DE69837602T2 - Mikropartikel zur verabreichung von nukleinsaeuren - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Verabreichung von Nukleinsäuren in Zellen.
  • Gentherapie ist ein sehr viel versprechendes Verfahren zur Behandlung von Erbkrankheiten, z. B. zystischer Fibrose. Gentherapie kann auch verwendet werden, wenn die Expression der Genprodukte von Genen gewünscht wird, welche natürlicherweise nicht in den Wirtszellen gefunden werden, zum Beispiel von zytotoxische Proteine kodierenden Genen, die auf eine Expression in Krebszellen zielen.
  • Gentherapie kann in verschiedene Kategorien fallen. In einigen Fällen ist es wünschenswert, ein defektes Gen für die gesamte Lebensspanne eines Säugers zu ersetzen, wie in dem Fall einer Erbkrankheit wie zum Beispiel zystische Fibrose, Phenylketonurie oder schwerer kombinierter Immundefekt (SCID). In anderen Fällen kann es erwünscht sein, einen Säuger mit einem Gen zu behandeln, das ein therapeutisches Polypeptid für eine begrenzte Zeitdauer exprimieren wird, z. B. während einer Infektion. Nukleinsäuren in Form von Antisense-Oligonukleotiden oder Ribozymen werden auch für therapeutische Zwecke genutzt. Außerdem können von Nukleinsäuren kodierte Polypeptide effektive Stimulatoren der Immunantwort in Säugern sein.
  • Verschiedene Verfahren wurden für das Einbringen von Genen in Zellen verwendet, einschließlich der Infektion mit viralen Vektoren, der biolistische Transfer, der Injektion "nackter" DNA ( US-Patent-Nr. 5,580,859 ) und der Verabreichung über Liposomen oder Polymerpartikel.
  • In der WO 9524929 werden eingekapselte zirkuläre DNA-Plasmide in Supercoil-Form in einen Verfahren hergestellt, welches die Entfernung von Lösungsmittel umfasst.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass Nukleinsäuren enthaltende Mikropartikel, die eine passende Größe zur Phagozytose aufweisen, hergestellt werden können, ohne die Nukleinsäureintegrität nachteilig zu beeinflussen. Diese Mikropartikel sind hoch effektive Träger zur Verabreichung von Polynukleotiden in phagozytische Zellen.
  • Im Allgemeinen zeichnet sich die Erfindung durch eine Präparation von Mikropartikeln (auch Mikrosphären genannt) aus, von denen jedes eine Polymermatrix und einen Nukleinsäureexpressionsvektor enthält. Die Polymermatrix enthält ein oder mehrere synthetische Polymere, die eine Wasserlöslichkeit von weniger als etwa 1 mg/l aufweisen; in dem vorliegenden Kontext wird synthetisch als nicht-natürlich vorkommend definiert. Wenigstens 90% der Mikropartikel haben einen Durchmesser von weniger als etwa 100 μm. Bei der Nukleinsäure handelt es sich entweder um RNA, wenigstens 50% (und vorzugsweise wenigstens 70% oder sogar 80%) davon liegt in Form geschlossener Ringe vor, oder um zirkuläre DNA-Plasmid-Moleküle, wenigstens 25% (und vorzugsweise wenigstens 35%, 40%, 50%, 60%, 70% oder sogar 80%) davon liegen in Supercoil-Form vor. Ein einigen Fällen ist es für wenigstens 90% der Mikropartikel wünschenswert, einen Durchmesser von weniger als 20 μm zu haben und vorzugsweise von weniger als 11 μm. Die Nukleinsäure kann entweder durch das Mikropartikel verteilt sein oder in dem Kern eines Mikropartikels mit ausgehöhltem Kern vorliegen.
  • Die Herstellung kann auch eine Stabilisatorverbindung umfassen (z. B. ein Kohlenhydrat, eine kationische Verbindung oder ein DNA-verdichtendes Agens). Eine Stabilisatorverbindung ist eine Verbindung, die zum Schutz der Nukleinsäure (z. B. um sie in Supercoil-Form zu erhalten) zu jeder Zeit während der Herstellung der Mikropartikel wirkt. Beispiele von Stabilisatorverbindungen umfassen Dextrose, Sucrose, Dextran, Polyvinylalkohol, Cyclodextrin, Dextransulfat, kationische Peptide und Lipide wie zum Beispiel Hexadecyltrimethylammoniumbromid. Die Stabilisatorverbindung kann mit der DNA nach einer späteren Freisetzung von der Polymermatrix assoziiert bleiben.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zeichnet sich durch ein Mikropartikel von weniger als 20 μm Durchmesser aus, einschließlich einer Polymermatrix und Nukleinsäure. Die Polymermatrix wird aus einem oder mehreren synthetischen Polymeren hergestellt, die eine Wasserlöslichkeit von weniger als etwa 1 mg/l haben. Wenigstens 50% (und vorzugsweise wenigstens 70% oder sogar 80%) der Nukleinsäuremoleküle liegen in Form von Supercoil-DNA vor.
  • Die Polymermatrix kann biologisch abbaubar sein. Biologisch abbaubar wird hier in der Absicht verwendet, dass die Polymere über die Zeit in Verbindungen degradieren, welche bekanntermaßen aus den Wirtszellen durch die normalen Stoffwechselwege herausgelöst werden. Im Allgemeinen wird ein biologisch abbaubares Polymer im Wesentlichen innerhalb eines Monats nach Injektion in einen Patienten metabolisiert und mit Sicherheit innerhalb von etwa 2 Jahren. In bestimmten Fällen kann die Polymermatrix aus einem einzelnen synthetischen biologisch abbaubaren Copolymer bestehen, z. B. Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA). Das Gewichtsverhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure in dem Copolymer kann innerhalb des Bereiches von etwa 1:2 bis etwa 4:1 liegen, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von etwa 1:1 bis etwa 2:1 und ist am meisten bevorzugt etwa 65:35. In einigen Fällen enthält die Polymermatrix auch ein Targeting-Molekül wie zum Beispiel einen Liganden, Rezeptor oder Antikörper, um die Spezifität des Mikropartikels für einen gegebenen Zelltyp oder Gewebetyp zu erhöhen.
  • Für bestimmte Anwendungen hat das Mikropartikel einen Durchmesser von weniger als 11 μm. Das Mikropartikel kann in einer wässrigen Lösung (z. B. zur Verabreichung durch Injektion) suspendiert werden oder in Form eines trockenen Feststoffes (z. B. zur Speicherung oder Verabreichung über Inhalation oder Implantation) vorliegen. Die Nukleinsäure kann eine Expressionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer kodierenden Sequenz sein. Expressionskontrollsequenzen umfassen zum Beispiel alle Nukleinsäuresequenzen, die zur Regulation der Transkription oder Translation bekannt sind, wie zum Beispiel Promotoren, Enhancer oder Silencer. In bevorzugten Beispielen liegen wenigstens 60% oder 70% der DNA in Supercoil-Form vor. Bevorzugter sind wenigstens 80% in Supercoil-Form.
  • In einer anderen Ausführungsform zeichnet sich die Erfindung durch ein Mikropartikel von weniger als 20 μm im Durchmesser einschließlich einer Polymermatrix und einem Nukleinsäuremolekül (vorzugsweise in geschlossener zirkulärer Form) aus, worin das Nukleinsäuremolekül eine operativ zu einer kodierenden Sequenz verknüpfte Expressionskontrollsequenz enthält. Das durch die kodierende Sequenz kodierte Expressionsprodukt kann ein Polypeptid von wenigstens 7 Aminosäuren Länge sein, welches im Wesentlichen eine Sequenz aufweist, die identisch ist zu der Sequenz von entweder einem natürlich vorkommenden Säugerproteinfragment oder einem natürlich vorkommenden Proteinfragment eines Mittels, welches einen Säuger infiziert oder in anderer Weise schädigt; oder ein Peptid, das eine Länge und Sequenz aufweist, welche eine Bindung an ein Molekül der MHC-Klasse I oder II erlaubt. Beispiele werden in WO 94/04171 aufgezeigt, welche durch Bezugnahme darauf hier aufgenommen werden.
  • Im Wesentlichen identisch ist im Kontext einer DNA- oder Polypeptidsequenz hier in der Bedeutung definiert, dass sie nicht mehr als 25% von der natürlich vorkommenden Sequenz abweicht, wenn das bestmögliche Alignment mit der Referenzsequenz erstellt wird und wo die Unterschiede die gewünschte Funktion der DNA oder des Polypeptides in den Verfahren der Erfindung nicht nachteilig beeinflussen. Das Phrase-Fragment eines Proteins wird verwendet, um alles, was weniger als das ganze Protein darstellt, zu bezeichnen.
  • Das Peptid oder Polypeptid kann mit einer Traffic-Sequenz verknüpft werden. Der Begriff "Traffic-Sequenz" bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, welche ein mit ihr fusioniertes Polypeptid dazu veranlasst, entweder aus der Zelle abgesondert zu werden oder zu einem spezifischen Kompartiment der Zelle transportiert zu werden, z. B. zum Nucleus, endoplasmatischen Reticulum, zu einem Lysosom oder einem Endosom.
  • In der Ausführungsform bei der das Expressionsprodukt ein Peptid mit einer Länge und Sequenz enthält, welche eine Bindung an ein Molekül der MHC-Klasse I oder II erlaubt, ist das Expressionsprodukt typischerweise immunogen. Das Expressionsprodukt kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die von der Sequenz eines natürlich vorkommenden von einer T-Zelle erkannten Proteins mit einer Identität von nicht mehr als 25% seiner Aminosäurereste abweicht, wodurch dafür Sorge getragen wird, dass sie immer noch von der gleichen T-Zelle erkannt wird und die Cytokin-Profile der T-Zelle (d. h. ein "geänderter Peptid-Ligand") ändern kann. Die Unterschiede zwischen dem Expressionsprodukt und dem natürlich vorkommenden Protein können zum Beispiel konstruiert werden, um die Kreuzreaktivität zu pathogenen viralen Stämmen oder die HLA-Allotyp-Bindung zu erhöhen.
  • Beispiele von Expressionsprodukten, wo das Fragment das MHC-Klasse-II-Molekül binden kann, umfassen Aminosäuresequenzen mit wenigstens 50% Identität zu der Sequenz eines Fragmentes an Myelin-Basic-Protein (MBP), Proteolipidprotein (PLP), Invariant-Chain, GAD65, Inselzellantigen, Desmoglein, α-Crystallin oder β-Crystallin. Tabelle 1 listet viele solcher Expressionsprodukte auf, von denen angenommen wird, dass sie an einer Autoimmunkrankheit involviert sind. Fragmente dieser Proteine können im Wesentlichen identisch sein zu einer der SEQ ID NO: 1–46 wie zum Beispiel MBP-Reste 80–102 (SEQ ID NO: 1), PLP-Reste 170–191 (SEQ ID NO: 2) oder Invariant-Chain-Reste 80–124 (SEQ ID NO: 3). Andere Fragmente werden in Tabelle 2 aufgelistet.
  • Alternativ kann das Expressionsprodukt eine Aminosäuresequenz enthalten, die zu der Sequenz eines antigenen Teils von einer der in Tabelle 3 aufgelisteten Tumorantigene im Wesentlichen identisch ist, wie zum Beispiel jene, die kodiert werden durch E6- und E7-Gene vom humanen Papillomavirus, Her2/neu-Gen, das Gen vom Prostata-spezifischen Antigen, das Gen vom durch T-Zellen erkannten Melanoma-Antigen (MART) oder das Gen vom Melanoma-Antigen (MAGE). Wieder kann das Expressionsprodukt konstruiert werden, um die Kreuz-Reaktivität zu erhöhen. In noch anderen Fällen enthält das Genprodukt eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen zu der Sequenz eines antigenen Fragmentes oder Proteins identisch ist, welches natürlicherweise exprimiert wird durch ein Virus, beispielsweise ein Zellen chronisch infizierendes Virus wie zum Beispiel humanes Papillomavirus (HPV), humanes Immundefizienzvirus (HIV), Herpes-Simplex-Virus (HSV), Hepatitis-B-Virus (HBV) oder Hepatitis-C-Virus (HCV); durch ein Bakterium wie zum Beispiel Myco bakterien; oder durch einen parasitischen Eukaryonten wie zum Beispiel Spezies von Plasmodium. Eine repräsentative Liste solcher Klasse-I-bindender Fragmente sowie von Fragmenten der Tumorantigene wird in Tabelle 4 eingeschlossen.
  • In einer anderen Ausführungsform zeichnet sich die Erfindung durch ein Mikropartikel von weniger als 20 μm im Durchmesser einschließlich einer Polymermatrix und einem Nukleinsäuremolekül aus, worin das Nukleinsäuremolekül eine operativ zu einer kodierenden Sequenz verknüpfte Expressionskontrollsequenz enthält. Das durch die kodierende Sequenz kodierte Expressionsprodukt ist ein Protein, welches, wenn es exprimiert wird, eine Immunantwort herabreguliert. Beispiele solcher Proteine umfassen Tolerizing-Proteine, MHC-blockierende Peptide, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren und Cytokine.
  • In einer weiteren Ausführungsform zeichnet sich die Erfindung durch ein Verfahren zum Herstellen von Mikropartikeln aus. Eine erste Lösung, die ein in einem organischen Lösungsmittel aufgelöstes Polymer enthält, wird gemischt (z. B. durch Ultraschallbehandlung, durch Vortexen oder in einem Microfluidizer) mit einer zweiten Lösung, die eine Nukleinsäure enthält, welche in einem polaren oder hydrophilen Lösungsmittel (z. B. eine wässrige Pufferlösung, die beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder eine Kombination davon enthält, wahlweise ein DNA-verdichtendes Agens wie zum Beispiel ein kationisches Peptid, ein Lipid oder ein Dendrimer enthält) aufgelöst oder suspendiert wurde. Die Mixtur bildet eine erste Emulsion. Die erste Emulsion wird dann mit einer dritten Lösung gemischt, welche eine organische Verbindung (z. B. Polyvinylalkohol) enthält, um eine zweite Emulsion zu bilden, die Mikropartikel der Polymermatrix und Nukleinsäure enthält. Die Mischungsschritte können beispielsweise in einem Homogenisator, Vortex-Gerät, Microfluidizer oder Ultraschall-Gerät ausgeführt werden. Beide Mischungsschritte werden in einer Art und Weise ausgeführt, dass ein Scheren der Nukleinsäure minimiert wird, während Mikropartikel von durchschnittlich weniger als 100 μm im Durchmesser hergestellt werden.
