JPS60248619A - 第8因子の精製方法 - Google Patents

第8因子の精製方法

Info

Publication number
JPS60248619A
JPS60248619A JP60023365A JP2336585A JPS60248619A JP S60248619 A JPS60248619 A JP S60248619A JP 60023365 A JP60023365 A JP 60023365A JP 2336585 A JP2336585 A JP 2336585A JP S60248619 A JPS60248619 A JP S60248619A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
factor
purification method
buffer
eluted
sodium chloride
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP60023365A
Other languages
English (en)
Inventor
リチヤード ハワード ソーンドレー
ジエフリイ フランシス サヴイツジ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUPESHIYARU TORASUTEIIZU FUOA
SUPESHIYARU TORASUTEIIZU FUOA SENTO TOOMASU HOSUPITARU ZA
Original Assignee
SUPESHIYARU TORASUTEIIZU FUOA
SUPESHIYARU TORASUTEIIZU FUOA SENTO TOOMASU HOSUPITARU ZA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUPESHIYARU TORASUTEIIZU FUOA, SUPESHIYARU TORASUTEIIZU FUOA SENTO TOOMASU HOSUPITARU ZA filed Critical SUPESHIYARU TORASUTEIIZU FUOA
Publication of JPS60248619A publication Critical patent/JPS60248619A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 以トの順序で本発明を説明する。
A 産業上の利用分野 B 発明の概要 C従来の技術 D 発明が解決しようとする問題点 E 問題点を解決するための手段 F 実施例 Flカラムクロマトグラフィによる冷却沈澱物からの第
■R因子ニジ諭の精製方法 F2カラムクロマトグラフィによる全血漿からの第■R
因子:v昨の精製方法 F3塩化すトリウム以外の塩を用いた、塩類濃度勾配の
クロマトグラフィによる全血漿からの第■R因子: v
Wpの精製方法 F4塩化アンモニウムの濃度勾配カラムクロマトグラフ
ィによる血漿からの第■因子複合体の精製方法 F5塩化ナトナトリウム度勾配カラムクロマトグラフィ
による冷却沈澱物からの第■因子複合体の精製方法 F6凹状に減少するpl(勾配を有すると共に直線状の
塩化ナトリウムの濃度勾配を使用してカラムクロマトグ
ラフィにより冷却沈澱物から第■因子複合体を精製する
方法 F7凸状に減少するpo勾配を有すると共に直線状の塩
化ナトリウムの濃度勾配を使用してカラムクロマトグラ
フィにより冷却沈澱物から第■因子複合体を精製する方
法 F8ガラスピーズと結合した硫酸デキストランのカラム
クロマトグラフィによる第■R因子:へgと第■C因子
:へgの精製方法 F9クロマトグラフィカラムからの“段階的゛溶出を使
用した第■因子の精製方法 FIO第■因子: vHpのパッチ式精製方法Fll冷
却沈澱物からのフィブリノーゲンのバッチ式除去 A 産業上の利用分野 本発明は、第■因子の凝固因子及び/又は第■因子関連
フォン・ウィレブランド(von Willebran
d)タンパク質より成る第■因子複合体の精製方法に関
する。
B 発明の概要 第■因子は、硫酸デキストランのような遊離の硫酸塩を
有す不溶性の支持体に吸着させた後、そごから選択的に
溶出させることにより精製する。
フォノ・ウィレブランドタンパク質(第■R因子: v
Wp )を精製するための適当な溶出液は、0.47M
塩化ナトリウムと2.14mM塩化カルシウムを含むp
H6,85のクエン酸塩緩衝液である。
第■因子複合体(第■R因子’ Ag+第■R因子: 
vWp及び第■因子:C)を精製するための適当な溶出
液は、+4℃の1.0Mグリシン、2.14mM塩化カ
ルシウム及び0.5M塩化ナトリウムを含む、pl(4
i%が6.2から7.3の間にあるクエン酸塩緩衝液で
ある。
C従来の技術 第■因子は、血液凝固の初期の段階で関係する血液タン
パク質の複合体である。これは、圧密な血漿中に高分子
の糖タンパク質として極(微量循環している。この複合
体は、生物学的に不活性か血友病Aに存在しない凝血促
進性成分(第■因子:C)及び血小板の凝結と粘着性に
関係する第■因子関連フォン・ウィレブランドタンパク
質(第■R因子: vWp )と呼ばれている成分より
できている。この後者のタンパク質は、フォノ・ウィレ
ブランド病に罹っている患者の血漿中では量的に又は質
的に変化している。生体内におけるこの複合体は、恐ら
く付加的な安定性を付与するりボタンバク質と結合して
いると考えられている。更には、最適濃度のカルシウム
イオンは、第■因子二C部分に付加的な安定性を与えて
いると考えられている。
血友病A又はフォノ・ウィレブランド病の出血性症状は
、健康な提供者からの第■因子の投与によって治療して
いる。これば、軽症の場合には血漿の全部を輸液するご
とにより、又は重症の場合には“冷却沈澱物”を静脈内
注射することにより行われている。冷却沈澱物は、通常
プール(Pool)他の方法によって得られる(ネイチ
ャー 203:312 (14364) )。この方法
により、血漿を凍らせた後、4℃でゆっくり解かすと、
37℃で容易に再熔解できる冷却沈澱物が得られる。血
漿中の第■因子の大部分は、この冷却沈澱物中に回収さ
れ、これにより、治療目的の濃縮第■因子の便利な供給
源となっ°Cいる。
D 発明が解決しよ・うとする問題点 血漿の全部又は冷却沈澱物を用いた血友病Aとフォノ・
ウィレブランド病の治療には、幾つかの重大な欠点があ
る。例えば、肺炎の原因となっているウィルス及び後天
性免疫不全症候群(^ID5)の原因と考えられている
ウィルスのような感染性生物が血漿の全部に含まれてい
ないということは保征し難い。このような生物は、感染
した血漿から得られた冷却沈澱物に運び込まれるという
こともあり得る。
従って、第■因子複合体を精製するための多大の研究努
力が現在までになされてきた。しかし、第■因子:Cと
第■R因子: vWpの両方の精製であるにも拘わらず
、従来報告された精製方法は多数の分離した精製工程よ
り成っていたため、低収率、報告された収率では20〜
40%しか得られなかった(ボー(Baugh )他、
Biochimica Biophysica^cta
 371: 360 (1974)及びオルソン(Ol
son )他、J、Lab、Cl1n、Med、89 
: 127B (1977)参照)。
E 問題点を解決するための手段 本発明は、第■因子:Cと第■R因子: vWpの両方
を精製するための経済的な魅力を有する方法を提供する
。本発明においては、第■因子の不純物を遊離の硫酸塩
を有する支持体に吸着させ、この後、選択的に所望の因
子成分を熔出さゼることより成る、第■因子複合体の精
製方法を提供する。
GB−Am2080312においては、凝固物である第
■。
Vll、IX、X因子及び第■因子−阻害剤−バイパス
店性(第1Xa因子と考えられ゛(いる)をクロマトグ
ラフィで分離するための不溶性の硫酸化支持体く硫酸デ
キストランアガロース)の使用法が開示されている。こ
れらは、所謂ビタミンに依存性凝固因子であり、構造的
に相互に関連あるものである。しかしながら、第■因子
は、これらの因子とは構造的に全く異なるものであり、
これも硫酸デキストランアガロースのような不溶性の硫
酸化支持体に結合するということは最も予期されないこ
とであった。第■因子複合体の硫酸デキストランアガロ
ースへの結合が実際に意外だということは、UP−A−
0022052に更に説明されている。本明細書は、血
液凝固因子の精製方法を開示するものであり、この方法
は、特定の条件のドで第■因子:Cが硫酸化ムコ多糖類
に結合することができないというごとに基づいている。
第■因子を精製するための従来の方法と比べて、本発明
に係る方法は次のような利点を持っている。
即ち、(例えば、出発物質における30〜50%の生物
学的に活性な第■因子:C及び70〜80%の第■R因
子: vWpから)f4J収率が得られること、第■R
因子: vWp活性に関与していると考えられる高分子
量多量体の形態が保存されること、簡単さのために商業
上の可能性が増加すること、バッチ処理へ応用できるこ
と、複雑な実験機器を必要としないことである。精製物
には低レベルのフィブリノーゲンとフィブロネクチンが
含まれている。これらの2つのタンパク質は、存在する
第■因子の調製物が容易に再構成されるのを防ぐと考え
られている。
適当な硫酸塩を含む支持体として、硫酸デキストラン又
は硫酸コンドロイチンと硫酸化アガロースがあり、これ
らは適宜アガロース又はガラスピーズのような支持体に
結合させておく。適当な材料は、硫酸デキストランであ
り、これは3 、500から500.000ダルトン位
までの幅広く変化した分子量をとりうる。アガロースの
ような支持体を使用した場合には、より丈夫な構成の材
料となる。
混合物の吸着及びその後の第W因子の選択的な溶出は、
バッチ式に又は従来のクロマトグラフィのカラムで行な
うことができる。吸着されているタンパク質の選択的な
溶出は、piが一定又は異ならせである、塩類濃度を次
第に増加させた水溶液で硫酸塩を含む支持体を洗浄する
ことにより行うことができる。なお、この塩類濃度は、
連続的に(例えば、直線状に)又は不連続的に変化させ
ることができる。
この第■因子は、6.0から8.0までの間の一定のp
Hでイオン強度を次第に増加させた塩類溶液を使用して
溶出するのが好ましく、より好ましくは6.2から7.
