JP2003514832A

JP2003514832A - 微粒子製造に関する連続フロー法

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Publication number: JP2003514832A
Application number: JP2001539061A
Authority: JP
Inventors: メアリーリンヘッドレイ; ユン−イースウ; マイケルチョウ
Original assignee: ザイコスインク．
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2003-04-22
Also published as: EP1230338A1; ATE319810T1; DE60026571T2; ES2260070T3; EP1230338B1; WO2001036583A1; DE60026571D1; CA2389613A1; AU783918B2; AU1623401A; EP1230338A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、会合した核酸の構造上の完全性を維持しかつ動物(例えばヒト)宿主への導入に適した純度を有する微粒子を生じるような、核酸包含微粒子の拡張性のある連続フロー製法の発見を基にしている。本明細書に記された連続フロー法で調製された微粒子は、遺伝子治療、アンチセンス療法、ワクチン接種、自己免疫疾患の治療、および免疫応答の特異的または非特異的のいずれかの変調(例えばサイトカイン調節による)のための核酸の送達に使用することができる。微粒子は更に、あらゆる種類の療法において有用なタンパク質またはペプチドをコードしている核酸の送達に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、高分子微粒子の製造法に関する。

【０００２】生分解性合成ポリマーが、薬物担体として使用されている。合成ポリマーは一
般に、薬物担体として使用される場合、生成物放出の再現性の点で天然のポリマ
ーよりも優れていることが認められている(Okadaら、「治療薬の担体系における
重要な総説（Critical Reviewes in Therapeutic Drug Carrier Systems）」、1 2(1) :1、1995)。

【０００３】親水性薬物を包含する疎水性合成ポリマーの微粒子を調製する方法がいくつか
開発されている。これらの方法は、(1)エマルション溶媒蒸発(例えば、水中油型
、油中水型、水中油中水型エマルション蒸発)、(2)相分離、(3)界面重合、およ
び(4)噴霧乾燥(同書)。

【０００４】発明の概要本発明は、会合した核酸の構造上の完全性を維持し、かつ動物(例えば、ヒト)
宿主への導入に適した純度を有する微粒子を生じるような、核酸包含微粒子の、
拡張性のある連続フロー製造に関する方法の発見を基にしている。本明細書に記
された連続フロー法に従い調製された微粒子は、遺伝子治療、アンチセンス療法
、ワクチン接種、自己免疫疾患の治療、および免疫応答の特異的または非特異的
のいずれかの変調(例えば、サイトカイン調節を介して)のための、核酸の送達に
使用することができる。更に加えてこれらの微粒子は、あらゆる種類の療法にお
いて有用なタンパク質またはペプチドをコードしている核酸の送達に使用するこ
とができる。

【０００５】従って本発明はひとつの局面において、核酸包含微粒子の調製のための拡張性
のある連続法を特徴とする。この方法は下記の工程を含む：(a)混合チャンバー
および溶媒除去装置を提供する工程；(b)第一のエマルションを混合チャンバー
に連続的に供給する工程(すなわちここで、第一のエマルションは、(i)高分子材
料および有機溶媒(例えば、ジクロロメタン「DCM」)を含む有機溶液の、(ii)核
酸を含有する第一の水溶液と混合されたものを含んでいる)；(c)界面活性剤を含
有する第二の水溶液を混合チャンバーへ連続的に供給する工程；(d)混合チャン
バー内の第一のエマルションおよび第二の水溶液を連続的に乳化し、核酸、高分
子材料、水、および有機溶媒を含有する第二のエマルションを生成する工程；(e
)第二のエマルションを混合チャンバーから溶媒除去装置へと連続的に移す工程
；並びに、(f)溶媒除去装置内の第二のエマルションから有機溶媒を除去し、核
酸包含微粒子の水性懸濁液を生成する工程。第一のエマルション、第二の水溶液
、またはこれら両方は、更に安定剤も含む。

【０００６】または、工程(b)は、核酸が水溶液中にない場合(例えば核酸が乾燥されている
場合)に実施することができる。この工程を乾燥核酸で実施する利点は、そのよ
うな作業は、高度の封入効率(例えばほぼ100％)につながり得ることである。

【０００７】いくつかの態様において、工程(b)および／または(d)は、温度約2℃〜約8℃で
実施される。

【０００８】第一のエマルションおよび第二の水溶液の混合チャンバー内の平均滞留時間は
、約60秒未満(例えば、60秒未満、45秒未満、30秒未満、20秒未満、15秒未満、1
0秒未満、5秒未満、2秒未満、または1秒未満)であることができる。第二のエマ
ルションの溶媒除去装置内の平均滞留時間は、約3時間未満(例えば、3時間未満
、2時間未満、1時間未満、30分未満、または15分未満)であることができる。本
出願の目的に関して、「平均滞留時間」は、流量対容積の比と定義される。

【０００９】第一の水溶液および第二の水溶液は、例えば本質的に等しい浸透圧、緩衝能、
およびpHであることができる。第二の水溶液は、選択的に、ポリビニルアルコー
ル(PVA)および／またはショ糖のような炭水化物を含むことができる。本明細書
の目的に関して、「本質的に等しい」という用語は、第一の溶液のあるパラメー
タの第二の溶液の同一パラメータとの差が約10％未満であることを意味する。従
って「本質的に等しい浸透圧」は、単位容積当りの粒子数が互いに約10％以内の
差であることを意味し、他方「本質的に等しいpH」は、他方の約10％以内の差の
pH単位を意味し(例えば、pH7.5および8.0は本質的に等しいpHである)、かつ「本
質的に等しい緩衝能」は、緩衝成分の濃度の差が約10％未満であることを意味す
る。本出願の目的に関して、「本質的に等しい」および「本質的に同じ」は互換
的意味の用語である。

【００１０】高分子材料は、例えば、乳酸-グリコール酸共重合体である「PLGA」のような
合成生分解性ポリマーであることができる。PLGAにおける乳酸のグリコール酸に
対する質量比は、例えば約1:2〜約4:1(例えば約1:1)であり、かつPLGAは、例え
ば約6,000〜100,000の範囲の平均分子量を有する。

【００１１】前記安定剤は、単独の化合物または化合物の混合物(例えば、ショ糖のような
炭水化物およびトリス-EDTA(TE)のような緩衝液)であることができる。安定剤は
代わりにまたは追加的に脂質を含有することができる。脂質は、例えばカチオン
性脂質、アニオン性脂質、または双性イオン性脂質であることができ、もしくは
電荷を有さなくとも良い。脂質の例は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド
(CTAB)およびリン脂質、例えばホスファチジルコリンである。具体例は、ポリエ
チレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-DSPE)、
3-[(3-コラミドプロリル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン-スルホン酸(CHAPS)
、タウロコール酸、グリココール酸、カプリン酸、N-ラウリルサルコシン、脂肪
族アシルカルニチンおよびビタミンD3がある。微粒子は、1種または1種より多い
種類の脂質を含有することができ、例えばこれらの脂質は、レシチン脂質調製物
中に存在し、かつ更に1種またはそれ以上の追加の安定剤を含有してもよい。

【００１２】凍結乾燥またはフリーズドライした微粒子は、例えば、約200ppm未満(例えば
、200ppm未満、150ppm未満、100ppm未満、50ppm未満、20ppm未満、または10ppm
未満)の残留有機溶媒レベルを有することができる。または、微粒子は、風乾す
ることができ、かつほぼ同じ残留有機溶媒レベルを有することができる。

【００１３】いくつかの態様において、前述の方法は更に、下記の工程も含む：(g)ダイア
フィルトレーション装置(例えば、中空繊維システムを備える)を提供する工程；
(h)水性懸濁液を水性洗浄液で希釈する工程；(i)希釈した水性懸濁液をダイアフ
ィルトレーション装置へ供給する工程；および、(j)ダイアフィルトレーション
装置内の希釈した水性懸濁液から水性廃液(すなわち、工程(h)の洗浄液の少なく
とも一部を含む)を除去し、核酸包含微粒子を含む精製された水性懸濁液を生成
する工程。この方法は更に、以下の工程の一部または全てを含むことができる：
精製した水性懸濁液を洗浄し、洗浄された微粒子の懸濁液を生成する工程；ダイ
アフィルトレーション装置内の洗浄された微粒子懸濁液または精製された水性懸
濁液の濃縮により、濃縮物を生成する工程；および、濃縮物の1個またはそれ以
上の容器へ移す工程。この方法は更になお、以下の工程を含むことができる：(m
)1個またはそれ以上の容器内の濃縮水性懸濁液を凍結乾燥、フリーズドライ、ま
たは風乾し、凍結乾燥、フリーズドライ、または風乾された微粒子を生成する工
程。工程(h)、(i)および(j)は、選択的に温度約2℃〜約8℃で実行することがで
きる。

【００１４】別の態様において、前述の方法は、以下の工程も含む：(g)水性懸濁液を振動
しているまたは振動していない微細メッシュスクリーンと接触する工程(例えば
、スウェコ（Sweco）装置またはカートリッジフィルター内に備えられた微細メ
ッシュステンレス鋼スクリーン中においてなど)；(h)スクリーンを通して水性懸
濁液を濾過し、第一および第二の各水溶液の少なくとも一部を除去し、かつスク
リーン上に微粒子を残留する工程；(i)微粒子を少なくとも1種の水性洗浄液(例
えば、注射用水(WFI))で洗浄し、洗浄された微粒子を生成する工程；および、(j
)洗浄された微粒子を乾燥し、乾燥された微粒子を生成する工程。この水性洗浄
液は、選択的に例えば約2℃〜約8℃の温度であることができる。この方法は更に
、洗浄された微粒子を賦形剤と接触する工程(例えば、乾燥工程前)および／また
は1個またはそれ以上の容器へ乾燥された微粒子を移す工程も含むことができる
。

【００１５】前記方法において、混合チャンバーは、例えば、ホモジナイザーを備えること
ができる。溶媒除去装置はバイオリアクターであることができる。第二の水溶液
は、混合チャンバーに、流量0.1〜100L/分(例えば、0.1〜20L/分または0.1〜50L
/分)で供給することができる。

【００１６】有機溶媒は、溶媒除去装置において第二のエマルションから、例えば蒸発によ
り、溶媒除去装置内の第二のエマルションの加熱により(例えば、30℃〜55℃）
、抽出法により、溶媒除去装置に部分真空を適用することにより、またはこれら
の方法を組合わせることにより除去される。代わりにまたは追加的に、溶媒除去
装置内の第二のエマルションからの有機溶媒の除去は、溶媒除去装置内の第二の
エマルションの希釈により容易にすることができる。

【００１７】本明細書の目的に関して、「溶媒除去装置」は、微粒子からの、しかし必ずし
もそれらが懸濁されている液体からではなく、溶媒の除去を実現する装置である
。適当な溶媒除去装置の例は、バイオリアクター、タンク(例えば、硬化用タン
ク)、中空繊維のカートリッジ、および微粒子を含みかつそれを通って水が通過
するような装置(例えば、スウェコ装置)である。

【００１８】前述のいずれかの方法において、各工程は、無菌的に実施することができる。

【００１９】前述のいずれかの方法において、微粒子中の核酸の少なくとも約50％(例えば
、50％、60％、70％、8O％、90％、95％、99％、またはそれ以上)は、環状RNA分
子またはスーパーコイル環状DNA分子の形状であることができる。

【００２０】微粒子の平均直径は、例えば、約100μm未満(例えば、100μm未満、50μm未満
、20μm未満、約0.5μm以上約2.5μm以下、またはそれよりも小さい)であること
ができ、ここでは数平均または容量平均で測定されている。

【００２１】生分解性とは、本明細書では、宿主細胞から通常の代謝経路で消失されるよう
な無毒の化合物に時間がたてば分解するポリマーを意味するように使用される。
一般に、生分解性ポリマーは、患者へ注射後1〜3ヶ月内に実質的に代謝され、本
質的には約2年以内に完全に代謝されると考えられる。