  • Die zweite Lösung kann beispielsweise durch Säulenchromatographie oder in anderer Weise durch Reinigen der Nukleinsäure (z. B. durch Ethanol- oder Isopropanolfällung) zubereitet werden, dann wird die gereinigte oder gefällte Nukleinsäure in einer wässrigen, polaren oder hydrophilen Lösung suspendiert. TABELLE 1: Autoantigene
    Krankheit assoziiertes Antigen Anmerkungen
    Zöliakie α-Gliadin a
    Goodpasture-Syndrom Kollagen der Basalmembran a
    Graves-Krankheit Rezeptor des Schilddrüsen-stimulierenden a
    Hormons (TSH)
    Hashimoto-Thyreoiditis Thyreoglobulin a
    Isaac-Syndrom spannungsabhängige Kaliumkanäle b
    Insulin-abhängiger Diabetes Glutaminsäuredecarboxylase (GAD) a
    Insulinrezeptor a
    Insulin-assoziiertes Antigen (IA-w) a
    Hsp b
    Myasthenisches Syndrom nach Synaptogamin in spannungsabhängigen b
    Lambert-Eaton (LEMS) Calciumkanälen
    Multiple Sklerose Myelin-Basic-Protein (MBP) a
    Proteolipidprotein (PLP) a
    Myelin-Oligodendrozyt-assoziiertes a
    Protein (MOG)
    αB-Crystallin a
    Myasthenia gravis Acetylcholinrezeptor a
    Paraneoplastische Enzephalitis RNA-bindendes Protein HuD b
    Pemphigus vulgaris „PeV-Antigenkomplex" a
    Desmoglein (DG) c
    Primär biliäre Zirrhose Dihydrolipoamidacetyltransferase b
    Pyruvatdehydrogenase-Komplex 2 (PDC-E2) d
    Progressive systemische DNA-Topoisomerase a
    Sklerose
    RNA-Polymerase a
    Rheumatoide Arthritis Immunglobulin-Fc a
    Kollagen
    Sklerodermie Topoisomerase I b
    Stiff-Man-Syndrom Glutaminsäuredecarboxylase (GAD) a
    Systemischer Lupus ds-DNA a
    erythematosus
    Uveitis Retinoid-bindendes Protein des b
    Interphotorezeptors
    S-Antigen (Segment rod out) b
  • Referenzen:
    • a) HLA and Autoimmune Disease, R. Heard, Seiten 123–151 in HLA & Disease, Academic Press, New York, 1994, (Herausgeber R. Lechler)
    • b) Cell 80, 7–10 (1995)
    • c) Cell 67, 869–877 (1991)
    • d) JEM 181, 1835–1845 (1995)
  • TABELLE 2: Klasse-II-assoziierte Peptide
    Peptid SEQ ID NO: Protein vom Ursprung
    GRTQDENPVVHFFKNIVTPRTPP 1 MBP 80–102
    AVYVYIYFNTWTTCQFIAFPFK 2 PLP 170–191
    FKMRMATPLLMQA 3 Invariant chain 88–100
    TVGLQLIQLINVDEVNQIV
    TVGLQTTNVRLKQQWVDYNLKW 4 AChR α 32–67
    QIVTTNVRLKQQWVDYNLKW 5 AChR α 48–67
    QWVDYNL 6 AChR α 59–65
    GGVKKIHIPSEKIWRPDL 7 AChR α 73–90
    AIVKFTKVLLQY 8 AChR α 101–112
    WTPPAIFKSYCEIIVTHFPF 9 AChR α 118–137
    MKLGTWTYDGSVV 10 AChR α 144–156
    MKLGIWTYDGSVV 11 AChR α 144–157
    analog(1–148)
    WTYDGSVVA 12 AChR α 149–157
    SCCPDTPYLDITYHFVM 13 AChR α 191–207
    DTPYLDITYHFVMQRLPL 14 AChR α 195–212
    FIVNVIIPCLLFSFLTGLVFY 15 AChR α 214–234
    LLVIVELIPSTSS 16 AChR α 257–269
    STHVMPNWVRKVFIDTIPN 17 AChR α 304–322
    NWVRKVFIDTIPNIMFFS 18 AChR α 310–327
    IPNIMFFSTMKRPSREKQ 19 AChR α 320–337
    AAAEWKYVAMVMDHIL 20 AChR α 395–410
    IIGTLAVFAGRLIELHQQG 21 AChR α 419–437
    GQTIEWIFIDPEAFTENGEW 22 AChR γ 165–184
    MAHYNRVPALPFPGDPRPYL 23 AChR γ 476–495
    LNSKIAFKIVSQEPA 24 desmoglein 3 190–204
    TPMFLLSRNTGEVRT 25 desmoglein 3 206–220
    PLGFFPDHQLDPAFGA 26 HBS preS1 10–25
    LGFFPDHQLDPAFGANS 27 HBS preS1 11–27
    FFLLTRILTI 28 HBS Ag 19–28
    RILTIPQSLD 29 HBS Ag 24–33
    TPTLVEVSRNLGK 30 HSA 444–456
    AKTIAYDEEARR 31 hsp 65 2–13
    VVTVRAERPG 32 hsp 18 61–70
    SQRHGSKYLATASTMDHARHG 33 MBP 7–27
    RDTGILDSIGRFFGGDRGAP 34 MBP 33–52
    QKSHGRTQDENPVVHFFKNI 35 MBP 74–93
    DENPVVHFFKNIVT 36 MBP 84–97
    ENPVVHFFKNIVTPR 37 MBP 85–99
    HFFNIVTPATPP 38 MBP 90–102
    KGFKGVDAQGTLSK 39 MBP 139–152
    VDAQGTLSKIFKLGGRDSRS 40 MBP 144–163
    LMQYIDANSKFIGITELKK 41 Tetanus Toxoid 828–846
    QYIKANSKFIGIT 42 Tetanus Toxoid 830–842
    FNNFTVSFWLRVPK 43 Tetanus Toxoid 947–960
    SFWLRVPKVSASHLE 44 Tetanus Toxoid 953–967
    KFIIKRYTPNNEIDSF 45 Tetanus Toxoid 1174–1189
    GQIGNDPNRDIL 46 Tetanus Toxoid 1273–1284
    TABELLE 3: Tumor-Antigene
    Krebs Assoziiertes Antigen
    Melanom BAGE 2–10
    Brust/Eierstock c-ERB2 (Her2/neu)
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBNA-1
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBNA-2
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBNA-3
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBNA-3A
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBNA-3C
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBNA-4
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBNA-6
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBV
    Burkitt-Lymphom/Hodgkin-Lymphom EBV LMP2A
    Melanom GAGE-1
    Melanom gp75
    Gebärmutterhals HPV 16 E6
    Gebärmutterhals HPV 16 E7
    Gebärmutterhals HPV 18 E6
    Gebärmutterhals HPV 18 E7
    Melanom MAG
    Melanom MAGE-1
    Melanom MAGE-2
    Melanom MAGE-3
    Melanom MAGE-4b
    Melanom MAGE-5
    Melanom MAGE-6
    Melanom MART-1/Melan-A
    Pankreas/Brust/Eierstock MUC-1
    Melanom MUM-1-B
    Brust/Enddarm/Burkitt-Lymphom p53
    Melanom Pmel 17 (gp 100)
    Prostata PSA/Prostata-spezifisches Antigen
    Melanom Tyrosinase
    CEA/Carcino-Embryonales Antigen
    LRP/Lungen-Resistenz-Protein
    Bcl-2
    Ki-67
    TABELLE 4: Klasse-I-assoziierte Tumor- und pathogene Peptide
    Pepptid SEQ ID NO: Protein vom Ursprung
    AARAVFLAL 47 RAGE 2–10
    YRPRPRRY 48 GAGE-i 9–16
    EADPTGHSY 49 MAGE-i 161–169
    SAYGEPRKL 50 MAGE-1 230–238
    EVDPIGHLY 51 MAGB-3 161–169
    FLWGPRALV 52 MAGE-3 271–279
    GIGILTV 53 MART-1 29–35
    ILTVILGV 54 MART-1 32–39
    STAPPAHGV 55 MUC-1 9–17
    EEKLIVVLF 56 MUM-1 261–269
    MLLAVLYCL 57 TYROSINASE 1–9
    SEIWRDIDF 58 TYROSINASE 192–200
    AFLPWHRLF 59 TYROSINASS 206–214
    YMNGTMSQV 60 TYROSINASE 369–376
    KTWGQYWQV 61 PMEL 17 (GP100) 154–162
    ITDQVPFSV 62 PMEL 17 (GP100) 209–217
    YLEPGPTVA 63 PMEL 17 (GP100) 280–288
    LLDGTATLRL 64 PMEL 17 (GP100) 476–485
    ELNEALELEK 65 p53 343–351
    STPPPGTRV 66 p53 149–157
    LLPENNVLSPL 67 p53 25–35
    LLGRNSFEV 68 p53 264–272
    RMPEAAPPV 69 p53 65–73
    KIFGSLAFL 70 HER-2/neu 369–377
    IISAVVGIL 71 HER-2/neu 654–662
    CLTSTVQLV 72 HER-2/neu 789–797
    YLEDVRLV 73 HER-2/neu 835–842
    VLVKSPNHV 74 HER-2/neu 851–859
    RFRELVSEFSRM 75 HER-2/neu 968–979
    LLRLSEPAEL 76 PSA 119–128
    DLPTQBPAL 77 PSA 136–144
    KLQCVD 78 PSA 166–171
    VLVASRGRAV 79 PSA 36–45
    VLVHPQWVL 80 PSA 49–57
    DMSLLKNRFL 81 PSA 98–107
    QWNSTAFHQ 82 HBV envelope 121–130
    VLQAGFF 83 HBV envelope 177–184
    LLLCLIFL 84 HBV envelope 250–257
    LLDYQGML 85 HBV envelope 260–267
    LLVPFV 86 HBV envelope 338–343
    SILSPFMPLL 87 HBV envelope 370–379
    PLLPIFFCL 88 HBV envelope 377–385
    ILSTLPETTV 89 HBV core 529–538
    FLPSDFFPSV 90 HBV core 47–56
    KLHLYSRPI 91 HBV polymerase 489–498
    ALMPLYACI 92 HBV polymerase 642–651
    HLYSHPIIL 93 HBV polym. 1076–1084
    FLLSLGIHL 94 HBV polym. 1147–1153
    HLLVGSSGL 95 HBV polymerase 43–51
    GLSRYVARL 96 HBV polymerase 455–463
    LLAQFTSAI 97 HBV polymerase 527–535
    YMDDVVLGA 98 HBV polymerase 551–559
    GLYSSTVPV 99 HBV polymerase 61–69
    NLSWL 100 HBV polymerase 996–1000
    KLPQLCTEL 101 HPV 16 E6 18–26
    FQTTIHDII 102 HPV 16 E6 26–34
    FAFRDLCIV 103 HPP 16 E6 52–60
    YMLDLQPET 104 HPV 16 E7 11–19
    TLHEYMLDL 105 HPV 16 E7 7–15
    LLMGTLGIV 106 HPV 16 E7 82–90
    TLGIVCPI 107 HPV 16 E7 86–93
    LLMGTLGIVCPI 108 HPV 16 E7 82–93
  • Die zweite Lösung kann wahlweise ein Tensid, ein DNA-verdichtendes Agens oder eine Stabilisatorverbindung (z. B. 1–10% Dextrose, Sucrose, Dextran oder andere Kohlenhydrate, Polyvinylalkohol, Cyclodextrin, Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder Dextransulfat) enthalten, die die Nukleinsäure oder Emulsion durch Erhalten der Nukleinsäure in Supercoil-Form während der Verkapselung oder durch die Mikropartikelbildung hindurch stabilisiert.
  • Die zweite Emulsion wird wahlweise mit einer vierten Lösung gemischt, welche eine organische Verbindung wie zum Beispiel Polyvinylalkohol enthält. Die zweite Emulsion kann wahlweise einer erhöhten Temperatur (z. B. Raumtemperatur bis etwa 60°C) ausgesetzt werden (d. h. allein oder als Mischung mit der vierten Emulsion), um beispielsweise eine schnellere Verdunstung der Lösungsmittel zu erleichtern.
  • Das Verfahren kann den zusätzlichen Schritt des Waschens der Mikropartikel mit einer wässrigen Lösung enthalten, um organische Verbindungen zu entfernen, wodurch gewaschene Mikropartikel hergestellt werden. Die gewaschenen Mikropartikel können dann einer Temperatur unter 0°C ausgesetzt werden, um gefrorene Mikropartikel herzustellen, welche der Reihe nach lyophilisiert werden, um lyophilisierte Mikropartikel herzustellen. Die Mikropartikel können wahlweise in einem Exzipienten wie zum Beispiel Tween-80, Mannitol, Sorbitol oder Carboxymethylzellulose vor oder nach der Lyophilisierung (wenn eine durchgeführt wurde) suspendiert werden.
  • Wenn gewünscht, kann das Verfahren den zusätzlichen Schritt des Screenens der Mikropartikel enthalten, um solche, die größer als 100 μm (oder sogar 20 μm) im Durchmesser sind, zu entfernen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zeichnet sich durch eine Mikropartikelpräparation aus, welche eine Polymermatrix, eine proteinartige antigene Determinante und ein DNA-Molekül enthält, welches ein antigenes Polypeptid kodiert, das von der zuvor erwähnten proteinartigen antigenen Determinante verschieden sein kann oder dasselbe wie diese sein kann. Die antigene Determinante umfasst ein Epitop, welches eine Antikörperreaktion hervorrufen kann. Das von der DNA exprimierte antigene Polypeptid kann eine T-Zellantwort (z. B. eine CTL-Antwort) induzieren. Die DNA kann Plasmid-DNA sein und kann als die antigene Determinante im gleichen Mikropartikel kombiniert vorliegen oder die zwei können in verschiedenen Mikropartikeln vorkommen, welche dann zusammen gemischt werden. In einigen Fällen kann ein Oligonukleotid eher als eine proteinartige antigene Deter minante zusammen mit einem Nukleinsäureplasmid verkapselt werden. Das Oligonukleotid kann beispielsweise Antisense- oder Ribozymaktivität aufweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung gekennzeichnet durch ein Verfahren der Verabreichung von Nukleinsäure in ein Tier durch Einbringen jeder der in den vorherigen Abschnitten beschriebenen Mikropartikel in das Tier (z. B. ein Säuger wie zum Beispiel ein Mensch, nicht-humaner Primat, Pferd, Kuh, Schwein, Schaaf, Ziege, Hund, Katze, Maus, Ratte, Meerschwein, Hamster oder Frettchen). Die Mikropartikel können in einer Lösung (z. B. eine wässrige Lösung) suspendiert oder irgendeiner anderen geeigneten Formulierung bereitgestellt werden und können beispielsweise in das Tier injiziert oder implantiert (z. B. chirurgisch) werden oder durch Inhalation (z. B. intranasal) verabreicht werden. Sie können wahlweise in Verbindung mit einem Protein wie zum Beispiel ein Cytokin, ein Hormon, ein Interferon oder ein Antigen geliefert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform zeichnet sich die Erfindung durch eine Präparation von Mikropartikeln aus, von denen jedes eine Polymermatrix, eine stabilisierende Verbindung und einen Nukleinsäureexpressionsvektor enthält. Die Polymermatrix enthält ein oder mehrere synthetische Polymere, die eine Wasserlöslichkeit von weniger als etwa 1 mg/l aufweisen; in dem vorliegenden Kontext wird synthetisch als nicht-natürlich vorkommend definiert. Wenigstens 90% der Mikropartikel haben einen Durchmesser von weniger als etwa 100 μm. Die Nukleinsäure ist eine RNA, wenigstens 50% (und vorzugsweise wenigstens 70% oder sogar 80%) davon liegen in der Form geschlossener Ringe vor.
