CN106086009A - 一种利用单个b细胞pcr技术生产全猪源单克隆抗体的方法 - Google Patents

一种利用单个b细胞pcr技术生产全猪源单克隆抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体的方法，属于生物技术领域。本发明利用已有的猪抗体基因文库，设计了多套引物，利用套式PCR，从单个B淋巴细胞扩增出抗体可变区基因，进而筛选出具有中和抗体活性的全猪源单克隆抗体。本发明首次建立了一种利用高通量单个B细胞技术生产全猪源单克隆抗体的方法，相较于传统的抗体制备技术具有效率高、全猪源、基因多样性好等优点，本发明的提出为研究猪的抗体免疫应答和分离治疗性抗体提供了一种新的技术手段。

Description

一种利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体的方法
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，特别涉及一种利用单个B细胞PCR抗体技术生产全猪源单克隆抗体的方法，本发明属于生物技术领域。
背景技术
单克隆抗体是现代生命医学科学的一个重要工具，广泛应用到诊断、治疗、研究等各个领域。高通量单个B细胞PCR抗体技术是目前国际最领先的抗体技术。主要原理为：将目标群体内B细胞通过流式分选单个细胞至96孔板，然后将单个B细胞内抗体基因利用PCR技术克隆至表达载体内，在哺乳动物细胞蛋白表达系统中表达抗体。这种方法保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全天然源性。该技术已经应用在寻找抗肿瘤和抗人类一些重要传染病的中和抗体，如艾滋病，严重急性呼吸道综合征，中东呼吸综合征及埃博拉病毒。但该技术至今还未见在兽医领域的应用报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
一方面，本发明提出了一种利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体的引物组，其包括：
(1)用于单个B淋巴细胞cDNA扩增的引物，所述引物由一条随机引物和4条特异性引物组成，所述的4条特异性引物的序列分别如SEQ ID No.1-4所示；
(2)用于重链可变区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNo.5-10所示，其中SEQ ID No.5-7所示的引物用于第一轮扩增，SEQ ID No.8-10所示的引物用于第二轮扩增；
(3)用于轻链λ链可变区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNo.11-18所示，其中SEQ ID No.11-14所示的引物用于第一轮扩增，SEQ ID No.15-19所示的引物用于第二轮扩增；
(4)用于轻链κ链可变区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNo.20-25所示，其中SEQ ID No.20-22所示的引物用于第一轮扩增，SEQ ID No.23-25所示的引物用于第二轮扩增；
(5)用于猪抗体IgG1重链恒定区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID No.26以及29所示；
(6)用于猪抗体λ轻链恒定区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQID No.27以及29所示；
(7)用于猪抗体κ轻链恒定区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQID No.28以及29所示；
(8)用于CMV启动子片段扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID No.30以及31所示；
(9)用于扩增抗体全长的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID No.30以及29所示。
此外，本发明还提出了所述的引物组在利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体中的用途。
另一方面，本发明还提出了一种利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
(1)B淋巴细胞的分离和筛选
从被抗原免疫的动物外周血中分离得到淋巴细胞，采用密度梯度离心纯化；将抗原采用生物素或荧光素进行标记后，使其与特异性B淋巴细胞结合，采用流式细胞术进行B淋巴细胞分选，把目标单个B淋巴细胞分离至96孔板的孔中；
