CN106866821A - 一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述方法将流式细胞分选技术和高通量测序技术进行结合，其包括的步骤为：获得特定蛋白质W免疫和未免疫的羊驼外周血单个核细胞(PBMC)；采用流式细胞分选法获得针对特定蛋白质W特异的PBMC；提取未免疫、免疫后及分选后PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；以所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白质W的纳米抗体的DNA片段；构建纳米抗体的DNA片段的DNA文库，并进行高通量测序分析；分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度；和将所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。

Description

一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法
技术领域
本发明属于抗体技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法。
背景技术
抗体是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
1993年比利时的Hamers Casterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条重链(H链)和2条轻链(L链)构成的IgG1型常规抗体，还存在缺失轻链的IgG2和IgG3亚型的重链抗(heavy-chain antibody，hcAb)，IgG2和IgG3亚型具有完全的抗原结合能力。这些重链抗体(HcAbs)在羊驼属(Lama)血清中约占总Ig的50％，在骆驼属(Camelus)血清中约占总Ig的75％。重链抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。另外，重链抗体还具有易表达，可溶性好，稳定性强，免疫原性弱，穿透性好等优点。已有的研究表明该重链抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、医疗领域、药物开发等领域有广阔的应用前景。
目前获取纳米抗体最常用的方法是噬菌体抗体库筛选技术，该技术采用聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示，将纳米抗体片段表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性纳米抗体。该技术构建的抗体库称为全套抗体库，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性抗体。
噬菌体抗体库按抗体基因的来源分天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库等。噬菌体抗体库建库的主要步骤包括：首先分离外周血单个核细胞(PBMC)，提取细胞的RNA，经过RT-PCR扩增可变区基因，之后酶切插入噬菌体质粒(phagemid)，转化感受态细胞并扩大培养，获取噬菌体抗体库；之后采用合适的筛选步骤筛选特异性的抗体分子。抗体库的筛选方法主要有两类：一是将抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；二是将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。
虽然噬菌体抗体库技术具有一些明显的优点，如方法简单易行，可通过发酵生产来大量制备；筛选容量增大，可在数周内筛选100万～1亿个克隆，可获得高亲和力的抗体；直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因，可以获得完全人源化的抗体；模拟体内免疫过程和天然全套抗体库，随意“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。然而，噬菌体抗体库技术也存在一些问题，如难于构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库库容和多样性下降等都需要改进。
发明内容
基于获取纳米抗体最常用噬菌体抗体库筛选技术的耗时长，筛选合适抗体困难，难于筛选到高亲和力的最佳抗体分子，难于构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库库容和多样性下降的缺点，本发明提供了一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法。
所采用的技术方案如下：
一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，其步骤包括：
A)获得特定蛋白质W免疫和未免疫的动物外周血单个核细胞(PBMC)，其中蛋白质W为任意蛋白；
B)采用流式细胞分选法获得针对所述特定蛋白质W特异的PBMC；
C)提取步骤A)中所述特定蛋白质W免疫的PBMC、未免疫的PBMC和步骤B)流式细胞分选的PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；
D)以步骤C)中所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白W的纳米抗体的DNA片段；
E)将步骤D)中PCR扩增获得所述纳米抗体的DNA片段的产物构建成DNA文库，并进行高通量测序分析；
F)采用生物信息学方法及分析软件分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度，纳米抗体的体细胞超突变和纳米抗体进化的谱系，并获得纳米抗体DNA片段的核苷酸序列；和
G)将步骤F)中所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。