4までの間のpuで行う、w&衝液はクエン酸塩とする
のが好ましく、また塩化カルシウムも加えておくのが好
ましい。低濃度(例えば、2から5−)の塩化カルシウ
ムは、第■因子:Cを畠収率で回収するのに役立つこと
がわかった。
第■R因子:州pを精製するための特に好ましい溶出液
は、約0.47Mの塩化ナトリウムと約2.14w+H
の塩化カルシウムを含む、pH6,85のクエン酸塩緩
衝液である。第■因子複合体(第■R因子:へg;第■
R因子雪v昨及び第■因子;C)を精製するための好ま
しい溶出液は、約1.0Mのグリシン、約2.14mM
の塩化カルシウム、約0.5Mの塩化ナトリウムを含む
、pHが6,2からり、3の間のクエン酸塩緩衝液であ
る。
第■因子:Cは、もし全工程を例えば4℃まで十げた温
度で行えば、高収率で得られる。しかし、第■因子複合
体の硫酸化支持体への結合は、4℃では遅いということ
がわかったため、最初の吸着は、10℃から30℃の間
の温度、例えば20℃で行なうのが好ましい。
未精製の第■因子の原料は、ヒトの血漿の全部とするこ
とができ、これをそのまま本発明に係る操作に使用する
ことができる。最高の収率は血弱の全部を用いて得られ
る。しかし、もし必要であれば、本発明に係る操作でf
fgJ、(又は更に精製)する前に、多少精製及び/又
は(例えば、冷却沈截法により)濃縮しておいても良い
冷却沈澱物から得られた第■因子の全収率は、血漿を使
用したときよりも低くなることがよくある。しかし、冷
却上清は、適宜ビタミンに依存性凝固因子とアルブミン
のような商業的に重要な他の血液タンパク質の精製のた
めに使用することができるため、冷却沈澱物は好ましい
出発物質である。
本発明に基づく第■因子の精製法については、下記の実
施例において詳細に説明する。これらの実施例において
、第■因子と他の活性を測定するための方法は、次の通
りである。
第■因子:C,#血促進性因子 未知の試験中の第■因子;Cの活性は、第■因子:Cの
足りない血漿の凝固時間を補止する能力を測定すること
により評価する。2段階の市販の第■因子検定用キット
(ダイアグノスティック・リエイジェンツしtd、テイ
ム、オクソン、英国)をこれらの研究のために使用する
。これは、ビッグズ(Biggs ) 、エベリング(
Eveling ) 、リチャーズ(’Richard
s) (1955)の2段階のトロンボプラスチン生成
試験に基づき、デンソン(Denson)KJ、Eによ
って開発された方法にもとづくものである(止血と血栓
症に関する国際会議の報告、チャペル・ヒル、ノース・
カロライナ、米国)。簡単に酋うと、試験物質と対照と
しての標準の正常な儒血血漿の連続的な希釈物を正常な
血清、リン脂質及び凝固性第■因子と一緒に37℃で1
0分間培養する。次に、この混合物を正常な基質血漿に
分けた後、フィブリンのかたまりが形成される時間を測
る。凝固時間と第■因子:Cの濃度との間には直線的な
関係が見出される。
リストセチン共同因子検定 第■因子(第■因子:C)の凝血促進性活性に加えて、
第■因子複合体中の第■因子ニジーpは、効力の少なく
なった抗生物質、リストセチン(riatocetin
)の存在で血小板の凝固活性を示す。
この活性は、リストセチン共同因子活性(第■R因子:
 CoP )と呼ばれており、フォノ・ウィレブランド
因子活性、即ち第■R因子: vWpと同一内容である
と一般に考えられている。この検定法では、ホルマリン
と化学的に結合している正常な血小板を試験試料と混ぜ
た後、抗生物質のりストセチンを添加して血小板の凝固
を起こさせる。この凝固にかかる時間は、凝固の初速度
と試験試料中の第■因子: vWpの量との間の良好な
相関関係をポして光の透過率の法則に従う。既知の標準
の第■R因子: vjlp濃度を有する試験試料と比較
することにより、未知の試料中の第■R因子: vWp
の量を叶算することができる。
免疫学的検定法 (1) 電気免疫学的検定法 高度に精製したヒトの第■因子複合体は、第■因子分子
に対する商力価を持ったウサギ中の異種の抗血清を高め
るために使用することができる。もし、抗血清濃度に対
して第■因子が正確な割合になっていれば、このような
抗血清は必ずヒトの第■因子と反応して沈澱物を生成す
る。この現象は、第■R因子: vWp J:の抗原決
定基(第■R因子: Ag)を測定するための適度に敏
感な技術を開発するために使用することができる。従来
の免疫泳動法(ローレル(1,aurell )C,B
、、(1966)アナリティカル・バイオケミストリ 
15:45)では、特異的な抗血清は1.第■因子が電
気泳動されるアガロースゲルに混ぜられ°ζいる。タン
パク質が移動するに従って、抗血清との相互作用が生じ
て沈澱が形成される。
適当な時間の後、電気泳動を止めるとタンパク質の沈澱
物は固定され、また染色されている。
この抗体−抗原複合体は、“沈澱物のロケット”として
目で見ることができ、その高さは元の試料中に存在する
第■因子抗原の量に比例している。
この技術に部分的な変更を施して、任意の試料中におけ
る第■因子複合体の大きさに関する定性的な情報を得る
ようにすることができる。
この技術は、“2次元交差電気泳動法”とじて知られて
いる。観察される移動が分子の大きさに比例している場
合、試料は抗血清を添加しないでアガロースゲル中で電
気泳動する。適当な時間の後、抗血清を混ぜた第2のア
ガロースゲル中でタンパク質を(最初の電気泳動に対し
て直交する方向に)再び電気泳動させる。沈澱物の列を
固定し、染色した後、1次元に第■因子によって移動し
た距離を測定して分子の大きさを評価する。
(2)酵素結合免疫学的検定法(ELIS^)ヒトの第
■R因子;へgに対して高力価を持っている異種のウサ
ギの抗血清を、特別に設計したミクロ滴定用プレートの
くぼみ内でアルカリ性のpl+で固定する。過剰の抗血
清を取り除いた後、これらのプレートを用い、表面への
非特異的な吸着を防ぐため洗浄剤を加え、中性で試験試
料と標準試料の培養を行なう、プレートは、未結合の試
料がないように完全に洗った後、より多量の同じ抗血清
と反応させる。しかし、この場合抗体は、前辺て酵素の
セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに化学的に結合させ
ておく。
プレートに付着している、酵素と結合している抗血清の
量は、くぼみ中の第■R因子:Agの量と直接的に関係
しており、これは最初の抗血清で固定化されている。定
量化は、特定の特異的な酵素基質を使い、光の吸収則に
基づき着色産物の量を測定することにより行う。このE
LIS^技術の利点は、従来の電気免疫学的検定法と比
べて、少ない時間で済み、異種の抗血清の使用に際して
より経済的であり、また同程度に敏感なことである。
(3)放射免疫検定法(RIA) 高度に精製した第■R因子: vHpを本発明に係る方
法により調製し、これに−塩化ヨウ素法の修正法により
放射性同位7c素12SIで標識した。この標識した物
質は、第■因子: vWpのための拮抗的検定に使用す