(2)扩增单个B淋巴细胞的cDNA
以步骤(1)分选的单个B淋巴细胞的RNA为模板，利用随机引物和4条特异性引物逆转录合成cDNA，所述的4条特异性引物的序列分别如SEQ ID No.1-4所示；
(3)扩增单个B淋巴细胞抗体可变区的编码基因
a抗体重链可变区编码基因的扩增：
以步骤(2)扩增得到的cDNA为模板，利用SEQ ID No.5-7所示的引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物为模板，利用SEQ ID No.8-10所示的引物进行第二轮扩增，得到抗体重链可变区的编码基因片段；
b抗体轻链λ链可变区编码基因的扩增：
以步骤(2)扩增得到的cDNA为模板，利用SEQ ID No.11-14所示的引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物为模板，利用SEQ ID No.15-19所示的引物进行第二轮扩增，得到抗体轻链λ链可变区的编码基因片段；
c抗体轻链κ链可变区编码基因的扩增：
以步骤(2)扩增得到的cDNA为模板，利用SEQ ID No.20-22所示的引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物为模板，利用SEQ ID No.23-25所示的引物进行第二轮扩增，得到抗体轻链κ链可变区的编码基因片段；
(4)扩增单个B淋巴细胞抗体恒定区-PolyA的编码基因
a抗体IgG1重链恒定区编码基因-PolyA的扩增
以构建好的含有编码猪抗体IgG1重链恒定区的全基因序列的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.26以及29所示的引物扩增得到IgG1的恒定区-PolyA编码基因片段；
b抗体轻链λ链恒定区编码基因-PolyA的扩增
以构建好的含有编码猪抗体λ轻链恒定区的全基因序列的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.27以及29所示的引物扩增得到抗体轻链λ链恒定区-PolyA编码基因片段；
c抗体轻链κ链恒定区编码基因-PolyA的扩增
以构建好的含有编码猪抗体κ轻链恒定区的全基因序列的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.28以及29所示的引物扩增得到抗体轻链κ链恒定区-PolyA编码基因片段；
(5)CMV启动子片段的扩增：
以pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.30以及31所示的引物扩增得到CMV启动子片段；
(6)含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列的扩增：
以扩增得到的重链或轻链的恒定区、重链或轻链的可变区以及CMV启动子片段为模板，利用SEQ ID No.29以及30所示的引物，扩增得到含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列；
(7)抗体重链以及轻链的配对转染：
于293T细胞上，将步骤(6)获得的含有CMV启动子片段的重链和轻链的全长序列进行共同转染，转染后收集上清，对抗体进行筛选，即得到所述的全猪源单克隆抗体。
在本发明所述的方法中，优选的，所述的转染是取步骤(6)获得的含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列PCR产物各0.6μg，加入到100μl DMEM中，根据QIAGENAttractene转染试剂的说明书操作，加入转染试剂4.5μl，室温作用15min后，加入到293T细胞中，转染后72h收集上清，对抗体进行筛选。
在本发明所述的方法中，优选的，抗体重链可变区编码基因第一轮扩增的PCR程序为：98℃10s、57℃5s、72℃90s，35个循环；72℃5min，第二轮扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃10s、58℃5s、72℃1min，35个循环；72℃5min。
在本发明所述的方法中，优选的，抗体轻链λ链可变区编码基因的第一轮扩增的PCR程序为：98℃10s、55℃5s、72℃60s，35个循环；72℃5min，第二轮扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。
在本发明所述的方法中，优选的，抗体轻链κ链可变区编码基因第一轮扩增的PCR程序为：98℃10s、55℃5s、72℃60s，35个循环；72℃5min，第二轮扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃10s、66℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min。