【００２２】 DNAまたはポリペプチド配列に関する本質的に同一とは、本明細書では、参照
配列と可能な限り最も合うアライメントを作成し、かつこの差異が本発明の方法
においてDNAまたはポリペプチドの望ましい機能に有害に作用しない場合に、天
然の配列から25％を超えずに異なることを意味すると定義される。タンパク質断
片という用語は、長さが少なくとも残基4個であるが、全タンパク質よりも短い
ようなタンパク質の一部を意味するように使用される。

【００２３】 2個の配列間の相同性の割合(％)の決定は、カーリン（Karlin）らのアルゴリ
ズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:2264-2268、1990)、カーリンらの変法(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA、90:5873-5877、1993)を用いて実行される。このよ
うなアルゴリズムは、アルシュール（Altschul）らのNBLASTおよびXBLASTプログ
ラム(J. Mol. Biol.、215:403-410、1990)に組込まれている。BLASTヌクレオチ
ド検索を、NBLASTプログラムにより、スコア=100、ワードレングス=12で実行し
、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索を
、XBLASTプログラムにより、スコア=50、ワードレングス=3で実行し、本発明の
タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得る。比較のためにギャップのあるアラ
イメントを得るためには、ギャップド（Gapped） BLASTが、アルシュールらの論
文(Nucleic Acids Res.、25:3389-3402、1997)に記されたように使用される。BL
ASTおよびギャップド BLASTプログラムを使用する場合、各プログラム(例えば、
XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトのパラメータが使用されるべきである。URL(h
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov)を参照のこと。

【００２４】核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドは、ターゲティング配列
に連結することができる。ターゲティング配列という用語は、輸送配列と互換的
に使用され、かつこれは、特定の細胞区画、例えば核、小胞体、ゴルジ装置、細
胞内小胞、リソソーム、またはエンドソームに輸送されるように融合されるポリ
ペプチドを生じるアミノ酸配列を意味する。

【００２５】発現産物がMHCクラスIまたはII分子と結合できるような長さおよび配列を有す
るペプチドを含むような態様において、発現産物は典型的には、免疫原性または
免疫抑制性である。この発現産物は、Ｔ細胞によって認識される天然のペプチド
またはタンパク質の配列と、同じＴ細胞により依然認識され得るという条件で、
最大25％まで配列同一性が異なるアミノ酸配列を有することができる。このよう
な変種ペプチドは、天然の対応物として正確に機能するか、そうではなくＴ細胞
のサイトカインプロフィールを変更することにより(すなわち「変更されたペプ
チドリガンド」)作用することができる。発現産物と天然のペプチドの間の差異
により、例えば、病原性ウイルス株との交差反応性を増大するよう、望ましくな
い機能のタンパク質を生じるアミノ酸を除去もしくは変更するよう、またはHLA
アロタイプ結合を増大するように遺伝子操作することができる。

【００２６】発現産物の例は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、プロテオリピドタンパク
質(PLP)、不変鎖、GAD65、膵島細胞抗原、デスモグレイン、α-クリスタリンま
たはβ-クリスタリンのMHCクラスII結合断片の配列と少なくとも50％同じアミノ
酸配列を含む。表１は、自己免疫疾患に関連していると考えられる多くのタンパ
ク質の一覧である。例えばこれらの断片は、配列番号：1-46のいずれかひとつと
本質的に同じであり、例えばMBP残基80-102(配列番号：1)、PLP残基170-191(配
列番号：2)、または不変鎖残基80-124(配列番号：3)がある。その他の断片の例
は表２に列記している。

【００２７】または、発現産物は、表３に列記された腫瘍抗原のいずれかの抗原性部分の配
列と本質的に同じアミノ酸配列を含むことができ、例えばヒトパピローマウイル
スE1、E2、E6およびE7遺伝子、Her2/neu遺伝子、前立腺特異抗原遺伝子、Ｔ細胞
認識性メラノーマ抗原(MART)遺伝子、またはメラノーマ抗原遺伝子(MAGE)がある
。同じく発現産物は、交差反応性を増大するように遺伝子操作することができる
。

【００２８】

【表１】自己抗原参照文献： a) 「HLAおよび自己免疫疾患（HLA and Autoimmune Disease)」、R. ハード（H
eard)、123〜151頁、HLA & Disease、Academic Press、ニューヨーク、1994（R.
Lechler編集） b) Cell、80：7〜10(1995) c) Cell、67：869〜877(1991) d) JEM、181：1835〜1845(1995)

【００２９】

【表２】クラスII関連ペプチド

【００３０】

【表３】腫瘍抗原

【００３１】

【表４】クラスI関連腫瘍および病原ペプチド

【００３２】更に別の場合、発現産物は、例えば細胞に慢性感染するようなウイルス、例と
してヒトパピローマウイルス(HPV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、単純ヘルペス
ウイルス(HSV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、またはC型肝炎ウイルス(HCV)のような
、ウイルス；マイコバクテリアまたはヘリコバクターピロリ（Helicobacter py
lori）のような、細菌；カンジダ（Candida）、アスペリギルス（Aspergillus）
、クリプトコッカス（Cryptococcus）、またはヒストプラズモシス（Histoplasm
osis）種のような、真菌、もしくはプラズモディウム（Plasmodium）種のような
他の真核生物により天然に発現されるタンパク質の抗原性断片の配列と本質的に
同じアミノ酸配列を含む。このようなクラスI結合断片に加え腫瘍抗原断片の代
表的一覧は、表4に示している。MHC結合断片(クラスIまたはクラスII)は、米国
特許出願第09/398,534号および米国特許出願第60/154,665号に開示されている種
類の比較的大きい多面体化合物の一部としてコードすることができる。

【００３３】本明細書に記された微粒子中の核酸は、微粒子全体を通じて、または微粒子内
の少数の独立した領域中のいずれかに分布することができる。または、核酸は、
中空コア微粒子のコア内に存在することができる。好ましくはこの微粒子は、細
胞(例えば、細菌細胞)、または細胞の天然のゲノムを含まない。

【００３４】前記微粒子は更に安定剤も含むことができる。安定剤は、微粒子の製造および
／または貯蔵期間のいずれかの時点で、核酸を保護する(例えば、そのスーパー
コイルを保つかまたはそれが分解されるのを防ぐ)ように作用する1個または複数
の化合物である。安定剤の例は、デキストロース、ショ糖、およびトレハロース
のような炭水化物；ポリビニルアルコール；シクロデキストリン；デキストラン
；デキストラン硫酸；カチオン性ペプチドのようなカチオン性化合物；トリス、
PBS、およびMOPSのような緩衝剤；EDTAおよびEGTAのようなキレート剤；DNase阻
害剤；プルロニック、例えばプロロニック（Pluronic）F-68(シグマアルドリッ
チ社（Sigma-Aldrich Co.）、セントルイス、MO)；および、脂質、例えばCHAPS
、PEG-DSPB、タウロコール酸、グリココール酸、脂肪族アシルカルニチン、N-ラ
ウリルサルコシン、カプリン酸、ビタミンD3、ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムブロミド、QS21、精製サポニン、またはポリミキシンBがある。

【００３５】安定剤は同じく、炭水化物、カチオン性化合物、プルロニック、脂質(例えば
、膜不安定化脂質)、タンパク質、塩、ペプチド、界面活性剤、および小分子な
どの変更因子を放出することもできる。この安定剤は、DNAがポリマーマトリッ
クスから放出された後も、DNAと会合され続け得る。更に「安定剤」という用語
は単数形で使用されるが、これは2種またはそれ以上の化合物の混合物(例えば、
炭水化物および緩衝剤、または炭水化物、緩衝剤および脂質)も意味すると理解
されるべきである。

【００３６】中でも本発明の利点は、研究、臨床、および他の商業的用途に必要量の微粒子
を製造する経済的で無菌の拡張性のある手順を提供することである。これらの手
順を用いて製造された微粒子は、安定で、活性があり、効能があり、構造的に無
傷の核酸、例えばスーパーコイルDNAを含む。この方法は同じく、微粒子中の核
酸の効率的封入も提供し、かつ微粒子を効率的に回収することができる。

【００３７】別の本発明の利点は、微粒子の調製に使用された有機溶媒のような不純物を、
微粒子が実質的に含まないようにすることができることである。従ってこの微粒
子は、経口、経直腸、経膣、点鼻、動脈内、静脈内、経肺、筋肉内、皮内、経粘
膜、クモ膜下、腹腔内、経皮、表皮下、または皮下の送達に適している。

【００３８】更に別の本発明の利点は、微粒子の拡張性がありかつ再現性のある大規模製造
に伴う、微粒子サイズについてもたらされる制御である。微粒子サイズは、多く
の理由により重要であり、これは特定標的部位への送達(例えば、吸入により肺
へ)、食細胞活動細胞による静脈内取り込み、並びに貯蔵および処置時の薬学的
懸濁液の安定性を含む。更に、本発明の微粒子は、凍結乾燥するか、スウェコ装
置(エマーソンエレクトリック社（Emerson Electric Co.）、フローレンス、KY
)を用いて乾燥するか、または凍結溶液として貯蔵することができる。微粒子の
乾燥は、米国特許第6,080,429号に開示されたように実行することができ、これ
は本明細書に参照として組入れられている。この方法で調製された微粒子は、広
範な分散剤中に容易に再懸濁される。

【００３９】これらの微粒子は、動物(例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムス
ター、またはフェレットのような哺乳類)に投与することができる。これらの微
粒子は、水溶液中に懸濁されるか、または任意の他の適当な製剤中で提供され、
かつ動物へ、例えば、経口、経膣、経直腸、点鼻、口内、もしくは吸入により送
達するか、または注射または移植(例えば、外科的に)することができる。これら
は選択的に、微粒子の内側または外側であることができるような、サイトカイン
またはインターフェロンのようなタンパク質、抗原、脂質、アジュバント、また
は賦形剤と一緒に送達することができる。

【００４０】特に定義しない限り、本明細書において使用された技術用語および科学用語は
全て、本発明が属する分野の一般的業者に通常理解されるものと同じ意味を有す
る。本明細書に記されたものに類似または同等の方法および材料を、本発明の実
践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料は以下
に記したものである。本明細書において言及された出版物、特許出願、特許、お
よび他の参考文献は全て、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
矛盾する場合は、定義を含み、本出願が優先すると考えられる。加えて材料、方
法、および実施例は、単に例証のためであり、限定することを意図するものでは
ない。

【００４１】本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、および特許請求の範囲か
ら明らかであると考えられる。

【００４２】好ましい態様の説明本発明の微粒子は、核酸の完全性を維持するように製剤される。プラスミドDN
Aについて、これは、スーパーコイル化されたプラスミド分子の割合を最大化し
、その結果スーパーコイル化されない(すなわち、ニックつきまたは直線状)プラ
スミドよりもより安定化していることを意味する(Middaughら、J. Pharm. Sci.
、87:130、1998)。

【００４３】核酸は、RNAもしくはDNA、または既知のDNA誘導体(例えば、アンチセンス用途
において典型的に使用されるホスホロチオラート誘導体など)であることができ
る。一部の態様において、核酸の少なくとも50％(および好ましくは少なくとも7
0％または80％さえも)が、閉環構造である。核酸は、直線状または環状分子であ
ることができ、従って例えばプラスミドであるか、もしくはウイルスゲノム、ま
たはウイルスゲノムの一部を含み得る。環状および2本鎖である場合、これはニ
ックを生じ、すなわち開環状であることができるか、もしくはスーパーコイル化
することができる。一部の態様において、核酸はプラスミド分子であり、その少
なくとも25％(および好ましくは少なくとも35％、40％、50％、60％、70％、80
％、または90％以上でさえも)がスーパーコイル化されている。