ることができ、標識された物質と標識されていない物質
の混合物中でヒトの第■R因子: vWpに対して特異
的な、限界量のウサギ抗血清を拮抗させる。抗体−抗原
複合体は、結合していない抗原(過剰の第■因子: J
p )から分離した後、放射能を測定した。
複合体11弓こ回収された放射能と試験試料中に存在す
る第■R因子: vWpの量との間には逆の相関関係が
ある。次に、標準箱■R因子: vWp濃縮液の連続的
な希釈液を使用して得た結果から作成した標準曲線を使
用して、第■R因子ニジーpのレベルを計算した。従来
の免疫電気泳動法と比べたこのRIAの大きな利点は、
感度が瘍かに商く、また正常な血漿試料中にある第■R
因子;シーpを0.1%のオーダーでそのレベルを正確
に評価することができることである。
、(4)多量体測定技術 第■R因子: vWpは、正常な血漿中を、基本的な第
■因子の分子複合体のポリマー状(多量体的)かたまり
として循環することが知られている。第■因子/フォン
・ウィレブランド因子/リストセチン共同囚子活性は、
フォノ・ウィレブランド病患者からの血漿中には存在し
ないか減少している、より大きな多量体の形態のものと
だけ結びついていると考えられている。これらの多量体
の形態のものは、ルゲリ (RugHeri )とチマ
ーマン(Zimmerman )の多量体の分類技術を
部分的に変更した技術を使用することにより同定するこ
とができる(Z、M’、ルケリとT、、S、チマーマン
(1981)ブロンド 51: 1140−1143゜
M、S、エネイアート(Enayat)とF、G、H’
、ヒル(llil+)(1983) J、Cl1n、P
athol、36: !J15−919 )。
簡単に言うと、第■因子の種々の多量体の形態のものを
それぞれに分離するために8M尿素/2%ドデシル硫酸
ナトリウムで前処珪した後、これらを0.8%アガロー
ス/2.5%ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動に
より相対的な大きさに従って分離した。次に、これらの
クンバク質を固定した後完全に洗浄し、引き続き第■因
子に対して特異的な、放射性同位元素で標識した抗血清
と一緒に培養する。過剰の結合していない抗血清を洗浄
により除去した後、第■因子/放射性同位7c素で標識
した抗第■因子複合体をオートラジオグラフィ技術によ
りゲル中に目で見えるようにする。この結果、X線フィ
ルムへの照射強度及び電気泳動操作中の第■因子: v
Wp分子の相対的移動度により、元の試料中に存在する
第■因子の多量体の形態のものの数、濃度及び大きさに
ついての情報が得られる。
電気泳動操作によって分離されたタンパク質を調べ、定
量するための別の方法が開発されている。ゲルを固定し
、蒸留水で完全に洗浄した後、先ずゲルを0.1%の洗
浄剤トウィーン(Tween )20を含むリン酸塩緩
衝液中でウサギの抗ヒト第■R因子:へgと一緒に培養
する。次に、過剰の結合していないウサギの抗血清を除
去した後、このゲルをブタの抗ウサギ免疫グログリンと
一緒に培養し、引き続きペルオキシダーゼが結合したウ
サギの免疫グログリンと一緒に培養する。
完全に洗浄した後、ケルを0.05%の酵素基質ジアミ
ノヘンジジンと0.2%の過酸化水素で覆う。
染色が終了したとき、ゲルの洗浄と乾燥を行い、保存す
る。バンドは従来法の写真により目で見えるようにする
か、標準的な走査分光測光技術により、染色したバンド
の色強度を測定することにより定量する。
(5)第■C因子:Agの免疫放射検定法何回も輸血さ
れた重症の血友病患者は、時々正常な第■因子;Cに対
する阻害物を生じさせる。このような阻害物は、免疫グ
ログリン(IgG)抗体であることが証明された。これ
は、このような患者の血漿から単離することができ、ま
た第■因子:C活性と関係がある抗原(第■C因子: 
Ag)の定量のための鋭敏な方法において使用すること
ができる。抗第■C因子:Ag作用を有する精製した1
、G分子を還元状態でタンパク質加水分解酵素のペプシ
ンを用いて分解し、抗第■C因子:Ag活性を依然とし
て保持している低分子の活性な断片(Fab’)を生じ
させる。このような調製物を従来法により放射性同位元
素125■で標識した後、試験試料の適当な希釈液に過
剰に加える。37℃で4時間培養した後、商分子量の第
■C因子: Ag−Fab’複合体を含むタンパク質を
、38%飽和硫酸アンモニウムを用いて選択的に沈澱さ
せる。そして、これらの沈澱物中の放射能を測定する。
試料中の第■C因子:^gの量と沈澱物中に回収された
放射能の量との間に良好な相関関係がある。絶対的なレ
ベルは、同時に全検定操作を行った、標準の第■C因子
:へgを含む試料の希釈液と比較することにより評価す
ることができる。
血小抛結合検定法 放射性同位元素で標識した第■R因子;νWpは、リス
トセチンのない状態で第■因子のホルマリンが固定され
た血小板への結合を調べるための極めて鋭敏な検定法に
おいて使用することができる。
血小板は11路賓な提供者の血漿から分離し、ホルマリ
ンで固定した後、使用するまで一80°Cで保存しCお
く。既知量の125■で標識した第■因子を試′l′A
試料に加え、37℃でリストセチンの存在下で“冷却゛
第■因子と限界数の血小板とを拮抗させる。30分後、
血小板を遠心分離で取り除き、上清の適当なアリコート
を放射能測定のために採取する。
ト、清中の同位ノし素の回収量は、試験試料量の第■R
因子:’vWpの量に比例している。そして、絶対量は
、標準の第■R因子: vWp試料を使用して得たデー
タから作成した標準曲線を参考にして計算することがで
きる。
タンパク質分解酵素活性の測定 第■因子複合体は、タンパク質分解酵素活性を落すこと
により不活性化する。これらの多くの酵素は、本発明に
係る操作中に活性化されるが、最終産物が汚染された場
合には、治療面での有用性が制限されることもあり得る
。第■因子間製物中の可能性の高い汚染体は、ト1コン
ピン(第11a因子)と活性化された凝固性第X因子(
第Xa因子)それに接触因子(第XTa及びXIIa因
子)であると考えられている。タンパク質分解酵素活性
は、特異的な色素生産性基質(第Xa因子活性を測定す
るために作ったS 2222、トr:lンビンにはS 
223B、血漿カリクレインにはS 2302)を使っ
て評価することができる。このような基質は、カビビト
ラムへB (Kabivitr+un AR)、(スト
・ンクホルム、スウェーデン)から市販のものを入手す
ることができるが、ミクロ滴定プレー1−におりる、生
産する省にとっ′ζ好ましいように変更した操作により
使用し、分光測光に基づく吸収則により酵素の反応速度
を測定した。
曲性能液体クロマトグラフィ (HPLC)本発明にお
いて使用する親和性支持体を用いたクロマトグラフィ操
作から得られた第■因子を含む分画について、TSK−
3WG−4000(無効排除分子量は1,000,00
0ダルトン)又はTSif−3WG−3000(無効排
除分子量は500,000 )のゲル濾過カラム(ベッ
クマンRIIC、ハイ・ワイコウム、ブックス、英国)
