ES2260070T3 - Metodo en flujo continuo para preparar microparticulas. - Google Patents

Metodo en flujo continuo para preparar microparticulas.

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ES2260070T3 ES00978814T ES00978814T ES2260070T3 ES 2260070 T3 ES2260070 T3 ES 2260070T3 ES 00978814 T ES00978814 T ES 00978814T ES 00978814 T ES00978814 T ES 00978814T ES 2260070 T3 ES2260070 T3 ES 2260070T3
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Yung-Yueh Hsu
Michael Tyo
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Abstract

Procedimiento continuo dimensionable para preparar micropartículas que contienen ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una cámara de mezclado y un dispositivo de eliminación de disolvente; (b) suministrar continuamente una primera emulsión a la cámara de mezclado, en la que la primera emulsión comprende (i) una solución orgánica que comprende un material polimérico y un disolvente orgánico mezclada con (ii) una primera solución acuosa que comprende un ácido nucleico; (c) suministrar continuamente una segunda solución acuosa a la cámara de mezclado, en la que la segunda solución acuosa comprende un tensioactivo; (d) emulsionar continuamente la primera emulsión y la segunda solución acuosa en la cámara de mezclado para formar una segunda emulsión, comprendiendo la segunda emulsión ácido nucleico, material polimérico, agua y disolvente orgánico; (e) transferir continuamente la segunda emulsión desde la cámara de mezclado hacia el dispositivo de eliminación de disolvente; y (f) eliminar el disolvente orgánico de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente para formar una suspensión acuosa de micropartículas que contienen ácido nucleico; en el que al menos una de la primera emulsión y la segunda solución acuosa comprende además un estabilizante.

Description

Método en flujo continuo para preparar micropartículas.
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere a un método para fabricar micropartículas poliméricas.
Se han usado polímeros biodegradables sintéticos como vehículos para fármacos. Se ha observado que, cuando se usan como vehículos para fármacos, los polímeros sintéticos son generalmente superiores a los polímeros naturales en cuanto a la reproducibilidad de la liberación del producto (Okada et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 12 (1):1, 1995).
Se han desarrollado diversos métodos para preparar microesferas de polímeros sintéticos hidrófobos que contienen fármacos hidrófilos. Estos métodos incluyen (1) evaporación de disolvente de emulsión (por ejemplo, evaporación de emulsiones de aceite/agua, agua/aceite, agua/aceite/agua), (2) separación de fases, (3) polimerización a la interfase, y (4) secado por pulverización (anteriormente).
La solicitud de patente WO 98/31398 describe micropartículas que contienen ácido nucleico y método de preparación.
Sumario de la invención
La invención se basa en el descubrimiento de un método para la producción dimensionable, en flujo continuo de una micropartícula que contiene ácido nucleico que mantiene la integridad estructural del ácido nucleico asociado y da como resultado una micropartícula que tiene una pureza adecuada para su introducción en un anfitrión animal (por ejemplo, un ser humano). Las micropartículas preparadas según el procedimiento en flujo continuo descrito en el presente documento pueden usarse para la administración de un ácido nucleico para una terapia génica, tratamiento antisentido, vacuna, tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, y modulación, ya sea específica o no específica, de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mediante regulación de la citocina). Las micropartículas pueden usarse adicionalmente para administrar ácido nucleico que codifica para una proteína o péptido útil en cualquier tipo de tratamiento.
En consecuencia, en un aspecto la invención se caracteriza por un procedimiento continuo dimensionable para preparar micropartículas que contienen ácido nucleico. El procedimiento incluye las etapas de: (a) proporcionar una cámara de mezclado y un dispositivo de eliminación de disolvente; (b) suministrar continuamente una primera emulsión a la cámara de mezclado (es decir, en la que la primera emulsión incluye (i) una solución orgánica que incluye un material polimérico y un disolvente orgánico (por ejemplo, diclorometano, "DCM"), mezclada con (ii) una primera solución acuosa, que incluye un ácido nucleico); (c) suministrar continuamente una segunda solución acuosa, que incluye un tensioactivo, a la cámara de mezclado; (d) emulsionar continuamente la primera emulsión y la segunda solución acuosa en la cámara de mezclado para formar una segunda emulsión que incluye ácido nucleico, material polimérico, agua, y disolvente orgánico; (e) transferir continuamente la segunda emulsión de la cámara de mezclado al dispositivo de eliminación de disolvente; y (f) eliminar el disolvente orgánico de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente para formar una suspensión acuosa de micropartículas que contienen ácido nucleico. La primera emulsión, la segunda solución acuosa, o ambas, incluyen además un estabilizante.
Alternativamente, puede llevarse a cabo la etapa (b) en la que el ácido nucleico no está en solución acuosa (por ejemplo, en la que el ácido nucleico está seco). Una ventaja de llevar a cabo esta etapa con ácido nucleico seco es que hacer esto puede conducir a una alta eficacia de encapsulación (por ejemplo, cercana al 100%).
En algunas realizaciones, las etapas (b) y/o (d) se llevan a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC.
El tiempo de residencia medio de la primera emulsión y la segunda solución acuosa en la cámara de mezclado puede ser inferior a aproximadamente 60 segundos (por ejemplo, inferior a 60 segundos, inferior a 45 segundos, inferior a 30 segundos, inferior a 20 segundos, inferior a 15 segundos, inferior a 10 segundos, inferior a 5 segundos, inferior a 2 segundos, o inferior a 1 segundo). El tiempo de residencia medio de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente puede ser inferior a aproximadamente 3 horas (por ejemplo, inferior a 3 horas, inferior a 2 horas, inferior a 1 hora, inferior a 30 minutos, o interior a 15 minutos). Para los fines de esta solicitud, "tiempo de residencia medio" se define como la razón de velocidad de flujo con respecto a volumen.
La primera solución acuosa y la segunda solución acuosa pueden ser, por ejemplo, de esencialmente igual osmolaridad, capacidad de tampón, y pH. La segunda solución acuosa puede, opcionalmente, incluir poli(alcohol vinílico) (PVA) y/o un hidrato de carbono tal como sacarosa. Para los fines de esta solicitud, el término "esencialmente igual" indica menos de aproximadamente un 10% de diferencia de un parámetro de la primera solución al mismo parámetro de la segunda solución. Por tanto, "esencialmente igual osmolaridad" significa que el número de partículas por unidad de volumen está dentro de aproximadamente el 10% de una con respecto a la otra, mientras que "esencialmente igual pH" significa unidades de pH dentro de aproximadamente el 10% de la otra (por ejemplo, pH 7,5 y 8,0 serían esencialmente igual pH) y "esencialmente igual capacidad de tampón" significa menos de aproximadamente un 10% de diferencia en la concentración de los componentes de tampón. Para los fines de esta solicitud, "esencialmente igual" y "esencialmente idéntico" son términos intercambiables.
El material polimérico puede ser, por ejemplo, un polímero sintético, biodegradable, tal como poli(ácido láctico-co-glicólico), "PLGA". La razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico en el PLGA puede ser de, por ejemplo, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 4:1 en peso (por ejemplo, de aproximadamente 1:1), y el PLGA puede tener un peso molecular promedio en el intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 6.000 a 100.000.
El estabilizante puede ser un único compuesto o una mezcla de compuestos (por ejemplo, un hidrato de carbono tal como sacarosa y un tampón tal como TRIS-EDTA, "TE"). Alternativa o adicionalmente, el estabilizante puede incluir un lípido. El lípido puede ser, por ejemplo, un lípido catiónico, un lípido aniónico, o un lípido zwitteriónico, o puede no tener carga. Ejemplos de lípidos incluyen bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y fosfolípidos, por ejemplo, fosfatidilcolina. Ejemplos específicos incluyen polietilenglicol diestearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano (CHAPS), ácido taurocólico, ácido glicocólico, ácido cáprico, N-laurilsarcosina, acilcarnitina grasa y vitamina D3. Las micropartículas pueden contener uno o más de un tipo de lípidos, por ejemplo, aquellos lípidos presentes en las preparaciones de lípidos de lecitina, y también pueden incluir uno o más estabilizantes adicionales.
Las micropartículas liofilizadas o deshidratadas por congelación pueden, por ejemplo, tener un nivel de disolvente orgánico residual inferior a aproximadamente 200 ppm (por ejemplo, inferior a 200 ppm, inferior a 150 ppm, inferior a 100 ppm, inferior a 50 ppm, inferior a 20 ppm, o inferior a 10 ppm). Alternativamente, las micropartículas pueden secarse al aire y pueden tener aproximadamente los mismos niveles de disolvente orgánico residual.
En algunas realizaciones, el procedimiento descrito anteriormente también incluye las etapas de: (g) proporcionar un aparato de diafiltración (por ejemplo, incluyendo un sistema de fibra hueca); (h) diluir la suspensión acuosa con una solución de lavado acuosa; (i) suministrar la suspensión acuosa diluida al aparato de diafiltración; y (j) eliminar la solución de deshecho acuosa (es decir, que incluye al menos parte de la solución de lavado de la etapa (h)) de la suspensión acuosa diluida en el aparato de diafiltración, para formar una suspensión acuosa purificada que incluye micropartículas que contienen ácido nucleico. El procedimiento puede incluir adicionalmente algunas o todas las etapas de: lavar la suspensión acuosa purificada para formar una suspensión de micropartículas lavadas; concentrar la suspensión de micropartículas lavadas o la suspensión acuosa purificada en el aparato de diafiltración, para formar un concentrado; y transferir el concentrado en uno o más recipientes. El procedimiento todavía puede incluir además la etapa de: (m) liofilizar, deshidratar por congelación, o secar al aire la suspensión acuosa concentrada en uno o más recipientes, para formar micropartículas liofilizadas, deshidratadas por congelación o secadas al aire. Las etapas (h), (i) y (j) pueden llevarse a cabo opcionalmente a una temperatura de entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC.
En otras realizaciones, el procedimiento descrito anteriormente también incluye las etapas de: (g) poner en contacto la suspensión acuosa con un tamiz de malla fina vibratorio o no vibratorio (por ejemplo, como en un tamiz de acero inoxidable de malla fina contenido en un dispositivo Sweco o un filtro de cartucho); (h) filtrar la suspensión acuosa a través del tamiz para eliminar al menos parte de cada una de las soluciones primera y segunda y para retener las micropartículas en el tamiz; (i) lavar las micropartículas con al menos una solución de lavado acuosa (por ejemplo, agua para inyección "API") para producir micropartículas lavadas; y (j) secar las micropartículas lavadas para producir micropartículas secadas. Opcionalmente, la solución de lavado acuosa puede estar a una temperatura de, por ejemplo, aproximadamente 2ºC a aproximadamente 8ºC. El procedimiento también puede incluir la etapa de poner en contacto las micropartículas lavadas con un vehículo (por ejemplo, antes de la etapa de secado), y/o la etapa de transferir las micropartículas secadas a uno o más recipientes.
En los procedimientos anteriores, la cámara de mezclado puede incluir, por ejemplo, un homogeneizador. El dispositivo de eliminación de disolvente puede ser un biorreactor. La segunda solución acuosa puede suministrarse a la cámara de mezclado con una velocidad de flujo de entre 0,1 y 100 l/min (por ejemplo, de 0,1 a 20 l/min o de 0,1 a
50 l/min).
El disolvente orgánico puede eliminarse de la segunda emulsión en un dispositivo de eliminación de disolvente, por ejemplo, mediante evaporación, mediante calentamiento de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente (por ejemplo, hasta entre 30ºC y 55ºC), mediante un procedimiento de extracción, mediante la aplicación de un vacío parcial al dispositivo de eliminación de disolvente, o cualquier combinación de esos métodos. Alternativa o adicionalmente, la eliminación del disolvente orgánico de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente puede facilitarse mediante la dilución de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de
disolvente.
Para los fines de esta solicitud, un "dispositivo de eliminación de disolvente" es un dispositivo que realiza la eliminación del disolvente de las micropartículas, pero no necesariamente del fluido en el que están suspendidas. Ejemplos de dispositivos de eliminación de disolvente adecuados incluyen un biorreactor, un tanque (por ejemplo, un tanque de endurecimiento), un cartucho de fibras hueco y un dispositivo que contiene las micropartículas y hace que pase agua a través de él (por ejemplo un dispositivo Sweco).
En cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, cada una de las etapas puede llevarse a cabo asépticamente.
En cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, al menos aproximadamente el 50% (por ejemplo, el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o más) del ácido nucleico en las micropartículas puede estar en forma de moléculas de ARN circular o moléculas de ADN circular superenrollado.
El diámetro medio de las partículas puede ser, por ejemplo, inferior a aproximadamente 100 micras (por ejemplo, inferior a 100 micras, inferior a 50 micras, inferior a 20 micras, entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2,5 micras, incluidas, o menor), ya se mida según el promedio en número o el promedio en volumen.
Biodegradable se usa en el presente documento para referirse a los polímeros que se degradan con el tiempo en compuestos no tóxicos que se aclaran de las células huésped mediante rutas metabólicas normales. Generalmente, un polímero biodegradable se metabolizará sustancialmente en un plazo de uno a tres meses tras la inyección al paciente, y se metabolizará de manera esencialmente completa en un plazo de aproximadamente dos años.
