CN114539393A - 2019-新冠状病毒n蛋白单域抗体及其应用 - Google Patents

2019-新冠状病毒n蛋白单域抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114539393A
CN114539393A CN202011339985.2A CN202011339985A CN114539393A CN 114539393 A CN114539393 A CN 114539393A CN 202011339985 A CN202011339985 A CN 202011339985A CN 114539393 A CN114539393 A CN 114539393A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
single domain
antibody
domain antibody
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011339985.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114539393B (zh
Inventor
叶青
程晓东
许莎莎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Newanbo Xinyi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Newanbo Xinyi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Newanbo Xinyi Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Newanbo Xinyi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202011339985.2A priority Critical patent/CN114539393B/zh
Publication of CN114539393A publication Critical patent/CN114539393A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114539393B publication Critical patent/CN114539393B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了2019‑新冠状病毒N蛋白单域抗体及其应用。本发明筛选得到抗2019‑新型冠病毒N蛋白的单域抗体N2‑8以及N2‑10，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.4或SEQ ID No.9所示。本发明提供的单域抗体活性高,与2019‑新型冠病毒N蛋白具有较强的结合能力，作为检测抗体采用ELISA检测方法或胶体金免疫检测方法能够准确检测样品中新型冠病毒N蛋白的含量。本发明所提供的2019‑新型冠病毒N蛋白的单域抗体或该单域抗体与IgG‑Fc构建得到的融合蛋白能够应用于制备检测2019‑新型冠状病毒N蛋白的试剂或制备治疗2019‑新冠状病毒感染所引起疾病的药物。

Description

2019-新冠状病毒N蛋白单域抗体及其应用
技术领域
本发明涉及单域抗体，尤其涉及抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体以及用该单域抗体与IgG-Fc构建得到的融合蛋白，本发明还涉及它们在检测新型冠病毒N蛋白或治疗由新型冠病毒所导致疾病的药物中的应用，属于抗新型冠病毒单域抗体及其应用领域。
背景技术
2019新型冠狀病毒(2019Novel coronavirus，简称2019-nCoV或2019新冠病毒或SARS-CoV2)的传播主要通过呼吸道系统，病灶主要是肺部，称为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”(Novel coronavirus pneumonia,NCP or COVID-19)。冠状病毒属于套式病毒目，冠状病毒科，分为四个属：甲型、乙型、丙型、丁型。在乙型里面又分为四个亚型，包括A亚型、B亚型、C亚型和D亚型。目前大家知道的甲型里有两个病毒，229E和NL63，在B亚型里有OC43和HKU1，这四个人类冠状病毒可以感染人，但引起的症状很轻，像感冒一样，所以并没有引起人们重视。直到2003年的SARS冠状病毒，2012年的MERS冠状病毒，和今年的新冠病毒出现以后，它们的高传染性、高致死率才引起了人们的高度重视。
2019-nCoV是一类新发现的单股正链RNA冠状病毒。新冠病毒粒子外包脂质双层膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein，是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基(subunit)，即S1和S2，其中S1主要包含有受体结合区(receptor bindingdomain,RBD)，负责识别细胞的受体(angiotensin-converting enzyme 2,AEC2)；S2含有膜融合过程所需的基本元件，S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点；小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(M，Membrane Protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。病毒核衣壳内最重要的蛋白之一核衣壳蛋白(N蛋白)，是冠状病毒中含量最丰富的蛋白，在病毒体组装过程中，其与病毒RNA结合而使螺旋核衣壳形成。N蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。
上世纪九十年代初，比利时自由大学免疫研究所所长Raymond Hamers教授领导的抗体研究组，在辅导医学院学生的实习实验研究中，发现了一种在骆驼血液中自然存在，功能全，仅有重链的抗体。经过后续深入研究，仅一个重链抗体的可变区，称为单域抗体(single domain antibody),由于其仅有2-5nm大小，又称纳米抗体(nanobody)。这种来源于骆驼重链抗体可变区的纳米抗体(VhH)，其分子量(15Kd)只有普通抗体分子量的十分之一，具有普通抗体和其它单价小分子抗体无可比拟的独特性质和优点。单域抗体技术也已成熟，Ablynx公司的抗急性血栓单域抗体药物已在欧美上市，还有多个药物在临床前和临床期研究。