を使用した商性能液体クロマトグラフィ (l(PLC
)によりタンパク質の分子量分布を調べた。これらのカ
ラムを(1,5mff/分又は1.0m6/分で操作し
、14mMクエン酸ナトリウム、2.14mM塩化カル
シウム、0.15M塩化ナトリウムより成る緩衝液(p
H7,0)を使用して展開した。
他の血漿タンパク質のための酵素結合免疫学的検定法(
ELIりA ) 種々の抗原に対する著しい特異性を有する商力価の抗血
清は、市販に供されている。第■R因子:Agのための
ELISA検定で説明した同じ原理を用いて、正常な血
漿タンパク質であるフィブリノーゲン、フィブロネクチ
ン(冷却した不溶性のグログリン、CIG)、プラスミ
ノーゲン、免疫グログリンG (IgG )、免疫グラ
ブリンM (IgM ) 、凝固性第X因子、α−リポ
タンパクfr(HDl2 、分子@ 350.000ダ
ルトン及びHDl、a 、分子量250.000ダルト
ン)及びβ−リポタンパク質(VLDL、分子量は10
,000.000まり大及びLDL、分子量3,000
.000 >と結合している抗原を測定するための特ハ
的なELIS^試験を開発した。
F 実施例 実施例1 カラムクロマトグラフィによる冷却沈澱物からの第■R
因子: vHpの精製方法 @酸デキストラン(15mg/ mlt )の水溶液は
、見掛けの分子1500 、000ダルトンの硫酸デキ
ストラン(フォーマシア・ファイン・ケミカルズ、ウプ
ザラ、スウェーデン)を溶解することにより調製した。
360m l!の硫酸デキストラン溶液を60(ln 
itの固定され、洗浄されたセファロース6B又はセフ
ァロース4B(フォーマシア・ファイン・ケミカルズ、
ウプサラ、スウェーデン)に加えた後、氷で冷やされて
いる反応容器中で攪拌しながら4℃に冷却した。pHを
11.0にm整した後、12mgの臭化シアンを加え、
攪拌した。pHは、4N水酸化ナトリウムの添加により
10.0から11.3の間に保ち、4℃で45分間反応
を続行させた。水酸化ナトリウムの添加を止め、反応物
を攪拌しながら室温に上げた。
なお、pH値は、終始8.5に保っておいた。混合物を
室温で1晩放置しておき、この後樹脂を0.2Mホウ酸
ナナトリウム10.5塩化ナトリウム溶液(pH8,5
)で洗い、引き続き0.2M酢酸ナトリウム10.5M
塩化ナトリウム溶液(pH4,0>で洗った。この樹脂
をシリコーン処理を施したガラスカラムに注ぎ、14畦
クエン酸三ナトリウム、2.14+aM塩化カルシウム
、0.15M塩化ナトリウム溶液(pH6,85)で平
衡させた。クエン酸塩化された全血液の個々の提供物か
ら得られた冷却沈澱物を約40m j!の平衡緩衝液で
再溶解させた後、 1/lO容量の水酸化アルミニウム
(0,25gm/ +nj! )を用いて37℃で3分
間処理し、ビタミンに依存性凝固因子を取り除いた。水
酸化アルミニウムを遠心分離で除去した後、上清をカラ
ムに入れ、溶出液の280mnでの光学濃度が溶出緩衝
液の光学濃度と同じになるまで室温で溶出した。pH6
,85の14n+Mクエン酸三ナトリウム、2.14m
M塩化カルシウム溶液における0、15から1.0Mま
での直線状塩@濃度勾配となっている塩化カルシウムを
入れ、そして約0.47X濃度の塩化ナトリウムで第■
R因子ニジWpを単一成分として迅速に溶出させた。第
■R因子: vWpは、検出し得る程度のフィブリノー
ゲン、第1Xa因子及び第X1因子の後に続いて溶出す
るのが観察できた。極微量のフィブロネクチン、第■因
子:C(カラムに入れた全量の1%まで)及び第■R因
子:Cag(全量の5%)が第■R因子: vWpのピ
ークの突出部分に存在していた。第■R因子: vWp
の収率は、精製系に入れた第■R因子: vWpの約8
5%であった。このタンパク質は、高多量体の形態であ
ることが明らかとなり、最初の物質の操作に係る第■R
因子:へg量の約65%を含んでいた。また、他の35
%の第■R因子:Agは、最初の不要の分画中に存在し
ているが、最初の第■因子:C活性の僅か(5%以下)
しか持っていない第■C因子:Agと共に、検出し得な
い第■R因子: vWp活性を持っている。
実施例2 カラムクロマトグラフィによる全血漿からの第■R因子
: vWpの精製方法 100nlの新鮮で血小板の少ない血漿を、37℃で3
分間かけて10mj!の水酸化アルミニウム溶液(0,
25mg/ vae )に吸収させた後、水酸化アルミ
ニウムを遠心分離で除去した。次に、この吸収された血
漿を、0.15M塩化ナトリウム、14+++Mクエン
酸三ナトリウム及び2.14mM塩化カルシウムより成
る等量の緩衝液(p)16.85)と混ぜた。これを(
実施例1のように調製した)セファロース4Bと結合し
ている65X 1.8cllの硫酸デキストランのカラ
ムに入れた後、溶出用緩衝液を用いて36mff1 /
 hrの速度で展開し、室温でfowlO分画を集める
支持体を緩衝液で洗った後、0.15から0.80Mの
線状濃度勾配となっている塩化ナトリウム溶液を入れ、
そして第■R因子: vWpに対応する分画を0.4M
塩化ナトリウム溶液で溶出した。第■R因子: vWp
の最終収率は、カラムに入った活性量の90%であった
実施例3 塩化ナトリウム以外の塩を用いた、塩類濃度勾配のクロ
マトグラフィによる全血漿からの第■R因子: vWp
の精製方法 −1111小根の少ない血漿全部から第■R因子ニジh
pを精製するために、実施例2で採用した操作方法を多
少変更したが、塩化ナトリウムの代わりに濃度勾配とな
っている他の塩類を使用した。第■R因子: vWpを
含むピークの場所を見つけ易くするため、1.0mAの
放射性同位元素で標識した第■R因子: vWpを2n
j!の血漿に加え(水酸化アルミニウムで処理した後)
、更に1nj!の最初の緩衝液を加えた後、硫酸デキス
トラン−セファロース4Bの支持体を有するaox Q
、9cmのカラムに入れ、そして室温で展開させた。調
べている塩類と塩化ナトリウムの効果を直接比較するこ
とができるように、2本の同じカラムを同時に操作した
。最初の緩衝液は、14mMクエン酸三ナトリウムと2
.14mM塩化カルシウム、pH6,85より成ってい
た。塩類の入った濃度勾配を有する緩衝液は、pH6,
85であり、常に最初の緩衝液と選んだ塩類濃度を含ん
でいる。
電気免疫学的検定法により放射能のピークを測定しζ、
第■R因子:Ag、第■因子血小扱結合活性及び第■R
因子: CoP活性を調べた。全部のケースで、塩類の
濃度勾配により展開された放射能のピークは、測定可能
な第■R因子活性と一致しζいた。放射性同位元素で標
識した物質は、クロマトグラフィ操作において血漿中の
第■R因子: vWpと同じように動いた。選んだ塩類
は、異なる濃度で第■R因子: vWpを溶出させた。
異なる塩類の濃度勾配を使用して活性のピークが溶出さ
れた塩類のモル濃度を表1に示す。これらの実験中、p
iは、塩化ナトリウム溶液における第■因子の最も強い
活性が観察されたp)IであるpH6,85に保ってお
いた。唯一の例外は、炭酸水素アンモニウムについて実
