografu na DEAE-Sephadex'ie A-50 (w 0,017 molowym buforze fosforanowym o pH 6.5), buforem równoważącym eluuje się oczyszczony preparat IgG, po czym 0,2 molowym NaCl wymywa się IgA i usuwa z niej białka balastowe przez związanie ich na SPSephadex'ie C-50 w 0,05 molowym buforze cytrynianowo-fosforanowym o pH 5.0, Białku ASepharose CL-4B oraz w chromatografii sitowej na Sephacrylu S400, z którego we frakcji retardowanej otrzymuje się oczyszczony monomer preparatu IgA.

Sposób według wynalazku charakteryzuje się łatwymi w wykonaniu metodami chromatografii jonowymiennej, sitowej oraz powinowactwa w nowoopracowanych warunkach pH i siły jonowej, a do elucji immunoglubulin nie jest wymagane stosowanie ciągłego gradientu stężeń soli, czy odczynników denaturujących białka. Zastosowanie w procesie oczyszczania immunoglobulin chromatografii powinowactwa na siarczanie protaminy związanym ze stałym nośnikiem, w odpowiednio dobranych warunkach, pozwala na selektywne i całkowite oddzielenie IgM od IgG i IgA. Duża pojemność wiążąca siarczanu protaminy w stosunku do IgM umożliwia wykorzystanie metody do celów produkcyjnych. Opracowane warunki chromatografii na SP-Sephadex'ie C-50, dotychczas nie stosowanym do izolowania immunoglobulin, pozwalają na znaczne zagęszczenie IgA w jednej frakcji i ułatwiają jej dalsze oczyszczanie.

Przykład. Osad III, w ilości 1 kg, wytrącony przy 17% stężeniu etanolu w pH 5.2, w procesie frakcjonowania plazmy ludzkiej według metody Cohn'a ekstrahowano 21 buforowanego fizjologicznego roztworu chlorku sodu przez około 6 h i do zawiesiny dodano, przy stałym mieszaniu, glikol polietylenowy 4000 do stężenia 4%. Całość pozostawiono w temperaturze pokojowej przez około 16 h, wydzielony osad odwirowano i odrzucono, a do płynu dodano glikol polietylenowy 4000 do stężenia 10%. Wytrącony osad immunoglobulin po 16 h odwirowano, osad rozpuszczono w 400 ml 0,02 molowego buforu fosforanowego o pH 7,4 i wydializowano do w/w buforu. Klarowny roztwór immunoglobulin nałożono na kolumnę o wymiarach 3 X 40 cm wypełnioną Sepharose 4BCN-siarczan protaminy i kolumnę płukano buforem równoważącym. Zebraną frakcję nieadsorbowaną przeznaczono do oczyszczania IgG i IgA. Białka związane przez sorbent wyeluowano 1 molowym NaCl i przeznaczono do otrzymania IgM. Roztwór zawierający IgG i IgA wydializowano do 0,017 molowego buforu fosforanowego o pH 6.5 i nałożono na DEAE-Sephadex A-50 (kolumna 3 X 30 cm) zrównoważony w/w buforem. We frakcji wyeluowanej buforem równoważącym uzyskano wysokooczyszczony, homogenny immunologicznie preparat IgG. Białka związane zawierające IgA wyeluowano 0,2 molowym NaCl, wydializowano do 0,05 molowego buforu

170 067 cytrynianowo-fosforanowego o pH 5.0 i nałożono na SP-Sephadex C-50 (kolumna 3X30 cm) zrównoważony w/w buforem. Preparat IgA wymyty buforem równoważącym poddano adsorpcji na Białku A-Sepharose CL-4B (w 0,1 molowym buforze cytrynianowo-fosforanowym pH 8.0), a η η ρ + λ-τλ o 1 »· ♦ν» «-* 4-zx z* »· r* i· « ·> o O r» 1 ¹ udstęphie cmuniatugiaiii siatuwej na Sepnacijiu i •nlppn *·<^4·ζ> **z4 rzm ί i »-»-»τη Ιζ-ζ* ·»* z·» rakcji ^taruM w an ej uzyskano mono^- mer homogennego immunologicznie preparatu IgA. Preparat IgM związany przez siarczan protaminy i wyeluowany 1 molowym NaCl oczyszczono metodą sączenia molekularnego przez Sephacryl S 1000 w roztworze soli fizjologicznej. IgM otrzymany we frakcji nieretardowanej w przypadku ewentualnych śladowych zanieczyszczeń immunoglobulinami G lub A doczyszczano na Białku A-Sepharose CL-4B lub Sepharose-4BCN-anty-IgA.

Otrzymane w wyżej opisany sposób immunoglobuliny G, A i M w badaniach immunodyfuzji i immunoelektroforezy dawały pojedyncze linie precypitacyjne ze swoistymi przeciwciałami oraz surowicą odpornościową przeciwko pełnej surowicy ludzkiej. Wydajność procesu oczyszczania poszczególnych immunoglobulin jest wysoka, ale zależna od zawartości tych białek w surowcu wyjściowym i stopnia ich denaturacji w fazie wytrącania metodami konwencjonalnymi.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 2,00 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób oczyszczania ludzkich immunoglobulin G, A i M wytrącanych z surowicy lub plazmy ludzkiej metodami konwencjonalnymi - siarczanem amonu (końcowe stężenie 38%) lub etanolem przy stężeniu 17% w pH 5.2 (osad III wg Cohn'a), znamienny tym, że osad immunoglobulin zawiesza się w roztworze soli fizjologicznej, białka nierozpuszczalne wytrąca się przy 4% stężeniu glikolu polietylenowego 4000 i odrzuca, po czym podnosi się stężenie glikolu do 10% i wytrącone immunoglobuliny G, A i M rozdziela chromatograficznie na Sepharose 4BCN-siarczan protaminy (w 0,02 molowym buforze fosforanowym o pH 7.4) na dwie frakcje - adsorbowaną zawierającą IgM oraz nieadsorbowaną bogatą w IgG i IgA, następnie IgM wyeluowany z kolumny 1 molowym roztworem chlorku sodowego sączy się przez Sephacryl S 1000 i we frakcji nieretardowanej otrzymuje oczyszczony preparat IgM, zaś IgG i IgA poddaje się chromatografii na DEAESephadex'ie A-50 (w 0,017 molowym buforze fosforanowym o pH 6.5), buforem równoważącym eluuje oczyszczony preparat IgG, po czym 0,2 molowym chlorku sodowego wymywa się IgA i usuwa z niej białka balastowe przez związanie ich na SP-Sephadex'ie C-50 w 0,05 molowym buforze cytrynianowo-fosforanowym o pH 5.0, Białku A-Sepharose CL-4B oraz w chromatografii sitowej na Sephacrylu S 400, z którego we frakcji retardowanej otrzymuje się monomer preparatu IgA.