JPH08119997A - フォンウィルブランド因子の高分子および低分子フラクション - Google Patents
フォンウィルブランド因子の高分子および低分子フラクションInfo
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- JPH08119997A JPH08119997A JP7257467A JP25746795A JPH08119997A JP H08119997 A JPH08119997 A JP H08119997A JP 7257467 A JP7257467 A JP 7257467A JP 25746795 A JP25746795 A JP 25746795A JP H08119997 A JPH08119997 A JP H08119997A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【課題】 フォンウィルブランド因子を高分子および低
分子フラクションに分別する方法を提供すること。 【解決手段】 ｖＷＦを親和性支持体に結合させ、次い
で異なった塩濃度で溶出させることを特徴とする、ｖＷ
Ｆを高分子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦに分別する方法。
分子フラクションに分別する方法を提供すること。 【解決手段】 ｖＷＦを親和性支持体に結合させ、次い
で異なった塩濃度で溶出させることを特徴とする、ｖＷ
Ｆを高分子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦに分別する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はフォンウィルブラン
ド因子を高分子および低分子フラクションに分別する方
法に関する。
ド因子を高分子および低分子フラクションに分別する方
法に関する。
【０００２】更に、本発明はフォンウィルブランド因子
(vWF)分子の低分子フラクション、フォンウィルブラン
ド因子分子の高分子フラクションおよび、低分子および
高分子フラクションのｖＷＦ分子の混合物に関する。
(vWF)分子の低分子フラクション、フォンウィルブラン
ド因子分子の高分子フラクションおよび、低分子および
高分子フラクションのｖＷＦ分子の混合物に関する。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】直接
および間接的機能として、通常、血液凝固の進行が、フ
ォンウィルブランド因子に帰する。第VIII因子に複合体
として結合する。この複合体は第VIII因子の安定化に働
く。安定化した第VIII因子は、次いで第Ｘ因子の活性化
の本質的コファクター機能を有する。加えて、フォンウ
ィルブランド因子は、傷害血管への血小板の集合を媒介
することにより、血液凝固に直接作用する。
および間接的機能として、通常、血液凝固の進行が、フ
ォンウィルブランド因子に帰する。第VIII因子に複合体
として結合する。この複合体は第VIII因子の安定化に働
く。安定化した第VIII因子は、次いで第Ｘ因子の活性化
の本質的コファクター機能を有する。加えて、フォンウ
ィルブランド因子は、傷害血管への血小板の集合を媒介
することにより、血液凝固に直接作用する。
【０００４】血漿において、ｖＷＦは５−１０mg／ｌの
濃度で、第VIII因子との非共有複合体の形で循環する。
ｖＷＦは、ヒト体内の異なった細胞で形成され、後に循
環へと遊離するグリコプロテインである。更に、約２２
０,０００(ｖＷＦモノマー)の分子量のポリペプチド鎖
から開始して、約５５０,0００分子量のｖＷＦダイマー
(主要ダイマー)が、細胞内で数個の硫黄架橋の形成によ
り形成される。次いで、約２０,０００,０００まで増加
した分子量のｖＷＦの更なるポリマーが、ｖＷＦダイマ
ーから、結合により形成される。
濃度で、第VIII因子との非共有複合体の形で循環する。
ｖＷＦは、ヒト体内の異なった細胞で形成され、後に循
環へと遊離するグリコプロテインである。更に、約２２
０,０００(ｖＷＦモノマー)の分子量のポリペプチド鎖
から開始して、約５５０,0００分子量のｖＷＦダイマー
(主要ダイマー)が、細胞内で数個の硫黄架橋の形成によ
り形成される。次いで、約２０,０００,０００まで増加
した分子量のｖＷＦの更なるポリマーが、ｖＷＦダイマ
ーから、結合により形成される。
【０００５】フォンウィルブランド因子の不足−または
過−形成に起因する幾つかの臨床像がある。したがっ
て、例えばｖＷＦの過形成は、血栓の傾向を高め、一方
ｖＷＦの低供給は出血傾向を高め、または長い出血時間
をもたらす。
過−形成に起因する幾つかの臨床像がある。したがっ
て、例えばｖＷＦの過形成は、血栓の傾向を高め、一方
ｖＷＦの低供給は出血傾向を高め、または長い出血時間
をもたらす。
【０００６】フォンウィルブランド症候群は、いくつか
の形でそれ自身明示できる。全ての形は、ｖＷＦ機能の
不完全な欠失またはｖＷＦの多量体組成の異常なスペク
トルのいずれかに基づく増加した出血時間により区別さ
れる。多量体形成が減少した、および、低分子ｖＷＦ分
子がほとんど存在しないフォンウィルブランド病の形
が、それにより診断される。他の形は高および低分子ｖ
ＷＦ分子を証明するが、その濃度および／または相互の
比が健康なヒトと比較して非常に減少しているおよび／
または変化している。
の形でそれ自身明示できる。全ての形は、ｖＷＦ機能の
不完全な欠失またはｖＷＦの多量体組成の異常なスペク
トルのいずれかに基づく増加した出血時間により区別さ
れる。多量体形成が減少した、および、低分子ｖＷＦ分
子がほとんど存在しないフォンウィルブランド病の形
が、それにより診断される。他の形は高および低分子ｖ
ＷＦ分子を証明するが、その濃度および／または相互の
比が健康なヒトと比較して非常に減少しているおよび／
または変化している。
【０００７】ｖＷＦの欠失は、上記のようにｖＷＦが機
能的第VIII因子の本質的成分であるため、血友病Ａを導
くことができる。これらの場合、第VIII因子の半減期
は、血液凝固カスケード(cascade)におけるその特異的
機能が遂行できないように減少している。
能的第VIII因子の本質的成分であるため、血友病Ａを導
くことができる。これらの場合、第VIII因子の半減期
は、血液凝固カスケード(cascade)におけるその特異的
機能が遂行できないように減少している。
【０００８】ｖＷＦの欠失に起因するフォンウィルブラ
ンド症候群の全ての形および血友病の形は、現在まで、
ｖＷＦ−第VIII因子複合体または濃縮ｖＷＦのいずれか
を含む血漿濃縮物の静脈点滴による不足ｖＷＦの回復に
より処置していた。第VIII因子の投与は両方の疾病の場
合必要でないという一つの点にもかかわらず、第VIII因
子からｖＷＦを分離することは技術的に非常に困難で不
可能である。
ンド症候群の全ての形および血友病の形は、現在まで、
ｖＷＦ−第VIII因子複合体または濃縮ｖＷＦのいずれか
を含む血漿濃縮物の静脈点滴による不足ｖＷＦの回復に
より処置していた。第VIII因子の投与は両方の疾病の場
合必要でないという一つの点にもかかわらず、第VIII因
子からｖＷＦを分離することは技術的に非常に困難で不
可能である。
【０００９】一方で高分子ｖＷＦ分子および他方で低分
子ｖＷＦの正確な機能を確立するために、これらのフラ
クションを濃縮形で単離するために方法が模索されてい
る。ワグナー、Ｄ．Ｄ．ら(J.Cell.Biol.101:112,1985)
は、インビトロでモネンシンを加えることにより多量体
形成を阻止し、別の実験から、ｖＷＦの低分子形は機能
的でないと結論付けている。一方、セノグレス、Ｓ．
Ｅ．ら(J.Biol.Chem.258:12327,1983)は、レストシチン
媒介血小板凝集において、ｖＷＦの高分子および低分子
の形に機能的差異の無いことを発見している。彼らは高
分子ｖＷＦ分子の硫黄架橋を還元することにより、低分
子形を得ている。アイハラ、Ｍ．ら(Tohoku J.Exp.Med.
153:169,1985)は、タイプIIaのフォンウィルブランド症
候群の患者から、ｖＷＦのアフィニティークロマトグラ
フィーのコラーゲンへの低い結合能力を観察した。フォ
ンウィルブランド症候群のこの型は、ｖＷＦの高分子量
分子の欠失により特徴付けられる。
子ｖＷＦの正確な機能を確立するために、これらのフラ
クションを濃縮形で単離するために方法が模索されてい
る。ワグナー、Ｄ．Ｄ．ら(J.Cell.Biol.101:112,1985)
は、インビトロでモネンシンを加えることにより多量体
形成を阻止し、別の実験から、ｖＷＦの低分子形は機能
的でないと結論付けている。一方、セノグレス、Ｓ．
Ｅ．ら(J.Biol.Chem.258:12327,1983)は、レストシチン
媒介血小板凝集において、ｖＷＦの高分子および低分子
の形に機能的差異の無いことを発見している。彼らは高
分子ｖＷＦ分子の硫黄架橋を還元することにより、低分
子形を得ている。アイハラ、Ｍ．ら(Tohoku J.Exp.Med.