験していた時であり、この際炭酸水素アンモニウムの濃
度勾配は0.05〜1.2Mであり、pHは7.7であ
;た。多くの可溶性塩類は、支持体から第■R因子: 
vWpを溶出させるために使用する濃度勾配で、塩化ナ
トリウムの代わりとなり得る。
表1 塩化ナトリウム NaCl 0.464塩化リチウムL
iCl 0.944 塩化カリウム にC10,286 塩化アンモニウムNH4Cl 0.733塩化マグネ:
/ ラムMg CI2 0.427フン化ナトリウム 
NaF O,733臭化ナトリウム NaBr O,3
81ギ酸ナトリウム NaCHCO20,575ギ酸7
7 モニ’7 ムNH4HCO20,73011v):
r!lIナトリウム NaCH2CO20,644硫酸
ナトリウムNa2SO40,354硫酸アンモニウム(
NH4)2304 0.420炭酸水素7 :/’t 
ニウムN)1411cO30、529実施例4 塩化77モニウムの濃度勾配力ラムクロマトクラフィに
よる血漿からの第■因子複合体の精製方法 実施例1のように作成した硫酸デキストラン・セファロ
ース4B支持体を2本の同じ30X O,9C1mのシ
リコーン処理を施したガラスカラムに注入した後、14
mMクエン酸三ナトリウム/2.14mM塩化カルシウ
ム溶液を4℃で1時間当り 20m Itの一定した速
さで流して平衡にした。9容量の新鮮でクエン酸塩化し
た血小板の少ない血漿を37℃で3分間1容量の水酸化
アルミニウム(0,25mg/ ttl! ) T:処
理した後、水酸化アルミニウムを遠心分離で除去した。
 10mj2の水酸化アルミニウムを吸収した血漿と 
10mj!の吸収していない血漿をそれぞれ別々に2本
のカラムに入れ、両方のカラムに対して同じ濃度勾配の
溶液を用いて同時に溶出させた。
不用の物質を溶出させた後、380m Itの平衡緩衝
液と0.8Mの塩化アンモニウムを含む3801の同じ
緩衝液より成る、直線状濃度勾配となっている塩類溶液
を両方のカラムに同時に通した。3.5nj!の分画に
ついて第■R因子: Ag、フィブリノーゲン、フィブ
ロネクチン、第■R因子: CoP 、第■C因子jA
g及び第■因子:C量を調べた後、実験中4℃で培養し
た血漿試料と比較して全収率を計算した。実験したタン
パク質は、カラムがら溶出した不用の物質中には見出さ
れず、両方のカラムは同じ断面をボした。フィブリノー
ゲンは、0.20Mの塩化゛?ンモニウムで、フィブロ
ネクチンは0.33Mの塩化アンモニウムで、第■R因
子: CoF /第■R因子:へgは0.53Mの塩化
アンモニウムで急峻なピークと17で溶出した。第■C
因子:へgば、第■R因子;^8の大部分から特に分離
し、先ず、フィブリノーゲンと一緒に小さな活性のピー
クとして溶出し、次に直前に溶出する2番目の主要なピ
ークとして溶出したが、0.45Mの塩化アンモニウム
で第■R因子:^g/ R: CoFのピークと重なっ
ていた。この後者の第■C因子:へgのピークには、か
なりの量の活性な第■因子:Cが含まれていた(2段階
検定で評価)。全収率ば、第■R因子:Agが86%、
第■C因子:^gが50%、第■R因子;CoFが10
0%、フィブリノーゲンが50%そしてフィブロネクチ
ンが75%であった。第■因子:Cの全収率は、水酸化
アルミニウムを吸収した物質を使用した場合には、25
%であるが、吸収していない物質を使用した場合には僅
か10%であった。
カリクレインの大部分とトロンビンに似た酵素活性は、
カラムに吸着されていないことがわかり、不用の分画と
一緒に溶出した。第■R因子ニジーpと第■因子:Cに
対応する分肉には、挽く微量のカリクレインとトロンビ
ンに似た酵素活性しか含まれζいなかった。これらのレ
ベルは、水酸化アルミニウムによる処理によって減少し
た。かなりの量の第Xa因子に似た活性が依然として存
在していたが、4℃で10%(L’v)のポリエチレン
グリコール6000を使用して分画中にタンパク質を沈
澱させた後はこの第Xa因子活性は、上清中に残存して
おり、また第■因子は沈澱物中に殆んど回収されていた
実施例5 塩化ナトリウムの濃度勾配カラムクロマトグラフィによ
る冷却沈v物からの第■因子複合体の精製方法 実施例1と同様に、60X 1.6cmのシリコーン処
理を施したガラスカラムに硫酸デキストランが結合した
セファロース4Bを詰めた後、14mMクエン酸三ナト
リウム、2.141IIM塩化カルシウムの溶液(pt
+6.85)を用いて4℃で1時間36mβの速度で流
して平衡にした。正常な提供者からの100m j+の
血液を1/10容量の3.8%のクエン酸三ナトリウム
溶液に採取した後、4℃で30分間、2000X gの
遠心分離を行って血小板の少ない血漿を得た。血漿をポ
リプロピレン試験管中に10111j2の6個の別々の
アリコートに分け、−80℃で一晩保存した。
4℃で解かし、4℃で30分間2000X gの遠心分
離を行った後、上清を捨てた。それぞれの試験管に生じ
た冷却沈澱物に対して、クアトレカサス(Cuatre
casas ) P、ウィルチェック (Wilche
k )i及びアンフィンゼン(Anfinsen) C
,B、 (1968)Proc、Nat、Acad、S
ci、U、S、61: 6367−643の方法に従い
、37℃で5111βの平衡緩衝液で再懸濁させた後、
前原て同じ緩衝液で平衡にしたセファロース4Bと結合
したゼラチンの1I11の(50%vol/ vol 
)懸濁液を加えた。混合した後、37℃で10分間の3
300Xgの遠心分離の前に、試験管を更に37℃で1
5分間培養した。6本のそれぞれの試験管から5mρの
−に清を取り出し、−緒にした後、クロマトグラフィの
カラムに入れた。結合していない物質の溶出が終rした
と判断した後、180mβの最初の緩衝液と180m/
!の0.8M塩化すrリウムより成る線状濃度勾配とな
っ”ζいる塩化ナトリウム溶液を使用して結合している
タンパク質を展開させ、4.0m/lの分画を採取した
。第■因子は、0.52Mの塩化ナトリウムで単一の急
峻なピークとして溶出し、全収率は第■R因子:へgが
87%、第■R因子: CoFが85%、第■C因子:
Agが75%そして第■因子:Cが44%であった。こ
れを、0.15MのNaClで溶出するごとが明らかに
なったプラスミノゲンの全部から、及び0.295Mの
塩化ナトリウムと0.375HのNaClで2つの別個
の成分として溶出したフィブリノーゲンの大部分から、
及び0.40MのNaClで溶出した第■因子から完全
に溶解した。ゼラチン−セファロースによる最初の処理
が、元の冷却沈澱物中に存在する98.5%以上のフィ
ブロネクチンを除去するのに有効であるということを示
すフィブロネクチンは殆ど見出されなかった。免疫グロ
ブリンG(IgG’)は、多くの分画、特にカラムから
溶出する不用の物質中に検出されたが、回収された全1
gGの1%以上が第■因子を含む分画中に見出された。
免疫グロブリンMは、0.62Mの塩化ナトリウムで第
■因子の後に溶出した。色素生産性基質S 2222を
使用して測定したタンパク質分解酵素活性のピークの活