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie gewöhnlich durch einen normalen Fachmann verstanden wird, zu dem diese Erfindung gehört. Die Materialien, Methoden und Beispiele sind nur erläuternd und nicht dazu bestimmt, die Erfindung zu begrenzen.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen offensichtlich.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A bis 1C sind ein Satz von drei Plasmidkarten bzw. den Plasmiden von pvA2.1/4, Luciferase und VSV-Npep.
  • 2 ist ein Plot der Größenverteilung von DNA-enthaltenden Mikropartikeln, wie sie mit einem COULTERTM-Zähler analysiert wurde.
  • 3A und 3B sind ein Satz von Fotografien zweier Agarose-Elektrophosese-Gele, die den Grad der Erhaltung der Supercoil-Form der DNA als eine Funktion verschiedener Homogenisierungsgeschwindigkeiten und -dauern zeigt.
  • 4A und 4B sind ein Paar von FACS-Ausdrucken, welche die Zellpopulationen in Abwesenheit oder Anwesenheit der Mikropartikel vergleichen.
  • 5 bis 9 sind Plots von spezifischer Lyse versus Effektor:Target-Verhältnis.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die Mikropartikel der Erfindung werden in einem von zwei Wegen formuliert: (1) um die Verabreichung in die phagozytischen Zellen des Patienten zu maximieren oder (2) um eine Einlagerung in die Gewebe des Patienten zu bilden, von welcher die Nukleinsäure nach und nach freigesetzt wird; nach der Freisetzung aus dem Mikropartikel wird die Nukleinsäure durch benachbarte Zellen aufgenommen (einschließlich Antigen-präsentierende Zellen oder APCs). In beiden Fällen ist das Erhalten der Integrität der DNA eine Priorität. Für Plasmid-DNA bedeutet dieses das Maximieren des Prozentsatzes an Plasmidmolekülen, die in der Supercoil-Form vorliegen und dadurch stabiler und fähiger zur effizienten Transfektion oder Expression sind als Plasmide, die keine Supercoil-Form aufweisen (d. h. solche in Nick-Form oder lineare). Mittel zum Schützen der Integrität der Nukleinsäure umfassen das Minimieren der Scherkräfte, welchen die Nukleinsäure notwendigerweise im Verfahren der Mikropartikelbildung ausgesetzt ist, das Begrenzen von Ultraschallbehandlung sowie den Zeiten des Mischens während der Herstellung und das Hinzufügen von Puffer oder anderen Stabilisatorverbindungen während der Nukleinsäureisolation und -verkapselung. Beispielsweise ist es notwendig, ein Gleichgewicht zwischen Zeit und Intensität bei der Ultraschallbehandlung zu erreichen. Diese Verfahren werden unten diskutiert.
  • Die Mikropartikel der Erfindung können zur Herstellung eines Medikamentes beispielsweise für die Behandlung von Krebs, jeder der in Tabelle 1 aufgelisteten Autoimmunkrankheiten oder jedem anderen Gesundheitszustand, der mit einer speziell definierten Nukleinsäure behandelbar ist, verwendet werden.
  • Die Phagozytose der Mikropartikel durch Makrophagen, dendritische Zellen und andere APCs ist ein effektives Mittel für die Einbringung der Nukleinsäure in diese Zellen. Die Phagozytose durch diese Zellen kann durch ein Aufrechterhalten der Partikelgröße unter etwa 20 μm und vorzugsweise unter etwa 11 μm erhöht werden. Der in den Mikropartikeln verwendete Polymertyp kann auch die Effizienz der Aufnahme durch phagozytische Zellen beeinflussen, wie unten diskutiert wird.
  • Die Mikropartikel können direkt in den Blutstrom (d. h. durch intravenöse oder intraarterielle Injektion oder Infusion) geliefert werden, wo die Aufnahme durch phagozytische Zellen des reticuloendothelialen Systems (RES) gewünscht wird. Alternativ kann man die Aufnahme durch die phagozytischen Zellen der Lympfknotenbahnen über subkutane Injektion erzielen. Die Mikropartikel können auch intradermal (d. h. zu den APCs der Haut wie zum Beispiel den dendritischen Zellen oder Langerhanszellen), intramuskulär oder intranasal oder über andere Mucosastellen (d. h. für die Immunität der Mucosa) eingebracht werden. Letztlich können die Mikropartikel in die Lunge (z. B. durch Inhalation von pulverisierten Mikropartikeln oder von einer als Nebel oder Aerosol vorliegenden die Mikropartikel enthaltenden Lösung) eingebracht werden, wo die Partikel durch die alveolären Makrophagen aufgenommen werden.
  • Sobald eine phagozytische Zelle das Mikropartikel phagozytiert hat, wird die Nukleinsäure in das Innere der Zelle freigesetzt. Nach der Freisetzung kann sie ihre beabsichtigte Funktion ausüben: Zum Beispiel die Expression durch die normale zelluläre Transkriptions/Translationsmaschinerie (für einen Expressionsvektor) oder die Änderung zellulärer Prozesse (für Antisense- oder Ribozymmoleküle).
  • Weil diese Mikropartikel passiv zu den Makrophagen und anderen Typen phagozytischer Zellen gebracht werden, stellen sie ein Mittel für die Modulation der Immunfunktion dar. Makrophagen und dendritische Zellen dienen als professionelle APCs, die sowohl MHC-Moleküle der Klasse I als auch der Klasse-II exprimieren. Die über Mikropartikel ausgeführte Verabreichung eines Expressionsvektors, der ein Fremdantigen kodiert, welches an ein Molekül der MHC-Klasse I oder II bindet, wird eine T-Zellantwort des Wirtes gegen das Antigen induzieren, wodurch sich die Immunität des Wirtes ergibt.
  • Kodiert der Expressionsvektor ein blockierendes Peptid (blocking peptide; siehe z. B. WO 94/04171 ), das an ein in der Autoimmunität beteiligtes MHC-Klasse-II-Molekül bindet, wird die Präsentation des Autoimmunerkrankung-assoziierten Eigenpeptides (autoimmune disease-associated self peptide) durch das Klasse-II-Molekül verhindert und die Symptome der Autoimmunerkrankung werden gelindert.
  • In einem weiteren Beispiel kann ein MHC-bindendes Peptid, das identisch oder fast identisch zu einem Autoimmunität induzierenden Peptid ist, die T-Zellfunktion durch Tolerisierung und Anergisierung der T-Zelle beeinflussen. Alternativ könnte das Peptid zum Modulieren der T-Zellfunktion durch Ändern der Profile der Cytokinsekretion folgend der Erkennung des MHC/Peptid-Komplexes konstruiert werden. Durch T-Zellen erkannte Peptide können eine B-Zellen zur Produktion von Antikörpern einer einzelnen Klasse veranlassende Cytokinsekretion induzieren, eine Entzündung induzieren und weiter T-Zellantworten des Wirtes fördern.
  • Die Induktion der Immunantworten kann verschiedene Faktoren erfordern. Es ist diese multifaktorielle Natur, welche einen Antrieb für Manipulationsversuche von mit dem Immunsystem verbundenen Zellen mit den Mikropartikeln der Erfindung an vielen Fronten liefert. Beispielsweise können Mikropartikel hergestellt werden, welche sowohl DNA als auch Polypeptide innerhalb jedes Mikropartikels tragen. Diese Mikropartikel dualer Funktion werden unten diskutiert.
  • CTL-Antworten
  • Klasse-I-Moleküle präsentieren antigene Peptide unreifen T-Zellen. Um T-Zellen voll zu aktivieren, sind andere als die antigenen Peptide erforderlich. Nichtspezifische Proteine wie zum Beispiel Interleukin-2 (IL-2), IL-12 und gamma-Interferon (γ-IFN) fördern die CTL-Antworten und können zusammen mit der DNA bereitgestellt werden, die Polypeptide kodiert, welche CTL-Epitope enthalten. Alternativ können Proteine, welche Helfer-T-Determinanten (TH-Determinanten) tragen, mit der das CTL-Epitop kodierenden DNA eingeschlossen werden. TH-Epitope fördern die Sekretion von Cytokinen aus TH-Zellen und spielen eine Rolle in der Differenzierung von naszierenden T-Zellen in CTLs.
  • Alternativ könnten Proteine oder Nukleinsäuren, welche die Wanderung von Lymphozyten und Makrophagen zu einem bestimmten Gebiet fördern, in die Mikropartikel zusammen mit entsprechenden DNA-Molekülen eingeschlossen werden. Im Ergebnis wird die Aufnahme der DNA verstärkt, weil die Freisetzung von Protein einen Influx von phagozytischen Zellen und T-Zellen hervorrufen würde, wie das Mikropartikel degradiert. Die Makrophagen würden die verbleibenden Mikropartikel phagozytieren und als APC wirken und die T-Zellen würden Effektor-Zellen werden.
  • Antikörperantworten
  • Die Elimination von bestimmten infektiösen Mitteln aus dem Wirt kann sowohl Antikörper- als auch CTL-Antworten erfordern. Wenn das Influenzavirus in einen Wirt eindringt, können beispielsweise Antikörper oft dieses davon abhalten, die Wirtszellen zu infizieren. Wenn Zellen infiziert sind, dann ist jedoch eine CTL-Antwort erforderlich, um die infizierten Zellen zu eliminieren und die fortgesetzte Virusproduktion in dem Wirt zu verhindern.
  • Im Allgemeinen sind die Antikörperantworten gegen die konformationsbedingten Determinanten gerichtet und erfordern so die Anwesenheit eines Proteins oder eines Proteinfragmentes, das eine solche Determinante enthält. Im Gegensatz sind T-Zell-Epitope lineare Determinanten, die typischerweise gerade 7–25 Reste lang sind. Wenn es die Notwendigkeit der Induktion sowohl einer CTL- als auch einer Antikörperantwort gibt, können folglich die Mikropartikel sowohl ein antigenes Protein als auch eine ein T-Zell-Epitop kodierende DNA enthalten.
  • Die langsame Freisetzung des Proteins aus den Mikropartikeln würde zur B-Zell-Erkennung führen und zur nachfolgenden Antikörpersekretion. Zusätzlich würde die Phagozytose der Mikropartikel die APCs veranlassen, (1) die DNA von Interesse zu exprimieren, wodurch eine T-Zellantwort hervorgebracht wird, und (2) das aus den Mikropartikeln freigesetzte Protein zu verdauen, wodurch Peptide erzeugt werden, welche nachher durch Klasse-I- oder Klasse-II-Moleküle oder beide präsentiert werden. Die Präsentation durch Klasse-II-Moleküle fördert sowohl die Antikörper- als auch die CTL-Antworten, da TH-Zellen, die durch Klasse-II/Peptid-Komplexe aktiviert wurden, nichtspezifische Cytokine absondern.
  • Immunsuppression
  • Bestimmte Immunantworten führen zu Allergie und Autoimmunität und können so für den Wirt schädlich sein. In diesen Fällen gibt es ein Bedürfnis zum Inaktivieren Gewebeschädigender Immunzellen. Immunsuppression kann mit Mikropartikeln erreicht werden, die DNA tragen, welche für geänderte Peptidliganden, Tolerizing-Peptide oder Epitope kodiert (z. B. "Blocking"-Peptide), die TH-Zellen und CTLs nach unten regulieren. In diesen Mikropartikeln könnte der Effekt der immunsuppressiven DNA verstärkt werden durch Einschließen bestimmter Proteine in die Trägermikropartikel mit der DNA. Eine Liste solcher Proteine umfasst Antikörper, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, Hormone und Interleukine.
  • Beispielsweise können Antikörper gegen stimulierende Cytokine, Zelloberflächenrezeptoren oder Homing-Proteine wie zum Beispiel Integrine oder interzelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAMs) die Effizienz der Epitope der immunsuppressiven DNA erhöhen. Diese Proteine dienen der Hemmung der Antworten bereits aktivierter T-Zellen, während die DNA weiter die Aktivierung naszierender T-Zellen verhindert. Die Induktion regulatorischer T-Zellantworten kann durch das Cytokinmilieu beeinflusst werden, welches vorhanden ist, wenn der T-Zellrezeptor aktiv ist. Cytokine wie zum Beispiel IL-4, IL-10 und IL-6 fördern die TH2-Differenzierung in Reaktion auf das DNA-kodierte Epitop. TH2-Antworten können die Bildung der TH1-Zellen und der entsprechenden schädliche Antworten hemmen, welche in der Pathologie von rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose und juvenilem Diabetes resultieren.
  • Der Einschluss von Proteinen, die lösliche Formen costimulierender Moleküle (z. B. CD-40, gp-39, B7-1 und B7-2) oder in der Apoptose beteiligter Moleküle (z. B. Fas, FasL, Bc12, Caspase, bax, TNFα, TNF-Rezeptoren) umfassen, ist ein weiterer Weg zum Hemmen der Aktivierung der einzelnen T-Zell- und/oder B-Zellantworten. Beispielsweise ist B7-1 in der Aktivierung von TH1-Zellen beteiligt und B7-2 aktiviert TH2-Zellen. In Abhängigkeit von der erforderlichen Antwort könnte das eine oder andere dieser Proteine in das Mikropartikel mit DNA eingeschlossen werden oder könnte in separaten Mikropartikeln bereitgestellt werden, die mit DNA-enthaltenden Mikropartikeln gemischt werden.
  • Mikropartikel zur Implantation
  • Eine zweite Mikropartikelformulierung der Erfindung ist nicht für die Aufnahme direkt durch die Zellen vorgesehen, sondern dient eher primär als ein langsam freisetzender Vorratsbehälter der Nukleinsäure, die nur nach der Freisetzung von dem Mikropartikel durch biologischen Abbau von den Zellen aufgenommen wird. Die Nukleinsäure kann mit einem Stabilisator zu einem Komplex verbunden werden (z. B. um die Integrität der Nukleinsäure während dem langsamen Freisetzungsprozess zu erhalten). Die Polymerpartikel in dieser Ausführungsform sollten dafür groß genug sein, um eine Phagozytose auszuschließen (d. h. größer als 5 μm und vorzugsweise größer als 19 μm). Solche Partikel werden durch die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung der kleineren Partikel produziert, aber mit weniger starkem Vermischen der zuvor erwähnten ersten oder zweiten Emulsionen. Das bedeutet, dass eine niedrigere Geschwindigkeit der Homogenisierung, Geschwindigkeit der Vermischung durch Vortexen oder Einstellung der Ultraschallbehandlung verwendet werden kann, um eher Partikel mit einen Durchmesser von etwa 100 μm als wie von 5 μm zu erhalten. Die Vermischungszeit, die Viskosität der ersten Emulsion oder die Konzentration des Polymers in der ersten Lösung kann auch verändert werden, um die Partikeldimension zu beeinflussen.