【００４４】本発明は、特定の核酸型を有する微粒子の製造に限定されるものではない。あ
らゆる種類の核酸を使用することができる。例として、アンチセンスRNAまたは
リボザイムの発現の鋳型として使用されるDNA、有用なタンパク質またはペプチ
ドをコードしている核酸、並びにアンチセンスDNAまたはRNA、ポリI:C、BCG DNA
、オリゴヌクレオチド、および免疫変調能を有するDNA(例えば、CpGモチーフ)の
ようなそれ自身所望の作用を生じる核酸を含む。

【００４５】核酸は、体液性または細胞性免疫応答を変調、例えば誘起、増強、変更または
抑制するような、ペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。細胞
性免疫応答の変調が望ましい場合、コードされた産物は、例えば、MHCクラスIま
たはMHCクラスII結合ペプチドまたはポリペプチドであるか、もしくはこれを含
むことができる。免疫応答を誘起するタンパク質またはペプチドをコードしてい
る核酸の例は、国際公開公報第95/23738号；国際公開公報第97/17063号；米国特
許第5,880,103号；ジョーンズ（Jones）ら、Vaccine、15:814、1997；チェン（C
hen）ら、J. Virology、72:5757、1998；マソーウィッツ（Mathowitz）ら、Natu
re、386:41、1997；ジョン（Jong）ら、J. Controlled Release、47:123、1997
；並びに、ヘドリー（Hedley）ら、Nature Med.、4:365 1998；米国特許出願第0
9/398,534号および米国特許出願第60/154,665号に記載されている。

【００４６】核酸は、代わりに非特異的免疫応答を誘起することができる。このような核酸
の一例は、インターフェロン応答を誘導するような、ポリI:C(すなわち、ポリイ
ノシン：ポリシトシン2本鎖核酸)である(例えば欧州特許出願第A-0248 531号参
照)。別の例は、免疫刺激性CpGオリゴヌクレオチドであり、これはタンパク質抗
原に対する、Th1応答および細胞傷害性Ｔ細胞応答のアジュバントとして作用す
る(Sparwasserら、Eur. J. Immunol.、28:2045、1998)。別の例は、免疫細胞(例
えばＴ細胞)を調節するポリペプチドをコードしている核酸により提供される。

【００４７】核酸は、遺伝子発現を調節するオリゴヌクレオチド、例えば、ルイス（Lewis
）らの論文(J. Controlled Release、37:173、1995)に記されたようなアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを含むこともできる。

【００４８】前述の核酸の、水溶液中への溶解の前のアルコール沈殿は、封入効率を高める
。エタノールによる沈殿は組込まれたDNAの最大147％の増加を、およびイソプロ
パノールによる沈殿は最大170％の増加を生じることができる(例えば、国際特許
出願番号PCT US98/01499参照)。

【００４９】水溶液の性質は、スーパーコイル化または封入されたDNAの収量に影響を及ぼ
し得る。例えば、トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン(トリス)、エチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)、またはトリスおよびEDTAの組合せ(TE)のいずれかを含有
する緩衝液の添加は、ゲル電気泳動による解析によると、スーパーコイル化され
たプラスミドDNAの安定化を生じる。更に、比較的高いpH(例えば、8.0〜9.9)も
安定化作用を有する。デキストラン硫酸、デキストロース、デキストラン、CTAB
、ポリビニルアルコール、トレハロース、脂質、シクロデキストリン、およびシ
ョ糖などのある種の化合物は、単独でまたはTE緩衝液との組合わせのいずれかで
、DNAの安定性およびスーパーコイル化の程度を増大することができる。脂質お
よび炭水化物のような安定剤も、微粒子に封入されたDNAの全体量を増加するこ
とができる。安定剤の組合せを用いて、封入された、スーパーコイル化されたDN
Aの量を増大することもできる。帯電した脂質(例えば、CTAB)、カチオン性ペプ
チド、またはデンドリマー(J. Controlled Release、39:357、1996)のような安
定剤は、核酸(例えば、DNA)を濃縮または沈殿することができる。更に安定剤は
、封入処理手順時に生成された粒子の物理的性質に影響を及ぼすことができる。
例えば、封入処理手順時の糖質、脂質、または界面活性剤の存在は、多孔質粒子
または多孔質の内側もしくは外側構造を有する中空の粒子を作成することができ
、数日または数ヶ月にわたる緩徐に制御された放出よりもむしろ、粒子からの薬
物のより迅速な流出をもたらす。これらの安定剤は、微粒子の調製時のいずれか
の時点(例えば、封入または凍結乾燥時、もしくは両方)、またはポリマーのイン
ビボ分解時に、作用することができる。

【００５０】本発明の微粒子は、一般に2種の方法のひとつで製剤される：(1)患者の食細胞
への送達を最大にするか、または(2)患者の組織内沈着を形成し、そこから核酸
が徐々に時間をかけて放出され；沈着からの放出時に、核酸が隣接細胞(抗原提
示細胞またはAPCを含む)により取り込まれる。両方の場合において、DNAの完全
性の維持は最優先である。プラスミドDNAについて、これは、スーパーコイル化
され、かつスーパーコイル化されない(すなわちニック付きまたは直線状)プラス
ミドよりもより効率的なトランスフェクションおよび転写が可能であるようなプ
ラスミド分子の割合を最大化することを意味する。スーパーコイル化されたプラ
スミド分子の割合の最大化は、細胞または微粒子内のDNAの安定性を増大するこ
とに加え、核酸包含微粒子の貯蔵寿命も増大する。

【００５１】核酸の完全性を保護する手段は、核酸が微粒子生成の過程において必ず曝され
るような剪断力を最小化すること、調製時の超音波処理、ホモジナイゼーション
、微細流動化、もしくはその他の混合時間を制限すること、凍結乾燥、乾燥、ま
たは硬化を制御すること、微粒子調製時に緩衝剤または他の安定剤を添加するこ
と、並びに核酸が高温に曝される時間を制限すること(例えば、約39℃より高い
温度に、ほぼ1時間未満曝されるよう制限する)を含む。例えば、剪断の最小化が
更に望ましい微粒子サイズを許容できる程高い封入効率(すなわち、核酸の25％
以上の封入効率)を生じるような、ホモジナイゼーションの時間および強度の間
の釣り合いをとることが望ましい。これらの技術は以下に考察している。

【００５２】本発明の微粒子は、例えば、癌、感染症、表1に列記された自己免疫疾患のい
ずれか、または特定の定義された核酸により治療可能なその他の病態のいずれか
の治療のための医薬品の製造において使用することができる。

【００５３】マクロファージ、樹状細胞、および他のAPCによる微粒子の食作用は、これら
の細胞への核酸導入の効果的手段である。これらの細胞による食作用は、粒子サ
イズを約20μmより小さい、好ましくは約11μmより小さい、および最も好ましく
は約5μmより小さいサイズに維持することにより増大することができる。微粒子
において使用される種類のポリマーは、同じく食細胞による取り込み効率に影響
を及ぼすことができ、これも以下に考察している。

【００５４】前記微粒子は、細網内皮系システム(RES)の食細胞による取り込みが望ましい
場合には、血流へ直接(すなわち、静脈内または動脈内への注射もしくは注入に
より)送達することができる。または微粒子は、経口的に(例えば、パイエル板ま
たは腸間膜リンパ節へ、経粘膜的、点鼻的、口内、経膣、経直腸または経病巣的
に)送達することができる。微粒子は同じく、排出中のリンパ節の食細胞による
取り込みを促進するために、皮下注射により送達される。または微粒子は、皮内
(すなわち、皮膚のAPC、例えば樹状細胞およびランゲルハンス細胞へ)または筋
肉内に導入することができる。最後に、微粒子は、(例えば、散剤化された微粒
子、または微粒子を含有するネブライザー用もしくはエアゾール用の溶液または
懸濁液の吸入により)肺へ導入することができ、ここで該粒子は肺胞マクロファ
ージにより捕獲される。

【００５５】一旦食細胞が微粒子を食細胞活動すると、核酸は、細胞内部へと放出される。
放出時に、その意図された機能を発揮することができる：例えば、正常細胞の転
写/翻訳機構による発現(発現ベクターについて)、または細胞プロセッシングの
変更(アンチセンスまたはリボザイム分子、もしくはCpGまたはポリ-I:C含有核酸
)。

【００５６】これらの微粒子はマクロファージおよび他の種類のプロフェッショナル抗原提
示細胞および食細胞に受動的に標的化されているので、これらは免疫機能を変調
する手段を表している。マクロファージおよび樹状細胞は、MHCクラスIおよびク
ラスII分子の両方を発現しているプロフェッショナル抗原提示細胞としての役割
を果たす。加えて、DNAの分裂促進作用を用いて、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびNK細
胞；マクロファージ；および他の細胞により媒介された非特異的免疫応答を刺激
することができる。

【００５７】 MHCクラスIまたはクラスII分子と結合する外来抗原をコードしている発現ベク
ターの微粒子を介した送達は、宿主に抗原に対するＴ細胞応答を誘発し、これに
より宿主に免疫をもたらす。

【００５８】発現ベクターが自己免疫に関連したMHCクラスII分子と結合するブロッキング
ペプチド(例えば国際公開公報第94/O4171号参照)をコードしている場合には、ク
ラスI分子による自己免疫疾患に関連した自己ペプチドの提示が妨げられ、かつ
自己免疫疾患の症状が緩和される。

【００５９】別の例において、自己免疫を誘導するペプチドと同じまたはほとんど同じであ
るMHC結合ペプチドは、Ｔ細胞を寛容(tolerizing）またはアネルギー（anergizi
ng)により、Ｔ細胞機能に影響を及ぼすことができる。またはこのペプチドは、M
HC/ペプチド複合体の認識後のサイトカイン分泌プロフィールを変更することに
より、Ｔ細胞機能を変調するようにデザインされる。Ｔ細胞により認識されたペ
プチドは、Ｂ細胞に特定のクラスの抗体産生、炎症反応の誘導、および更に宿主
Ｔ細胞応答の促進を生じるようなサイトカインの分泌を誘導することができる。

【００６０】例えばペプチドまたはタンパク質に対する特異的抗体反応のような、免疫応答
の誘導は、いくつかの要因を必要としている。この多因子的性質は、本発明の微
粒子を用い、複数の戦線(front)に対し免疫関連細胞を操る試みに対する推進力
を提供するものである。例えば、各微粒子内にDNAと、ペプチド、ポリペプチド
、および／またはアジュバントの両方を保持する微粒子を調製することができ；
または、各々がこれらの物質の一種のみを保持するような微粒子の個別のバッチ
を調製し、その後混合することができる。これらの二元機能性微粒子は、以下に
考察している。

【００６１】CTL応答クラスI分子は、抗原性ペプチドを未熟Ｔ細胞に提示する。Ｔ細胞を完全に活
性化するために、抗原性ペプチド以外の要因が必要である。インターロイキン-2
(IL-2)、IL-12、およびγインタフェロン(γ-IFN)のような非特異的タンパク質
は、CTL応答を促進し、かつCTLエピトープを含むポリペプチドをコードしている
DNAと共に提供され得る。またはヘルパーＴ(Th)の抗原決定基を生じるタンパク
質は、1個または複数のCTLエピトープをコードしているDNAと共に含まれる。Ｔ
ヘルパーエピトープは、Ｔヘルパー細胞からのサイトカインの分泌を促進し、か
つ発生期のＴ細胞のCTLへの分化において役割を果たしている。

【００６２】または、リンパ球およびマクロファージの特定領域への移動、分化または増殖
を促進するようなペプチド、タンパク質、核酸、またはアジュバントを、適当な
DNA分子と共に、微粒子中に含むことができる。このDNAの取り込みは、タンパク
質の放出は微粒子分解時に食細胞およびＴ細胞の流入を引き起すので、結果的に
増強される。マクロファージは、残留する微粒子を食作用し、およびAPCとして
作用し、かつＴ細胞はエフェクター細胞となる。