153:169,1985)は、タイプIIaのフォンウィルブランド症
候群の患者から、ｖＷＦのアフィニティークロマトグラ
フィーのコラーゲンへの低い結合能力を観察した。フォ
ンウィルブランド症候群のこの型は、ｖＷＦの高分子量
分子の欠失により特徴付けられる。
【００１０】文献において、両方の形の量的比率につい
てなし得る記載のようなフォンウィルブランド因子の高
分子形および低分子形の分析的分析を記載した多くの方
法がある。例として、バイロッドら、Thrombosis Res.6
6:745、1992を記載しなければならない。しかしながら、
低分子および高分子形の分離の調製法は、今日まで記載
されていない。
てなし得る記載のようなフォンウィルブランド因子の高
分子形および低分子形の分析的分析を記載した多くの方
法がある。例として、バイロッドら、Thrombosis Res.6
6:745、1992を記載しなければならない。しかしながら、
低分子および高分子形の分離の調製法は、今日まで記載
されていない。
【００１１】本発明の目的は、フォンウィルブランド因
子(ｖＷＦ)のフォンウィルブランド因子の低分子および
高分子フラクションへの分画の調製法の開発である。
子(ｖＷＦ)のフォンウィルブランド因子の低分子および
高分子フラクションへの分画の調製法の開発である。
【００１２】この目的は、ｖＷＦが親和性支持体に結合
し、次いで異なった塩濃度で溶出することを特徴とす
る、ｖＷＦ、特に組換フォンウィルブランド因子の高分
子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦへの分離法により達成され
た。好ましい実施態様は、従属請求項２から１３に記載
する。
し、次いで異なった塩濃度で溶出することを特徴とす
る、ｖＷＦ、特に組換フォンウィルブランド因子の高分
子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦへの分離法により達成され
た。好ましい実施態様は、従属請求項２から１３に記載
する。
【００１３】本発明の特に好ましい実施態様において、
分離はＣａ2+−フリー緩衝系で行う。本方法において、
特に高い生理活性を有する高分子ｖＷＦフラクションま
たは高分子ｒＶＷＦフラクションが、良好な収率で得ら
れる。
分離はＣａ2+−フリー緩衝系で行う。本方法において、
特に高い生理活性を有する高分子ｖＷＦフラクションま
たは高分子ｒＶＷＦフラクションが、良好な収率で得ら
れる。
【００１４】本発明の別の対象は、ダイマーおよびテト
ラマーを含み、ダイマーおよびテトラマーが同一サブユ
ニットを構成する、ｖＷＦ分子の低分子フラクションで
ある。加えて、本発明は、請求項１から１３のいずれか
に記載の方法により得ることができるｖＷＦ分子の低分
子フラクションに関する。好ましい実施態様は、従属請
求項１６から２０に記載する。
ラマーを含み、ダイマーおよびテトラマーが同一サブユ
ニットを構成する、ｖＷＦ分子の低分子フラクションで
ある。加えて、本発明は、請求項１から１３のいずれか
に記載の方法により得ることができるｖＷＦ分子の低分
子フラクションに関する。好ましい実施態様は、従属請
求項１６から２０に記載する。
【００１５】本発明は、高分子および低分子ｖＷＦ分子
の生理的混合物と比較して、血小板凝固において蛋白質
μｇ当たりの活性が少なくとも５０％、好ましくは６０
％改善されるｖＷＦ分子の高分子フラクションに関す
る。加えて、本発明は請求項１から１３のいずれかに記
載の方法により得ることができるｖＷＦ分子の高分子フ
ラクションに関する。本発明により、蛋白μg当たりの
活性は更に増加することができる。高分子フラクション
の好ましい実施態様は、従属請求項２３および２４に記
載する。
の生理的混合物と比較して、血小板凝固において蛋白質
μｇ当たりの活性が少なくとも５０％、好ましくは６０
％改善されるｖＷＦ分子の高分子フラクションに関す
る。加えて、本発明は請求項１から１３のいずれかに記
載の方法により得ることができるｖＷＦ分子の高分子フ
ラクションに関する。本発明により、蛋白μg当たりの
活性は更に増加することができる。高分子フラクション
の好ましい実施態様は、従属請求項２３および２４に記
載する。
【００１６】本発明は更に、請求項１４から２０のいず
れかに記載のｖＷＦ分子の低分子フラクションおよび請
求項２１から２４のいずれかに記載のｖＷＦ分子の高分
子フラクションの任意の混合比の混合物に関する。好ま
しい実施態様は、請求項２６に記載する。
れかに記載のｖＷＦ分子の低分子フラクションおよび請
求項２１から２４のいずれかに記載のｖＷＦ分子の高分
子フラクションの任意の混合比の混合物に関する。好ま
しい実施態様は、請求項２６に記載する。
【００１７】本発明は、また血友病Ａまたはフォンウィ
ルブランド病の他の形の処置のための、ｖＷＦ分子の低
分子フラクションまたはｖＷＦ分子の高分子フラクショ
ンまたは任意の混合比のこれらの混合物の使用に関す
る。
ルブランド病の他の形の処置のための、ｖＷＦ分子の低
分子フラクションまたはｖＷＦ分子の高分子フラクショ
ンまたは任意の混合比のこれらの混合物の使用に関す
る。
【００１８】先行文献の観点から、調製分離法により得
ることができるフラクションおよび／またはその混同物
が上記疾病の処置に好適であることは予測できなかっ
た。
ることができるフラクションおよび／またはその混同物
が上記疾病の処置に好適であることは予測できなかっ
た。
【００１９】本発明の対象は、また、ｖＷＦ分子の低分
子フラクションまたはｖＷＦ分子の高分子フラクション
またはこれらの任意の比の混合物を、生理学的に許容可
能な担体中に含むことを特徴とする、医薬組成物であ
る。その好ましい実施態様は従属請求項２９に記載す
る。
子フラクションまたはｖＷＦ分子の高分子フラクション
またはこれらの任意の比の混合物を、生理学的に許容可
能な担体中に含むことを特徴とする、医薬組成物であ
る。その好ましい実施態様は従属請求項２９に記載す
る。
【００２０】本発明の方法は、血漿性および組換ｖＷＦ
(ｒＶＷＦ)について同様の方法で好適である。高分子お
よび低分子フラクションを分別するための出発物質は、
濃縮ｖＷＦ血漿フラクションまたは、そこから組換ｖＷ
Ｆが単離され、前精製された動物細胞の発酵後の無細胞
培養培地のいずれかである。分別に使用するｖＷＦは、
任意の既知の方法により前精製できる。
(ｒＶＷＦ)について同様の方法で好適である。高分子お
よび低分子フラクションを分別するための出発物質は、
濃縮ｖＷＦ血漿フラクションまたは、そこから組換ｖＷ
Ｆが単離され、前精製された動物細胞の発酵後の無細胞
培養培地のいずれかである。分別に使用するｖＷＦは、
任意の既知の方法により前精製できる。
【００２１】ｖＷＦ、および特にｒＶＷＦの高分子およ
び低分子フラクションへの分別のための本方法におい
て、ｖＷＦは親和性支持体に結合し、次いで異なった塩
濃度で溶出する。特に高い収率で得るために、分別はＣ
ａ2+−フリー緩衝系で行う。
び低分子フラクションへの分別のための本方法におい
て、ｖＷＦは親和性支持体に結合し、次いで異なった塩
濃度で溶出する。特に高い収率で得るために、分別はＣ
ａ2+−フリー緩衝系で行う。
【００２２】低分子ｖＷＦフラクションは、高分子ｖＷ
Ｆより低い塩濃度で溶出できる。可溶性一および二価塩
は、溶出に使用可能である。カルシウム塩は溶出に好適
ではない。好ましい実施態様において、ｖＷＦは塩濃度
＜１５０mＭで親和性支持体に結合する。次いで、塩濃
度１５０から２５０mＭの間、特に１６０mＭでｖＷＦの
低分子集合体が溶出し、その後、塩濃度＞２５０mＭ、
特に＞２７０mＭでｖＷＦの高分子集合体が溶出する
Ｆより低い塩濃度で溶出できる。可溶性一および二価塩
は、溶出に使用可能である。カルシウム塩は溶出に好適
ではない。好ましい実施態様において、ｖＷＦは塩濃度
＜１５０mＭで親和性支持体に結合する。次いで、塩濃
度１５０から２５０mＭの間、特に１６０mＭでｖＷＦの
低分子集合体が溶出し、その後、塩濃度＞２５０mＭ、
特に＞２７０mＭでｖＷＦの高分子集合体が溶出する
【００２３】ＮａＣｌは塩として好ましい。カルシウム
塩は好適でない。本発明の方法は、好ましくはヘパリン
親和性カラムで行う。ヘパリンが結合できる任意の支持
体がアフィニティークロマトグラフィーに使用できる。
例えば、ＡＦ−ヘパリントーヨーパール(AF-heparin To
yopearl)(登録商標)(メタクリル酸を基本にした合成、大
きい穴の、親水性ポリマー)(トソハース(Tosohaas))、
ヘパリンＥＭＤ−フラクトゲル(EMD-Fraktogel)(登録商
標)(エチレングリコール、メタクリル酸およびジメチル
アクリル酸を基本にした合成、親水性ポリマー)(メルク
(Merck))またはヘパリンセファロースファーストフロー
(Heparin SepharoseFast Flow)(登録商標)(天然デキス
トランおよび／またはアガロース誘導体を含む)(ファル
マシア(Pharmacia))は、非常に好適であることが証明さ
れている。
塩は好適でない。本発明の方法は、好ましくはヘパリン
親和性カラムで行う。ヘパリンが結合できる任意の支持
体がアフィニティークロマトグラフィーに使用できる。
例えば、ＡＦ−ヘパリントーヨーパール(AF-heparin To
yopearl)(登録商標)(メタクリル酸を基本にした合成、大
きい穴の、親水性ポリマー)(トソハース(Tosohaas))、
ヘパリンＥＭＤ−フラクトゲル(EMD-Fraktogel)(登録商
標)(エチレングリコール、メタクリル酸およびジメチル
アクリル酸を基本にした合成、親水性ポリマー)(メルク
(Merck))またはヘパリンセファロースファーストフロー
(Heparin SepharoseFast Flow)(登録商標)(天然デキス
トランおよび／またはアガロース誘導体を含む)(ファル
マシア(Pharmacia))は、非常に好適であることが証明さ
れている。
【００２４】アフィニティークロマトグラフィーは、好
ましくは６.０から８.５のｐＨ範囲、特に７.４のｐＨ
値で行う。本発明の方法において、緩衝物質、特にトリ
ス／ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液
および所望により塩を含に、好ましくは安定化剤、アミ
ノ酸および他の添加剤を含まない緩衝液を緩衝系として
使用する。特に良好な低分子および高分子ｖＷＦ蛋白質
集合体の分別は、Ｃａ2+−フリー緩衝系中でＥＤＴＡで
処理したｖＷＦ溶液で達成できることが示された。した
がって、本方法において、特に高い生理活性を有する高
分子ｖＷＦフラクションまたは高分子ｒｖＷＦフラクシ
ョンを、また高い収率でまた得ることができる。
ましくは６.０から８.５のｐＨ範囲、特に７.４のｐＨ
値で行う。本発明の方法において、緩衝物質、特にトリ