性値により、第Xa因子に似た活性の大部分は、0.2
95Mの塩化ナトリウムでフィブリノーゲンの最初のピ
ークと同時に溶出することが明らかになった。第■因子
に対応する分画には、検出可能なレベルのタンパク質分
解酵素活性が含まれていた。なお、この酵素活性は、S
 2222 (第Xa因子)(カラムからの全溶出液中
にあるものの約10%)と32238 ()ロンビン、
全溶出液中にあるものの約25%)を使用して測定した
ものである。これらのタンパク質分解酵素活性を有する
ものは、109チ(io/v)のポリエチレングリコー
ル6000を使用した4°Cでの処理によっては沈澱し
なかった。この処理によって、第■因子の全部は沈澱し
た。第■因子調製物中に存在している唯一の他の主要な
タンパク質は、種々のタイプのりボタンバク質であった
。これらは、超遠心分離法によって第■因子から分離す
ることができた。
実施例6 凹状に減少するpn勾配を有すると共に直線状の塩化ナ
トリうムの濃度勾配を使用してカラムクロマトグラフィ
により冷却沈澱物がら第■因子複合体を精製する方法 60X 1.6cmノシリコーン処理を施したガラスカ
ラムに、実施例1で調製したように、セファロース4B
に結合した硫酸デキストランを詰めた後、4℃で14m
Mクエン酸三ナトリウム、2.1mM塩化カルシウム、
0.075塩化ナトリウムより成るpH7,3の溶液で
平衡にした。ブロンド・トランスヒユージョン1サービ
ス(Blood Transfusion 5ervi
ces)からの冷却沈澱物の入った2つの袋を全部(全
容量は40mjり37℃で解かした後、平衡緩衝液で1
001にした。次に、この溶液を50mMの塩酸を使用
してpH7,3に滴定した後、室温で13分間2000
 Xl(の遠心分離を行って沈澱物を除去した。得られ
た20m Aの」二請を、更に平衡緩衝液を使用して5
0m eに希釈した後、カラムに入れ、1時間42me
の速度で溶出した。結合していない物質が溶出し終った
と判断したとき、4℃で450mj2の0.15M塩化
ナトリウム、14n+Mクエン酸三ナトリウム、2.I
MPA化力nシ’7 JJa液(pH7,6) &ヒ4
50nl(7)1.00M塩化ナトリウム、14mMク
エン酸三ナトリウム、2.1mM塩化カルシウム溶液(
pH5,8)より成る2段階の直線状塩類濃度勾配を使
用してタンパク質を展開した。この濃度勾配は、塩化ナ
トリウム濃度に関して直線状であり、またpiに関して
凹状である。他方の結合しているタンパク質からの第■
因子複合体の分離は良好に行うことができた。即ら、フ
ィブリノーゲンは0.30M塩化ナトリウム、p116
.9で、フィブロネクチンは0.42M塩化ナトリウム
、pH6,63で、そして第■因子は0.51M塩化ナ
トリウム、pl+6.4でそれぞれ単一成分として溶出
65%及び第■因子二〇粘性が35%であった。
実施例7 凸状に減少するpl+勾配を有すると共に直線状の塩化
ナトリウムの濃度勾配を使用してカラムクロマトグラフ
ィにより冷却沈澱物から第■因子複合体を精製する方法 実施例1で調製したように、60X 1..6=のシリ
コーン処理を施したカラムに硫酸テキストラン・セファ
ロース4B支持体を詰めた。この樹脂を、4℃で14m
Mクエン酸三ナトリウム、2.1mM塩化カルシウムを
含む1.0Mグリシン溶液(pH7,3)を使用して平
衡にした。ブロンド・トランスヒユージョン・サービス
からの冷却沈澱物の入った2つの袋を37℃で解がした
後−緒にし、次に平衡緩(◆i液テ100nl ニ希釈
し、0.05M5M塩酸チル7.3ニ調整した。室温で
遠心分離し、微粒子を除去した後、20m IlO上清
を50m j!に希釈し、これをクロマトグラフィカラ
ムに入れ、そして4℃で1時間、42m1の速さで展開
した。未結合の物質が全部溶出し終わったと判断したと
き、pt+s、sの450.mj!の最初の平衡緩衝液
及び4501の1.0Mグリシン、1.0M塩化ナトリ
ウム、2.1mM塩化カルシウム溶液より成る単純な2
段階濃度勾配を用いて、結合しているタンパク質を展開
した。これにより、塩化ナトリウム濃度に関しては直線
状であるが、pH値の低ドに関しては凸状である溶出プ
ロフィルが得られた。実施例4と同様に、血漿タンパク
質の大部分から第■因子がかなり分解した。フィブリノ
ーゲンは0.15M塩化ナトリウム、pH6,7で、フ
ィブロネクチンは0.28M塩化ナトリウム、pH6,
7で、また第■因子は0.38M塩化ナトリウム、$1
!(6,5で溶出し、全収率は第■R因子]へgが10
0%、第■R因子: CoFが100%、第■C因子:
へgが65%、第■因子:Cは35%であった。
実施例8 ガラスピーズと結合した硫酸デキストランのカラムクロ
マトグラフィによる第■R因子:^gと第■C因子:^
gの精製方法 制御された孔(平均の孔のif径は3125オングスト
ローム)を有し、メソシュ・サイズ120/200の2
.5gn+のガラスピーズ(エレクトロ・ニュークレオ
ニクスInc、、フェアフィールド、N、J、米国)を
洗浄した後、室温で2時間、0.05Mリン酸塩緩衝液
に1%のゼラチンを解かしたpH7,2の溶液500I
l17!を用いて平衡にした。グルクルアルデヒドを最
終濃度が1%(vol/ vol )となるまで添加し
た後、室温で5時間攪拌し、その後更に16時間放置し
た。過剰のタンパク質とグルタルアルデヒドは、ビーズ
を1h塩化すトリウムで洗い、最後に蒸留水で洗うこと
により除去した。 20mβの再懸濁したビーズをlo
omβの硫酸デキストラン(20mg/mjl)に加え
た後、2gmの臭化シアンを攪拌しながら加えた。4N
水酸化ナトリウムを4℃、30分間で添加する間、pn
は10から11の間に保っておいた。更に水酸化ナトリ
ウムを添加するのを止めた後、pH値は、室温ドで20
時間、8.5の一定値に保っておいた。ビーズをt、o
n塩化ナトリウム溶液で濾過、洗浄した。次に、ビーズ
を20X O,9cmのシリコーン処理を施したガラス
カラムに注ぎ込んだ後、室温1’14+wMクエン酸三
ナトリウムと2.14mM塩化カルシウムを含むPII
6.85の溶液を、1時間当り20m 12の流速を維
持して平衡にした。平衡緩衝液を使用して5mlの正常
な欝血した血漿を15mβに希釈したものをカラムに入
れた。不用の物質を全て溶出した後、100m+7!の
平衡緩衝液及びこの同じrii衝液中に1.0Hの塩化
ナトリウムを含む100+wJの緩衝液より成るpH6
,85の直線状塩類濃度勾配液を用いて展開した。第■
R因子;Agは、フィブリノーゲンから良く分解し、フ
ィブリノーゲンは0.25M及び0.3Mの塩化ナトリ
ウム溶液で1対のピークとして溶出した。これに対して
、第■R因子;^gは、0.55M塩化ナトリウム溶液
で単一成分として溶出し、71%の収率であっな。第■
R因子:へgは、フィブロネクチンで汚染されていた。
このフィブロネクチンは、0.51M塩化ナトリウム溶
液でクロマトグラフィにより単一成分として分離され、
この収率は86%であった。第■C因子:へgは、0.