Esencialmente idéntica en el contexto de una secuencia de ADN o polipéptido se define en el presente documento para referirse a que difiere en no más de un 25% de una secuencia que se produce en la naturaleza, cuando se realiza la alineación más próxima posible con la secuencia de referencia y en la que las diferencias no afectan de manera adversa a la función deseada del ADN o polipéptido en los métodos de la invención. La frase fragmento de una proteína se usa para indicar alguna parte de una proteína que tiene al menos cuatro residuos de longitud, pero menor que la proteína entera.
La determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se consigue usando el algoritmo de Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, modificado según Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993. Un algoritmo así se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST se realizan dentro del programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas de BLAST se realizan dentro del programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener alineaciones de intervalos para fines de comparación, se utiliza Gapped BLAST tal como se describe por Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997. Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, deben usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
El péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico pueden unirse a una secuencia de selección de diana. El término secuencia de selección de diana se usa de manera intercambiable con secuencia de tráfico y se refiere a una secuencia de aminoácidos que provoca que se transporte un polipéptido al que está fusionada hasta un compartimiento específico de la célula, por ejemplo, el núcleo, el retículo endoplasmático, el aparato de golgi, una vesícula intracelular, un lisosoma, o un endosoma.
En la realización en la que el producto de expresión incluye un péptido que tiene una longitud y una secuencia que le permite unirse a una molécula de CHM de clase I o II, el producto de expresión es normalmente inmunogénico o inmunodepresor. El producto de expresión puede tener una secuencia de aminoácidos que se diferencia en la identidad de secuencia por hasta un 25% de la secuencia de un péptido o proteína que se produce en la naturaleza reconocido por una célula T, siempre que todavía pueda reconocerse por la misma célula T. Tales péptidos variantes pueden funcionar exactamente como la contrapartida que se produce en la naturaleza, o en vez de eso puede actuar mediante la alteración del perfil de citocinas de la célula T (es decir, un "ligando de péptido alterado"). Por ejemplo, las diferencias entre el producto de expresión y el péptido que se produce en la naturaleza pueden diseñarse mediante ingeniería para aumentar la reactividad cruzada frente a cepas virales patógenas, para eliminar o alterar los aminoácidos que proporcionan a la proteína una función indeseable, o para aumentar la unión a alotipo HLA.
Ejemplos de productos de expresión incluyen secuencias de aminoácidos idénticas en al menos un 50% a la secuencia de un fragmento de unión a CHM de clase II de proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP), cadena invariante, GAD65, antígeno de célula de islote, desmogleína, \alpha-cristalina, o \beta-cristalina. La tabla 1 enumera muchas proteínas que se piensa que están implicadas en la enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser esencialmente idénticos a uno cualquiera de las SEQ ID NO: 1-46, tales como residuos 80-102 de MBP (SEQ ID NO: 1), residuos 170-191 de PLP (SEQ ID NO: 2), o residuos 80-124 de cadena invariante (SEQ ID NO: 3). Otros ejemplos de fragmentos se enumeran en la tabla 2.
Alternativamente, el producto de expresión puede incluir una secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica a la secuencia de una parte antígena de cualquiera de los antígenos tumorales enumerados en la tabla 3, tales como los codificados por los genes E1, E2, E6 y E7 del virus del papiloma humano, el gen Her2/neu, el gen de antígeno específico de próstata, el gen del antígeno de melanoma reconocido por las células T (MART), o el gen del antígeno de melanoma (MAGE). De nuevo, el producto de expresión puede diseñarse mediante ingeniería para aumentar la reactividad cruzada.
TABLA 1 Autoantígenos 
\vskip1.000000\baselineskip
Enfermedad Antígeno asociado Notas
Celiaquía a-gliadina a
Síndrome de Goodpasture Colágeno de la membrana basal a
Enfermedad de Graves-Basedow Receptor de la hormona estimulante de tiroides (TSH) a
Enfermedad de Hashimoto Tiroglobulina a
Síndrome de Isaac Canales de potasio dependientes del voltaje b
Diabetes dependiente de la Ácido glutámico descarboxilasa (GAD) a
insulina Receptor de insulina a
Antígeno asociado con la insulina (IA-w) a
Hsp b
Síndrome miasténico de Lambert- Sinaptotagmina en los canales de calcio dependientes
Eaton (LEMS) del voltaje b
Esclerosis múltiple Proteína básica de mielina (MBP) a
Proteína proteolipídica (PLP) a
Proteína asociada con la mielina de los
oligodendrocitos (MOG) a
\alpha\beta-cristalina a
Miastenia grave Receptor de la acetilcolina a
Encefalitis paraneoplásica Proteína HuD de unión a ARN b
Pénfigo común "Complejo de antígeno PeV" a
Desmogleína (DG) c
Cirrosis biliaria primaria Dihidrolipoamida acetiltransferasa b
Complejo 2 de piruvato deshidrogenasa (PDC-E2) d
Esclerosis sistémica progresiva ADN topoisomerasa a
ARN polimerasa a
Artritis reumatoide Colágeno de inmunoglobulina Fc a
Escrelodermia Topoisomerasa I b
Síndrome del hombre rígido Ácido glutámico descarboxilasa (GAD) a
Lupus sistémico eritematoso ds-ADN a
Uveitis Proteína de unión a retinoide interfotoreceptor b
Antígeno S (segmento externo del bastón) b 
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias
a) HLA and Autoinmmune Disease, R. Heard, págs. 123-151 en HLA & Disease, Academic Press, Nueva York, 1994, (R. Lechler, ed.)
b) Cell 80: 7-10 (1995)
c) Cell 67: 869-877 (1991)
d) JEM 181: 1835-1845 (1995)
TABLA 2 Péptidos asociados de clase II 
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido SEQ ID NO: Proteína fuente
GRTQDENPVVHFFKNIVTPRTPP 1 MBP 80-102
AVYVYIYFNTWTTCQFIAFPFK 2 PLP 170-191
FKMRMATPLLMQA 3 Cadena invariante 88-100
TVGLQLIQLINVDEVNQIV
TTNVRLKQQWVDYNLKW 4 Achr \alpha 32-67
QIVTTNVRLKQQWVDYNLKW 5 Achr \alpha 48-67
QWVDYNL 6 Achr \alpha 59-65
GGVKKIHIPSEKIWRPDL 7 Achr \alpha 73-90
AIVKFTKVLLQY 8 Achr \alpha 101-112
WTPPAIFKSYCEIIVTHFPF 9 Achr \alpha 118-137
MKLGTWTYDGSVV 10 Achr \alpha 144-156
MKLGIWTYDGSVV 11 Análogo (1-148) de Achr \alpha 144-157
WTYDGSVVA 12 Achr \alpha 149-157
SCCPDTPYLDITYHFVM 13 Achr \alpha 191-207
DTPYLDITYHFVMQRLPL 14 Achr \alpha 195-212
FIVNVIIPCLLFSFLTGLVFY 15 Achr \alpha 214-234
LLVIVELIPSTSS 16 Achr \alpha 257-269
STHVMPNWVRKVFIDTIPN 17 Achr \alpha 304-322
NWVRKVFIDTIPNIMFFS 18 Achr \alpha 310-327
IPNIMFFSTMKRPSREKQ 19 Achr \alpha 320-337
AAAEWKYVAMVMDHIL 20 Achr \alpha 395-410
IIGTLAVFAGRLIELNQQG 21 Achr \alpha 419-437
GQTIEWIFIDPEAFTENGEW 22 Achr \gamma 165-184
MAHYNRVPALPFPGDPRPYL 23 Achr \gamma 476-495
LNSKIAFKIVSQEPA 24 desmogleina 3 190-204
TPMFLLSRNTGEVRT 25 desmogleina 3 190-204
PLGFFPDHQLDPAFGA 26 HBS preS1 10-25
LGFFPDHQLDPAFGANS 27 HBS preS1 11-27
FFLLTRILTI 28 HBS Ag 19-28
RILTIPQSLD 29 HBS Ag 24-33
TPTLVEVSRNLGK 30 HSA 444-456
AKTIAYDEEARR 31 hsp 65 2-13
VVTVRAERPG 32 hsp 18 61-70
SQRHGSKYLATASTMDHARHG 33 MBP 7-27
RDTGILDSIGRFFGGDRGAP 34 MBP 33-52
QKSHGRTQDENPVVHFFKNI 35 MBP 74-93
DENPVVHFFKNIVT 36 MBP 84-97
ENPVVHFFKNIVTPR 37 MBP 85-99
HFFKNIVTPRTPP 38 MBP 90-102
KGFKGVDAQGTLSK 39 MBP 139-152
VDAQGTLSKIFKLGGRDSRS 40 MBP 144-163
LMQYIDANSKFIGITELKK 41 Toxoide tetánico 828-846
QYIKANSKFIGIT 42 Toxoide tetánico 830-842
FNNFTVSFWLRVPK 43 Toxoide tetánico 947-960
SFWLRVPKVSASHLE 44 Toxoide tetánico 953-967
KFIIKRYTPNNEIDSF 45 Toxoide tetánico 1174-1189
GQIGNDPNRDIL 46 Toxoide tetánico 1273-1284
TABLA 3 Antígenos tumorales
Cáncer Antígeno asociado
Melanoma BAGE 2-10
Mama/ovario c.ERB2 (Her2/neu)
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBNA-1
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBNA-2
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBNA-3
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBNA-3A
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBNA-3C
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBNA-4
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBNA-6
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBV
Linfoma de Burkitt/linfoma de Hodgkin EBV LMP2A
Melanoma GAGE-1
Melanoma/carcinoma de célula renal /glioma gp75/TRP1
Cervical VPH 16 E6
Cervical VPH 16 E7
Cervical VPH 18 E6
Cervical VPH 18 E7
Melanoma MAG
Melanoma MAGE-1
Melanoma MAGE-2
Melanoma MAGE-3
Melanoma MAGE-4b
Melanoma MAGE-5
Melanoma MAGE-6
Melanoma MART-1/Melan-A
Páncreas/mama/ovario MUC-1
Melanoma MUM-1-B
Mama/colorectal/linfoma de Burkitt p53
Melanoma Pmel 17 (gp 100)
Próstata PSA (antígeno específico de la proteasa)
Melanoma/mama/glioma Tirosinasa
Colorectal/gástrico/páncreas/mama/pulmón CEA (antígeno carcinoembrionico)
Pulmón LRP (proteína de resistencia pulmonar)
Pulmón/colorectal/próstata hCG
Múltiple IGFR-1
Melanoma/cabeza/cuello/carcinoma de célula renal NY-ESO-1
Pulmón/ovario/vejiga/próstata MAGE-A3
>85% de los cánceres humanos hTERT
Mama/glioma/gástrico/ovario/célula escamosa EGFR
Colorectal/gástrico/ovario/osteosarcoma CD55
Mama/ovario/próstata/páncreas/vejiga Her-2
Próstata PAP
TABLA 4 Péptidos de patógenos y tumores asociados de clase I
Péptido SEQ ID NO: Proteína fuente
AARAVFLAL 47 BAGE-2
YRPRPRRY 48 GAGE-1 9-16
EADPTGHSY 49 MAGE-1 161-169
SAYGEPRKL 50 MAGE-1 230-238
EVDPIGHLY 51 MAGE-3 161-169
FLWGPRALV 52 MAGE-3 271-279
GIGILTV 53 MART-1 29-35
ILTVILGV 54 MART-1 32-39
STAPPAHGV 55 MUC-1 9-17
EEKLIVVLF 56 MUM-1 261-269
MLLAVLYCL 57 TIROSINASA 1-9
SEIWRDIDF 58 TIROSINASA 192-200
AFLPWHRLF 59 TIROSINASA 206-2147
YMNGTMSQV 60 TIROSINASA 369-376
YMNGTMSQV 61 PMEL 17 (GP100) 154-162
ITDQVPFSV 62 PMEL 17 (GP100) 209-217
YLEPGPTVA 63 PMEL 17 (GP100) 280-288
LLDGTATLRL 64 PMEL 17 (GP100) 476-485
ELNEALELEK 65 p53 343-351
STPPPGTRV 66 p53 149-157
LLPENNVLSPL 67 p53 25-35
LLGRNSFEV 68 p53 264-272
RMPEAAPPV 69 p53 65-73
KIFGSLAFL 70 HER-2/neu 369-377
IISAVVGIL 71 HER-2/neu 654-662
CLTSTVQLV 72 HER-2/neu 789-797
YLEDVRLV 73 HER-2/neu 835-842
VLVKSPNHV 74 HER-2/neu 851-859
RFRELVSEFSRM 75 HER-2/neu 968-979
RFRELVSEFSRM 76 PSA 119-128
DLPTQEPAL 77 PSA 136-144
KLQCVD 78 PSA 166-171
VLVASRGRAV 79 PSA 36-45
VLVHPQWVL 80 PSA 49-57
DMSLLKNRFL 81 PSA 98-107
QWNSTAFHQ 82 Envuelta HBV 212-130
VLQAGFF 83 Envuelta HBV 177-184
LLLCLIFL 84 Envuelta HBV 250-257
LLDYQGML 85 Envuelta HBV 260-267
LLVPFV 86 Envuelta HBV 338-343
SILSPFMPLL 87 Envuelta HBV 370-379
PLLPIFFCL 88 Envuelta HBV 377-385
ILSTLPETTV 89 Núcleo HBV 529-538
FLPSDFFPSV 90 Núcleo 47-56
KLHLYSHPI 91 HBV polimerasa 489-498
ALMPLYACI 92 HBV polimerasa 642-651
HLYSHPIIL 93 HBV polimerasa 1076-1084
FLLSLGIHL 94 HBV polimerasa 1147-1153
HLLVGSSGL 95 HBV polimerasa 43-51
GLSRYVARL 96 HBV polimerasa 455-463
LLAQFTSAI 97 HBV polimerasa 527-535
TABLA 4 (continuación)
Péptido SEQ ID NO: Proteína fuente
YMDDVVLGA 98 HBV polimerasa 551-559
GLYSSTVPV 99 HBV polimerasa 61-69
NLSWL 100 HBV polimerasa 996-1000
KLPQLCTEL 101 VPH 16 E6 18-26
LQTTIHDII 102 VPH 16 E6 26-34
FAFRDLCIV 103 VPH 16 E6 52-60
YMLDLQPET 104 VPH 16 E7 11-19
TLHEYMLDL 105 VPH 16 E7 7-15
LLMGTLGIV 106 VPH 16 E7 82-90
TLGIVCPI 107 VPH 16 E7 86-93
LLMGTLGIVCPI 108 VPH 16 E7 82-93
LLMGTLGIVCPICSQK 109 VPH 16 E7 82-97 
\vskip1.000000\baselineskip
Todavía en otros casos, el producto de expresión incluye una secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica a la secuencia de un fragmento antigénico de una proteína expresada de manera natural por un virus, por ejemplo, un virus que infecta células de manera crónica, tal como el virus del papiloma humano (VPH), virus de inmunodeficiencia humano (VIH), virus del herpes simple (HSV), virus de la hepatitis B (HBV), o virus de la hepatitis C (HCV); una bacteria, tal como microbacteria o Helicobacter pylori; un hongo tal como especies de Candida, Aspergillus, Cryptococcus o Histoplasmosis, u otras eucariotas tales como una especie de Plasmodium. Una lista representativa de tales fragmentos de unión a clase I así como fragmentos de antígenos tumorales se incluye en la tabla 4. Los fragmentos de unión a CHM (de clase I o clase II) pueden codificarse como parte de un compuesto politopo más grande del tipo descrito en los documentos USSN 09/398.534 y USSN 60/154.665.