现代最常用的病原体快速检测技术主要是两大类，一类是核酸的检测，另一类是抗原抗体的检测。核酸(DNA或RNA)是病毒的遗传物质，任何物种都有其独一无二的核酸序列，那么对它特征序列的检测即可确定病原体。抗原是能激发人免疫反应产生抗体的任何物质，比如病毒的特征蛋白质是抗原，而人体免疫系统产生用来专门对抗该抗原的另外一种蛋白质(免疫球蛋白)就是它对应的抗体。这一组抗原抗体可以特异性相互结合的特性可以作为检测的理论基础。
目前核酸检测主要方法有测序、PCR、等温扩增及CRISPR技术等。抗原抗体的检测方法主要有胶体金免疫层析、ELISA和免疫化学发光技术等。核酸检测作为SARS-CoV2临床诊断的金标准，但也存在检测时间长、检出率低、需要专门设备、需要培训专业检测人员、检测费用相对较高等缺陷。
由于1个病毒颗粒只含有1条RNA，而病毒颗粒外面含有3000多个N蛋白分子，当核酸检测灵敏度为200-1000拷贝/ml，开发检测病毒N蛋白抗原的检测方法是可行的。因此，应用单域抗体技术平台，筛选SARS-CoV2的N蛋白特异性单域抗体，这对于SARS-CoV2的N蛋白快速检测具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体及其编码基因；
本发明的目的之二是将所述的单域抗体与IgG1-Fc融合得到融合蛋白；
本发明的目的之三将所述的抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体以及单域抗体与IgG1-Fc融合得到融合蛋白应用于制备检测新型冠病毒N蛋白的试剂或制备治疗由新型冠病毒所导致的疾病的药物；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体，所述单域抗体均包括3个互补决定区，所述单域抗体选自所述单域抗体选自N2-8或N2-10；其中，单域抗体N2-8的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；单域抗体N2-10的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
作为本发明一种优选的具体实施方式，单域抗体N2-8的氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示，单域抗体N2-10的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
本发明进一步提供了所述单域抗体的编码基因；优选的，所述单域抗体N2-8的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，所述单域抗体N2-10的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；或者与上述所示的任何一种多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或者与上述所示的任何一种的多核苷酸序列至少有90％以上同一性的多核苷酸序列。
本发明更进一步提供了重组表达载体，所述重组表达载体包含所述抗新型冠病毒N蛋白的单域抗体或人源化单域抗体的编码基因；优选的，所述重组表达载体为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。
本发明还提供了重组宿主细胞，其包含上面所述的重组表达载体。优选的，所述的重组宿主细胞为重组原核表达细胞、重组真核表达细胞，重组真菌细胞或酵重组母细胞，所述重组原核表达细胞优选大肠杆菌。
更进一步的，本发明提供了一种融合蛋白，将本发明提供的单域抗体N2-8或N2-10与IgG-Fc构建得到融合蛋白；优选的，所述Fc基因可以是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段基因；也可以是鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的Fc片段基因；或兔IgG的Fc片段基因或其它种属的抗体Fc片段的基因。
作为本发明一种优选的具体实施方式，本发明将N2-8与IgG-Fc进行融合后得到的一种融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.12所示，将N2-10与IgG-Fc进行融合后得到的一种融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.14所示。
本发明筛选得到的抗2019-新型冠病毒N蛋白的单域抗体活性高、与新型冠病毒N蛋白具有较强的结合能力，特异性强，亲和力高，能够应用于制备检测新型冠病毒N蛋白的试剂或预防2019-新冠状病毒所致疾病的药物。
作为本发明一种优选的具体实施方式，本发明提供了一种2019-新冠状病毒N蛋白的ELISA检测试剂盒，包括：一抗，酶标记的二抗，抗体稀释液、洗涤液、封闭液，显色液；其中，所述的一抗或二抗是单域抗体N2-8或N2-10，或者所述的一抗或二抗是单域抗体N2-8或N2-10与IgG-Fc进行融合后得到的融合蛋白。
作为本发明一种优选的具体实施方式，本发明提供了一种检测2019-新冠状病毒N蛋白的胶体金免疫检测试纸，包括：样品垫、金标记检测抗体结合垫、反应膜、吸附垫和底衬；所述样品垫搭接在所述金标记检测抗体结合垫的一端设置有血细胞阻挡滤膜；所述金标记检测抗体结合垫、反应膜依此相邻粘接在底衬上，所述样品垫搭接在所述金标记检测抗体结合垫上，所述吸水垫搭接在所述吸附垫上；所述反应膜上设置有捕获抗体检测线区带和质量控制线区带；其中，所述金标记检测抗体结合垫内包含金标记的单域抗体N2-8或N2-10或单域抗体N2-8或N2-10与IgG-Fc进行融合后得到的融合蛋白；所述捕获抗体检测线区带包含金标记的单域抗体N2-8或N2-10或单域抗体N2-8或N2-10与IgG-Fc进行融合后得到的融合蛋白。
本发明所涉及的术语定义
本文所用的术语“单域抗体(sdAb)”是指包含了抗体中单个可变域的片段，也称为纳体(Nanobody)。和完整的抗体一样，它可以选择性的和特定抗原结合。与完整抗体的150－160kDa的质量相比，单域抗体则显得小得多，大约只有12－15kDa。第一个单域抗体是从骆驼的重链抗体中人造工程制作出来的，称为“VHH区段”。
本文所用的术语序列的“同一性(identity)”可以与“相同性”互换使用，指的是序列之间通过序列比对软件例如BLAST确定的相似程度。序列比对的方法和软件对于本领域技术人员是公知的。可以通过对已知序列进行一个或几个氨基酸或碱基的取代、缺失和/或添加而获得经改造的核苷酸序列。例如，通过常规手段(例如保守取代等)，对本发明的序列SEQ ID NO：1-198中一个或多个所示的氨基酸或核苷酸序列进行改造，可以获得与这些具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的序列同一性，并且具有基本相同的性能，这都在本发明的保护范围之内。优选地，本发明通过保守取代获得序列同一性，但并不限于保守取代。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照一个方向读取。氨基酸有100多种不同类型，其中20种常用，本发明不排除氨基酸链上有其他物质，例如糖类、脂类等修饰，本发明也不限于20中常用的氨基酸。