在本发明所述的方法中，优选的，抗体IgG1重链恒定区-PolyA编码基因扩增的PCR程序为：94℃2min；98℃10s、60℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min。
在本发明所述的方法中，优选的，抗体轻链λ链恒定区编码基因-PolyA扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min；抗体轻链κ链恒定区编码基因-PolyA扩增的PCR程序为：94℃2min；98℃10s、60℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min。
在本发明所述的方法中，优选的，CMV启动子片段扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。
在本发明所述的方法中，优选的，含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。
本发明首次建立了全猪源单个B细胞PCR抗体技术，可用于分离任何猪源病毒的全猪源单克隆抗体。本发明利用已有的猪抗体基因文库，设计了多套引物，利用套式PCR，从单个B细胞扩增出抗体可变区基因，进而获得具有中和抗体效价的全猪源单克隆抗体。本发明首次建立了一种利用高通量单个B细胞技术生产全猪源单克隆抗体的方法，相较于传统的抗体制备技术具有效率高、全猪源、基因多样性好等优点，本发明的提出为研究猪的抗体免疫应答和分离治疗性抗体提供了一种新的技术手段。
附图说明
图1为PEDV抗体监测结果；
图2为重链可变区编码基因的PCR扩增结果；
1:100bp Marker,2-7:来自7个不同孔的VH IgG PCRb扩增结果；
图3为轻链可变区编码基因的PCR扩增结果；
A.λ链可变区。1-5:不同孔的PCR扩增结果；6:100bp DNA
B.κ链可变区。1:100bp DNA marker；2-5:不同孔的PCR扩增结果；
图4为恒定区基因的PCR扩增结果；
1:CMV；2:IgG-CH；3:Cλ；4:Cκ；M1:Marker100bp；M2:DL2000
图5为重轻链全长片段PCR组装扩增结果；
M1:100bp Marker；M2:DL2000marker；1:IgG；2:λ；3:κ
图6为抗体的PEDV病毒抑制实验的间接免疫荧光结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下面仅以PEDV为例说明全猪源抗PEDV单克隆抗体的制备过程，对于其他病毒单抗的制备与此方法相同，根据需要，只需将免疫程序中所使用的PEDV和筛选的特异性抗原替换为其他病毒和抗原即可，本实施例不再进行赘述。
实施例1利用单个B细胞PCR单克隆抗体技术分离全猪源抗PEDV单克隆抗体方法的建立
1、动物免疫
选用3头35日龄左右的健康长白仔猪，编号分别为#241，#242，#243，分别用2ml的PEDV CV777病毒株(104TCID50/ml)后海穴注射(首免)；间隔2周，用2倍首免剂量灭活病毒再进行后海穴注射(二免)；2周后，用本实验室分离的，与二免相同剂量的PEDV强毒株LNCT2株进行加强免疫。监测ELISA抗体和中和抗体效价。剖杀，收集抗凝血和肠系膜淋巴结。
2、单个B淋巴细胞的分离和筛选：
采用PEDV Spike蛋白和抗猪IgG双标记选择PEDV抗原特异性的猪记忆性淋巴细胞。
2.1 PEDV阳性B淋巴细胞的分选：
取PEDV中和抗体阳性猪的外周抗凝血和肠系膜淋巴结，经梯度离心分离淋巴细胞，计数，将细胞稀释至1×106个/100μl，在200μl细胞中加入2μl的抗猪IgG-FITC和anti-PEDV S1-PE进行双染，并设对照，混匀，4℃避光孵育60min。500g/min离心5min，1％BSA PBS洗涤3次，用200μ1 1％BSA的PBS重悬细胞，采用流式细胞术进行B淋巴细胞分选，把FITC和PE双阳性单个B淋巴细胞分离至96孔板的孔中。
2.2 单个B淋巴细胞的处理：
将预先配制的含RNA抑制剂的细胞裂解液(1ml dH2O，10μl 1M Tris pH8.0，25μlRNase Inhibitor)，加入到96孔板中，10μl/孔。流式细胞仪分选的单个B淋巴细胞直接放置干冰上迅速冷冻，冷冻后转移至-80℃保存至RT-PCR。
3 单个B淋巴细胞抗体的制备：
首先对分选的单个B淋巴细胞进行转录扩增，扩增出抗体可变区基因。本实验针对猪源抗体的重、轻链可变区设计多对引物，用来扩增抗体的可变区基因。对扩增产物进行测序分析，如有功能，应用体外重叠PCR组装成完整的重链和轻链，共转染293T细胞，并分析共转染后293T细胞上清所产生抗体的中和活性。
3.1 单个B淋巴细胞Ig基因的转录扩增、测序：
3.1.1 制备cDNA：
以分选单个B淋巴细胞的RNA为模板，进行反转录，以随机引物Random mers和特异性引物IGH cDNA RT primer，IGλV RT primer，IGκV RT primer，IGA Ext PCR rev primer(分别为表1中SEQ ID No.1-4所示)为引物，逆转录合成cDNA。操作方法见反转录试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA，6210A)说明书。引物序列见表1。
表1 扩增抗体可变区的引物
注：R＝A/G,Y＝C/T,S＝C/G,M＝A/C。
3.1.2 扩增单个B淋巴细胞抗体可变区基因
3.1.2.1 抗体可变区引物设计：
抗体可变区基因采用套式PCR扩增。猪抗体可变区基因存在很多变异，根据抗体基因文库(IMGT)已有的猪抗体可变区基因，在抗体的前导序列、1框架区及J序列，利用Primer5软件设计引物用于扩增重链可变区(VH)、κ轻链可变区(Vκ)和λ轻链可变区(Vλ)，引物序列如表1中SEQ ID No.5-25所示。
3.1.2.2 猪源抗体可变区编码基因的扩增：
3.1.2.2.1 重链可变区编码基因的扩增：
以3.1.1扩增得到的cDNA为模板，利用IgHV 1st PCR F primer、IgG ext PCR Revprimer、IgA Ext PCR rev primer引物(分别为表1中SEQ ID No.5-7所示)进行套式PCR的重链第一轮扩增。PCR程序：98℃10s、57℃5s、72℃90s，35个循环；72℃5min。
以第一轮产物为模板，利用IgHV Int PCR F primer，IgG1J1-3 2nd rev primer和IgG1J5 2nd rev primer引物(分别为表1中SEQ ID No.8-10所示)进行第二轮扩增，反应程序：95℃5min；98℃10s、58℃5s、72℃1min，35个循环；72℃5min。将符合预期大小PCR产物(约400bp)进行PCR纯化并测序。
3.1.2.2.2 λ轻链可变区编码基因的扩增：
以3.1.1扩增得到的cDNA为模板，利用IGλV3 1st PCR F primer，IGλV2-6 1stPCR F primer，IGλV8 1st PCR F primer(分别为表1中SEQ ID No.11-13所示)和IGλV 1stRev primer引物(表1中SEQ ID No.14所示)进行套式PCR的轻链λ链的第一轮扩增；PCR程序为：98℃10s、55℃5s、72℃60s，35个循环；72℃5min。
以轻链λ链的第一轮产物为模板，利用不同的上游引物IGλV8int PCR F primer，IGλV3-2int PCR F primer，IGλV3-3int PCR F primer，IGλV3-5int PCR F primer(分别为表1中SEQ ID No.15-18所示)和同一下游引物IGλV 2nd rev primer(表1中SEQ IDNo.19所示)进行第二轮扩增，反应程序：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。将符合预期大小PCR产物(约350bp)进行PCR纯化并测序。
3.1.2.2.3 κ轻链可变区编码基因的扩增：
以cDNA为模板，利用IGκV1 1st PCR F primer，IGκV2 1st PCR F primer(分别为表1中SEQ ID No.20、21所示)和IGκV 1st PCR rev primer引物(表1中SEQ ID No.22所示)进行套式PCR的轻链κ链的第一轮扩增。PCR程序为：98℃10s、55℃5s、72℃60s，35个循环；72℃5min。
以轻链κ链的第一轮产物为模板，利用不同的上游引物IGκV1 V3F primer,IGκV2V3F primer(分别为表1中SEQ ID No.23和24所示)和同一下游引物IGκV2nd rev primer(表1中SEQ ID No.25所示)进行第二轮扩增，反应程序：95℃5min；98℃10s、66℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min。将符合预期大小的PCR产物(约350bp)进行PCR纯化并测序。
3.1.3 PCR产物测序和序列分析：
利用IMGT-V/QUEST以及NCBI对测序的抗体可变区进行分析。
3.1.4 抗体重轻链全长的扩增：
利用融合PCR将抗体重轻链分别与CMV和恒定区的片段连接起来，构成CMV+VH/Vλ/Vκ+CH/Cλ/Cκ序列。各引物序列见表2。
表2 扩增抗体恒定区、CMV和全长的引物
SEQ ID NO. 引物名称 引物序列(5’→3’)
26 IgG-H 2nd F primer GCC CCC AAG ACG GCC CCA TCG GTC TA
27 IgCλ2nd F primer GGT CAG CCC AAG GCC RCT CCC ACG G
28 IgCκ2nd F primer GG CTG ATG CCA AGC CAT CCG TCT TC
29 BGH R1235 TCCCCAGCATGCCTGCTATTGTC
30 CMV F262 AGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAG
31 CR942V2 GGCCAGCACGGAGGCCACCAG
3.1.4.1 抗体恒定区-PolyA片段的扩增：
3.1.4.1.1 猪抗体IgG1重链恒定区的扩增
以本实验室构建好的含有猪抗体IgG1重链恒定区(GenBank:U03781.1)的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用IgG-H 2nd F primer(表2中SEQ ID No.26所示)为上游引物，BGH R1235(表2中SEQ ID No.29所示)为下游引物扩增IgG1的恒定区。反应程序：94℃2min；98℃10s、60℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min；将符合预期大小(1200bp)的重链恒定区-Poly A PCR片段回收并纯化。
3.1.4.1.2 猪抗体κ轻链恒定区的扩增
以本实验室构建好的含有猪抗体κ轻链恒定区(GenBank:FP312898,g132117..132442)的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用IgCκ2nd F primer(表2中SEQ IDNo.28所示)为上游引物，BGH R1235(表2中SEQ ID No.29所示)为下游引物扩增轻链κ链的恒定区。反应程序：94℃2min；98℃10s、60℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min；将符合预期大小(570bp)的κ轻链恒定区-Poly A PCR片段回收并纯化。
3.1.4.1.3 猪抗体λ轻链恒定区的扩增
以本实验室构建好的含有猪抗体λ轻链恒定区(GenBank:CU467669,g2693..3009)的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用IgCλ2nd F primer(表2中SEQ ID No.27所示)为上游引物，BGH R1235(表2中SEQ ID No.29所示)为下游引物扩增IgG1λ链的恒定区。反应程序：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min；将符合预期大小(570bp)的λ轻链恒定区-Poly A PCR片段回收并纯化。
3.1.4.2 CMV启动子片段的扩增：
以pcDNA3.1表达质粒为模板，以CMV F262(表2中SEQ ID No.30所示)为上游引物，CR942V2(表2中SEQ ID No.31所示)为下游引物扩增CMV启动子片段，反应程序：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。将符合预期大小(650bp)的PCR片段回收并纯化。
3.1.4.3 全长的扩增：
以CMV F262(表2中SEQ ID No.30所示)为上游引物，BGH R1235(表2中SEQ IDNo.29所示)为下游引物，以重/轻链的恒定区、重/轻链的可变区和CMV片段为模板，扩增含有CMV启动子片段的重链/轻链的全长序列。反应程序：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。将符合预期大小的抗体的重链(2200bp)和轻链(1500bp)PCR片段回收并纯化。
3.1.4.4 抗体重轻链的配对转染：
于293T细胞上，将配对纯化的抗体的重链和轻链片段进行共同转染，按照QIAGENAttractene转染试剂的说明书操作。取重轻链PCR各0.6μg(以24孔板为例)，加入到100μlDMEM中，根据转染试剂的说明书(Qiagen)，加入转染试剂4.5μl，室温作用15min，将液体加入到细胞(提前用3％FBS，1％双抗的DMEM换液)；转染后72h收集上清，应用PEDV的ELISA试验和PEDV感染抑制试验对抗体进行筛选。
4 抗体鉴定及筛选
4.1 ELISA检测方法
4.1.1 抗PEDV ELISA检测方法
用PBS稀释PEDV CV777病毒至2.5×103TCID50/ml，包被酶标版，100μl/孔，4℃过夜。采用0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3min；5％脱脂乳和5％FBS的PBS封闭酶标板，200μl/孔，37℃，2h，洗板；用抗体转染上清孵育酶标板，37℃1h，洗板；洗涤后加HRP标记的抗猪的抗体(Rabbit anti-pig IgG-HRP，catab6777，8000倍稀释)，于37℃作用1h，洗板；通过TMB(amiresco)使底物显色，100μl/孔，37℃作用10min；最后以2M浓硫酸50μl/孔终止反应，测定OD450nm值。
4.1.2 抗猪IgG ELISA检测方法
用pH9.6的碳酸盐包被液稀释鼠抗猪IgG(BD公司，cat552554)至2μg/ml，包被酶标版，100μl/孔，4℃过夜。采用0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3min；5％脱脂乳和5％FBS的PBS封闭酶标板，200μl/孔，37℃，2h，洗板；用抗体转染293T上清孵育酶标板，37℃1h，洗板；洗涤后加HRP标记的抗猪的抗体(Rabbit anti-pig IgG-HRP，catab6777，16000倍稀释)，于37℃作用1h，洗板；通过TMB(amiresco)使底物显色，100μl/孔，37℃作用15min；最后以2M浓硫酸50μl/孔终止反应，测定OD450nm值。
4.2 抗体的PEDV病毒抑制实验
该实验包括检测抗PEDV IgG感染细胞的制备及间接免疫荧光试验(IFA)，操作如下：
4.2.1 检测抗PEDV IgG感染细胞的制备：
将Vero-E6细胞培养于96孔细胞板，至细胞长成单层后，取160μl 293T抗体转染上清，与80μl PEDV CV777(104TCID50/ml，1：50稀释，含3μl/ml 0.05％胰酶，1％双抗)混合，37℃，孵育1h。用无血清DMEM洗96孔板上的Vero-E6细胞2次，加入上述液体，37℃，继续孵育2h；再用无血清DMEM洗Vero-E6细胞2次洗细胞，加入3％FBS DMEM营养液。48h后，弃上清液，PBST洗涤3次，每孔加入冷4％多聚甲醛100μl，4℃固定30min；甩干，PBST洗涤3次，每孔加入0.2％Triton-X100 100μl，室温通透15min；甩干，PBST洗涤3次，每孔加入10％FBS的PBST100μl，37℃封闭2h；甩干，PBST洗涤3次。-20℃冻存备用或直接进行间接免疫荧光试验(IFA)。
4.2.2 间接免疫荧光试验(IFA)：
检测时，于上述细胞板中，每孔加入100μl(100倍稀释)的抗PEDV核衣壳蛋白鼠源单克隆抗体腹水(本实验室提供)，于37℃作用30min，用PBST洗涤3次；每孔加入100μl(200倍稀释)Alexa Fluor 546荧光标记的羊抗鼠二抗，于37℃作用1h，用PBST洗涤3次；加入100μl(10000倍稀释)的DAPI，于室温作用10min，用PBST洗涤3次；每孔加入50μl的PBS，于倒置荧光显微镜(OLYMPUS型)下观察。
5、结果：
5.1 猪免疫后血清的PEDV抗体效价：
ELISA抗体监测曲线如图1所示，中和抗体效价检测结果如表3。
表3中和抗体效价
5.2 重链可变区编码基因的扩增：
96孔分选的单个B淋巴细胞裂解物经RT-PCR成功扩增得到大小约为400bp的PCR产物，与预期扩增产物大小一致；回收大小正确的PCR产物测序，经与抗体基因库(IMGT)比对分析证实PCR产物为猪抗体重链可变区IgG VH(图2)。
5.3 轻链可变区编码基因的扩增：
96孔分选的单个B淋巴细胞裂解物经PCR成功扩增得到大小约为400bp的PCR产物，与预期扩增产物大小一致；回收大小正确的PCR产物测序分析，经与抗体基因库(IMGT)比对分析证实扩增得到的PCR产物分别为猪抗体λ轻链可变区(Ig Vλ)和猪抗体κ轻链可变区(IgVκ)(图3)。
5.4 恒定区的扩增：
以本实验室构建好的含有猪抗体重链和轻链恒定区的pcDNA3.1表达质粒为模板PCR扩增CMV片段大小约650bp；IgG-CH片段大小约1200bp；Cλ和Cκ大小约为570bp，与预期扩增结果一致(图4)，并测序确认。
5.5 体外组装抗体全长片段：
利用重叠PCR将CMV启动子、抗体可变区和恒定区3个片段组装含CMV启动子和PolyA尾巴的重链和轻链全长片段：IgG全长大小约为2200bp；λ和κ链全长大小约1500bp；与预期扩增结果一致(图5)。
5.6 抗体转染上清的ELISA检测：
将293T细胞转染后含有的抗体上清进行ELISA检测，在阴阳对照成立的情况下，如表4所示，OD值均较高于阴性对照2倍以上。证明同时转染本发明组装的猪的重链和轻链后的293T细胞成功分泌猪IgG抗体，命名为PC10，并且该抗体能够结合PEDV病毒，证实为猪源的抗PEDV抗体。
表4 抗体转染上清的ELISA检测结果
5.7 抗体的PEDV病毒抑制实验：
为进一步证实分离到的抗PEDV抗体有中和活性，本发明进行了PEDV抑制实验。如图6，结果显示，阴性对照细胞对照组和阴性血清对照组的镜下观察中，两者对病毒没有任何中和作用，病毒感染大部分Vero-E6细胞，细胞在镜下呈现红色荧光，与细胞核DAPI染色重叠，呈现红蓝相叠的效果；而在PEDV高免阳性血清对照组的镜下观察中，如我们所预期的一样，阳性血清几乎完全中和了病毒，表现为Vero-E6细胞在镜下仅呈现蓝色的DAPI染色荧光；在猪源化抗体PC10作用的细胞孔中，抗体抑制了绝大部分病毒感染，红色荧光显著减少，说明本发明所获得的PC10抗体具有抑制PEDV病毒的作用。

Claims (10)

1.一种利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体的引物组，其特征在于包括：
(1)用于单个B淋巴细胞cDNA扩增的引物，所述引物由一条随机引物和4条特异性引物组成，所述的4条特异性引物的序列分别如SEQ ID No.1-4所示；
(2)用于重链可变区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID No.5-10所示，其中SEQ ID No.5-7所示的引物用于第一轮扩增，SEQ ID No.8-10所示的引物用于第二轮扩增；
(3)用于轻链λ链可变区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNo.11-18所示，其中SEQ ID No.11-14所示的引物用于第一轮扩增，SEQ ID No.15-19所示的引物用于第二轮扩增；
(4)用于轻链κ链可变区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNo.20-25所示，其中SEQ ID No.20-22所示的引物用于第一轮扩增，SEQ ID No.23-25所示的引物用于第二轮扩增；
(5)用于猪抗体IgG1重链恒定区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQID No.26以及29所示；
(6)用于猪抗体λ轻链恒定区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNo.27以及29所示；
(7)用于猪抗体κ轻链恒定区编码基因扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ IDNo.28以及29所示；
(8)用于CMV启动子片段扩增的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID No.30以及31所示；
(9)用于扩增抗体全长的引物，所述的引物的序列分别如SEQ ID No.30以及29所示。
2.权利要求1所述的引物组在利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体中的用途。
3.一种利用单个B细胞PCR技术生产全猪源单克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)B淋巴细胞的分离和筛选
从被抗原免疫的动物外周血中分离得到淋巴细胞，采用密度梯度离心纯化；将抗原采用生物素或荧光素进行标记后，使其与特异性B淋巴细胞结合，采用流式细胞术进行B淋巴细胞分选，把目标单个B淋巴细胞分离至96孔板的孔中；
(2)扩增单个B淋巴细胞的cDNA
以步骤(1)分选的单个B淋巴细胞的RNA为模板，利用随机引物和4条特异性引物逆转录合成cDNA，所述的4条特异性引物的序列分别如SEQ ID No.1-4所示；
(3)扩增单个B淋巴细胞抗体可变区的编码基因
a抗体重链可变区编码基因的扩增：
以步骤(2)扩增得到的cDNA为模板，利用SEQ ID No.5-7所示的引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物为模板，利用SEQ ID No.8-10所示的引物进行第二轮扩增，得到抗体重链可变区的编码基因片段；
b抗体轻链λ链可变区编码基因的扩增：
以步骤(2)扩增得到的cDNA为模板，利用SEQ ID No.11-14所示的引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物为模板，利用SEQ ID No.15-19所示的引物进行第二轮扩增，得到抗体轻链λ链可变区的编码基因片段；
c抗体轻链κ链可变区编码基因的扩增：
以步骤(2)扩增得到的cDNA为模板，利用SEQ ID No.20-22所示的引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物为模板，利用SEQ ID No.23-25所示的引物进行第二轮扩增，得到抗体轻链κ链可变区的编码基因片段；
(4)扩增单个B淋巴细胞抗体恒定区-PolyA的编码基因
a抗体IgG1重链恒定区编码基因-PolyA的扩增
以构建好的含有编码猪抗体IgG1重链恒定区的全基因序列的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.26以及29所示的引物扩增得到IgG1的恒定区-PolyA编码基因片段；
b抗体轻链λ链恒定区编码基因-PolyA的扩增
以构建好的含有编码猪抗体λ轻链恒定区的全基因序列的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.27以及29所示的引物扩增得到抗体轻链λ链恒定区-PolyA编码基因片段；
c抗体轻链κ链恒定区编码基因-PolyA的扩增
以构建好的含有编码猪抗体κ轻链恒定区的全基因序列的pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.28以及29所示的引物扩增得到抗体轻链κ链恒定区-PolyA编码基因片段；
(5)CMV启动子片段的扩增：
以pcDNA3.1表达质粒为模板，利用SEQ ID No.30以及31所示的引物扩增得到CMV启动子片段；
(6)含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列的扩增：
以扩增得到的重链或轻链的恒定区、重链或轻链的可变区以及CMV启动子片段为模板，利用SEQ ID No.29以及30所示的引物，扩增得到含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列；
(7)抗体重链以及轻链的配对转染：
于293T细胞上，将步骤(6)获得的含有CMV启动子片段的重链和轻链的全长序列进行共同转染，转染后收集上清，对抗体进行筛选，即得到所述的全猪源单克隆抗体，其中，优选的，所述的转染是取步骤(6)获得的含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列PCR产物各0.6μg，加入到100μl DMEM中，根据QIAGENAttractene转染试剂的说明书操作，加入转染试剂4.5μl，室温作用15min后，加入到293T细胞中，转染后72h收集上清，对抗体进行筛选。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于抗体重链可变区编码基因第一轮扩增的PCR程序为：98℃10s、57℃5s、72℃90s，35个循环；72℃5min，第二轮扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃10s、58℃5s、72℃1min，35个循环；72℃5min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于抗体轻链λ链可变区编码基因的第一轮扩增的PCR程序为：98℃10s、55℃5s、72℃60s，35个循环；72℃5min，第二轮扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于抗体轻链κ链可变区编码基因第一轮扩增的PCR程序为：98℃10s、55℃5s、72℃60s，35个循环；72℃5min，第二轮扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃10s、66℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于抗体IgG1重链恒定区-PolyA编码基因扩增的PCR程序为：94℃2min；98℃10s、60℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于抗体轻链λ链恒定区编码基因-PolyA扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min；抗体轻链κ链恒定区编码基因-PolyA扩增的PCR程序为：94℃2min；98℃10s、60℃5s、72℃60s、35个循环；72℃5min。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于CMV启动子片段扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于含有CMV启动子片段的重链或轻链的全长序列扩增的PCR程序为：95℃5min；98℃30s、68℃90s、35个循环；72℃5min。
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