  • Die größeren Mikropartikel können als eine Suspension, ein Puder oder ein implantierbarer Feststoff formuliert werden, um durch intramuskuläre, subkutane, intradermale, intravenöse oder intraperitoneale Injektion; über Inhalation (intranasal oder intrapulmonär); oral oder durch Implantation bereitgestellt zu werden. Diese Partikel sind nützlich für die Verabreichung eines Expressionsvektors oder einer anderen Nukleinsäure, für welche eine langsame Freisetzung über eine relativ lange Periode gewünscht wird: z. B. ein Antisense-Molekül, ein Gen-Ersetzungs-Therapeutikum, ein Mittel zum Liefern eines Cytokin- basierenden, Antigen-basierenden oder Hormonbasierenden Therapeutikums, oder ein immunsuppressives Agens. Die Rate des Abbaus und folglich der Freisetzug variiert mit der Polymerformulierung. Dieser Parameter kann verwendet werden, um die Immunfunktion zu kontrollieren. Man würde beispielsweise eine relativ langsame Freisetzung zur Bereitstellung von IL-4 oder IL-10 und eine relativ schnelle Freisetzung zur Bereitstellung von IL-2 oder γ-IFN wollen.
  • Zusammensetzung der Polymerpartikel
  • Das Polymermaterial wird von kommerziellen Quellen erhalten oder kann durch bekannte Methoden hergestellt werden. Beispielsweise können die Polymere von Milch- und Glykolsäure erzeugt werden, wie in US-Patent-Nr. 4,293,539 beschrieben, oder von Aldrich gekauft werden.
  • Alternativ oder zusätzlich kann die Polymermatrix Polylactid, Polyglycolid, Poly(lactid-co-glycolid), Polyanhydrid, Polyorthoester, Polycaprolacton, Polyphosphazen, proteinartiges Polymer, Polypeptid, Polyester oder Polyorthoester enthalten.
  • Bevorzugte Substanzen zur kontrollieren Freisetzung, welche in den Formulierungen der Erfindung nützlich sind, schließen die Polyanhydride, co-Polymere der Milch- und Glycolsäure, wobei das Gewichtsverhältnis Milchsäure zu Glykolsäure nicht mehr als 4:1 beträgt, und die einen Abbau-verstärkenden Katalysator wie zum Beispiel ein Anhydrid, beispielsweise 1% Apfelsäureanhydrid, enthaltenden Polyorthoester ein. Da Polymilchsäure wenigstens ein Jahr zum Abbau in vivo benötigt, sollte dieses Polymer selber nur unter Umständen verwendet werden, wo ein verlängerter Abbau wünschenswert ist.
  • Assoziation von Nukleinsäure und Polymerpartikeln
  • Nukleinsäuren enthaltende Polymerpartikel können unter Verwendung eines doppelten Emulsionsverfahrens hergestellt werden. Zuerst wird das Polymer in einem organischen Lösungsmittel aufgelöst. Ein bevorzugtes Polymer ist Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA), mit einem Gewichtsverhältnis Milchsäure/Glykolsäure von 65:35, 50:50 oder 75:25. Als nächstes wird eine in wässriger Lösung suspendierte Nukleinsäureprobe zu der Polymerlösung dazugegeben und die zwei Lösungen werden gemischt, um eine erste Emulsion zu bilden. Die Lösungen können durch Vortexen oder Schütteln vermischt werden oder die Mischung kann mit Ultraschall behandelt werden. Die Emulsion kann in einem Microfluidizer hergestellt werden. Am meisten bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem die Nukleinsäure die wenigste Beschädigung in Form von Nicking, Scherung oder Abbau erhält, während immer noch die Bildung einer entsprechenden Emulsion gewährt wird. Beispielsweise können akzeptable Ergebnisse mit einem Vibra-Cell-Ultraschallgerät Model VC-250 mit einer 1/8-Zoll großen Mikrospitzensonde bei der Einstellung #3 erhalten werden oder durch Kontrollieren des Druckes in dem Microfluidizer.
  • Während diesem Verfahren bilden sich Wassertröpfchen (die die Nukleinsäure enthalten) innerhalb des organischen Lösungsmittels. Wenn es gewünscht wird, kann man eine kleine Menge an Nukleinsäure zu diesem Punkt isolieren, um die Integrität zu beurteilen, z. B. durch Gelelektrophorese.
  • Es hat sich herausgestellt, dass die Alkoholfällung oder andere Formen der Reinigung von Nukleinsäure vor der Suspension in der wässrigen Lösung die Effizienz der Verkapselung verbessern können. Die Alkoholfällung erbrachte eine bis zu 147%ige Erhöhung an aufgenommener DNA und die Isopropanolfällung erhöhte die Aufnahme um bis zu 170%.
  • Die Natur der wässrigen Lösung kann den Ertrag an DNA in Supercoil-Form beeinflussen. Beispielsweise kann die Anwesenheit von Detergenzien wie zum Beispiel Polymyxin B, welche oft zur Entfernung von Endotoxinen während der Präparation und Reinigung von DNA-Proben verwendet werden, zu einer Verringerung in der Effizienz der DNA-Verkapselung führen. Es kann notwendig sein, die negativen Wirkungen auf die Verkapselungseffizienz mit den positiven Wirkungen auf das Erhalten der Supercoil-Form auszubalancieren, besonders wenn Detergenzien, Tenside und/oder Stabilisatoren während der Verkapselung gebraucht werden. Weiterhin erbrachte entsprechend der Analyse durch Gelelelektrophorese die Zugabe von Pufferlösungen, die entweder Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder eine Kombination aus IRIS und EDTA (TE) enthalten, eine Stabilisierung der Plasmid-DNA in Supercoil-Form. pH-Effekte werden auch beobachtet. Von anderen stabilisierenden Verbindungen wie zum Beispiel Dextransulfat, Dextrose, Dextran, CTAB, Cyclodextrin und Sucrose wurde auch gefunden, dass sie die Stabilität und den Grad der Erhaltung der Supercoil-Form der DNA entweder allein oder in Kombination mit TE-Puffer verstärken. Kombinationen von Stabilisatoren können verwendet werden, um die Menge an verkapselter DNA in Supercoil-Form zu erhöhen. Stabilisatoren wie zum Beispiel geladene Lipide (z. B. CTAB), kationische Peptide oder Dendrimere (J. Controlled Release, 39: 357, 1996) können die DNA verdichten oder fällen. Weiter können Stabilisatoren eine Wirkung auf die physikalische Natur der Partikel haben, die während dem Verkapselungsverfahren gebildet werden. Beispielsweise kann die Anwesenheit von Zuckern oder Tensiden während dem Verkapselungsverfahren poröse Partikel mit porösen inneren oder äußeren Strukturen erzeugen, die einen schnelleren Austritt eines Arzneimittels aus dem Partikel erlauben. Die Stabilisatoren können zu jeder Zeit während der Herstellung der Mikrosphären wirken: Beispielsweise während der Verkapselung oder der Lyophilisierung oder beides.
  • Die erste Emulsion wird dann zu einer organischen Lösung zugegeben, um die Bildung der Mikropartikel zu erlauben. Die Lösung kann beispielsweise Methylenchlorid, Ethylacetat oder Aceton umfassen, vorzugsweise Polyvinylalkohol (PVA) enthalten und weist am meisten bevorzugt ein Verhältnis von 1:100 vom Gewicht von PVA zum Volumen der Lösung auf. Die erste Emulsion wird im Allgemeinen zu der organischen Lösung unter Rühren in einem Homogenisator (z. B. ein Silverson-Homogenisator Modell L4RT (5/8-Zoll-Sonde) bei 7000 Upm für 12 Sekunden; eine Homogenisierungszeit von 60 Sekunden würde bei dieser Homogenisierungsgeschwindigkeit zu rau sein) oder einem Microfluidizer hinzugegeben.
  • Dieser Prozess bildet eine zweite Emulsion, welche nachher zu einer weiteren Lösung, die eine organische Verbindung (z. B. PVA) enthält, unter Rühren (z. B. in einem Homogenisator oder auf einer Rührerplatte) hinzugegeben wird. Dieser Schritt bewirkt die Freisetzung des ersten organischen Lösungsmittels (z. B. Dichlormethan) und die Mikrosphären werden gehärtet. Alternativ kann Wärme verwendet werden, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu beschleunigen. Die langsame Freisetzung des organischen Lösungsmittels (z. B. bei Raumtemperatur) führt zu "schwammigen" Partikeln, die eine durch und durch hoch poröse Struktur aufweisen, während eine schnelle Freisetzung (z. B. bei erhöhter Temperatur) Mikropartikel mit ausgehöhltem Kern ergibt. Letztere Lösung kann beispielsweise 0,05% PVA (w/v) sein. Wenn Zucker oder andere Verbindungen zu der DNA zugegeben werden, kann eine gleiche Konzentration der Verbindung zu der dritten oder vierten Lösung zugegeben werden, um die Osmolarität anzugleichen, wodurch der Verlust von Nukleinsäure aus der Mikrosphäre während dem Härtungsprozess effektiv verringert wird. Die entstandenen Mikropartikel werden mehrmals mit Wasser gewaschen, um organische Verbindungen zu entfernen. Die Teilchen können Siebe passieren, um diejenigen selektiv zu entfernen, die größer als die gewünschte Größe sind. Wenn die Größe der Mikropartikel nicht kritisch ist, kann man ohne den Größenselektionsschritt auskommen. Nach dem Waschen können die Partikel entweder sofort verwendet werden oder zur Aufbewahrung lyophilisiert werden.
  • Größere Partikel wie zum Beispiel solche, die zur Implantation verwendet werden, können durch den Gebrauch weniger kräftiger Bedingungen der Emulsionsbildung während der Herstellung der ersten Emulsion erhalten werden, wie schon oben ausführlich beschrieben wurde. Größere Partikel könnten beispielsweise durch Ändern der Polymerkonzentration, Ändern der Viskosität der Emulsion, Ändern der Partikelgröße der ersten Emulsion (z. B. können größere Partikel durch Verringern des verwendeten Druckes hergestellt werden, während die erste Emulsion in einem Microfluidizer geschaffen wird) oder Homogenisieren mit beispielsweise dem Silverson-Homogenisatorsatz bei 5000 Upm für etwa 12 Sekunden erhalten werden.
  • Die zurückgewonnenen Mikropartikel können in einem Exzipienten suspendiert werden, ohne die Menge an Plasmid-DNA in Supercoil-Form innerhalb der Mikrosphären negativ zu beeinflussen. Exzipienten werden oft in der Arzneimittelformulierung verwendet und sorgen hier für eine wirksame Resuspension der Mikrosphären, vermeiden ein Absetzen und halten die Mikrosphären in der Suspension. Entsprechend der Analyse durch Gelelektrophorese haben Exzipienten (einschließlich Tween 80, Mannitol, Sorbitol und Carboxymethylzellulose) keine Wirkung auf die DNA-Stabilität oder ihre Erhaltung der Supercoil-Form.
  • Nach Rückgewinnung der Mikrosphären oder der Mikrosphärensuspension in einem Exzipienten können die Proben für den zukünftigen Gebrauch gefroren und lyophilisiert werden.
  • Charakterisierung der Mikropartikel
  • Die Größenverteilung der durch obiges Verfahren hergestellten Mikropartikel kann mit einem COULTERTM-Zähler bestimmt werden. Dieses Instrument liefert ein Profil der Größenverteilung und eine statistische Analyse der Partikel. Alternativ kann die Durchschnittsgröße der Partikel durch Betrachtung unter einem Mikroskop bestimmt werden, das für einen Objektträger oder ein Okular zur Größenbestimmung angepasst wurde.
  • Wenn es gewünscht wird, kann die Nukleinsäure aus den Mikropartikeln zwecks Analyse durch das folgende Verfahren extrahiert werden. Mikropartikel werden in einem organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel Chloroform oder Methylenchlorid in der Anwesenheit einer wässrigen Lösung aufgelöst Das Polymer bleibt in der organischen Phase, während die DNA in die wässrige Phase geht. Die Grenzfläche zwischen den Phasen kann durch Zentrifugation deutlicher gemacht werden. Die Isolation der wässrigen Phase erlaubt die Rückgewinnung der DNA. Zum Nachweis der Degradation kann die extrahierte Nukleinsäure durch HPLC oder Gelelektrophorese analysiert werden.
  • Um die Rückgewinnung der Nukleinsäure zu erhöhen, können vor der Zugabe der wässrigen Lösung zusätzliche organische Lösungsmittel wie zum Beispiel Phenol und Chloroform zu den aufgelösten Mikropartikeln zugegeben werden. Nach der Zugabe der wässrigen Lösung geht die Nukleinsäure in die wässrige Phase, welche leicht aus der organischen Phase nach dem Mischen abgeteilt wird. Für eine saubere Grenzfläche zwischen organischer und wässriger Phase sollten die Proben zentrifugiert werden. Die Nukleinsäure wird aus der wässrigen Phase durch Fällung mit Salz und Ethanol entsprechend den Standardverfahren wiedergewonnen.
  • Intrazelluläre Verteilung der Mikropartikel
  • DNA-enthaltende Mikropartikel werden in Saline, gepufferter Salzlösung, Gewebekulturmedium oder anderen physiologisch akzeptablen Trägern resuspendiert. Für den Gebrauch in vitro/ex vivo kann die Mikropartikelsuspension entweder zu kultivierten adhärenten Säugerzellen oder zu einer Zellsuspension gegeben werden. Nach einer 1–24-stündigen Inkubationsperiode werden jene nicht aufgenommenen Partikel durch Aspiration oder Zentrifugation über fötalem Kälberserum entfernt. Die Zellen können entweder sofort analysiert oder für eine zukünftige Analyse rekultiviert werden.
  • Die Aufnahme der Nukleinsäure enthaltenden Mikropartikel in die Zellen kann durch PCR bestimmt werden oder durch Nachweisen der Nukleinsäureexpression. Beispielsweise könnte man die Transkription der Nukleinsäure mit einem Northern-Blot, Reverser-Transcriptase-PCR oder RNA-Mapping messen. Proteinexpression kann mit einem geeigneten, auf Antikörpern basierenden Assay oder mit einem auf das durch die Nukleinsäure kodierte Polypeptid zugeschnittenen funktionellen Assay gemessen werden. Beispielsweise können Zellen, die eine Luciferase kodierende Nukleinsäure exprimieren, wie folgt untersucht werden: Nach der Lyse in einem geeigneten Puffer (z. B. Kulturreagenz zur Zelllyse von Promega Corp, Madison WI), wird das Lysat zu einem Luciferin enthaltenden Substrat (Promega Corp) zugegeben und die erzeugte Lichtmenge in einem Luminometer oder Scintillationszähler gemessen. Die erzeugte Lichtmenge ist direkt proportional zu der Expression des Luciferasegens.
  • Wenn die Nukleinsäure ein Peptid kodiert, das bekannterweise mit einem MHC-Molekül der Klasse I oder Klasse II interagiert, kann ein für den MHC-Molekül/Peptid-Komplex spezifischer Antikörper verwendet werden, um den Komplex auf der Zelloberfläche der Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (fluorescence activated cell sorter/FACS) zu bestimmen. Solche Antikörper können mit Standardverfahren hergestellt werden (Murphy et al. Nature, Vol. 338, 1989, S. 765–767). Nach der Inkubation mit den Mikropartikeln, die eine das Peptid kodierende Nukleinsäure enthalten, werden die Zellen für 10–120 Minuten mit den spezifischen Antikörper in Gewebekulturmedium inkubiert. Überschüssiger Antikörper wird durch Waschen der Zellen in dem Medium entfernt. Ein fluores zenzmarkierter sekundärer Antikörper, welcher den ersten Antikörper bindet, wird mit den Zellen inkubiert. Diese sekundären Antikörper sind oft kommerziell erhältlich oder können unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden. Überschüssiger sekundärer Antikörper muss vor der FACS-Analyse weggewaschen werden.