术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序，即在DNA中为A、T、G、C的排列顺序，或者在mRNA中A、U、G、C的排列顺序，也包括rRNA、tRNA、mRNA中碱基的排列顺序。应该理解，本发明请求保护的抗体基因除了DNA序列外，也涵盖RNA(rRNA、tRNA、mRNA)以及它们的互补序列。
本发明中所述的取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。因氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而成的突变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(参见例如Nucleic AcidResearch，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用其全文引入本说明书)来制作。
在本说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸，并非限定，但优选为20个以下、15个以下、10个以下、或7个以下，更优选为5个以下。就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，以上述合成寡核苷酸为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。而且，在保持其活性的同时对酶等生物活性肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变源处理基因的方法，以及选择性地断开基因，然后删除、取代、插入或添加选定核苷酸，再进行连接的方法。
术语“表达载体(Expression vectors)”是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。本发明包括但不限于原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或其它细胞表达载体。
术语“框架区(Framework region)”，即骨架区，在免疫球蛋白的H和L链的近N端约有110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区(V)和恒定区(C)。可变区内包含超变区HVR(hypervariable region)或称互补决定区CDR(Complementarity-determining region)与FR骨架区。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
附图说明
图1新冠状病毒N蛋白单域抗体的SDS-PAGE电泳图。
图2纯化的新冠状病毒N蛋白单域抗体与新冠状病毒N蛋白抗原特异性结合的活性试验结果。
图3新冠状病毒N蛋白单域抗体Fc融合蛋白表达纯化后SDS-PAGE还原胶和非还原胶电泳结果。
图4测定新冠状病毒N蛋白抗原的标准曲线。
图5横向胶体金免疫层析试剂卡结构示意图；1、样品垫，2、血细胞阻挡滤膜，3、金标记检测抗体结合垫，4、反应膜，5、反应膜上设置有捕获抗体检测线区带，6、质量控制线区带，7、吸附垫，8，底衬。
图6应用新冠状病毒N蛋白单域抗体采用胶体金免疫层析检测新冠状病毒样品结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1噬菌体展示免疫羊驼单域抗体基因库的设计构建
(1)分离羊驼外周血淋巴细胞和提取纯化RNA：采集5只以上的羊驼全血，分离羊驼外周血淋巴细胞，用RNA抽提试剂盒(QIAGEN)，从得到的淋巴细胞中提取总RNA。
(2)巢式PCR方法获得羊驼重链抗体可变区-VHH：为提高扩增特异性，逆转录引物采用重链抗体的特异引物，合成cDNA第一链，以此模板，分别用两套引物进行PCR扩增重链抗体VHH基因片段。采用巢式PCR方法，第一次PCR扩增中大于800bp的为普通重链基因片段，在800～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，切胶回收缺失轻链重链抗体基因片段，以此为模板用VHH特异性引物经PCR扩增得到VHH目的基因(500bp)。
多样性引物的合成：
Heavy Chain Fd 5’primers:
YTL-1:GGTGGTCCTGGCTGCNCTN；
YTCh-2:GGG GTA CCT GTC ATC CAC GGA CCA GCT GA；
Heavy Chain Fd 3’primers:
YTVHH-F:GATCGCCGGCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG；
YTVHH-B:CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGG；
(3)VHH片段和噬菌体展示载体分别用sfiI(NEB公司)酶切，按适当比例用T4连接酶(NEB公司)进行连接反应，然后电转化TG1感受态。
(4)VHH抗体基因库的库容及多样性的鉴定和保存：根据转化后测定的滴度乘以转化的总量计算库容量。进行了90个电转化，库容量为1.2×1011；随机选出电转后做滴度测定的平板上生长的50个克隆，进行PCR和测序鉴定，50个菌落PCR，全部阳性，扩增片段大小与插入的VHH大小相同；50个克隆测序结果显示没有重复VHH序列，该抗体基因库的库容量和多样性符合设计要求。
实施例2针对SARS-CoV2的N蛋白的单域抗体的制备
(1)针对N蛋白特异性单域抗体的筛选
用SARS-ConV2的N蛋白(北京新百意生物技术有限公司或和北京义翘神州生物技术有限公司)包被免疫管，3轮筛选分别用25ug/ml，15ug/ml和10ug/ml抗原包被。用4％脱脂牛奶PBST封闭，加入上述的噬菌体库结合一定时间，经洗涤，去除非特异性结合噬菌体，用TEA洗脱特异结合的噬菌体，然后扩增，进行3轮筛选。
表l亲和筛选对噬菌体抗体的富集效应
筛选轮数 输入噬菌体效价 输出噬菌体效价
1 1.5×10<sup>12</sup> 2.4×10<sup>4</sup>
2 1.0×10<sup>12</sup> 4.0×10<sup>6</sup>
3 1.1×10<sup>12</sup> 2.02×10<sup>8</sup>
(2)ELISA方法测定单个克隆培养上清，进行阳性克隆筛选