【００６３】抗体反応ある種の感染性物質の宿主からの消去は、抗体反応およびCTL応答の両方を必
要とする場合がある。例えば、インフルエンザウイルスが宿主に侵入した場合、
抗体はこれが宿主細胞を感染することを防ぐことが多い。しかし、細胞が感染さ
れた場合には、その後CTL応答が、感染された細胞を消去しかつ宿主内における
ウイルスの連続した産生を防止するために必要である。

【００６４】一般に、抗体反応は、構造上の抗原決定基に対して向けられ、その結果このよ
うな決定基を含むタンパク質またはタンパク質断片の存在が必要である。対照的
に、Ｔ細胞エピトープは直線状の抗原決定基であり、典型的には長さがわずかに
7〜25残基である。従ってCTL応答および抗体反応の両方の誘導が必要な場合は、
微粒子は、抗原性タンパク質およびＴ細胞エピトープをコードしているDNAの両
方を含むことができる。細胞外の微粒子からのタンパク質の緩徐な放出は、Ｂ細
胞認識につながり、かつ引き続き抗体分泌をもたらす一方で、微粒子の食作用は
、APCに、(1)関心対象のDNAを発現し、これによりＴ細胞応答を生じること、並
びに(2)微粒子から放出されたタンパク質を消化し、これによりクラスIまたはII
分子により順次提示されるペプチドを生成することを生じる。クラスIまたはII
分子による提示は、クラスII/ペプチド複合体により活性化されたTヘルパー細胞
は非特異的サイトカインを分泌するので、抗体反応およびCTL応答の両方を促進
する。

【００６５】移植用微粒子本発明は、第二の微粒子製剤が、細胞により直接取り込まれることはなく、む
しろ微粒子からの放出時にのみ細胞により取り込まれる核酸の緩徐な放出用の貯
蔵容器として主に使用されることを意図している。放出は、例えば分解、侵蝕、
または核酸により引き起されると考えられる。核酸は、例えば緩徐な放出工程時
に核酸の完全性を維持するために、安定剤と複合することができる。その結果、
この態様の高分子粒子は、食作用の程度を最小化するのに十分な程に大きい(す
なわち、5μmより大きいおよび好ましくは20μmよりも大きい)はずである。この
ような粒子は、比較的小さい粒子の製造について説明された方法ではあるが、激
しくない混合を行う方法によっても作成される。いわゆる、より遅いホモジナイ
ゼーション速度を用いて、直径が5μmではなくほぼ100μmである粒子を得ること
ができる。混合時間、第一のエマルションの粘度、および第一の溶液中のポリマ
ー濃度は同じく、粒子寸法に影響するように変更することができる。

【００６６】比較的大きい微粒子は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、または腹腔内注射によ
り；吸入(経肺的)；経口的、例えば錠剤の形状で；点鼻または移植により送達さ
れるために、懸濁剤、散剤、または移植可能な固形物として製剤することができ
る。これらの粒子は、比較的長期にわたる緩徐な放出が望ましいような任意の発
現ベクターまたは他の核酸の送達のために有用であり；例えば、アンチセンス分
子、遺伝子補充治療、サイトカインベース、抗原ベースまたはホルモンベースの
治療薬、または免疫抑制薬を送達する手段である。分解速度、およびその結果と
しての放出速度は、高分子製剤により変動する。このパラメータは、免疫機能を
制御するために使用することができる。例えば、IL-4またはIL-10の送達につい
ては比較的緩徐な放出を、およびIL-2またはγ-IFNの送達のためには比較的迅速
な放出を欲することができる。

【００６７】ポリマー粒子の組成高分子材料は、市販の供給業者から入手されるか、または公知の方法により調
製することができる。例えば、乳酸およびグリコール酸のポリマーは、米国特許
第4,293,539号に記載されたように生成するか、もしくはアルドリッチケミカル
ズ（Aldrich Chemicals）、バーミンガムポリマーズ（Birmingham Polymers）
、またはベーリンガーインゲルハイム（Boehringer Ingelheim）などの市販の
供給業者から購入することができる。適当なポリマーのひとつは、乳酸-グリコ
ール酸共重合体)(PLGA)であり、乳酸/グリコール酸質量比が約1:2〜約4:1(例え
ば、50:50、65:35、または75:25)のものである。

【００６８】代わりにまたは追加的に、ポリマーマトリックスは、ポリラクチド、ポリグリ
コリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリホスファ
ゼン、ポリペプチド、ポリエステル、またはアルギナート、キトサン、およびゼ
ラチンのような天然のポリマーの1種またはそれ以上のいずれかを含有すること
ができる。

【００６９】本発明の製剤において有用な好ましい制御された放出物質は、ポリ無水物、乳
酸のグリコール酸に対する比が4:1を超えないような乳酸およびグリコール酸の
共重合体、および例えば1％無水マレイン酸などの無水物のような分解増強触媒
を含有するポリオルトエステルである。ポリ乳酸は、インビボで分解されるのに
少なくとも1年を要するので、このポリマーはそれ自身単独で、延長された分解
が望ましいような状況において使用されるはずである。

【００７０】場合によっては、これらのポリマーマトリックスは更に、所定の細胞型または
組織型に対する微粒子の特異性を増大するために、リガンド、受容体、または抗
体のようなターゲティング分子も含む。

【００７１】微粒子の調製：微粒子は、核酸を含有する水溶液および有機溶媒(例えば、ジクロロメタン、
フェノール、クロロホルム、または酢酸エチル)に溶解した高分子材料を含有す
る溶液からの第一のエマルションの製造(すなわち、バッチ法または連続フロー
法により)、その後の第一のエマルションと、界面活性剤を含有する第二の水溶
液(例えば、ポリ(ビニルアルコール)、PVA；オレイン酸；トゥィーン（TWEEN）(
登録商標)；スパン（SPAN）(登録商標)；ポリ(ビニルピロリドン)、PVP；他の界
面反応性物質の溶液)を一緒にし第二のエマルションを生成し、これから微粒子
が単離されることにより調製される。次に微粒子は精製され、かつ選択的に、例
えばダイアフィルトレーション、またはスウェコ(商標)装置(エマーソンエレク
トリック社、フローレンス、KY)の使用により、濃縮される。

【００７２】ダイアフィルトレーションは、いずれも同じ懸濁液中に存在するような、粒子
および比較的高分子量の溶質が、比較的低分子量の溶質から分離される方法であ
る。この懸濁液は、溶媒(例えば水)で希釈され、かつ中空繊維膜を通って流れ、
比較的低分子量の溶質が残留分から洗浄除去される。本方法において、ダイアフ
ィルトレーションを使用し、過剰な界面活性剤(例えばPVA)、安定剤(例えばショ
糖)、および緩衝液(例えばTE)を微粒子から除去することができる。

【００７３】スウェコ装置、例えばファーマセップフィルタードライヤー（PharmASep Fil
ter-Dryer）(商標)(エマーソンエレクトリック社、フローレンス、KY)を、ダイ
アフィルトレーション代わりに使用することができる。微粒子の液体スラリーは
、精製のためにスウェコ装置にポンプ注入される。この液体が該装置を通過する
間に、固形微粒子は、振動している微細メッシュスクリーンにより捕獲される。
微粒子は注射用水で洗浄され、可溶性夾雑物(例えば、PVA、ショ糖)が除去され
る。選択的に、微粒子は更にこの装置内で賦形剤で被覆することができる(すな
わち、賦形剤溶液による洗浄により)。賦形剤の例はPEG、カルボキシメチルセル
ロース、ソルビトール、トゥィーンおよびマンニトールである。その後滅菌した
空気または窒素の流れを該装置中を通過させ、微粒子を乾燥する。粉末の形状の
乾燥した微粒子を、出口から滅菌した貯蔵容器へと排出する。その後粉末らせん
錐を用いて、粉末は測定された速度でチューブに、および個々のバイアルへ運ば
れる。または微粒子は、溶媒を除去するために洗浄され、振動しているまたは振
動していないステンレス鋼微細メッシュスクリーン装置を用いて濃縮され、次に
乾燥される(例えば凍結乾燥機において)。

【００７４】本発明の方法において、第一のエマルションおよび界面活性剤含有溶液は、混
合チャンバーへとポンプ注入され、これは例えば微細流動化装置(例えば、マイ
クロフルイディクス（Microfluidics）、ニュートン、MAから入手できるもの)、
フレンチ（French）プレス(例えば、マイクロフルイディクスまたはガウリン-AP
V（Gaulin-APV）から入手できるもの)、機械的ホモジナイザー(例えば、シルバ
ーサン（Silverson）、ウィルティス（VirTis）、またはイカワークス（Ika Wo
rks）から入手できるもの)、または超音波乳化装置(例えば、ブランソンウルト
ラソニック社（Branson Ultrasonics Corporation）またはウィルティスから入
手できるもの)を含む。混合チャンバー内において、第一のエマルションおよび
界面活性剤含有溶液は配合され、第二のエマルションを生成する。この界面活性
剤含有溶液は、選択的に安定剤、例えば核酸放出変調剤、緩衝液、炭水化物また
は脂質などを含有することができる。第二の水溶液の浸透圧、pH、および緩衝能
が、第一の水溶液のものと本質的に同じであることは、核酸の第二のエマルショ
ンの水相への喪失を最小化するために重要である。

【００７５】第一のエマルションおよび界面活性剤含有溶液は混合チャンバーへポンプ注入
されると共に、第二のエマルションは混合チャンバーから溶媒除去装置へと連続
してポンプ排出することができる。溶媒除去装置は、滅菌することができる任意
の容器(例えば密閉容器)であることができる。適当な溶媒除去装置の例は、医薬
用加圧容器(例えば、イーグルステンレスコンテナー（Eagle Stainless Conta
iner）、アロイプロダクツ社（Alloy Products Corporation）、DCI社（DCI In
c.）、ウォーカーステンレスイクイップメント（Walker Stainless Equipment
）から入手できるもの)、バイオリアクター/発酵槽(例えば、アプリコン（Appli
kon）、ニューブランスウィック（New Brunswick）、ケマップ（Chemap）、B.
ブラウン（Braun）、およびLHから入手できるもの)、ならびに中空繊維膜装置が
ある。溶媒除去装置において、有機溶媒は除去される(例えば、加熱(例えば30〜
55℃)または減圧の適用により；抽出により；イソプロパノールまたはエタノー
ルのようなアルコールの添加により；水による希釈により；または中空繊維膜の
使用により)。

【００７６】この有機溶媒の除去の間に、ポリマーマトリックスまたはシェル中に封入され
た核酸を包含する微粒子は、該エマルションから沈殿し、懸濁液を生成する。有
機溶媒の除去後、微粒子含有懸濁液を、溶媒除去装置から濾過または洗浄貯蔵容
器へと連続して除去することができる。貯蔵容器の内容物は、水性洗浄液(例え
ば水)で希釈され、かつ濾過装置(例えば、ダイアフィルトレーション装置)へと
ポンプ注入される。水溶液はこれらの装置から除去され、後に微粒子が残留する
。除去された溶液は、例えば、微粒子に組み込まれない過剰な界面活性剤を含ん
でいる。微粒子の懸濁液は、洗浄液がポンプ注入されるよりもより高速で濾過装
置から水溶液を除去することにより、または洗浄液の流入を全て停止することに
より、濃縮することができる。最終の濃縮された懸濁液は、賦形剤、例えばマン
ニトール、PEG、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、およびトゥィー
ンなどを含むことができる。次に懸濁液は、単回投与用のバイアルに小分けする
ことができる。単回投与用のバイアルに入った濾過した微粒子懸濁液の凍結およ
び凍結乾燥は、貯蔵が容易な乾燥調製物を生じる。または、該粒子を含有する溶
液は、洗浄および乾燥のために、スウェコ装置のような微細メッシュ篩上へポン
プ注入することができる。この篩は、水溶液は通過させるが、粒子は残留させる
。スウェコユニット上で洗浄された粒子は、該粒子上を滅菌空気が通過すること
により乾燥される。これらの粒子は、スウェコユニットから保持容器へと移され
る。ここから、該粒子は、所定量の粒子を各バイアルに沈積させる回転スクリュ
ーにより、単回投与用のバイアルに小分けすることができる。次にこれらのバイ
アルは、貯蔵のために封止される。更に粒子は、洗浄のためにスウェコ装置に残
留することもでき、その後凍結乾燥機において乾燥され、その後単回投与用のバ
イアルに小分けされる。