  • Man kann auch einen Assay durchführen durch Betrachten der T- oder B-Effektorzellen. Beispielsweise kann die T-Zellproliferation, zytotoxische Aktivität, Apoptose oder Cytokin-Sekretion gemessen werden.
  • Alternativ kann man direkt die intrazelluläre Verabreichung der Partikel durch den Gebrauch fluoreszenzmarkierter Nukleinsäuren demonstrieren und die Zellen mittel FACS analysieren. Die Internalisation der fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure bewirkt ein Fluoreszieren der Zelle über dem Hintergrundsniveau. FACS ist besonders nützlich für eine Optimierung der Bedingungen der Verabreichung der Nukleinsäuren in vitro oder in vivo, weil sie schnell und quantitativ ist. Nach einer solchen Optimierung wird der Gebrauch des Fluoreszenzmarkers unterbrochen.
  • Wenn die Nukleinsäure selber direkt die Zellfunktion beeinflusst, z. B. wenn sie ein Ribozym oder ein Antisense-Molekül ist oder in eines transkribiert wird, kann ein passender Funktionstest verwendet werden. Wenn beispielsweise die Ribozym- oder Antisense-Nukleinsäure zur Verringerung der Expression eines bestimmten Zellproteins konstruiert wurde, kann die Expression von diesem Protein überwacht werden.
  • In-Vivo-Verabreichung der Mikropartikel
  • Nukleinsäure enthaltende Mikropartikel können in Säuger intramuskulär, intravenös, intraarteriell, intradermal, intraperitoneal, intranasal oder subkutan injiziert werden oder sie können in den Verdauungstrakt oder in die Atmungswege z. B. durch Inhalation einer Lösung oder eines Pulvers mit den Mikropartikeln eingebracht werden. Die Expression der Nukleinsäure wird durch ein geeignetes Verfahren überwacht. Beispielsweise wird die Expression einer ein immunogenes Protein von Interesse kodierenden Nukleinsäure durch die Suche nach einer Antikörper- oder T-Zellantwort auf das Protein getestet.
  • Antikörperantworten können durch das Testen von Serum in einem ELISA-Assay gemessen werden. In diesem Assay wird eine 96-Mulden-Platte mit dem Protein von Interesse beschichtet und es werden serielle Verdünnungen des Serums aus dem Versuchssubjekt in jede Mulde pipettiert. Ein sekundärer Enyzm-verknüpfter Antikörper wie zum Beispiel anti-Mensch-Meerettichperoxidase-verknüpfter Antikörper wird dann in die Mulden zugegeben. Wenn in dem Serum des Versuchssubjektes Antikörper gegen das Protein von Interesse vorhanden sind, werden sie das an der Platte fixierte Protein binden und werden der Reihe nach durch den sekundären Antikörper gebunden. Ein Substrat für das Enzym wird zu der Mixtur zugegeben und eine colorimetrische Änderung wird in einem ELISA-Platten-Lesegerät quantifiziert. Eine positive Serumantwort zeigt, dass das durch die DNA der Mikropartikel kodierte immunogene Protein in dem Versuchssubjekt exprimiert wurde und eine Antikörperantwort stimulierte. Alternativ kann ein ELISA-Spot-Assay angewendet werden.
  • Die T-Zellproliferation in Antwort auf ein Protein nach der intrazellulären Verabreichung der Mikropartikel, die die Protein kodierende Nukleinsäure enthalten, wird durch Untersuchen der T-Zellen, die in der Milz, den Lymphknoten oder peripheren Blutlymphozyten eines Versuchstieres anwesend sind, gemessen. Die aus einer solchen Quelle erhaltenen T-Zellen werden mit syngenen (genetisch identischen) APCs in Anwesenheit des Proteins oder Peptides von Interesse inkubiert. Die T-Zellproliferation wird durch die Aufnahme von 3H-Thymidin entsprechend den Standardverfahren kontrolliert. Die in die Zellen aufgenommene Menge an Radioaktivität steht in direktem Zusammenhang zu der Intensität der Proliferationsantwort, die in dem Versuchssubjekt durch Expression der durch Mikropartikel gelieferten Nukleinsäure induziert wurde. Eine positive Antwort zeigt, dass die Mikropartikel, welche die das Protein oder Peptid kodierende DNA enthalten, durch die APCs aufgenommen und in vivo exprimiert wurde.
  • Die Erzeugung zytotoxischer T-Zellen kann in einem Standard-51Cr-Freisetzungsassay demonstriert werden. In diesen Assays werden Milzzellen oder periphere Blutlymphozyten, die von dem Versuchssubjekt erhalten wurden, in Anwesenheit von syngenen APCs und entweder dem Protein von Interesse oder einem von diesem Protein stammenden Epitop kultiviert. Nach einem Zeitraum von 4–6 Tagen werden die zytotoxischen Effektor-T-Zellen mit 51Cr-markierten Zielzellen, die ein aus dem Protein von Interesse abgeleitetes Epitop exprimieren, gemischt. Wenn das Versuchssubjekt eine zytotoxische T-Zellantwort gegen das Protein oder Peptid entwickelt, welches durch die in dem Mikropartikel enthaltene Nukleinsaure kodiert wird, werden die zytotoxischen T-Zellen die Ziele auflösen. Aufgelöste Ziele werden das radioaktive 51Cr in das Medium freigeben. Aliquots des Mediums werden in einem Scintillationszähler auf Radioaktivität geprüft. Assays wie zum Beispiel der ELISA können auch verwendet werden, um Cytokin-Profile zu messen.
  • Im Folgenden werden Beispiele aus der Praxis der Erfindung gegeben. Sie sind nicht als Begrenzung der Reichweite der Erfindung in irgendeinem Weg auszulegen.
  • BEISPIEL 1: Inkorporation der DNA;
  • Analyse der Partikelgröße und DNA-Integrität
  • Präparation der DNA für die Inkorporation
  • Plasmid-DNA wurde durch Standardverfahren unter Verwendung vom MEGA-PREPTM-Kit (Qiagen) entsprechend den Herstelleranleitungen präpariert. Ein Endotoxin-freies Puffer-Kit (Qiagen) wurde für alle DNA-Manipulierungen verwendet. Die DNA wurde in destilliertem, deionisiertem sterilem Wasser resuspendiert, um eine Endkonzentration von 3 μg/μl zu erhalten. 1 zeigt die Plasmidkarten von DNA-Expressionsvektoren, welche a) Luciferase, b) ein VSV-Npep genanntes Peptidepitop des vesiculären Stomatitisvirus (VSV/vesicular stomatitis virus) und c) ein A2.1/4 genanntes Peptidepitop des humanen Papillomavirus (HPV/human papilloma virus) kodieren.
  • Assoziation der DNA mit PLGA
  • 200 mg an Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) (Aldrich, Verhältnis 65:35 von Milchsäure zu Glykolsäure) wurden in 5–7 ml Methylenchlorid aufgelöst. 300 μl der oben zubereiteten DNA-Lösung, die 900 μg DNA enthält, wurden zu der PLGA-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde in einem SONIC-DISMEMBRATORTM Model 550 (Fisher Scientific) mit der Einstellung #3 für 5–60 Sekunden mit Ultraschall behandelt und die entstehende Emulsion wurde analysiert. Eine DNA mit befriedigender Integrität (wie unten bestimmt) enthaltende Emulsion, die geprüft wurde, dass sie Partikel der gewünschten Größe enthält, wurde in einen Becher gegeben, der 50 ml wässrigen 1%igen (w/v) Polyvinylalkohol (PVA) (Molekulargewichtsbereich: 30–70 kD) enthält. Die Mischung wurde in einem POWERGENTM-Homogenisator (Fisher Scientific) bei 3000–9000 Upm für 5–60 Sekunden homogenisiert. Wieder wurde die DNA-Integrität analysiert. In den Fällen, bei denen die DNA als ausreichend intakt vorgefunden wurde, wurde die resultierende zweite Emulsion in einen zweiten Becher unter beständigem Rühren transferiert, der 100 ml wässrigen 0,05%igen PVA enthält. Das Rühren wurde für 2–3 Stunden fortgesetzt.
  • Die Mikropartikellösung wurde in ein 250-ml-Zentrifugenröhrchen gegossen und bei 2000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Die Röhrcheninhalte wurden dekantiert und die sedimentierten Partikel wurden in 100 ml deionisiertem Wasser resuspendiert. Nach Wiederholen der Zentrifugations- und Dekantierungsschritte wurde die Partikel in flüssigem Stickstoff eingefroren und schließlich bis zur Trockenheit lyophilisiert.
  • Analyse des Größenprofils der Mikropartikel
  • 5 mg lyophilisierte Mikropartikel wurden in 200 μl Wasser resuspendiert. Die resultierende Suspension wurde etwa 1:10.000 für die Analyse mit einem COULTERTM-Zähler verdünnt. 2 ist ein Ausdruck aus dem COULTERTM-Zähler, welcher anzeigt, dass ungefähr 85% der Mikropartikel zwischen 1,1 und 10 μm im Durchmesser groß waren.
  • Bestimmung der DNA-Integrität
  • 2–5 μg der Mikropartikel wurden mit 10 μl Wasser in einem EPPENDORFTM-Röhrchen angefeuchtet. 500 μl Chloroform wurden unter gründlichem Mischen zugegeben, um die Polymermatrix aufzulösen. 500 μl Wasser wurden zugegeben, wieder mit Mischen. Die resultierende Emulsion wurde bei 14.000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde in ein sauberes EPPENDORFTM-Röhrchen transferiert, zusammen mit 2 Volumenäquivalenten an Ethanol und 0,1 Volumenäquivalenten an 3 M wässrigem Natriumacetat. Die Mischung wurde bei 14.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde die pelletierte DNA in 50 μl Wasser resuspendiert. 5 μg DNA wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel neben einem Standard, der die Input-DNA enthält, elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA im Gel wurde auf einem UV-Lichtkasten sichtbar gemacht. Der Vergleich mit dem Standard gibt einen Hinweis auf die Integrität der DNA der Mikropartikel. Das Verfahren der Mikropartikelbildung wurde als erfolgreich betrachtet, wenn die aufgenommene DNA einen hohen Prozentsatz an DNA in Supercoil-Form im Vergleich zu der Input-DNA behielt.
  • Wie in den 3A und 3B angezeigt, stehen Geschwindigkeit und Dauer der Homogenisierung invers mit der DNA-Integrität im Zusammenhang. 3A schildert die aus Mikropartikeln isolierte DNA, die durch Homogenisierung bei 7000 Upm für 1 Minute (Spur 1) erzeugt wurde, und die Input-DNA in Supercoil-Form (Spur 2). 3B zeigt die aus Mikropartikeln isolierte DNA, die durch Homogenisierung bei 7000 Upm für 5 Sekunden erzeugt wurde (Spur 1), aus Mikropartikeln isolierte DNA, die durch Homogenisierung bei 5000 Upm für 1 Minute erzeugt wurde (Spur 2), und die Input-DNA in Supercoil-Form (Spur 3).
  • BEISPIEL 2: Präparation von DNA und Mikrosphären
  • DNA-Präparation
  • 500-ml-Bakterienkulturen wurden in Ein-Liter-Zentrifugenflaschen gegossen. Die Kulturen wurden bei 4000 Upm bei 20°C für 20 Minuten zentrifugiert. Die Medien wurden von den pelletierten Bakterien abgegossen. Das Bakterienpellet wurde vollständig in 50 ml Puffer P1 (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 100 μg/ml RNAse) resuspendiert, es wurden keine Klümpchen übrig gelassen. 50 ml Puffer P2 (200 mM NaOH, 1% SDS) wurden unter sanftem Herumwirbeln dazugegeben und die Suspensionen wurden bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubiert. 50 ml Puffer P3 (3,0 M Kaliumacetat, pH 5,5, gekühlt auf 4°C) wurden unter unmittelbarem, sanftem Mischen zugegeben. Die Suspensionen wurden für 30 Minuten auf Eis inkubiert, dann bei 4000 Upm bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
  • Ein gefalteter Rundfilter wurde mit Wasser angefeuchtet. Als die Zentrifugation abgeschlossen war, wurde der Überstand sofort durch den Filter gegossen. Der gefilterte Überstand wurde in einer sauberen 250-ml-Zentrifugenflasche gesammelt.
  • 15 ml ER-Puffer von Qiagen wurden zu dem gefilterten Lysat gegeben, es wurde gemischt, indem die Flasche 10 mal umgedreht wurde. Das Lysat wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
  • Eine Qiagen-Tip-2500-Säule wurde äquilibriert durch Verwenden von 35 ml QBT-Puffer (750 mM Natriumchlorid; 50 mM MOPS, pH 7,0; 15% Isopropanol und 0,15% Triton X-100). Man ließ die Säule durch Einwirkung der Schwerkraft sich entleeren. Das inkubierte Lysat wurde auf die Säule gegeben und man ließ es durch Einwirkung der Schwerkraft eintreten. Die Säule wurde mit 4 × 50 ml Endofree-QC-Puffer von Qiagen (1,0 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7,0; 15% Isopropanol) gewaschen. Die DNA wurde aus der Säule mit 35 ml QN-Puffer (1,6 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7,0; 15% Isopropanol) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit Schraubverschluss eluiert. Die DNA-Suspension wurde in zwei Röhrchen aufgeteilt, indem etwa 17,5 ml der Suspension in ein zweites 50-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss gegossen wurden.
  • Unter Verwendung einer sterilen 10-ml-Pipette wurden zu jedem Röhrchen 12,25 ml Isopropanol zugegeben. Die Röhrchen wurden dicht verschlossen und es wurde gründlich gemischt. Die Inhalte aus jedem Röhrchen wurden in 30-ml-Corex-(VWR)-Zentrifugenröhrchen gegossen. Jedes Corex-Röhrchen wurde mit PARAFILM® versiegelt. Die Röhrchen wurden bei 11.000 Upm bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
  • Der Überstand wurde aus jedem Röhrchen abgesaugt und das Pellet wurde mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Das Ethanol wurde abgesaugt. Das Pellet wurde für 10 Minuten an der Luft getrocknet, dann in 0,5–1,0 ml Wasser resuspendiert und in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen transferiert.
  • Herstellung der Mikrosphären
  • 200 mg PLGA wurden in 7 ml Methylenchlorid in einem 14-ml-Kulturröhrchen aufgelöst. Ein mit einem 7-mm-Mischkopf ausgerüsteter PowerGen-700-Homogenisator von Fisher Scientific wurde auf Einstellung 6 und die Geschwindigkeit 4.5 eingestellt. Ein Sonic-Dismembrator-550-Ultraschallgerät von Fisher Scientific wurde auf Einstellung 3 eingestellt.
  • 1,2 mg DNA in 300 μl H2O wurden zu der PLGA-Lösung zugegeben und die resultierende Mischung wurde für 15 Sekunden mit Ultraschall behandelt. 50 ml 1,0%iger PVA wurden in einen 100-ml-Becher gegossen und unter dem Homogenisator aufgestellt. Die Homogenisatorsonde wurde bis etwa 4 mm von dem Boden des Bechers entfernt eingetaucht und der Homogenisator wurde mit Strom versorgt. Die DNA/PLGA-Mischung wurde sofort in den Becher gegossen und die erhaltene Emulsion wurde für 10 Sekunden homogenisiert. Das Homogenisat wurde in den Becher, der 0,05% PVA enthält, gegossen.