从单个菌落生长分离较好的琼脂平板上随机挑取单个菌落，接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔培养板中培养过夜，离心，分离上清，以N蛋白为抗原包被96孔ELISA板，进行噬菌体ELISA测定，挑选出针对N蛋白的阳性孔克隆，经DNA测序以鉴定针对N蛋白特异性单域抗体克隆的基因序列，其中，N2-8单域抗体的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示，N2-8单域抗体基因的核苷酸序列是SEQ ID No.5所示；N2-10单域抗体的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.9所示，N2-10单域抗体基因的核苷酸序列是SEQ ID No.10所示。
实施例3特异性单域抗体表达质粒的构建
PCR扩增实施例2所获得的特异性的N2-8和N2-10单域抗体基因，获得带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点PCR产物，用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理PCR产物和载体(pSJF2载体)(kim Is.Biosic Biochem.2002,66(5):1148-51)，经T4连接酶连接重组，获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb-pSJF2，并进行基因序列测定以确定其序列的正确性。
实施例4特异性N蛋白单域抗体的表达、纯化和鉴定
(一).特异性N蛋白单域抗体的表达、纯化
(1)将实施例3所述的含有质粒sdAb-pSJF2的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上，37℃过夜。(2)挑选单个菌落接种于5ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜。(3)转种于100ml含氨基苄青霉素的2YT培养液中，37℃摇床培养，220转/分，培养到OD值达0.6～1.0时，加入0.1～0.5M IPTG，继续培养过夜。离心5000转/分钟，20分钟，收菌。(5)加入0.05M Tris缓冲液洗2次菌体，用高渗蔗糖，提取细菌胞周质中表达的可溶性单域抗体，离心收上清中可溶性单域抗体蛋白。(6)经Ni+离子亲和层析磁珠(BeaverBeadsTM His-tag Protein Purification,苏州海狸生物医学工程有限公司)分离获得纯度达90％以上的单域抗体蛋白。结果见图1的SDS-PAGE电泳图。N2-8-pSJF2和N2-10-PSJF带有c-myc和His6标签，其表达蛋白分子大约17kd。
(二).表达的单域抗体活性测定：
1.试验材料：酶标板(Thermofisher公司)，N蛋白抗原，Anti-Myc tag antibody-HRP(北京义翘神州生物技术有限公司)，TMB显色液(北京梅科万德，Cat：1001)，包被液pH9.6，BSA(Sigma公司)。
2.实验过程：
2.1分别包被N蛋白，浓度2ug/ml，100ul/孔，4℃孵育过夜。
2.2加入2％脱脂牛奶PBS封闭，300ul/孔。37℃，孵育1.5h。
2.3稀释不同编号的N蛋白单域抗体至终浓度为10.0ug/ml和1.0ug/ml，100ul/孔。
2.4稀释Anti-Myc tag antibody(HRP)(1:5000)，100ul/孔，37℃孵育1h。
2.5加入TMB显色液，100ul/孔，避光反应10min。
2.6加入50ul/孔2M H2SO4终止反应。(2.7)在450nm波长测OD值。
图2为纯化的N2-8单域抗体以及N2-10单域抗体与N蛋白抗原特异性结合的活性的实验结果，根据试验结果可见，N2-8单域抗体以及N2-10单域抗体与N蛋白抗原具有较高的结合活性。
实施例5特异性N蛋白单域抗体-Fc融合蛋白的载体构建、表达、纯化和鉴定
1.融合蛋白的序列：N2-8-Fc(IgG1-Fc)(该融合蛋白基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.11所示，该该融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.12所示)，N2-10-Fc(IgG1-Fc)(该融合蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No.13所示，该融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.14所示)。
2.构建步骤：N2-8或N2-10+IgG1-Fc基因全合成，加入XhoI-EcoRI双酶切，将其基因连接至p327.7表达载体(北京比洋生物技术有限公司惠赠(专利公布号CN 104195173A))，并加入相应酶切位点和终止密码子,用XbaI-SalI双酶切，将另一sdAb-Fc基因连接至已含有N2-8-Fc或N2-10-Fc(已XhoI-EcoRI双酶切连接)的p327.7表达载体中，最终使一个载体有两条sdAb-Fc序列。
3.N蛋白单域抗体Fc融合蛋白的表达与纯化：
3.1将表达载体N2-8-Fcp327.7或N2-10-Fc-p327.7分别转染CHO/K1细胞，用MSX筛选稳定的蛋白高表达细胞株，共筛选到2株稳定表达细胞株，用稳定表达细胞株，在500ml摇瓶中培养进行蛋白表达。
3.2蛋白质纯化：将上述细胞表达上清用蛋白A株亲和层析纯化，纯化蛋白置换为柠檬酸(0.05％Tween80，pH6.2)缓冲液。N蛋白单域抗体Fc融合蛋白载体所表达纯化的蛋白见图3，图3是2种N蛋白单域抗体Fc融合蛋白表达纯化后，SDS-PAGE还原胶和非还原胶电泳结果。
上述融合蛋白表达载体表达的蛋白分别含有350、350个氨基酸；理论推算值分子量(MW)为，经Hinge二硫键连接分子量分别为7.717KD、7.724KD,等电点分别为(pI)为7.87、7.29，纯化后蛋白电泳SDS-PAGE还原后分子量约为38.5KD左右、非还原分子量为7.7KD左右与理论推算值一致。
实施例6应用单域抗体快速检测SARS-CoV2的N蛋白的检测试验
1.试验原理：
(1)用N2-8-Fc或N2-10-Fc包被ELISA板，当样品中有新冠病毒N蛋白抗原存在时，加入N2-10-Fc或N2-8-Fc标记的HRP，加入底物TMB，与重组表达的N蛋白(北京义翘神州有限公司)所测定量标准曲线比较，能测定出样品中所含有新冠病毒N蛋白抗原的含量。
(2)用N2-8-Fc或N2-10-Fc画线在硝酸纤维素的检测位置，抗人IgG-Fc画线在硝酸纤维素的质控位置，将金标记的N2-10-Fc或N2-8-Fc加载到金标垫上，加入样品，当样品有新冠病毒N蛋白抗原存在时，与金标记的抗体结合，经侧向流层析到检测位置上的特异性抗体结合，出现阳性的紫红色带，如果样品中没有新冠病毒N蛋白抗原存在或含有低于检测灵敏度的新冠病毒N蛋白抗原时，就会在质控位置出现紫红色带，表示测定样品为阴性结果。
2.试验过程：