El ácido nucleico en las micropartículas descritas en el presente documento puede distribuirse o bien a lo largo de la micropartícula, o bien en un pequeño número de regiones diferenciadas dentro de la micropartícula. Alternativamente, el ácido nucleico puede estar en el núcleo de una micropartícula de núcleo hueco. Preferiblemente, la micropartícula no contiene una célula (por ejemplo, una célula bacteriana), ni un genoma que se produce en la naturaleza de una célula.
Las micropartículas también pueden incluir un estabilizante. Un estabilizante es un compuesto o compuestos que actúan para proteger el ácido nucleico (por ejemplo, para mantenerlo superenrollado o protegerlo frente a la degradación) en algún momento durante la producción y/o almacenamiento de las micropartículas. Ejemplos de estabilizantes incluyen hidratos de carbono tales como dextrosa, sacarosa, y trehalosa; poli(alcohol vinílico); ciclodextrina; dextrano; sulfato de dextrano; compuestos catiónicos tales como péptidos catiónicos; agentes de tamponamiento tales como TRIS, PBS, y MOPS; agentes quelatantes tales como EDTA y EGTA; inhibidores de la DNasa; compuestos plurónicos, por ejemplo, Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO); y lípidos tales como CHAPS, PEG, DSPE, ácido taurocólico, ácido glicocólico, acilcarnitina grasa, N-laurilsarcosina, ácido cáprico, vitamina D3, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, QS21, saponina purificada, o polimixina B.
Los estabilizantes también pueden ser modificadores de la liberación tales como hidratos de carbono, compuestos catiónicos, compuestos plurónicos, lípidos (por ejemplo, lípidos desestabilizantes de membrana), proteínas, sales, péptidos, tensioactivos, y pequeñas moléculas. El estabilizante puede permanecer asociado con el ADN después de que éste último se libere de la matriz polimérica. Además, aunque el término "estabilizante" se usa en forma singular, debe entenderse que se refiere también a mezclas de dos o más compuestos (por ejemplo, un hidrato de carbono y un tampón, o un hidrato de carbono, un tampón y un lípido).
Entre las ventajas de la invención se encuentra que proporciona un procedimiento económico, aséptico y dimensionable para producir una micropartícula en cantidades necesarias para usos de investigación, clínicos y otros usos comerciales. Una micropartícula producida usando estos procedimientos contiene ácido nucleico estable, activo, potente, estructuralmente intacto, por ejemplo, como ADN superenrollado. El método también proporciona una encapsulación eficiente del ácido nucleico en la micropartícula y permite la recuperación eficiente de la micropartícula.
Otra ventaja de la invención es que proporciona micropartículas que están sustancialmente libres de impurezas, tales como disolventes orgánicos usados para preparar la micropartícula. Por tanto, las micropartículas son adecuadas para la administración por vía oral, rectal, vaginal, intranasal, intraaerial, intravenosa, pulmonar, intramuscular, intradérmica, transmucosal, intratecal, intraperitoneal, transdérmica, subdérmica o subcutánea.
Todavía otra ventaja de la invención es el control proporcionado sobre el tamaño de micropartícula, que coincide con la producción dimensionable y reproducible a gran escala de micropartículas. El tamaño de micropartícula puede ser importante por una variedad de motivos, incluyendo la administración a un sitio diana particular (por ejemplo, los pulmones mediante inhalación), la captación por vía intravenosa por células fagocíticas, y la estabilidad de la suspensión farmacéutica durante el almacenamiento y tratamiento. Además, las micropartículas de la invención pueden liofilizarse, secarse usando un dispositivo Sweco (Emerson Electric Co., Florencia, KY), o almacenarse como un líquido congelado. Puede conseguirse secar las micropartículas tal como se describe en el documento US 6.080.429. Las micropartículas preparadas de esta manera se vuelven a suspender fácilmente en un amplio intervalo de agentes dispersantes.
Las micropartículas pueden administrarse a un animal (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano, primate no humano, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, perro, gato, ratón, rata, cobaya, conejo, hámster, o hurón). Las micropartículas pueden proporcionarse suspendidas en una solución acuosa o cualquier otra formulación adecuada, y puede, por ejemplo, administrarse por vía oral, vaginal, rectal, nasal, bucal, o mediante inhalación, o inyectarse o implantarse (por ejemplo, quirúrgicamente) en el animal. Pueden administrarse opcionalmente junto con una proteína tal como una citocina o interferón, un antígeno, un lípido, un adyuvante, o excipientes que pueden estar dentro o fuera de la micropartícula.
Otras características y ventajas de la invención resultarán claras a partir de lo siguiente.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de un sistema para preparar micropartículas que contienen ácido nucleico según la invención.
Descripción de las realizaciones preferidas
Las micropartículas de la invención se formulan de modo que conserven la integridad del ácido nucleico. Para ADN de plásmido, esto significa maximizar el porcentaje de moléculas de plásmido que están superenrolladas y por tanto son más estables que los plásmidos no superenrollados (es decir, cortados o lineales) (Middaugh et al., J Pharm Sci. 87: 130, 1998).
El ácido nucleico puede ser ARN o ADN, o cualquier derivado conocido de ADN (por ejemplo, derivados de fosforotiolato y similares usados normalmente en aplicaciones antisentido). En algunas realizaciones, al menos el 50% (y preferiblemente al menos el 70% o incluso el 80%) del ácido nucleico está en forma de círculos cerrados. El ácido nucleico puede ser una molécula lineal o circular, y por tanto puede ser, por ejemplo, un plásmido, o puede incluir un genoma viral, o parte de un genoma viral. Cuando es circular y de doble cadena, puede estar cortado, es decir, en un círculo abierto, o superenrollado. En algunas realizaciones los ácidos nucleicos son moléculas de plásmido, de las cuales al menos el 25% (y preferiblemente al menos el 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o incluso el 90% o más) están superenrolladas.
La invención no se restringe a la fabricación de una micropartícula que tiene un tipo particular de ácido nucleico. Puede usarse cualquier tipo de ácido nucleico. Ejemplos incluyen ADN que sirve como plantilla para la expresión de ARN antisentido o una ribozima, ácidos nucleicos que codifican para una proteína o péptido útil, y ácido nucleicos que producen ellos mismos el efecto deseado, tales como ARN o ADN antisentido, poli I:C, ADN de BCG, oligonucleótidos, y ADN que tiene potencial inmunomodulador (por ejemplo, motivos de CpG).
El ácido nucleico puede codificar para un péptido o polipéptido que module, por ejemplo, provoca, potencia, altera, o suprime, una respuesta inmunitaria mediada por células o humoral. Cuando se desea la modulación de las respuestas inmunitarias mediadas por células, el producto codificado puede ser o incluir, por ejemplo, un péptido o polipéptido de unión a CHM de clase I o a CHM de clase II. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican para proteínas o polipéptidos que provocan respuestas inmunitarias se describen en los documentos WO 95/23738; WO 97/17063; patente de los EE.UU número 5.880.103; Jones et al., Vaccine 15:814, 1997; Chen et al., J. Virology 72: 5757, 1998; Mathowitz et al., Nature 386: 41, 1997; Jong et al., J Controlled Release 47: 123, 1997; y Hedley et al., Nature Med 4: 365, 1998, los documentos USSN 09/398.534 y USSN 60/154.665.
El ácido nucleico puede producir alternativamente una respuesta inmunitaria no específica. Un ejemplo de un ácido nucleico así es poli I:C (es decir, ácido nucleico de doble cadena de poliinosina:policitosina), que incluye una respuesta a interferón (véase, por ejemplo, el documento EP A-0248 531). Otro ejemplo son los CpG-oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes, que actúan como adyuvantes para las respuestas de Th1 y las respuestas de las células T citotóxicas frente a antígenos proteínicos (Sparwasser et al., Eur. J. Immunol. 28: 2045, 1998). Otro ejemplo lo proporciona el ácido nucleico que codifica para un polipéptido que regula las células inmunitarias (por ejemplo, células T).
Los ácidos nucleicos también pueden incluir oligonucleótidos que modulan la expresión de los genes, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido descritos por Lewis et al., J. Controlled Release 37: 173, 1995.
La precipitación en alcohol del ácido nucleico antes de la solución en la solución acuosa puede mejorar la eficiencia de la encapsulación. La precipitación con etanol puede dar como resultado un aumento de hasta el 147% de ADN incorporado, y la precipitación con isopropanol hasta el 170% (véase, por ejemplo, el documento PCT US 98/01499).
La naturaleza de la solución acuosa puede afectar al rendimiento del ADN supernerollado o encapsulado. Por ejemplo, la adición de soluciones tampón que contienen ya sea tris(hidroximetil)-aminometano (TRIS), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , o una combinación de TRIS y EDTA (TE), da como resultado la estabilización de ADN de plásmido superenrollado, según el análisis mediante electroforesis de gel. Además, un pH relativamente alto (por ejemplo, de 8,0 a 9,9) también tiene un efecto estabilizante. Ciertos compuestos, tales como sulfato de dextrano, dextrosa, dextrano, CTAB, poli(alcohol vinílico), trehalosa, lípidos, ciclodextrina, y sacarosa, pueden potenciar la estabilidad y el grado de superenrollamiento del ADN, ya sea solos o en combinación con el tampón TE. Los estabilizantes tales como lípidos e hidratos de carbono también pueden aumentar la cantidad global de ADN encapsulado en las micropartículas. Las combinaciones de estabilizantes pueden usarse para aumentar la cantidad de ADN encapsulado, superenrollado. Los estabilizantes tales como lípidos cargados (por ejemplo, CTAB), péptidos catiónicos, o dendrimeros (J. Controlled Release, 39: 357, 1996) pueden condensar o precipitar el ácido nucleico (por ejemplo, ADN). Además, los estabilizantes pueden tener un efecto sobre la naturaleza física de las partículas formadas durante el procedimiento de encapsulación. Por ejemplo, la presencia de azúcares, lípidos, o tensioactivos durante el procedimiento de encapsulación puede generar partículas porosas o huecas con estructuras interiores o exteriores porosas, permitiendo una salida más rápida de un fármaco desde la partícula, en vez de una liberación controlada lenta a lo largo de varios días o meses. Los estabilizantes pueden actuar en cualquier momento durante la preparación de las micropartículas (por ejemplo, durante la encapsulación o la liofilización, o ambas) o durante la degradación del polímero in vivo.
Las micropartículas de la invención se formulan generalmente de una de dos maneras: (1) para maximizar la administración dentro de las células fagocíticas del paciente, o (2) para formar un depósito en los tejidos del paciente, desde el que se libera el ácido nucleico de manera gradual con el tiempo; con la liberación desde el depósito, las células cercanas toman el ácido nucleico (incluyendo células presentadoras de antígeno, o CPA). En ambos casos, el conservar la integridad del ADN es una prioridad. Para ADN de plásmido, esto significa maximizar el porcentaje de moléculas de plásmido que están superenrolladas y que pueden tener capacidad para una transfección y transcripción más eficiente que plásmidos no superenrollados (por ejemplo, cortados o lineales). Maximizar el porcentaje de moléculas de plásmido superenrolladas también puede aumentar la estabilidad del ADN en la célula o micropartícula, así como el término de caducidad de las micropartículas que contienen ácido nucleico.