【００７７】粒子が動物における使用に適するように、ごく少量の残留有機溶媒を伴う微粒
子を生成することは重要である。乾燥または凍結乾燥した粒子内の有機溶媒残留
量は、好ましくは200ppmより低く、かつより好ましくは50ppmより低い。

【００７８】粒子が動物(例えばヒト)の疾患の治療に使用される場合は、粒子が無菌の様式
(例えば、米国薬局法USP24<71>に定義されたように)で調製されることも重要で
ある。本明細書に記された方法は、無菌性が全体を通じて維持され、かつ得られ
る生成物が本質的に生物学的夾雑物を含有しないように設計されている。機械部
品の滅菌および溶液の無菌的濾過の技術は、医薬品製造分野の業者には公知であ
り(例えば、生物製剤製造業者の医薬品および医薬部外品の製造管理および品質
管理規則(「GMP」))、かつこれは本方法において使用される。

【００７９】例えば移植に使用されるもののような比較的大きい粒子は、第二のエマルショ
ンを製造する際に余り激しくない乳化条件を用いることにより、ポリマー濃度を
変更することにより、エマルションの粘度を変更することにより、第一のエマル
ションの粒子サイズを変更することにより(例えば、比較的大きい粒子は、微細
流動化装置内の第一のエマルションの製造時に使用される圧力を低下することに
より製造することができる)、または例えばシルバーサンホモジナイザーを5000r
pmに設定し約12秒間使用しホモジナイズすることにより得ることができる。

【００８０】洗浄された、または洗浄および凍結乾燥された、または洗浄および乾燥された
微粒子は、微粒子内のスーパーコイルプラスミドDNAの量に悪影響を及ぼさない
よう、賦形剤中に懸濁することができる。生理食塩水、炭水化物、洗浄剤および
他の界面活性剤、ポリマー、緩衝液および脂質のような賦形剤は、薬剤の製剤に
おいて頻用され、かつここでは効果的微粒子の再懸濁を提供し、沈降を防止する
ように作用し、および／またはインビボ分散を増加する。ゲル電気泳動解析によ
ると、トゥィーン 80、マンニトール、ソルビトールおよびカルボキシメチルセ
ルロースのような賦形剤は、凍結乾燥前または後に含まれた場合、核酸の安定性
またはスーパーコイル度に有害な作用を有さない。

【００８１】微粒子の特徴決定前述の方法により調製された微粒子のサイズ分布は、コールター（COULTER）(
商標)カウンターにより決定することができる。この装置は、粒子のサイズ分布
プロフィールおよび統計解析を提供する。または、粒子の平均サイズは、サイジ
ングスライドまたは接眼レンズを装着した顕微鏡下で可視化することにより決定
することができる。

【００８２】必要に応じて、核酸は、下記の手順による分析のために微粒子から抽出するこ
とができる。微粒子は、水溶液中に存在するクロロホルムまたは塩化メチレンの
ような有機溶媒中に溶解される。このポリマーは有機相中に滞留する一方で、核
酸は水相に移行する。これらの相間の界面は、遠心分離によりより明確にするこ
とができる。水相の単離により、核酸を回収できる。核酸は、常法に従う塩およ
びエタノールによる沈殿により、水相から回収される。分解について調べるため
に、抽出した核酸をHPLC、キャピラリーゲル電気泳動、またはアガロースゲル電
気泳動で分析することができる。

【００８３】これらの粒子中の残留有機溶媒の量は、例えばガスクロマトグラフィーまたは
質量分析と組合わせたガスクロマトグラフィーのような、当技術分野において公
知の方法により決定することができる。より詳細に述べると、微粒子は、実施例
2に詳述された手順により製造され、かつ以下のように残留溶媒が試験される：

【００８４】バイアル充填量の異なる段階を表す4個のバイアルを、分析のために取ってお
いた。凍結乾燥物質およそ15mgを、4個の各バイアルから取除き、かつ緩徐に混
合し(手でスパチュラを操作)、被験物質の均質性を確認した。次にプールした凍
結乾燥物質を、内部標準(1,2-ジクロロ-プロパン)を伴うテトラヒドロフラン中
に再懸濁し、注入から注入までの注入容量を変動するように調節した。各被験物
質を、サプレッコ（Supelco）(商標)SPB-5 30m X 0.53mmカラムおよび電子捕獲
検出装置を装着したガスクロマトグラフィーへ2つ組で注入した。ジクロロメタ
ンDCMおよび注入対照のピーク面積を決定した(両方のピークはベースライン分離
する)。DCM/1,2-ジクロロプロパン比を、被験物質について決定し、かつ既知の
濃度で調製した標準の対応する比と比較した。この比較は、被験物質中のDCMの
濃度が得られた。本試験法は、50〜100ppm DCM濃度範囲で定量的であり、定量限
界はおよそ30ppmであり、かつ検出限界はおよそ20ppmである。この手順を、2種
の微粒子調製物に適用した。一方の調製物は、残留DCMレベルが検出限界辺り(す
なわち、約20ppm)であることがわかった。他方は、残留DCMレベル79ppmであった
。

【００８５】 GMPに該当しない試料を、同様の方法で分析した。凍結乾燥した被験物質を、1
,2-ジクロロプロパンを含むTHF中に再懸濁し、かつ先に記したようにGC分析を施
した。液体被験物質は、試料調製の助けを借りずGCへ直接注入した。各試料セッ
トについてDCM標準曲線を作成し、かつ被験物質のDCM濃度を標準曲線から外挿し
た。

【００８６】微粒子のインビボ送達核酸を含有する微粒子を生理食塩水、緩衝塩溶液、組織培地、炭水化物含有も
しくは脂質含有溶液、または他の生理的に許容される担体中に再懸濁することが
できる。これらは、動物(例えば、ヒトのような哺乳類)へ、筋肉内、静脈内、動
脈内、皮内、クモ膜下、腹腔内、もしくは皮下に注射することができ、またはこ
れらは、例えば微粒子を含有する懸濁剤もしくは散剤の吸入により、または微粒
子を含有する錠剤もしくは懸濁剤の燕下などにより、胃腸管または気道に導入す
ることができる。または、微粒子は、膣、鼻または直腸のような粘膜部位に導入
することができる。核酸の発現は、適当な方法によりモニターされる。例えば、
関心対象の免疫原性タンパク質をコードしている核酸の発現は、RT-PCRにより、
もしくは該タンパク質に対する抗体反応またはＴ細胞応答を調べることによりア
ッセイされる。

【００８７】抗体反応は、ELISA法において血清を試験することにより測定することができ
る。このアッセイ法において、関心対象のタンパク質は、96ウェルプレート上に
被覆され、かつ被験対象からの血清の連続希釈物が各ウェルにピペット注入され
る。その後ウェルに、第二の酵素結合抗体、例えばヒトの西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合抗体などが添加される。関心対象のタンパク質に対する抗体が被験対
象の血清中に存在する場合には、これらはプレートに固定されたタンパク質に結
合し、次に二次抗体により結合されると考えられる。この混合物に酵素基質が添
加され、かつ比色変化がELISAプレートリーダーにより定量化される。陽性の血
清反応は、該微粒子のDNAでコードされた免疫原性タンパク質が、被験対象にお
いて発現され、かつ抗体反応を刺激することを示している。または、ELISAスポ
ットアッセイ法が用いられる。

【００８８】タンパク質をコードしている核酸を包含する微粒子の細胞内送達後の該タンパ
ク質に対し反応したＴ細胞増殖は、被験動物の脾臓、リンパ節、または末梢血リ
ンパ球中に存在するＴ細胞をアッセイすることにより測定される。このような供
給源から得られたＴ細胞は、関心対象のタンパク質またはペプチドの存在下で、
同系APCと共にインキュベーションされる。Ｔ細胞増殖は、常法に従い、³H-チミ
ジンの取り込みによりモニターされる。細胞に取り込まれた放射能量は、微粒子
が送達した核酸の発現により被験物質において誘導された増殖反応の強度と直接
相関している。陽性反応は、該タンパク質またはペプチドをコードしているDNA
を包含する微粒子が取り込まれ、かつAPCによりインビボにおいて発現されてい
ることを示していた。

【００８９】細胞傷害性Ｔ細胞の誘発は、標準⁵¹Crの放出アッセイ法において明らかにする
ことができる(例えば、国際公開公報第99/18995号、米国特許出願第09/398,534
号、または米国特許出願第60/154,665号を参照のこと)。これらのアッセイ法に
おいて、被験対象から得られた脾細胞または末梢血リンパ球は、同系APC(例えば
樹状細胞)と関心対象のタンパク質またはこのタンパク質由来のエピトープのい
ずれかの存在下で培養される。刺激サイクル(例えば、4〜10日間)後、エフェク
ター細胞傷害性Ｔ細胞は、関心対象のタンパク質由来のエピトープを発現してい
る⁵¹Cr標識された標的細胞と混合される。エフェクター細胞は、インビトロにお
いて1〜3回刺激される。被験対象が、微粒子内に包含された核酸によりコードさ
れたタンパク質またはペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を生じる場合には
、この細胞傷害性Ｔ細胞は該標的を溶解すると考えられる。溶解された標的は、
放射性⁵¹Crを培地へ放出すると考えられる。培地のアリコートは、シンチレーシ
ョンカウンターにおいて放射能についてアッセイされる。更にELISAまたはFACS
のようなアッセイ法を用いて、Ｔ細胞に応答するサイトカインプロフィールを測
定することができる(例えば、国際公開公報第99/18995号、米国特許出願第09/39
8,534号または米国特許出願第60/154,665号参照)。

【００９０】脂質包含微粒子更に本明細書に記された微粒子は、1種またはそれ以上の脂質を安定化化合物
として含有することもできる。微粒子中の脂質の包含は、例えば、共有的に閉じ
た2本鎖DNA分子をスーパーコイル状態で維持することにより、微粒子中の核酸の
安定性を増大することができる。粒子中の脂質の存在は、薬物または核酸が微粒
子から放出される速度を変更、すなわち増加または減少することができる。

【００９１】脂質の微粒子への添加は、場合によっては、核酸の封入効率を増加するか、ま
たは微粒子内の核酸の負荷を増加することができる。例えば、脂質の存在は内側
の水相および有機相の間の表面張力を低下するので、封入効率を改善することが
できる。表面張力の低下は、環境を核酸にとってより好ましいものにし、その結
果微粒子内のそれの保留を増大すると考えられる。表面張力の低下は更に、第一
のエマルションがより少ない操作で生成されることを可能にし、これは核酸の剪
断を最小化し、かつスーパーコイル化を増大する。更に微粒子内の脂質の存在は
、微粒子/核酸製剤の安定性を増大することができ、かつ微粒子の疎水性を増大
することができ、これにより食細胞による取り込みを増大することを可能にする
。

【００９２】脂質は、カチオン性、アニオン性、または双性イオンであることができ、もし
くは非極性グリセリドのように帯電した基を有さなくともよい。これらは、例え
ば、脂肪酸、エイコサノイド、グリセロリン脂質、トリアセチルグリセロール、
ワックス、スフィンゴ脂質、ステロイド(例えば、コレステロール、CHAPS、胆汁
酸、ホルモン、心臓のアグリコン)、脂質性ビタミン、またはテルペンであって
もよい。これらの脂質は好ましくは、微粒子を封入している(すなわち取り囲む)
リポソームとしては存在しない。これらの脂質は選択的に、ミセルを形成するこ
とがある。