1)ELISA方法检测：(2.1)用N2-8-Fc或N2-10-Fc包被ELISA板，浓度2ug/ml，100ul/孔，4℃孵育过夜。(2.2)加入2％脱脂牛奶PBS封闭，300ul/孔。37℃，孵育1.5h。(2.3)加入样品或稀释不同浓度的N蛋白，100ul/孔。37℃，孵育1h，PBS洗3次。(2.4)加入N2-10-Fc-HRP或N2-8-Fc-HRP)(1:2500)，100ul/孔，37℃孵育1h，PBS洗3次。(2.5)加入TMB显色液，100ul/孔，避光反应10min。(2.6)加入50ul/孔2M H2SO4终止反应。(2.7)在450nm波长测OD值。
实验结果见图4，为测定N蛋白抗原的标准曲线。
2)胶体金方法
制备的胶体金卡如图5。所述横向胶体金免疫层析试剂卡由样品垫、金标记检测抗体结合垫、反应膜、吸附垫和底衬各个部分组成。所述样品垫搭接在所述金标记检测抗体结合垫的一端设置有血细胞阻挡滤膜；所述金标记检测抗体结合垫、反应膜依此相邻粘接在底衬上，所述样品垫搭接在所述金标记检测抗体结合垫上，所述吸水垫搭接在所述吸附垫的上；所述反应膜上设置有捕获抗体检测线区带和质量控制线区带；所述金标记检测抗体结合垫内包含金标记的N2-10-Fc或N2-8-Fc；所述捕获抗体检测线区带包括N2-8-Fc或N2-10-Fc检测线区带；所述反应膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
将SARS-CoV2的N蛋白稀释为10ng/ml、1ng/ml和100pg/ml,加入到检测卡的样品孔中50ul，10分钟观察结果，加入样品浓度为10ng/ml，约30秒，在检测窗口(T)处，出现紫红色阳性条带；当加入样品1ng/ml,约3分钟在检测窗口(T)处，出现紫红色阳性条带；当加入样品100pg/ml，约10分钟在检测窗口(T)处，出现紫红色阳性条带；检测结果图6所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京纽安博新逸生物科技有限公司
<120> 2019-新冠状病毒N蛋白单域抗体及其应用
<130> BJ-3038-201102A
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 1
Phe Ser Ile Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 2
Ala Ala Ile Ser Lys Ser Gly Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 3
Ala Ala Ser Arg Val Val Val Ser Gly Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Lys Ser Gly Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ala
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Val Val Val Ser Gly Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 372
<212> DNA
<213> Vicugna pacos
<400> 5
caggtgcagc tggtagagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tttgacgctc 60
tcctgtgcag cctctggacg cacctcaaat aactatgcca tggcctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagctgga gtggtggtgg cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa cacaatgtat 240
ttgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agttccagat 300
gcggtagtcg ctggcctcct tccatccgag tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 6
Phe Ser Ile Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 7
Ala Ala Ile Ser Lys Ser Gly Asp Gly Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 8
Val Ala Ser Arg Thr Val Val Ser Gly Ala Ser Pro Asp Glu Tyr Asp
1 5 10 15
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gly Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Lys Ser Gly Asp Gly Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ala
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Ser Arg Thr Val Val Ser Gly Ala Ser Pro Asp Glu Tyr Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 372
<212> DNA
<213> Vicugna pacos
<400> 10
caggtgcaac tggtggagtc tgggggagga ttggtgcaga ctgggggctc tctaggagtc 60
tcctgcgcag cctctggacg caccttcagt atctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagcaaga gtggtgatgg caaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtggct 240
ctacaaatga acagcctgaa atttgaggac acggccgttt attactgtgt agccagtagg 300
acggtagttt ccggggcgag cccagatgag tatgacttgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 11
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 11
caggtgcaac tggtggagtc tgggggagga ttggtgcaga ctgggggctc tctaggagtc 60