Los medios para proteger la integridad del ácido nucleico incluyen minimizar las fuerzas de cizallamiento a las que está necesariamente expuesto el ácido nucleico en el procedimiento de formación de micropartículas, limitar el tiempo de sonicación, homogeneización, microfluidificación, u otros tiempos de mezclado durante la preparación, controlar la liofilización, secado, o endurecimiento, añadir tampones u otros estabilizantes durante la preparación de micropartículas, y limitar el tiempo durante el que está expuesto el ácido nucleico a temperaturas elevadas (por ejemplo, limitar la exposición a temperaturas superiores a aproximadamente 39ºC a menos de aproximadamente una hora). Por ejemplo, es deseable alcanzar un equilibrio entre el tiempo y la intensidad de homogeneización lo que minimiza el cizallamiento pero produce el tamaño de micropartículas deseado con una eficiencia de encapsulación aceptable (es decir, una eficiencia de encapsulación \geq25% del ácido nucleico). Estas técnicas se discuten a continuación.
Las micropartículas de la invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, por ejemplo, de cáncer, enfermedad infecciosa, cualquiera de las enfermedades autoinmunitarias enumeradas en la tabla 1, o cualquier otro estado que pueda tratarse con un ácido nucleico particular definido.
La fagocitosis de micropartículas por los macrófagos, células dendríticas, y otras CPA es un medio eficaz para introducir el ácido nucleico en estas células. La fagocitosis por estas células puede aumentarse mediante la conservación del tamaño de partícula inferior a aproximadamente 20 \mum, preferiblemente inferior a aproximadamente 11 \mum, y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 5 \mum. El tipo de polímero usado en la micropartícula también puede afectar a la eficiencia de la captación por células fagocíticas, tal como se trata a continuación.
Las micropartículas pueden administrarse directamente al torrente circulatorio (es decir, mediante inyección o infusión intravenosa o intraarterial) cuando se desea la captación por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial (RES). Alternativamente, las micropartículas pueden administrarse por vía oral (por ejemplo, a las placas de Peyers o nódulos linfoides mesentéricos, por vía mucosal, nasal, bucal, vaginal, rectal o intralesional). Las micropartículas también pueden administrarse mediante inyección subcutánea para facilitar la captación por las células fagocíticas de los nódulos linfoides de drenaje. Alternativamente, las micropartículas pueden introducirse por vía intradérmica (es decir, a las CPA de la piel, tales como células dendríticas y células de Langerhans) o por vía intramuscular. Finalmente, las micropartículas pueden introducirse en el pulmón (por ejemplo, mediante inhalación de micropartículas en polvo o de una solución o suspensión atomizada o pulverizada que contiene las micropartículas), en la que los macrófagos alveolares toman las partículas.
Una vez que una célula fagocítica fagocita la micropartícula, el ácido nucleico se libera en el interior de la célula. Con la liberación, puede realizar su función prevista: por ejemplo, la expresión por una maquinaria de transcripción/traducción celular normal (para un vector de expresión), o la alteración de procedimientos celulares (para moléculas antisentido o ribozimas, o ácidos nucleicos que contienen CpG o poli I:C).
Debido a que estas micropartículas están dirigidas pasivamente hacia macrófagos y otros tipos de células fagocíticas y CPA profesionales, representan un medio para modular la función inmunitaria. Los macrófagos y células dendríticas sirven como CPA profesionales, expresando moléculas de CHM tanto de clase I como de clase II. Además, el efecto mitógeno del ADN puede usarse para estimular respuestas inmunitarias no específicas mediadas por células B, T y NK; macrófagos; y otras células.
La administración, mediante micropartículas, de un vector de expresión que codifica para un antígeno extraño que se une a una molécula de CHM de clase I o clase II inducirá una respuesta en célula T huésped frente al antígeno, confiriendo así inmunidad al huésped.
Cuando el vector de expresión codifica para un péptido bloqueante (véase, por ejemplo, el documento WO 94/
04171) que se une a una molécula de CHM de clase II implicada en la autoinmunidad, se evita la presentación del propio péptido asociado con la enfermedad autoinmunitaria por la molécula de clase I, y se alivian los síntomas de la enfermedad autoinmunitaria.
En otro ejemplo, un péptido de unión a CHM que es idéntico o casi idéntico a un péptido que induce autoinmunidad puede afectar a la función de la célula T induciendo tolerancia o anergia a la célula T. Alternativamente, podría diseñarse el péptido para modular la función de la célula T mediante la alteración de los perfiles de secreción de citocina tras el reconocimiento del complejo CHM/péptido. Los péptidos reconocidos por las células T pueden inducir la secreción de citocinas lo que provoca que las células B produzcan anticuerpos de una clase particular, induce la inflamación, y además estimula respuestas de la célula T huésped.
La inducción de respuestas inmunitarias, por ejemplo, respuestas de anticuerpo específicas frente a péptidos o proteínas, puede requerir diversos factores. Esta naturaleza de múltiples factores es lo que proporciona el impulso para los intentos para manipular células inmunorelacionadas en múltiples frentes, usando las micropartículas de la invención. Por ejemplo, pueden prepararse micropartículas que llevan tanto ADN como péptidos, polipéptidos y/o adyuvantes dentro de cada micropartícula; alternativamente, pueden prepararse lotes separados de micropartículas cada uno de los cuales sólo lleva una de estas sustancias, y luego se mezclan. Estas micropartículas de función dual se tratan a continuación.
Respuestas de CTL
Las moléculas de clase I presentan péptidos antigénicos frente a células T inmaduras. Para activar completamente las células T, se requieren otros factores distintos del péptido antigénico. Las proteínas no específicas tales como interleucina-2 (IL-2), IL-12, e interferón gamma (\gamma-IFN) estimulan respuestas de CTL y pueden proporcionarse junto con ADN que codifica para péptidos lo que incluye epítopos de CTL. Alternativamente, pueden incluirse proteínas que llevan determinantes de T cooperador (Th) con el ADN que codifica para el epítopo o los epítopos de CTL. Los epítopos T cooperadores estimulan la secreción de citocinas de células T cooperadoras y desempeñan un papel en la diferenciación de células T nacientes en CTL.
Alternativamente, podrían incluirse péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, o adyuvantes que estimulan la migración, diferenciación, o proliferación de linfocitos y macrófagos hacia una zona en particular en las micropartículas, junto con las moléculas de ADN apropiadas. Como resultado, se potencia la captación de ADN, ya que la liberación de la proteína provocará un influjo de células fagocíticas y células T a medida que se degrada la micropartícula. Los macrófagos fagocitarán las micropartículas restantes y actuarán como CPA, y las células T se volverán células efectoras.
Respuestas de anticuerpos
La eliminación de ciertos agentes infecciosos del huésped puede requerir respuestas tanto de CTL como de anticuerpos. Por ejemplo, cuando el virus influenza entra en un huésped, a menudo los anticuerpos pueden evitar que infecte a las células huésped. Sin embargo, si las células se infectan, entonces se requiere una respuesta de CTL para eliminar a las células infectadas y evitar la producción continuada de virus dentro del huésped.
En general, las respuestas de anticuerpos están dirigidas frente a determinantes conformacionales y por tanto requieren la presencia de una proteína o fragmento de proteína que contiene dicho determinante. Al contrario, los epítopos de células T son determinantes lineales, normalmente de sólo 7-25 residuos de longitud. Por tanto, cuando se necesita inducir una respuesta tanto de CTL como una de anticuerpos, las micropartículas pueden incluir tanto una proteína antígena como el ADN que codifica para un epítopo de célula T. La liberación lenta de la proteína desde las micropartículas fuera de la célula conduciría al reconocimiento de la célula B y posterior secreción del anticuerpo, mientras que la fagocitosis de las micropartículas provocaría que las CPA (1) expresen el ADN de interés, generando así una respuesta de célula T; y (2) digieran la proteína liberada de las micropartículas, generando así péptidos que se presentan posteriormente por moléculas de clase I o de II. La presentación por moléculas de clase I o II estimula las respuestas tanto de anticuerpos como de CTL, ya que las células T cooperadoras activadas por los complejos clase II/péptido secretarán citocinas no específicas.
Micropartículas para su implantación
Una segunda formulación de micropartículas de la invención se prevé no para su captación directa por células, sino en vez de eso para servir en primer lugar como depósito de liberación lenta de ácido nucleico que sólo se capta por las células con su liberación de la micropartícula. La liberación puede producirse, por ejemplo, mediante degradación, erosión o difusión. El ácido nucleico puede complejarse a un estabilizante, por ejemplo, para conservar la integridad del ácido nucleico durante el procedimiento de liberación lenta. Por tanto, las partículas poliméricas en esta realización deben ser lo bastante grandes como para minimizar el grado de fagocitosis (es decir, superiores a 5 \mum y preferiblemente superiores a 20 \mum). Tales partículas se producen mediante los métodos descritos para hacer las partículas más pequeñas, pero con un mezclado menos enérgico. Es decir, una velocidad de homogeneización menor puede usarse para obtener partículas que tienen un diámetro de aproximadamente 100 \mum en vez de 5 \mum. El tiempo de mezclado, la viscosidad de la primera emulsión, y la concentración del polímero en la primera solución también pueden alterarse para afectar a la dimensión de partícula.
Las micropartículas más grandes pueden formularse como una suspensión, un polvo, o un sólido implantable, para administrarse mediante inyección intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal; mediante inhalación (vía intrapulmonar); por vía oral, por ejemplo, en forma de un comprimido; por vía intranasal o mediante implantación. Estas partículas son útiles para la administración de cualquier vector de expresión u otro ácido nucleico para el que se desea una liberación lenta a lo largo de un plazo relativamente largo, por ejemplo, una molécula antisentido, un agente terapéutico de sustitución de gen, un medio para administrar un agente terapéutico basado en citocina, basado en antígeno, o basado en hormonas terapéuticas, o un agente inmunosupresor. La velocidad de degradación, y en consecuencia de liberación, varía con la formulación polimérica. Este parámetro puede usarse para controlar la función inmunitaria. Por ejemplo, puede quererse una liberación relativamente lenta para la administración de IL-4 o IL-10, y una liberación relativamente rápida para la administración de IL-2 o \gamma-IFN.
Composición de partículas poliméricas
Se obtiene material polimérico a partir de fuentes comerciales o puede prepararse mediante métodos conocidos. Por ejemplo, pueden generarse polímeros de ácido láctico y glicólico tal como se describe en la patente de los EE.UU número 4.293.539 o comprarse a partir de una fuente comercial tal como Aldrich Chemicals, Brimingham Polymers, o Boehringer Ingelheim. Un polímero adecuado es poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) , con una razón de ácido láctico/glicólico de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 4:1 (por ejemplo, 50:50, 65:35, o 75:25).
Alternativamente, o además de ello, la matriz polimérica puede incluir uno cualquiera o más de polilactida, poliglicólido, polianhídrido, poliortoéster, policaprolactona, polifosfaceno, polipéptido, poliéster, o polímeros que se producen en la naturaleza tales como alginato, quitosano, y gelatina.
Las sustancias de liberación controlada preferidas que son útiles en las formulaciones de la invención incluyen los polianhídridos, copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico en los que la razón de peso de ácido láctico con respecto a ácido glicólico no es superior a 4:1, y poliortoésteres que contienen un catalizador potenciador de la degradación, tal como un anhídrido, por ejemplo, anhídrido maléico al 1%. Ya que el poli(ácido láctico) puede tardar al menos un año en degradarse in vivo, este polímero debe utilizarse en sí mismo sólo en circunstancias en las que se desea una degradación sostenida.
En algunos casos, la matriz polimérica también incluye una molécula de selección de diana tal como un ligando, receptor, o anticuerpo, para aumentar la especificidad de la micropartícula por un tipo de célula o un tipo de tejido dado.
Preparación de micropartículas
Se preparan las micropartículas mediante la preparación de una primera emulsión (es decir, mediante un procedimiento discontinuo o un procedimiento en flujo continuo) a partir de una solución acuosa que contiene un ácido nucleico y una solución que contienen un material polimérico disuelto en un disolvente orgánico (por ejemplo, diclorometano, fenol, cloroformo, o acetato de etilo), y luego la combinación de la primera emulsión con una segunda solución acuosa que contiene tensioactivo (por ejemplo, una solución de poli(alcohol vinílico), PVA; ácido oleico; TWEEN®; SPAN®; polivinilpirrolidona, PVP; otros agentes tensioactivos) para producir una segunda emulsión a partir de la cual se aíslan las micropartículas. Entonces se purifican las micropartículas y opcionalmente se concentran, por ejemplo, mediante diafiltración o usando un dispositivo Sweco^{TM} (Emerson Electric Co., Florencia, KY).
La diafiltración es un procedimiento mediante el cual pueden separarse partículas y solutos de peso molecular relativamente alto de solutos de peso molecular relativamente bajo, cuando ambos están presentes en la misma suspensión. Se diluye la suspensión con disolvente (por ejemplo, agua) y se hace pasar a través de una membrana de fibra hueca, separando mediante lavados los solutos de peso molecular relativamente bajo del material retenido. En los métodos presentes, puede usarse la diafiltración para eliminar los tensioactivos (por ejemplo, PVA), estabilizantes (por ejemplo, sacarosa), y tampones (por ejemplo, TE) en exceso de las micropartículas.