其中，所述步骤B)采用生物素标记的特定蛋白质W分选特异的PBMC。
所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物为根据纳米抗体恒定区序列设计的引物。
进一步的，两步法PCR的第一步PCR的引物如SEQ ID NO:1和2所示。所述步骤D)中，两步法PCR的第二步PCR的引物如SEQ ID NO:3、4和5所示。
所述步骤E)中DNA文库的构建步骤包括：a)PCR扩增获得的所述纳米抗体DNA片段的末端修复；b)步骤a)中所述修复的纳米抗体DNA片段与Adaptor连接；c)步骤b)中连接adaptor后的所述DNA片段的选择性回收；和d)以步骤c)中所述DNA片段为模板进行PCR扩增，并纯化所述PCR产物。所述步骤d)中使用的引物序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。
所述步骤G)中表达载体为pET28a。
一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤A)中动物选自骆驼属或人。优选的，所述步骤A)中动物为羊驼或者骆驼。
本发明的有益效果：
本发明的高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法主要采用羊驼抗体组库利用高通量测序分析技术可以快速获得高特异性、高结合力(驼类)纳米抗体；本发明的方法简便、快速，动物免疫后，可在4周左右的时间内完成纳米抗体的筛选；工艺简单，成本低。本技术筛选的纳米抗体较常规抗体具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性好、易表达和免疫原性低等特点，比常规抗体用途更广。
详细描述：
纳米抗体：在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm,长4nm,分子量只有15KDa,此也被称作纳米抗体(Nanobody,Nb)。
PBMC是指外周血单个核细胞，英文全称为peripheral blood mononuclear cell，指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。
RNA是核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。
cDNA指互补脱氧核糖核酸，与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。
Adaptor指衔接子是一小段带有一个平端(与双链cDNA连接)和一个粘性端末(可与载体的相应末端连接)的双链核苷酸。它与双链cDNA连接后无需进行限制酶消化。就可以与载体相连接。
附图说明：
图1.为获得同一种抗体本发明技术与噬菌体展示库筛选技术比较。
图2.为获得CD3e纳米抗体库第一步PCR电泳图。泳道1为扩增CD3e纳米抗体DNA片段电泳图，M:DNA maker长度分别为2000、1000、750、500、250、100(bp)。
图3.为获得CD3e纳米抗体库第二步PCR电泳图。泳道1-2为扩增CD3e纳米抗体可变区DNA片段电泳图，M:DNA maker长度分别为2000、1000、750、500、250、100(bp)。
图4.为高通量测序抗体组库中的高频率纳米抗体分布。每个克隆序列占总抗体库序列的百分比。
图5.为表达纯化后的CD3e纳米抗体聚丙烯酰胺电泳图，M为蛋白marker，大小为116、66.2、45、35、25、18.4、14.4(KDa)；1、2和3分别为纯化后的CD3e纳米抗体蛋白。
具体实施方式
下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明
本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。
本发明以获得CD3e纳米抗体的技术过程为例进行说明利用流式细胞分选和高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法：
一、PBMC细胞的分离
1.采用常规方法用CD3e蛋白免疫羊驼，并在免疫前和免疫后获得静脉血。具体采血步骤为：静脉取血30mL，放入预先准备好的加有抗凝剂的50mL离心管内。抗凝剂用量为20-50U每毫升血，分离外周血单个核细胞即PBMC，液氮保存备用。
2.无菌操作分离PBMC，其具体步骤如下：
a、将装有羊驼血液的15mL离心管在室温下离心；
b、吸取上层血清800μL，每管分装标记，保存在-80℃冰箱备用；
c、吸完血清后剩余血液约为2.5mL，共3管，将3管血液吸到一个50mL的离心管内，用2-3mL的灭菌的PBS洗干净离心管，再加入5mL的PBS稀释，另取一个无菌的50mL离心管，倒入15mL的Ficoll分离液，将稀释好的血液缓慢平稳的平铺在Ficoll分离液上，配平离心；
d、离心后，离心管中由上至下分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层；
e、用吸头吸取上层的血浆层并弃去，收集中间第二层环状乳白色单个核细胞层到另一个50mL离心管中，在离心管中加PBS到45mL，混匀，离心10min；
f、在超净台内快速倒掉PBS，将离心管底部PBMC轻轻敲起，再加入PBS至45mL，混匀，重复步骤e再洗一次；
g、加2mL的细胞冻存液，取10μL混匀细胞的细胞冻存液加入10μL台盼蓝混匀在显微镜下用细胞计数板计数；用细胞冻存液调节PBMC浓度，使每1毫升细胞冻存液保存2×106个细胞；
h、将调好浓度的PBMC分装在细胞冻存管内，放于缓冻盒内-80℃过夜，第二天放入液氮中保存。
3.用流式细胞分选仪进行细胞分选，所需原料为生物素标记的CD3e蛋白即CD3e储备液，在100μL CD3e储备液中每百万个分子加入藻红蛋白-链霉亲和素即PE-Streptavidin的量为0.015μg。细胞流式分选时:(1)免疫后的PBMC不标记任何荧光素偶联抗体；(2)未免疫的天然PBMC偶联PE-SA-CD3E储备液作为阴性对照试验，CD3e免疫后的PBMC加偶联PE-SA-CD3E储备液作为实验样本。