tcctgcgcag cctctggacg caccttcagt atctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagcaaga gtggtgatgg caaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtggct 240
ctacaaatga acagcctgaa atttgaggac acggccgttt attactgtgt agccagtagg 300
acggtagttt ccggggcgag cccagatgag tatgacttgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct cagataagac ccacacttgt cctccttgcc ccgctcctga gctgctcggc 420
ggcccatctg tgtttctgtt tccaccaaag ccaaaggatc agctcatgat tagtagaaca 480
cccgaggtga catgcgtcgt ggttgatgtg agccacgaag atcccgaggt caagtttaat 540
tggtacgttg atggcgtgga ggtgcacaac gcaaagacca agccacgcga ggagcagtac 600
aatagcactt accgggtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggattg gctcaatgga 660
aaggagtaca agtgtaaagt ctctaataag gctctgcccg cacctattga aaaaactatt 720
agtaaggcta agggccagcc tagagagccc caggtctaca cactgccacc atctcgcgag 780
gagatgacca agaatcaggt gtccctgaca tgtctcgtca agggctttta ccctagcgat 840
attgccgtcg agtgggagag caacggacag cctgagaata attacaagac aaccccacct 900
gtgctcgatt ccgacggcag cttcttcctg tactctaagc tcacagtcga taagtccaga 960
tggcagcagg gcaatgtgtt ttcttgtagt gtgctgcacg aggcactcca caatcactac 1020
acacagaagt ccctgtccct cagtcccggc 1050
<210> 12
<211> 349
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Lys Ser Gly Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ala
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Val Val Val Ser Gly Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
245 250 255
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
290 295 300
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
305 310 315 320
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His
325 330 335
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345
<210> 13
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 13
caggtgcaac tggtggagtc tgggggagga ttggtgcaga ctgggggctc tctaggagtc 60
tcctgcgcag cctctggacg caccttcagt atctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagcaaga gtggtgatgg caaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtggct 240
ctacaaatga acagcctgaa atttgaggac acggccgttt attactgtgt agccagtagg 300
acggtagttt ccggggcgag cccagatgag tatgacttgt ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct cagataagac ccacacttgt cctccttgcc ccgctcctga gctgctcggc 420
ggcccatctg tgtttctgtt tccaccaaag ccaaaggatc agctcatgat tagtagaaca 480
cccgaggtga catgcgtcgt ggttgatgtg agccacgaag atcccgaggt caagtttaat 540
tggtacgttg atggcgtgga ggtgcacaac gcaaagacca agccacgcga ggagcagtac 600
aatagcactt accgggtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggattg gctcaatgga 660
aaggagtaca agtgtaaagt ctctaataag gctctgcccg cacctattga aaaaactatt 720
agtaaggcta agggccagcc tagagagccc caggtctaca cactgccacc atctcgcgag 780
gagatgacca agaatcaggt gtccctgaca tgtctcgtca agggctttta ccctagcgat 840
attgccgtcg agtgggagag caacggacag cctgagaata attacaagac aaccccacct 900
gtgctcgatt ccgacggcag cttcttcctg tactctaagc tcacagtcga taagtccaga 960
tggcagcagg gcaatgtgtt ttcttgtagt gtgctgcacg aggcactcca caatcactac 1020
acacagaagt ccctgtccct cagtcccggc 1050
<210> 14
<211> 349