Pueden usarse dispositivos Sweco tales como el secador de filtros PharmASep Filter-Dryer^{TM} (Emerson Electric Co., Florencia, KY) en lugar de la diafiltración. Se bombea una suspensión acuosa espesa de las micropartículas dentro del dispositivo Sweco para su purificación. A medida que el líquido pasa a través del dispositivo, las micropartículas sólidas se retienen por un tamiz de malla fina vibratorio. Pueden lavarse las micropartículas con agua para inyección para eliminar los contaminantes solubles (por ejemplo, PVA, sacarosa). Opcionalmente, también pueden recubrirse las micropartículas con un excipiente en el dispositivo (es decir, mediante el lavado con una solución del excipiente). Ejemplos de excipientes son PEG, carboximetilcelulosa, sorbitol, TWEEN, y manitol. Entonces se hace pasar un flujo de aire estéril o nitrógeno a través del dispositivo para secar las micropartículas. Se descargan las micropartículas secas, en forma de polvo, a través de un orificio de salida dentro de un recipiente estéril receptor. Entonces se usa augur en polvo para llevar el polvo hasta un tubo a una velocidad medida y dentro de viales individuales. Alternativamente, pueden lavarse las micropartículas para eliminar disolvente, concentrarse usando un dispositivo de tamiz de malla de acero inoxidable vibratorio o no vibratorio, y luego secarse (por ejemplo, en un liofilizador).
En el procedimiento de la invención, se bombean la primera emulsión y la solución que contiene tensioactivo dentro de una cámara de mezclado, que incluye, por ejemplo, un microfluidificador (por ejemplo, tal como está disponible de Microfluidics, Newton, MA), una prensa French (por ejemplo, tal como está disponible de Microfluidics o Gaulin-APV), un homogeneizador mecánico (por ejemplo, tal como está disponible de Silverson, VirTis, o Ika Works), o un emulsionante ultrasónico (por ejemplo, tal como está disponible de Branson Ultrasonics Corporation o VirTis). En la cámara de mezclado, se mezclan la primera emulsión y la solución que contiene tensioactivo para formar una segunda emulsión. Opcionalmente, la solución que contiene tensioactivo puede incluir un estabilizante, tal como un modulador de la liberación de ácido nucleico, un tampón, un hidrato de carbono o un lípido. Es importante que la segunda solución acuosa tenga una osmolaridad, pH, y capacidad de tamponamiento esencialmente idénticas a la de la primera solución acuosa para minimizar la pérdida de ácido nucleico en la fase acuosa de la segunda emulsión.
A medida que se bombean la primera emulsión u solución que contiene tensioactivo hacia la cámara de mezclado, la segunda emulsión puede bombearse continuamente fuera de la cámara de mezclado hacia el dispositivo de eliminación de disolvente. El dispositivo de eliminación de disolvente puede ser cualquier recipiente (por ejemplo, un recipiente cerrado) que puede esterilizarse. Ejemplos de dispositivos de eliminación de disolvente adecuados incluyen recipientes a presión farmacéuticos (por ejemplo, tal como está disponible de Eagle Stainless Container, Alloy Products Corporation, DCI Inc., Walker Stainless Equipment), biorreactores/fermentadores (por ejemplo, tal como está disponible de Applikon, New Brunswick, Chemap, B. Braun y LH), y dispositivos de membrana de fibra hueca. En el dispositivo de eliminación de disolvente, se elimina el disolvente orgánico (por ejemplo, mediante evaporación con calentamiento (por ejemplo, de 30-55ºC) o aplicación de vacío; mediante extracción, mediante adición de un alcohol tal como isopropanol o etanol; mediante dilución con agua, o usando membranas de fibras huecas.
Durante la eliminación del disolvente orgánico, las micropartículas que contienen ácido nucleico encapsulado en una matriz o carcasa polimérica precipitan de la emulsión, formando una suspensión. Tras la eliminación del disolvente orgánico, la suspensión que contiene micropartículas puede eliminarse continuamente del dispositivo de eliminación de disolvente hacia un depósito de filtración o lavado. Se diluye el contenido del depósito con una solución de lavado acuosa (por ejemplo, agua) y se bombea hacia un aparato de filtración (por ejemplo, un aparato de diafiltración). Se elimina la solución acuosa del aparato, dejando atrás las micropartículas. La solución eliminada incluye, por ejemplo, cualquier tensioactivo en exceso que no está incorporado en las micropartículas. Puede concentrarse la suspensión de micropartículas mediante la eliminación de la solución acuosa del aparato de filtración a una velocidad superior a la que se introduce por bombeo la solución de lavado, o mediante la detención total del flujo de entrada de la solución de lavado. La solución final, concentrada, puede contener excipientes tales como manitol, PEG, carboximetilcelulosa, sorbitol y TWEEN. Puede prepararse alícuotas de la solución en viales de dosis única. Congelar y liofilizar la suspensión de micropartículas filtrada en un vial de dosis única da como resultado una preparación seca de fácil almacenamiento. Alternativamente, puede bombearse la solución que contiene las partículas sobre un tamiz de malla fina tal como un dispositivo Sweco para el lavado y secado. El tamiz permitirá que pase la solución acuosa a través mientras que retendrá las partículas. Se secarán las partículas lavadas sobre una unidad Sweco haciendo pasar aire estéril sobre las partículas. Se eliminarán estas partículas de la unidad Sweco en un recipiente colector. Desde aquí, pueden prepararse alícuotas de las partículas en viales de dosis única mediante un tornillo giratorio que deposita una cantidad predeterminada de partículas en cada vial. Entonces se sellarán los viales para su almacenamiento. También pueden retenerse las partículas en un dispositivo Sweco para su lavado, y entonces se secan en un liofilizador antes de preparar alícuotas en viales de dosis única.
Es importante generar micropartículas con muy poco disolvente orgánico residual, de modo que las partículas sean adecuadas para su uso en animales. La cantidad de disolvente orgánico residual en las partículas secadas o liofilizadas es preferiblemente inferior a 200 ppm, y más preferiblemente inferior a 50 ppm.
También es importante que se preparen las partículas de una manera aséptica (por ejemplo, tal como se define en la farmacopea de los EE.UU. USP24<71>) si deben usarse en el tratamiento de enfermedades en animales (por ejemplo, seres humanos). Los procedimientos descritos en el presente documento se han diseñado de modo que pueda mantenerse la esterilidad en todo momento y el producto resultante está esencialmente libre de contaminantes biológicos. Los expertos en la técnica de la fabricación farmacéutica (por ejemplo, fabricantes de productos biológicos con Buenas Prácticas de Fabricación ("GMP")) conocen las técnicas para esterilizar la maquinaria y filtrar las soluciones de manera aséptica, y se emplean en los procedimientos presentes.
Pueden obtenerse partículas más grandes, tales como las usadas para su implantación, usando condiciones de emulsificación menos enérgicas cuando se prepara la segunda emulsión, mediante la alteración de la concentración del polímero, la alteración de la viscosidad de la emulsión, la alteración del tamaño de partícula de la primera emulsión (por ejemplo, pueden prepararse partículas más grandes disminuyendo la presión usada mientras se crea la primera emulsión en un microfluidificador), o la homogeneización con, por ejemplo, el juego homogeneizador de Silverson a 5.000 rpm durante aproximadamente 12 segundos.
Pueden suspenderse las micropartículas lavadas, o lavadas y liofilizadas, o lavadas y secadas, en un excipiente sin afectar negativamente a la cantidad de ADN de plásmido superenrollado dentro de las micropartículas. A menudo se usan excipientes tales como solución salina, hidratos de carbono, detergentes y otros tensioactivos, polímeros, tampones, y lípidos en la formulación de fármacos, y aquí proporcionan una resuspensión de micropartículas eficiente, actúan para evitar la sedimentación, y/o aumentan la dispersión in vivo. Según el análisis mediante electroforesis de gel, los excipientes tales como TWEEN 80, manitol, sorbitol y carboximetilcelulosa no tienen un efecto perjudicial sobre la estabilidad o superenrollamiento del ácido nucleico, cuando se incluyen antes o después de la liofilización.
Caracterización de micropartículas
Puede determinarse la distribución de tamaño de las micropartículas preparadas mediante el método anterior con un contador COULTER^{TM}. Este instrumento proporciona un perfil de distribución de tamaño y análisis estadístico de las partículas. Alternativamente, puede determinarse el tamaño medio mediante visualización con un microscopio ajustado con un portaobjetos o lente ocular de calibración.
Si se desea, puede extraerse el ácido nucleico de las micropartículas para su análisis mediante el siguiente procedimiento. Se disuelven las micropartículas en un disolvente orgánico tal como cloroformo o cloruro de metileno en presencia de una solución acuosa. El polímero permanece en la fase orgánica, mientras que el ácido nucleico pasa a la fase acuosa. Puede diferenciarse mejor la interfase entre las fases mediante centrifugación. El aislamiento de la fase acuosa permite la recuperación del ácido nucleico. Se recupera el ácido nucleico de la fase acuosa mediante precipitación con sal y etanol según los métodos habituales. Para probar la degradación, puede analizarse el ácido nucleico extraído mediante HPLC, electroforesis de gel capilar, o electroforesis de gel de agarosa.
Puede determinarse la cantidad de disolvente orgánico residual mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía de gases o cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Más específicamente, se produjeron las micropartículas mediante el procedimiento detallado en el ejemplo 2 y se probaron para determinar el disolvente residual tal como sigue:
se secuestraron cuatro viales que representaban varias etapas del rellenado de viales para su análisis. Se eliminaron aproximadamente 15 mg de producto liofilizado de cada uno de los cuatro viales y se combinaron con agitación suave (utilizando una espátula sujetada a mano) para garantizar la homogeneidad del artículo de prueba. Entonces se resuspendió el producto liofilizado seleccionado en tetrahidrofurano con un patrón interno (1,2-dicloropropano), para ajustarse a las variaciones en el volumen de inyección de inyección en inyección. Se sometió cada artículo de prueba a inyecciones por duplicado en un cromatógrafo de gases equipado con una columna Supelco^{MR} SPB-5 de 30 m X 0,53 mm y un detector de captura de electrones. Se determinaron las áreas máximas de diclorometano DCM y control de la inyección (ambos máximos alcanzaron la resolución de referencia). Se determinó la razón DCM/1,2-dicloropropano para el artículo de prueba y se comparó con la razón correspondiente de un patrón preparado a una concentración conocida. Esta comparación dio como resultado la concentración de DCM en el artículo de prueba. El método de prueba es cuantitativo en el intervalo de concentraciones de 50 a 100 ppm de DCM, con un límite de cuantificación de aproximadamente 30 ppm y un límite de detección de aproximadamente 20 ppm. Se aplicó el procedimiento a dos preparaciones de micropartículas. Se encontró que una preparación tenía un nivel de DCM residual a aproximadamente el límite de detección (es decir, aproximadamente 20 ppm). La otra tenía un nivel de DCM residual de 79 ppm.
Se analizaron muestras de no GMP de una manera similar. Se resuspendió el artículo de prueba liofilizado en THF con 1,2-dicloropropano y se sometió a un análisis de CG tal como se describió anteriormente. Se inyectó el artículo de prueba líquido directamente en la CG sin la ventaja de la preparación de las muestras. Se generó una curva patrón de DCM para cada conjunto de muestras y se extrapolaron las concentraciones de DCM de los artículos de prueba de la curva patrón.
Administración in vivo de micropartículas
Las micropartículas que contienen ácido nucleico pueden resuspenderse en solución salina, solución de sal tamponada, medio de cultivo tisular, solución que contiene carbohidratos o lípidos, u otros vehículos fisiológicamente aceptables. Pueden inyectarse en un animal (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano) por vía intramuscular, intravenosa, intrarterial, intradérmica, intratecal, intraperitoneal, o subcutánea, o pueden introducirse en el tracto gastrointestinal o el tracto respiratorio, por ejemplo, mediante inhalación de una suspensión o polvo que contiene las micropartículas, o tragando un comprimido o suspensión que contiene las micropartículas. Alternativamente, pueden introducirse las micropartículas en una zona mucosa tal como la vagina, nariz, o recto. Se monitoriza la expresión del ácido nucleico mediante un método apropiado. Por ejemplo, se somete a ensayo la expresión de un ácido nucleico que codifica para una proteína inmunógena de interés mediante la RT-PCR o buscando una respuesta de un anticuerpo o célula T a la proteína.
Las respuestas de anticuerpo pueden medirse probando el suero en un ensayo ELISA. En este ensayo, se recubre la proteína de interés sobre una placa de 96 pocillos y se pipetean diluciones en serie de suero del sujeto de prueba en cada pocillo. Entonces se añade un anticuerpo secundario unido a una enzima, tal como el anticuerpo unido a peroxidasa del rábano antihumano. Si hay anticuerpos para la proteína de interés presentes en el suero del sujeto de prueba, se unirán a la proteína fijada en la placa, y estarán unidas a su vez al anticuerpo secundario. Se añade un sustrato para la enzima a la mezcla y se cuantifica un cambio colorimétrico en un lector de placas ELISA. Una respuesta positiva del suero indica que se expresó la proteína inmunógena codificada por el ADN de las micropartículas en el sujeto de prueba, y estimuló una respuesta de anticuerpo. Alternativamente, puede emplearse un ensayo in situ ELISA.