二、cDNA的合成
提取三组细胞(未免疫的PBMC、免疫后未进行流式分选的PBMC和免疫后流式分选后的阳性PBMC)中的总RNA，并反转录成cDNA。整个实验过程所用到的试剂、枪头、EP管都是无核糖核酸酶。
具体操作步骤如下：
A、取3组实验细胞各1×104个，分别加入1mL的总核糖核酸提取试剂液，用枪来回吹打几次使细胞充分裂解；
B各加200μL氯仿后剧烈震荡30S，静置5min，12000r/min离心10min，分层，吸取上层液体相到另一1.5mL管中；
C各加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀20min；
D将沉淀液体转移到RNA提取柱中，3min挂住，用700μL缓冲液W2洗两遍，再用60μL无RNA酶水洗脱，得到细胞总RNA；RNA反转录成cDNA；将得到的cDNA转移到已灭菌的1.5mLEP管中，-80℃保存备用。
三、PCR扩增纳米抗体片段
采用如下引物通过两步法PCR扩增获得羊驼抗CD3e的纳米抗体的基因片段，其中R指腺嘌呤或者鸟嘌呤，所述引物kz-001和kz-002为根据纳米抗体序列的恒定区设计引物。未免疫的PBMC、免疫后未进行流式分选的PBMC和免疫后流式分选后的阳性PBMC的cDNA为模板。
kz-001：5’-CAGGTGAAGGTCATCGARTC-3’(SEQ ID NO：1)
kz-002：5’-GATGCTCTTGTGACTCAGGAATC-3’(SEQ ID NO：2)
kz-003：5’-GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：3)
kz-004：5’-GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACAGGTCACCTTGAAGGAGGAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：4)
kz-005：5’-GGAATTCCATATGGATTATAAAGATGATGATAAACAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3’(SEQ ID NO：5)
表1：第一步扩增获得羊驼单链和双链的重链可变区-恒定区(VH-CH)体系及PCR程序
PCR程序：
表2：第二步扩增获得羊驼单链重链可变区(VHH)体系及PCR程序
PCR程序：
PCR得到的电泳结果见附图2，回收大小约450bp的目的片段，备用。
四、高通量测序分析
将(三)中PCR扩增纳米抗体片段的产物构建成DNA文库并送到测序公司进行高通量测序检测。
1.构建DNA文库具体步骤如下：
DNA末端修复→Adaptor连接→连接adaptor后的DNA片段的选择性回收→PCR扩增→PCR产物纯化(30min)
样本要求：5ng-1μg双链DNA，溶于EB(10mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中。DNA纯度要求：OD260/OD280＝1.8～2.0。
DNA末端修复反应
A.向200μl PCR管中加入10倍浓度末端修复反应缓冲液6.5μL、末端修复酶2μL、需要修复的PCR扩增纳米抗体的DNA片段20μL(1μg)和无RNA酶的水36.5μL；
B.用枪头将步骤A中溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心,使所有组分收集到管底；
C.将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：12℃，15min；37℃，15min；72℃，20min；保持4℃。
Adaptor连接
A.向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入DNA连接缓冲液14μL、DNA连接酶2μL和Adaptor 2.5μL；
B.用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底；
C.20℃温浴15min，或者将热盖关闭在PCR仪中20℃温浴15min。
DNA片段的选择性回收
以下操作步骤中，可选择回收DNA片段长度峰值为320bp(插入片段长度200bp)，反应起始体积为100μl。
DNA片段的回收采用康为世纪的纯化试剂盒，纯化过程和步骤参照说明书进行,获得目的DNA片段。
PCR扩增
在PCR管中加入以下试剂并混匀：连接adaptor后的DNA片段23μL、2倍浓度的高保真酶混合液25μL、KZ006引物(SEQ ID NO：6)1μL、接头引物1μl、总体积50μl。引物序列如下，其中*为任意碱基？
kz-006：5’CCACGATTCTGCGGCCGCTTACTGAGGAGACAGTGACCTGGGTCC3’(SEQ ID NO：6)
接头引物-1：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGT*C-3’(SEQ ID NO：7)
接头引物-2：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’(SEQ ID NO：8)
PCR反应条件
PCR产物的纯化采用康为世纪的纯化试剂盒，纯化过程和步骤参照说明书进行,获得目的PCR产物，大小约200bp。DNA文库送测序公司高通量测序。
五.纳米抗体组库序列分析
纳米抗体高通量的测序结果分析采用我们自主设计的分析软件，其主要分析内容包括如下几个方面：(1)纳米抗体的丰度分析，分析每个具有独特序列的纳米抗体在抗体组库中的比例，并按照纳米抗体的丰度由高到低进行排序分析；(2)纳米抗体的体细胞超突变(Somatic Hypermutation)分析,包括突变的位置及突变的频率，通常高的突变频率的纳米抗体具有较强的抗原结合活性；(3)纳米抗体进化的谱系分析(lineage)。
经过测序结果分析的抗CD3e纳米抗体的DNA片段序列结果见图4，1号克隆序列占总纳米抗体序列的47％，2号克隆序列和3号克隆序列占总纳米抗体序列的23％和11％，其他克隆序列所占比例较小。