【００９３】微粒子において使用することができる脂質の例は、酸(例えば、カプロン酸の
ような脂肪酸を含むカルボン酸)、塩基(例えばアミン)、双性イオン脂質(例えば
、CHAPS)、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリンまた
はホスファチジル酸のようなリン脂質であり、各々下記の基を1個またはそれ以
上含有する：プロピオニル(プロパノイル)、ブチリル(ブタノイル)、バレリル(
ペンタノイル)、カプロイル(ヘキサノイル)、カプリリル(ヘプタノイル)、カプ
リル(デカノイル)、ウンデカノイル、ラウリル(ドデカノイル)、トリデカノイル
、ミリスチル(テトラデカノイル)、ペンタデカノイル、パルミチル(ヘキサデカ
ノイル)、フィタノイル(3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカノイル)、ヘプタデ
カノイル、ステアリル(オクタデカノイル)、ブロモステアリル、ノナデカノイル
、アラキドイル(エイコサノイル)、ヘネイコサノイル、ベヘニル(ドコサノイル)
、トリコサノイル、リグノセリル(テトラコサノイル)、ミリストレオイル(9-cis
-テトラデカノイル)、ミリステライドイル(9-trans-テトラデカノイル)、パルミ
トレイル(9-cis-ヘキサデカノイル)、パルミテライジル(9-trans-ヘキサデセノ
イル)、ペトロセリノイル(6-cis-オクタデセノイル)、オレオイル(9-cis-オクタ
デセノイル)、エライドイル(9-trans-オクタデセノイル)、リノレオイル(9-cis-
12-cis-オクタデカジエノイル)、リノレノイル(9-cis-12-cis-15-cis-オクタデ
カトリエノイル)、エイコセノイル(11-cis-エイコセノイック)、アラキドニル(5
,8,11.14-(全て-cis)-エイコサテトラエノイック)、エルコイル(13-cis-ドコセ
ノイック)、およびネルボノイル(15-cis-テトラコセノイック)である。

【００９４】他の適当な脂質は、セチルトリメチルアンモニウムイオンを含み、これは、CT
AB、PEG-DSPE、並びにコレステロール、CHAPS、並びにある種のビタミンおよび
ホルモンのようなステロイド構造を含むもの、として入手できる。サポニン由来
の脂質(例えば、QS21)も使用することができる。

【００９５】脂質混合物を使用し、脂質包含微粒子を形成することができる。適当な市販の
脂質調製物は、レシチン、オボシン（OVOTHIN）16O(商標)、およびエピクロン（
EPIKURON）135F(商標)脂質懸濁液を含み、これらは全てルーカスマイヤー（Luc
as Meyer、Inc.、）デカチュア、ILから入手できる。

【００９６】この脂質は、例えば放線菌のような生物から単離することもできる。脂質は、
好ましくはCD1制限脂質であり、例えばペーマー（Pamer）、Trend Microbiol.、
7:13、1999；ブラウド（Braud）、Curr Opin. Immunol.、11:100. 1999；ジャッ
クマン（Jackman）、Crit. Rev. Immunol.、19:49、1999；および、プリゴジー
（Prigozy）、Trends Microbiol.、6:454、1998に記された脂質などがある。

【００９７】微粒子への脂質の混入の代わりにまたはこれに加えて、微粒子は、注射後の分
散、送達を改善するため、もしくはそれらを懸濁された状態で維持するために、
脂質(または脂質懸濁液)中に懸濁することができる。

【００９８】脂質包含微粒子も、追加的に前述のような安定剤を含有することができる。微
粒子内にショ糖のような安定剤と共に脂質を含有することは、微粒子内の核酸の
放出の相乗的増大を提供することができる。

【００９９】前述のように、脂質包含微粒子は、脂質の、ポリマーを含有する有機溶媒への
、DNA溶液を含有する水溶液への、または界面活性剤を含有する水溶液への添加
により調製することができる。有機または水性溶媒中の特定の脂質の溶解度特性
は、どの溶媒が使用されるかを決定すると考えられる。

【０１００】一部の脂質または脂質懸濁液は、有機溶媒または水溶液のいずれかに添加する
ことができる。微粒子は更に、脂質含有溶液中へ再懸濁され、微粒子の再懸濁お
よび分散を促進する。

【０１０１】本明細書に記された脂質包含微粒子に加え、微粒子は、キチン、ゼラチン、ま
たはアルギナートのような他の巨大分子、またはこれらの巨大分子および脂質の
様々な組合せを、ポリマー溶液への取り込みにより(すなわちPLGAと共に)製造す
ることもできる。これらの他の巨大分子と共に作成された微粒子は更に前述の安
定剤を含有することもできる。

【０１０２】本方法は、下記の限定しない実施例により例証される。

【０１０３】実施例実施例1：DNAの調製プラスミドDNAを含有する細菌培養物500mlを、1Lの遠心ボトルに注いだ。これ
らの培養物を、4000rpmで20分間、20℃で遠心した。ペレット化された細菌から
培地を除去した。細菌ペレットを、50mlの緩衝液P1(50mM トリス-HCl、pH8.0；1
0mM EDTA；100μg/ml RNase)中に完全に再懸濁し、凝集塊が残らないようにした
。ゆるやかに回旋してかき混ぜながら、緩衝液P2(200mM NaOH、1％ SDS)50mlを
添加し、かつ懸濁液を室温で5分間インキュベーションし、細胞を溶解した。す
ぐに緩衝液P3(3.0M酢酸カリウム、pH5.5、4℃に冷却)50mlを添加し、緩やかに混
合した。この懸濁液を、氷上で30分間インキュベーションし、その後4000rpmで3
0分間4℃で遠心した。

【０１０４】折りたたんだ円形濾紙を水で湿らせた。遠心が完了した時、上清をすぐに濾紙
上に注いだ。濾過した上清を、きれいな250ml遠心ボトル中に収集した。

【０１０５】濾過した溶解液に、キアゲン（Qiagen） ER(商標)緩衝液15mlを添加し、ボト
ルを10回反転混合させた。この溶解液を、氷上で30分間インキュベーションした
。

【０１０６】キアゲンチップ2500(商標)カラムを、キアゲン QBT(商標)緩衝液(750mM塩化ナ
トリウム；50mM MOPS、pH7.0；15％イソプロパノール；および、0.15％トライト
ン（Triton）X-100)35mlを適用することにより平衡化した。カラムを重力流れに
より空にした。インキュベーションした溶解液をこのカラムに適用し、重力流れ
により空にした。このカラムを、4 x 50ml キアゲンエンドフリー（Qiagen Endo
free） QC(商標)緩衝液(1.0M NaCl；50mM MOPS、pH7.0；15％イソプロパノール)
で洗浄した。QN(商標)緩衝液(1.6M NaCl；50mM MOPS、pH7.0；15％イソプロパノ
ール)35mlにより、DNAをカラムから50mlポリプロピレン製スクリューキャップ付
き遠心チューブへと溶出した。このDNA懸濁液を、およそ17.5mlの懸濁液を第二
の50mlスクリューキャップ付きチューブに注ぐことにより、2本のチューブに分
割した。

【０１０７】滅菌した10mlピペットを使用し、イソプロパノール12.25mlを各チューブに添
加した。これらのチューブを密閉し、かつ完全に混合した。各チューブの内容物
を、30mlコレックス（Corex）(商標)(VWR)遠心チューブに注いだ。各コレックス
チューブを、パラフィルム（PARAFILM）(登録商標)で蓋をした。これらのチュー
ブを、11,000rpmで30分間4℃で遠心した。

【０１０８】上清を、各チューブから吸引し、かつペレットを70％エタノール2mlで洗浄し
た。エタノールを吸引により廃棄した。ペレットを10分間風乾し、その後0.5〜1
.0mlの水で再懸濁し、かつ滅菌した1.5ml微量遠心チューブに移した。

【０１０９】実施例2：微粒子の調製図１を参照し、乳酸-グリコール酸共重合体6gを溶解したジクロロメタン(DCM)
50ml(「PLGA/DCM」)を含有するボトル5を、氷浴中に入れた。ボトル5に、シルバ
ーサン SL2T(商標)ホモジナイザー7を装着した。

【０１１０】 DNA/ショ糖/TE溶液10.8ml(すなわち72mg DNA、300mMショ糖、および10mM TE)
を、シリンジを用いて、PLGA/DCM溶液へ注入した。DNA溶液の注入と同時に、ホ
モジネナイザーを10,000rpmで開始し、15分間継続した。

【０１１１】その後追加のDCM 100mlを、得られたエマルションへ、シリンジにより20秒を
超えないように注入した。100ml DCMの注入後、ホモジナイゼーションを更に30
秒間継続し、その後ホモジナイザー7を停止した。次に第一のエマルションを含
有するボトル5を、氷浴から取り出し、導管14を取り付けた。導管14は、ポンプ1
6を通って、シルバーサン L4RT(商標)ホモジナイザー24が装着されたホモジナイ
ザー用チャンバー23につながっていた。

【０１１２】第一のエマルションを界面活性剤と共にホモジナイジングし、微粒子を調製し
た。混合チャンバー23を、1％ポリビニルアルコール(PVA)/10.37％ショ糖溶液を
含有する貯蔵容器18とインラインに並べた。貯蔵容器18を、導管20によりポンプ
22を介して混合チャンバー23に連結した。

【０１１３】 PVA/ショ糖溶液を、貯蔵容器18からポンプ22を通して、流量を1L/分にセット
し、くみ出した。PVA/ショ糖溶液の流れが始まった直後に、ホモジナイザー24を
6,000rpmに設定した。その後流量を36ml/分にセットしたポンプ16により、第一
のエマルションをボトル5からチャンバー23へとくみ出すことにより、第二のエ
マルションを生成した。ホモジナイゼーション後、第二のエマルションを導管25
を通して排出し、かつ50rpmで操作されるスターラーを備えるバイオフロー（BIO
FLOW） 2000(商標)バイリアクターチャンバー28(ニューブランスウィックサイ
エンティフィック（New Brunswick Scientific）、エジソン、NJ)に入れた。導
管25をクランプ26に装着し、ホモジナイザー24とバイオリアクターチャンバー28
の間の第二のエマルションの流れを調節した。

【０１１４】同じくバイオリアクターチャンバー28は、窒素を送達するための注入口32、圧
力解放バルブ34、およびクランプ38が装着された流出導管36を特徴としていた。
導管36を、「Y型」コネクター40と連結し、これは導管36から導管42への流れを
方向転換させた。導管42を通る液体流れは、クランプ44で調節した。または、液
体は、クランプ38の閉鎖およびクランプ43および44の開放により、導管41および
42を介して、導管48へと導入することができた。

【０１１５】貯蔵容器18からのPVA/ショ糖溶液5Lおよびボトル5からの第一のエマルション1
50mlを、ホモジナイザー24へポンプ注入し、その後バイオリアクターチャンバー
28へ5分かけて注入した。溶液がホモジナイザー24へポンプ注入された後、バイ
オリアクターチャンバー28内の攪拌速度を、375rpmで30分間に増した。

【０１１６】バイオリアクターチャンバー28の温度を22℃に設定し、5分毎にモニターした
。30分後、設定温度を37℃に上昇し、かつ再度温度を5分毎にモニターした。温
度が37℃に到達した時点で、攪拌速度を375rpmに維持し、かつ攪拌を1.5時間継
続し、その後攪拌速度を150rpmに調節し、かつ設定温度を15℃に低下した。

【０１１７】微粒子の洗浄は、導管41および42(すなわちクランプ38は閉鎖)、ポンプ46、お
よび導管48を通じて、水500ml(4℃）を、AG テクノロジーズ（AG Technologies
）中空繊維貯蔵容器50へと導入することにより開始した。中空繊維貯蔵容器50を
通る流量は、最初はポンプ57により、11L/分に設定した。