Se mide la proliferación de células T en respuesta a una proteína tras la administración intracelular de micropartículas que contienen ácido nucleico que codifica para la proteína sometiendo a ensayo las células T presentes en el bazo, nódulos linfáticos, o linfocitos sanguíneos periféricos de una animal de prueba. Se incuban las células T obtenidas de una fuente tal con CPA singénicas en presencia de la proteína o péptido de interés. Se monitoriza la proliferación de células T mediante la captación de ^{3}H-timidina, según los métodos convencionales. La cantidad de radioactividad incorporada a las células se relaciona directamente con la intensidad de la respuesta proliferativa inducida en el sujeto de prueba mediante la expresión del ácido nucleico administrado por micropartículas. Una respuesta positiva indica que se captó el ADN que contiene micropartículas que codifica para la proteína o péptido y se expresó mediante CPA in vivo.
Puede demostrarse la generación de células T citotóxicas en un ensayo de liberación de ^{51}Cr convencional (véase, por ejemplo, la solicitud PCT WO99/18995, USSN 09/398.534, o USSN 60/154.665). En estos ensayos, se cultivan células de bazo o linfocitos sanguíneos periféricos obtenidos del sujeto de prueba en presencia de CPA singénicas (por ejemplo, células dendríticas) y o bien la proteína de interés o bien un epítopo derivado de esta proteína. Tras un ciclo de estimulación (por ejemplo, de 4-10 días), se mezclan las células T citotóxicas efectoras con células diana marcadas con ^{51}Cr que expresan un epítopo derivado de la proteína de interés. Pueden estimularse las células efectoras in vitro de 1-3 veces. Si el sujeto de prueba dio lugar a una respuesta de la célula T citotóxica a la proteína o péptido codificado por el ácido nucleico contenido dentro de la micropartícula, las células T citotóxicas lisarán las dianas. Las dianas lisadas liberarán el ^{51}Cr radioactivo al medio. Se sometieron a ensayo alícuotas del medio para determinar la radioactividad en un contador de centelleo. También pueden utilizarse ensayos, tales como ELISA o citometría de flujo activada por fluorescencia, para medir los perfiles de citosina de las células T que responden (véase, por ejemplo, la solicitud PCT WO99/18995, USSN 09/398.534, o USSN 60/154.665).
Micropartículas que contienen lípidos
Las micropartículas descritas en el presente documento pueden incluir también uno o más tipos de lípidos como compuestos estabilizantes. La inclusión de un lípido en una micropartícula puede incrementar la estabilidad del ácido nucleico en la micropartícula, por ejemplo, manteniendo una molécula de ADN de cadena doble cerrada covalentemente en un estado superenrollado. La presencia de un lípido en la partícula puede modular, es decir, aumentar o disminuir, la velocidad a la que se libera un fármaco o ácido nucleico de la micropartícula.
La adición de un lípido a la micropartícula puede aumentar en ciertos casos la eficacia de la encapsulación del ácido nucleico o aumentar la carga del ácido nucleico dentro de las micropartículas. Por ejemplo, puede mejorarse la eficacia de la encapsulación porque la presencia del lípido reduce la tensión superficial entre la fase acuosa interna y la fase orgánica. Se cree que la reducción de la tensión superficial crea un ambiente más favorable para el ácido nucleico, y por tanto que aumenta su retención dentro de la micropartícula. Una reducción en la tensión superficial también permite que se forme la emulsión primaria con menos manipulación, lo que minimiza el cizallamiento del ácido nucleico y aumenta el superenrollamiento. También es posible que la presencia de un lípido en la micropartícula pueda mejorar la estabilidad de la formulación micropartícula/ácido nucleico, y que pueda aumentar la naturaleza hidrófoba de las micropartículas, aumentando mediante esto la absorción de células fagocíticas.
Los lípidos pueden ser catiónicos, aniónicos, o zwitteriónicos, o pueden no llevar grupos con carga, tal como los glicéridos apolares. Pueden ser, por ejemplo, ácidos grasos, eicosanoides, glicerofosfolípidos, triacetilgliceroles, ceras, esfingolípidos, esteroides (por ejemplo, colesterol, CHAPS, ácidos biliares, hormonas, agliconas cardiacas), vitaminas lipídicas, o terpenos. Preferiblemente los lípidos no están presentes como liposomas que encapsulan (es decir, rodean) las micropartículas. Los lípidos pueden formar opcionalmente micelas.
Ejemplos de lípidos que pueden utilizarse en las micropartículas incluyen ácidos (por ejemplo, ácidos carboxílicos, incluyendo ácidos grasos tales como ácido cáprico), bases (tales como aminas), lípidos zwitteriónicos (por ejemplo, CHAPS), fosfolípidos tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina, o ácido fosfatídico, conteniendo cada uno o más de los grupos siguientes: propionilo (propanoílo), butirilo (butanoílo), valerilo (pentanoílo), caproílo (hexanoílo), caprililo (heptanoílo), caprilo (decanoílo), undecanoílo, laurilo (dodecanoílo), tridecanoílo, miristilo (tetradecanoílo), pentadecanoílo, palmitilo (hexadecanoílo), fitanoílo (3,7,11,15-tetrametilhexadecanoílo), heptadecanoílo, estearilo (octadecanoílo), bromoestearilo, nonadecanoílo, araquidoílo (eicosanoílo), heneicosanoílo, behenilo (docosanoílo), tricosanoílo, lignocerilo (tetracosanoílo), miristoleoílo (9-cis-tetradecanoílo), miristelaidoílo (9-trans-tetradecanoílo), palmitoleílo (9-cis-hexadecenoílo), petroselinoílo (6-cis-octadecenoílo), oleoílo (9-cis-octadecenoílo), elaidoílo (9-trans-octadecenoílo), linoleoílo (9-cis-12-cis-octadecadienoílo), linolenoílo (9-cis-12-cis-15-cis-octadecatrienoílo), eicosenoílo (11-cis-eicosenoico), araquidonilo (5,8,11,14-(todo-cis)-eicosatetranoico), erucoílo (13-cis-docosenoico), y nervonoílo (15-cis-tetracosenoico).
Otros lípidos adecuados incluyen el ión cetiltrimetilamonio, que está disponible como CTAB, PGE-DSPE, y aquellos que contienen estructuras de esteroide tales como colesterol, CHAPS, y ciertas vitaminas y hormonas. También pueden usarse lípidos derivados de la saponina (por ejemplo, QS-21).
Pueden utilizarse mezclas de lípidos para preparar una micropartícula que contiene lípidos. Las preparaciones disponibles comercialmente adecuadas incluyen lecitina, suspensiones lipídicas de EPIKURON 135^{MR} y OVOTHIN 160^{MR}, todas las cuales están disponibles de Lucas Meyer, Inc., Decatur, IL.
También puede aislarse el lípido de un organismo, por ejemplo, una micobacteria. El lípido es preferiblemente un lípido restringido a CD1, tal como los lípidos descritos en Pamer, Trend Microbiol. 7:13, 1999; Braud, Curr. Opin. Immunol. 11:100, 1999; Jackman, Crit. Rev. Immunol. 19:49, 1999; y Prigozy, Trends Microbiol. 6:454, 1998.
En lugar de, o además de, incorporar lípidos en las micropartículas, pueden suspenderse las micropartículas en un lípido (o una suspensión lipídica) para mejorar la dispersión, la administración tras la inyección, o mantenerlas en un estado suspendido.
Las micropartículas que contienen lípidos puede incluir también estabilizantes adicionales, tal como se describió anteriormente. La inclusión de un lípido en una micropartícula junto con un estabilizante tal como la sacarosa puede proporcionar un aumento sinérgico en la administración de ácidos nucleicos dentro de la micropartícula.
Tal como se describió anteriormente, pueden prepararse micropartículas que contienen lípidos añadiendo un lípido a un disolvente orgánico que contiene el polímero, a la solución acuosa que contiene la solución de ADN, o a la solución acuosa que contiene el tensioactivo. Las propiedades de solubilidad de un lípido particular en un disolvente orgánico o acuoso determinarán que disolvente se utiliza.
Pueden añadirse algunos lípidos o suspensiones lipídicas al disolvente orgánico o a la solución acuosa. Además pueden resuspenderse las micropartículas en una solución que contiene lípidos para facilitar la resuspensión y dispersión de las micropartículas.
Además de las micropartículas que contienen lípidos descritas en el presente documento, también pueden prepararse micropartículas incorporando en la solución de polímero (es decir, junto al PLGA) otras macromoléculas tales como quitina, gelatina, o alginato, o varias combinaciones de estas macromoléculas y lípidos. Las micropartículas preparadas con estas otras macromoléculas pueden incluir además los agentes estabilizantes descritos anteriormente.
Se ilustra el método mediante los ejemplos siguientes.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de ADN
Se vertieron 500 ml de cultivos bacterianos que contienen ADN plásmido en frascos de centrifugación de un litro. Se centrifugaron los cultivos a 4.000 rpm a 20ºC durante 20 minutos. Se retiró el medio de la bacteria sedimentada. Se resuspendió completamente el sedimento bacteriano en 50 ml de tampón P1 (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM; RNasa 100 \mug/ml), sin dejar grumos. Se añadieron 50 ml de tampón P2 (NaOH 200 mM, SDS al 1%) con agitación suave, y se incubaron las suspensiones a temperatura ambiente durante cinco minutos para lisar las células. Se añadieron 50 ml de tampón P3 (acetato de potasio 3,0 M, pH 5,5, enfriado hasta 4ºC) con mezclado suave inmediato. Se incubaron las suspensiones en hielo durante 30 minutos, luego se centrifugaron a 4.000 rpm a 4ºC durante 30 minutos.
Se humectó con agua un filtro redondo doblado. Cuando se completó la centrifugación, se vertió inmediatamente el sobrenadante a través del filtro. Se recogió el sobrenadante filtrado en un frasco de centrifugación limpio de 250 ml.
Se añadieron 15 ml de tampón Qiagen ER^{MR} al producto lisado filtrado, mezclando mediante la inversión del frasco 10 veces. Se incubó el producto lisado sobre hielo durante 30 minutos.
Se equilibró una columna de tipo Qiagen 2500^{MR} mediante la aplicación de 35 ml de tampón Qiagen QBT^{MR} (cloruro de sodio 750 mM; MOPS 50 mM, pH 7,0: isopropanol al 15%; y Triton X-100 al 0,15%). Se permitió que se vaciara la columna mediante el flujo gravitacional. Se lavó la columna con 4 x 50 ml de tampón Qiagen Endofree QC^{MR} (NaCl 1,0 M; MOPS 50 mM, pH 7,0; isopropanol al 15%). Se eluyó el ADN de la columna con 35 ml de tampón QN^{MR} (NaCl 1,6 M; MOPS 50 mM, pH 7,0; isopropanol al 15%) en un tubo de centrifugación con tapón de rosca de polipropileno de 50 ml. Se dividió la suspensión de ADN en dos tubos vertiendo aproximadamente 17,5 ml de la suspensión en un segundo tubo con tapón de rosca de 50 ml.
Utilizando una pipeta estéril de 10 ml, se añadieron 12,25 ml de isopropanol a cada tubo. Se cerraron fuertemente los tubos y se mezclaron meticulosamente. Se vertieron los contenidos de cada tubo en tubos de centrifugación de Corex^{MR} (VWR) de 30 ml. Se cubrió cada tubo Corex con PARAFILM®. Se centrifugaron los tubos a 11.000 rpm a 4ºC durante 30 minutos.
Se aspiró el sobrenadante de cada tubo y se lavó el sedimento con 2 ml de etanol al 70%. Se eliminó el etanol por aspiración. Se secó al aire el sedimento durante 10 minutos, entonces se resuspendió en 0,5-1,0 ml de agua y se transfirió a un tubo de microfuga de 1,5 ml.
Ejemplo 2 Preparación de micropartículas
Con respecto a la figura 1, se colocó un frasco 5 que contenía 50 ml de diclorometano (DCM) en el que se habían disuelto 6 g de poli(ácido láctico-co-glicólico) ("PLGA/DCM") en una cuba de hielo. Se equipó el frasco 5 con un homogeneizador 7 Silverson SL2T^{MR}.
Se inyectaron 10,8 ml de una solución de ADN/sacarosa/TE (es decir, 72 mg de ADN, sacarosa 300 mM, y TE 10 mM) en la solución PLGA/DCM utilizando un jeringuilla. Se comenzó la homogeneización a 10,000 rpm simultáneamente con la inyección de solución de ADN, y continuó durante 15 minutos.
Entonces se inyectaron 100 ml adicionales de DCM a la emulsión resultante con una jeringuilla durante un periodo de no más de 20 segundos. Tras la inyección de los 100 ml de DCM, se permitió que continuara la homogeneización durante 30 segundos adicionales, y entonces se paró el homogeneizador 7. Entonces se retiró el frasco 5 que contenía la primera emulsión de la cuba de hielo y se unió al conducto 14. Se desvió el conducto 14 a través de la bomba 16 hasta la cámara 23 de homogeneización equipada con un homogeneizador 24 Silverson L4RT^{MR}.
Se prepararon micropartículas mediante homogeneización de la primera emulsión con un tensioactivo. La cámara 23 de mezclado estaba en línea con un depósito 18 que contenía una solución de poli(alcohol vinílico) al 1%/sacarosa al 10,37%. Se conectó el depósito 18 por medio del conducto 20 a través de la bomba 22 con la cámara 23 de
mezclado.