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gly Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Lys Ser Gly Asp Gly Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ala
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Ser Arg Thr Val Val Ser Gly Ala Ser Pro Asp Glu Tyr Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
245 250 255
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
290 295 300
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
305 310 315 320
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His
325 330 335
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340 345

Claims (10)

1.抗2019-新冠状病毒N蛋白的单域抗体，所述单域抗体均由框架区和3个互补决定区组成，其特征在于，所述单域抗体选自N2-8或N2-10；其中，单域抗体N2-8的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；单域抗体N2-10的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
2.按照权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，单域抗体N2-8的氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示，单域抗体N2-10的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；
或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2任何一项所述单域抗体的编码基因；优选的，所述单域抗体N2-8的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，所述单域抗体N2-10的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；
或者与上述所示的任何一种多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或者与上述所示的任何一种的多核苷酸序列至少有90％以上同一性的多核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求3所述的编码基因中的一个或多个。
5.一种融合蛋白，其特征在于，将权利要求1或2任何一种的单域抗体与IgG-Fc构建得到的融合蛋白；优选的，所述IgG-Fc基因序列是来源于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段基因，或鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的Fc片段基因，或兔IgG的Fc片段基因，或其它种属的抗体Fc片段的基因。
6.按照权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.12或者其氨基酸序列为SEQ ID No.14所示。
7.权利要求6所述融合蛋白的编码基因，优选的，所述的编码基因的核苷酸序列为SEQID No.11或SEQ ID No.13所示。
8.权利要求1或2所述的单域抗体、权利要求3所述编码基因或权利要求3所述的融合蛋白在制备检测2019-新冠状病毒N蛋白或治疗2019-新冠状病毒所致疾病的试剂或药物中的用途。
9.一种2019-新冠状病毒N蛋白的ELISA检测试剂盒，包括：一抗，酶标记的二抗，抗体稀释液、洗涤液、封闭液，显色液；其特征在于，所述的一抗或二抗是权利要求1或2所述的单域抗体或者是权利要求5所述的融合蛋白。
10.一种检测2019-新冠状病毒N蛋白的胶体金免疫检测试纸，包括：样品垫、金标记检测抗体结合垫、反应膜、吸附垫和底衬；所述样品垫搭接在所述金标记检测抗体结合垫的一端设置有血细胞阻挡滤膜；所述金标记检测抗体结合垫、反应膜依此相邻粘接在底衬上，所述样品垫搭接在所述金标记检测抗体结合垫上，所述吸水垫搭接在所述吸附垫上；所述反应膜上设置有捕获抗体检测线区带和质量控制线区带；其特征在于，所述金标记检测抗体结合垫内包含金标记的权利要求1和2所述的单域抗体或权利要求5所述的融合蛋白；所述捕获抗体检测线区带包含金标记的权利要求1或2所述的单域抗体或权利要求5所述的融合蛋白。
CN202011339985.2A 2020-11-25 2020-11-25 2019-新冠状病毒n蛋白单域抗体及其应用 Active CN114539393B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011339985.2A CN114539393B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 2019-新冠状病毒n蛋白单域抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011339985.2A CN114539393B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 2019-新冠状病毒n蛋白单域抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114539393A true CN114539393A (zh) 2022-05-27
CN114539393B CN114539393B (zh) 2023-06-09

Family

ID=81659987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011339985.2A Active CN114539393B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 2019-新冠状病毒n蛋白单域抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114539393B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116496392A (zh) * 2023-02-01 2023-07-28 武汉科技大学 抗新型冠状病毒n蛋白单域抗体、融合蛋白及其编码基因和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101076543A (zh) * 2004-10-13 2007-11-21 阿布林克斯公司 用于治疗和诊断变性神经疾病如阿尔茨海默症的单结构域骆驼抗淀粉样蛋白β的抗体以及包含它的多肽