  • Die erhaltene Emulsion wurde für zwei Stunden gerührt, in eine konische 250-ml-Zentrifuge gegeben und bei 2000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Die pelletierten Mikrosphären wurde mit 50 ml Wasser gewaschen, in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen transferiert und bei 2000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde mit weiteren 50 ml Wasser gewaschen und bei 2000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann über Nacht lyophilisiert.
  • Extraktion der DNA aus Mikrosphären zur Gelanalyse
  • 1 ml der in Flüssigkeit suspendierten Mikrosphären wurden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und bei 14.000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde größtenteils entfernt. 50 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) wurden zugegeben und die Mikrosphären wurden durch Schnippen an die Seite des Röhrchens resuspendiert.
  • Um gefriergetrocknete oder vakuumgetrocknete Mikrosphären zu isolieren, wurden 2–4 mg Mikrosphären in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen. 70 μl TB-Puffer wurden zugegeben und die Mikrosphären wurden resuspendiert.
  • 200 μl Chloroform wurden zugegeben und die Röhrchen wurden stark aber nicht gewaltsam für zwei Minuten geschüttelt, um wässrige und organische Schichten zu vermischen. Die Röhrchen wurden bei 14.000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. 30 μl der wässrigen Phase wurden vorsichtig in ein neues Röhrchen gegeben.
  • Pico-Green- und Gelanalyse der Mikrosphären
  • 3,5–4,5 mg Mikrosphären wurden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen. 100 μl DMSO wurden in jedes Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für 10 min. rotiert. Die Proben wurden aus dem Rotor entfernt und visuell inspiziert, um zu prüfen, dass die Proben vollständig aufgelöst waren. Wo es notwendig war, wurde eine Pipettenspitze verwendet, um jedes verbliebene Klümpchen aufzubrechen. Man ließ keine der Proben länger als 30 Minuten in DMSO.
  • Für jede zu testende Probe wurden 990 μl TE in drei getrennte Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. 10 μl der DMSO/Mikrosphärenlösung wurden mit Mischen in jede 990 μl TE pipettiert. Die Mischungen wurden bei 14.000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert.
  • Für jede Probe wurden 1,2 ml TE in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden und Schnappdeckel aliquotiert. 50 μl der 1-ml-TE/DMSO/Mikrosphärenmischung wurden zu den 1,2 ml TE gegeben. 1,25 ml Pico-Green-Reagenz wurden in jedes Röhrchen gegeben und die Fluoreszenz wurde in einem Fluorimeter gemessen.
  • BEISPIEL 3: Alkoholfallung
  • Alkoholfallung
  • DNA wurde wie in Beispiel 2 präpariert. Drei Proben, jede enthält 1,2 mg DNA, wurden durch die Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumen Ethanol gefällt. Die DNA wurde in Wasser resuspendiert und auf eine Endkonzentration von 4 mg/ml eingestellt. Die DNA in zwei der Proben wurde sofort vor Verwendung resuspendiert und die DNA der dritten Probe wurde resuspendiert und dann für 4 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Kontroll-DNA mit 4 mg/ml wurde nicht mit Ethanol gefällt.
  • Jede der vier Proben wurde in Mikrosphären durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren eingekapselt. Die DNA-Menge pro mg Mikrosphären wurde durch Pico-Green-Analyse wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
    Probe mg der Mikrosphären μg DNA/mg Mikrosphären % Inkorporation % Erhöhung
    Ethanol, 0 h; #1 4,66 3,37 56 44
    Ethanol, 0 h; #2 4,45 4,91 82 62
    Ethanol, 4 h 3,96 4,30 72 57
    ungefällt 3,97 1,85 31 –
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Ethanolfällung der DNA vor der Verkapselung in Mikrosphären eine erhöhte Inkorporation, welche von 31% bis größer als 56% reicht, ergab, die eine 44–62%ige Steigerung in der Menge verkapselter DNA darstellt.
  • Die folgenden Experimente bestätigen, dass die oben beobachteten Wirkungen der Ethanolfällung unabhängig von den Verfahren der DNA-Präparation sind.
  • DNA wurde nach drei verschiedenen Möglichkeiten präpariert. Probe #1 wurde wie in Beispiel 2 präpariert. Probe #2 wurde wie in Beispiel 2 präpariert, aber ohne die Zugabe von ER-Puffer zum Entfernen. Probe #3 wurde in einem maßstäblich vergrößerten Fermentationsherstellungsdurchlauf präpariert. Die drei DNA-Proben waren repräsentativ für zwei verschiedene Plasmide (DNA-1 und DNA-3 waren identisch) der Größen 4,5 kb und 10 kb. Die drei DNA-Proben wurden auf die Verstärkung der Verkapselungseffizienz durch Ethanolfällung getestet. Drei DNA-Proben, jede enthält 1,2 mg DNA, wurden durch die Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumen Ethanol gefallt. Die DNA wurde in Wasser resuspendiert und auf eine Konzentration von 4 mg/ml eingestellt. Drei Proben an Kontroll-DNA mit 4 mg/ml wurden nicht mit Ethanol gefällt.
  • Jede der Proben wurde durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren eingekapselt.
  • Die DNA-Menge pro mg Mikrosphären wurde durch Pico-Green-Analyse wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
    Probe mg der Mikrosphären μg DNA/mg Mikrosphären % Inkorporation % Erhöhung
    #1 ethanolgefällt 3,35 3,10 67 59
    #2 ethanolgefällt 4,45 4,91 66 47
    #3 ethanolgefällt 3,34 2,65 48 29
    #1 ungefällt 3,38 1,95 42 –
    #2 ungefällt 3,35 1,80 45 –
    #3 ungefällt 3,33 1,81 37 –
  • Die Daten zeigen, dass die Ethanolfällung die Menge der in Mikrosphären eingekapselten DNA um 29–59% erhöhte. Der Effekt war beständig ungeachtet der Größe und dem Präparationsverfahren.
  • Isopropanol- versus Ethanolfällung
  • Plasmid-DNA wurde mit Ethanol oder Isopropanol gefallt, dann in Wasser für 4 Stunden oder 16 Stunden resuspendiert. Kontroll-DNA wurde nicht gefällt. Mikrosphären wurden entsprechend dem Protokoll aus Beispiel 2 hergestellt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
    Probe mg der Mikrosphären μg DNA/mg Mikrosphären % Inkorporation % Erhöhung
    ungefällte #1 4,43 0,99 17 –
    ungefällte #2 4,30 0,99 17 –
    ethanolgefällte #1; 16h 4,26 2,12 37 118
    ethanolgefällte #2; 16h 4,34 1,66 31 82
    isopropanolgefällte #1; 16 h 4,60 1,71 31 82
    isopropanolgefällte #2; 16 h 4,90 1,72 32 88
    ethanolgefällte #1; 4h 4,65 2,22 42 147
    ethanolgefällte #2; 4h 4,27 1,69 30 76
    isopropanolgefällte #1; 4 h 4,55 1,41 25 47
    isopropanolgefällte #2; 4h 4,30 2,78 46 170
  • Diese Daten demonstrieren, dass die Alkoholfällung die Verkapselungseffizienz der DNA erhöhte unabhängig von dem zum DNA-Fällen verwendeten Alkoholtyp und unabhängig von der Zeit nach der DNA-Fällung.
  • Leitfähigkeit
  • Die Leitfähigkeiten der ethanolgefällten und nicht-gefällten DNA-Proben wurden mit einem Leitfähigkeitsmessgerät bestimmt. Es wurde herausgefunden, dass die DNA-Fällung zu einer Verringerung der anwesenden Salzmenge führte. Die Leitfähigkeit ohne Ethanolfällung betrug 384 μΩ, während die Leitfähigkeit nach der Ethanolfällung 182 μΩ aufwies. Folglich wird die Alkoholfällung oder jedes andere Mittel zur Entfernung von Salz/Verunreinigungen wahrscheinlich die Verkapselungseffizienz erhöhen. Deshalb erscheint es, dass Behandlungen, die DNA von Verunreinigungen befreien, wahrscheinlich die Effizienz der DNA-Verkapselung erhöhen.
  • Dann wurde DNA mit Ethanol gefallt oder in Anwesenheit von 0,4 M NaCl und 5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) gefallt. Die DNA wurde wie oben beschrieben verkapselt. Die DNA wurde extrahiert und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Fällung der DNA mit CTAB zu einer auffallenden Erhöhung in der Menge der DNA in Supercoil-Form in den Mikrosphären führte.
  • BEISPIEL 4: Zugabe von Stabilisatorverbindungen
  • TE-Puffer
  • In einem Bemühen zur Erhöhung der DNA-Stabilität wurde Plasmid-DNA nach der Ethanol-Fällung in TE-Puffer resuspendiert. Die Mikrosphären wurden dann wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. DNA wurde aus den Mikrosphären extrahiert und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Eine Spur wurde mit Input-Plasmid (pIiPLPLR) beladen; eine wietere Spur mit Plasmid-DNA nach Ethanolfällung, Resuspension in Wasser und Einkapselung in Mikrosphären; und noch eine weitere Spur mit Plasmid-DNA nach Ethanolfällung, Resuspension in TB-Puffer und Einkapselung in Mikrosphären. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Menge an DNA in Supercoil-Form in den Mikrosphären durch Resuspension in TE-Puffer erhöht wurde.
  • Zwei andere als pbkcmv-n-p und E3PLPLR bezeichnete Plasmide wurden den oben beschriebenen Bedingungen unterzogen. Dieses Experiment bestätigte, dass zwei andere Plasmide auch durch TE-Puffer stabilisiert wurden.
  • Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um das Timing des TE-Effektes zu bestimmen. 2 g PLGA wurden in 18 ml Methylenchlorid aufgelöst. 500 μg DNA wurden ethanolgefällt und in 3,6 ml TE oder Wasser aufgelöst. Die zwei Lösungen wurden durch mehrfaches Umdrehen gemischt und dann in dem Fisher-Apparat (siehe Beispiel 2) mit Einstellung 3 für 10 Sekunden mit einer 1/8-Zoll-Mikrospitze ultraschallbehandelt. Zu verschiedenen Zeiten nach der Ultraschallbehandlung (d. h. 5, 15, 30, 45 und 60 Minuten) wurde aus jedem Röhrchen eine 1-ml-Probe entnommen, 100 μl Wasser wurden zugegeben, die Probe wurde in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert und die oberste Schicht der zentrifugierten Probe wurde in ein separates Röhrchen gegeben. Die Proben wurden durch Gelelektrophorese analysiert.
  • Die Ergebnisse zeigten an, dass TB-Puffer in der Stabilisierung der DNA frühzeitig im Verkapselungsprozess während der Bildung der Öl-in-Wasser-Emulsion wirkte.
  • Um die Wirkung von Tris und/oder EDTA in TB-Puffer zu bestimmen, wurde vor der Einkapselung in Mikrosphären nach dem Verfahren von Beispiel 2 DNA in Wasser, TE-Puffer, 10 mM TRIS oder 1 mM EDTA resuspendiert. Die DNA wurde aus den Mikrosphären extrahiert und auf einem Agarosegel analysiert. Es wurde gefunden, dass sowohl Tris als auch EDTA in ihrer Fähigkeit dem vollständigen TE-Puffer ähnlich sind, um DNA während dem Verkapselungsprozess und während der Lyophilisierung zu schützen.
  • Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung vom pH auf die Verkapselung zu bestimmen (der pH der EDTA-, Tris- und TE-Lösungen in dem vorherigen Experiment war überall ähnlich). Mikrosphären wurden durch die Verkapselung von DNA hergestellt, welche ethanolgefällt und in Tris von unterschiedlichem pH oder in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS/phosphate buffered saline) resuspendiert worden war. Die DNA wurde nach Lyophilisierung der Partikel extrahiert und auf einem Agarosegel analysiert. Die Ergebnisse zeigten an, dass es eine signifikante Wirkung vom pH auf die Stabilität der verkapselten DNA gab.
  • Die Resuspension der DNA in Wasser (pH 6,5), PBS (pH 7,3) und Tris (pH 6,8) führte in allen Fällen zu einer Verringerung des Verhältnisses von DNA in Supercoil-Form in Bezug auf die Gesamt-DNA in den Mikrosphären.
  • Das Erhöhen vom pH auf 7,5 oder höher hatte eine positive Wirkung auf die Menge der Supercoil-Form, wodurch nahe gelegt wird, dass basische pH-Spiegel wichtig für die Erhaltung der DNA-Stabilität sind. Ein erhöhter pH hatte also eine Wirkung auf die Verkapselungseffizienz:
    Probe mg der Mikrosphären μg DNA/mg Mikrosphären % Inkorporation
    Tris; pH 6,8 2,42 2,77 55,5
    Tris; pH 7,5 2,52 2,73 54,6
    Tris; pH 8,0 2,49 3,29 65,9
    Tris; pH 9,9 2,46 3,81 76,3
    Wasser 2,46 2,48 49,7
    PBS; pH 7,3 2,49 0,55 11
    TE; pH 8,0 2,52 2,22 44,3
  • Andere Pufferkomponenten
  • Borgt- und Phosphat-Puffer wurden auch auf ihre Wirkung auf die Qualität der eingekapselten DNA getestet. DNA wurde ethanolgefällt, in verschiedenen Pufferlösungen resuspendiert und entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 2 verkapselt. Die DNA wurde aus den Mikrosphären extrahiert und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. TE, BE und PE gewährten alle mehr als 50% Erhaltung der Supercoil-Form der verkapselten DNA. Ein zusätzlicher Vorteil für die DNA wurde auch entdeckt, der sich vom EDTA in Anwesenheit von Tris, Borgt oder Phosphat ergibt.
  • Andere Stabilisatorverbindungen
  • Zusätzlich zu den Puffer wurden andere Verbindungen auf ihre Fähigkeit, DNA während dem Verkapselungsverfahren zu schützen, getestet. Plasmid-DNA wurde ethanolgefällt und in Wasser oder einer Lösung von Dextransulfat resuspendiert. Die Mikrosphären wurden dann entsprechend dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt. Die DNA wurde aus den Mikrosphären vor und nach der Lyophilisierung extrahiert und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • Die Ergebnisse legen nahe, dass die Zugabe von einem Stabilisator zu einer Einkapselung von mehr DNA in Supercoil-Form führte als die Resuspension von DNA nur in Wasser. Die größte Verbesserung in der DNA-Struktur wurde mit einer 10%igen Lösung an Dextransulfat beobachtet. Schutz kam offenbar auf zwei Ebenen vor. Es wurde eine Wirkung von Dextransulfat auf die Prälyophilisierung der DNA gesehen, weil nach der Verkapselung ein größerer Teil der DNA mit wachsenden Mengen an Dextransulfat im Zustand der Supercoil-Form blieb. Der durch den Stabilisator erreichte Schutz kam auch während dem Lyophilisierungsverfähren vor, da die Anwesenheit von dem Stabilisator während diesem Verfahren den Prozentsatz an DNA erhöhte, der in dem Zustand der Supercoil-Form bleibt.