ス／ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液
および所望により塩を含に、好ましくは安定化剤、アミ
ノ酸および他の添加剤を含まない緩衝液を緩衝系として
使用する。特に良好な低分子および高分子ｖＷＦ蛋白質
集合体の分別は、Ｃａ2+−フリー緩衝系中でＥＤＴＡで
処理したｖＷＦ溶液で達成できることが示された。した
がって、本方法において、特に高い生理活性を有する高
分子ｖＷＦフラクションまたは高分子ｒｖＷＦフラクシ
ョンを、また高い収率でまた得ることができる。
【００２５】本発明の方法において、形質転換細胞の無
細胞培養上清から濃縮した組換ｖＷＦが使用するのに好
ましい。本発明のｖＷＦの高分子および低分子フラクシ
ョンへの分別の方法により、低分子および高分子ｖＷＦ
は、能率的で簡単な方法により得ることができる。した
がって、この分別方法により、血友病Ａおよびフォンウ
ィルブランド病の他の形の処置のために非常に好適な特
に生理的に活性なｖＷＦの高分子または低分子フラクシ
ョンが良好な収率で産生できる。
細胞培養上清から濃縮した組換ｖＷＦが使用するのに好
ましい。本発明のｖＷＦの高分子および低分子フラクシ
ョンへの分別の方法により、低分子および高分子ｖＷＦ
は、能率的で簡単な方法により得ることができる。した
がって、この分別方法により、血友病Ａおよびフォンウ
ィルブランド病の他の形の処置のために非常に好適な特
に生理的に活性なｖＷＦの高分子または低分子フラクシ
ョンが良好な収率で産生できる。
【００２６】本発明の好ましい実施態様において、精製
ｖＷＦは高分子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦに分別する。
分別に使用するｖＷＦは、任意の既知の方法により前精
製できる。
ｖＷＦは高分子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦに分別する。
分別に使用するｖＷＦは、任意の既知の方法により前精
製できる。
【００２７】特に好ましくは、精製フォンウィルブラン
ド因子は、第４級アミノ型のアニオン交換器のアニオン
交換クロマトグラフィーならびに緩衝物質および所望に
より塩を含む緩衝液中の非動化ヘパリンのアフィニティ
ークロマトグラフィーにより血漿性フォンウィルブラン
ド因子をクロマトグラフィー的に精製する工程を含む方
法により得ることができる。
ド因子は、第４級アミノ型のアニオン交換器のアニオン
交換クロマトグラフィーならびに緩衝物質および所望に
より塩を含む緩衝液中の非動化ヘパリンのアフィニティ
ークロマトグラフィーにより血漿性フォンウィルブラン
ド因子をクロマトグラフィー的に精製する工程を含む方
法により得ることができる。
【００２８】更に好ましい実施態様において、精製フォ
ンウィルブランド因子は、第４級アミノ型のアニオン交
換器のアニオン交換クロマトグラフィーならびに緩衝物
質および所望により塩化ナトリウムを含む緩衝液中の非
動化ヘパリンのアフィニティークロマトグラフィーによ
り組み換えフォンウィルブランド因子をクロマトグラフ
ィー的に精製する工程を含む方法により得ることができ
る。
ンウィルブランド因子は、第４級アミノ型のアニオン交
換器のアニオン交換クロマトグラフィーならびに緩衝物
質および所望により塩化ナトリウムを含む緩衝液中の非
動化ヘパリンのアフィニティークロマトグラフィーによ
り組み換えフォンウィルブランド因子をクロマトグラフ
ィー的に精製する工程を含む方法により得ることができ
る。
【００２９】特に好ましくは、ｒｖＷＦ濃縮物を形質転
換細胞の無細胞培養上清から濃縮する方法により、精製
フォンウィルブランド因子を得ることができる。
換細胞の無細胞培養上清から濃縮する方法により、精製
フォンウィルブランド因子を得ることができる。
【００３０】ｖＷＦの精製において、安定化剤、アミノ
酸および他の添加剤を含まない緩衝系が、緩衝溶液とし
て使用するのに特に好ましい。アニオン交換クロマトグ
ラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフ
ィーは、好ましくは６.０から８.５のｐＨ範囲、更に好
ましくは７.４のｐＨ値で行う。
酸および他の添加剤を含まない緩衝系が、緩衝溶液とし
て使用するのに特に好ましい。アニオン交換クロマトグ
ラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフ
ィーは、好ましくは６.０から８.５のｐＨ範囲、更に好
ましくは７.４のｐＨ値で行う。
【００３１】アニオン交換クロマトグラフィー中のアニ
オン交換器およびアフィニティークロマトグラフィー中
の非動化ヘパリンに結合するフォンウィルブランド因子
は、塩濃度を上昇させて溶出できる。
オン交換器およびアフィニティークロマトグラフィー中
の非動化ヘパリンに結合するフォンウィルブランド因子
は、塩濃度を上昇させて溶出できる。
【００３２】触手構造のフラクトゲル(Fraktogel)の第
４級アニオン交換器、特にＥＭＤ−ＴＭＡＥ−フラクト
ゲルが好ましい。精製法において、アニオン交換器のｖ
ＷＦは、好ましくは塩濃度＜２７０mＭＮａＣｌで結合
し、塩濃度＞２７０mＭ ＮａＣｌ、好ましくは＞２８
０mＭＮａＣｌで溶出する。
４級アニオン交換器、特にＥＭＤ−ＴＭＡＥ−フラクト
ゲルが好ましい。精製法において、アニオン交換器のｖ
ＷＦは、好ましくは塩濃度＜２７０mＭＮａＣｌで結合
し、塩濃度＞２７０mＭ ＮａＣｌ、好ましくは＞２８
０mＭＮａＣｌで溶出する。
【００３３】ｖＷＦの精製において、アフィニティーク
ロマトグラフィーは好ましくはそれにヘパリンが結合し
た支持体で行い、好ましくはＡＦ−ヘパリントーヨーパ
ール(登録商標)(トソハース)であり、ヘパリンＥＭＤ−
フラクトゲル(登録商標)(メルク)およびヘパリンセファ
ロースファーストフロー(登録商標)も同様に好適であ
る。
ロマトグラフィーは好ましくはそれにヘパリンが結合し
た支持体で行い、好ましくはＡＦ−ヘパリントーヨーパ
ール(登録商標)(トソハース)であり、ヘパリンＥＭＤ−
フラクトゲル(登録商標)(メルク)およびヘパリンセファ
ロースファーストフロー(登録商標)も同様に好適であ
る。
【００３４】好ましい実施態様において、精製フォンウ
ィルブランド因子は、アニオン交換クロマトグラフィー
で前精製したｖＷＦを、塩濃度＜１５０mＭ ＮａＣｌ
で非動化ヘパリンに結合させ、塩濃度＞１５０mＭ Ｎ
ａＣｌ、好ましくは２００から３００ｍＭ ＮａＣｌ、
更に好ましくは１６０から２７０mＭ ＮａＣｌで溶出
する方法により得ることができる。
ィルブランド因子は、アニオン交換クロマトグラフィー
で前精製したｖＷＦを、塩濃度＜１５０mＭ ＮａＣｌ
で非動化ヘパリンに結合させ、塩濃度＞１５０mＭ Ｎ
ａＣｌ、好ましくは２００から３００ｍＭ ＮａＣｌ、
更に好ましくは１６０から２７０mＭ ＮａＣｌで溶出
する方法により得ることができる。
【００３５】あらかじめ精製した濃縮物を、高分子およ
び低分子ｖＷＦの分別の出発物質として使用するのは有
利である。加えて、クロマトグラフィー分別法は、更に
精製効果をもたらす。
び低分子ｖＷＦの分別の出発物質として使用するのは有
利である。加えて、クロマトグラフィー分別法は、更に
精製効果をもたらす。
【００３６】本発明の分別法により得た高分子および低
分子フラクションおよび任意の混合比の両方のフラクシ
ョンの混合物は、生理的に活性であり、治療目的で使用
できる。ｖＷＦ分子の低分子フラクションは、同一ｖＷ
Ｆサブユニットを構成するダイマーおよびテトラマーを
主に含むことを特徴とする。
分子フラクションおよび任意の混合比の両方のフラクシ
ョンの混合物は、生理的に活性であり、治療目的で使用
できる。ｖＷＦ分子の低分子フラクションは、同一ｖＷ
Ｆサブユニットを構成するダイマーおよびテトラマーを
主に含むことを特徴とする。
【００３７】低分子フラクション中のダイマーとテトラ
マーの部分は、vＷＦの生理的組成物のものより高い。
驚くべきことに、組み換えvＷＦの低分子フラクション
は同一vＷＦサブユニットから成り、一方、血漿vＷＦは
異なるサブユニットを有するダイマーとテトラマーから
成ることが判った。vＷＦ分子の低分子フラクション
は、請求項１から３のいずれかの方法に従って得ること
ができる。
マーの部分は、vＷＦの生理的組成物のものより高い。
驚くべきことに、組み換えvＷＦの低分子フラクション
は同一vＷＦサブユニットから成り、一方、血漿vＷＦは
異なるサブユニットを有するダイマーとテトラマーから
成ることが判った。vＷＦ分子の低分子フラクション
は、請求項１から３のいずれかの方法に従って得ること
ができる。
【００３８】好ましい実施態様では、vＷＦ分子の低分
子フラクションは、少なくとも８３％のダイマーと最大
１６％のテトラマーおよび最大１％の高ポリマーを含
む。低分子フラクションは、形血小板凝集を有せず、第
VIII因子を結合し、第VIII因子の安定化に貢献し、そし
て第VIII因子の貯蔵安定に明確に影響する。
子フラクションは、少なくとも８３％のダイマーと最大
１６％のテトラマーおよび最大１％の高ポリマーを含
む。低分子フラクションは、形血小板凝集を有せず、第
VIII因子を結合し、第VIII因子の安定化に貢献し、そし
て第VIII因子の貯蔵安定に明確に影響する。
【００３９】vＷＦ分子の低分子フラクションは、好ま
しくは組み換えvＷＦから成る。 vＷＦ分子の高分子フラクションは、高分子および低分
子vＷＦ分子の生理的混合物と比べて、血液凝固におい
てタンパク質μg当たり少なくとも５０％、好ましくは
６０％改善された活性を有する。
しくは組み換えvＷＦから成る。 vＷＦ分子の高分子フラクションは、高分子および低分
子vＷＦ分子の生理的混合物と比べて、血液凝固におい
てタンパク質μg当たり少なくとも５０％、好ましくは
６０％改善された活性を有する。
【００４０】vＷＦ分子の高分子フラクションは、請求
項１から１３のいずれかの方法に従って得ることができ
る。組み換えvＷＦの高分子フラクションが、同一vＷＦ
サブユニットから成るマルチマーを含み、一方、血漿v
ＷＦのフラクションは異なるサブユニットを伴うマルチ
マーの混合物から成ることが驚くべきことに判った。v
ＷＦ分子の高分子フラクションは、好ましくは組み換え
vＷＦから成る。
項１から１３のいずれかの方法に従って得ることができ
る。組み換えvＷＦの高分子フラクションが、同一vＷＦ
サブユニットから成るマルチマーを含み、一方、血漿v
ＷＦのフラクションは異なるサブユニットを伴うマルチ
マーの混合物から成ることが驚くべきことに判った。v
ＷＦ分子の高分子フラクションは、好ましくは組み換え
vＷＦから成る。
【００４１】驚くべきことに、組み換えvＷＦの低分子
および高分子フラクションは、血漿vＷＦの対応するフ