CN110520533A (zh) * 2017-01-05 2019-11-29 赫利克斯生物药品公司 治疗癌症的vegfr-2 car免疫细胞
CN111116752A (zh) * 2019-12-24 2020-05-08 北京纽安博生物技术有限公司 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用
CN111272721A (zh) * 2020-03-17 2020-06-12 长春万成生物电子工程有限公司 一种新型冠状病毒荧光定量快速检测试剂盒
CN111537720A (zh) * 2020-05-25 2020-08-14 浙江峻山生物科技有限公司 一种新型冠状病毒2019-nCoV IgM/IgG抗体联合检测试剂盒的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101076543A (zh) * 2004-10-13 2007-11-21 阿布林克斯公司 用于治疗和诊断变性神经疾病如阿尔茨海默症的单结构域骆驼抗淀粉样蛋白β的抗体以及包含它的多肽
CN110520533A (zh) * 2017-01-05 2019-11-29 赫利克斯生物药品公司 治疗癌症的vegfr-2 car免疫细胞
CN111116752A (zh) * 2019-12-24 2020-05-08 北京纽安博生物技术有限公司 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用
CN111272721A (zh) * 2020-03-17 2020-06-12 长春万成生物电子工程有限公司 一种新型冠状病毒荧光定量快速检测试剂盒
CN111537720A (zh) * 2020-05-25 2020-08-14 浙江峻山生物科技有限公司 一种新型冠状病毒2019-nCoV IgM/IgG抗体联合检测试剂盒的制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116496392A (zh) * 2023-02-01 2023-07-28 武汉科技大学 抗新型冠状病毒n蛋白单域抗体、融合蛋白及其编码基因和应用
CN116496392B (zh) * 2023-02-01 2024-05-14 武汉科技大学 抗新型冠状病毒n蛋白单域抗体、融合蛋白及其编码基因和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114539393B (zh) 2023-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112010965B (zh) 一种针对新冠病毒SARS-CoV-2棘突蛋白RBD区的单克隆抗体及其应用
US20230331822A1 (en) SARS-COV-2 spike protein binding molecule and application thereof
US20220089693A1 (en) Nano-antibody and its application based on sars-cov-2 s protein
Wels et al. Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single–chain antibody–phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB–2 receptor
CN113150129B (zh) 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S2蛋白的单链抗体及其应用
CN104804093A (zh) 一种针对cd47的单域抗体
CN113264998A (zh) 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
CN109970858B (zh) Cd22单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
CN111116752B (zh) 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用
CN110003336B (zh) Pd-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
CN110577594A (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体a21、应用及试剂盒
CN114702576B (zh) 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
KR20210031946A (ko) Ns1 단백질의 결합 단백질 및 응용
CN114539393B (zh) 2019-新冠状病毒n蛋白单域抗体及其应用
CN113698475B (zh) 抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条
CN110964113B (zh) 介导结合免疫球蛋白的单域抗体、由其构建的双功能抗体及其应用
US9063141B2 (en) Listeria bacteriophage tailspike protein and uses thereof
CN116063466A (zh) 抗SARS-CoV-2病毒N蛋白的结合抗体及其应用
CN116589569A (zh) 一种抗h7n9亚型流感病毒ha蛋白的纳米抗体及其噬菌体展示文库的构建方法和应用
CN116496392B (zh) 抗新型冠状病毒n蛋白单域抗体、融合蛋白及其编码基因和应用
JP6744670B2 (ja) タグ付抗体
CN118005792A (zh) 一种抗cd99抗原的纳米抗体及其应用
CN113583119A (zh) 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
CN118307665A (zh) 抗新型冠状病毒广谱中和单域抗体、双价人源化单域抗体及其应用
CN112457402B (zh) 抗ceacam6单域抗体、人源化单域抗体及其融合蛋白和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant