JPH0784480B2 - 改良免疫吸着剤 - Google Patents

改良免疫吸着剤

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JPH0784480B2
JPH0784480B2 JP3202313A JP20231391A JPH0784480B2 JP H0784480 B2 JPH0784480 B2 JP H0784480B2 JP 3202313 A JP3202313 A JP 3202313A JP 20231391 A JP20231391 A JP 20231391A JP H0784480 B2 JPH0784480 B2 JP H0784480B2
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viii
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サミュエル ジマーマン セオドール
アン フルチャー カーラル
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スクリップス クリニック アンド リサーチ ファンデーション
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は因子VIII凝固活性蛋白
質の分離および精製のための改良免疫吸着剤に関する。
この発明の吸着剤は血漿または市販濃縮液から高純度の
因子VIII凝固活性蛋白質を分離するに特に適する。
【０００２】
【従来の技術】血漿からの抗血友病因子の分離について
は、文献に発表されている。抗血友病因子、すなわち因
子VIII凝固活性蛋白質（因子VIII）の精密な構造は、一
部には、十分量の純物質がえられず、より深い研究が不
可能なために、いまだに確認されていない。純物質の入
手に制約があり、しかもこの因子が稀薄状態で存在する
ために、この因子の治療上の利用が妨げられていた。
【０００３】因子VIII凝固活性蛋白質は、血友病血漿中
の凝固欠陥を正すよう機能する。これは、血漿中でフォ
ンウィルブランド因子蛋白質と複合して循環する。フォ
ンウィルブランド因子蛋白質は、フォンウィルブランド
病における血小板機能欠陥を変化させうる。因子VIIIフ
ォンウィルブランド因子複合物の凝固活性を有する部分
は因子VIII凝固活性蛋白質、因子VIII−凝固活性、また
は単にVIII：Ｃと呼ばれる（“VIII：Ｃ”の名称は、以
後、上記の凝固活性のある因子VIII分子の部分を同定す
るために用いられる）。
【０００４】因子VIIIフォンウィルブランド因子複合物
のフォンウィルブランド病の血小板機能欠陥を正す能力
を有する他の部分は、フォンウィルブランド因子、因子
VIII関連抗原、VIIIＲ：Ａg 、VIII：ＲＰ因子と呼ばれ
る（表示“VIII：ＲＰ”は、以後因子VIII分子の血小板
補正機能を同定するために用いられる）。これまでに実
証されているわけではないが、VIII：Ｃが、非共有複合
物としてVIII：ＲＰと結合している小分子の性質と挙動
を示すという結論を裏付ける徴候がある。またVIII：Ｃ
およびVIII：ＲＰの双方が結合している性質は適当な条
件のもとで開裂して２つの断片を生じうる単一分子でも
ありうるという主張についての根拠もある。
【０００５】因子VIII／フォンウィルブランド因子複合
物、VIII：Ｃ、およびVIII：ＲＰの構造を同定する必要
性およびVIII：Ｃに帰せられる凝固活性の重要な薬剤価
値に鑑み、因子VIIIを精製する、およびVIII：ＣとVII
I：ＲＰを分離し、かつ濃縮する多くの試みが行なわれ
た。使用する技法は、一般に免疫吸着法またはイオン交
換クロマトグラフィのいずれかに基いていた。このため
に従来使用されている技法は、蛋白質を荷電イオン物質
から損傷のない状態で着脱させたり、または蛋白質を適
切量で回収することが困難なために、成功には制約があ
った。
【０００６】免疫吸着クロマトグラフィを利用するＶＩ
ＩＩ：ＣをＶＩＩＩ：ＲＰから分離する上記方法の１つ
が、Ｅ．Ｇ．Ｄ．Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ等によりＪＯＵＲ
ＮＡＬ ＯＦ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＣＬＩＮＩＣＡ
Ｌ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，９３巻，４０頁（１９７９年）
に“免疫吸着クロマトグラフィによって調製した因子Ｖ