ラクションに比べて第VIII因子に対する潜在的高結合能
力を有することが判った。従って、組み換えvＷＦのフ
ラクションは、血漿フラクションよりも第VIII因子とよ
り効果的に結合する。
および高分子フラクションは、血漿vＷＦの対応するフ
ラクションに比べて第VIII因子に対する潜在的高結合能
力を有することが判った。従って、組み換えvＷＦのフ
ラクションは、血漿フラクションよりも第VIII因子とよ
り効果的に結合する。
【００４２】高分子および／または低分子フラクション
の異なる使用はそれらの生理的活性に起因する。両フラ
クションの目的にかなった混合物の生成の可能性は、特
別な医学的徴候の処置を可能にする。
の異なる使用はそれらの生理的活性に起因する。両フラ
クションの目的にかなった混合物の生成の可能性は、特
別な医学的徴候の処置を可能にする。
【００４３】従って、本発明のさらなる対象は、vＷＦ
分子の低分子フラクションまたはvＷＦ分子の高分子フ
ラクションまたはその混合物の、血友病Ａまたはフォン
ウィルブランド病異なる形の処置のための使用である。
分子の低分子フラクションまたはvＷＦ分子の高分子フ
ラクションまたはその混合物の、血友病Ａまたはフォン
ウィルブランド病異なる形の処置のための使用である。
【００４４】本発明の分別方法において組み換えvＷＦ
を用いると、最終生成物(高分子および低分子フラクシ
ョン並びに任意の混合比の両フラクションの混合物)は
血漿蛋白無しおよび第VIII因子無し、並びに病原性ウイ
ルス無しであることが特に指摘される。医薬生成物の生
成においては、上記したように、このことはある医学的
徴候にとって大きな利点である。
を用いると、最終生成物(高分子および低分子フラクシ
ョン並びに任意の混合比の両フラクションの混合物)は
血漿蛋白無しおよび第VIII因子無し、並びに病原性ウイ
ルス無しであることが特に指摘される。医薬生成物の生
成においては、上記したように、このことはある医学的
徴候にとって大きな利点である。
【００４５】本発明の対象は、また、vＷＦ分子の低分
子フラクションまたはvＷＦ分子の高分子フラクション
または任意の混合比のそれらの混合物を薬理学的に許容
されうる担体中に含む医薬組成物である。
子フラクションまたはvＷＦ分子の高分子フラクション
または任意の混合比のそれらの混合物を薬理学的に許容
されうる担体中に含む医薬組成物である。
【００４６】好ましくは、医薬組成物は、医薬組成物は
第VIII因子または第VIII因子の機能的欠失変異(複数も
あり)を含み、それにより高分子フラクションまたは低
分子フラクションまたはその混合物のvＷＦ分子は第VII
I因子または第VIII因子の機能的欠失変異体(複数もあ
り)を安定化する。
第VIII因子または第VIII因子の機能的欠失変異(複数も
あり)を含み、それにより高分子フラクションまたは低
分子フラクションまたはその混合物のvＷＦ分子は第VII
I因子または第VIII因子の機能的欠失変異体(複数もあ
り)を安定化する。
【００４７】医薬製剤の生成には、好ましくは各フラク
ションまたはその混合物を濃縮し、濃縮物を更に処理す
る。医薬組成物の生成は、既知の慣用方法で行うことが
できる。好ましくは、生成物(低分子および高分子フラ
クション並びに全ての可能なその混合物)またはそれら
を含む濃縮物は適当な生理的に許容されうる担体と混合
することができる。好ましくは生理食塩水が担体として
用いられる。
ションまたはその混合物を濃縮し、濃縮物を更に処理す
る。医薬組成物の生成は、既知の慣用方法で行うことが
できる。好ましくは、生成物(低分子および高分子フラ
クション並びに全ての可能なその混合物)またはそれら
を含む濃縮物は適当な生理的に許容されうる担体と混合
することができる。好ましくは生理食塩水が担体として
用いられる。
【００４８】医薬組成物は、血友病Ａまたは異なる形の
フォンウィルブランド病の処置に慣用され、有用な投与
形で存在できる。好ましくは、それらは注入に適した製
剤の形で存在する。
フォンウィルブランド病の処置に慣用され、有用な投与
形で存在できる。好ましくは、それらは注入に適した製
剤の形で存在する。
【００４９】以下の実施例で、本発明は一層明らかに説
明されるが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。実施例１では、本発明のヘパリンアフィニテ
ィークロマトグラフィーによる高分子および低分子vＷ
Ｆポリマーの分別を示す。
明されるが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。実施例１では、本発明のヘパリンアフィニテ
ィークロマトグラフィーによる高分子および低分子vＷ
Ｆポリマーの分別を示す。
【００５０】
実施例１：フォンウィルブランド因子の高および低分子
形の分別 ２０mＭ トリス／ＨＣl緩衝液(トリス緩衝液)、pＨ７.
４中、組み換えフォンウィルブランド因子(rvＷＦ)を１
ml／分／cm2の流速で、ＡＦヘパリントヨパール(登録商
標)(トソハース)を充填したガラスカラムに適用した。
非特異的に結合した蛋白を除去するために、カラムをま
ずトリス緩衝液で洗浄した。次いで、カラムをトリス緩
衝液中１６０mＭ ＮaＣlで、次いでトリス緩衝液中２７
０mＭ ＮaＣlで溶出した。クロマトグラフィーの間に、
蛋白吸収を慣用方法で２８０nmで追跡した。クロマトグ
ラフィー後、蛋白濃度をブラドフォード法(Ｍ.ブラドフ
ォード、Ａnal.Ｂiochem.７２：２４８−２５４、1976)
により測定した。rvＷＦの含量を商業的エリザシステム
(ベーリンガー・マンハイム)により測定した。個々の精
製フラクション中の組み換えフォンウィルブランド因子
を、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動により慣用方法で試
験し、デンシトメトリーにより定量分析した。リストセ
チン仲介血小板凝集の能力は商業的試験システム（フォ
ンウィルブランド・リージェント、ベーリング・ウェル
ケ）により試験した。
形の分別 ２０mＭ トリス／ＨＣl緩衝液(トリス緩衝液)、pＨ７.
４中、組み換えフォンウィルブランド因子(rvＷＦ)を１
ml／分／cm2の流速で、ＡＦヘパリントヨパール(登録商
標)(トソハース)を充填したガラスカラムに適用した。
非特異的に結合した蛋白を除去するために、カラムをま
ずトリス緩衝液で洗浄した。次いで、カラムをトリス緩
衝液中１６０mＭ ＮaＣlで、次いでトリス緩衝液中２７
０mＭ ＮaＣlで溶出した。クロマトグラフィーの間に、
蛋白吸収を慣用方法で２８０nmで追跡した。クロマトグ
ラフィー後、蛋白濃度をブラドフォード法(Ｍ.ブラドフ
ォード、Ａnal.Ｂiochem.７２：２４８−２５４、1976)
により測定した。rvＷＦの含量を商業的エリザシステム
(ベーリンガー・マンハイム)により測定した。個々の精
製フラクション中の組み換えフォンウィルブランド因子
を、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動により慣用方法で試
験し、デンシトメトリーにより定量分析した。リストセ
チン仲介血小板凝集の能力は商業的試験システム（フォ
ンウィルブランド・リージェント、ベーリング・ウェル
ケ）により試験した。
【００５１】図１は、個々に得られたフラクションのマ
ルチマーのスペクトルを示す。１６０mＭ ＮaＣlの塩濃
度で、主として第一ダイマー形の低分子量のrvＷＦが溶
出した。これに対し、高分子量のrvＷＦが２７０mＭ Ｎ
aＣlの塩濃度で溶出した。
ルチマーのスペクトルを示す。１６０mＭ ＮaＣlの塩濃
度で、主として第一ダイマー形の低分子量のrvＷＦが溶
出した。これに対し、高分子量のrvＷＦが２７０mＭ Ｎ
aＣlの塩濃度で溶出した。
【００５２】図２は、１６０mＭ ＮaＣlで得られた組み
換えフォンウィルブランド因子のマルチマーの分布のデ
ンシトメトリー分析を示す。本分析は、この方法で得ら
れるrvＷＦ−ポリマー混合物が８４.４％までの第一ダ
イマー(分子量約４４０,０００)および１４.９％までの
テトラマー(分子量約８８０,０００)を含むことを示し
た。
換えフォンウィルブランド因子のマルチマーの分布のデ
ンシトメトリー分析を示す。本分析は、この方法で得ら
れるrvＷＦ−ポリマー混合物が８４.４％までの第一ダ
イマー(分子量約４４０,０００)および１４.９％までの
テトラマー(分子量約８８０,０００)を含むことを示し
た。
【００５３】２７０mＭ ＮaＣlによる溶出によって得ら
れた図３に示されるrvＷＦフラクションの密度測定分析
は、本方法で得られるrvＷＦ−ポリマー混合物が増強さ
れた高ポリマーのカスケードを含むことを示した。
れた図３に示されるrvＷＦフラクションの密度測定分析
は、本方法で得られるrvＷＦ−ポリマー混合物が増強さ
れた高ポリマーのカスケードを含むことを示した。
【００５４】rvＷＦフラクションのクロマトグラフィー
および第一機能分析の結果を表１にまとめる。分析か
ら、ほとんど全てのrvＷＦが支持体に結合したことが明
らかとなる。１６０mＭ ＮaＣlで溶出するvＷＦ−ポリ
マー混合物（低分子）は血小板の凝集能力を示さなかっ
た。２７０mＭ ＮaＣlで溶出するフラクション（高分
子）は血小板凝集に関し高い能力を有した。非凝集、低
分子rvＷＦ形の分画により、凝集に関する特異的能力が
出発原料に比べて６９％増加した。
および第一機能分析の結果を表１にまとめる。分析か
ら、ほとんど全てのrvＷＦが支持体に結合したことが明
らかとなる。１６０mＭ ＮaＣlで溶出するvＷＦ−ポリ
マー混合物（低分子）は血小板の凝集能力を示さなかっ
た。２７０mＭ ＮaＣlで溶出するフラクション（高分
子）は血小板凝集に関し高い能力を有した。非凝集、低
分子rvＷＦ形の分画により、凝集に関する特異的能力が
出発原料に比べて６９％増加した。
【００５５】同時に、rvＷＦの純度が実施例１に記載さ
れる親和性支持体上のrvＷＦのクロマトグラフィーによ
り実質的に増加した。１６０mＭ ＮaＣlフラクションの
rvＷＦは出発材料に比べて２倍の、そして２７０mＭ Ｎ
aＣlフラクションのrvＷＦは６倍の高純度を示した。
れる親和性支持体上のrvＷＦのクロマトグラフィーによ
り実質的に増加した。１６０mＭ ＮaＣlフラクションの
rvＷＦは出発材料に比べて２倍の、そして２７０mＭ Ｎ
aＣlフラクションのrvＷＦは６倍の高純度を示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】実施例２：組み換えフォンウィルブランド
因子の第VIII因子への結合 以下の実験は、抗vＷＦ免疫グロブリンで被覆したエリ
ザマイクロタイタープレート(アサーアクロムvＷＦ、ベ
ーリンガー・マイハイム)で実施した。５ngのvＷＦを、
それぞれ、２００μl ５０mＭトリス／ＨＣl、pＨ７.
４、１５０mＭ ＮaＣl、０.５％アルブミン、１００ng
／ml vＷＦ：Ａgを含む０.１％ツイン２０(ＴＢＳ緩衝
液)と室温で１時間インキュベートすることにより反応
容器に結合した。以下のvＷＦ試料を用いた。ヒトvＷＦ
(ダイアグノスティカ スタゴ)、rvＷＦ(実施例１の出
発材料)、低分子rvＷＦ(実施例１の１６０mＭ ＮaＣl溶
出フラクション)、高分子rvＷＦ(実施例１の２７０mＭ
ＮaＣl溶出フラクション)。次いでマイクロタイタープ
レートをＴＢＳで３回、３分間洗浄し、次いで各反応容
器をＴＢＳ中２５μl組み換え第VIII因子(マイルス)の
層で覆い、室温で１時間インキュベートした。第VIII因
子の濃度を１００mＵ／mlから７.１２mＵ／mlの範囲で
変化させた。その後、反応容器をそれぞれ２００μl Ｔ
ＢＳで３回、３分間洗浄した。次いで、固定化vＷＦに
より結合した第VIII因子の量を商業的試験システム(ク
ロモゲニクス コーテスト VIII：Ｃ／４)により測定し
た。
因子の第VIII因子への結合 以下の実験は、抗vＷＦ免疫グロブリンで被覆したエリ
ザマイクロタイタープレート(アサーアクロムvＷＦ、ベ
ーリンガー・マイハイム)で実施した。５ngのvＷＦを、
それぞれ、２００μl ５０mＭトリス／ＨＣl、pＨ７.
４、１５０mＭ ＮaＣl、０.５％アルブミン、１００ng
／ml vＷＦ：Ａgを含む０.１％ツイン２０(ＴＢＳ緩衝
液)と室温で１時間インキュベートすることにより反応
容器に結合した。以下のvＷＦ試料を用いた。ヒトvＷＦ
(ダイアグノスティカ スタゴ)、rvＷＦ(実施例１の出
発材料)、低分子rvＷＦ(実施例１の１６０mＭ ＮaＣl溶
出フラクション)、高分子rvＷＦ(実施例１の２７０mＭ
ＮaＣl溶出フラクション)。次いでマイクロタイタープ
レートをＴＢＳで３回、３分間洗浄し、次いで各反応容
器をＴＢＳ中２５μl組み換え第VIII因子(マイルス)の
層で覆い、室温で１時間インキュベートした。第VIII因
子の濃度を１００mＵ／mlから７.１２mＵ／mlの範囲で
変化させた。その後、反応容器をそれぞれ２００μl Ｔ
ＢＳで３回、３分間洗浄した。次いで、固定化vＷＦに
より結合した第VIII因子の量を商業的試験システム(ク
ロモゲニクス コーテスト VIII：Ｃ／４)により測定し
た。
【００５８】図４は、利用できる量の第VIII因子の機能
としての第VIII因子のフォンウィルブランド因子への結
合を示す。結果は、全ての試験したvＷＦフラクション
が濃度依存方法で第VIII因子に結合することを示し、一
方、rvＷＦはヒトvＷＦに比べてほぼ同一の第VIII因子
結合を示した。実施例１の２７０mＭ ＮaＣlフラクショ
ンのrvＷＦは、第VIII因子の増強された結合を示し、１
６０mＭ ＮaＣlフラクションのrvＷＦは第VIII因子のご
くわずかの低い結合を示した。
としての第VIII因子のフォンウィルブランド因子への結
合を示す。結果は、全ての試験したvＷＦフラクション
が濃度依存方法で第VIII因子に結合することを示し、一
方、rvＷＦはヒトvＷＦに比べてほぼ同一の第VIII因子
結合を示した。実施例１の２７０mＭ ＮaＣlフラクショ
ンのrvＷＦは、第VIII因子の増強された結合を示し、１
６０mＭ ＮaＣlフラクションのrvＷＦは第VIII因子のご
くわずかの低い結合を示した。
【００５９】実施例３：組み換えフォンウィルブランド
因子による組み換え第VIII因子の安定化 第VIII因子は、人体中、フォンウィルブランド因子によ
り生理的に結合し、この形で安定である。これに対し、
未結合第VIII因子は数分で蛋白分解で不活性化する。
因子による組み換え第VIII因子の安定化 第VIII因子は、人体中、フォンウィルブランド因子によ
り生理的に結合し、この形で安定である。これに対し、
未結合第VIII因子は数分で蛋白分解で不活性化する。
【００６０】実施例１の方法に従って得られる組み換え
フォンウィルブランド因子の異なるフラクションを、細
胞培養中、第VIII因子を分泌する形質転換ＳＫ−Ｈep細
胞に添加した。２４時間後、細胞培養上清中の組み換え
第VIII因子の活性を商業的試験システム(クロモゲニク
ス コーテスト VIII：Ｃ／４)により測定した。結果
は表２にまとめられる。データから、実質的に高濃度の
第VIII因子が細胞へのrvＷＦ添加により２４時間後現れ
ることが明らかである。高分子vＷＦフラクションおよ
び低分子vＷＦフラクションは第VIII因子を固めて安定
化するが、高分子フラクションは低分子フラクションよ
りも第VIII因子を安定化するより良好な能力を有する。
さらに、これらのデータは、遺伝子組み換えで産生され
た第VIII因子もフォンウィルブランド因子の添加により
安定化されることを示した。
フォンウィルブランド因子の異なるフラクションを、細
胞培養中、第VIII因子を分泌する形質転換ＳＫ−Ｈep細
胞に添加した。２４時間後、細胞培養上清中の組み換え
第VIII因子の活性を商業的試験システム(クロモゲニク
ス コーテスト VIII：Ｃ／４)により測定した。結果
は表２にまとめられる。データから、実質的に高濃度の
第VIII因子が細胞へのrvＷＦ添加により２４時間後現れ
ることが明らかである。高分子vＷＦフラクションおよ
び低分子vＷＦフラクションは第VIII因子を固めて安定
化するが、高分子フラクションは低分子フラクションよ
りも第VIII因子を安定化するより良好な能力を有する。
さらに、これらのデータは、遺伝子組み換えで産生され
た第VIII因子もフォンウィルブランド因子の添加により
安定化されることを示した。
【００６１】
【表２】 試料 ２４時間後の第VIII因子活性１５μg／ml Ｕ/ml コントロール ０.５ rvＷＦ開始 １.８ rvＷＦ-160mＭ ＮaＣl溶出液 ０.８ rvＷＦ-270mＭ ＮaＣl溶出液 ２.４
【００６２】実施例４：組み換えフォンウィルブランド
因子による第VIII因子の安定化実施例３で得られたもの
と同様の、第VIII因子と細胞培養上清からの組み換えフ
ォンウィルブランド因子の混合物を−２０℃で凍結し、
−２０℃で６日間保存した。その後で、第VIII因子の活
性を再び測定した。表３に結果をまとめる。結果から、
全ての試験したvＷＦフラクションが第VIII因子の貯蔵
安定性を２.５倍以上増加したことが明らかである。こ
れは、また、低分子フラクションとのvＷＦ−因子複合
体の強い結合を示す。
因子による第VIII因子の安定化実施例３で得られたもの
と同様の、第VIII因子と細胞培養上清からの組み換えフ
ォンウィルブランド因子の混合物を−２０℃で凍結し、
−２０℃で６日間保存した。その後で、第VIII因子の活
性を再び測定した。表３に結果をまとめる。結果から、
全ての試験したvＷＦフラクションが第VIII因子の貯蔵
安定性を２.５倍以上増加したことが明らかである。こ
れは、また、低分子フラクションとのvＷＦ−因子複合
体の強い結合を示す。
【００６３】
【表３】 試料 第VIII因子活性（mＵ/ml）１５μg/ml t=0 t=6日 ％損失 コントロール 500 150 70 rvＷＦ開始 1800 1300 28 rvＷＦ-160mＭ ＮaＣl溶出液 800 600 25 rvＷＦ-270mＭ ＮaＣl溶出液 2400 1800 25
【００６４】実施例５：アニオン交換クロマトグラフィ
ーによる培養上清からのrvＷＦの精製 組み換えvＷＦは、細胞培養中ワクチニアウイルスによ
るベロ細胞(サル腎臓細胞)の感染後、慣用方法により分
離した。ベロ／ワクチニア発現系および細胞培養条件
は、Ｆ.Ｇ.フォークナー等、Ｔhrombosis and Ｈaemost
asis６８，(1992)１１９−１２４、Ｎ.バレット等、Ａ
ＩＤＳ Ｒes.５，(1985)１５９−１７１およびＦ.ドー
ナー等、ＡＩＤＳ Ｖaccine Ｒesearch and Ｃlinical
Ｔrials、マーセル・デッカー・インコーポレイテッ
ド、ニューヨーク(1990)に詳細に記載されている。vＷ
Ｆの発現は合成ＤＭＥＭ標準培地(ダルベッコ最小基本
培地)で起きた。形質転換細胞の発酵後、培養培地を分
別し、細胞および細胞断片を遠心により除去した。膜断
片または細菌のような付加的小成分を０.４μmの孔径を
有するフィルターを濾過させることにより除去した。
ーによる培養上清からのrvＷＦの精製 組み換えvＷＦは、細胞培養中ワクチニアウイルスによ
るベロ細胞(サル腎臓細胞)の感染後、慣用方法により分
離した。ベロ／ワクチニア発現系および細胞培養条件
は、Ｆ.Ｇ.フォークナー等、Ｔhrombosis and Ｈaemost
asis６８，(1992)１１９−１２４、Ｎ.バレット等、Ａ
ＩＤＳ Ｒes.５，(1985)１５９−１７１およびＦ.ドー
ナー等、ＡＩＤＳ Ｖaccine Ｒesearch and Ｃlinical
Ｔrials、マーセル・デッカー・インコーポレイテッ
ド、ニューヨーク(1990)に詳細に記載されている。vＷ
Ｆの発現は合成ＤＭＥＭ標準培地(ダルベッコ最小基本
培地)で起きた。形質転換細胞の発酵後、培養培地を分
別し、細胞および細胞断片を遠心により除去した。膜断
片または細菌のような付加的小成分を０.４μmの孔径を
有するフィルターを濾過させることにより除去した。
【００６５】７７０mlの無細胞培養上清を、２ml／cm2
／分の流速でカラム(１.６cm×５cm、１０mlのアニオン
交換体 ＥＭＤ−ＴＭＡＥ−フラクトゲル(メルク)充
填)を通して濾過した。ゲルは予め２０mＭトリス／ＨＣ
l緩衝液(pＨ７.４)で平衡化した。次いで、カラムを２
０mＭトリス／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)で洗浄した。２０
０mＭ ＮaＣl含有緩衝液でカラムを洗浄することにより
異質材料を除去した。次いでrvＷＦを、２０mＭトリス
／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)中の２８０mＭ ＮaＣlで支持
体から溶出した。続いて存在する全ての残留材料を１Ｍ
ＮaＣlでカラムから溶出した。クロマトグラフィーの
間、蛋白吸収を通常の方法で２８０nmで追跡した。クロ
マトグラフィー後、蛋白濃度をブラドフォード法(Ｍ.ブ
ラドフォード、Ａnal.Ｂiochem.，７２(1976)２４８−
２５４)によって測定した。rvＷＦの含量は商業的エリ
ザシテスム(ベーリンガー・マンハイム)によって測定し
た。ほとんどの総rvＷＦは支持体に結合したことが分か
った。０.２８mＭ ＮaＣlによりアニオン交換体からrv
ＷＦを溶出した。アニオン交換体でのrvＷＦの精製結果
は表４にまとめられている。rvＷＦは本実施例に記載さ
れる精製によって６倍増加した。
／分の流速でカラム(１.６cm×５cm、１０mlのアニオン
交換体 ＥＭＤ−ＴＭＡＥ−フラクトゲル(メルク)充
填)を通して濾過した。ゲルは予め２０mＭトリス／ＨＣ
l緩衝液(pＨ７.４)で平衡化した。次いで、カラムを２
０mＭトリス／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)で洗浄した。２０
０mＭ ＮaＣl含有緩衝液でカラムを洗浄することにより
異質材料を除去した。次いでrvＷＦを、２０mＭトリス
／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)中の２８０mＭ ＮaＣlで支持
体から溶出した。続いて存在する全ての残留材料を１Ｍ
ＮaＣlでカラムから溶出した。クロマトグラフィーの
間、蛋白吸収を通常の方法で２８０nmで追跡した。クロ
マトグラフィー後、蛋白濃度をブラドフォード法(Ｍ.ブ
ラドフォード、Ａnal.Ｂiochem.，７２(1976)２４８−
２５４)によって測定した。rvＷＦの含量は商業的エリ
ザシテスム(ベーリンガー・マンハイム)によって測定し
た。ほとんどの総rvＷＦは支持体に結合したことが分か
った。０.２８mＭ ＮaＣlによりアニオン交換体からrv
ＷＦを溶出した。アニオン交換体でのrvＷＦの精製結果
は表４にまとめられている。rvＷＦは本実施例に記載さ
れる精製によって６倍増加した。
【００６６】
【表４】 容量 総蛋白 rvＷＦ rvＷＦ／ 試料 （ｍｌ） (μg/ml) (μg/ml) 総蛋白 無細胞培養上清 770 113 7.9 0.069 200mM NaClによる溶出 95 147 0.0016 0.00001 280mM NaClによる溶出 75 168 61 0.36 １M NaClによる溶出 50 196 6 0.03
【００６７】実施例６：アフィニティークロマトグラフ
ィーによるrvＷＦの精製 実施例５で得たrvＷＦを２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液で
希釈し塩濃度(１６０mＭ ＮaＣl)を下げた。次いで溶液
を１ml／cm2／分の流速でカラム(１.６cm×５cm、１０m
lのＡＦヘパリントヨパール６５０(トソハース)充填)を
通して濾過した。カラムは予め２０mＭトリス／ＨＣl緩
衝液(pＨ７.４)で平衡化した。非特異的に結合した蛋白
を２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)で洗浄するこ
とにより、まず除去した。次いでrvＷＦを２０mＭトリ
ス／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)中２７０mＭ ＮaＣlにより
支持体から溶出した。続いて、残留材料を１Ｍ ＮaＣl
によりカラムから溶出した。クロマトグラフィーの間、
蛋白吸収を通常の方法で２８０nmで追跡した。クロマト
グラフィー後、蛋白濃度をブラドフォード法(Ｍ.ブラド
フォード、上記)によって測定した。rvＷＦの含量を商
業的エリザシステム(ベーリンガーマンハイム)によって
測定した。
ィーによるrvＷＦの精製 実施例５で得たrvＷＦを２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液で
希釈し塩濃度(１６０mＭ ＮaＣl)を下げた。次いで溶液
を１ml／cm2／分の流速でカラム(１.６cm×５cm、１０m
lのＡＦヘパリントヨパール６５０(トソハース)充填)を
通して濾過した。カラムは予め２０mＭトリス／ＨＣl緩
衝液(pＨ７.４)で平衡化した。非特異的に結合した蛋白
を２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)で洗浄するこ
とにより、まず除去した。次いでrvＷＦを２０mＭトリ
ス／ＨＣl緩衝液(pＨ７.４)中２７０mＭ ＮaＣlにより
支持体から溶出した。続いて、残留材料を１Ｍ ＮaＣl
によりカラムから溶出した。クロマトグラフィーの間、
蛋白吸収を通常の方法で２８０nmで追跡した。クロマト
グラフィー後、蛋白濃度をブラドフォード法(Ｍ.ブラド
フォード、上記)によって測定した。rvＷＦの含量を商
業的エリザシステム(ベーリンガーマンハイム)によって
測定した。
【００６８】ほとんどの総rvＷＦは支持体に結合したこ
とが分かった。大部分のrvＷＦは２７０mＭ ＮaＣlによ
る溶出でカラムから溶出したが、１Ｍ ＮaＣlによる洗
液は痕跡量のrvＷＦを含有した。本精製段階の結果は表
５にまとめられている。総蛋白に対するrvＷＦ蛋白の割
合は本精製段階により８６％以上、増加した。２７０m
Ｍ ＮaＣlのフラクションは、変性ＳＤＳ蛋白ゲル電気
泳動（Ｕ.Ｋ.ラームリ、Ｎature２２７，(1970)６８０
−６８５）および続くウエスタンブロットによってより
正確に測定した。図５に示すように、変性電気泳動分析
は、rvＷＦが実施例５および実施例６に記載される精製
により、高純度で回収されることを成就した。本方法で
分離された生成物では、第VIII因子のような他の凝集因
子は検出されなかった。
とが分かった。大部分のrvＷＦは２７０mＭ ＮaＣlによ
る溶出でカラムから溶出したが、１Ｍ ＮaＣlによる洗
液は痕跡量のrvＷＦを含有した。本精製段階の結果は表
５にまとめられている。総蛋白に対するrvＷＦ蛋白の割
合は本精製段階により８６％以上、増加した。２７０m
Ｍ ＮaＣlのフラクションは、変性ＳＤＳ蛋白ゲル電気
泳動（Ｕ.Ｋ.ラームリ、Ｎature２２７，(1970)６８０
−６８５）および続くウエスタンブロットによってより
正確に測定した。図５に示すように、変性電気泳動分析
は、rvＷＦが実施例５および実施例６に記載される精製
により、高純度で回収されることを成就した。本方法で
分離された生成物では、第VIII因子のような他の凝集因
子は検出されなかった。
【００６９】
【表５】 容量 総蛋白 rvＷＦ rvＷＦ/ 試料 (ml) (μg/ml) (μg/ml) 総蛋白 rvＷＦ濃縮物 225 50 13.9 0.27 270mM NaClによる溶出 43 70 60 0.86 １M NaClによる溶出 32 25 2 0.08
【００７０】実施例７：異なるマルチマー化の血漿およ
び組み換えフォンウィルブランド因子の分離並びに第VI
II因子への結合の特徴付け 組み換えフォンウィルブランド因子(r−vＷＦ)、ヒト血
漿からのフォンウィルブランド因子(p−vＷＦ)および血
漿寒冷型沈降物からのフォンウィルブランド因子(k−v
ＷＦ)をアニオン交換クロマトグラフィーおよびヘパリ
ンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
アニオン交換クロマトグラフィーでは、出発材料(r−v
ＷＦ：組み換えＣＨＯ細胞の発酵上清；p−vＷＦ：ヒト
クエン酸血漿；k−vＷＦ：血漿寒冷型沈降物)をフラク
トゲル−ＥＭＤ−ＴＭＡＥカラム(メルク)に適用してv
ＷＦを２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液、pＨ７.０、２８０
mＭ ＮaＣlによる溶出によって得た。次いで、調製物を
２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液の添加により９０mＭの塩
濃度に希釈し、フラクトゲル−ＥＭＤ−ヘパリンカラム