  • Um festzustellen, ob die Wirkungen von TE und anderen Stabilisatoren addierbar sind oder nicht, wurde ethanolgefällte DNA in TE oder Wasser resuspendiert, wobei eine Lösung mit einem weiteren Stabilisator (z. B. Sucrose, Dextrose, CTAB, Cyclodextrin oder Dextran) verwendet wurde oder nicht. Mikrosphären wurden entsprechend dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt. DNA wurde aus den Mikrosphären extrahiert und durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
  • Diese Ergebnisse demonstrierten, dass das Resuspendieren der DNA in einer Stabilisator/TE-Lösung besser oder gleichwertig ist, als der Gebrauch von TE allein, insofern als ein größerer Prozentsatz an DNA im Zustand der Supercoil-Form nach Verkapselung unter diesen Bedingungen bleibt.
  • Stabilisatoren wurden auch in Kombination zugegeben, um zu bestimmen, ob die Stabilisatorwirkungen addierbar sind oder nicht. DNA wurde ethanolgefällt und in verschiedenen Stabilisatorlösungen resuspendiert. Die DNA wurde wie in Beispiel 2 beschrieben verkapselt, extrahiert und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse zeigten an, dass Kombinationen von Stabilisatoren verwendet werden können, um die Menge an verkapselter DNA in Supercoil-Form zu erhöhen.
  • BEISPIEL 5: Zugabe von Exzipienten
  • Um zu bestimmten, ob Exzipientenverbindungen eine nachteilige Wirkung auf die verkapselte Plasmid-DNA haben oder nicht haben, wurden Mikrosphären aus ethanolgefällter DNA nach dem Protokoll aus Beispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, dass vor der Lyophi lisierung die Mikrosphären in Exzipienten enthaltenden Lösungen resuspendiert wurden. Jede Probe wurde dann eingefroren und wie in Beispiel 2 lyophilisiert. Die Endkonzentration der Exzipienten in den Mikrosphären aufgrund der Resuspension zu 50 mg/ml betrug 0,1% Tween 80, 5% D-Sorbitol, 5% D-Mannitol oder 0,5% Carboxymethylzellulose (CMC). Die DNA wurde aus den Mikrosphären extrahiert und auf einem Agarosegel analysiert.
  • Die Ergebnisse illustrierten, dass die Zugabe von Exzipienten vor der Lyophilisierung keinen signifikanten Einfluss auf die DNA-Stabilität oder den Grad der Erhaltung der Supercoil-Form hat.
  • BEISPIEL 6: In-Vitro-Zellstudien
  • In Vitro Phagozytose der DNA-enthaltenden Mikropartikel
  • In je zwei Mulden einer Sechs-Mulden-Gewebekulturplatte wurden etwa 106 Makrophagen in 3 ml RPMI-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält, plattiert. 5 mg der Mikropartikel, die Luciferase kodierende DNA enthalten, wurden in 200 μl Salzlösung resuspendiert und 50 μl der erhaltenen Suspension wurden in eine der Makrophagen enthaltenden Mulden zugegeben. Die Platte wurde bei 37°C für 1–6 Stunden inkubiert. Seiten- versus Vorwärtsstreulicht (d. h. intrazelluläre Komplexität versus Größe) der Zellen wurde durch FACS mit einem FACS-Gerät von Becton Dickinson analysiert.
  • 4 zeigt die Ergebnisse. Zellpopulationen, die nicht phagozytiert haben, werden in Region R1 gefunden. Phagozytierende Zellen behalten die gleiche Größe (FSC-Profil), aber zeigen ein erhöhtes Seitenstreulichtprofil. Diese Zellen werden in der Region R2 gefunden.
  • Messung der DNA-Expression, die der Phagozytose folgt
  • In zwei Mulden einer 24-Mulden-Kulturplatte wurden etwa 2,5 × 105 Makrophagen in 1 ml RPMI-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält, plattiert. Die Platte wurde bei 37°C für 6 Stunden inkubiert. 1 mg der lyophilisierten Mikropartikel, die Luciferase kodierende DNA enthalten, wurde in 400 μl Salzlösung resuspendiert. 6 μl der erhaltenen Suspension wurden in eine der Makrophagen enthaltenden Mulden zugegeben und 25 μl der Suspension wurden in die andere zugegeben. Die Platte wurde bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Das die Mikropartikel enthaltende Medium wurde entfernt und frisches Medium wurde zu den Zellen zugegeben. Die Platte wurde wieder bei 37°C für 1–5 Tage inkubiert. Die Zellen wurden in ein Röhrchen übertragen und bei 1.500 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden in 100 μl of 1 fach-Zelllyse-Puffer (Promega) in einem EPPENDORFTM-Röhrchen resuspendiert. Die Mischung wurde bei 14.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um sämtliche Zelltrümmer herauszufällen. Das Zelllysat wurde durch Zugabe von 5 μl des Überstandes zu 100 μl Luciferasesubstrat (Promega) getestet und die erzeugte Lichtmenge mit einer TOPCOUNTTM-Luminometer/Scintillationszähler-Kombination (Packard Instruments) gemessen.
  • Die Daten für dieses Experiment werden in Table 5 bereitgestellt. Sie zeigen an, dass Zellen, die Mikropartikel phagozytieren, die zum Beispiel Luciferase-DNA enthalten, tatsächlich DNA exprimieren. Somit sind Integrität und Funktionalität der DNA bestätigt. Die Daten zeigen auch an, dass die Aufnahme von Mikropartikeln durch Phagozytose die DNA nicht hindert, den Zellkern zu erreichen. TABELLE 5: Phagozytose der verkapselten DNA führt zur Expression eines Luciferasereportergenkonstruktes.
    MIKROPARTIKEL ENTHALTEND:
    Luciferase-DNA Kontroll-DNA
    25 μl 6 μl 25 μl 6 μl
    Tag 1 1257 168 103 245
    Tag 2 2632 492 107 133
    Tag 3 3400 507 80 93
    Tag 5 763 310 90 90
  • Die Daten wurden in Counts pro 0,01 Minuten angegeben.
  • BEISPIEL 7: In-Vivo Zellstudien
  • In-Vivo-Expression der inkorporierten DNA
  • 45 mg Luciferase-cDNA in Mikropartikeln wurden in 250 μl Salzlösung resuspendiert. 40 μl der erhaltenen Suspension wurden in jeden Muskel tibialis anterior (vorderen Schienbeinmuskel) einer Maus injiziert. Sieben Tage später wurde jeder tibialis anterior zerlegt und in ein EPPENDORFTM-Röhrchen auf Trockeneis gegeben. Mit Mörser und Stößel, die mit Trockeneis gekühlt wurden, wurde jeder Muskel tibialis anterior pulverisiert und dann in das EPPENDORFTM-Röhrchen zurückgegeben. 500 μl 1 fach-Zelllyse-Puffer (Promega) wurden zugegeben. Das Röhrchen wurde verkehrt herum auf einem Vortex-Mischer bei 4°C für 15 Minuten geschüttelt. Das Röhrchen und seine Inhalte wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann auf 37°C aufgetaut. Der Einfrier-/Auftau-Zyklus wurde zwei weitere Male wiederholt. Das Röhrchen wurde bei 14.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen transferiert und für 5 Minuten erneut zentrifugiert. Um die Ex pression zu testen, wurden 20 μl Überstand zu 100 μl Luciferasesubstrat (Promega) gegeben und die erzeugte Lichtmenge wurde mit einer TOPCOUNTTM-Luminometer/Scintillationszähler-Kombination (Packard Instruments) gemessen.
  • Die Daten für dieses Experiment werden in Table 6 bereitgestellt. Sie zeigen an, dass Muskelzellen aus Mikropartikeln freigesetzte DNA exprimieren können. Da von diesen Zellen nicht bekannt ist, dass sie phagozytieren, handelt es sich hier um ein Beispiel einer Depotwirkung. TABELLE 6: Expression der verkapselten Luciferase-DNA in Muskeln der Maus
    Muskel 1 2 × 105
    Muskel 2 8 × 104
    Muskel 3 1 × 106
    Muskel 4 6 × 105
    Kontrolle 2 × 102
  • Die Daten wurden in Counts pro 0,01 Minuten angegeben.
  • Bildung zytotoxischer T-Zellen, die der Infektion von DNA enthaltenden Mikropartikeln folgt
  • 90 mg Mikropartikel, die VSV-Npep kodierende DNA enthalten, wurden in 900 μl Salzlösung resuspendiert. 60 mg Mikropartikel mit Kontroll-Vektor-DNA wurden in 600 μl Salzlösung resuspendiert. 300 μg VSV-Npep-Plasmid-DNA wurden in 300 μl Salzlösung resuspendiert. 300 μg Kontroll-Vektor-DNA wurden in 300 μl Salzlösung resuspendiert. 150 μg VSV-N-Peptid wurden in inkompletten Freundschem Adjuvans (IFA) resuspendiert.
  • Die fünf Suspensionen wurden gemäß folgender Regelung intraperitoneal, intramuskulär oder subkutan injiziert:
    • 1. Intraperitoneal: Eine erste Gruppe von 3 Mausen wurde intraperitoneal mit 100 μl VSV-Npep-DNA enthaltenden Mikropartikeln injiziert (Gruppe 1). Eine zweite Gruppe von 3 Mausen wurde mit 100 μl Kontroll-Vektor-DNA enthaltenden Mikropartikeln injiziert (Gruppe 2).
    • 2. Intramuskulär: (in jeden Muskel tibialis anterior): Eine dritte Gruppe von 3 Mausen wurde intramuskulär mit 100 μl VSV-Npep-DNA enthaltenden Mikropartikeln injiziert (Gruppe 3). Eine vierte Gruppe von 3 Mausen wurde mit 100 μl Kontroll-Vektor-DNA enthaltenden Mikropartikeln injiziert (Gruppe 4). Eine fünfte Gruppe von 3 Mausen wurde mit 50 μg/Bein VSV-Npep-Plasmid-DNA injiziert (d. h. ohne Mikropartikel) (Gruppe 5).
    • Eine sechste Gruppe von 3 Mausen wurde mit 50 μg/Bein Kontroll-Vektor-Plasmid-DNA injiziert (Gruppe 6).
    • 3. Subkutan: Eine siebente Gruppe von 3 Mausen wurde subkutan mit 100 μl VSV-Npep-DNA enthaltenden Mikropartikeln injiziert (Gruppe 7). Eine achte Gruppe von 3 Mausen wurde mit 50 μg VSV-N-Peptid/IFA injiziert (Gruppe 8).
  • Nach zwei Wochen wurden Gruppen 5, 6 und 8, welche entweder synthetisches Peptid oder DNA ohne Mikropartikel erhalten hatten, wieder injiziert. Gruppen 1–4 und 7, welche anfänglich Mikropartikel erhalten hatten, wurden nicht injiziert.
  • Sieben Tage nach dem letzten Injektionssatz wurden die Milzen der Mause entnommen. Einzelzellsuspensionen wurden nach Standardverfahren hergestellt, rote Blutzellen wurden lysiert und die verbleibenden Zellen wurden in RPMI mit 10%igen fötalem Kälberserum resuspendiert, um eine Endkonzentration von 4 × 106 Effektor-Zellen/ml zu erhalten. Dann wurde die Hälfte der Zellen aus jeder Gruppe bei 37°C für 6 Tage mit einer gleichen Anzahl an Peptid-gepulsten syngenen Stimulator-Zellen inkubiert, welche zuvor mit Mitomycin C behandelt worden waren. Die verbleibenden Zellen wurden nur mit 50 μM Peptid inkubiert.
  • Nach dem zweiten Inkubationstag wurden 0,1 Volumenäquivalente an IL-2-enthaltendem Überstand zugegeben, der von in ConA inkubierten Zellen abstammt. Nach dem sechsten Inkubationstag wurden die Effektorzellen geerntet und in 96-Mulden-Platten mit runden Böden, welche 51Cr-markierte Peptid-gepulste Zielzellen enthalten, bei 37°C für 5 Stunden inkubiert. Die Verhältnisse von Effektor- zu Zielzellen reichten in den Mulden von 200:1 bis herunter zu 1:1.
  • Um das Niveau der maximalen Lyse zu bestimmen, wurden 20 μl wässriges 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) zu bestimmten Mulden zugegeben, die nur Zielzellen enthalten. Um das Niveau der spontanen Lyse zu bestimmen, wurden bestimmte Mulden nur mit Medium inkubiert (d. h. Zielzellen aber keine Effektorzellen). Die spezifische Lyse wird wie folgt berechnet: [(experimentelle Lyse) – (spontane Lyse)/(maximale Lyse) – (spontane Lyse)] × 100 = spezifische Lyse.
  • Die Ergebnisse werden in den 5–9 gezeigt.
  • In dem mit 5 assoziierten Experiment wurden Effektorzellen aus intraperitoneal mit Mikropartikeln, welche die ein Peptid aus dem VSV-N-Protein kodierende DNA enthalten, immunisierten Mausen (Gruppe 1) auf zytologische Aktivität gegen verschiedene Zielzellen getestet. Das VSV-Peptid bindet an den Maus-H-2Kb-Klasse-I-Rezeptor. Syngene Ziele exprimieren den H-2Kb-Rezeptor, während die allogenen Ziele, die in diesem Experiment verwendet wurden, den H-2Kd-Rezeptor exprimieren.
  • Die CTL-Aktivität wurde getestet an syngenen Zielen (EL4) ohne Peptid, mit dem VSV-Peptid markierten syngenen Zielen (EL4/VSV), mit SV-Peptid markierten (d. h. ein nicht-spezifisches Peptid) syngenen Zielen (EL4/SV) und mit VSV-Peptid markierten allogenen Zielen (P815/VSV).
  • Weil die allogenen Ziele (P815/VSV) nicht den H-2Kb-Rezeptor exprimieren, sollten sie durch die Effektorzellen nicht erkannt und lysiert werden. Folglich werden mit VSV-Peptid gemischte P815-Ziele nicht lysiert. Syngene Ziele (EL4), die kein VSV-Peptid aufweisen, werden ebenfalls nicht lysiert. Syngene Ziele (EL4/SV), die ein vom VSV verschiedenes Peptid aufweisen, werden ebenfalls nicht lysiert. Nur solche Ziele (EL4/VSV), die sowohl den richtigen MHC-Rezeptor als auch das richtige Peptid aufweisen, werden lysiert.
  • Zugleich demonstrieren diese Daten, dass die CTL-Aktivität durch Immunisierung mit Mikropartikeln, die ein VSV-Peptid kodierende DNA enthalten, hervorgerufen werden kann und die Lyse durch das MHC eingeschränkt und Peptid-spezifisch ist. In anderen Worten, nur das richtige Peptid mit dem richtigen MHC-Rezeptor wird durch den T-Zell-Rezeptor des CTL erkannt, der durch Immunisierung in Übereinstimmung mit der Erfindung erzeugt worden ist. Dieses demonstrierte, dass die Mikropartikel die gewünschte Funktion erfüllen.