经过以上系列分析的可能的阳性纳米抗体序列，例如1号克隆序列将会人工合成全序列(SEQ ID NO:9)，并克隆入相应的克隆载体中，准备进一步的活性分析鉴定。
六.构建表达载体、表达抗CD3e的纳米抗体并纯化纳米抗体
1.构建表达载体
将合成的抗CD3e纳米抗体DNA片段双酶切连入表达载体pET28a中，测序正确后在表达宿主中表达。表达载体的酶切条件为载体(1ug)35μL，10倍浓度快切酶缓冲液10μL，两种酶NdeI、NotI各2μL，水51μL，37℃水浴20min，80℃失活10min，琼脂糖凝胶电泳回收定量。DNA片段酶切条件为DNA片段1ug 20μL，10倍浓度快切酶缓冲液10μL，两种酶NdeI、NotI各2μL，水66μL，37℃水浴20min，80℃失活10min，琼脂糖凝胶电泳回收定量。表达载体与DNA片段连接条件：表达载体(50ng/μL)1μL，DNA片段(40ng/μL)1.5μL，10倍浓度的T4脱氧核糖核酸缓冲液1μL，T4脱氧核糖核酸连接酶1μL，水5.5μL，室温1h连接，转入BL21大肠杆菌感受态。
2.诱导表达
将序列正确的样品进行诱导表达，诱导表达步骤为：将正确序列样本菌液与2YT培养基按1:100稀释，37℃，180～200rpm进行摇菌，摇至菌液OD600值为0.6～1.0时，取出少量菌液，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达3～4h，收集菌液，空载体pet28a菌液按照上述正确样本菌液相同诱导表达步骤操作；以未诱导的空载体pet28a菌液、诱导的空载体pet28a菌液和未诱导的正确样本菌液作为对照进行聚丙烯酰胺凝胶电泳试验，结果表明IPTG能够诱导抗CD3e纳米抗体在pet28a菌液中的表达。
3.纯化蛋白
将IPTG诱导、表达后的菌液于离心机中7000rpm，离心10min收集菌体，用缓冲液PBS(PH7.4)清洗一次，再次离心收集菌体；用10mL的PBS(PH7.4)将菌液吹打混匀，置于冰上，放到超声波细胞粉碎仪中，按超声发振时间5s，间隙时间5s，保护温度60℃，超声功率10％的程序超声破碎10min，将破碎后的菌液放于离心机中7000rpm，离心10min，将上清液进行亲和层析纯化，纯化实验结果见图5，保存备用。图5结果表明获得纯化的抗CD3e纳米抗体，且抗CD3e纳米抗体的表达量较高。
七、CD3e纳米抗体酶联免疫活性检测
CD3e抗原用包被液(PH9.6)稀释到2ng/μL，按每孔100μL加入到酶标板中，放置于4℃冰箱中过夜，第二天进行ELISA实验，ELISA步骤如下：
步骤1、按每孔200μL的PBS-T加入包被后的酶标板进行清洗，清洗5次，每次3min，甩掉清洗液，于纸巾上拍板确保洗液全部被吸干；
步骤2、按每孔200μL向酶标板中加入5％的脱脂奶粉，室温封闭1h；
步骤3、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，依次将100μL的空白对照液、阳性对照、阴性对照、纯化后的CD3e抗体加入到酶标板中，室温孵育2h；
步骤4、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，按每孔100μL向酶标板加入HRP标记的标签抗体，室温孵育1h；
步骤5按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后向每孔加入100μL的TMB，避光放置10min；
步骤6、向每孔加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，终止反应，将酶标板放于酶标仪中，于450nm条件下读数。
结果如表3所示：kz87为CD3e纳米抗体的一个克隆号，阳性对照为同行业的一个抗CD3e的纳米抗体单克隆，ELISA结果显示kz87阳性，OD值即效价大于同行业的一个单克隆抗体，是其抗体效价的2倍，说明本发明的方法筛出的抗体序列与抗原结合活性较大。
表3.CD3e纳米抗体酶联免疫活性检测结果
样品 OD值
kz87 0.657
阳性对照 0.352
阴性对照 0.073
空白 0.062
序列表
<110> 申请人名称
<120> 一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法
<130> Reference
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> kz-001的引物序列
<400> 1
caggtgaagg tcatcgartc 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> kz-002的引物序列
<400> 2
gatgctcttg tgactcagga atc 23
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> kz-003的引物序列
<400> 3
ggaattccat atggattata aagatgatga taaacaggtg cagctggtgc agtctgg 57
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> kz-004的引物序列
<400> 4
ggaattccat atggattata aagatgatga taaacaggtc accttgaagg aggagtctgg 60
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> kz-005的引物序列
<400> 5
ggaattccat atggattata aagatgatga taaacaggtg cagctgcagg agtcggg 57
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> kz-006的引物序列
<400> 6
ccacgattct gcggccgctt actgaggaga cagtgacctg ggtcc 45
