PT1005374E - Micropartículas para administração de ácido nucleico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MICROPARTÍCULAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO"

Antecedentes da Invenção

Esta invenção refere-se a métodos de administração de ácidos nucleicos as células. A terapia génica é uma técnica altamente promissora para o tratamento de doenças hereditárias, e. g., fibrose cística. A terapia génica também pode ser utilizada quando é desejada a expressão de produtos génicos de genes que não se encontram naturalmente nas células hospedeiras, por exemplo, de genes que codificam proteínas citotóxicas dirigidas para a expressão em células cancerosas. A terapia génica pode pertencer a várias categorias. É, algumas vezes, desejável substituir um gene defeituoso durante toda a vida de um mamífero, como no caso de uma doença hereditária, tal como fibrose cística, fenilcetonuria ou doença da imunodeficiência combinada severa (SCID). Noutros casos, pode ser desejável tratar um mamífero com um gene que irá expressar um polipéptido terapêutico durante uma quantidade de tempo limitada, e. g., durante uma infecção. Também podem ser utilizados terapeuticamente ácidos nucleicos na forma de oligonucleótidos anti-sentido ou ribozimas. Além disso, os polipéptidos codificados pelos ácidos nucleicos podem ser estimuladores eficazes da resposta imunitária em mamíferos. 1

Foram utilizadas várias técnicas para introduzir genes em células, incluindo infecção com vectores virais, transferência biolistica, injecção de ADN "nu" (Patente US N° 5580859), e distribuição através de lipossomas ou partículas poliméricas.

No documento WO 9524929, são preparados plasmideos de ADN circular superenrolado encapsulados num processo compreendendo a remoção de solvente.

Sumário da Invenção A invenção baseia-se na verificação de que microparticulas contendo ácidos nucleicos possuindo um tamanho apropriado para fagocitose podem ser preparadas sem afectar adversamente a integridade do ácido nucleico. Estas microparticulas são veiculos altamente eficazes para a distribuição de polinucleótidos a células fagocíticas.

Em geral, a invenção apresenta uma preparação de microparticulas (também denominadas microesferas), cada uma das quais inclui uma matriz polimérica e um vector de expressão de ácido nucleico. A matriz polimérica inclui um ou mais polímeros sintéticos possuindo uma solubilidade em água inferior a cerca de 1 mg/L; no presente contexto, sintético é definido como não ocorrendo naturalmente. Pelo menos 90% das microparticulas possuem um diâmetro inferior a cerca de 100 microns. O ácido nucleico é ARN, pelo menos 50% (e, de um modo preferido, pelo menos, 70% ou mesmo 80%) do qual está na forma de círculos fechados, ou são moléculas de plasmideos de ADN circular, pelo menos 25% (e, de um modo preferido, pelo menos, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% ou mesmo 80%) das quais são superenroladas. Em alguns 2 casos, é desejável que, pelo menos, 90% das micropartículas possuam um diâmetro inferior a cerca de 20 microns, e de um modo preferido, inferior a cerca de 11 microns. O ácido nucleico pode estar distribuído ao longo das micropartículas ou pode estar no núcleo de uma microparticula de núcleo oco. A preparação também pode incluir um composto estabilizador (e. g., um hidrato de carbono, um composto catiónico ou um agente de condensação de ADN). Um composto estabilizador é um composto que actua para proteger o ácido nucleico (e. g., para o manter superenrolado) em qualquer momento durante a produção de micropartículas. Exemplos de compostos estabilizadores incluem dextrose, sacarose, dextrano, álcool polivinílico, ciclodextrina, sulfato de dextrano, péptidos catiónicos e lípidos, tal como brometo de hexadeciltrimetilamónio. O composto estabilizador pode permanecer associado ao ADN após uma libertação posterior da matriz polimérica.

Outra forma de realização da invenção apresenta uma microparticula inferior a cerca de 20 microns em diâmetro, incluindo uma matriz polimérica e ácido nucleico. A matriz polimérica é preparada a partir de um ou mais polímeros sintéticos possuindo uma solubilidade em água inferior a cerca de 1 mg/L. Pelo menos 50% (e, de um modo preferido, pelo menos, 70% ou mesmo 80%) das moléculas de ácido nucleico estão na forma de ADN superenrolado. A matriz polimérica pode ser biodegradável. Biodegradável é aqui utilizado para significar que os polímeros se degradam ao longo do tempo em compostos que se sabe serem eliminados das células hospedeiras através de vias metabólicas normais. Geralmente, um polímero biodegradável será substancialmente 3 metabolizado dentro de cerca de 1 mês após injecção num doente, e certamente dentro de cerca de 2 anos. Em certos casos, a matriz polimérica pode ser preparada a partir de um único co-polímero sintético, biodegradável, e. g., ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA). A proporção de ácido láctico para ácido glicólico no copolimero pode estar no intervalo de cerca de 1:2 até cerca de 4:1 em peso, de um modo preferido dentro do intervalo de cerca de 1:1 até cerca de 2:1 em peso, e de um modo muito preferido cerca de 65:35 em peso. Em alguns casos, a matriz polimérica também inclui uma molécula de direccionamento, tais como um ligando, receptor ou anticorpo, para aumentar a especificidade da microparticula para um dado tipo de célula ou tipo de tecido.

Para certas aplicações, a microparticula possui um diâmetro inferior a cerca de 11 microns. A microparticula pode estar suspensa numa solução aquosa (e. g., para distribuição por injecção) ou estar na forma de um sólido seco (e. g., para armazenamento ou para distribuição através de inalação ou implantação). 0 ácido nucleico pode ser uma sequência de controlo de expressão ligada operacionalmente a uma sequência codificante. As sequências de controlo de expressão incluem, por exemplo, quaisquer sequências de ácido nucleico conhecidas por regularem a transcrição ou tradução, tais como promotores, intensificadores ou silenciadores. Em exemplos preferidos, pelo menos, 60% ou 70% do ADN está superenrolado. De um modo mais preferido, pelo menos, 80% está superenrolado.

Noutra forma de realização, a invenção apresenta uma microparticula inferior a cerca de 20 microns em diâmetro, incluindo uma matriz polimérica e uma molécula de ácido nucleico (de um modo preferido na forma circular fechada), em que o ácido 4 nucleico inclui uma sequência de controlo de expressão ligada operacionalmente a uma sequência codificante. 0 produto de expressão codificado pela sequência codificante pode ser um polipéptido de, pelo menos, 7 aminoácidos de comprimento, possuindo uma sequência essencialmente idêntica à sequência de um fragmento de uma proteína de mamífero que ocorre naturalmente ou de um fragmento de uma proteína que ocorre naturalmente de um agente que infecta ou, de outro modo, danifica um mamífero; ou um péptido possuindo um comprimento e sequência que lhe permite ligar-se a uma molécula de MHC classe I ou II. São apresentados exemplos no documento WO 94/04171, aqui incorporado por referência.

Essencialmente idêntico, no contexto de uma sequência de ADN ou de polipéptido é aqui definido como significando diferir em não mais de 25% da sequência que ocorre naturalmente, quando o alinhamento possível mais próximo é feito em referência à sequência e em que as diferenças não afectam de forma adversa a função desejada do ADN ou polipéptido nos métodos da invenção. 0 fragmento frase de uma proteína é utilizado para referir tudo o que seja menos do que a proteína total. O péptido ou polipéptido pode ser ligado a uma sequência de tráfico. 0 termo "sequência de tráfico" refere-se a uma sequência de aminoácidos que faz com que um polipéptido, ao qual está fundido, seja secretado da célula ou transportado para um compartimento específico da célula, e. g., o núcleo, retículo endoplásmico, um lisossoma ou um endossoma.

Na forma de realização em que o produto da expressão inclui um péptido possuindo um comprimento e sequência que permitem que se ligue a uma molécula de MHC de classe I ou II, o produto de 5 expressão é tipicamente imunogénico. 0 produto de expressão pode possuir uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de uma proteína que ocorre naturalmente, reconhecida por uma célula T numa identidade não superior a 25% dos seus resíduos de aminoácidos, na condição de poder ainda ser reconhecida pela mesma célula T e poder alterar o perfil de citocina da célula T (í. e., um "ligando de péptido alterado"). As diferenças entre o produto de expressão e a proteína que ocorre naturalmente podem, por exemplo, ser construídas para aumentar a capacidade de reacção cruzada para ligação a estirpes virais patogénicas ou alotipo de HLA.

Exemplos de produtos de expressão incluem sequências de aminoácidos, pelo menos, 50% idênticas à sequência de um fragmento de proteína de mielina básica (MBP), proteína de proteolípido (PLP), cadeia invariável, GAD65, antigénio de ilha celular, desmogleína, α-cristalina ou β-cristalina, em que o fragmento se pode ligar à molécula de MHC de classe II. A Tabela 1 lista muitos desses produtos de expressão que se pensa estarem envolvidos na doença auto-imune. Os fragmentos destas proteínas podem ser essencialmente idênticos a qualque r uma das SEQ ID N°: 1-46, tais como os resíduos de MBP 80-102 (SEQ ID N° : D, resíduos de PLP 170-191 (SEQ ID N° : 2) , ou resíduos cadeia invariável 80-124 (SEQ ID N° : 3) Outros fragmentos estão listados na Tabela 2.

Alternativamente, o produto de expressão pode incluir uma sequência de aminoácidos essencialmente idêntica à sequência de uma porção antigénica de qualquer dos antigénios tumorais listados na Tabela 3, tais como aqueles codificados pelos genes E6 e E7 do vírus do papiloma humano, gene Her2/neu, o gene do antigénio específico da próstata, o gene do antigénio do 6 melanoma reconhecido pelas células T (MART) ou o gene do antigénio do melanoma (MAGE). Novamente, o produto de expressão pode ser construído para aumentar a capacidade de reacção cruzada.

Ainda noutros casos, o produto de expressão inclui uma sequência de aminoácidos essencialmente idêntica à sequência de um fragmento antigénico de uma proteína expressa naturalmente por um vírus, e. g., um vírus que infecta cronicamente células, tais como vírus do papiloma humano (HPV), vírus da imunodeficiência humano (HIV), vírus herpes simplex (HSV), vírus da hepatite B (HBV), ou vírus da hepatite C (HCV); uma bactéria, tal como micobacteria; ou um eucariota parasita, tal como a espécie Plasmodium. Uma lista representativa desses fragmentos de ligação de classe I, assim como fragmentos de antigénios tumorais está incluída na Tabela 4.

Noutra forma de realização, a invenção apresenta uma micropartícula inferior a cerca de 20 microns em diâmetro, incluindo uma matriz polimérica e uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico inclui uma sequência de controlo de expressão ligada operacionalmente a uma sequência codificante. O produto de expressão codificado pela sequência codificante é uma proteína que, quando expressa, regula negativamente uma resposta imunitária. Exemplos dessas proteínas incluem proteínas de tolerância, péptidos de bloqueamento de MHC, receptores, factores de transcrição e citocinas.

Noutra forma de realização, a invenção apresenta um processo para preparar micropartículas. Uma primeira solução, incluindo um polímero dissolvido num solvente orgânico, é misturada 7 (e. g., com sonicação, com agitação em vórtice ou num microfluidizador) com uma segunda solução que inclui um ácido nucleico dissolvido ou suspenso num solvente polar ou hidrofilico (e. g., uma solução tampão aquosa contendo, por exemplo, ácido etilenodiaminatetracético, tris (hidroximetil)aminometano ou combinações destes, incluindo opcionalmente um agente de condensação de ADN, tais como um péptido catiónico, um lipido, ou um dendrimero). A mistura forma uma primeira emulsão. A primeira emulsão é então misturada com uma terceira solução que inclui um composto orgânico (e. g., álcool polivinilico), para formar uma segunda emulsão contendo microparticulas de matriz de polímero e ácido nucleico. Os passos de mistura podem ser executados, por exemplo, num homogeneizador, misturador de vórtice, microfluidizador ou sonicador. Ambos os passos de mistura são realizados de um modo que minimiza a fractura do ácido nucleico enquanto produz microparticulas, em média mais pequenas do que 100 microns em diâmetro. TABELA 1: Autoantigénios

Doença Antigénio Associado Notas

Doença do Celíaco α-Gliadina a Síndrome de

Goodpasture Colagénio de membrana basal a

Doença de Graves Receptor da Hormona Estimuladora da Tiróide (TSH) a

Doença de Hashimoto Tiroglobulina a Síndrome de Isaac Canais de potássio dependentes da voltagem b

Diabetes dependente Descarboxilase de Ácido Glutâmico da insulina (GAD) a

Receptor da insulina a

Antigénio associado à insulina (IA-w) a

Hsp b Síndrome miasténico Sinaptogamina em canais de cálcio de Lambert-Eaton dependentes da voltagem b (LEMS)

Esclerose Múltipla Proteína da mielina básica (MBP) a

Proteína de Proteolípido (PLP) a

Proteína Associada a oligodendrócito de Mielina (MOG) a αΒ-cristalina a

Miastenia Grave Receptor de Acetilcolina a

Encefalite

Paraneoplásica Proteína de ligação a ARN HuD b

Pemphigus vulgaris "Complexo do antigénio PeV" a

Desmogleína (DG) c 9 (continuação)

Doença Antigénio Associado Notas Cirrose Biliar Acetiltransferase de Primária esidrolipoamida b Complexo 2 da desidrogenase do piruvato (PDC-E2) d Esclerose sistémica progressiva topoisomerase de ADN a Polimerase de ARN a Artrite reumatóide Colagénio da Imunoglobulina Fc a Escleroderma Topoisomerase I b Sindrome de Stiff- Descarboxilase do ácido glutâmico man (GAD) a Lúpus eritematoso sistémico ADN-cd a Uveite Proteína de ligação a retinóide interfotorreceptor b Antigénio S (segmento sem bastonete) b

Referências: a) HLA e Doença Autoimune, R. Heard, pg· 123-151 em HLA & Doença, Academic Press, Nova Iorque, 1994, (R. Lechler, ed.) b) Cell 80, 7-10 (1995) c) Cell 67, 869-877 (1991) d) JEM 181, 1835-1845 (1995) 10