ＩＩＩ凝固活性の特性”の題名で発表されている。報告
された方法は、ＶＩＩＩ：ＲＰに対する多クローン抗血
清（抗−ＶＩＩＩ：ＲＰ）が結合されているアガロース
・ビーズを充填したクロマトグラフィ・カラムを用い
て、ＶＩＩＩ：ＣをほとんどすべてのＶＩＩＩ：ＲＰ、
およびほとんどのその他の血漿蛋白質から分離する１段
法である。因子ＶＩＩＩ／フォンウィルブランド因子を
含む血漿が、ＶＩＩＩ：ＣとＶＩＩＩ：ＲＰの双方を吸
着するカラムにかけられる。その他の不要な血漿蛋白質
は、緩衝塩水溶液で洗浄することによってカラムから除
去され、そして所望のＶＩＩＩ：Ｃが、その後のカルシ
ウム・イオン勾配液による溶離によってえられる。この
方法は、従来の既知の方法と比較して、ＶＩＩＩ：Ｃの
純度と収率の双方の改善であると述べらているが、生じ
た生成物はＶＩＩＩ：ＲＰおよびその他の血漿蛋白質を
も含むとも述べられている。このような不純物質は、ア
ガロース・ビーズに結合された多クローン抗血清を使用
することに原因するものと考えられる。抗血清を構成す
る免疫グロブリンの大多数は、ＶＩＩＩ：ＲＰに対して
特異でないから、ＶＩＩＩ：ＲＰに特異な抗体がアガロ
ースに結合されうる有効座数は、アガロース上の有限数
の結合座に対する抗血清の間の競合により、比較的少な
い。
【０００７】アミノヘキシル置換アガロースを用いるク
ロマトグラフィ技法によって、VIII：ＲＰとリストセチ
ン共同因子からVIII：Ｃを分離するもう一つの方法が
Ｄ．Ｅ．Ｇ．Ａusten の、ＢＲＩＴＩＳＨ ＪＯＵＲＮ
ＡＬ ＯＦ ＨＡＥＭＡＴＯＬＯＧＹ，４３巻，６６９
頁（１９７９年）“因子VIIIのアミノヘキシル・セファ
ロース上でのクロマトグラフィによる分離”により報告
されている。記述の方法は、人間と豚の双方の因子VIII
／フォンウィルブランド因子の成分部分についての改善
法であると述べられている。しかしながら、この方法も
また、得られる生成物中に不純物質が存在するという欠
点を示す。ＴuddenhamらおよびＡusten による両方法に
おいて、不純物質を含む生成物が、通常希望されるより
さらに稀薄な状態で、生成する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、血漿また
は濃縮液を用いて、VIII：ＲＰからVIII：Ｃを分離し、
精製するための改善方法の必要性があることは明らかで
ある。したがって、この発明の目的は、このような必要
性を満すことにある。
【０００９】この発明は、因子VIII／フォンウィルブラ
ンド因子複合物の成分分子、即ちVIII：ＣおよびVIII：
ＲＰの分離および凝固活性蛋白質VIII：Ｃの精製に使用
される免疫吸着剤に関している。この吸着剤は、高純度
のVIII：Ｃを製造する目的を達成する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記目的はこの発明によ
れば、基質に結合された、VIII：ＲＰに特異な単クロー
ン抗体からなる免疫吸着剤を提供することにより達成さ
れる。基質は好ましくは、固体粒子の形である。また、
基質は好ましくは樹脂、例えばアガロースからなる。
【００１１】この発明の免疫吸着剤は、本願の原出願で
ある特願昭５７−２１７９２８号の主題である血漿また
は市販濃縮液からVIII：Ｃを分離し精製しそして濃縮す
る以下に述べる２段法の第１段階に用いるに特に適す
る。
【００１２】第１段階は、血漿または市販濃縮液からの
因子VIIIの免疫吸着法である。使用する吸着剤は、例え
ばアガロース・ビーズのような適当な基質に結合された
VIII：ＲＰに特異な単クローン抗体からなっている。VI
II：Ｃ／VIII：ＲＰが最初に吸着されてから、基質粒子
を緩衝溶液により十分に洗浄して、非吸着蛋白質を除去
する。つぎに吸着物質を、吸着VIII：Ｃを溶離するため
に、カルシウム・イオンを含む溶液で処理する。VIII：
ＲＰ部分は、抗VIII：ＲＰが結合した物質に吸着された
ままである。この時点で、最初に吸着されたVIII：Ｃの
約４０〜６０％が、高純度状態で回収される。ただし、
回収された凝固活性蛋白質は、きわめて純度は高いが、
すなわち、ほとんど汚染物質を含んでいないが、稀薄す
ぎるため、有意な治療的価値を有していない。
【００１３】この方法の第２段階は、アフィニィティ・
クロマトグラフィとして特性化される技法を用いて、回
収した高純度VIII：Ｃを主として濃縮することに向けら
れている。
【００１４】この方法の第１段階からえられた約１０〜
２０国際単位（以下“単位”と呼称する）の効力をもつ
VIII：Ｃ溶液を、アミノヘキシル置換アガロースを含む
カラムで処理する。つぎにカラムを緩衝溶液で洗浄し、
そしてVIII：Ｃをカルシウム・イオン含有溶液で溶離
し、１０００単位／mlを超え、かつ血漿から１６０，０
００倍以上純化されているVIII：Ｃ濃縮液をうる。かく
て、この方法によって、予期しない高純度の凝固活性蛋
白質が、高度に濃縮され、かつ治療上有用な状態でえら
れた。これまでに使用された方法では、いくつかの理由
から、上記の顕著な結果を達成できない。前述したＴud
denhamらの方法は、この発明によるVIII：ＲＰに特異
で、かつ高度に選択的な単クローン抗体の代りに、結合
多クローン抗血清を使用している。その結果、VIII：Ｒ
Ｐに特異な抗体が、少数しか、一定重量のアガロースと
結合しない。この発明によれば、単クローン抗体がもっ
ぱら比較的不活性な基質と結合される。Ｔuddenhamらの
方法を使用するときは、免疫グロブリン−アガロース・
ビーズml当りVIII：ＲＰ２．６〜６．４単位（カラムに
適用した量の５３．１〜８２．９％に相当）のみが除去
される。これは、この発明の単クローン抗体免疫吸着剤
を使用する場合に回収されるビーズml当り１２．５−１
８．８単位（すなわち、カラムに適用したVIII：ＲＰの
９０〜１００％）以上と比較される。したがって、ビー
ズml当りにより多くのVIII：Ｃ／VIII：ＲＰ（因子VIII
／フォンウィルブランド因子）を吸着する能力が、それ
が引続き免疫吸着剤から溶離された時、より高濃度のVI
II：Ｃを生ずる。かくて、Ｔuddenhamらの方法による溶
離液mlあたり０．５〜１．２５単位と対比して、この発
明による免疫吸着剤を用いる方法では、溶離液ml当りVI
II：Ｃ１０〜２０単位がえられる。
【００１５】この方法によると、VIII：ＲＰに対して高
親和力を示す単クローン抗体の選択もできる。一方、多
クローン抗体を使用すると親和力に変化をもたらす。VI
II：ＲＰの結合抗体の親和性と、VIII：ＲＰの溶離の間
には、間接的な関係があることを認めなければならな
い。かくて、VIII：ＲＰに対する抗体の親和性が高くな
るほど、溶離液中にVIII：Ｃとともに存在するVIII：Ｒ
Ｐの量が減少する。この発明によって、特異単クローン
抗体を無制限にうることもでき、したがってまた種々の
バッチの間の変動を排除できる。
【００１６】前述したように、Ａusten は、VIII：Ｃを
VIII：ＲＰから分離するためにアミノヘキシル・アガロ
ースを使用したことを報告したが、分離および精製段階
に続いて、VIII：Ｃを濃縮するために、このような物質
が使用されたことはなかった。これまでに、クロマトグ
ラフィにアミノヘキシル・アガロースを用いて達成され
た最高のVIII：Ｃ濃度は、人間の蛋白質について溶離液
ml当りに０．５３単位、豚のVIII：Ｃについて溶離液ml
当り２．３８単位であった。この発明によれば、これよ
り数桁大きな濃度をうることができる。おそらく、さら
に重要と考えられるのは、この発明によって、これまで
に報告されたより高い純度の人間のVIII：Ｃがえられる
という事実である（血漿の１６４，０００倍対１７，０
００倍）。以後に、さらに詳細に述べるこの方法によっ
て、市販の濃縮液を使用すると、２，３００単位／mgの
比活性を有するVIII：Ｃがえられる。これは血漿からの
純度の１６４，０００倍に相当する。VIII：Ｃと、VII
I：ＲＰの比は、血漿中の比と比較すると１０5 以上で
ある。
【００１７】以下の記述によって、VIII：Ｃの分離、精
製および濃縮が、従来知られなかった程度の純度と濃縮
度に達成されるために、この発明の実施態様が実施さ
れ、かつ用いられる方法の詳細が示される。この記述
は、この発明を例示するものではあるが、とくにこの発
明を限定するものと解されるべきではなく、また、当業
者の知識範囲内にあると考えられる変化は、この発明の
範囲内に入るとみなすものとする。
【００１８】
【実施例】Ａ．ＶＩＩＩ：ＲＰに対する単クローン抗体
の調製 後に分離基質に結合されるＶＩＩＩ：ＲＰに対する単ク
ローン抗体は、因子ＶＩＩＩ／フォンウィルブランド因
子（ＶＩＩＩ：Ｃ／ＶＩＩＩ：ＲＰ複合物）の高度に精
製された調製物から出発する段階的な方法に従って調製
できる。免疫のための精製は、血漿源からえられた物質
により行なう。またポリビニル板のコーティングのため
のあまり純度の高くない物質は、ＦＡＣＴＯＲＡＴＥ
（ニューヨーク州Ｔｕｃｋａｈｏｅ市Ａｒｍｏｕｒ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ社製品の商標名）ま
たはＨｅｍｏｐｈｉｌ（カリフォルニア州Ｃｏｓｔａ