Se extrajo la solución de PVA/sacarosa del depósito 18 a través de la bomba 22, ajustada a una velocidad de flujo de 1 l/min. Inmediatamente tras el comienzo del flujo de la solución de PVA/sacarosa, se ajustó el homogeneizador 24 a 6.000 rpm. Entonces se formó una segunda emulsión extrayendo la primera emulsión del frasco 5 hacia la cámara 23 ajustando la bomba 16 a una velocidad de flujo de 36 ml/min. Tras la homogeneización, la segunda emulsión salió a través del conducto 25 y entró en una cámara 28 del biorreactor BIOFLOW 2000® (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) que contenía un agitador funcionando a 50 rpm. Se equipó el conducto 25 con una abrazadera 26 para regular el flujo de la segunda emulsión entre el homogeneizador 24 y la cámara 28 del biorreactor.
La cámara 28 del biorreactor también mostraba una entrada 32 para suministrar nitrógeno, una válvula 34 de descompresión, y un conducto 36 de salida al cual estaba unida la abrazadera 38. El conducto 36 estaba comunicado con el conector 40 "Y", que desviaba el flujo desde el conducto 36 al conducto 42. Se reguló el flujo de fluido a través del conducto 42 mediante la abrazadera 44. Alternativamente, podían introducirse los fluidos en el conducto 48 a través de los conductos 41 y 42 cerrando la abrazadera 38 y abriendo las abrazaderas 43 y 44.
Se bombearon cinco litros de la solución de PVA/sacarosa del depósito 18 y 150 ml de la primera emulsión del frasco 5 en el homogeneizador 24, y luego en la cámara 28 del biorreactor, durante un periodo de 5 minutos. Después de haber bombeado las soluciones a través del homogeneizador 24, se aumentó la velocidad de agitación en la cámara 28 del biorreactor hasta 375 rpm durante 30 minutos.
Se ajustó la temperatura de la cámara 28 del biorreactor a 22ºC y se monitorizó cada 5 minutos. Tras 30 minutos, se aumentó el punto de ajuste de temperatura hasta 37ºC, y se monitorizó de nuevo la temperatura cada 5 minutos. Cuando la temperatura hubo alcanzado 37ºC, se mantuvo la velocidad de agitación a 375 rpm y se continuó agitando durante 1,5 horas, tras las cuales se ajustó la velocidad de agitación a 150 rpm y se redujo el punto de ajuste de temperatura hasta 15ºC.
Se inició el lavado de las micropartículas introduciendo 500 ml de agua (4ºC) a través de los conductos 41 y 42 (es decir, con la abrazadera 38 cerrada), la bomba 46, y el conducto 48, en un depósito 50 de fibra hueca de AG Technologies. Inicialmente se ajustó la velocidad de flujo a través del depósito 50 de fibra hueca a una velocidad de 11 l/min por medio de la bomba 57.
Tras la adición de los 500 ml de agua al depósito 50 de fibra hueca, se cerró la abrazadera 43, y se soltó la abrazadera 38. Entonces se usó la bomba 46 para transferir la solución de la cámara 28 del biorreactor al depósito 50 de fibra hueca a una velocidad de flujo de 80 ml/min.
El depósito 50 de fibra hueca estaba conectado a un orificio 52 de ventilación de descompresión, que tenía un filtro 54, y a los conductos 55 y 56. Se circuló el fluido desde el depósito 50 de fibra hueca a través del conducto 56 por medio de la bomba 57 hasta unos cartuchos 59 de fibra hueca apilados en serie, teniendo cada uno membranas porosas de polisulfona con poros de 0,2 \mum. El fluido que entraba en los cartuchos 59 de fibra hueca desde el conducto 56 pasó a la región interior de las fibras huecas. Esta región, a su vez, estaba comunicada con el conducto 64. El tamaño de los poros de las membranas de fibra hueca era suficientemente pequeño de modo que las micropartículas no podían pasar a través de las membranas. Por el contrario, los reactivos y productos secundarios del procedimiento de fabricación, por ejemplo el PVA y sacarosa, sí pasaban a través de las membranas. Se retiró este permeado a través del conducto 62 mediante la bomba 66 utilizando una velocidad de flujo de 40 ml/min. Por tanto la velocidad de flujo total era de 80 ml/min para las dos cámaras.
El conducto 56 del depósito 50 de fibra hueca también estaba conectado a la abrazadera 70, que regulaba el flujo del líquido a un vaso 72 de precipitados de vidrio de 600 ml. Tal como se explicará con más detalle a continuación, el hecho de soltar la abrazadera 70 permitió el suministro de micropartículas desde el depósito 50 de fibra hueca al vaso 72 de precipitados.
Con la abrazadera 70 cerrada, se dirigió el fluido desde el depósito 50 de fibra hueca a través del conducto 56 mediante la bomba 57 a los cartuchos 59 de fibra hueca. Se permitió que el fluido fluyera hasta que quedó menos de 1 litro de fluido en la cámara 28 del biorreactor. En este momento, se aumentó la velocidad de flujo de modo que toda la solución se transfirió desde la cámara 28 del biorreactor al depósito 50 de fibra hueca durante 2 minutos. Entonces se paró el flujo de nitrógeno a la cámara 28 del biorreactor, al igual que la agitación dentro de la cámara 28 del
biorreactor.
Se lavaron las micropartículas bombeando agua fría (4ºC) en el sistema de fibra hueca a través del conducto 48 por medio de los conductos 41 y 42, utilizando la bomba 46 a una velocidad de flujo de 80 ml/min. Se mantuvo el volumen de la solución constante en el depósito 50 de fibra hueca a 500 ml. Se continuó el lavado hasta que se hubieron bombeado 3,5 litros de agua fría (4ºC) al sistema. En este momento, se paró la bomba 46. La bomba 66 continuó sacando permeado a 80 ml/min hasta que quedaron aproximadamente 200 ml de solución en el depósito 50 de fibra hueca. Entonces se pararon las bombas 46 y 47, y se abrió la abrazadera 70 para permitir que las micropartículas fluyeran desde el depósito 50 de fibra hueca hasta el vaso 72 de precipitados.
Entonces se cerró la abrazadera 70 y se introdujeron 100 ml de agua fría (4ºC) en el sistema desde el conducto 41 utilizando la bomba 46, para aclarar los cartuchos 59 de fibra hueca con el fin de recuperar las micropartículas que se habían dejado atrás en la primera recolección descrita anteriormente y para maximizar mediante esto el rendimiento de producto. Entonces se encendió la bomba 57, y se aumentó lentamente la velocidad de flujo de recirculación hasta 11 l/ml y se mantuvo durante 5 minutos, entonces se disminuyó disminuyendo gradualmente la velocidad de flujo, tal como controlaba la bomba 57.
Se abrió de nuevo la abrazadera 70 para recoger la suspensión de micropartículas. Se combinó la suspensión con la suspensión de micropartículas recogida anteriormente, y se determinó el peso de las suspensiones de micropartículas combinadas. Se agitaron las micropartículas a temperatura ambiente durante un tiempo adicional para lograr una retirada adicional de DCM.
Se liofilizó la suspensión de micropartículas tras alicuotar en primer lugar 1,5 ml en viales de 5 ml. Se mantuvieron los viales a -50ºC durante 3 horas para congelar la suspensión dentro de la cámara de liofilización, tras lo cual se aumentó la temperatura a una velocidad de 5ºC por hora hasta una temperatura final de -10ºC. Se mantuvieron los viales a -10ºC durante un mínimo de 6 minutos, y entonces a 25ºC durante 4-16 horas para liofilizar. Se rellenó la cámara de liofilización con gas nitrógeno a una presión de \sim 2'' Hg, y se asentaron los tapones de caucho de los viales mientras se mantenía esta presión. Cuando se completó la liofilización, se rebordearon los viales con un septo de caucho/aluminio, y se almacenaron a -20ºC.
Se encontró que las partículas tenían un diámetro de aproximadamente 1-2 \mum en media numérica.
Ejemplo 3 Resultados
Se llevó a cabo el procedimiento del ejemplo 2 con varias condiciones y cargas de ácido nucleico para preparar la primera emulsión. Los resultados fueron tal como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento nº 1
72 mg de ADN plásmido
Primera emulsión preparada en un microfluidificador
Rendimiento: 4,6 g (77%)
Diámetro de micropartícula promedio: 1,9 \mum
Eficacia de encapsulación: 4,8 \mug de ADN/mg de micropartículas
ADN que permanece en forma superenrollada: \geq 60%
PVA residual en relación a la masa de las micropartículas: 0,88%
\newpage
Experimento nº 2
72 mg de ADN plásmido
Primera emulsión preparada en un homogeneizador SL2T, procedimiento discontinuo
Rendimiento: 4,5 g (74%)
Diámetro de micropartícula promedio: 2,1 \mum
Eficacia de encapsulación: 5,09 \mug de ADN/mg de micropartículas
ADN que permanece en forma superenrollada: \geq 60%
PVA residual en relación a la masa de las micropartículas: 0,89%
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento nº 3
72 mg de ADN plásmido
Primera emulsión preparada en un homogeneizador SL2T (en este caso, en lugar de 50 ml de DCM y 10,8 ml de solución de ADN, se combinaron todos los 150 ml de DCM y toda la solución de ADN de una vez)
Rendimiento: 5,0 g (83%)
Diámetro de micropartícula promedio: 2,0 \mum
Eficacia de encapsulación: 3,99 \mug de ADN/mg de micropartículas
ADN que permanece en forma superenrollada: \geq 80%
PVA residual en relación a la masa de las micropartículas: 1,1%
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento nº 4
108 mg de ADN plásmido
Primera emulsión preparada en un homogeneizador SL2T
Rendimiento: 5,6 g (93%)
Diámetro de micropartícula promedio: 1,9 \mum
Eficacia de encapsulación: 7,04 \mug de ADN/mg de micropartículas
ADN que permanece en forma superenrollada: \geq 60%
PVA residual en relación a la masa de las micropartículas: 1,48%
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento nº 5
108 mg de ADN plásmido
Primera emulsión preparada en un homogeneizador, SL2T
Rendimiento: 5,75 g (96%)
Diámetro de micropartícula promedio: 1,8 \mum
Eficacia de encapsulación: 9,78 \mug de ADN/mg de micropartículas
ADN que permanece en forma superenrollada: 70%
PVA residual en relación a la masa de las micropartículas: 1,63%
Ejemplo 4 Método alternativo para retirar el disolvente orgánico residual de la segunda emulsión
Se forman las micropartículas tal como se describió en el ejemplo 2. Se bombea la emulsión secundaria en un dispositivo de retirada de disolvente, en el que el DCM se difunde desde las micropartículas en la fase acuosa de la emulsión secundaria. Se agita la suspensión acuosa espesa muy suavemente en este tanque; evitar una agitación vigorosa y aireación ayuda a descartar la formación de espuma. A diferencia del procedimiento descrito en el ejemplo 2, no hay superposición de gas, sino más bien se saca un vacío parcial a través del espacio de cabeza, purgando cualquier DCM que evapora. Según el DCM difunde en la fase acuosa desde las micropartículas, los niveles de DCM aumentan en la fase acuosa hasta alcanzar saturación (aproximadamente el 1-2%, dependiendo de la temperatura de la solución). Durante la fase de endurecimiento, se añade agua adicional al dispositivo de extracción de disolvente hasta que están presentes un total de 10 litros de agua por 150 ml de DCM. Entonces se transfiere la suspensión acuosa espesa (por ejemplo, presurizando el tanque de endurecimiento) a un filtro/secador Sweco PharmaSep (Emerson Electric). Esta unidad está equipada con un tamaño de tamizado nominal de una micra o inferior para retener micropartículas mayores que una micra en diámetro. El tamaño de tamizado puede ajustarse para retener micropartículas de tamaños variables. Se retiene el producto dentro del filtro/secador según la fase acuosa pasa a través del tamiz y se descarga.
Dentro de la unidad Sweco, después se lavan las micropartículas lentamente con agua para inyección (API), manteniendo las partículas en suspensión a través de la vibración del tamiz. El DCM pasa desde las micropartículas al agua, que pasa a través de la unidad y saca el DCM. Puesto que el agua que entre en la unidad no tiene DCM, se exponen sólo las micropartículas a niveles de DCM muy bajos en fase acuosa en masa, acelerando de ese modo el procedimiento difusivo para transferir DCM fuera de las micropartículas. Según descienden los niveles de DCM en el producto, la velocidad de flujo de agua puede reducirse para conservar los costes y ayudar a la extracción de disolvente. Puede ajustarse la temperatura del agua de lavado para maximizar la velocidad de la transferencia difusiva sin dañar el producto. Finalmente, puede aclararse el producto con un excipiente final y secarse con gas nitrógeno hasta el estado apropiado de sequedad. Se descarga el producto secado del filtro/secador a un contenedor de recepción estéril para colocar un vial. Alternativamente, puede retenerse el producto en el dispositivo del filtro para su lavado, y luego secarse en un liofilizador antes de descargar en un contenedor de recepción estéril para colocar un vial.