‘TABELA 2: Péptidos Associados a Classe II Péptido SEQ ID N°: Fonte de Proteína GRTQDENPWHFFKNIVTPRTPP 1 MBP 80- 102 AVYVYIYFNTWTTCQFIAFPFK 2 PLP 17C ι-191 FKMRMAT PLLMQA 3 Cadeia invariável 88- TVGLQLIQLINVDEVNQIV TTNVRLKQQWVDYNLKW 4 AChR α 32-67 QIVTTNVRLKQQWVDYNLKW 5 AChR α 48-67 QWVDYNL 6 AChR α 59-65 GGVKKIHIPSEKIWRPDL 7 AChR α 73-90 AIVKFTKVLLQY 8 AChR α 101-112 WTPPAIFKSYCEIIVTHFPF 9 AChR α 118-137 MKLGTWTYDGSVV 10 AChR α 144-156 MKLGIWTYDGSW 11 AChR α 144-157 análogc ) (1-148) WTYDGSWA 12 AChR α 149-157 SCCPDTPYLDITYHFVM 13 AChR α 191-207 DTPYLDITYHFVMQRLPL 14 AChR α 195-212 FIVNVIIPCLLFSFLTGLVFY 15 AChR α 214-234 LLVIVELIPSTSS 16 AChR α 257-269 S THVMPNWVRKVFID TIPN 17 AChR α 304-322 NWVRKVFIDTIPNIMFFS 18 AChR α 310-327 IPNIMFFSTMKRPSREKQ 19 AChR α 320-337 AAAEWKYVAMVMDHIL 20 AChR α 395-410 IIGTLAVFAGRLIELNQQG 21 AChR α 419-437 GQTIEWIFIDPEAFTENGEW 22 AChR Υ 165-184 MAHYNRVPALPFPGDPRPYL 23 AChR Υ 476-495 LNSKIAFKIVSQEPA 24 desmogleína 3 190-204 TPMFLLSRNTGEVRT 25 desmogleína 3 206-220 11 (continuação) Péptido SEQ ID N°: Fonte de Proteína PLGFFPDHQLDPAFGA 26 HBS preSl 10-25 LGFFPDHQLDPAFGANS 27 HBS preSl 11-27 FFLLTRILTI 28 HBS Ag 19-28 RILTIPQSLD 29 HBS Ag 24-33 TPTLVEVSRNLGK 30 HSA 444-456 ΑΚΤIAYDEEARR 31 hsp 65 2-13 VVTVRAERPG 32 hsp 18 61-70 SQRHGSKYLATASTMDHARHG 33 MBP 7-27 RDTGILDSIGRFFGGDRGAP 34 MBP 33-52 QKSHGRTQDENPVVHFFKNI 35 MBP 74-93 DENPVVHFFKNIVT 36 MBP 84-97 ENPVVHFFKNIVTPR 37 MBP 85-99 HFFKNIVTPRTPP 38 MBP 90-102 KGFKGVDAQGTLSK 39 MBP 139-152 VDAQGTLSKIFKLGGRDSRS 40 MBP 144-163 LMQYIDANSKFIGITELKK 41 Toxóide do Tétano 828-846 QYIKANSKFIGIT 42 Toxóide do Tétano 830-842 FNNFTVSFWLRVPK 43 Toxóide do Tétano 947-960 SFWLRVPKVSASHLE 44 Toxóide do Tétano 953-967 KFIIKRYTPNNEIDSF 45 Toxóide do tétano 1174-1189 GQIGNDPNRDIL 46 Toxóide do tétano 1273-1284 12 TABELA 3: Antigénios Tumorais

Cancro Antigénio Associado

Melanoma BAGE 2- 10 Mama/Ovário C-ERB2 (Her2/neu) Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBNA-1 Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBNA-2 Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBNA-3 Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBNA-3A Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBNA-3C Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBNA-4 Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBNA-6 Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBV Linfoma de Burkitt/Linfoma de Hodgkin EBV LMP2A Melanoma GAGE-1 Melanoma gp75 Cervical HPV 16 E6 Cervical HPV 16 E7 Cervical HPV 18 E6 Cervical HPV 18 E7 Melanoma MAG Melanoma MAGE-1 Melanoma MAGE-2 Melanoma MAGE-3 Melanoma MAGE-4b Melanoma MAGE-5 Melanoma MAGE-6 Melanoma MART-1/Melan-A Pancreático/Mama/ovárico MUC-1 Melanoma MUM-l-B Mama/Colorrectal/Linfoma de Burkitt p53 13 (continuação)

Cancro Antigénio Associado

Melanoma Pmel 17 (gplOO) Próstata Antigénio Especifico de PSA da Próstata Melanoma Tirosinase Antigénio Carcino- embrionário de CEA Proteina de Resistência a LRP de Pulmão Bcl-2 Ki-67 TABELA 4: Tumor associado a Classe I e péptidos de patogénio Péptido SEQ ID N°: Fonte de Proteina AARAVFLAL 47 BAGE 2-10 YRPRPRRY 48 GAGE-1 9-16 EADPTGHSY 49 MAGE-1 161-169 SAYGEPRKL 50 MAGE-1 230-238 EVDPIGHLY 51 MAGE-3 161-169 FLWGPRALV 52 MAGE-3 271-279 GIGILTV 53 MART-1 29-35 ILTVILGV 54 MART-1 32-39 STAPPAHGV 55 MUC-1 9-17 BEKLIVVLF 56 MUM-1 261-269 MLLAVLYCL 57 TIROSINASE 1-9 SEIWRDIDF 58 TIROSINASE 192-200 14 (continuação) Péptido SEQ ID N°: Fonte de Proteína AFLPWHRLF 59 TIROSINASE 206-214 YMNGTMSQV 60 TIROSINASE 369-376 KTWGQYWQV 61 PMEL 17 (GP100) 154-162 ITDQVPFSV 62 PMEL 17 (GP100) 209-217 YLEPGPTVA 63 PMEL 17 (GP100) 280-288 LLDGTATLRL 64 PMEL 17 (GP100) 476-485 ELNEALELEK 65 p53 343-351 STPPPGTRV 66 p53 149-157 LLPENNVLSPL 67 p53 25-35 LLGRNSFEV 68 p53 264-272 RMPEAAPPV 69 p53 65-73 KIFGSLAFL 70 HER- 2/neu 369-377 IISAWGIL 71 HER- 2/neu 654-662 CLTSTVQLV 72 HER- 2/neu 789-797 YLEDVRLV 73 HER-2/neu 835-842 VLVKSPNHV 74 HER- 2/neu 851-859 RFRELVSEFSRM 75 HER- 2/neu 968-979 LLRLSEPAEL 76 PSA 119-128 DLPTQEPAL 77 PSA 136-144 KLQCVD 78 PSA 166-171 VLVASRGRAV 79 PSA 36-45 VLVHPQWVL 80 PSA 49-57 DMSLLKNRFL 81 PSA 98-107 QWNSTAFHQ 82 envelope de HBV 121-130 VLQAGFF 83 envelope de HBV 177-184 LLLCLIFL 84 envelope de HBV 250-257 LLDYQGML 85 envelope de HBV 260-267 LLVPFV 86 envelope de HBV 338-343 15 (continuação) Péptido SEQ ID N°: Fonte de Proteína SILSPFMPLL 87 envelope de HBV 370-379 PLLPIFFCL 88 envelope de HBV 377-385 ILSTLPETTV 89 núcleo de HBV 529- 538 FLPSDFFPSV 90 núcleo de HBV 47-56 KLHLYSHPI 91 Polimerase de HBV 489 -498 ALMPLYACI 92 Polimerase de HBV 642 -651 HLYSHPIIL 93 Polim. de HBV 1076 -1084 FLLSLGIHL 94 Polim. de HBV 1147 -1153 HLLVGSSGL 95 Polimerase de HBV 43- 51 GLSRYVARL 96 Polimerase de HBV 455 -463 LLAQFTSAI 97 Polimerase de HBV 527 -535 YMDDVVLGA 98 Polimerase de HBV 551 -559 GLYSSTVPV 99 Polimerase de HBV 61- 69 NLSWL 100 Polimerase de HBV 996 -1000 KLPQLCTEL 101 HPV 16 E6 18- 26 LQTTIHDII 102 HPV 16 E6 26- 34 FAFRDLCIV 103 HPV 16 E6 52- 60 YMLDLQPET 104 HPV 16 E7 11- 19 TLHEYMLDL 105 HPV 16 E7 7-15 LLMGTLGIV 106 HPV 16 E7 82- 90 TLGIVCPI 107 HPV 16 E7 86- 93 LLMGTLGIVCPI 108 HPV 16 E7 82- 93 A segunda solução pode, por exemplo, ser preparada por cromatografia em coluna ou, de outro modo, purificando o ácido nucleico (e. g., por precipitação com etanol ou isopropanol), depois suspendendo o ácido nucleico purificado ou precipitado numa solução aquosa, polar ou hidrofílica. 16 A segunda solução pode incluir, opcionalmente, um tensioactivo, um agente de condensação de ADN ou um composto estabilizador (e. g., 1-10% de dextrose, sacarose, dextrano, ou outros hidratos de carbono, álcool polivinilico, ciclodextrina, brometo de hexadeciltrimetilamónio ou sulfato de dextrano) que podem estabilizar o ácido nucleico ou emulsão, mantendo o ácido nucleico superenrolado durante a encapsulação ou durante a formação da microparticula. A segunda emulsão é, opcionalmente, misturada com uma quarta solução incluindo um composto orgânico, tal como álcool polivinilico. A segunda emulsão pode, opcionalmente, ser exposta (i. e., isolada ou como uma mistura com a quarta emulsão) a uma temperatura elevada (e. g., temperatura ambiente até cerca de 60 °C), por exemplo, para facilitar a evaporação mais rápida dos solventes. O processo pode incluir o passo adicional de lavar as microparticulas com uma solução aquosa para remover compostos orgânicos, produzindo desse modo microparticulas lavadas. As microparticulas lavadas podem então ser submetidas a uma temperatura abaixo de 0 °C, para produzir microparticulas congeladas, que são, por sua vez, liofilizadas para produzir microparticulas liofilizadas. As microparticulas podem, opcionalmente, ser suspensas num excipiente, tais como Tween-80, manitol, sorbitol, ou carboximetil-celulose, antes de ou após liofilização (caso ocorra).

Quando desejado, o processo pode incluir o passo adicional de rastreio das microparticulas para remover as que são maiores que 100 microns (ou mesmo 20 microns) em diâmetro. 17

Ainda outra forma de realização da invenção apresenta a preparação de microparticulas que incluem uma matriz polimérica, um determinante antigénico proteico, e uma molécula de ADN que codifica um polipéptido antigénico que pode ser diferente do, ou igual ao, determinante antigénico proteico referido acima. 0 determinante antigénico contém um epitopo que pode induzir uma resposta de anticorpo. 0 polipéptido antigénico expresso a partir do ADN pode induzir uma resposta de células T (e. g., uma resposta de CTL) . 0 ADN pode ser ADN plasmidico, e pode ser combinado na mesma microparticula que o determinante antigénico, ou os dois podem estar em microparticulas distintas que são então misturadas conjuntamente. Em alguns casos, um oligonucleótido, em vez de um determinante antigénico proteico, pode ser encapsulado juntamente com um ácido nucleico plasmidico. 0 oligonucleótido pode por exemplo, possuir actividade anti-sentido ou de ribozima.

Noutra forma de realização, a invenção apresenta um método de administrar ácido nucleico a um animal, introduzindo no animal (e. g., um mamífero, tal como um humano, primata não humano, cavalo, vaca, porco, ovelha, cabra, cão, gato, murganho, rato, porquinho da índia, hamster, ou furão) qualquer das microparticulas descritas nos parágrafos acima. As microparticulas podem ser proporcionadas suspensas numa solução (e. g., uma solução aquosa) ou qualquer outra formulação adequada, e pode ser, por exemplo, injectada ou implantada (e. g., cirurgicamente) no animal ou administrada por inalação (e. g., intranasalmente). Elas podem, opcionalmente, ser distribuídas em conjunto com uma proteína, tais como uma citocina, uma hormona, um interferão, ou um antigénio. 18

Noutra forma de realização, a invenção apresenta uma preparação de micropartículas, cada uma das quais inclui uma matriz polimérica, um composto estabilizador, e um vector de expressão de ácido nucleico. A matriz polimérica inclui um ou mais polímeros sintéticos possuindo uma solubilidade em água inferior a cerca de 1 mg/L; no presente contexto, sintético é definido como que não ocorre naturalmente. Pelo menos, 90% das micropartículas possuem um diâmetro inferior a cerca de 100 microns. O ácido nucleico pode ser ARN, pelo menos 50% (e, de um modo preferido, pelo menos 70% ou mesmo 80%) do qual está na forma de círculos fechados.

Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é normalmente entendido por um especialista na técnica ao qual esta invenção pertence. Os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

Outras características e vantagens da invenção serão óbvias a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figs. IA a 1C são um conjunto de três mapas de plasmídeo, dos plasmídeos pvA2.1/4, luciferase, e VSV-Npep, respectivamente. A Fig. 2 é uma representação gráfica da distribuição de tamanho das micropartículas contendo ADN como analisado num contador COULTER™. 19

As Figs. 3A e 3B são um conjunto de fotografias de dois géis de electroforese em agarose indicando o grau de superenrolamento do ADN como uma função de diferentes velocidades de homogeneização e durações.

As Figs. 4A e 4B são um par de impressões de FACS comparando populações de células na ausência ou presença de microparticulas.

As Figs. 5 a 9 são representações gráficas de lise específicos versus a proporção efector:alvo.

Descrição das Formas de Realização Preferidas

As microparticulas da invenção são formuladas num de dois modos: (1) para maximizar a distribuição nas células fagocíticas do doente ou, (2) para formar um depósito nos tecidos do doente, dos quais o ácido nucleico é libertado gradualmente ao longo do tempo; após libertação da micropartícula, o ácido nucleico é incorporado pelas células vizinhas (incluindo células que apresentam antigénio ou APC). Em ambos os casos, manter a integridade do ADN é uma prioridade. Para o ADN plasmídico, isto significa maximizar a percentagem de moléculas plasmídicas que são superenroladas e desse modo mais estáveis ou mais capazes de transfecção ou expressão mais eficientes do que plasmídeos não superenrolados (i. e., com cortes ou lineares). Meios para proteger a integridade do ácido nucleico incluem minimizar as forças de fractura às quais o ácido nucleico está necessariamente exposto no processo de formação de microparticulas, limitando os tempos de sonicação e de mistura durante a preparação, e tampões de adição ou outros compostos 20 estabilizadores durante o isolamento e encapsulação do ácido nucleico. Por exemplo, é necessário atingir um equilíbrio entre o tempo de sonicação e a intensidade. Estas técnicas são discutidas abaixo.

As microparticulas da invenção podem ser utilizadas no fabrico de um medicamento para o tratamento de, por exemplo, cancro, qualquer das doenças autoimunes listadas na Tabela 1 ou qualquer outro estado tratável com um ácido nucleico particular definido. A fagocitose de microparticulas por macrófagos, células dendriticas, e outras APC, de um modo eficaz, para introduzir o ácido nucleico nestas células. A fagocitose por estas células pode ser aumentada mantendo um tamanho de partícula abaixo de cerca de 20 pm e, de um modo preferido, abaixo de cerca de 11 pm. O tipo de polímero utilizado na micropartícula também pode afectar a eficiência da incorporação por células fagociticas, como discutido abaixo.

As microparticulas podem ser distribuídas directamente para a corrente sanguínea (i. e., por injecção intravenosa ou intraarterial ou infusão) em que a incorporação pelas células fagociticas do sistema reticuloendotelial (RES) é desejada. Alternativamente, pode-se dirigir, através de injecção subcutânea, a incorporação pelas células fagociticas dos nódulos linfáticos de drenagem. As microparticulas também podem ser introduzidas intradermicamente (i. e., para as APC da pele, tais como células dendriticas e células de Langerhans), intramuscularmente, intranasalmente ou através de outros sítios de mucosa (i. e., para imunidade da mucosa). Finalmente, as microparticulas podem ser introduzidas no pulmão (e. g., por 21 inalação de micropartículas em pó, de uma solução nebulizada ou de aerossóis contendo as micropartículas), em que as partículas são seleccionadas pelos macrófagos alveolares.

Assim que uma célula fagocitária fagocite a microparticula, o ácido nucleico é libertado para o interior da célula. Após libertação, pode realizar a sua função pretendida: por exemplo, expressão pela maquinaria de transcrição/tradução celular normal (para um vector de expressão) ou alteração de processos celulares (para moléculas anti-sentido ou ribozima).

Uma vez que estas micropartículas são passivamente dirigidas aos macrófagos e outros tipos de células fagocíticas, elas representam um meio para modular a função imunitária. Os macrófagos e células dendríticas servem como APC profissionais, expressando ambas as moléculas de MHC de classe I e classe II. A distribuição, através de micropartículas, de um vector de expressão codificando um antigénio estranho que se liga a uma molécula de MHC de classe I ou classe II irá induzir uma resposta de célula T hospedeira contra o antigénio, conferindo assim imunidade ao hospedeiro.

Quando o vector de expressão codifica um péptido de bloqueamento (Ver, e. g., documento WO 94/04171) que se liga a uma molécula de MHC de classe II envolvida na autoimunidade, a apresentação do péptido próprio associado à doença auto-imune pela molécula de classe II é prevenida, e os sintomas da doença auto-imune são aliviados.

Noutro exemplo, um péptido de ligação a MHC que é idêntico ou quase idêntico a um péptido de indução de autoimunidade pode afectar a função de células T tornando tolerante ou dando 22 anergia à célula T. Alternativamente, o péptido pode ser concebido para modular a função da célula T alterando os perfis de secreção de citocina seguindo o reconhecimento do complexo MHC/péptido. Os péptidos reconhecidos pelas células T podem induzir a secreção de citocinas que provoca nas células B a produção de anticorpos de uma classe particular, induz inflamação, e ainda promove respostas de células T do hospedeiro. A indução de respostas imunitárias pode requerer vários factores. É esta natureza multifactorial que proporciona o ímpeto para tentar manipular células relacionadas com a imunidade em múltiplas frentes, utilizando as micropartículas da invenção. Por exemplo, podem ser preparadas micropartículas que comportam ambos ADN e polipéptidos em cada micropartícula. Estas micropartículas de função dupla são discutidas abaixo.

Respostas de CTL

As moléculas de Classe I apresentam péptidos antigénicos para células T imaturas. Para activar completamente células T, são necessários outros factores para além do péptido antigénico. Proteínas não específicas, tais como interleucina-2 (IL-2), IL-12, e interferão gama (γ-IFN) promovem respostas de CTL e podem ser proporcionadas em conjunto com ADN codificando polipéptidos que incluem epitopos de CTL. Alternativamente, as proteínas que contêm determinantes de auxiliar T (TH) podem ser incluídas com o ADN que codifica o epitopo de CTL. Os epitopos TH promovem a secreção de citocinas das células TH e desempenham um papel na diferenciação de células T nascentes em CTL. 23

Alternativamente, proteínas ou ácidos nucleicos que promovem a migração de linfócitos e macrófagos para uma área particular podem ser incluídos nas micropartículas juntamente com moléculas de ADN apropriadas. A incorporação do ADN é aumentada como um resultado, porque a libertação da proteína iria provocar um influxo de células fagocíticas e células T como as degradações de micropartícula. Os macrófagos iriam fagocitar as restantes micropartículas e actuar como APC, e as células T iriam tornar-se células efectoras.

Respostas de Anticorpo A eliminação de certos agentes infecciosos do hospedeiro pode requerer quer respostas de anticorpo quer de CTL. Por exemplo, quando o vírus influenza entra num hospedeiro, os anticorpos podem frequentemente impedi-lo de infectar células hospedeiras. Todavia, se as células são infectadas, então uma resposta de CTL é necessária para eliminar as células infectadas e para prevenir a produção continuada de vírus no hospedeiro.

Em geral, as respostas de anticorpo são dirigidas contra determinantes conformacionais e desse modo requerem a presença de uma proteína ou um fragmento de proteína contendo tal determinante. Em contraste, os epitopos de célula T são determinantes lineares, tipicamente de apenas 7-25 resíduos de comprimento. Assim, quando há uma necessidade para induzir quer uma resposta de CTL como de um anticorpo, as micropartículas podem incluir ambos a proteína antigénica e o ADN codificando um epitopo de célula T. 24 A libertação lenta da proteína de micropartículas iria conduzir ao reconhecimento de células B e subsequente secreção de anticorpo. Adicionalmente, a fagocitose das micropartículas poderia fazer com que as APC (1) expressem o ADN de interesse, gerando assim uma resposta de células T; e (2) digiram a proteína libertada das micropartículas, gerando assim péptidos que são subsequentemente apresentados por moléculas de classe I ou classe II, ou ambas. A apresentação por moléculas de classe II promove ambas as respostas de anticorpo e de CTL, uma vez que as células TH activadas pelos complexos de classe II/péptido poderiam secretar citocinas não específicas.

Imunossupressão

Certas respostas imunitárias conduzem a alergia e autoimunidade, e desse modo pode ser nociva para o hospedeiro. Nestes casos, existe uma necessidade para inactivar células imunitárias que danifiquem os tecidos. A imunossupressão pode ser alcançada com micropartículas contendo ADN que codifica ligandos peptídicos alterados, péptidos de tolerância, ou epitopos que regulam negativamente células TH e CTL (e. g., péptidos "bloqueadores"). Nestas micropartículas, o efeito do ADN imunossupressor pode ser amplificado incluindo certas proteínas nas micropartículas transportadoras com o ADN. Uma lista dessas proteínas inclui anticorpos, receptores, factores de transcrição, hormonas e as interleucinas.

Por exemplo, os anticorpos para citocinas estimuladoras, receptores de superfície celular, ou proteínas domésticas, tais como integrinas ou moléculas de adesão intercelular (ICAM), podem aumentar a eficácia do epitopo de ADN imunossupressor. 25

Estas proteínas servem para inibir as respostas de células T já activadas, enquanto que o ADN previne ainda a activação de células T nascentes. A indução de respostas de regulação de células T pode ser influenciada pela citocina do meio presente quando o receptor de células T (TCR) é envolvido. As citocinas, tais como IL-4, IL-10, e IL-6, promovem a diferenciação de TH2 em resposta ao epitopo codificado pelo ADN. As respostas de TH2 podem inibir a formação de células TH1 e as respostas nocivas correspondentes que resultam em patologias de artrite reumatóide, esclerose múltipla e diabetes juvenil. A inclusão de proteínas compreendendo formas solúveis de moléculas co-estimuladoras (e. g., CD-40, gp-39, B7-1, e B7-2) ou moléculas envolvidas na apoptose (e. g., Fas, FasL, Bcl2, caspase, bax, TNFa, receptores de TNF) é outro modo de inibir a activação de respostas de células T e/ou células B particulares. Por exemplo, B7-1 está envolvido na activação de células TH1, e B7-2 activa células TH2. Dependendo da resposta que é requerida, uma ou a outra destas proteínas pode ser incluída na micropartícula com o ADN, ou pode ser fornecida em micropartículas separadas misturadas com as micropartículas contendo ADN.

Micropartículas para Implantação

Uma segunda formulação de micropartículas da invenção é pretendida não ser incorporada directamente pelas células, mas em vez disso servir principalmente como um reservatório de ácido nucleico de libertação lenta, que é retirado para as células apenas após libertação das micropartículas através de biodegradação. 0 ácido nucleico pode ser complexado com um 26 estabilizador (e. g-, para manter a integridade do ácido nucleico durante o processo de libertação lenta). As partículas poliméricas nesta forma de realização devem, por isso, ser suficientemente grandes para eliminar , a fagocitose (i. e., maiores do que 5 pm e, de um modo preferido, maiores do que 19 pm). Essas partículas são produzidas pelos métodos descritos acima para tornar as partículas menores, mas com mistura menos vigorosa das referidas primeira ou segunda emulsões acima. 0 mesmo é dizer, pode ser utilizadas uma velocidade de homogeneização, velocidade de mistura em vórtice, ou condições de sonicação mais baixas para obter partículas possuindo um diâmetro de cerca de 100 pm em vez de 5 pm. O tempo de mistura, a viscosidade da primeira emulsão, ou a concentração do polímero na primeira solução pode também ser alterado para afectar a dimensão da partícula.

As micropartículas maiores podem ser formuladas como uma suspensão, um pó, ou um sólido implantável, para ser distribuído por injecção intramuscular, subcutânea, intradérmica, intravenosa, ou intraperitoneal; através de inalação (intranasal ou intrapulmonar); oralmente; ou por implantação. Estas partículas são úteis para distribuição de qualquer vector de expressão ou outro ácido nucleico para o qual é desejada a libertação lenta durante um período de tempo relativamente longo: e. g., uma molécula anti-sentido, uma terapêutica de substituição de gene, um meio terapêutico de distribuição à base de citocina, à base de antigénio, à base de hormona ou um agente imunossupressor. A taxa de degradação, e consequentemente de libertação, varia com a formulação polimérica. Este parâmetro pode ser utilizado para controlar a função imunitária. Por exemplo, pode desejar-se uma libertação relativamente lenta para 27 a distribuição de IL-4 ou IL-10, e uma libertação relativamente rápida para a distribuição de IL-2 ou γ-IFN.

Composição de Partículas Poliméricas 0 material polimérico é obtido de fontes comerciais ou pode ser preparado por métodos conhecidos. Por exemplo, podem ser gerados polímeros de ácido láctico e glicólico como descrito na Patente US N°. 4293539 ou adquiridos da Aldrich.

Alternativamente, ou adicionalmente, a matriz polimérica pode incluir polilactídeo, poliglicolídeo, poli (lactídeo-co-glicolídeo), polianidrido, poliortoéster, policaprolactona, polifosfazeno, polímero proteico, polipéptido, poliéster ou poliortoéster.

Substâncias de libertação controlada preferidas que são úteis nas formulações da invenção incluem os polianidridos, co-polímeros de ácido láctico e ácido glicólico em que a proporção em peso de ácido láctico para ácido glicólico não é superior a 4:1, e poliortoésteres contendo um catalizador intensificador de degradação, tal como um anidrido, e. g., anidrido maleico a 1%. Uma vez que o poliácido láctico demora, pelo menos, um ano para degradar in vivo, este polímero deve ser utilizado isolado apenas em circunstâncias em que é desejável a degradação ampliada. 28

Associação de Ácido Nucleico e Partículas Poliméricas

As partículas poliméricas contendo ácidos nucleicos podem ser utilizadas utilizando uma técnica de emulsão dupla. Primeiro, o polímero é dissolvido num solvente orgânico. Um polímero preferido é ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA), com uma proporção em peso de ácido láctico/glicólico de 65:35, 50:50 ou 75:25. De seguida, uma amostra de ácido nucleico suspensa em solução aquosa é adicionada à solução de polímero e as duas soluções são misturadas para formar a primeira emulsão. As soluções podem ser misturadas por vórtice ou agitação ou a mistura pode ser sonicada. A emulsão pode ser realizada num microfluidizador. De um modo mais preferido, é qualquer método pelo qual o ácido nucleico recebe a quantidade mínima de lesão na forma de corte, fractura, ou degradação, enquanto que ainda permite a formação de uma emulsão apropriada. Por exemplo, podem ser obtidos resultados aceitáveis com um sonicador Vibracell modelo VC-250 com uma sonda de microponta de 1/8", na posição 3 ou controlando a pressão no microfluidizador.

Durante este processo, formam-se gotículas de água (contendo o ácido nucleico) no solvente orgânico. Se desejado, pode isolar-se uma pequena quantidade do ácido nucleico neste momento de modo a avaliar a integridade, e. g., por electroforese em gel.

Verificou-se que a precipitação com álcool, ou outros modos de purificação, do ácido nucleico antes da suspensão na solução aquosa pode melhorar a eficiência de encapsulação. A precipitação com etanol resultou num aumento até 147% no ADN incorporado e a precipitação com isopropanol aumentou a incorporação até 170%. 29 A natureza da solução aquosa pode afectar o rendimento de ADN superenrolado. Por exemplo, a presença de detergentes, tal como polimixina B, que são frequentemente utilizados para remover endotoxinas durante a preparação e purificação de amostras de ADN, pode conduzir a uma diminuição na eficiência da encapsulação do ADN. Pode ser necessário equilibrar os efeitos negativos na eficiência de encapsulação com os efeitos positivos no superenrolamento, especialmente quando são utilizados detergentes, tensioactivos, e/ou estabilizadores durante a encapsulação. Além disso, a adição de soluções tampão contendo quer tris (hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), ou uma combinação de TRIS e EDTA (TE) resultou na estabilização de ADN plasmidico superenrolado, de acordo com a análise por electroforese em gel. Também são observados efeitos no pH. Também se verificou que outros compostos estabilizadores, tais como sulfato de dextrano, dextrose, dextrano, CTAB, ciclodextrina e sacarose, aumentam a estabilidade e o grau de superenrolamento do ADN, quer isoladamente ou em combinação com o tampão TE. Podem ser utilizadas combinações de estabilizadores para aumentar a quantidade de ADN encapsulado, superenrolado. Estabilizadores, tais como lipidos carregados (e. g., CTAB), péptidos catiónicos, ou dendrimeros (J. Controlled Release, 39:357, 1996) podem condensar ou precipitar o ADN. Além disso, os estabilizadores podem possuir um efeito na natureza física das partículas formadas durante o processo de encapsulação. Por exemplo, a presença de açúcares ou tensioactivos durante o processo de encapsulação pode criar partículas porosas com estruturas porosas interiores ou exteriores, permitindo um êxito mais rápido de um fármaco da partícula. Os estabilizadores podem actuar a qualquer momento durante a preparação das microesferas: durante a encapsulação ou liofilização, ou ambas, por exemplo. 30 A primeira emulsão é então adicionada a uma solução orgânica, permitindo a formação de micropartículas. A solução pode ser compreendida por, por exemplo, cloreto de metileno, acetato de etilo ou acetona, de um modo preferido contendo álcool polivinilico (PVA), e de um modo mais preferido, possuindo uma proporção 1:100 em peso de PVA para o volume da solução. A primeira emulsão é geralmente adicionada à solução orgânica com agitação num homogeneizador (e. g., um homogeneizador Silverson Modelo L4RT (sonda 5/8") fixado a 7000 RPM durante cerca de 12 segundos; um tempo de homogeneização de 60 segundos seria demasiado severo a esta velocidade de homogeneização) ou um microfluidizador.

Este processo forma uma segunda emulsão que é adicionada subsequentemente a outra solução contendo um composto orgânico (e. g., PVA) com agitação (e. g., num homogeneizador ou numa placa de agitação). Este passo provoca a libertação do primeiro solvente orgânico (e. g., diclorometano) e o endurecimento das microesferas. Pode ser utilizado, alternativamente, aquecimento para acelerar a evaporação do solvente. A libertação lenta do solvente orgânico (e. g., à temperatura ambiente) resulta em partículas "esponjosas" possuindo uma estrutura altamente porosa em toda a parte, enquanto que a libertação rápida (e. g., a temperatura elevada) resulta em partículas de núcleo oco. A última solução pode, por exemplo, ser PVA a 0,05% p/v. Se foram adicionados açúcar ou outros compostos ao ADN, pode ser adicionada uma concentração igual do composto à terceira ou quarta solução, para equilibrar a osmolaridade, diminuindo eficazmente a perda de ácido nucleico da microesfera durante o processo de endurecimento. As micropartículas resultantes são lavadas várias vezes com água, para remover os compostos orgânicos. As partículas podem ser passadas através de ecrãs de 31 separação por tamanho para remover selectivamente as que são maiores do que o tamanho desejado. Se o tamanho das micropartículas não é crucial, pode dispensar-se o passo de separação por tamanho. Após lavagem, as partículas podem ser utilizadas imediatamente ou serem liofilizadas para armazenamento.