【０１１８】水500mlを中空繊維貯蔵容器50に添加した後、クランプ43を閉鎖し、かつクラ
ンプ38を開放した。その後ポンプ46を用いて、溶液をバイオリアクターチャンバ
ー28から中空繊維貯蔵容器50へと、流量80ml/分で移した。

【０１１９】中空繊維貯蔵容器50を、フィルター54を有する圧力解放通気口52へと、並びに
導管55および56へと連結した。液体を、ポンプ57により、中空繊維貯蔵容器50か
ら、導管56を通って、各々0.2μmの細孔を伴うポリスルホン多孔質膜を有する一
連の積層した中空繊維カートリッジ59へと循環させた。導管56から中空繊維カー
トリッジ59へと進入する液体は、中空繊維の内側領域を通過した。この領域は次
に、導管64に連結していた。中空繊維膜の孔サイズは、微粒子は膜を通過できな
いように十分に小さかった。対照的に、本製造法の試薬および副産物、例えばPV
Aおよびショ糖は、この膜を通過した。この浸透物は、流量40ml/分を用いポンプ
66により導管62を通って除去された。従って2個のチャンバーについて総流量は8
0ml/分であった。

【０１２０】中空繊維貯蔵容器50からの導管56も、600mlガラスビーカー72への液体の流れ
を調節するクランプ70に連結した。以下により詳細に説明するように、クランプ
70の開放は、中空繊維貯蔵容器50からビーカー72への微粒子の送達を可能にした
。

【０１２１】クランプ70を閉鎖し、ポンプ57により、液体を中空繊維貯蔵容器50から、導管
56を通り、中空繊維カートリッジ59へと方向付けた。液体は、バイリアクターチ
ャンバー28に残留した液体が1L未満になるまで流した。この時点で、流量を増大
し、全ての溶液を、バイオリアクターチャンバー28から中空繊維貯蔵容器50へと
2分かけて移した。その後バイオリアクターチャンバー28内を攪拌しながら、バ
イオリアクターチャンバー28への窒素流れを停止した。

【０１２２】ポンプ46を流量80ml/分で使用し、冷水(4℃)を導管41および42を介し導管48を
通り中空繊維システムへポンプ注入することにより、微粒子を洗浄した。中空繊
維貯蔵容器50中の溶液容量は、500mlで一定に保った。洗浄を、冷水(4℃)3.5Lが
システムにポンプ注入されるまで継続した。この時点で、ポンプ46を停止した。
ポンプ66は、中空繊維貯蔵容器50中に残留する溶液がおよそ200mlになるまで、8
0ml/分で浸透物を運搬するよう継続した。その後ポンプ46および57を停止し、か
つクランプ70を開放し、微粒子を中空繊維貯蔵容器50からビーカー72へと流した
。

【０１２３】その後クランプ70を閉じ、かつ冷水(4℃)100mlを、ポンプ46を用いて、導管41
からこのシステムへ導入し、中空繊維カートリッジ59をすすぎ、前述の1回目の
収集において残留した微粒子を回収し、これにより生成物の収量を最大化した。
その後ポンプ57を開き、かつ再循環流量をゆっくりと11L/mlに増加し、5分間維
持し、次にポンプ57により制御し、この流量を次第に減少することにより低下し
た。

【０１２４】再度クランプ70を開放し、微粒子懸濁液を収集した。懸濁液を、先に収集した
微粒子懸濁液と一緒にし、かつ一緒にした微粒子懸濁液の質量を測定した。微粒
子を室温で、更にDCM除去を実行するために追加の時間攪拌した。

【０１２５】微粒子懸濁液を、5mlバイアルへ1.5mlで1回目に小分けした後、凍結乾燥した
。これらのバイアルを、凍結乾燥チャンバー内で、-50℃で3時間維持し、懸濁液
を凍結し、その後温度を5℃/時間で上昇し、最終温度-10℃とした。バイアルを-
10℃で最低6分間維持し、その後25℃で4〜16時間維持し、凍結乾燥した。凍結乾
燥チャンバーは、〜2"mmHgの圧力に窒素ガスで充填して戻し、かつゴム製バイア
ル栓で封止し、この圧力を維持した。凍結乾燥が完了した後、このバイアルをゴ
ム/アルミニウム隔壁で圧着し、かつ-20℃で貯蔵した。

【０１２６】これらの粒子は、数平均直径約1〜2μmを有することがわかった。

【０１２７】実施例3：結果実施例2の手順を、第一のエマルションの調製のために、様々な核酸の充填量
および条件で実施した。結果を下記に示す：試行#1 プラスミドDNA 72mg 微細流動化装置中で調製された第一のエマルション収量：4.6g(77％) 平均微粒子直径：1.9μm 封入効率：4.8μg DNA/mg微粒子スーパーコイルの形で残留するDNA：≧60％微粒子質量に対する残留PVA：0.88％

【０１２８】試行#2 プラスミドDNA 72mg バッチ法で、SL2Tホモジナイザー中で調製された第一のエマルション収量：4.5g(74％) 平均微粒子直径：2.1μm 封入効率：5.09μg DNA/mg微粒子スーパーコイルの形で残留するDNA：≧60％微粒子質量に対する残留PVA：0.89％

【０１２９】試行#3 プラスミドDNA 72mg SL2Tホモジナイザー中で調製された第一のエマルション(この場合、DCM 50mlお
よびDNA 10.8ml溶液の代わりに、DCM全150mlおよび全DNA溶液を一度に一緒にし
た) 収量：5.0g(83％) 平均微粒子直径：2.0μm 封入効率：3.99μg DNA/mg微粒子スーパーコイルの形で残留するDNA：≧80％微粒子質量に対する残留PVA：1.1％

【０１３０】試行#4 プラスミドDNA 108mg SL2Tホモジナイザー中で調製された第一のエマルション収量：5.6g(93％) 平均微粒子直径：1.9μm 封入効率：7.04μg DNA/mg微粒子スーパーコイルの形で残留するDNA：≧60％微粒子質量に対する残留PVA：1.48％

【０１３１】試行#5 プラスミドDNA 108mg SL2Tホモジナイザー中で調製された第一のエマルション収量：5.75g(96％) 平均微粒子直径：1.8μm 封入効率：9.78μg DNA/mg微粒子スーパーコイルの形で残留するDNA：70％微粒子質量に対する残留PVA：1.63％

【０１３２】実施例4：第二のエマルションから残留有機溶媒を除去する別法微粒子は、実施例2に記したように調製した。第二のエマルションを、溶媒除
去装置へポンプ注入し、DCMを微粒子から第二のエマルションの水相へと拡散し
た。このスラリーを、このタンク内で非常にゆっくり攪拌した；激しい攪拌およ
び通気を避けることは、泡の発生を避ける一助である。実施例2に記された手順
とは対照的に、表面を覆う気体はなかったが、むしろ部分真空がヘッドスペース
に生じ、蒸発した任意のDCMをガス抜きする。DCMが微粒子から水相へ拡散するに
つれ、水相のDCMレベルは上昇し、飽和に到達した(およそ1〜2％、溶液の温度に
よって決まる)。硬化相の期間中に、追加の水を溶媒除去装置に、DCM 150ml当り
全部で水10Lが存在するようになるまで、添加した。その後スラリーを、スウェ
コファーマセップフィルター/ドライヤー（Sweco PharmaSep Filter/Dryer）(
エマーソンエレクトロニック)に移した(例えば、硬化タンクの加圧により)。こ
のユニットは、1ミクロンまたはそれ以下の基準スクリーンサイズにあわせてお
り、直径が1μmよりも大きい微粒子は保持する。このスクリーンサイズは、異な
るサイズの微粒子を保持するように調節することができる。水相がスクリーンを
通過するにつれて、生成物はフィルター/ドライヤーの内側に保持され、かつ放
出される。

【０１３３】その後スウェコユニット内部で、微粒子を注射用水(WFI)でゆっくり洗浄し、
スクリーン振動により懸濁液中に微粒子を維持した。DCMは、微粒子から水へと
進み、水はユニットを通って流れかつDCMを運び出す。ユニットに進入する洗浄
水はDCMを有さないので、この微粒子は、バルク水相においては、非常に低いDCM
レベルにのみ曝され、これにより微粒子の外へDCMを移す拡散法が迅速化される
。生成物中のDCMレベルは低下するので、洗浄水の流量は低下することができ、
これは経費を節約し溶媒除去を補助する。洗浄水の温度は、生成物に損傷を及ぼ
すことなく、拡散移動率を最大化するように調節することができる。最後に、生
成物を、最終の賦形剤で洗浄し、かつ窒素ガスで、適当な乾燥状態に乾燥される
。乾燥生成物を、バイアルに入れるために、フィルター/ドライヤーから滅菌し
た受取容器へ排出する。または生成物を、洗浄のためにフィルター装置内に保持
し、次に凍結乾燥機において乾燥し、その後バイアルに入れるために、滅菌した
受取容器へ排出する。

【０１３４】必要に応じて、DCMを、廃棄した洗浄水から蒸留により回収することができる
。廃棄した洗浄水は生成物を含まないので、これは沸騰することができ、かつ発
生気体を蒸留カラムに通すことができる。DCMおよび水を、蒸留カラムにより分
離し、かつDCMを再利用のために回収することができる。これは、一般に現行法
では失われているDCMの経費を削減する点で有利であり、かつ大気中に放出され
たDCMに関連した環境の問題をなくす。

【０１３５】実施例5：2倍スケールの微粒子製造法本方法の2Xスケールアップは、2個の第一のホモジナイザー、1個の第二の(フ
ロースルー)ホモジナイザー、2個のバイオリアクター、および1個の(2倍サイズ
の)中空繊維装置を要する。

【０１３６】 1. 乳化機ヘッドが貫通するテフロン（TEFLON）(登録商標)栓で封止した250ml
ポリプロピレン製特注容器内で、DCM 50ml中のPLGA 6gおよび10％ショ糖10.8ml
中のDNA 72mgを用いて、単独のエマルションを生成した。シルバーサン SR2Tホ
モジナイザーで10,000rpmで15分間ホモジネーションした後、さらに100mlのDCM
を、容器にポンプで注入した。このエマルションの最終容量は161mlであった。
ホモジネーションを更に30秒間行った。 2. ホモジナイザーチップを取り外すことなく、エマルションを、容器から、
テフロン(登録商標)栓を貫通しかつ容器の底に達したステンレス鋼チューブを通
って、ポンプ排出した。第一のエマルションを、32.2ml/分で(5分間)、PVA溶液5
L(1％PVA＋10.37％ショ糖)と共にポンプ排出し、これはシルバーサン L4RT(商標
)フロースルーホモジナイザーを通って10リットルのニューブランスウィック
サイエンティフィックバイオフロー（Bioflo）(商標)反応容器へと1L/分(5分間
)でポンプ注入した。この反応容器を、375rpmで攪拌し、かつ滅菌濾過した窒素
ガスを、20L/分でヘッドスペースを通過させた。反応容器の温度を、20℃で30分
間維持し、その後37℃に上昇し、かつその温度に維持しながら更に2〜3時間連続
して攪拌し、ガスを発生した。 3. 第一のエマルションを攪拌しながら、工程1を第二の容器およびホモジナイ
ザーで繰り返した。 4. 工程2を、同じ第二のホモジナイザーおよび異なる反応容器を用いて繰り返
した。 5. 第一の反応容器の内容物を2〜3時間攪拌した後、この反応容器内の液体を
、巨大な大きい中空繊維カートリッジを通して、8L/分でポンプ注入し、かつ反
応容器に循環し戻した。浸透物を、定量160ml/分で除去し、廃棄した。 6. 浸透物1Lを、第一の反応容器から除去し、第二の反応容器を再循環回路に
配置するように、バルブセットをスイッチした。浸透物の1Lを第二の反応容器か
ら除去し、廃棄した。 7. 各容器の懸濁液の容量が1Lになるまで、工程5および6を繰り返した。この
時点で、両方のリアクターの内容物を、中空繊維装置に隣接している2Lの貯蔵容
器にポンプ注入し、かつ中空繊維装置を通して8L/分で再循環した。浸透物は、1
60m/分で連続除去される。 8. 懸濁液の容量が1Lの場合、WFIを貯蔵容器へ160ml/分でポンプ注入した。浸
透物を、160ml/分で連続除去した。7Lがシステムを通過した時点で、WFIの流れ
を停止した。 9. 再循環流れを4L/分に低下し、かつ浸透物流れを80ml/分に低下した。ポン
プ注入は、懸濁液容量が約400mlになるまで継続する。 10. この時点で、ポンプを停止し、かつ懸濁液を中空繊維装置から滅菌受取容
器へと排出した。 11. 賦形剤の濃縮溶液を、この段階で生成物に添加した。生成物を、5分間攪
拌した。 12. 生成物を、凍結乾燥、充填、およびクリンピングのために、バイアルに分
配した。