Ｍｅｓａ市Ｈｙｌａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
製品の商標名）のような市販されている抽出物からより
高い濃度で得られる。精製は、ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ
Ｓ：ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣ
ＨＮＩＱＵＥＳ ＦＯＲ ＴＨＥ １９８０′ｓ，Ｒ．
Ｍ．Ｎａｋａｍｕｒａ．等編、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３３９〜３４９頁（１９
８０年）に発表されたＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＲｏｂ
ｅｒｔｓによる“因子ＶＩＩＩ関連抗原”に記述されて
いるような、クリオプレシピテートの標準アガロースー
ゲル濾過によって行なわれる。マウスに、以下の手順に
したがって血漿から得られた高度に精製した因子ＶＩＩ
Ｉ／フォンウィルブランド因子を注射した。ゼロ日に、
マウスに、０．０５Ｍのトリス，０．１５Ｍの塩化ナト
リウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、１ｍＭのフェ
ニル・メチル弗化スルフォニル、および１０単位／ｍｌ
のトレイシロール（ｔｒａｙｓｙｌｏｌ）を含む０．１
ｍｌの緩衝溶液中にＰＨ７．３で蛋白質１０ｍｇを溶解
（または懸濁）させ、等容量の完全フロイントアジュバ
ントと振盪して調製された組成物を、腹腔内注射した。
１４日目に、完全フロイントアジュバントが不完全フロ
イントアジュバントに替った以外は上記と同一である物
質をマウスに再び注射した。２１日目に、１４日目の注
射を繰返した。３８日目に、マウスに精製ＶＩＩＩ：Ｃ
／ＶＩＩＩ：ＲＰのみを注射した。４２日目に、マウス
の脾臓を取り出しそしてＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯ
ＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２２５巻，４９
８０〜４９８３頁（１９８０年）記載のＪ．Ｐ．Ｂｒｏ
ｗｎらによる“単クローン抗体による免疫析出法により
識別した正常および悪性人間細胞の蛋白質抗原”で発表
された型の標準法にしたがって融合した。標準法は、５
０％ポリエチレン・グリコール１０００が３５％ポリエ
チレン・グリコールに替っている程度にしか変えていな
い。ＶＩＩＩ：ＲＰに対する抗体を産生するクローンの
放射免疫測定は次の手順により行なう。“Ｖ”字型底を
備えるフレキシブル型のポリビニール板を、上記の手順
にしたがって市販抽出液から精製された蛋白質濃度０．
１２５ｍｇ／ｍｌの因子ＶＩＩＩ０．１ｍｌでコーティ
ングする。ポリビニール板を、アルブミンでブロック
し、緩衝液で洗浄し、そして被験クローンからの培養液
でインキュベートする。つぎにポリビニール板を洗浄し
て、ラビット抗マウスＩｇＧ抗血清と反応させ、もう一
度洗浄し、そして１２５Ｉで標識した山羊抗ラビット１
ｇＧ抗血清をウェルに添加して、インキューベートす
る。ポリビニール板を再び洗浄して、つぎに乾燥し、そ
してウェルを切除して計数する。陽性のクローンを決定
してから、これらを少なくとも２回サブクローニング
し、つぎにＶＩＩＩ：ＲＰに対する抗体を産生する安定
なクローンを、細胞注射の少なくとも４日前にプリスタ
ン０．５ｍｌにより腹腔内に前処置してあるＢａｌｂ／
Ｃマウスの腹腔に注射する。ハイブリドーマ細胞をマウ
ス当り約５×１０６細胞の濃度で、牛胎児血清のない
０．５ｍｌのＤｅＩｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地を介
して注入する。マウスを、鼓脹した時に穿刺し、そして
腹水液を約１０単位／ｍｌのへパリン中に集める。複数
のマウスからの腹水液をプールして、その後の単クロー
ンＩｇＧの分離用の適当量を供給する。ヘパリン化した
腹水液をただちに使用しないときは、この腹水液は、−
７０℃で保存し、そして使用直前に解凍しうる。腹水液
からのＩｇＧの最終収量は１００ｍｌ腹水液当りＩｇＧ
約１ｇである。
【００１９】VIII：Ｃを精製するために使用される単ク
ローンＩg Ｇの特異性は次のようにして判断される。即
ち、まず下記の方法でＩg Ｇを分離基質媒体と結合さ
せ、次に(1) 結合したＩg Ｇが血漿からVIII：ＲＰおよ
びVIII：Ｃの両方を除去すること、および(2) VIII：Ｃ
がその後カルシウム・イオン含有溶液で溶離され、一方