Partículas maiores, tais como aquelas utilizadas para implantação, podem ser obtidas utilizando condições de emulsificação menos vigorosas quando se prepara a primeira emulsão, como já foi descrito acima em extensão. Por exemplo, partículas maiores podem ser obtidas alterando a concentração do polímero, alterando a viscosidade da emulsão, alterando o tamanho das partículas da primeira emulsão (e. g., partículas maiores podem ser realizadas diminuindo a pressão utilizada enquanto se cria a primeira emulsão num microfluidizador), ou homogeneizando com, por exemplo, o homogeneizador Silverson fixa a 5000 RPM durante cerca de 12 segundos.

As micropartículas recuperadas podem ser suspensas num excipiente sem afectar negativamente a quantidade de ADN de plasmídeo superenrolado nas microesferas. São frequentemente utilizados excipientes na formulação de fármacos, e aqui proporcionam ressuspensão eficiente de microesferas, actuam para prevenir a deposição e reter as microesferas em suspensão. De acordo com a análise por electroforese em gel, os excipientes (incluindo Tween 80, manitol, sorbitol, e carboximetilcelulose) não têm efeito na estabilidade ou superenrolamento do ADN.

Após recuperação das microesferas ou suspensão das microesferas num excipiente, as amostras podem ser congeladas e liofilizadas para utilização futura. 32

Caracterização de Micropartículas A distribuição de tamanho das micropartículas preparadas pelo método acima pode ser determinada com um contador COULTER™. Este instrumento proporciona um perfil de distribuição de tamanho e análise estatística das partículas. Alternativamente, o tamanho médio das partículas pode ser determinado por visualização sob um microscópio ajustado com uma lâmina ou ocular de determinação de tamanho.

Se desejado, o ácido nucleico pode ser extraído das micropartículas para análise pelo processo seguinte. As micropartículas são dissolvidas num solvente orgânico, tal como clorofórmio ou cloreto de metileno na presença de uma solução aquosa. 0 polímero permanece na fase orgânica, enquanto que o ADN vai para a fase aquosa. A interface entre as fases pode ser tornada mais distinta por centrifugação. 0 isolamento da fase aquosa permite a recuperação do ácido nucleico. Para testar a degradação, o ácido nucleico extraído pode ser analisado por HPLC ou electroforese em gel.

Para aumentar a recuperação de ácido nucleico, podem ser adicionados solventes orgânicos adicionais, tais como fenol e clorofórmio, às micropartículas dissolvidas, antes da adição da solução aquosa. Após a adição da solução aquosa, o ácido nucleico entra na fase aquosa que pode ser facilmente separado da fase orgânica após mistura. Para uma interface mais limpa entre as fases orgânica e aquosa, as amostras devem ser centrifugadas. 0 ácido nucleico é recuperado da fase aquosa por precipitação com sal e etanol, de acordo com métodos convencionais. 33

Distribuição Intracelular de Micropartículas

Microparticulas contendo ADN são ressuspensas em soro fisiológico, solução salina tamponada, meio de cultura de tecidos, ou outro veiculo fisiologicamente aceitável. Para utilização in vitro/ex vivo, a suspensão de microparticulas pode ser adicionada quer a células de mamíferos aderentes cultivadas ou a uma suspensão de células. Após um período de incubação de 1-24 horas, as partículas não incorporadas são removidas por aspiração ou centrifugação sobre soro de vitelo fetal. As células podem ser analisadas imediatamente ou recultivadas para análise futura. A incorporação de micropartículas contendo ácido nucleico nas células pode ser detectada por PCR ou ensaiando a expressão do ácido nucleico. Por exemplo, pode medir-se a transcrição do ácido nucleico com uma transferência de Northern, PCR de transcriptase reversa ou mapeamento de ARN. A expressão da proteína pode ser medida com um ensaio apropriado à base de anticorpo ou com um ensaio funcional concebido à medida para a função do polipéptido codificado pelo ácido nucleico. Por exemplo, células que expressam um ácido nucleico codificando luciferase podem ser ensaiadas como se segue: após lise no tampão apropriado (e. g., reagente de cultura de lise celular,

Promega Corp, Madison WI), o lisado é adicionado a uma luciferina contendo substrato (Promega Corp) e a luz produzida é medida num luminómetro ou contador de cintilações. A luz produzida é directamente proporcional à expressão do gene da luciferase.

Se o ácido nucleico codificar um péptido conhecido por interagir com uma molécula de MHC de classe I ou classe II, um 34 anticorpo específico para esse complexo de molécula de MHC/péptido pode ser utilizado para detectar o complexo na superfície celular da célula, utilizando um separador de células em função do seu tamanho activado por fluorescência (FACS) . Esses anticorpos podem ser preparados utilizando técnicas convencionais (Murphy et al. Nature, Vol. 338, 1989, pp. 765-767) . Após incubação com micropartícuias contendo um ácido nucleico codificando o péptido, as células são incubadas durante 10-120 minutos com o anticorpo específico em meio de cultura de tecidos. O anticorpo em excesso é removido lavando as células no meio. Um anticorpo secundário marcado com fluorescência que se liga ao primeiro anticorpo, é incubado com as células. Estes anticorpos secundários estão frequentemente disponíveis comercialmente ou podem ser preparados utilizando métodos conhecidos. O anticorpo secundário em excesso deve ser removido por lavagem antes da análise de FACS.

Também se pode realizar o ensaio visualizando as células efectoras T ou B. Por exemplo, pode medir-se a proliferação de células T, actividade citotóxica, apoptose ou secreção de citocina.

Alternativamente, pode demonstrar-se directamente a distribuição intracelular das partículas utilizando ácidos nucleicos que são marcados com fluorescência, e analisar as células por FACS. A internalização do ácido nucleico marcado com fluorescência provoca a fluorescência da célula acima dos níveis de fundo. Porque é rápida e quantitativa, a FACS é especialmente útil para optimização das condições para distribuição in vitro ou in vivo de ácidos nucleicos. Após essa optimização, a utilização de marcador fluorescente é descontinuada. 35

Se o próprio ácido nucleico afecta directamente a função celular, e. g., se é uma molécula ribozima ou anti-sentido, ou é transcrito numa, pode ser utilizado um ensaio funcional apropriado. Por exemplo, se a ribozima ou ácido nucleico anti-sentido é concebido para diminuir a expressão de uma proteína celular particular, a expressão dessa proteína pode ser monitorizada.

Distribuição In Vivo de Micropartículas

Micropartícuias contendo ácido nucleico podem ser injectadas em mamíferos intramuscularmente, intravenosamente, intra-arterialmente, intradermicamente, intraperitonealmente, intranasalmente ou subcutaneamente, ou podem ser introduzidos no tracto gastrointestinal ou o tracto respiratório, e. g., por inalação de uma solução ou pó contendo as micropartículas. A expressão do ácido nucleico é monitorizada por um método apropriado. Por exemplo, a expressão de um ácido nucleico codificando uma proteína imunogénica de interesse é ensaiada monitorizando uma resposta de anticorpo ou célula T à proteína.

As respostas de anticorpo podem ser medidas testando o soro num ensaio ELISA. Neste ensaio, a proteína de interesse é revestida numa placa de 96 poços e diluições em série de soro do indivíduo do teste são pipetadas para cada poço. Um anticorpo secundário, ligado a enzima, tal como anticorpo anti-humano, ligado a peroxidase de rábano, é então adicionado aos poços. Se os anticorpos contra a proteína de interesse estão presentes no soro do indivíduo do teste, eles irão ligar-se à proteína fixa na placa, e por sua vez vão ligar-se pelo anticorpo secundário. Um substrato para a enzima é adicionado à mistura e uma 36 alteração colorimétrica é quantificada num leitor de placas de ELISA. Uma resposta de soro positiva indica que a proteína imunogénica codificada pelo ADN da micropartícula foi expressa no indivíduo do teste, e estimulada a uma resposta de anticorpo. Alternativamente, pode ser empregue um ensaio de ponto de ELISA. A proliferação de células T em resposta a uma proteína após a distribuição intracelular de micropartículas contendo ácido nucleico codificando a proteína é medida ensaiando as células T presentes no baço, nódulos linfáticos ou linfócitos do sangue periférico de um animal de teste. As células T obtidas de uma tal fonte são incubadas com APC singénicos na presença da proteína ou péptido de interesse. A proliferação de células T é monitorizada pela incorporação de 3H-timidina, de acordo com métodos convencionais. A quantidade de radioactividade incorporada nas células está directamente relacionada com a intensidade da resposta proliferativa induzida no indivíduo do teste pela expressão do ácido nucleico distribuído pelas micropartículas. Uma resposta positiva indica que as micropartículas contendo ADN codificando a proteína ou péptido foi incorporada e expressa pelas APC in vivo. A criação de células T citotóxicas pode ser demonstrada num ensaio de libertação de 51Cr convencional. Nestes ensaios, as células do baço ou linfócitos de sangue periférico obtidos do indivíduo do teste são cultivadas na presença de APC singeneicas e da proteína de interesse ou um epitopo derivado desta proteína. Após um período de 4-6 dias, as células T efectoras citotóxicas são misturadas com células alvo marcadas com 51Cr expressando um epitopo derivado da proteína de interesse. Se o indivíduo do teste originou uma resposta de células T citotóxicas para a proteína ou péptido codificado pelo ácido 37 nucleico contido na micropartícula, as células T citotóxicas irão lisar os alvos. Os alvos Usados irão libertar o 51Cr radioactivo no meio. As fracções do meio são ensaiadas para a radioactividade num contador de cintilações. Os ensaios, tais como ELISA, também podem ser utilizados para medir os perfis de citocina.

Os seguintes são exemplos da prática da invenção. Não devem ser interpretados como limitando o âmbito da invenção de modo algum.

EXEMPLO 1: Incorporação de ADN; Análise do Tamanho de Partícula e Integridade do ADN

Preparação de ADN para Incorporação 0 ADN plasmídico foi preparado por métodos convencionais utilizando o MEGA-PREP™ Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Foi utilizado um kit de tampão sem endotoxinas (Qiagen) para todas as manipulações de ADN. 0 ADN foi ressuspenso em água destilada, desionizada, estéril para produzir uma concentração final de 3 pg/pL. A Fig. 1 apresenta mapas de plasmídeos de vectores da expressão de ADN codificando a) luciferase, b) um péptido epitopo de vírus de estomatite vesicular (VSV) denominado VSV-Npep, e c) um péptido epitopo de vírus de papiloma humano (HPV) denominado A2.1/4. 38

Associação de ADN com PLGA

Foi dissolvido 200 mg de ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA) (Aldrich, 65:35 proporção de ácido láctico para ácido glicólico) em 5-7 mL de cloreto de metileno. Foi adicionado 300 pL da solução de ADN preparada acima, contendo 900 pg de ADN, à solução de PLGA. A mistura foi sonicada num Modelo 550 SONIC DISMEMBRATOR™ (Fisher Scientific) fixo a 3 durante 5-60 segundos, e a emulsão resultante foi analisada. Uma emulsão que se verificou conter partículas do tamanho desejado possuindo ADN de integridade satisfatória (como determinado abaixo) foi adicionada a uma proveta contendo 50 mL de álcool polivinílico aquoso a 1% p/v (PVA) (intervalo de pm: 30-70 kdal). A mistura foi homogeneizada num homogeneizador POWERGEN™ (Fisher Scientific) fixado a 3000-9000 RPM durante 5-60 segundos. Novamente, a integridade do ADN foi analisada. Nos casos em que o se verificou que o ADN estava suficientemente intacto, a segunda emulsão resultante foi transferida para uma segunda proveta contendo 100 mL de PVA aquosa a 0,05%, com agitação constante. A agitação foi continuada durante 2-3 horas. A solução de micropartículas foi vertida para um tubo de centrífuga de 250 mL e centrifugada a 2000 rpm durante 10 minutos. Os conteúdos dos tubos foram decantados e as partículas sedimentadas foram ressuspensas em 100 mL de água desionizada. Após repetir os passos de centrifugação e decantação, as partículas foram congeladas em azoto líquido e finalmente liofilizadas até à secura. 39

Análise do Perfil de Tamanho de Micropartículas

Foram ressuspensas 5 mg das micropartículas liofilizadas em 200 pL de água. A suspensão resultante foi diluída até cerca de 1:10 000 para análise com um contador COULTER™. A Fig. 2 é uma impressão do contador COULTER™ que indica que, aproximadamente, 85% das micropartículas estavam entre 1,1 e 10 pm em diâmetro.

Determinação da Integridade do ADN

Foram humedecidos 2-5 pg das micropartículas com 10 pL de água num tubo EPPENDORF™. Foi adicionado 500 pL de clorofórmio com agitação profunda para dissolver a matriz polimérica. Foi adicionado 500 pL de água, novamente com mistura. A emulsão resultante foi centrifugada a 14000 rpm durante 5 minutos. A camada aquosa foi transferida para um tubo EPPENDORF™ limpo, juntamente com 2 equivalentes de volume de etanol e 0,1 equivalentes de volume de acetato de sódio aquoso a 3 Μ. A mistura foi centrifugada a 14000 rpm durante 10 minutos. Após aspiração do sobrenadante, o ADN sedimentado foi ressuspenso em 50 pL de água. Foi sujeito a electroforese 5 pg de ADN num gel de agarose a 0,8% ao lado de um padrão contendo o ADN de

aplicação. O ADN no gel foi visualizado numa caixa de luz UV. A comparação com o padrão dá uma indicação da integridade do ADN das micropartículas. O processo de formação de micropartícula foi estimado com sucesso se o ADN incorporado retido numa percentagem elevada de ADN superenrolado em relação ao ADN aplicado.

Como indicado nas Figs. 3A e 3B, a velocidade de homogeneização e duração estão inversamente relacionadas com a 40 integridade do ADN. A Fig. 3A apresenta o ADN isolado das microparticulas preparadas por homogeneização a 7000 rpm durante 1 minuto (pista 1), e ADN superenrolado aplicado (pista 2). A Fig. 3B apresenta o ADN isolado das microparticulas preparadas por homogeneização a 7000 rpm durante 5 segundos (pista 1), ADN isolado das microparticulas preparadas por homogeneização a 5000 rpm durante 1 minuto (pista 2), e ADN aplicado superenrolado (pista 3) . EXEMPLO 2: Preparação de ADN e Microesferas

Preparação de ADN

Foram vertidas culturas bacterianas de 500 mL para frascos de centrifugação e um litro. As culturas foram centrifugadas a 4000 rpm a 20 °C durante 20 minutos. Os meios foram eliminados vertendo-os das bactérias sedimentadas. O precipitado bacteriano foi completamente ressuspenso em 50 mL de tampão PI (Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0; EDTA a 10 mM; ARNase a 100 pg/mL) , não deixando aglomerados. Foi adicionado 50 mL de tampão P2 (NaOH a 200 mM, SDS a 1%) com agitação circular suave, e as suspensões foram incubadas à temperatura ambiente durante cinco minutos. Foi adicionado 50 mL de tampão P3 (acetato de potássio a 3,0 M, pH 5,5, arrefecidos para 4 °C) com agitação imediata, suave. As suspensões foram incubadas em gelo durante 30 minutos, depois centrifugadas a 4000 rpm a 4 °C durante 30 minutos.

Um filtro redondo, dobrado foi molhado com água. Quando a centrifugação estava completa, o sobrenadante foi imediatamente vertido através do filtro. O sobrenadante filtrado foi recolhido num frasco de centrífuga de 250 mL, limpo. 41

Foi adicionado 15 mL de tampão Qiagen ER ao lisado filtrado, misturando por inversão do frasco 10 vezes. O lisado foi incubado em gelo durante 30 minutos.

Uma coluna Qiagen-tip 2500 foi equilibrada aplicando 35 mL de tampão QBT (cloreto de sódio a 750 mM; MOPS a 50 mM, pH 7,0; isopropanol a 15%; e triton x-100 a 0,15%). A coluna foi deixada a esvaziar por fluxo de gravidade. O lisado incubado foi aplicado à coluna e deixado entrar por fluxo de gravidade. A coluna foi lavada com 4 x 50 mL de tampão Qiagen Endofree QC (NaCl a 1,0 M; MOPS a 50 mM, pH 7,0; isopropanol a 15%). O ADN foi eluido da coluna com 35 mL de tampão QN (NaCl a 1,6 M,; MOPS a 50 mM, pH 7,0; isopropanol a 15%) num tubo de centrífuga de 50 mL de polipropileno de tampa de rosca. A suspensão de ADN foi dividida em dois tubos vertendo, aproximadamente, 17,5 mL da suspensão num segundo tubo de 50 mL de tampa de rosca.

Utilizando uma pipeta estéril de 10 mL, foi adicionado 12,25 mL de isopropanol a cada tubo. Os tubos foram fechados firmemente e misturados profundamente. Os conteúdos de cada tubo foram vertidos em tubos de centrífuga Corex de 30 mL (VWR). Cada tubo Corex foi coberto com PARAFILM®. Os tubos foram centrifugados a 11000 rpm, a 4 °C, durante 30 minutos. O sobrenadante foi aspirado de cada tubo e o precipitado foi lavado com 2 mL de etanol a 70%. O etanol foi removido por aspiração. O precipitado foi seco ao ar durante 10 minutos, depois ressuspenso em 0,5-1,0 mL de água, e transferido para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL. 42

Preparação de microesferas

Foi dissolvido 200 mg de PLGA em 7 mL de cloreto de metileno num tubo de cultura de 14 mL. Um homogeneizador Fisher Scientific PowerGen 700 equipado com uma cabeça de mistura de 7 mm foi ajustado para a posição 6 e velocidade 4,5. Um sonicador Fisher Scientific Sonic Dismembrator 550 foi fixado para a posição 3.

Foi adicionado 1,2 mg de ADN em 300 pL de H20 à solução de PLGA e a mistura resultante foi sonicada durante 15 segundos. Foi vertido 50 mL de PVA a 1,0% numa proveta de 100 mL e colocado sob o homogeneizador. A sonda do homogeneizador foi imersa até que estava a cerca de 4 mm do fundo da proveta e o homogeneizador foi fornecido com fonte. A mistura de ADN/PLGA foi imediatamente vertida para a proveta e a emulsão resultante foi homogeneizada durante 10 segundos. O homogenato foi vertido para a proveta contendo PVA a 0,05%. A emulsão resultante foi agitada durante duas horas, vertida para um tubo de centrífuga cónico de 250 mL e centrifugada a 2000 rpm durante 10 minutos. As microesferas sedimentadas foram lavadas com 50 mL de água, transferidas para um tubo de centrífuga de 50 mL de polipropileno e centrifugado a 2000 rpm, durante 10 minutos. O precipitado foi lavado com outros 50 mL de água e centrifugados a 2000 rpm durante 10 minutos. O precipitado foi congelado em azoto líquido, depois liofilizado durante a noite. 43

Extracção de ADN de microesferas para análise em gel

Foram removidas 1 mL de microesferas suspensas em liquida para um tubo de microcentrí fuga de 1,5 mL e centrifugadas a 14 000 rpm durante 5 minutos. A maioria do sobrenadante foi removida. Foi adicionado 50 pL de tampão TE (Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0; EDTA a 1 mM) e as microesferas foram ressuspensas abanando o lado do tubo.

Para isolar microesferas liofilizadas ou secas sobre vácuo, foram pesados 2-4 mg de microesferas para um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Foi adicionado 70 pL de tampão TE e as microesferas foram ressuspensas.

Foi adicionado 200 pL de clorofórmio e os tubos foram agitados vigorosamente, mas não violentamente, agitados durante dois minutos para misturar as camadas orgânica e aquosa. Os tubos foram centrifugados a 14000 rpm durante 5 minutos. Foi removido cuidadosamente 30 pL da fase aquosa para um tubo novo.

Pico Green e Análise em Gel de Microesferas

Foram pesados 3,5-4,5 mg de microesferas para um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Foi adicionado 100 pL de DMSO a cada tubo, e os tubos foram rodados à temperatura ambiente durante 10 min. As amostras foram removidas do dispositivo de rotação e inspeccionadas visualmente para verificar que as amostras estavam completamente dissolvidas. Quando necessário, foi utilizada uma ponta de pipeta para quebrar quaisquer aglomerados residuais. Nenhuma das amostras foram deixadas permanecer em DMSO durante mais de 30 minutos. 44

Para cada amostra a ser testada, foi pipetado 990 pL de TE para três tubos de microcentrífuga separados. Foi pipetado 10 pL da solução de DMSO/microesfera para cada 990 pL de TE com mistura. As misturas foram centrifugadas a 14000 rpm durante 5 minutos.

Para cada amostra, foi retirado 1,2 mL de TE para um tubo de centrífuga de fundo redondo, de 5 mL com tampa de pressão. Foi adicionado 50 pL da mistura de 1 mL de TE/DMSO/microesfera aos 1,2 mL de TE. Foi adicionado 1,25 mL de reagente de pico green a cada tubo, e a fluorescência foi medida num fluorímetro. EXEMPLO 3: Precipitação com Álcool

Precipitação com Etanol

Foi preparado ADN como no Exemplo 2. Três amostras, cada uma contendo ADN a 1,2 mg, foram precipitadas pela adição de 0,1 vol de acetato de sódio a 3 M e 2 volumes de etanol. O ADN foi ressuspenso em água para uma concentração final de 4 mg/mL. O ADN em duas das amostras foi ressuspenso imediatamente antes da utilização e o ADN na terceira amostra foi ressuspenso e depois rodado durante 4 horas à temperatura ambiente. O ADN de controlo a 4 mg/mL não foi precipitado com etanol.

Cada uma das quatro amostras foi encapsulada para microesferas pelo processo descrito no Exemplo 2. A quantidade de ADN por mg de microesferas foi determinada por análise de pico green, como descrito no Exemplo 2. Foram obtidos os seguintes resultados: 45

Amostra mg de MS pg de ADN/mg HS % incorp. % incr. Etanol, 0 h 1 4, 66 3,37 56 44 Etanol, 0 h 2 4,45 4,91 82 62 Etanol, 4 h 3, 96 4,30 72 57 Não precip. 3, 97 1,85 31

Os resultados indicam que a precipitação do ADN com etanol antes da encapsulação em microesferas resultou no aumento da incorporação variando desde 31% até mais de 56%, representando um aumento de 44-62% na quantidade de ADN encapsulado.

As experiências seguintes verificaram que os efeitos da precipitação com etanol observados acima são independentes dos processos de preparação de ADN. 0 ADN foi preparado em três locais diferentes. A amostra 1 foi preparada como no Exemplo 2. A amostra 2 foi preparada como no Exemplo 2, mas sem a adição de tampão de remoção de ER. A amostra 3 foi preparada numa corrida de fabrico de fermentação a uma escala superior. As três amostras de ADN foram representativas de dois plasmideos diferentes (DNA-1 e DNA-3 foram idênticos) de tamanhos 4,5 kb e 10 kb. As três amostras de ADN foram testadas para o aumento da eficiência de encapsulação por precipitação com etanol. Foram precipitadas três amostras de ADN, contendo cada uma 1,2 mg, pela adição de 0,1 vol de acetato de sódio a 3 M e 2 volumes de etanol. O ADN foi ressuspenso em água a uma concentração de 4 mg/mL. Três amostras de ADN de controlo, a 4 mg/mL, não foram precipitadas com etanol.

Cada uma das amostras foi encapsulada pelo processo descrito no Exemplo 2. 46 A quantidade de ADN por mg de microesferas foi determinada por análise de pico green como descrito no Exemplo 2. Foram obtidos os seguintes resultados:

Amostra mg de MS pg ADN/mg MS % incorp. % incr. 1 ppt et 3,35 3,10 67 59 2 pt et 4,45 4, 91 66 47 3 ppt et 3,34 2, 65 48 29 1 não ppt 3,38 LO Oh 1—1 42 - 2 não ppt 3,35 1, 80 45 - 3 não ppt 3,33 1—1 co 1-1 37 -

Os dados demonstram que a precipitação com etanol aumentou a quantidade de ADN encapsulado nas microesferas em 29-59%. 0 efeito demonstrou manter-se independentemente do tamanho e da técnica de preparação.

Precipitação com isopropanol vs. etanol 0 ADN plasmidico foi precipitado com etanol ou isopropanol, depois ressuspenso em água durante 4 horas ou 16 horas. 0 ADN de controlo não foi precipitado. As microesferas foram preparadas de acordo com o protocolo no Exemplo 2. Foram obtidos os seguintes resultados: 47

Amostra mg MS pg ADN/mg MS %incorp. % incr. não ppt. 1 4,43 0,99 17 - não ppt. 2 4,30 0,99 17 - ppt. et 1 16 h 4,26 2,12 37 118 ppt. et 2 16 h 4,34 1,66 31 82 ppt. isoprop. 1 16 h 4,60 1,71 31 82 ppt. isoprop. 2 16 h 4,90 1,72 32 88 ppt. et. 1 4 h 4,65 2,22 42 147 ppt. et. 2 4 h 4,27 1,69 30 76 ppt. isopro. 1 4 h 4,55 1,41 25 47 ppt. isopro. 2 4 h 4,30 2,78 46 170

Estes resultados demonstram que a precipitação com álcool aumenta a eficiência de encapsulação do ADN, independentemente do tipo de álcool utilizado para precipitar o ADN e independentemente do tempo após a precipitação do ADN.

Condutibilidade

As condutibilidades das amostras precipitadas com etanol e não precipitadas foram determinadas utilizando um medidor de condutibilidade. Verificou-se que a precipitação do ADN conduziu a uma diminuição na quantidade de sal presente. A condutibilidade sem precipitação com etanol foi 384 μΩ, enquanto que a condutibilidade após precipitação com etanol foi 182 μΩ. Assim, a precipitação com álcool, ou com qualquer outro meio de remoção de sal/contaminante, é provável que aumente a eficiência de encapsulação. Por isso, parece que os tratamentos que tornam o ADN livre de contaminantes provavelmente aumentam a eficiência de encapsulação do ADN. 48 0 ADN foi então precipitado com etanol ou precipitado na presença de NaCl a 0,4 M e brometo de hexadeciltrimetilamónio a 5% (CTAB). O ADN foi então encapsulado como descrito acima. O ADN foi extraído e analisado por electroforese em gel de agarose. Os resultados indicaram que a precipitação do ADN com CTAB conduziu a um aumento marcado na quantidade de ADN superenrolado nas microesferas. EXEMPLO 4: Adição de Compostos Estabilizadores

Tampão TE O ADN plasmídico foi ressuspenso em tampão TE após precipitação com etanol, numa tentativa de aumentar a estabilidade do ADN. As microesferas foram então preparadas como descrito no Exemplo 2. O ADN foi extraído das microesferas e analisado por electroforese em gel de agarose. Uma faixa foi carregada com o plasmídeo utilizado (pliPLPLR); outra faixa com o ADN plasmídico após precipitação com etanol, ressuspensão em água, e encapsulação em microesferas; e ainda outra faixa com o ADN plasmídico após precipitação com etanol, ressuspensão em tampão TE, e encapsulação em microesferas. Os resultados indicaram que a quantidade de ADN superenrolado nas microesferas foi aumentada por ressuspensão em tampão TE.

Dois outros plasmídeos, designados pbkcmv-n-p e E3PLPLR, foram sujeitos às condições descritas acima. Esta experiência confirmou que os dois outros plasmídeos foram também estabilizados pelo tampão TE. 49 A experiência seguinte foi conduzida para determinar o tempo do efeito do TE. Foram dissolvidas 2 g de PLGA em 18 mL de cloreto de metileno. 500 pg ADN foram precipitadas com etanol e dissolvidas em 3,6 mL de TE ou água. As duas soluções foram misturadas por inversão várias vezes e depois sonicadas no dispositivo de Fisher (ver Exemplo 2) na marca 3 durante 10 segundos com uma microponta 1/8". A vários tempos de pós-sonicação (i. e., 5, 15, 30, 45, e 60 minutos), foi removido 1 mL de amostra de cada tubo, foi adicionado 100 pL de água, a amostra foi centrifugada numa centrífuga Eppendorf, e a camada superior da amostra centrifugada foi removida para um tubo separado. As amostras foram então analisadas por electroforese em gel.

Os resultados indicaram que o tampão TE actuou para estabilizar o ADN precocemente no processo de encapsulação, durante a formação da emulsão de óleo em água.

Para determinar o efeito de Tris e/ou EDTA no tampão TE, o ADN foi ressuspenso em água, tampão TE, TRIS a 10 mM, ou EDTA a 1 mM antes da encapsulação nas microesferas pelo método do Exemplo 2. O ADN foi extraído das microesferas e analisado num gel de agarose. Verificou-se que o Tris e EDTA eram, cada um, semelhantes ao tampão TE completo na sua capacidade para proteger o ADN durante o processo de encapsulação e durante a liofilização.

Foi efectuada uma experiência para determinar o efeito do pH na encapsulação (o pH das soluções de EDTA, Tris, e TE na experiência anterior foram todos semelhantes). As microesferas foram preparadas encapsulando o ADN que tinha sido precipitado com etanol e ressuspenso em Tris de pH diferente, ou em soro 50 fisiológico tamponado com fosfato (PBS). 0 ADN foi extraído após liofilização das partículas, e analisado em gel da agarose. Os resultados indicaram que houve um efeito significativo do pH na estabilidade do ADN encapsulado. A ressuspensão do ADN em água (pH 6,5), PBS (pH 7,3), e Tris (pH 6,8) todas conduziram a uma diminuição na proporção de ADN superenrolado em relação ao ADN total nas microesferas. Aumentar o pH para 7,5 ou superior teve um efeito positivo numa quantidade de superenrolamento, sugerindo que níveis de pH básico são importantes para manter a estabilidade do ADN. 0 pH aumentado também teve um efeito na eficiência de encapsulação: AMOSTRA mg de MS pg ADN/mg MS % incorp. Tris pH 6,8 2,42 2, 77 55,5 Tris pH 7,5 2,52 2,73 54,6 Tris pH 8,0 2,49 3,29 65,9 Tris pH 9,9 2,46 3, 81 76,3 água 2,46 2,48 49,7 PBS pH 7,3 2,49 0,55 11 TE pH 8,0 2,52 2,22 44,3

Outros compostos tampão

Também foram testados tampões de borato e fosfato para o seu efeito na qualidade do ADN encapsulado. 0 ADN foi precipitado com etanol, ressuspenso em várias soluções de tampão, e encapsulado, de acordo com o processo do Exemplo 2. 0 ADN foi extraído das microesferas e analisado por electroforese em gel de agarose. TE, BE, e PE produziram , todos, mais de 50% de superenrolamento no ADN encapsulado. Um benefício adicional ao 51 ADN foi também verificado, resultando do EDTA na presença de Tris, borato ou fosfato.

Outros compostos estabilizadores

Adicionalmente aos tampões, foram testados outros compostos para a sua capacidade em proteger o ADN durante o processo de encapsulação. 0 ADN plasmidico foi precipitado com etanol e ressuspenso em água ou uma solução de sulfato de dextrano. Foram, então preparadas microesferas de acordo com o método do Exemplo 2. 0 ADN foi extraído das microesferas antes e após liofilização e analisado por electroforese em gel de agarose.

Os resultados sugeriram que a adição de um estabilizador conduziu à encapsulação de mais ADN superenrolado do que a ressuspensão de ADN apenas em água. A maior melhoria na estrutura do ADN foi observada com uma solução de sulfato de dextrano a 10%. A protecção ocorreu aparentemente a dois níveis. Um efeito do sulfato de dextrano foi observado no ADN pré-liof ilização, uma vez que, após encapsulação, uma maior proporção do ADN permaneceu no estado superenrolado com quantidades crescentes de sulfato de dextrano também ocorreu. A protecção promovida pelo estabilizador durante o processo de liofilização, uma vez que a presença do estabilizador durante este processo aumentou a percentagem de ADN que permaneceu no estado superenrolado.

Para determinar se os efeitos de TE e de outros estabilizadores foram ou não aditivos, o ADN precipitado com etanol foi ressuspenso em TE ou água, com ou sem uma solução de outro estabilizador (e. g., sacarose, dextrose, CTAB, 52 ciclodextrina ou dextrano). Foram preparadas microesferas de acordo com o método do Exemplo 2. 0 ADN foi extraído das microesferas e analisado por electroforese em gel de agarose.

Os resultados demonstraram que ressuspender o ADN numa solução de estabilizador/TE é melhor do que, ou equivalente, à utilização apenas de TE, na medida em que uma percentagem maior de ADN permanece no estado superenrolado após encapsulação nestas condições.

Também foram adicionados estabilizadores em combinação, para determinar se os efeitos do estabilizador são ou não aditivos. 0 ADN foi precipitado com etanol e ressuspenso em várias soluções de estabilizador. 0 ADN foi encapsulado como descrito no Exemplo 2, extraído, e analisado por electroforese em gel de agarose. Os resultados indicaram que podem ser utilizadas combinações de estabilizadores para aumentar a quantidade de ADN encapsulado, superenrolado. EXEMPLO 5: Adição de Excipientes

Para determinar se os compostos de excipiente possuem ou não um efeito adverso no ADN plsmídico encapsulado, foram preparadas microesferas do ADN precipitado com etanol seguindo o protocolo no Exemplo 2, com a excepção de, antes da liofilização, as microesferas terem sido ressuspensas em soluções contendo excipientes. Cada amostra foi então congelada e liofilizada como no Exemplo 2. A concentração final dos excipientes nas microesferas após ressuspensão a 50 mg/mL foi Tween 80 a 0,1%, D-sorbitol a 5%, D-manitol a 5 %, ou carboximetilcelulose (CMC) 53 a 0,5%. O ADN foi extraído das microesferas e analisado num gel de agarose.

Os resultados ilustraram que a adição de excipientes antes da liofilização não afectaram significativamente a estabilidade do ADN ou o grau de superenrolamento. EXEMPLO 6: Estudos Celulares In Vitro

Fagocitose In Vitro de Micropartícuias Contendo ADN

Em cada um dos dois poços de uma placa de cultura de tecidos, foram plaqueados cerca de 10β macrófagos em 3 mL de meio RPMI contendo soro de bovino fetal a 10%. Foram ressuspensos 5 mg das micropartículas contendo ADN codificando luciferase em 200 pL de solução salina, e 50 pL da suspensão resultante foi adicionada a uma das paredes contendo macrófagos. A placa foi incubada a 37 °C durante 1-6 horas. A disseminação lateral vs. para a frente (i. e., complexidade intracelular vs. tamanho) das células foi analisada por FACS utilizando um instrumento Becton Dickinson FACS. A Fig. 4 apresenta os resultados. Populações de células que não fagocitaram encontram-se na região Rl. As células fagocitárias permanecem do mesmo tamanho (perfil de FSC), mas não demonstraram um perfil de disseminação lateral aumentado. Estas células encontram-se na região R2. 54

Medição da Expressão de AON Após Fagocitose

Em dois poços de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços, cerca de 2,5xl05 macrófagos foram plaqueados em 1 mL de meio RPMI contendo soro de vitela fetal a 10%. A placa foi incubada a 37 °C durante 6 horas. Foi ressuspenso 1 mg das micropartículas liofilizadas contendo ADN codificando luciferase em 400 pL de solução salina. Foi adicionado 6 pL da suspensão resultante a uma das paredes contendo macrófagos, e foi adicionado 25 pL da suspensão à outra. A placa foi incubada a 37 °C durante 4 horas. O meio, incluindo as micropartículas, foi

removido e foi adicionado meio fresco às células. A placa foi novamente incubada a 37 °C durante 1-5 dias. As células foram recolhidas para um tubo e centrifugadas a 1500 RPM durante 5 minutos. As células sedimentadas foram ressuspensas em 100 pL de IX Tampão de Lise Celular (Promega) num tubo EPPENDORF™. A mistura foi centrifugada a 14000 RPM durante 5 minutos de modo a remover por precipitação qualquer resíduo celular. O lisado celular foi ensaiado adicionando 5 pL do sobrenadante a 100 pL de substrato luciferase (Promega) e medindo a saída de luz numa combinação luminómetro/contador de cintilações TOPCOUNT™ (Packard Instruments).

Os resultados para esta experiência são apresentados na Tabela 5. Estes indicam que as células que fagocitam micropartículas que contêm, por exemplo, ADN de luciferase, expressam, de facto, o ADN. Assim, a integridade do ADN e a funcionalidade são confirmadas. Os resultados também indicam que a incorporação das micropartículas por fagocitose não evite a chegada do ADN ao núcleo. 55 TABELA 5: Fagocitose de ADN encapsulado leva à expressão de uma construção com o gene repórter de luciferase. MICROPARTICULAS CONTENDO: ADN de Luciferase ADN Controlo 25 pL 6 pL 25 pL 6 pL Dia 1 1257 168 103 245 Dia 2 2632 492 107 133 Dia 3 3400 507 80 93 Dia 5 763 310 90 90 Dados apresentados em contagens por 0,01 minutos EXEMPLO 7: Estudos Celulares In Vivo

Expressão In Vivo de ADN Incorporado

Foram ressuspendidos 45 mg de ADNc de luciferase em microparticulas em 250 pL de solução de soro fisiológico. Foram injectados 40 pL da suspensão resultante em cada músculo anterior tibial de um murganho. Sete dias mais tarde, cada anterior tibial foi dissecado e colocado num tubo EPPENDORF™ em gelo seco. Utilizando um almofariz e um pilão arrefecidos em gelo seco, cada músculo anterior tibial foi moído num pó, depois voltou ao tubo EPPEMDORF™. Foram adicionados 500 pL de tampão de lise celular lx (Promega) . O tubo foi agitado para cima e para baixo num misturador vórtice a 4 °C durante 15 minutos. O tubo e o seu conteúdo foram congelados em azoto líquido, depois descongelados a 37 °C. O ciclo de congelação/descongelamento foi repetido mais duas vezes. O tubo foi centrifugado a 14000 RPM durante 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo 56 tubo e centrifugado de novo durante 5 minutos. Para ensaiar a expressão, foram adicionados 20 pL do sobrenadante a 100 pL de substrato de luciferase (Promega) e a produção de luz foi medida num contador de combinação luminómetro/cintilação TOPCOUNT™ (Packard Instruments).

Os dados para esta experiência são proporcionados na Tabela 6. Estes indicam que as células do músculo podem expressar ADN libertado a partir das microparticulas. Uma vez que não se conhece fagocitose nestas células, este é um exemplo de efeito de depósito. TABELA 6: Expressão do ADN de luciferase encapsulado em músculos de murídeo Músculo 1 2 x 10' Músculo 2 8 x 104 Músculo 3 1 x 10b Músculo 4 6 x 10' Controlo 2 x 10" Dados apresentados em contagens por 0,01 minutos

Produção de Células T Citotóxicas Após a Injecção de Microparticulas Contendo ADN

Foram ressuspendidas 90 mg de microparticulas contendo ADN que codifica VSV-Npep em 900 pL de solução de soro fisiológico. Foram ressuspendidas 60 mg de microparticulas contendo ADN vector de controlo em 600 pL de solução de soro fisiológico. Foram ressuspendidos 300 pg de ADN plasmidico de VSV-Npep em 57 300 pL de solução de soro fisiológico. Foram ressuspendidos 300 pL de ADN vector de controlo em 300 pL de solução de soro fisiológico. Foram ressuspendidos 150 pg do péptido VSV-N em adjuvante incompleto de Freund (IFA).

As cinco suspensões foram injectadas intraperitonealmente, intramuscularmente, ou subcutaneamente, de acordo com o regime seguinte: 1. Intraperitoneal: um primeiro grupo de 3 murganhos foi injectado intraperitonealmente com 100 pL de microparticulas contendo ADN de VSVNpep (Grupo 1). Um segundo grupo de 3 murganhos foi injectado com 100 pL de microparticulas contendo ADN vector de controlo (Grupo 2). 2. Intramuscular: (em cada músculo anterior tibial): um terceiro grupo de 3 murganhos foi injectado intramuscularmente com 100 pL de microparticulas contendo ADN de VSV-Npep (Grupo 3) . Um quarto grupo de 3 murganhos foi injectado com 100 pL de microparticulas contendo ADN vector de controlo (Grupo 4) . Um quinto grupo de 3 murganhos foi injectado com 50 pg/perna de ADN plasmidico de VSV-Npep (i. e., na ausência de microparticulas) (Grupo 5). Um sexto grupo de 3 murganhos foi injectado com 50 pg/perna de ADN plasmidico vector de controlo (Grupo 6). 3. Subcutâneo: Um sétimo grupo de 3 murganhos foi injectado subcutaneamente com 100 pL de microparticulas contendo ADN de VSV-Npep (Grupo 7) . Um oitavo grupo de 3 murganhos foi injectado com 50 pg de péptido VSV-N/IFA (Grupo 8). 58

Após duas semanas, os grupos 5, 6, e 8, que receberam o péptido sintético ou ADN sem microparticulas, foram injectados de novo. Os grupos 1-4 e 7 que receberam inicialmente microparticulas, não foram re-injectados.

Sete dias após o ultimo conjunto de injecções, os baços de murideo foram recolhidos. Foram produzidas suspensões de célula única pelos métodos convencionais, as células vermelhas do sangue foram lisadas, e as restantes células foram ressuspendidas em RPMI com soro de vitela fetal a 10% para produzir uma concentração final de 4 x 106 células efectoras/mL. Metade das células de cada grupo foram então incubadas a 37 °C durante 6 dias com um igual número de células estimuladoras singénicas com pulso de péptido que foram previamente tratadas com mitomicina C. As restantes células foram incubadas só com 50 μΜ de péptido.

Após o segundo dia de incubação, foi adicionado 0,1 volume de equivalentes de sobrenadante contendo IL-2, derivado de células incubadas com ConA. Após o sexto dia de incubação, as células efectoras foram recolhidas e incubadas em placas de 96 poços de fundo redondo contendo células alvo marcadas com 51Cr, com pulsos de péptido a 37 °C durante 5 horas. As proporções efector-para-alvo para os poços variaram de 200:1 decrescendo a 1:1.

Para determinar o nivel de lise máxima, foram adicionados 20 pL de dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS) a certas células contendo apenas células alvo. Para determinar o nivel de lise espontânea, certos poços foram incubados apenas com meio (i. e., células alvo mas não células efectoras). A lise especifica foi calculada como se segue: [(lise experimental)- (lise 59 espontânea)/(lise máxima)-(lise espontânea)]xlOO = lise específica.

Os resultados são apresentados nas Figs. 5-9.

Na experiência associada com a Fig. 5, as células efectoras de murganhos (Grupo 1) imunizados intraperitonealmente com micropartículas contendo ADN que codifica um péptido da proteína VSV-N foram testados para actividade citolítica contra várias células alvo. 0 péptido VSV liga-se ao receptor H-2Kb da classe I. Os alvos singénicos expressam o receptor H-2Kb enquanto os alvos alogeneicos utilizados nesta experiência expressam o receptor H-2Kd. A actividade de CTL foi testada em alvos singénicos (EL4) sem péptido, alvos singénicos (EL4/VSV) marcados com o péptido VSV, alvos singénicos (EL4/SV) marcados com o péptido SV (i. e., um péptido não específico), e alvos alogénicos (P815/VSV) marcados com o péptido VSV.

Porque os alvos alogeneicos (P815/VSV) não expressam o receptor H-2Kb, não devem ser reconhecidos e lisados pelas células efectoras. Deste modo, os alvos P815 em mistura com o péptido VSV não são lisados. Os alvos singénicos (EL4) que não possuem o péptido VSV também não são lisados. Os alvos singénicos (EL4/SV) que expressam um péptido diferente de VSV também não são lisados. Apenas os alvos (EL4/VSV) que possuem ambos, o receptor MHC certo e o péptido certo são lisados.

Em conjunto, os dados demonstram que a actividade de CTL pode ser estimulada por imunização com micropartículas contendo ADN que codifica um péptido VSV, e a lise é restrita a MHC e 60 específica para o péptido. Por outras palavras, apenas o péptido certo com o receptor MHC certo é reconhecido pelo receptor de célula T dos CTL produzidos por imunização de acordo com a invenção. Isto demonstrou que as micropartículas servem para a função desejada. A seguir, a resposta de CTL produzida pelos murganhos imunizados subcutaneamente com péptido sintético (Grupo 8) foi comparada com a resposta de CTL produzida pelos murganhos imunizados intraperitonealmente com micropartículas contendo ADN codifica o péptido VSV (Grupos 1 e 2). Na Fig. 6 é apresentada a lise obtida a uma proporção E:T de 100:1 para CTL produzida pela imunização dos murganhos com micropartículas incluindo ADN que codifica o péptido VSV-N (MS-VSV; Grupo 1), micropartículas incluindo ADN vector de controlo que não codifica um péptido VSV (MS-vector; Grupo 2), ou péptido VSV-N sintético (péptido; Grupo 8). Os alvos foram células singeneicas (EL4) marcadas com péptido VSV.

Os murganhos imunizados com o ADN de VSV-Npep em micropartículas (MS-VSV) produziu uma resposta de CTL mais forte (33% de lise específica) do que a dos murganhos imunizados com micropartículas de controlo contendo vector de ADN vazio (MS-vector) (10% de lise específica). Os murganhos imunizados com o péptido VSV-N (péptido) produzem uma resposta de CTL mais fraca do que os imunizados com micropartículas contendo ADN de VSV-Npep (MS-VSV). Assim, as micropartículas serviram para a função desejada.

As respostas de CTL em murganhos imunizados intraperitonealmente com ADN de VSV-Npep contido em micropartículas (MS-VSV) foram comparadas com as respostas de 61 CTL de murganhos imunizados intramuscularmente com ADN "nu" de VSV (VSV) . As respostas de CTL em murganhos imunizados com as microparticulas contendo ADN (MS-VSV; Grupo 1) foram mais fortes que a dos murganhos imunizados com ADN nu (VSV; Grupo 5) numa proporção E:T de 3:1 (Fig. 7). Os alvos foram células singénicas (EL4) marcadas com péptido VSV. Os murganhos que receberam o ADN nu foram imunizados duas vezes, enquanto os murganhos imunizados com as microparticulas foram apenas dadas num tratamento. Os dados na Fig. 7 mostram, assim, que uma injecção de ADN em microparticulas foi mais eficaz do que duas injecções de uma quantidade maior de ADN "nu". A Fig. 8 apresenta os resultados de uma experiência equivalente à relatada na Fig. 5, com a excepção de que as injecções foram subcutâneas (murganhos do Grupo 8) em vez de intraperitoneais. Esta experiência demonstrou que as injecções subcutâneas de microparticulas contendo ADN de VSV-Npep são também eficazes para produzir respostas por CTL. A experiência ilustrada na Fig. 9 é também semelhante à da Fig. 5, excepto que foi utilizado o ADN codificante de um péptido diferente, de modo a demonstrar que os resultados obtidos não eram exclusivos para o ADN de VSV-Npep. Os murganhos transgénicos HLA-A2 foram imunizados com microparticulas contendo ADN que codifica um péptido do péptido E6 do vírus papiloma humano (HPV). 0 péptido E6 de HPV denominado A2.1/4 liga-se ao receptor de MHC humano HLA-A2. A experiência comprovou a capacidade dos efectores de CTL lisarem alvos singénicos (i. e., alvos que possuem o receptor HLA correcto) que são marcados com o péptido de HPV correcto (A2.1/4) ou qualquer outro péptido não marcado (sem péptido). As proporções E:T estão listadas ao longo do eixo do X. 62

EXEMPLO 8: Tratamento com Micropartículas Contendo ADN

De acordo com o procedimento do exemplo 1, as micropartículas são preparadas contendo ADN que codifica um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos cerca de 50% idêntica aos resíduos 170-191 de PLP (SEQ ID N°: 2). Um doente com esclerose múltipla cujas células T segregam citocinas TH1 em excesso (i. e., IL-2 e γ-IFN) em resposta a auto-antigénios foi injectado intravenosamente com 100 pL a 10 mL das micropartículas. A expressão do péptido do tipo PLP pelos APCs resulta no desencadear do perfil de citocinas das células T, de modo que estas produzem citocinas TH2 (i. e., IL-4 e IL-10) em resposta a autoantigénios.

EXEMPLO 9: Tolerância com Micropartículas Contendo DNA

De acordo com o processo do exemplo 1, as micropartículas são preparadas contendo ADN que codifica um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos correspondente aos resíduos 33-52 de MBP (SEQ ID N°: 34) . Um mamífero foi injectado subcutaneamente com 1-500 pL das micropartículas. A expressão do péptido de MBP pelos APCs resulta na tolerância das células T que reconhecem o autoantigénio. EXEMPLO 10: Implantação de Micropartículas

Uma molécula de ADN, incluindo uma sequência de controlo de expressão operacionalmente ligada a uma sequência que codifica uma sequência de tráfico e um péptido essencialmente idêntico aos resíduos 80-102 da proteína mielina básica (MBP) 63 (SEQ ID N°: 1), é associada com um polímero para formar micropartícuias, de acordo com o processo do exemplo 1. As partículas inferiores a 100 pm são removidas. O constituinte polimérico da micropartícula é o ácido poli-láctico-co-glicólico, em que a proporção de ácido láctico para ácido glicólico é 65:35 em peso. As micropartículas resultantes são cirurgicamente implantadas subcutaneamente num doente. EXEMPLO 11: Preparação de Micropartículas Contendo ADN e Proteína O ADN plasmídico foi preparado por métodos convencionais utilizando MEGA-PREP™ Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Foi utilizado um kit de tampão isento de endotoxina (Qiagen) para todas as manipulações de ADN. O ADN é ressuspendido em água destilada, desionizada, estéril, para produzir uma concentração final de 3 pg/pL. Adicionalmente, é adicionado 0-40 mg de proteína purificada a cerca de 1 mL de solução de ADN. É adicionada uma massa de gelatina, igual a cerca de 20% da massa de proteína.

Até aos 400 mg de PLGA (i. e., pelo menos, dez vezes a massa de proteína) é dissolvida em cerca de 7 mL de cloreto de metileno. A solução de ADN/proteína é vertida na solução de PLGA e homogeneizada ou sonicada para formar uma primeira emulsão. A primeira emulsão é vertida em cerca de 50-100 mL de uma solução aquosa de tensioactivo (e. g., 0,05% a 2% de PVA em peso). A mistura é homogeneizada a cerca de 3000-8000 RPM para formar uma segunda emulsão. As micropartículas são então isoladas de acordo com o processo do exemplo 1. 64 EXEMPLO 12: Tratamento com Micropartículas Contendo ADN e Proteína

As micropartículas incluindo uma proteína antigénica possuindo os determinantes conformacionais necessários para a indução de resposta de células B contra o vírus da hepatite B (HBV) e ADN que codifica o epitopo CTL para HBV, são preparadas de acordo com o processo do exemplo 10. Um doente infectado ou em risco de infecção com HBV é imunizado com as micropartículas. A libertação lenta da proteína das micropartículas não fagocitadas leva a um reconhecimento pelas células B dos determinantes conformacionais e subsequente secreção de anticorpo. A libertação lenta do ADN ou fagocitose de outras micropartículas leva os APCs (1) a expressar o ADN de interesse, produzindo assim uma resposta de célula T; e (2) a digerir a proteína libertada a partir das micropartículas, produzindo assim péptidos que são subsequentemente apresentadas por moléculas de classe I ou II. A apresentação pelas moléculas da classe I promove a resposta de CTL; a apresentação pelas moléculas da classe II promove a resposta de anticorpos e de células T, uma vez que as células TH activadas pelos complexos de classe II/péptidos segregam citocinas não específicas.

Os resultados são a eliminação de HBV do doente e prevenção continuada da produção de vírus nas células do doente. 65

EXEMPLO 13: Fagocitose de Microesferas Contendo ADN

Plasmídico por Células Dendríticas de Murídeo

As microesferas foram preparadas pelo processo do Exemplo 2, excepto que foi adicionado um oligonucleótido fluorescente durante o processo de encapsulação. Foram isoladas células dendriticas do baço a partir de murganhos e incubadas sem nada, com esferas fluorescentes, ou com microesferas preparadas. A análise de FACS das células indicou que as esferas fluorescentes e as microesferas preparadas foram ambas fagocitadas. Além disso, as microesferas preparadas não fluorescem a menos que tenham sido ingeridas pelas células dendriticas, sugerindo que depois da fagocitose, as microesferas são hidratadas e degradadas, permitindo a libertação do ADN encapsulado no citoplasma das células.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Pangaea, Inc.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MICROPARTÍCULAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 107 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Fish & Richardson, P.C. (B) RUA: 225 Franklin Street 66 (C) CIDADE: Boston

(D) ESTADO: MA

(E) PAÍS: US (F) CÓDIGO POSTAL: 02110-2804 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM Compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: Windows95 (D) SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versão 2.0¾ (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US98/---- (B) DATA DE PEDIDO: 22-JAN-1998 (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/787 547 (B) DATA DO PEDIDO: 22-JAN-1997 (viii) INFORMAÇÃO DO REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Fraser, Janis K. (B) NÚMERO DE REGISTO: 34819 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ARQUIVO: 08191/003W01 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 617-542-5070 (B) TELEFAX: 617-542-8906 67 (C) TELEX: 200154 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:l: (i) CARACTERÍSTICAS DAS SEQUÊNCIAS: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:l:

Giy Thr Gin Ásp Gin km Pro uai uai lis Ph« Phe Lys àím lie 1 5 10 15

Uai Thr Pro Rrg Thf Pro Prc-20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:2: 68

Ala Vai Tyr Vai Tyr Xle Tyr Phe ήβη Thr Trp Thr Thr Cys Oln Phe 1 i ÍÕ IS lia Ala Phe Pro PM Lya ao (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:3: PM Lya Mat .&«* Mat Ala Thr' Pro Mu Mu Mat Oia Ala 1 § 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:4: 69

Thr Vai Oly Leu Gin £>eu 11» ©In Leu lie hm Vai Asj? ©lu Vai Asn l S 10 15

Glfi Ile Vai Thr Thr Am Vai Ãrçj Leu Lys 51« 51« Trp Vai ftep Tyr 20 2§ 30 hm Leu Lya Trp 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:5:

Gin Xle vai The Thr Aan Vai Arg Leu Lys Gin ela Trp vai ãsp Tyr 1 S 10 15

Aan Ly« Trp 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:6: 70 βΐη Τιρ Vai Asp 5yr han Leu X 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:7:

Cly Óly Vai Ly,s lie Mis I;la Pro Ser Lys Ile ϊϊ:|> ftjrg Pr o X 5 10 IS Ãsp Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:8: 71 JU.it II* Vfcl tyn Ph® fte Lyts Visl &*« Leu Mk Tyr i s m (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:9:

Trp Ifcr Pm Pm Aia Ile Pfte Lya Ser Tyr Cya Gla Iie lie Vai Thr 1 5 10 15

His Phe Pro Phst (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:10: 72

Mste i»ye Lsu Gly Thr Trp Thr Tyr ftsp Gly ser Vai vai 1 % 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:ll: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:ll:

Mst Lys Leu Gly Tle Trp Thr Tyr Asp Gly Ser Vai Vai 1 3 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12:

Vrp thr Tyr Mp Sly Ser Vai Vai Ala I 5 73 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:13:

Ser Cya Cye Prc Aep fhr Pro Tyr Leu Asp 11« Ihr Tyr His Phs vai 1 S 10 15

Met (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:14:

Mp ®hr Pre fyr leu Asp lie Thr Tyr Sis Phe Vãl Met Gin Arg 1«« i S 10 IS

Pro Leu 74 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:15:

Pite Ile Vai ften Vai lie lie Pps Cyu Leu Lesa J?he Ser m* Leu 3Cbr í 5 10 15

Giy Lea Vai Phe Tyr 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:16:

Lee Lee Vai He Vai Glu Lea lie Pro Ser Tfcr Ser Ser 1 s 10 75 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:17:

fh-E Hia Vai M£t PfO Asn Trp Vãl. Arg Lys Vai Phe 11« Âep Thr 1 & 10 IS J.le Pro Asa (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:18:

Asa S?rp Vai Arg Lys Vai Pha Xla ftap thr lie Pr© λβη 11« Mst p&e 1 S 10 15 PA# iéaí 76 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:19: 11* .&** 11* M*fe Pha Ffie $** ffer g$* teg F» §«*? δ lis í ' & 10 ^ li

Pyg Pio (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:20:

Ala Ais Ala slti Trp Lye Tyr vai Ala «et vai Het ftsp His He hmx 1 5 10 is 77 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:21:

Ils li© Gly Xhr Leu Me Vai. ffeé Ma €»ly Ârg Leu Ϊ1© <3.1« Leu 1 1 10 15

Glii Gin Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:22: Ôly Gin Thr XI© G,lu Xrp II.© Ph© lis ãsp Pró Glu ik Phe Xhr Glu 1 s 10 15

Asn <Siy Glu Trp so 78 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:23:

Het Ala Bis Tyr Asn Afíj Vâl Pr» Ma Lee Pro Pfae Pro Ôiy ãssp Pro i η ίο is

Arg Pro fyr Leu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:24:

Lsa Asn Ser Lys lis Ala Phs Lys He Vai Ser Gin Gla Pro· Ala .1 & 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 79 (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:25:

Thr Pro Mefc Phe Le» Leu Sm Arff Thr (11 y «Slu Vai Arq fhr 1 5 10 IS (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:26:

Pío Leu Gly fhe Phe Pro Asp Hl a 01« Leu Aep firo Ala Phe Gly àla 1 5 10 ‘ IS (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 80 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:27: Léu OLy PM Pké Pro Âsg Mie <Slo Leu As|> Pro Ala Pite Oly Ala. Aert 1 5 10 15 fer (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:28:

Ph» Ph® IíSh Len Ite Arg 11© tA* Ϊ1» i S 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:29: 81 ftrg ile Leu Thr xle Pro Glr mx leu A8p 1 · $ 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:30: ?hr Pro Thr hm Vai Vai Ser Arg hm leu Oly lyè 1 S 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:31:

Ala Lya Thr lie Ala ff» &«£> Giu fíiu Ala A.rg Arg 1 S 10 82 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:32:

Vai Vai Thr Vai Arg Ala CSla Arg fro Oly l 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:33:

Ser Oiti Arg Bis Gly Ser Lys Tyr Léu ftlâ Thr Alá Ser Thr Mét. Asp I S 10 15

Mis Alá Axg Mie Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 83 (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:34:

Mg Mp FM Gly II e Mti Asp $m:e lie Sly Mg Phe Fhe dly Gly Mp x s ίο m

Mg Gly Ala Me 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:35:

ôlft Lys Sm Hle ôiy Arg ΪΜ sin Aap qím Mn pre vai vai His pite I S 20 IS

Phe Lys Asn lie 20 1(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 84 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:36:

Asp Giu Asn Pro Vai Vsl Ms Fh© Phe Lya Mt Ile Vai Thr ,'i 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:37: GM Aen Pro Vai Vai Bis Pto Pfea Lys ASft Ila Vai T&sr Fr o Arg X 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:38: 85

Sis Fhe Lys Αβη Ile Vai EAr Fro Arg fhr pare Fr» 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:39:

Lye OXy Fhe tys OXy Vai Aep Alã 01® OXy thv leu Ser Lye 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:40:

Vai Aep Ala Glft Oly Thr Leu set Lya lie Fhe Lys Lee oiy Oly 1 $ 10 15

Aep Ser Arg Ser 20 86 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:41:

Leu Gin Tysf IX» Asp Ais Asn set Lys Fhe lia Giy ile Thr ®lu 1 & 10 xs

Leu Lys Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:42:

Gin Tyr lie lya Ala ftstt ser Lys Fite xie Giy He Tftr :i s ίο (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 87 (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:43:

Phe Aen Ma Phe Thr Vml Ser Phe Trp Leu Aít? Vai Pro Lye 1 S 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:44:

Ser Phe Trp Leu Arg Vàl Pr© Lys fal Ser Ala Ser Hís Lets Olu l 5 10 is (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 88 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:45:

Ay» FM XM Π« Lya AxtJ Tfg thx fso Mn Mò 01« XX« Assjj 0M FM i $ ίο n (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:46:

Gly Gin lie Gly hm Asp Pro An» Arg A»p lia 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:47: 89

Ala Ãta Arg Ata Vai Phe Ria Leu, X 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:48:

Tyr Arg Pm Arg Pm· Arg Arq Tyr 1 s (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:49:

Gla Ria. Rap- Pro Thr Cdy lis Ser $yr 1 S 90 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:50:

Sez* Ala Tyr Oly Glu Pro hsg Lye Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:51:

<5l« Vai Asp Pró lie <Sly ílís Leu Tyr 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 91 (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:52: rnm Um txp úkf JUrg M* Mu Ml i 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:53:

Ulj Jle Gly lis L«u T&r Vai ã s (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 92 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:54: %m fàr Vai n# C4y Vai 1 s (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:55: 8«r ffar Ma tm Ma Ri» «ly Vai 1 $ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:56: 93 6¼ «1« ítm li* Vai hm fh* i i (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:57: M®t. Peta Leu Ala Vai Lee Tyt Gy& Lati 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:58:

Ser <5 1b Ile Trp A.rg &sp ϊΐβ Asp Phe 1 S 94 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:59: M» íí&u Ρϊο Trp tfis Mg leu pfce 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:60

Tyr A«n Gly »»fe Ser Uln Vai

1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 95 (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:61:

Lys Thr frp Qly Gin Tyr Trp Gla Vai X 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido I(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:62:

Xla thr hsp Gin Vai iVàes &m: Vsl .1 S Ç(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 96 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:63:

Tyr Leu Clu Pro Qly Piro Xhr Vai Má X S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:64:

Leu Leu Aap GXy Tiir Me ThP Leu ftrg Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: ( A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:65: 97 &1ύ Leu ftsn <3Iu Ma Leu OLu Leu 01« Ly» 1' S 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:66: I(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:66:

Ser Thr Pro Pro Pro SJy Tlwr Arg Vai 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:67:

Leu Leu Pm Glu Asn Asm Vai Leu Ser Pro Leu l S 10 98 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:68:

Leu Leu Gly &rg Asn Ser Pha Gly Vai i 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:69: &rg Hat Pro Glu Ala Ala Pro pro vai 1 s (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 99 (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:70:

tys ílô Phe Gly Ssr Leu Ala. Pine Leu i S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:71: 21* 21* Sett Ala Vai Vai Gly Jl©

1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 100 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:72:

Cya Leu Lhr Ser ftsr Vel Gin Leu V&l X 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:73:

Tyr Leu Ght Asp Vai Arg teu Vai i 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:74: 101 vai Lau vai Lya ser Pto mu Eia vai i s (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:75:

Pba ferg Glu Leu Vai Ser Glu Phe Ser Arg Met 1 S 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:76: leu Leu Axg leu Ser Gl« Pro Ai a Glu Leu i s m 102 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:77:

Asp Leu Pró Thr <3in Ciu Pro Ma Leu X S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:78:

Lye Leu ain Cys vai Asp Leu Bis vai 1 $ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 103 (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:79:

Vai Leu Vàl Ala Ser Arg Sly Arg Ma Vai i s iò (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:80:

Vai teu Vai Sis fro Gin Trç» Vai Lau 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 104 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:81:

Mftt Ser 1 § Hí (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:82: (Sis for» Aísts ser fhr ?he Μ® % % (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:83: 105

Vsl Leu Gin Ala Gly Phe Phe 1 s (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:84

Leu Leu Leu Leu. Ile Fhe Leu

1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:85

Leu Leu Asj» Tf t Gin Gly Mefc Leu 1 5 106 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:86:

Leu Leu Vai Pro Ffee Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:87:

Ser xle Leu ser tre Ph© Met iro Lee Leu 1 I 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 107 (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:88:

Pro Leu Leu Pr© 11© Ph» Phe Cy8 L&»

l S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:89: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:89: li« t«u s»*· ¥h* **« tto f br Vai, 1 § 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:90:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 108 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:90:

Fhe Lbu Pra ser Aap Phe Pb» Pro Vai 1 S .10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:91:

Ljrs Leu hís teu tjfr see ale wo He

1 " S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:92: 109

Ma Lati mt Pro Le« Tyr Ma Cys. lie 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:93:

Bis Leu Tyr Ser Bis Pro íle Ile Leu 1 § (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:94:

Fhe L&u Lea ser Leu lie Ris 1 5 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:95:

Bis Leu Leu fsi <Siy Ser Ser Ply Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:96:

Qly Leu Sgr &rg Tyr Vai Ala ftrg Leu 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 111 (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:97: aia «In Fhe *Phr Ser ala Ile 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:98

Tyr &sp A*»p val V&l Ima Ply Ma 1 $ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 112 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:99:

Sly Léu Tyr S»r Ser The Vai Pro Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:100:

Mn Lôu Ser Ttp Leu M Léu Asp vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:101: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:101: 113

Lys Ls« Fr© Gin Lea eys Thr Gin tôu x s (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:102:

Thr thr ila Hia lie iík 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:103: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:103:

® hm 11« VAX 1 114 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:104:

fye Hat Leu âep Leu Sln Pro eit» Thr l S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:105:

Thr Leu His Plu Τγτ Met Leu Asp Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 115 (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:106:

Lew Leu Môt Giy Thr Leu Gly Ile Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:107:

Thr &eu Giy íle Vai Cys Pro lie 1 S

Lisboa, 6 de Julho de 2007 116

Claims (56)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Preparação de micropartículas, cada uma das quais compreendendo uma matriz polimérica de ácido nucleico, consistindo a matriz polimérica de um ou mais polímeros sintéticos possuindo uma solubilidade em água inferior a 1 mg/L, em que: pelo menos, 90% das micropartículas possui um diâmetro inferior a 100 microns; e o ácido nucleico é um vector de expressão consistindo de moléculas de ADN plasmidico circular, pelo menos, 50% das quais são superenroladas.
2. 2. Preparação da reivindicação 1, em que, pelo menos, 90% das micropartículas possui um diâmetro inferior a 20 microns.
3. 3. Preparação da reivindicação 1, em que o vector de expressão codifica um polipéptido antigénico, e cada uma das micropartículas compreende um determinante proteico antigénico.
4. 4. Preparação da reivindicação 3, em que o determinante antigénico promove uma resposta de anticorpo num mamífero.
5. 5. Preparação da reivindicação 3, em que o polipéptido antigénico induz uma resposta de célula T. 1
6. 6. Preparação da reivindicação 5, em que a resposta de célula T é uma resposta de célula T citotóxica.
7. 7. Preparação de qualquer das reivindicações 3 a 6, em que o polipéptido antigénico é diferente do determinante antigénico.
8. 8. Micropartícula inferior a 20 microns de diâmetro, compreendendo: uma matriz polimérica consistindo em um ou mais polímeros sintéticos possuindo uma solubilidade em água inferior a 1 mg/L; e moléculas de ácido nucleico, pelo menos, 50% das quais são ADN plasmidico circular superenrolado.
9. 9. Micropartícula da reivindicação 8, em que o DNA compreende uma sequência de controlo de expressão operacionalmente ligada a uma sequência de codificação.
10. 10. Micropartícula da reivindicação 9, em que a sequência de codificação codifica um produto de expressão com, pelo menos, 7 aminoácidos de comprimento, possuindo uma sequência idêntica à sequência de (a) um fragmento de uma proteína de mamífero que ocorre naturalmente ou, (b) um fragmento de uma proteína que ocorre naturalmente num agente infeccioso que infecta um mamífero.
11. 11. Micropartícula da reivindicação 10, em que o produto de 2 expressão compreende uma sequência de aminoácidos, pelo menos, 50% idêntica à sequência de aminoácidos de um fragmento de uma proteína seleccionada a partir do grupo consistindo na proteína mielina básica (MBP), proteína proteolipídica (PLP), cadeia invariante, GAD65, antigénio de células do ilhéu, desmogleína α-cristalina, e β-cristalina, em que o fragmento liga uma molécula de MHC de classe II.
12. 12. Micropartícula da reivindicação 10, em que o produto de expressão compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência seleccionada do grupo consistindo das SEQ ID N° 1-46.
13. 13. Micropartícula da reivindicação 10, em que o produto de expressão compreende uma sequência de tráfico seleccionada do grupo consistindo numa sequência que trafica para o retículo endoplasmático, uma sequência que trafica para um lisossoma, uma sequência que trafica para um endossoma e uma sequência que trafica para o núcleo.
14. 14. Micropartícula da reivindicação 10, em que o produto de expressão compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de uma porção antigénica de um antigénio de tumor.
15. 15. Micropartícula da reivindicação 14, em que o antigénio de tumor é seleccionado do grupo consistindo nos antigénios listados na Tabela 3.
16. 16. Micropartícula da reivindicação 10, em que o produto de 3 expressão compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de um fraqmento antiqénico de uma proteína naturalmente expressa através de um agente infeccioso seleccionado do grupo consistindo num vírus, uma bactéria e um eucariota parasita.
17. 17. Micropartícula da reivindicação 16, em que o agente infeccioso é seleccionado do grupo consistindo em vírus de papiloma humano, vírus da imunodeficiência humana, vírus herpes simplex, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, espécies de Plasmodium e micobactérias.
18. 18. Micropartícula da reivindicação 16, em que o agente infeccioso é um vírus crónico.
19. 19. Preparação ou micropartícula de qualquer uma das reivindicações 1 a 18, compreendendo adicionalmente um composto estabilizante.
20. 20. Preparação ou micropartícula da reivindicação 19, em que o composto estabilizante é um composto catiónico.
21. 21. Preparação ou micropartícula da reivindicação 19, em que o composto estabilizante é um carbo-hidrato ou um agente de condensação de ADN.
22. 22. Preparação ou micropartícula de qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a matriz polimérica é biodegradável.
23. 23. Preparação ou micropartícula de qualquer uma das 4 reivindicações 1 a 21, em que a matriz polimérica consiste num copolimero sintético biodegradável.
24. 24. Preparação ou microparticula da reivindicação 23, em que o copolimero é ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA).
25. 25. Preparação ou microparticula da reivindicação 24, em que a proporção de ácido láctico para ácido glicólico no copolimero está no intervalo entre 1:2 a 4:1 em peso.
26. 26. Preparação ou microparticula da reivindicação 24, em que a proporção de ácido láctico para ácido glicólico no copolimero está no intervalo entre 1:1 a 2:1 em peso.
27. 27. Preparação ou microparticula da reivindicação 24, em que a proporção de ácido láctico para ácido glicólico no copolimero é 65:35 em peso.
28. 28. Preparação ou microparticula de qualquer uma das reivindicações 1 a 27, em que a matriz polimérica compreende ainda uma molécula alvo.
29. 29. Preparação ou microparticula de qualquer uma das reivindicações 1 a 28, em que a microparticula ou microparticulas possuem um diâmetro inferior a 11 microns.
30. 30. Preparação ou microparticula de qualquer uma das reivindicações 1 a 29, em que a microparticula ou microparticulas são suspensas numa solução aquosa.
31. 31. Preparação ou microparticula de qualquer uma das 5 reivindicações 1 a 30, em que a microparticula ou microparticulas estão na forma de um sólido seco.
32. 32. Preparação ou microparticula da reivindicação 19, em que o composto estabilizante é um lipido.
33. 33. Preparação ou microparticula da reivindicação 32, em que o lipido é um lipido carregado.
34. 34. Preparação ou microparticula da reivindicação 32, em que o lipido é brometo de hexadeciltrimetilamónio.
35. 35. Preparação ou microparticula de qualquer uma das reivindicações 1 a 34, em que, pelo menos, 60% do ADN plasmídico circular é superenrolado.
36. 36. Preparação ou microparticula de qualquer uma das reivindicações 1 a 34, em que, pelo menos, 70% do ADN plasmídico circular é superenrolado.
37. 37. Preparação ou microparticula de qualquer uma das reivindicações 1 a 34, em que pelo menos 80% do ADN plasmídico circular é superenrolado.
38. 38. Preparação ou microparticula como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 para utilização como medicamento ou para administrar ácido nucleico a um animal.
39. 39. Utilização de uma preparação ou microparticula como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37 para a preparação de um medicamento para tratar o cancro ou 6 doenças autoimunes.
40. 40. Processo para preparar micropartículas, compreendendo: (1) proporcionar uma primeira solução compreendendo um polímero dissolvido num solvente orgânico; (2) proporcionar uma segunda solução compreendendo um ácido nucleico dissolvido ou suspenso num solvente polar ou hidrofílico; (3) misturar a primeira e segunda soluções para formar uma primeira emulsão; e (4) misturar a primeira emulsão com uma terceira solução compreendendo um composto orgânico, para formar uma segunda emulsão compreendendo micropartículas de matriz polimérica e ácido nucleico; em que ambos os passos de mistura são efectuados de uma forma que minimiza a fragmentação do ácido nucleico enquanto se produzem micropartículas possuindo um número médio inferior a 100 microns de diâmetro, de modo que, pelo menos, 50% do ácido nucleico nas micropartículas consistem em ADN plasmídico circular superenrolado.
41. 41. Processo da reivindicação 40, em que a segunda solução é preparada por purificação do ácido nucleico e, depois, suspendendo o ácido nucleico purificado no solvente polar ou hidrofílico. 7
42. 42. Processo da reivindicação 40, em que a segunda solução é preparada por precipitação do ácido nucleico com álcool e, depois, a suspendendo o ácido nucleico precipitado no solvente polar ou hidrofilico.
43. 43. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 42, em que a segunda solução compreende ainda uma solução tampão aquosa compreendendo um composto tampão seleccionado do grupo consistindo em ácido etilenodiaminatetracético, tris (hidroximetil)aminometano, e combinações destes.
44. 44. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 43, em que a segunda solução compreende ainda um composto estabilizante.
45. 45. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 44, em que a segunda solução compreende ainda um tensioactivo.
46. 46. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 45, em que a segunda solução compreende ainda um agente de condensação de ADN.
47. 47. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 46, compreendendo ainda ressuspender as microparticulas numa solução excipiente.
48. 48. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 47, em que a segunda emulsão é exposta a uma temperatura elevada.
49. 49. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 48, compreendendo o passo adicional de misturar a segunda 8 emulsão com uma quarta solução compreendendo um composto orgânico.
50. 50. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 49, compreendendo o passo adicional de lavagem de micropartículas com uma solução aquosa, proporcionando assim micropartículas lavadas.
51. 51. Processo da reivindicação 50, compreendendo os passos adicionais de: submeter as micropartículas lavadas a uma temperatura abaixo de 0 °C, para produzir micropartículas congeladas; e liofilizar as micropartículas congeladas para produzir micropartículas liofilizadas.
52. 52. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 51, compreendendo o passo adicional de rastreio das micropartículas para remover essencialmente todas as que possuírem mais de 100 microns de diâmetro.
53. 53. Processo de qualquer uma das reivindicações 40 a 52, compreendendo o passo adicional de rastreio de micropartículas para remover essencialmente todas as que possuírem mais do que 20 microns de diâmetro.
54. 54. Processo da reivindicação 44, em que o composto estabilizante é um lípido.
55. 55. Processo da reivindicação 54, em que o lípido é um lípido carregado. 9
56. 56. Processo da reivindicação 54, em que o lipido é brometo de hexadeciltrimetilamónio. Lisboa, 6 de Julho de 2007 1/9 Aat II

    10 2/9 Nae I Pvu II Pvu Κρη ] Xba I

    3/9 Aot II

    Aat II FIG. IC 4/9

    DIÂMETRO DE PARTÍCULA (pm) LC= 1,083 pm UC= 33,70(100,00%} 5/9

    FIG. 3B 6/9 Peso de SSC

    7/9 DE LISE ESPECIFICA

    Proporção E:T

    FfG. 5

    F1G. 6 1 8/9 DE LISE ESPECIFICA % DE LISE ESPECÍFICA

    VSVMS-VSV FIG. 7

    Proporção E:T 9/9 LISE ESPECÍFICA