【０１３７】結果：前述の微粒子を分析し、下記の結果を得た：封入(UV吸収により決定)：4.0μg DNA/mg 粒子スーパーコイル：微粒子中60％微粒子直径：数平均2.0μm、容量平均6.2μm；80％は直径2.8μmよりも大きい収量：水650ml中10.3g (85.8％) PVA濃度：1.1％

【０１３８】実施例6：微粒子製造の10倍およびそれ以上のスケールアップ以下に、60gおよびそれより大きいスケールでの微粒子製造技術を説明する。

【０１３９】 1. DNAおよびショ糖の水溶液、並びにDCM中のPLGAおよび脂質溶液を、連続フ
ローホモジナイザーを通して同時にポンプ注入し、第一のエマルションを生成す
る。 2. 第一のエマルションおよびPVA/ショ糖溶液を、第二の連続フローホモジナ
イザーを通して同時にポンプ注入し、第二のエマルションを生成する。この第二
のエマルションを、溶媒除去装置へと通過させ、微粒子の懸濁液を生成する。 3. 懸濁液を、スクリーン型洗浄乾燥機(例えば、スウェコ装置)へとポンプ注
入し、ここで生成物を第一の水溶液またはWFIで洗浄する。これは、引き続き、
賦形剤(例えばマンニトール)を含有する第二の水溶液で洗浄する。 4. 生成物を、滅菌乾燥した空気の定常流により、スウェコユニット内で乾燥
する。 5. 乾燥した生成物を、スウェコユニットから、排出口を通して、滅菌した受
取容器へと放出する。 6. 乾燥した生成物を、粉末オーガーと共にバイアルに充填した。このスクリ
ュー様装置は、受取容器から粉末を巻き上げ、かつ注射用バイアルへ分配し、そ
の後蓋をしかつ圧着する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る核酸包含微粒子の調製のためのシステムの概略図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/18 Ａ６１Ｋ 47/18 47/26 47/26 47/30 47/30 47/32 47/32 47/34 47/34 47/44 47/44 Ａ６１Ｐ 37/00 Ａ６１Ｐ 37/00 Ｂ０１Ｊ 13/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 15/09 Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者チョウマイケルアメリカ合衆国マサチューセッツ州マルボロイーストメインストリート 332 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 HA17 4C076 AA22 AA30 BB01 CC03 CC07 CC29 DD49Q DD67Q EE01A EE06A EE20A EE51Q FF05 GG06 4C084 AA03 AA13 BA35 NA10 ZB011 4C086 EA16 MA05 MA23 MA44 MA52 NA14 ZB01 4G005 AA01 AB21 BA12 BB15 BB21 BB26 DB22X DD08Z DD12Z DD59Z DE08X EA03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の工程を含み、第一のエマルションおよび第二の水溶液
の少なくとも一方が、安定剤を更に含む、核酸包含微粒子調製のための拡張性の
ある連続法： (a)混合チャンバーおよび溶媒除去装置を提供する工程； (b)(i)高分子材料含む有機溶液、および(ii)核酸を含有する第一の水溶液と混
合された有機溶媒を含む、第一のエマルションを混合チャンバーに連続的に供給
する工程； (c)界面活性剤を含有する、第二の水溶液を混合チャンバーへ連続的に供給す
る工程； (d)混合チャンバー内の第一のエマルションおよび第二の水溶液を連続的に乳
化し、第二のエマルションを生成し、この第二のエマルションが、核酸、高分子
材料、水、および有機溶媒を含んでいる工程； (e)第二のエマルションを混合チャンバーから溶媒除去装置へと連続的に移す
工程；および (f)溶媒除去装置内の第二のエマルションから有機溶媒を除去し、核酸包含微
粒子の水性懸濁液を生成する工程；。
【請求項２】第一の水溶液および第二の水溶液が本質的に等しい浸透圧で
ある、請求項１記載の方法。
【請求項３】安定剤が、炭水化物および緩衝液を含む、請求項２記載の方
法。
【請求項４】安定剤がショ糖およびトリス-EDTAを含む、請求項３記載の
方法。
【請求項５】安定剤が更に脂質を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】安定剤が脂質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】下記の工程を更に含む、請求項１記載の方法： (g)ダイアフィルトレーション装置を提供する工程； (h)水性懸濁液を水性洗浄液で希釈する工程； (i)希釈した水性懸濁液をダイアフィルトレーション装置へ供給する工程；お
よび (j)ダイアフィルトレーション装置内の希釈した水性懸濁液からの水性廃液を
除去し、水性廃液が工程(h)の洗浄液の少なくとも一部を含んでおり、ダイフィ
ルトレーション装置内で核酸包含微粒子を含む精製された水性懸濁液を生成する
工程。
【請求項８】下記の工程を更に含む、請求項７記載の方法： (k)ダイアフィルトレーション装置内の精製された水性懸濁液を濃縮し、濃縮
物を生成する工程； (l)濃縮物を1個またはそれ以上の容器に移す工程。
【請求項９】下記の工程を更に含む、請求項８記載の方法： (m)1個またはそれ以上の容器内の濃縮物を凍結乾燥、フリーズドライ、または
風乾し、凍結乾燥、フリーズドライ、または風乾された微粒子を生成する工程。
【請求項１０】凍結乾燥またはフリーズドライされた微粒子が、残留有機
溶媒レベル200ppm未満を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】凍結乾燥またはフリーズドライされた微粒子が、残留有機
溶媒レベル50ppm未満を有する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】下記の工程を更に含む、請求項１記載の方法： (g)水性懸濁液を振動しているまたは振動していない微細メッシュスクリーン
と接触する工程； (h)スクリーンを通して水性懸濁液を濾過し、第一および第二の水溶液の各々
の少なくとも一部を除去し、かつスクリーン上に微粒子を残留する工程； (i)微粒子を少なくとも1種の水性洗浄液で洗浄し、洗浄された微粒子を作製す
る工程；および (j)洗浄された微粒子を乾燥し、乾燥された微粒子を作製する工程。
【請求項１３】乾燥工程が、洗浄された微粒子の凍結乾燥、フリーズドラ
イ、または風乾を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】第一の水性洗浄液が、温度約2℃〜約8℃の注射用滅菌水で
ある、請求項12記載の方法。
【請求項１５】乾燥工程の前に、洗浄された微粒子を賦形剤と接触させる
工程を更に含む、請求項12記載の方法。
【請求項１６】下記の工程を更に含む、請求項12記載の方法： (k)乾燥された微粒子を1個またはそれ以上の容器に移す工程。
【請求項１７】混合チャンバーがホモジナイザーを備える、請求項１記載
の方法。
【請求項１８】溶媒除去装置がバイオリアクターである、請求項１記載の
方法。
【請求項１９】第二の水溶液が、混合チャンバーに流量0.1〜20L/分で供
給される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】有機溶媒が、蒸発により、溶媒除去装置内の第二のエマル
ションから除去される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】有機溶媒が、30℃〜55℃に溶媒除去装置内の第二のエマル
ションを加熱することにより、第二のエマルションから除去される、請求項１記
載の方法。
【請求項２２】有機溶媒が、抽出法により、溶媒除去装置内の第二のエマ
ルションから除去される、請求項１記載の方法。
【請求項２３】有機溶媒の溶媒除去装置内の第二のエマルションからの除
去が、溶媒除去装置内の第二のエマルションの希釈により容易にされる、請求項
１記載の方法。
【請求項２４】有機溶媒が、溶媒除去装置に部分真空を適用することによ
り、溶媒除去装置内の第二のエマルションから除去される、請求項１記載の方法
。
【請求項２５】有機溶媒がジクロロメタンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】各工程が無菌的に実施される、請求項９記載の方法。
【請求項２７】ダイフィルトレーション装置が、中空繊維システムを備え
る、請求項７記載の方法。
【請求項２８】工程(i)および(j)が、約2℃〜約8℃の温度で実施される、
請求項７記載の方法。
【請求項２９】微粒子中の核酸の少なくとも約50％が、環状RNA分子また
はスーパーコイル環状DNA分子の形状である、請求項１記載の方法。
【請求項３０】精製された水性懸濁液中の微粒子中の核酸の少なくとも約
50％が、環状RNA分子またはスーパーコイル環状DNA分子の形状である、請求項７
記載の方法。
【請求項３１】凍結乾燥またはフリーズドライされた微粒子中の核酸の少
なくとも約50％が、スーパーコイル環状DNA分子の形状である、請求項９記載の
方法。
【請求項３２】微粒子の平均直径が、約100μm未満である、請求項１記載
の方法。
【請求項３３】平均直径が、約20μm未満である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】平均直径が、約0.5μm以上約2.5μm以下である、請求項32
記載の方法。
【請求項３５】高分子材料が、合成、生分解性ポリマーである、請求項１
記載の方法。
【請求項３６】ポリマーが、乳酸-グリコール酸共重合体(PLGA)である、
請求項35記載の方法。
【請求項３７】 PLGAにおける乳酸のグリコール酸に対する質量比が、約1:
2〜約4:1である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】 PLGAにおける乳酸のグリコール酸に対する質量比が、約1:
1である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】 PLGAが平均分子量の範囲6,000〜100,000を有する、請求項
36記載の方法。
【請求項４０】第二の水溶液が、ポリビニルアルコール(PVA)を更に含む
、請求項１記載の方法。
【請求項４１】第二の水溶液が炭水化物を更に含む、請求項40記載の方法
。
【請求項４２】炭水化物がショ糖である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】乳化工程(d)が、約2℃〜約8℃で実施される、請求項１記
載の方法。
【請求項４４】第一のエマルションおよび第二の水溶液の混合チャンバー
内の平均滞留時間が、約60秒未満である、請求項１記載の方法。
【請求項４５】第一のエマルションおよび第二の水溶液の混合チャンバー
内の平均滞留時間が、約1秒未満である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】第二のエマルションの溶媒除去装置内の平均滞留時間が、
約3時間未満である、請求項１記載の方法。
【請求項４７】下記の工程を更に含む、請求項１記載の方法： (g)ダイアフィルトレーション装置を提供する工程； (h)水性懸濁液を水性洗浄液により希釈する工程； (i)希釈した水性懸濁液をダイアフィルトレーション装置へ供給する工程； (j)ダイアフィルトレーション装置内の希釈した水性懸濁液からの水性廃液を
除去し、水性廃液が工程(h)の洗浄液の少なくとも一部を含んでおり、核酸包含
微粒子を含む精製された水性懸濁液を生成する工程； (k)精製された水性懸濁液を洗浄し、洗浄された微粒子の懸濁液を生成する工
程； (l)洗浄された微粒子の懸濁液を濃縮し、濃縮物を生成する工程； (m)濃縮物を1個またはそれ以上の容器に移す工程； (n)1個またはそれ以上の容器内の濃縮物を、凍結乾燥、フリーズドライ、また
は風乾し、凍結乾燥、フリーズドライ、または風乾された粉末を生成する工程。