Si se desea, puede recuperarse el DCM del agua de lavado descargado mediante destilación. Puesto que el agua de lavado descargado no contiene producto, puede llevarse hasta el punto de ebullición y pasarse el gas residual a una columna de destilación. Pueden separarse el DCM y el agua en la columna de destilación y puede recuperarse el DCM para su reutilización. Esto tiene los beneficios de reducir el coste de DCM, que se pierde generalmente en los procedimientos actuales, y de eliminar los problemas ambientales asociados con el DCM purgado a la atmósfera.
Ejemplo 5 Escala 2X del procedimiento de producción de micropartículas
La ampliación a escala 2X del procedimiento requiere dos homogeneizadores primarios, un homogeneizador secundario (de flujo a través), dos biorreactores, y un dispositivo de fibra hueca (dimensionado 2x).
1.
Se preparó una emulsión individual utilizando 6 g de PLGA en 50 ml de DCM y 72 mg de ADN en 10,8 ml de sacarosa el 10% en un contenedor de encargo de polipropileno de 250 ml sellado mediante un tapón de TEFLON® a través del cual penetra la cabeza del emulsificador. Tras 15 minutos de homogeneización con un homogeneizador Silverson SR2T a 10.000 rpm, se bombearon 100 ml adicionales de DCM al contenedor. El volumen final de esta emulsión fue de 161 ml. La homogeneización continuó durante 30 segundos adicionales.
2.
Sin extraer la punta del homogeneizador, se bombeó la emulsión fuera del contenedor a través de un tubo de acero inoxidable que penetraba el tapón de TEFLON® y que llegaba a la parte inferior del contenedor. Se bombeó la emulsión primaria a 32,2 ml/min (5 minutos) junto con 5 litros de solución de PVA (PVA al 1% más sacarosa al 10,37%), que se bombeó a 1 litro/min (5 minutos) a través de un homogeneizador de flujo a través Silverson L4RT^{MR} en un vaso de reactor New Brunswick Scientific Bioflo^{TM} de 10 litros. Se agitó el vaso del reactor a 375 rpm y se pasó gas nitrógeno filtrado estéril a través del espacio de cabeza a 20 litros/minuto. Se mantuvo la temperatura del vaso de reactor a 20ºC durante 30 minutos, entonces se subió hasta 37ºC y se mantuvo a esa temperatura mientras se agitaba y gasificaba continuamente durante de 2 a 3 horas adicionales.
3.
Mientras se agitaba la primera emulsión, se repitió la etapa 1 con un segundo contenedor y homogenizador.
4.
Se repitió la etapa 2 utilizando el mismo homogeneizador secundario y un vaso de reactor diferente.
5.
Después de haber agitado el contenido del primer vaso de reactor durante de 2 a 3 horas, se bombeó el líquido en el vaso de reactor a 8 l/min a través de un cartucho de fibra hueca largo y se recirculó de vuelta al vaso de reactor. Se retiró el permeado a 160 ml/minuto constantes y se descargó.
6.
Cuando se hubo retirado un litro de permeado del primer vaso de reactor, se cambió un conjunto de válvulas para colocar el segundo vaso de reactor en el circuito de recirculación. Se retiró un litro de permeado del segundo vaso de reactor y se desechó.
7.
Se repitieron las etapas 5 y 6 hasta que el volumen de suspensión en cada vaso fue de un litro. En ese momento, se bombeó el contenido de ambos reactores en un depósito de dos litros adyacente al aparato de fibra hueca y se recirculó a través del dispositivo de fibra hueca a 8 litros por minuto. Se retiró el permeado continuamente a 160 ml/min.
8.
Cuando el volumen de la suspensión fue de un litro, se bombeó API en el depósito a 160 ml/min. Se retiró el permeado continuamente a 160 ml/min. Se paró el flujo de API cuando siete litros hubieron pasado a través del sistema.
9.
Se redujo el flujo de recirculación hasta 4 litro/minutos y se redujo el flujo de permeado hasta 80 ml/min. El bombeo continua hasta que el volumen de la suspensión es de aproximadamente 400 ml.
10.
Se paran las bombas en ese momento y se drena la suspensión desde el aparato de fibra hueca a un vaso de recepción estéril.
11.
Se añadió una solución concentrada de excipiente al producto en esta etapa. Se dejó agitar el producto durante 5 minutos.
12.
Se dispensó el producto en viales para la liofilización, taponamiento, y rebordeado.
Resultados
Se analizaron las micropartículas y se obtuvieron los resultados siguientes:
Encapsulación (determinada mediante absorción UV): 4,0 \mug ADN/mg de partículas
Superenrollamiento: el 60% en micropartículas
Diámetro de micropartícula: 2,0 \mum mediante media numérica, 6,2 \mum mediante media en volumen; el 80% era mayor que 2,8 \mum en diámetro
Rendimiento: 10,3 g (85,8%) en 650 ml de agua
Concentración de PVA: el 1,1%
Ejemplo 6 Escala 10X y superior para la producción de micropartículas
Lo siguiente describe la técnica para la producción de micropartículas en la escala de 60 gramos y superior.
1.
Se bombean simultáneamente una solución acuosa de ADN y sacarosa, y una solución de PLGA y lípido en DCM a través de un homogeneizador de flujo continuo para formar la emulsión primaria.
2.
Se bombean simultáneamente la emulsión primaria y una solución de PVA/sacarosa a través de un segundo homogeneizador de flujo continuo para formar la emulsión secundaria. Se pasa la emulsión secundaria a un dispositivo de retirada de disolvente, formando una suspensión de micropartículas.
3.
Se bombea la suspensión a un lavador-secador de tipo tamiz (por ejemplo, un dispositivo Sweco), en el que se lava el producto con una primera solución de API. Esto es seguido de un lavado con una segunda solución acuosa que contiene un excipiente (por ejemplo, manitol).
4.
Se seca el producto dentro de la unidad Sweco mediante una corriente constante de aire seco estéril.
5.
Se retira el producto secado de la unidad Sweco a través del orificio de descarga a un vaso de recepción estéril.
6.
Se rellena el producto secado en viales con un tornillo sinfín de polvo. Este dispositivo parecido a un tornillo sube el polvo desde el vaso de recepción y lo dispensa a los viales de inyección que entonces se tapan y se rebordean.

Claims (47)

1. Procedimiento continuo dimensionable para preparar micropartículas que contienen ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento:
(a) proporcionar una cámara de mezclado y un dispositivo de eliminación de disolvente;
(b) suministrar continuamente una primera emulsión a la cámara de mezclado, en la que la primera emulsión comprende (i) una solución orgánica que comprende un material polimérico y un disolvente orgánico mezclada con (ii) una primera solución acuosa que comprende un ácido nucleico;
(c) suministrar continuamente una segunda solución acuosa a la cámara de mezclado, en la que la segunda solución acuosa comprende un tensioactivo;
(d) emulsionar continuamente la primera emulsión y la segunda solución acuosa en la cámara de mezclado para formar una segunda emulsión, comprendiendo la segunda emulsión ácido nucleico, material polimérico, agua y disolvente orgánico;
(e) transferir continuamente la segunda emulsión desde la cámara de mezclado hacia el dispositivo de eliminación de disolvente; y
(f) eliminar el disolvente orgánico de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente para formar una suspensión acuosa de micropartículas que contienen ácido nucleico;
en el que al menos una de la primera emulsión y la segunda solución acuosa comprende además un estabilizante.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la primera solución acuosa y la segunda solución acuosa son de esencialmente igual osmolaridad.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el estabilizante comprende un hidrato de carbono y un tampón.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el estabilizante comprende sacarosa y TRIS-EDTA.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el estabilizante comprende adicionalmente un lípido.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el estabilizante comprende un lípido.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además:
(g) proporcionar un aparato de diafiltración;
(h) diluir la suspensión acuosa con una solución de lavado acuosa;
(i) suministrar la suspensión acuosa diluida al aparato de diafiltración; y
(j) eliminar una solución de deshecho acuosa de la suspensión acuosa diluida en el aparato de diafiltración, en la que la solución de deshecho acuosa comprende al menos algo de la solución de lavado de la etapa (h), para formar en el aparato de diafiltración una suspensión acuosa purificada que comprende micropartículas que contienen ácido nucleico.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, que comprende además:
(k) concentrar la suspensión acuosa purificada en el aparato de diafiltración para formar un concentrado; y
(l) transferir el concentrado en uno o más recipientes.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, que comprende además:
(m) liofilizar, deshidratar por congelación, o secar al aire el concentrado en uno o más recipientes, para formar micropartículas liofilizadas, deshidratadas por congelación o secadas al aire.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que las micropartículas liofilizadas o deshidratadas por congelación tienen un nivel de disolvente orgánico residual inferior a 200 ppm.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que las micropartículas liofilizadas o deshidratadas por congelación tienen un nivel de disolvente orgánico residual inferior a 50 ppm.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además:
(g) poner en contacto la suspensión acuosa con un tamiz de malla fina vibratorio o no vibratorio;
(h) filtrar la suspensión acuosa a través del tamiz para eliminar al menos parte de cada una de dichas primera y segunda soluciones acuosas y para retener las micropartículas en el tamiz;
(i) lavar las micropartículas con al menos una solución de lavado acuosa para producir micropartículas lavadas; y
(j) secar las micropartículas lavadas para producir micropartículas secadas.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la etapa de secado comprende liofilizar, deshidratar por congelación, o secar al aire las micropartículas lavadas.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la primera solución de lavado acuosa es agua estéril para inyección a una temperatura de aproximadamente 2ºC a aproximadamente 8ºC.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende además poner en contacto las micropartículas lavadas con un excipiente, antes de la etapa de secado.
16. Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende además:
(k) transferir las micropartículas secadas a uno o más recipientes.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cámara de mezclado comprende un homogeneizador.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de eliminación de disolvente es un biorreactor.
19. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la segunda solución acuosa se suministra a la cámara de mezclado con una velocidad de flujo de entre 0,1 y 20 l/min.
20. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico se elimina de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente mediante evaporación.
21. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico se elimina de la segunda emulsión mediante calentamiento de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente hasta entre 30ºC y 55ºC.
22. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico se elimina de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente mediante un procedimiento de extracción.
23. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la eliminación del disolvente orgánico de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente se facilita mediante la dilución de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente.
24. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico se elimina de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente mediante la aplicación de un vacío parcial al dispositivo de eliminación de disolvente.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico comprende diclorometano.
26. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que cada una de las etapas se lleva a cabo asépticamente.
27. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el aparato de diafiltración comprende un sistema de fibra hueca.
28. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que las etapas (i) y (j) se llevan a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC.
29. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que al menos aproximadamente el 50% del ácido nucleico en las micropartículas está en forma de moléculas de ARN circular o moléculas de ADN circular superenrollado.
30. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que al menos aproximadamente el 50% del ácido nucleico en las micropartículas en la suspensión acuosa purificada está en forma de moléculas de ARN circular o moléculas de ADN circular superenrollado.
31. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que al menos aproximadamente el 50% del ácido nucleico en las micropartículas liofilizadas o deshidratadas por congelación está en forma de moléculas de ADN circular superenrollado.
32. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el diámetro medio de las micropartículas es inferior a aproximadamente 100 micras.
33. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que el diámetro medio es inferior a aproximadamente 20 micras.
34. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que el diámetro medio es de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2,5 micras, incluidas.
35. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el material polimérico es un polímero sintético, biodegradable.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que el polímero es poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA).
37. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico en el PLGA es de entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 4:1 en peso.
38. Procedimiento según la reivindicación 37, en el que la razón de ácido láctico con respecto a ácido glicólico en el PLGA es de aproximadamente 1:1 en peso.
39. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que el PLGA tiene un peso molecular promedio en el intervalo de 6.000 a 100.000.
40. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la segunda solución acuosa comprende además poli(alcohol vinílico) (PVA)
41. Procedimiento según la reivindicación 40, en el que la segunda solución acuosa comprende además un hidrato de carbono.
42. Procedimiento según la reivindicación 41, en el que el hidrato de carbono es sacarosa.
43. Procedimiento según la reivindicación 41, en el que la etapa de emulsión (d) se lleva a cabo a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC.
44. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tiempo de residencia medio de la primera emulsión y la segunda solución acuosa en la cámara de mezclado es inferior a aproximadamente 60 segundos.
45. Procedimiento según la reivindicación 44, en el que el tiempo de residencia medio de la primera emulsión y la segunda solución acuosa en la cámara de mezclado es inferior a aproximadamente 1 segundo.
46. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tiempo de residencia medio de la segunda emulsión en el dispositivo de eliminación de disolvente es inferior a aproximadamente 3 horas.
47. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además:
(g) proporcionar un aparato de diafiltración;
(h) diluir la suspensión acuosa con una solución de lavado acuosa;
(i) suministrar la suspensión acuosa diluida al aparato de diafiltración;
(j) eliminar una solución de deshecho acuosa de la suspensión acuosa diluida en el aparato de diafiltración, en la que la solución de deshecho acuosa comprende al menos algo de la solución de lavado de la etapa (h), para formar en el aparato de diafiltración una suspensión acuosa purificada que comprende micropartículas que contienen ácido nucleico;
(k) lavar la suspensión acuosa purificada para formar una suspensión de micropartículas lavadas;
(l) concentrar la suspensión de micropartículas lavadas para formar un concentrado;
(m) transferir el concentrado en uno o más recipientes; y
(n) liofilizar, deshidratar por congelación, o secar al aire el concentrado en uno o más recipientes, para formar un polvo liofilizado, deshidratado por congelación o secado al aire.
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