(メルク)に適用した。塩濃度を増加しつつ用いる段階的
溶出によりvＷＦを溶出した。これにより、２０mＭトリ
ス／ＨＣl緩衝液中のＮaＣl濃度は１２０mＭと２８０m
Ｍの間を変化した。この方法では、マルチマーの組成が
互いに異なるp−vＷＦ、k−vＷＦおよびr−vＷＦが１２
０mＭ ＮaＣl、１６０mＭ ＮaＣl、１９０mＭ ＮaＣl、
２３０mＭ ＮaＣlおよび２８０mＭ ＮaＣlで得られた。
び組み換えフォンウィルブランド因子の分離並びに第VI
II因子への結合の特徴付け 組み換えフォンウィルブランド因子(r−vＷＦ)、ヒト血
漿からのフォンウィルブランド因子(p−vＷＦ)および血
漿寒冷型沈降物からのフォンウィルブランド因子(k−v
ＷＦ)をアニオン交換クロマトグラフィーおよびヘパリ
ンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
アニオン交換クロマトグラフィーでは、出発材料(r−v
ＷＦ：組み換えＣＨＯ細胞の発酵上清；p−vＷＦ：ヒト
クエン酸血漿；k−vＷＦ：血漿寒冷型沈降物)をフラク
トゲル−ＥＭＤ−ＴＭＡＥカラム(メルク)に適用してv
ＷＦを２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液、pＨ７.０、２８０
mＭ ＮaＣlによる溶出によって得た。次いで、調製物を
２０mＭトリス／ＨＣl緩衝液の添加により９０mＭの塩
濃度に希釈し、フラクトゲル−ＥＭＤ−ヘパリンカラム
(メルク)に適用した。塩濃度を増加しつつ用いる段階的
溶出によりvＷＦを溶出した。これにより、２０mＭトリ
ス／ＨＣl緩衝液中のＮaＣl濃度は１２０mＭと２８０m
Ｍの間を変化した。この方法では、マルチマーの組成が
互いに異なるp−vＷＦ、k−vＷＦおよびr−vＷＦが１２
０mＭ ＮaＣl、１６０mＭ ＮaＣl、１９０mＭ ＮaＣl、
２３０mＭ ＮaＣlおよび２８０mＭ ＮaＣlで得られた。
【００７１】vＷＦ(vＷＦ−抗原、vＷＦ：Ａg)の含量を
通常のエリザ試験(アッセラクロムvＷＦ、ベーリンガー
・マンハイム)により測定した。凝集第VIII因子のp−v
ＷＦ、k−vＷＦおよびr−vＷＦへの結合を、表面プラス
モン共鳴技術(モームビスト、Ｍ.、Ｎature1993；３６
１：１８６−１８７）からの測定に基づく「同時生体特
異相互反応分析」により測定した。それによって、vＷ
Ｆサブユニット対結合第VIII因子の化学量論比を測定し
た。モノクローナル抗ヒトフォンウィルブランド抗体
(ＡvＷ８／２)はセンサーチップＣＭ５(ファルマシア・
バイオセンサーＡＢ)に共有結合した(オシアネシィ、
Ｄ.Ｊ.等、1993、Ａnal.Ｂiochem.２１２，４５７−４
６８；カールソン、Ｒ. 1994 Ａnal.Ｂiochem.２２１，
１４２−１５１)。それにより、共鳴単位(ＲＵ)の測定
は基線(ＲＵBL)に対応する。
通常のエリザ試験(アッセラクロムvＷＦ、ベーリンガー
・マンハイム)により測定した。凝集第VIII因子のp−v
ＷＦ、k−vＷＦおよびr−vＷＦへの結合を、表面プラス
モン共鳴技術(モームビスト、Ｍ.、Ｎature1993；３６
１：１８６−１８７）からの測定に基づく「同時生体特
異相互反応分析」により測定した。それによって、vＷ
Ｆサブユニット対結合第VIII因子の化学量論比を測定し
た。モノクローナル抗ヒトフォンウィルブランド抗体
(ＡvＷ８／２)はセンサーチップＣＭ５(ファルマシア・
バイオセンサーＡＢ)に共有結合した(オシアネシィ、
Ｄ.Ｊ.等、1993、Ａnal.Ｂiochem.２１２，４５７−４
６８；カールソン、Ｒ. 1994 Ａnal.Ｂiochem.２２１，
１４２−１５１)。それにより、共鳴単位(ＲＵ)の測定
は基線(ＲＵBL)に対応する。
【００７２】p−vＷＦ、k−vＷＦおよびr−vＷＦを、１
０mＭ ＨＥＰＥＳ、pＨ７.４、１５０mＭ ＮaＣl、１m
Ｍ ＣaＣl2、０.０５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ緩衝
液）中２０μg／mlの濃度に溶解した。各実験用に、vＷ
Ｆの５０μl試料を５μl／分の流速でセンサーチップ上
に適用してＡvＷ８／２のvＷＦへの結合を行わせた(フ
ェーズＡ)。非結合vＷＦをＨＢＳ緩衝液で洗浄して除去
した(フェーズＢ)。痕跡量の血漿第VIII因子を除去する
ためにp−vＷＦとk−vＷＦを２０μl ２５０mＭＣaＣl2
でさらに洗浄した。vＷＦのＡvＷ８／２への結合はvＷ
Ｆ共鳴単位(ＲＵvWF)に対応する。第VIII因子の結合分
析用に、６０μlの組み換えＦVIII(ＨＢＳ緩衝液中、
２.５μg／ml)を５μl／分の一定流速でセンサーチップ
上に注入して第VIII因子のvＷＦへの結合を行わせた(フ
ェーズＣ)。共鳴単位の測定はＦVIII因子結合(ＲＵ
FVIII)に対応する。第VIII因子を、ＨＢＳ緩衝液で洗浄
することによりvＷＦから再び分離した(フェーズＤ)。
ＦＶIIIとvＷＦサブユニットの複合体の化学量論比は共
鳴単位と分子量から確立される。vＷＦ(サブユニッ
ト)：ＦVIII＝(ＲＵvWF−ＲＵBL)／(ＲＵFVIII−ＲＵ
vWF)×330,000／220,000（オシャネシィ、Ｄ.Ｊ.等、19
93、Ａnal.Ｂiochem.２１２，４５７−４６８；カール
ソン、Ｒ.1994 Ａnal.Ｂiochem.２２１，１４２−１５
１）。図６は第VIII因子のr−vＷＦへの付着のセンソグ
ラムを示す。
０mＭ ＨＥＰＥＳ、pＨ７.４、１５０mＭ ＮaＣl、１m
Ｍ ＣaＣl2、０.０５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ緩衝
液）中２０μg／mlの濃度に溶解した。各実験用に、vＷ
Ｆの５０μl試料を５μl／分の流速でセンサーチップ上
に適用してＡvＷ８／２のvＷＦへの結合を行わせた(フ
ェーズＡ)。非結合vＷＦをＨＢＳ緩衝液で洗浄して除去
した(フェーズＢ)。痕跡量の血漿第VIII因子を除去する
ためにp−vＷＦとk−vＷＦを２０μl ２５０mＭＣaＣl2
でさらに洗浄した。vＷＦのＡvＷ８／２への結合はvＷ
Ｆ共鳴単位(ＲＵvWF)に対応する。第VIII因子の結合分
析用に、６０μlの組み換えＦVIII(ＨＢＳ緩衝液中、
２.５μg／ml)を５μl／分の一定流速でセンサーチップ
上に注入して第VIII因子のvＷＦへの結合を行わせた(フ
ェーズＣ)。共鳴単位の測定はＦVIII因子結合(ＲＵ
FVIII)に対応する。第VIII因子を、ＨＢＳ緩衝液で洗浄
することによりvＷＦから再び分離した(フェーズＤ)。
ＦＶIIIとvＷＦサブユニットの複合体の化学量論比は共
鳴単位と分子量から確立される。vＷＦ(サブユニッ
ト)：ＦVIII＝(ＲＵvWF−ＲＵBL)／(ＲＵFVIII−ＲＵ
vWF)×330,000／220,000（オシャネシィ、Ｄ.Ｊ.等、19
93、Ａnal.Ｂiochem.２１２，４５７−４６８；カール
ソン、Ｒ.1994 Ａnal.Ｂiochem.２２１，１４２−１５
１）。図６は第VIII因子のr−vＷＦへの付着のセンソグ
ラムを示す。
【００７３】
【表６】 vＷＦ−第VIII因子複合体のストイキオメトリーの測定 ストイキオメトリー 試料 vＷＦサブユニット：FVIII r−vＷＦ 120mＭ 溶出物 2.25：1 r−vＷＦ 160mＭ 溶出物 2.5：1 r−vＷＦ 190mＭ 溶出物 2.0：1 r−vＷＦ 230mＭ 溶出物 2.0：1 r−vＷＦ 280mＭ 溶出物 2.0：1 k−vＷＦ 280mＭ 溶出物 2.6：1 p−vＷＦ 280mＭ 溶出物 3：1
【００７４】表６は血漿および組み換えvＷＦの低およ
び高分子フラクションのvＷＦ：第ＶIII因子のストイキ
オメトリーを示す。データは、rvＷＦの低分子および高
分子フラクションがp−vＷＦよりも第VIII因子に対し高
い結合能力を有することを示す。
び高分子フラクションのvＷＦ：第ＶIII因子のストイキ
オメトリーを示す。データは、rvＷＦの低分子および高
分子フラクションがp−vＷＦよりも第VIII因子に対し高
い結合能力を有することを示す。
【００７５】実施例８：血漿vＷＦ、寒冷型沈降物から
のvＷＦおよび組み換えvＷＦの精製および分離 血漿vＷＦ（p−vＷＦ）、寒冷型沈降物からのvＷＦ（k
−vＷＦ）および組み換えvＷＦ（r−vＷＦ）をヘパリン
アフィニティークロマトグラフィーにより精製して低分
子および高分子フラクションを実施例１に従って分離し
た。図７から、p−vＷＦとk−vＷＦの各フラクションが
r−vＷＦのものよりも実質的にシャープでないバンドを
有することが認識される。このこととは、p−vＷＦとr
−vＷＦの分別マルチマーを直接比較した図８において
より一層明らかである。γ−vＷＦのシャープなバンド
は、ＳＤＳゲルでの分離後、明らかに可視となり、一
方、異なる分子量を有する明瞭な中間体はp−vＷＦの分
画に現れる。これらの「中間体バンド」は、血漿中に存
在するプロテアーゼによる分解によって生じるp−vＷＦ
フラクション中の異なる大きさのvＷＦサブユニットの