VIII：ＰＲは固体状態の基質と結合している単クローン
Ｉg Ｇと複合物を形成したまゝであることを明示するこ
とにより判断される。
【００２０】続いて免疫吸着剤を調製するために使用さ
れる単クローンＩｇＧは、へパリン化してプールした腹
水液から捕集直後に分離でき、又は保存溶液の凍結部分
を解凍しうる。新鮮物質または凍結物質のいずれを使用
するかに関わりなく、溶液を４℃にたもち、その組成を
下記に示す等容量のリン酸塩緩衝塩水溶液（ＰＢＳ）に
よって処理する。稀釈腹水は、等容量の飽和硫酸アンモ
ニウム（ＳＡＳ）を４℃で攪拌しながら滴下することに
より沈殿させる。ＳＡＳは、過剰の硫酸アンモニウムを
水中で沸騰させ、４℃に冷却し、不溶解結晶を濾別し、
そして水酸化アンモニウムによって、ＰＨを７．０に調
節して、調製する。沈殿物とその上澄み液を少なくとも
２時間攪拌して、４℃で遠心分離する。遠心分離操作は
好ましくは１４，０００ｒｐｍで、６０分間行なう（３
０，０００×ｇ）。腹水の上澄み液は、もう２回ＳＡＳ
で沈殿させ、そして沈殿物と上澄み液の混合物を攪拌し
て、第１サイクルと同様な方法で遠心分離する。第３沈
殿からえられるペレットは、稀釈腹水液と等容量のＰＢ
Ｓ中に再懸濁させ、そしてつぎにＰＢＳに対して徹底的
に透析する。透析バッグ内に現われる凝固物質は、２０
℃で遠心分離により除去する。透析したＩｇＧは、これ
を室温で、水酸化アルミニウムの５％水溶液と攪拌し、
吸着後２０℃で遠心分離することによって吸着させる。
吸着処理は、第１回の処理後の各処理ごとに、２．５％
水酸化アルミニウム溶液を用いて少なくともあと３回繰
返す。吸着されたＩｇＧは、４℃にして、１回、上記の
ようにＳＡＳで再沈殿する。沈殿ペレットは、使用まで
−２０℃で保存するとよい。
【００２１】Ｂ． 免疫吸着剤の調製 免疫吸着剤は、結合のための単クローンＩg Ｇを調製
し、結合のための固体基質を調製し、そして前者が後者
と結合するよう両成分を反応させることによって調製さ
れる。
【００２２】（i ） 結合用Ｉg Ｇの調製 新たに沈殿したＩg Ｇを使用することができ、または、
予め凍結した沈殿物を解凍して使用してもよい。沈殿物
はつぎにＰＢＳに対して透析し、そしてなおＰＢＳ中に
ある間に、容積とＩg Ｇ濃度（Ａ280 ／１．４＝mg／ml
Ｉg Ｇ）を測定する。Ｉg Ｇは、つぎに、Ｉg Ｇ溶液５
０ml当り、１０〜３０マイクロリットル好ましくは２０
マイクロリットルの量の弗化燐酸ジイソプロピルで処理
する。生ずる溶液を室温で３０分間、フード内で撹拌
し、そして処理したＩg Ｇを、使用直前に、結合用緩衝
液に対して一晩中透析する。最適と認められる結合用緩
衝液は、好ましくは水酸化ナトリウムによりＰＨ９に調
節した０．２５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液である。
【００２３】（ii） 結合用固体基質の調製 単クローン抗体は、蛋白質、とくに因子VIII自体に対し
て高度の親和性をもたないいかなる物質に結合させても
よいが、ガラス・ビーズ、アガロースおよびその誘導体
のような物質が好ましい。もっとも好ましい物質は、Ｓ
epharose ＣＬ２Ｂ（ニュージャージー州Ｐiscatway市
Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals社製品の商標名）とし
て知られるゲルとして市販されている架橋アガロースで
ある。
【００２４】好ましい免疫吸着樹脂の調製方法は、一般
に、Ｊ．Ｐorath ら、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯ
ＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，８６巻，５３〜５６頁（１９７
３年）の方法のような、文献に発表されたと同一の方法
である。最適と認められる方法は、つぎの通りである。
すなわち、約２リットル容量のＳepharose ＣＬ２Ｂ
を、酸で洗浄された２リットル容量の焼結ガラス・フィ
ルタ漏斗中に置く。樹脂を水で洗浄し、そして濾過して
湿潤ケーキにする。洗浄した樹脂を、磁気撹拌棒を備え
る大きな（約４リットル）ガラス・ビーカ内に置く。つ
ぎに５Ｍの二塩基性燐酸カリ溶液１部と５Ｍの三塩基性
燐酸カリ溶液２部を混合して調製した冷燐酸カリ緩衝溶
液７５０mlを樹脂に添加する。冷却された水を加えて、
最終容量を３リットルとする。つぎに混合物を４℃に冷
却し、磁気撹拌板上に置いた氷−水浴中で４〜１０℃に
保持する。フード内で臭化シアンを、磁気撹拌棒を含む
ストッパ付きガラスびん内の水３００mlに添加する。溶
液を生ずるまで、混合物を迅速に撹拌する。つぎに臭化
シアン溶液を、２分間にわたって撹拌しながら、冷Ｓep
harose混合液に添加する。撹拌をさらに８分間続けて、
つぎに４リットル容量の真空フラスコに支持される冷し
た２リットル容量の焼結ガラス・フィルタに移す。臭化
シアンで処理した樹脂を、つぎに約２０リットルの冷水
によるか、または濾液のＰＨが中性となるまで洗浄す
る。洗浄した樹脂をつぎに速やかに、冷結合用緩衝液で
平衡化させて、つぎに大型の磁気撹拌棒を備える４リッ
トル容量のプラスチック・ビーカに移す。
【００２５】（iii ） 単クローン抗体の固体基質への
結合 上記にしたがって調製した固体基質樹脂は、結合用緩衝
液で平衡化されると、使用するばかりの状態になってい
るから、その後に保存してはならない。したがって、樹
脂混合物を、先に一晩中結合用緩衝液に対して透析され
たＩg Ｇと結合させる。結合させた樹脂／Ｉg Ｇの懸濁
混合液を、約２４時間、４℃で撹拌する。上澄み結合液
の希釈しない試料のＡ280 を、標準として牛の血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、または標準としてＢＳＡを使用する
バイオレイド（Bio-Rad ） プロテイン アセイ（ブラ
ッドフォード 試薬）を用いて測定しうる。次に結合さ
れた配位子の百分率が計算できる。上記の手順にしたが
うと、この百分率は通常約９５％である。抗体に結合さ
れない樹脂の残留活性座は、焼結ガラス・フィルタ漏斗
上で、０．１Ｍグリシンを含有する冷結合用緩衝液を用
いて樹脂を洗浄することによってブロックできる。つぎ
に樹脂をこの溶液中に再懸濁させて、それぞれの結合用
緩衝液中で樹脂と抗体が結合されたときの容積に等しい
最終容積にする。懸濁液を４℃で一晩中、ゆっくりと撹
拌する。つぎに樹脂を、以下に示す組成のVIII：Ｃ緩衝
液で十分に洗浄する。つぎに結合され、ブロックされた
樹脂を、好ましくは塩化カルシウムとしての０．５Ｍカ
ルシウム・イオンをさらに含むVIII：Ｃ緩衝液で予備溶
離する。樹脂を再びVIII：Ｃ緩衝液だけで洗浄し、使用
するまで、４℃で、または室温で連続的にポンプ送りさ
れるカラム中に保存する。Ｉg ＧのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ
に対する結合密度は、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ リットル当
り２〜５g 、好ましくは３〜４g とする。
【００２６】Ｃ． VIII：Ｃの分離と精製 人間および動物血漿、および市販の因子VIIIの濃縮液の
ような因子VIIIの試料調製物を、この発明で用いること
ができ、かつこの方法は、特定型の物質に限られるもの
ではない。好ましい物質、および良好な結果を示した物
質は、豚および人間の血漿、および市販されている人間
の因子VIIIの濃縮液例えば、Ａrmour Ｐharmaceutical
社から発売されているＦＡＣＴＯＲＡＴＥである。以下
の記述は、豚の血漿、または例えばＦＡＣＴＯＲＡＴＥ
のような市販の人間の濃縮液を用いての詳細を示すもの
である。
【００２７】すなわち、ＦＡＣＴＯＲＡＴＥを、VIII：
Ｃ緩衝液２５ml部を、ボトル当り４００−５００VIII：
Ｃ単位を含む２０ボトル（２５ml／ボトル）のそれぞれ
の内容物に加えることによって戻す。混合液を、VIII：
Ｃ緩衝液によって最終容量１リットルに調節する。０．
５mlで区分された試料を分析のため除くことができ、そ
して残余の物質を、免疫吸着カラムに、約６０ml／時の
割合で一晩中加えることができる。
【００２８】新鮮な状態で引出さない場合、豚の血漿
は、従来の方法でくえん酸処理して、凍結保存する。使
用する場合には、これを３５〜４０℃の間、好ましくは
３７℃の温度で解凍して、直接６０ml／時の割合でカラ
ムに加える。
【００２９】この発明の記述は、クロマトグラフィ・カ
ラム中の免疫吸着剤が結合された粒子の使用に言及し、
かつ主としてこれらの使用を指向しているが、抗体結合
樹脂粒子を、適当な容器に入れ、そして上記にしたがっ
て、また下記にさらに詳述するように、戻した濃縮液、
または血漿を加えてから、バッチ方式でVIII：Ｃの分離
を行なうことは、この発明の範囲内であることに注目す
べきである。
【００３０】クロマトグラフィ法により、この方法を実
施する場合には、以下の実施態様が好ましい。
【００３１】すなわち、樹脂を、Ａmicon ８６００１
（マサチュセッツ州レキシントン市Ａmicon 社製品商標
名）のような、蠕動ポンプを備え、かつ流れヘッドの高
いカラム内に入れる。因子VIII源として濃縮液を使用す
る場合には、２０ボトルの希釈濃縮液に対して、上記に
したがって調製した樹脂約１．５リットルを用いる。豚
の血漿を使用するときは、血漿リットルごとに１５０ml
の樹脂を使用する。
【００３２】試料をカラムに施してから、それを１リッ
トルのＶＩＩＩ：Ｃ緩衝液で洗浄し、続いて、さらに
０．５ＭのＮａＣｌを含むＶＩＩＩ：Ｃ緩衝液により第
２洗浄する。因子ＶＩＩＩが濃縮液として与えられると
きは、約２０リットルの塩水緩衝液を用い、豚の血漿を
用いるときは、２０床容積の緩衝液を用いる。１リット
ル／ｈｒの流速で最適の結果が得られる。
【００３３】精製VIII：Ｃの溶離は、カルシウム・イオ
ンを含むVIII：Ｃ緩衝液で行なわれる。上記のＴuddenb
ram らによって示されるように、線型勾配で良好に行な
えるが、この点は、この発明の目的を達成するためには
必要ない。固定された濃度のカルシウム・イオンを有す
る溶液が、きわめて適切である。かくて、濃縮液からえ
られるVIII：Ｃが溶離されているときは、塩化カルシウ
ムに関して０．２５〜０．５Ｍ、好ましくは０．３５Ｍ
のVIII：Ｃ緩衝液が、流速４５０〜７５０ml／時、好ま
しくは６００ml／時として有利に使用される。VIII：Ｃ
が豚の血漿からえられるときは、溶離は、塩化カルシウ
ム濃度０．３５〜０．７Ｍの間、好ましくは０．５Ｍの
VIII：Ｃ緩衝溶液で、かつ流速１０〜３０ml／時の間、
好ましくは２０ml／時で行なわれる。１２mlおよび３ml
のフラクションを、それぞれ濃縮液および豚の血漿から
えられるVIII：Ｃ用に集める。少なくとも１．０単位／
mlのVIII：Ｃ活性を含むフラクションをプールし、そし
てプールの総容量と活性を測定する。
【００３４】VIII：Ｃプールを最初に圧力限外濾過のよ
うな標準的な方法によって１０〜２０mlに濃縮する。こ
の目的に、５０psi の窒素圧の下におけるＹＭ−１０メ
ンブレンを含むＡmicon 攪拌セルが良好に作用すること
がわかった。窒素圧を解放してから、３０分間ゆっくり
と撹拌を続け、そして濃縮プールの容積と活性を測定す
る。プールは、温度が４℃に維持されるかぎり、短期
間、例えは、一晩中保存できる。
【００３５】上記した免疫吸着カラムは、流速約０．５
〜１リットル／時で３Ｍのチオシアン酸ナトリウム水溶
液２床容量で処理してVIII：ＲＰを溶離すると再生でき
ることに注目してよい。
【００３６】Ｄ． 精製VIII：Ｃの濃縮 免疫吸着カラムによるVIII：ＲＰからの分離によって回
収されたVIII：Ｃは、高度に精製されているが、治療上
に利用するためには、未だ稀薄すぎる。これ以上の濃縮
は、以下の方法で調製され、かつ使用されるアミノヘキ
シル・アガロース・カラムを用いて行なわれる。
【００３７】（i ） アミノヘキシル・アガロース・カ
ラムの調製および（または）調整 アミノヘキシル・アガロースは、１．６−ジアミノヘキ
サンと反応したアガロースであって、そのそれぞれに端
末アミノ基をもつ多数の６炭素原子鎖をもつアガロース
樹脂を生ずる。このアガロース樹脂は、上記Ａusten に
よって記述された方法にしたがって調製でき、または供
給業者から入手できる。この発明で、好首尾に使用され
た上記物質の１つは、ＡＨ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂ
（ニュージャージ州Ｐiscataway 市Ｐharmacia Ｆine
Ｃhemicals社製品の商標名）の名称のもとで入手でき
る。
【００３８】調製したものであれ、購入したものであ
れ、樹脂は、使用前に調整しなければならない。これは
以下のようにして行なわれる。容積、量、および寸法は
濃縮対象物質の量に比例して調整される。
【００３９】約１g のアミノヘキシル・アガロース（Ａ
Ｈ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂ）を、焼結ガラス・フィ
ルタ漏斗に入れ、撹拌しながら、少なくとも２００mlの
０．５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄する。つぎに樹脂をVII
I：Ｃ緩衝液で平衡化させて、約０．９cm径のカラムに
充填する。ここで考慮される使用の型には、流れアダプ
タ付きのＢio−Ｒad Ｅconoカラムが極めて適当である
ことがわかった。充填カラムの床容量は約４mlである。
【００４０】（ii） アミノヘキシル・アガロース・カ
ラムへの適用とその使用法 上記のようにして調製した濃縮プールを、前節で述べた
樹脂量およびカラム寸法を使用する場合、最終濃度１０