45M塩化ナトリウム溶液で第■R因子:^gから分離
して単一成分として溶出し、その全回収率は55%であ
った。
実施例9 クロマトグラフィカラムからの“段階的″溶出を使用し
た第■因子の精製方法 実施例1におい一ζ作成したように硫酸デキストラン・
セファロース4B支持体を[3,5cmX横5.0am
のシリコーン処理を施したガラスカラムに注ぎ込んだ後
、1.0Mグリシン、14mMクエン酸三ナトリウム及
び2.1s+M塩化カルシウムより成る平衡緩衝液(p
H1,3)を使用し、1時間当り 40m1の流速、温
度4℃で溶出した。ブロンド・トランスヒユーシロン・
サービスからの冷却沈澱物である2つの供与分を37℃
で解かし、平衡緩衝液で容量を100mj!に調整した
後、pHを50wMの塩酸を使用して7.3にm!!し
た。室温で2000X gの予備的な遠心分離を行って
微粒子を除去した後、2勧−の上清を平衡緩衝液を使用
して50m liに希釈し、その後1時間当り 40+
++βの一定の流速でクロマトグラフィカラムに入れ、
1.5mlの分画を集めた。不用の物質が溶出し終った
後、カラムを先ず、1.0台グリシン、14mMクエン
酸三ナトリウム、2.14+++M塩化カルシウム及び
0.175M塩化ナトリウムより成る“中間緩衝液” 
(pH7,0)を用い、1時間当り 40m Itの流
速を維持しながら熔出し、次に1.0Mグリシン、14
mMクエン酸三ナトリウム、2.1+wM塩化カルシウ
ム、0.5F塩化ナトリウムより成る“最終緩衝液”(
pH6,2)を用い、流速を1時間当り200ca l
に増やして溶出した。第■因子は検出されず、そしてカ
ラムから溶出した不用の物質中に最初のフィブリノーゲ
ンの僅か0.04%しか回収されなかった。
最初のフィブリノーゲンの86%は、“中間緩衝液”で
溶出され、これには、検出可能な第■因子:C活性は存
在せず、僅か0.2%の最初の第■R因子:へgと7.
5%の第■C因子:へgを含んでいた。逆に、“最終塩
類緩衝液”を使用して速い流速で溶出させた物質には、
0.2%以下の最初のフィブリノーゲン、60%の第■
R因子:へg、20%の第■C因子:へg及び22%の
第■因子:C活性が含まれていた。商性能液体クロマト
グラフィ (HPLC)とELIS^測定によるこの分
画の分析により、第■因子以外に存在する唯一の主要な
成分はリン脂質であることが明らかになった。リポタン
パク質が表面に浮かんでいる場合、このリン脂質は、1
0%のポリエチレングリコール6500を用いた処理に
よって生じた沈澱物を65.000X gで遠心分離す
ることにより除去できた。“最終緩衝液”の代わりとな
る溶液は、1.0Mグリシン、14+++Mクエン酸三
ナトリウム、2.14wM塩化カルシウム及び0.5M
塩化ナトリウムより成る溶液(pH7,3)であり、こ
れにより略同じ全収率が得られる。
実施例1O 第■因子:v訃のバッチ式精製方法 硫酸デキストラン・セファロース4Bは、実施例1のよ
うに臭化シアン法で調製した。支持体は、0.15M塩
化ナトリウム、14+*Mクエン酸三ナトリウム及び2
.14+++M塩化カルシウム溶液(pH6,85)で
平衡にした後、室温で等量の新鮮で、血小板の少ないク
エン酸塩化血漿及び2容量の平衡緩衝液と混ぜた。支持
体を30分間ゆっくり攪拌した後、+10℃で10分間
3000x gの遠心分離を行い、この後上清を捨てた
。最後に、洗浄した硫酸デキストランのビーズは、0.
80M塩化ナトリウムを含む几の血漿と等しい容量の緩
衝液中に懸濁した後、30分間混合した。この樹脂を1
10℃で再び遠心分離した後、溶出した第■因子: v
Wpを含む上清を取り出した。バッチ式方法における第
■R因子ニジーpの収率は、操作に係る全物質の60%
に相当した。
実施例11 冷却沈澱物からのフィブリノーゲンのバッチ式硫酸デキ
ストラン・セファロース4B支持体は、実施例工のよう
に臭化シアン法で4N製した。7w1Ilの洗浄した樹
脂は、4℃で14mMクエン酸三ナトリウム、2.1m
M塩化カルシウムより成る等量の緩衝液(pH6,85
)中で再懸濁した。7111にの再溶解したブロンド・
トランスヒユージョン・サービスの冷却沈澱物を加えた
後、試験管を30分間攪拌した。
試験管を4℃で5分間2000X gの遠心分離にかけ
た後、上清を取り出した。ゲルを等量の平衡緩衝液中で
5分間再懸濁させた後、遠心分離し、そして上清を取り
出した。−緒にした上清のフィブリノーゲン量は、最初
のフィブリノーゲンの5%以下であったが、第■R因子
:へgは最初の85%、第■因子:Cは最初の50%存
在していた。4℃において、タンパク質が支持体へ結合
する反応速度は、フィブリノーゲンの場合は速く、これ
に対して第■因子複合体の場合は遅い。4℃で22時間
支持体と一緒に培養した後においてのみ、最初の第■因
子の90%以上が支持体と結合する。この実施例におい
て用いた操作の原理は、結合していない第■因子複合体
を更に精製する前に血柴全部からフィブリノーゲンを除
去する方法を提供するものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、第■因子の不純物を遊離の硫酸塩を有する不溶性の
    支持体に吸着させ°ζ、第■因子又は所望の第■因子成
    分を選択的に溶出させることより成る、第■因子複合体
    又はこの成分の1つ又は2つ以上を精製するための精製
    方法。 2、不溶性の支持体は、硫酸デキストラン、硫酸コンド
    ロイチン又は硫酸化アガロースである特許請求の範囲第
    1項記載の精製方法。 3、連続的に又は不連続的に塩類濃度を増加させた緩衝
    液を使用し°ζ不熔性の支持体から所望の物質を溶出さ
    せるようにした特許請求の範囲第1項記載の精製方法。 4、塩11は、アンモニ゛7又はアルカリ金属のハロゲ
    ン化物、ギ酸塩、酢酸塩、硫酸塩又は炭酸水素塩である
    特許請求の範囲第3項記載の精製方法。 5、連続的に又は不連続的にpHを減少させた緩衝液を
    使用して不溶性の支持体から所望の物質を溶出させるよ
    うにした特許請求の範囲第1項から第4項までのいずれ
    か1項に記載の精製方法。 6、 6.0から8.0までのpH及び少なくとも0.