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头引物-1的引物序列
<400> 7
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt *c 32
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头引物-2的引物序列
<400> 8
acactctttc cctacacgac gctcttccga tc*t 34
<210> 9
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的抗CD3e纳米抗体的基因序列
<400> 9
ggggggggga aattacctct agataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatgg 60
gcagcagcca tcatcatcat catcacagca gcggcctggt gccgcgcggc agccatatgg 120
attacaaaga tgacgacgat aagcaggtgc agctggtgga gtctggggga gggttggtgc 180
aggctgggga ctctgtgaca ctctcctgta cagcctctgg acgcaccttc agtagctatg 240
ccttggcctg gtttcgccaa cgtccaggaa aggagcgtga gttcgtcgca ggtttgaggt 300
ggggtggtcc cacaaactac gcagactccg tgaaggaccg attcaccatc tccggagaca 360
gcgccaagca cacaatgtat ctgcaaatga acagcttgaa acctgaggac acggccgttt 420
attactgtgg atataatccg gggggttggg cggtgccctc ccaatatgag tatgactcgt 480
ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct cagcgcacca cagcgaagac cccagcagag 540
gcggtgggtc aagcggagga ggttctggtg gtggaggctc ccaggtgcag ctggtggact 600
ctgggggagg cttggtgcac tctggggggt ctctgacacc ct 642

Claims (10)

1.一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，其包括的步骤为：
A)获得特定蛋白质W免疫和未免疫的动物外周血单个核细胞(PBMC)，其中蛋白质W为任意蛋白；
B)采用流式细胞分选法获得针对所述特定蛋白质W特异的PBMC；
C)提取步骤A)中所述特定蛋白质W免疫的PBMC、未免疫的PBMC和步骤B)流式细胞分选的PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；
D)以步骤C)中所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白W的纳米抗体的DNA片段；
E)将步骤D)中PCR扩增获得所述纳米抗体的DNA片段的产物构建成DNA文库，并进行高通量测序分析；
F)采用生物信息学方法及分析软件分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度，纳米抗体的体细胞超突变和纳米抗体进化的谱系，并获得纳米抗体DNA片段的核苷酸序列；和
G)将步骤F)中所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。
2.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤B)采用生物素标记的特定蛋白质W分选特异的PBMC。
3.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物为根据纳米抗体序列的恒定区设计的引物。
4.如权利要求1或3所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物如SEQ ID NO:1和2所示。
5.如权利要求4所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤D)中，两步法PCR的第二步PCR的引物如SEQ ID NO:3、4和5所示。
6.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤E)中DNA文库的构建步骤包括：
a)PCR扩增获得的所述纳米抗体DNA片段的末端修复；
b)步骤a)中所述修复的纳米抗体DNA片段与Adaptor连接；
c)步骤b)中连接adaptor后的所述DNA片段的选择性回收；和
d)以步骤c)中所述DNA片段为模板进行PCR扩增，并纯化所述PCR产物。
7.如权利要求6所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤E)中PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO：6、7和8所示。
8.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤G)中表达载体为pET28a。
9.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤A)中动物选自骆驼属或人。
10.如权利要求9所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤A)中动物为羊驼或者骆驼。
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