０〜２００mlまで、VIII：Ｃ緩衝液で１：１０に希釈す
る。希釈プールを、流速２００ml／時でカラムに適用す
る。
【００４１】つぎにカラムを、好ましくは塩化カルシウ
ムからのカルシウム・イオンを含むVIII：Ｃ緩衝液で洗
浄する。溶液は、カルシウムイオンに関して、０．０１
Ｍ〜０．０３Ｍの間、好ましくは０．０２５Ｍとする。
【００４２】濃縮VIII：Ｃの溶離は、先の洗浄段階で用
いたより高濃度のカルシウム・イオンを含む含むVIII：
Ｃ緩衝液により、流速５〜２０ml／時、好ましくは１０
ml／時で行なう。この場合もまた、塩化カルシウムは、
０．２５〜０．５Ｍの間、好ましくは０．３Ｍ濃度の好
ましいカルシウム・イオン源である。１ml容積のフラク
ションを集め、そして下記にしたがって検定する。集め
たフラクションは、４℃でまたは凍結して保存できる。
豚の血漿源からえられたVIII：Ｃの調製物は、貯蔵前に
５〜１０％の人間血清アルブミンにより安定化される。
【００４３】検定は、フラクションを、必要に応じてVI
II：Ｃ緩衝液で希釈し、そしてさらに基質へ添加する前
に、フラクションを検定緩衝液で１：１００に希釈して
行なう。標準部分トロンボプラスチン時間検定法が用い
られる。
【００４４】緩衝液の組成は以下のとうりである。
【００４５】燐酸塩緩衝塩水溶液 燐酸ナトリウム１．６ｇ 一塩基性−水和物 燐酸ナトリウム８．４ｇ 二塩基性無水物 塩化ナトリウム６１．４ｇ 水で７リットルとする。
【００４６】緩衝液のＰＨは７．２である。
【００４７】VIII：Ｃ緩衝液 ml ０．０２Ｍ イミダゾール ml ０．１５Ｍ 塩化ナトリウム ml ０．１０Ｍ リジン ml ０．０２％ アジ化ナトリウム 緩衝液のＰＨは、濃塩酸で６．８に調整する。
【００４８】表I および表IIに挙げるデータは、上記し
たこの発明にしたがってえられた代表的なデータであ
る。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】好ましい実施態様のみが、この明細書にと
くに例示され、かつ記述されているが、この発明の多数
の変形および変更が、上記の教示に照して、またこの発
明の精神と意図する範囲から離れることなく、付記のク
レームの範囲内で、可能であることが認められるであろ
う。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カーラル アン フルチャー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037ラ ジョラ ラ ジョラ ボールエ バード 7543 (56)参考文献 Ｊ．ＬＡＢ．ＣＬＩＮ．ＭＥＤ．93．40 −53（1979) ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮ ＶＯＬ．62, ＳＵＰＰＬ．▲ＩＩＩ▼ 第▲ＩＩＩ▼ −106頁 ＡＢＳＴＲＡＣＴ ＮＯ．395 （1980) ＢＬＯＯＤ 58（３），530−536 （1981)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基質に結合されたヒトのＶＩＩ
    Ｉ：ＲＰに特異な単クローン抗体からなる、ＶＩＩＩ：
    Ｃ／ＶＩＩＩ：ＲＰからＶＩＩ：Ｃを分離して精製する
    ための改良免疫吸着剤。
  2. 【請求項２】 基質が固体粒子である請求項１に記載の
    吸着剤。
  3. 【請求項３】 固体粒子が樹脂からなる請求項２に記載
    の吸着剤。
  4. 【請求項４】 樹脂がアガロースからなる請求項３に記
    載の吸着剤。
  5. 【請求項５】 アガロースが架橋したアガロースである
    請求項４に記載の吸着剤。
  6. 【請求項６】 アガロースリットル当り単クローン抗体
    ３ないし４ｇの結合密度を有する請求項５に記載の吸着
    剤。
  7. 【請求項７】 単クローン抗体は、VIII：Ｃの溶離中VI
    II：ＲＰに結合されたままである請求項１に記載の吸着
    剤。
  8. 【請求項８】 溶離が塩水溶液で行なわれる請求項７に
    記載の吸着剤。
  9. 【請求項９】 塩水溶液がカルシウムイオンを含む請求
    項８に記載の吸着剤。
  10. 【請求項１０】 塩水溶液が塩化カルシウム溶液である
    請求項９に記載の吸着剤。
  11. 【請求項１１】 塩化カルシウムの濃度が０．２５Ｍな
    いし約０．５Ｍである請求項１０に記載の吸着剤。
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