    3Mの塩化ナトリウム濃度を有する緩衝液を用いて不溶
    性の支持体から第■R因子: vWpを溶出させるよう
    にした、第■因子関連フォン・ウィレブランドタンパク
    質(第■R因子: vWp )を精製するための特許請
    求の範囲第1項から第5項までのいずれか1項に記載の
    精製方法。 7、上記緩衝液は、6.7から7.0までのpHと少な
    くとも0.4Mの塩化ナトリウム濃度を有している特許
    請求の範囲第6項記載のlPi製方決方法、第■因子の
    不純物の最初の吸着は、10℃から30℃までの温度で
    行なうようにした特許請求の範囲第1項から第7rJt
    までのいずれか1項に記載の精製方法。 9.1から5ffMまでの濃度の塩化カルシウムを含む
    緩衝液を使用して所望の物質を溶出するようにした特許
    請求の範囲第1項から第8項までのいずれか1項に記載
    の精製方法 10.第■因子の不純物はヒトの血漿又はこれから得ら
    れた冷却沈澱物である特許請求の範囲第1項から第9項
    までのいずれか1項に記載の精製方法。
JP60023365A 1984-02-09 1985-02-08 第8因子の精製方法 Pending JPS60248619A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8403473 1984-02-09
GB848403473A GB8403473D0 (en) 1984-02-09 1984-02-09 Purification of factor viii

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS60248619A true JPS60248619A (ja) 1985-12-09

Family

ID=10556358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP60023365A Pending JPS60248619A (ja) 1984-02-09 1985-02-08 第8因子の精製方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US4578218A (ja)
JP (1) JPS60248619A (ja)
DE (1) DE3504385A1 (ja)
GB (2) GB8403473D0 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62501562A (ja) * 1985-02-01 1987-06-25 ニユ−ヨ−ク ユニバ−シイテイ 抗血友病因子の精製方法
JPS63209750A (ja) * 1987-02-25 1988-08-31 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 血液凝固第8因子精製用吸着体およびそれを用いた血液凝固第8因子の精製法

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5043428A (en) * 1984-08-31 1991-08-27 Behringwerke Aktiengesellschaft Pasteurized, isoagglutinin-free factor VIII preparation and a process for its production
DK525384D0 (da) * 1984-11-05 1984-11-05 Nordisk Insulinlab Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat
GB8505882D0 (en) * 1985-03-07 1985-04-11 Central Blood Lab Authority Purification of blood coagulation factor viii
DE3512910A1 (de) * 1985-04-11 1986-10-16 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur reinigung von plasminogenaktivatoren
US4769336A (en) * 1985-05-24 1988-09-06 Scripps Clinic And Research Foundation Treatment of factor VIII inhibitors
GB2178533B (en) * 1985-07-22 1989-07-19 Asahi Chemical Ind Analytical method of enzyme precursors and device therefor
JPS62191042A (ja) * 1986-02-17 1987-08-21 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 血液凝固第8因子吸着体およびそれを用いた血液凝固第8因子の精製法
AT399095B (de) * 1986-03-27 1995-03-27 Vukovich Thomas Dr Verfahren zur auftrennung von proteinen mittels gradientenelution und vorrichtung zur durchführung des verfahrens
US4795806A (en) * 1987-07-16 1989-01-03 Miles Laboratories, Inc. Phospholipid affinity purification of Factor VIII:C
US5605884A (en) * 1987-10-29 1997-02-25 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Factor VIII formulations in high ionic strength media
FR2632309B1 (fr) * 1988-06-07 1990-08-24 Lille Transfusion Sanguine Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus
DE3904354A1 (de) 1989-02-14 1990-08-16 Behringwerke Ag Pasteurisiertes, gereinigtes von willebrand-faktor-konzentrat und verfahren zu seiner herstellung
US5110907A (en) * 1989-08-01 1992-05-05 Alpha Therapeutic Corporation Factor viii complex purification using heparin affinity chromatography
US5830709A (en) * 1989-10-27 1998-11-03 Benson; Roger E. Detection method for homologous portions of a class of substances
US5202264A (en) * 1989-10-27 1993-04-13 Health Research, Incorporated ELISA using multi-species antibodies for detection of von Willebrand factor in multiple species
US5196311A (en) * 1989-10-27 1993-03-23 Health Research, Incorporated Elisa test for von willebrand factor
BE1004336A3 (fr) * 1991-01-15 1992-11-03 Analis Sa Procede de separation et de quantification de l'hemoglobine glycosylee hb a1c.
AU2253392A (en) * 1991-06-20 1993-01-25 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Therapeutic fragments of von willebrand factor
US5847086A (en) * 1991-06-20 1998-12-08 Centeon L.L.C. Therapeutic fragments of von Willebrand factor
US5525519A (en) * 1992-01-07 1996-06-11 Middlesex Sciences, Inc. Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers
US5659017A (en) * 1995-11-07 1997-08-19 Alpha Therapeutic Corporation Anion exchange process for the purification of Factor VIII
AT403764B (de) * 1996-03-15 1998-05-25 Immuno Ag Stabiler faktor viii/vwf-komplex
AT406373B (de) * 1997-02-27 2000-04-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie
WO2012082933A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Baxter International, Inc. Eluate collection using conductivity gradient
US8557657B1 (en) 2012-05-18 2013-10-15 International Business Machines Corporation Retrograde substrate for deep trench capacitors

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB883549A (en) * 1958-09-03 1961-11-29 Crookes Lab Ltd Improvements in and relating to the purification of antihaemophilic globulin
US3920625A (en) * 1973-06-19 1975-11-18 Kabi Ab Isolation of coagulation factors from biological material using cross linked sulfated, sulfonated carbohydrates
US4022758A (en) * 1973-06-19 1977-05-10 Ab Kabi Isolation of coagulation factors I and VIII from biological material
US4210580A (en) * 1979-06-19 1980-07-01 David Amrani Process for separation and isolation of AHF and fibronectin from blood plasma
US4278594A (en) * 1979-06-19 1981-07-14 David Amrani Process for separation and isolation of AHF, von Willebrand's ristocetin cofactor (VWF:RCF) and fibronectin from blood plasma
AT368883B (de) * 1980-07-22 1982-11-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung einer neuen blutgerinnungsfoerdernden praeparation auf basis von humanproteinen
US4361509A (en) * 1981-12-14 1982-11-30 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
US4471112A (en) * 1982-06-28 1984-09-11 Monsanto Company Heparin polyelectrolyte polymer complex
US4397841A (en) * 1982-06-28 1983-08-09 Monsanto Company Production of blood coagulation factor VIII:C
AT379510B (de) * 1983-05-20 1986-01-27 Immuno Ag Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf) -haeltigen praeparation

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62501562A (ja) * 1985-02-01 1987-06-25 ニユ−ヨ−ク ユニバ−シイテイ 抗血友病因子の精製方法
JPS63209750A (ja) * 1987-02-25 1988-08-31 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 血液凝固第8因子精製用吸着体およびそれを用いた血液凝固第8因子の精製法

Also Published As

Publication number Publication date
US4578218A (en) 1986-03-25
DE3504385A1 (de) 1985-08-14
GB8503192D0 (en) 1985-03-13
GB2154591B (en) 1987-08-19
GB2154591A (en) 1985-09-11
GB8403473D0 (en) 1984-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS60248619A (ja) 第8因子の精製方法
Coller et al. Studies with a murine monoclonal antibody that abolishes ristocetin-induced binding of von Willebrand factor to platelets: additional evidence in support of GPIb as a platelet receptor for von Willebrand factor
JP2554848B2 (ja) Viii:c製剤
Coller Interaction of normal, thrombasthenic and Bernard-Soulier platelets with immobilized fibrinogen: defective platelet-fibrinogen interaction in thrombasthenia
US4657894A (en) New factor VIII coagulant polypeptides
Hershgold et al. Isolation and some chemical properties of human factor VIII (antihemophilic factor)
Fulcher et al. Human factor VIII procoagulant protein. Monoclonal antibodies define precursor-product relationships and functional epitopes.
Olson et al. Purification of porcine and human ristocetin-Willebrand factor
JPH0638790A (ja) ファクターviii:c凝固因子ポリペプチド類に特異的なモノクローナル抗体
Niewiarowski et al. Immunoassay of human platelet factor 4 (PF4, antiheparin factor) by radial immunodiffusion
Connaghan et al. Specific identification of fibrin polymers, fibrinogen degradation products, and crosslinked fibrin degradation products in plasma and serum with a new sensitive technique
US4886876A (en) Factor VIII coagulant polypeptides
Kunicki et al. Human platelet fibrinogen: Purification and hemostatic properties
Knutson et al. Porcine factor VIII: C prepared by affinity interaction with von Willebrand factor and heterologous antibodies: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel analysis
Pitney et al. Inactivation of ‘Arvin’by plasma proteins
Dunn et al. Fibrinogen binding on human platelets. Influence of different heparins and of pentosane polysulfate
US4857635A (en) Factor VIII coagulant polypeptides and monoclonal antibodies tof them
Wickerhauser et al. Development of Large-Scale Fractionation Methods
Ali‐Briggs et al. Antibodies against Platelet Membrane Glycoproteins: I. CROSSED IMMUNOELECTROPHORESIS STUDIES WITH ANTIBODIES THAT INHIBIT RISTOCETIN‐INDUCED PLATELET AGGREGATION
Tran et al. Dissociation of factor VIII procoagulant antigen VIII: CAg and factor VIII related antigen VIIIR: Ag by EDTA-influence of divalent cation on the binding of VIII: CAg and VIIIR: Ag
Cooper et al. The cold-insoluble globulin of plasma and its relationship to factor VIII
Malm et al. Inhibition of human vitamin‐K‐dependent protein‐S‐cofactor activity by a monoclonal antibody specific for a Ca2+‐dependent epitope
Furlan et al. Preparation of Factor VIII‐Deficient Plasma by Immunoadsorption
Tran et al. Rabbit antibodies against the procoagulant activity (VIII: C) of human factor VIII
Madaras et al. Isolation and insolubilisation of human F VIII by affinity chromatography