不均質混合物に由来する。これらの中間体生成物は、い
わゆるトリプレット構造物として文献で知られている。
のvＷＦおよび組み換えvＷＦの精製および分離 血漿vＷＦ（p−vＷＦ）、寒冷型沈降物からのvＷＦ（k
−vＷＦ）および組み換えvＷＦ（r−vＷＦ）をヘパリン
アフィニティークロマトグラフィーにより精製して低分
子および高分子フラクションを実施例１に従って分離し
た。図７から、p−vＷＦとk−vＷＦの各フラクションが
r−vＷＦのものよりも実質的にシャープでないバンドを
有することが認識される。このこととは、p−vＷＦとr
−vＷＦの分別マルチマーを直接比較した図８において
より一層明らかである。γ−vＷＦのシャープなバンド
は、ＳＤＳゲルでの分離後、明らかに可視となり、一
方、異なる分子量を有する明瞭な中間体はp−vＷＦの分
画に現れる。これらの「中間体バンド」は、血漿中に存
在するプロテアーゼによる分解によって生じるp−vＷＦ
フラクション中の異なる大きさのvＷＦサブユニットの
不均質混合物に由来する。これらの中間体生成物は、い
わゆるトリプレット構造物として文献で知られている。
【図１】 個々に得られたフラクションのマルチマーの
スペクトル。
スペクトル。
【図２】 １６０mＭ ＮaＣlで得られた組換えフォンウ
ィレブランド因子のマルチマーの分布の密度測定分析。
ィレブランド因子のマルチマーの分布の密度測定分析。
【図３】 rvＷＦフラクションの密度測定分析。
【図４】 利用できる量の第VIII因子の機能としての第
VIII因子のフォンウィレブレンド因子への結合。
VIII因子のフォンウィレブレンド因子への結合。
【図５】 変性電気泳動分析。
【図６】 血漿および組換えvＷＦの低および高分子フ
ラクションのvＷＦ：第VIII因子のストイキオメトリ
ー。
ラクションのvＷＦ：第VIII因子のストイキオメトリ
ー。
【図７】 p−vＷＦ、k−vＷＦおよびr−vＷＦのフラク
ションのＳＤＳアガロース電気泳動。
ションのＳＤＳアガロース電気泳動。
【図８】 p−vＷＦとr−vＷＦフラクションのＳＤＳア
ガロース電気泳動。
ガロース電気泳動。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フリードリッヒ・ドルナー オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペー ターリニガッセ17番
Claims (29)
- 【請求項１】 ｖＷＦを親和性支持体に結合させ、次い
で異なった塩濃度で溶出させることを特徴とする、ｖＷ
Ｆを高分子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦに分別する方法。 - 【請求項２】 分別すべきｖＷＦがｖＷＦに富む血漿フ
ラクションに存在することを特徴とする、請求項１記載
のｖＷＦを分別する方法。 - 【請求項３】 分別すべきｖＷＦが、形質転換細胞の無
細胞培養上清由来の組換ｖＷＦ濃縮物に存在する組換ｖ
ＷＦであることを特徴とする、請求項１記載の分別方
法。 - 【請求項４】 精製ｖＷＦが高分子ｖＷＦおよび低分子
ｖＷＦに分画されることを特徴とする、請求項１記載の
ｖＷＦを分別する方法。 - 【請求項５】 分別をＣａ2+−フリー緩衝系で行うこと
を特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のｖＷ
Ｆを高分子ｖＷＦおよび低分子ｖＷＦに分別する方法。 - 【請求項６】 親和性支持体が、それに結合したヘパリ
ンを含む支持体であり、ＡＦ−ヘパリントーヨーパール
(AF-heparin Toyopearl)(登録商標)(トソハース)(Tosoh
aas)、ヘパリンＥＭＤ−フラクトゲル(EMD-Fraktogel)
(登録商標)(メルク)(Merck)、およびヘパリンセファロ
ースファーストフロー(Heparin Sepharose Fast Flow)
(登録商標)が同様に好適であることを特徴とする、請求
項１から５の何れかに記載のｖＷＦを分別する方法。 - 【請求項７】 緩衝物質および所望により塩を含む緩衝
液が、アフィニティークロマトグラフィーの緩衝系とし
て使用されることを特徴とする、請求項１から６のいず
れかに記載のｖＷＦを分別する方法。 - 【請求項８】 トリス／ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液ま
たはクエン酸緩衝液および所望により塩化ナトリウムを
含む緩衝液が緩衝系として使用されることを特徴とす
る、請求項７記載のｖＷＦを分別する方法。 - 【請求項９】 アフィニティークロマトグラフィーを、
６.０から８.５のｐＨ範囲、好ましくは７.４のｐＨ値
で行うことを特徴とする、請求項１から８のいずれかに
記載のｖＷＦを分別する方法。 - 【請求項１０】 低分子ｖＷＦが高分子ｖＷＦより低い
塩濃度で溶出することを特徴とする、請求項１から９の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 ｖＷＦが塩濃度＜１５０ｍＭで親和性
支持体に結合し、ｖＷＦの低分子集合体は塩濃度１５０
から２５０mＭの間、好ましくは１６０mＭで溶出し、そ
の後、ｖＷＦの高分子集合体が塩濃度＞２５０mＭ、好
ましくは＞２７０mＭで溶出することを特徴とする、請
求項１から１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 可溶性一および二価塩が塩として使用
されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１３】 ＮａＣｌを塩として使用することを特
徴とする、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 主にダイマーおよびテトラマーから成
ることを特徴とする、ｖＷＦ分子の低分子フラクショ
ン。 - 【請求項１５】 請求項１から１３のいずれかに記載の
方法で得ることができる、ｖＷＦ分子の低分子フラクシ
ョン。 - 【請求項１６】 少なくとも８３％のダイマーおよび最
大１６％のテトラマーおよび最大１％のより高いポリマ
ーから成る、請求項１４または１５記載のｖＷＦ分子の
低分子フラクション。 - 【請求項１７】 血小板凝集活性を含まない、請求項１
４から１６のいずれかに記載のｖＷＦ分子の低分子フラ
クション。 - 【請求項１８】 第VIII因子に結合し、第VIII因子の安
定化に寄与し、第VIII因子の保存安定性に明確に影響す
る、請求項１４から１７のいずれかに記載のｖＷＦ分子
の低分子フラクション。 - 【請求項１９】 血漿性ｖＷＦから成ることを特徴とす
る、請求項１４から１８のいずれかに記載のｖＷＦ分子
の低分子フラクション。 - 【請求項２０】 組換ｖＷＦから成ることを特徴とす
る、請求項１４から１８のいずれかに記載のｖＷＦ分子
の低分子フラクション。 - 【請求項２１】 高分子および低分子ｖＷＦ分子の生理
学的混合物と比較して、血小板凝固において蛋白質μg
当たりの活性が少なくとも５０％、好ましくは６０％改
善された、ｖＷＦ分子の高分子フラクション。 - 【請求項２２】 請求項１から１３のいずれかに記載の
方法で得ることができる、ｖＷＦ分子の高分子フラクシ
ョン。 - 【請求項２３】 血漿性ｖＷＦから成ることを特徴とす
る、請求項２１または２２に記載のｖＷＦ分子の高分子
フラクション。 - 【請求項２４】 組換ｖＷＦから成ることを特徴とす
る、請求項２１または２２に記載のｖＷＦ分子の高分子
フラクション。 - 【請求項２５】 請求項１４から２０のいずれかに記載
のｖＷＦ分子の低分子フラクションおよび請求項２１か
ら２４のいずれかに記載のｖＷＦ分子の高分子フラクシ
ョンの任意の混合比の混合物。 - 【請求項２６】 低分子ｖＷＦの割合が３５％より低い
かまたは４５％より高い混合比である、請求項２５記載
の混合物。 - 【請求項２７】 血友病Ａまたは他の形のフォンウィル
ブランド病の処置のための、請求項１４から２０のいず
れかに記載のｖＷＦ分子の低分子フラクションもしくは
請求項２１から２４のいずれかに記載のｖＷＦ分子の高
分子フラクションもしくは請求項２５または２６に記載
のそれらの混合物の使用。 - 【請求項２８】 請求項１４から２０のいずれかに記載
のｖＷＦ分子の低分子フラクションもしくは請求項２１
から２４のいずれかに記載のｖＷＦ分子の高分子フラク
ションもしくは請求項２５または２６に記載のそれらの
混合物を、生理学的に許容可能な担体中に含むことを特
徴とする医薬組成物。 - 【請求項２９】 ｖＷＦ分子の高分子フラクションまた
は低分子フラクションもしくはそれらの混合物が第VIII
因子または第VIII因子の機能的欠失変異体を安定化させ
る、第VIII因子または第VIII因子の機能的欠失変異体を
含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
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