  • Als Nächstes wurde die CTL-Antwort, die durch subkutane Immunisierung von Mausen mit synthetischem Peptid (Gruppe 8) erzeugt wurden, mit der CTL-Antwort verglichen, die durch intraperitoneale Immunisierung von Mausen mit Mikropartikeln, welche die VSV-Peptid kodierende DNA enthalten (Gruppen 1 und 2), erzeugt wurde. In 6 wird die bei einem E:T-Verhältnis von 100:1 erhaltene Lyse für CTL gezeigt, die durch Immunisierung von Mausen mit entweder die VSV-N-Peptid kodierende DNA enthaltenden Mikropartikeln (MS-VSV; Gruppe 1), nicht die ein VSV-Peptid kodierende Kontroll-Vektor-DNA enthaltenden Mikropartikeln (MS-Vektor; Gruppe 2) oder einem synthetischen VSV-N-Peptid (Peptid; Gruppe 8) erzeugt wurden. Die Ziele waren syngene (EL4) Zellen, die mit VSV-Peptid markiert waren.
  • Mit VSV-Npep-DNA in Mikropartikeln (MS-VSV) immunisierte Mause erzeugten eine stärkere CTL-Antwort (33% spezifische Lyse) als mit Kontroll-Mikropartikeln, die leere Vektor-DNA (MS-Vektor) enthalten, immunisierte Mause (10% spezifische Lyse). Mit VSV-N-Peptid (Peptid) immunisierte Mause erzeugten eine schwächere CTL-Antwort als solche, die mit VSV-Npep-DNA enthaltenden Mikropartikeln (MS-VSV) immunisiert wurden. Deshalb erfüllten die Mikropartikel die gewünschte Funktion.
  • Die CTL-Antworten in intraperitoneal mit in Mikropartikeln enthaltener VSV-Npep-DNA (MS-VSV) immunisierten Mausen wurden mit CTL-Antworten von intramuskulär mit "nackter" VSV-DNA (VSV) immunisierten Mäusen verglichen. Die CTL-Antworten in mit DNA enthaltenden Mikropartikeln immunisierten Mausen (MS-VSV; Gruppe 1) waren stärker als solche in mit nackter DNA immunisierten Mausen (VSV; Gruppe 5) bei einem E:T-Verhältnis von 3:1 (7). Die Ziele waren syngene (EL4) Zellen, die mit VSV-Peptid markiert waren. Die Mause, welche die nackte DNA erhalten hatten, wurden doppelt immunisiert, während Mause, die mit Mikropartikeln immunisiert worden waren, nur eine Behandlung erhielten. Die Daten in 7 zeigen deshalb, dass eine einzelne Injektion von DNA in Mikropartikeln effektiver war, als zwei Injektionen einer größeren Menge an nackter DNA.
  • 8 zeigt die Ergebnisse eines Experimentes, das äquivalent zu dem ist, das sich auf 5 bezieht, mit der Ausnahme, dass die Injektionen subkutan (Mause der Gruppe 8) statt intraperitoneal erfolgten. Dieses Experiment demonstrierte, dass subkutane Injektionen von VSV-Npep-DNA enthaltenden Mikropartikeln effektiver für das Hervorbringen der CTL-Antworten sind.
  • Das in 9 illustrierte Experiment ist auch dem von 5 ähnlich, mit der Ausnahme, dass eine ein anderes Peptid kodierende DNA verwendet wurde, um zu demonstrieren, dass die erhaltenen Ergebnisse nicht einzig auf die VSV-Npep-DNA zutreffen. HLA-A2-transgene Mause wurden mit Mikropartikeln immunisiert, welche DNA enthalten, die ein Peptid aus dem humanen Papillomavirus-(HPV)-E6-Peptid kodiert. Das als A2.1/4 bezeichnete HPV-E6-Peptid bindet an den humanen MHC-Rezeptor HLA-A2. Das Experiment schätzte die Fähigkeit von CTL-Effektoren ein, syngene Ziele (d. h. Ziele, die den richtigen HLA-Rezeptor haben) zu lysieren, die entweder mit dem richtigen HPV-Peptid (A2.1/4) markiert oder sonst unmarkiert (kein Peptid) sind. Die E:T-Verhältnisse werden entlang der X-Achse aufgelistet.
  • BEISPIEL 8: Behandlung mit DNA enthaltenden Mikropartikeln
  • Entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1 wurden Mikropartikel hergestellt, welche DNA enthalten, die ein Peptid mit einer zu etwa 50% identischen Aminosäuresequenz zu den Resten 170–191 von PLP (SEQ ID NO: 2) kodiert. Ein Patient mit multipler Sklerose, dessen T-Zellen überschüssige TH1-Cytokine (d. h. IL-2 und γ-IFN) als Antwort auf Autoantigene absondern, wird intravenös mit 100 μl bis 10 ml Mikropartikeln injiziert. Die Expression der PLP-ähnlichen Peptide durch APCs ergibt einen Wechsel des Cytokin-Profils der T-Zellen, so dass sie stattdessen TH2-Cytokine (d. h. IL-4 und IL-10) als Antwort auf Autoantigene produzieren.
  • BEISPIEL 9: Tolerisierung mit DNA enthaltenden Mikropartikeln
  • Entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1 werden Mikropartikel hergestellt, welche DNA enthalten, die ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die mit den Resten 33–52 vom MBP (SEQ ID NO: 34) übereinstimmt. Ein Säuger wird subkutan mit 1–500 μl der Mikropartikel injiziert. Die Expression des MBP-Peptides durch APCs resultiert in der Tolerisation der T-Zellen, die das Autoantigen erkennen.
  • BEISPIEL 10: Implantation von Mikropartikeln
  • Ein DNA-Molekül, einschließlich einer Expressionskontrollsequenz, die operativ zu einer Sequenz verknüpft ist, welche sowohl eine Traffic-Sequenz als auch ein im Wesentlichen zu den Resten 80–102 vom Myelin-Basic-Protein (MBP) (SEQ ID NO: 1) identisches Peptid kodiert, wird entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1 mit einem Polymer verbunden, um Mikropartikel zu bilden. Partikel kleiner als 100 μm werden entfernt. Der polymere Bestandteil des Mikropartikels ist Polymilchsäure-co-Glykolsäure, wobei das Gewichtsverhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure 65:35 beträgt. Die resultierenden Mikropartikel werden chirurgisch in einen Patienten subkutan implantiert.
  • BEISPIEL 11: Herstellung von Mikropartikeln, die sowohl DNA als auch Protein enthalten
  • Plasmid-DNA wird nach Standardverfahren mit dem MEGA-PREPTM-Kit (Qiagen) entsprechend den Herstelleranleitungen produziert. Ein Endotoxin-freies Puffer-Kit (Quiagen) wird für alle DNA-Manipulierungen verwendet. Die DNA wird in destilliertem, deionisiertem sterilem Wasser resuspendiert, um eine Endkonzentration von 3 μg/μl zu erhalten. Zusätzlich werden 0–40 mg gereinigtes Protein zu etwa 1 ml DNA-Lösung zugegeben. Eine zu etwa 20% der Proteinmasse gleiche Masse an Gelatine wird hinzugeben.
  • Bis zu 400 mg PLGA (d. h. wenigstens zehn Mal die Proteinmasse) werden in etwa 7 ml Methylenchlorid aufgelöst. Die DNA/Protein-Lösung wird in die PLGA-Lösung gegossen und homogenisiert oder mit Ultraschall behandelt, um eine erste Emulsion zu bilden. Die erste Emulsion wird in etwa 50–100 ml einer wässrigen Tensid-Lösung gegossen (z. B. 0,05% bis 2% PVA nach Gewicht). Die Mischung wird bei etwa 3000–8000 Upm homogenisiert, um eine zweite Emulsion zu bilden. Die Mikropartikel werden dann entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1 isoliert.
  • BEISPIEL 12: Behandlung mit Mikropartikeln, die sowohl DNA als auch Protein enthalten
  • Mikropartikel, welche sowohl ein antigenes Protein mit zur Induktion der B-Zell-Antwort gegen das Hepatis-B-Virus (HBV) notwendigen konformationsbedingten Determinanten als auch die das CTL-Epitop für HBV kodierende DNA enthalten, werden entsprechend dem Verfahren aus Bespiel 10 hergestellt. Ein mit HBV infizierter oder dem Risiko einer Infektion ausgesetzter Patient wird mit den Mikropartikeln immunisiert.
  • Die langsame Freisetzung des Proteins aus nicht-phagozytierten Mikropartikeln führt zur B-Zell-Erkennung der konformationsbedingten Determinanten und zur nachfolgenden Antikörpersekretion. Die langsame DNA-Freisetzung oder Phagozytose von den anderen Mikropartikeln veranlassen APCs (1) die DNA von Interesse zu exprimieren, wodurch eine T-Zellantwort erzeugt wird, und (2) das aus den Mikropartikeln freigesetzte Protein zu verdauen, wodurch Peptide erzeugt werden, welche nachher durch Klasse-I- oder Klasse-II-Moleküle präsentiert werden. Die Präsentation durch Klasse-I-Moleküle fördert die CTL-Antwort; die Präsentation durch Klasse-II-Moleküle fördert sowohl Antikörper- als auch T-Zellantworten, da durch die Klasse-II/Peptid-Komplexe aktivierte TH-Zellen nicht-spezifische Cytokine absondern.
  • Die Ergebnisse sind die Elimination des HBV im Patienten und die fortdauernde Verhinderung der Virusproduktion in den Patientenzellen.
  • BEISPIEL 13: Phagozytose der Plasmid enthaltenden Mikrosphären durch dendritische Mauszellen
  • Mikrosphären wurden durch das Verfahren aus Beispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, dass ein fluoreszierendes Oligonukleotid während dem Verkapselungsverfahren zugegeben wurde. Dendritische Zellen der Milz wurden aus Mäusen isoliert und mit nichts, mit fluoreszierenden Kügelchen oder mit hergestellten Mikrosphären inkubiert. Die FACS-Analyse der Zellen zeigte, dass sowohl die fluoreszierenden Kügelchen als auch die hergestellten Mikrosphären phagozytiert wurden. Außerdem fluoreszierten die hergestellten Mikropartikel nicht, wenn sie nicht durch dendritische Zellen aufgenommen wurden, was nahe legt, dass nach der Phagozytose die Mikrosphären hydriert und abgebaut wurden, wodurch die Freisetzung der eingekapselten DNA in das Zytoplasma der Zellen möglich wurde.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (56)

  1. Präparat von Mikropartikeln, wobei jedes davon eine Polymermatrix und Nukleinsäure umfasst, wobei die Polymermatrix aus einem oder mehreren synthetischen Polymeren mit einer Wasserlöslichkeit von weniger als 1 mg/l besteht, wobei: wenigstens 90% der Mikropartikel einen Durchmesser von weniger als 100 μm aufweisen; und die Nukleinsäure ein Expressionsvektor ist, der aus zirkulären Plasmid-DNA-Molekülen besteht, wovon wenigstens 50% eine Supercoil-Struktur besitzen.
  2. Präparat nach Anspruch 1, wobei wenigstens 90% der Mikropartikel einen Durchmesser von weniger als 20 μm aufweisen.
  3. Präparat nach Anspruch 1, worin der Expressionsvektor für ein Antigen-Polypeptid kodiert und jedes der Mikropartikel eine proteinartige antigene Determinante umfasst.
  4. Präparat nach Anspruch 3, worin die antigene Determinante eine Antikörperantwort in einem Säuger hervorruft.
  5. Präparat nach Anspruch 3, worin das antigene Polypeptid eine T-Zellantwort hervorruft.
  6. Präparat nach Anspruch 5, worin die T-Zellantwort eine cytotoxische T-Zellantwort ist.
  7. Präparat nach einem der Ansprüche 3 bis 6, worin das antigene Polypeptid von der antigenen Determinante verschieden ist.
  8. Mikropartikel mit einem Durchmesser von weniger als 20 μm, umfassend: eine Polymermatrix, bestehend aus einem oder mehreren synthetischen Polymeren mit einer Wasserlöslichkeit von weniger als 1 mg/l/; und Nukleinsäuremolekülen, wovon wenigstens 50% zirkuläre Plasmid-DNA mit Supercoil-Struktur ist.
  9. Mikropartikel nach Anspruch 8, worin die DNA eine Expressionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit einer kodierenden Sequenz umfasst.
  10. Mikropartikel nach Anspruch 9, worin die kodierende Sequenz für ein Expressionsprodukt mit einer Länge von wenigstens 7 Aminosäuren kodiert, das eine Sequenz aufweist, die identisch ist mit der Sequenz von (a) einem Fragment eines natürlich auftretenden Säugerproteins oder (b) einem Fragment eines natürlich auftretenden Proteins eines infektiösen Agens, welches einen Säuger infiziert.
  11. Mikropartikel nach Anspruch 10, worin das Expressionsprodukt eine Aminosäuresequenz umfasst, welche zu wenigstens 50% mit der Sequenz eines Fragmentes aus einem Protein identisch ist, das ausgewählt ist unter Myelin Basic Protein (MBP), Proteolipidprotein (PLP), Invariant Chain, GAD65, Inselzellantigen, Desmoglein, α-Crystallin und β-Crystallin, wobei das Fragment an ein MHC-Klasse-II-Molekül bindet.
  12. Mikropartikel nach Anspruch 10, worin das Expressionsprodukt eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit einer Sequenz, ausgewählt unter SEQ ID NOs: 1–46 identisch ist.
  13. Mikropartikel nach Anspruch 10, worin das Expressionsprodukt eine Traffic-Sequenz umfasst, ausgewählt unter einer Sequenz, welche zum endoplasmatischen Reticulum wandert, einer Sequenz, welche zu einem Lysosom wandert, einer Sequenz, welche zu einem Endosom wandert und einer Sequenz, welche zum Nucleus wandert.
  14. Mikropartikel nach Anspruch 10, worin das Expressionsprodukt eine Aminosäuresequenz umfasst, welche identisch ist mit der Sequenz für einen antigenen Teil eines Tumorantigens.
  15. Mikropartikel nach Anspruch 14, worin das Tumorantigen ausgewählt ist unter der Gruppe von Antigenen, aufgelistet in Tabelle 3.
  16. Mikropartikel nach Anspruch 10, worin das Expressionsprodukt eine Aminosäuresequenz umfasst, die identisch ist mit der Sequenz eines Antigenfragmentes eines Proteins, das in natürlicher Weise durch ein infektiöses Agens, ausgewählt unter einem Virus, einem Bakterium und einem parasitischen Eukaryonten, exprimiert wird.
  17. Mikropartikel nach Anspruch 16, worin das infektiöse Agens ausgewählt ist unter humanem Papillomavirus, humanem Immunodefizienzvirus, Herpes-simplex-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, Plasmodium Species und Mycobakterien.
  18. Mikropartikel nach Anspruch 16, worin das infektiöse Agens ein chronisches Virus ist.
  19. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 18, zusätzlich umfassend eine stabilisierende Verbindung.
  20. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 19, wobei die stabilisierende Verbindung eine kationische Verbindung ist.
  21. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 19, wobei die stabilisierende Verbindung ein Kohlehydrat oder ein DNA-verdichtendes Agens ist.
  22. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin die Polymermatrix biologisch abbaubar ist.
  23. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin die Polymermatrix aus einem synthetischen, biologisch abbaubaren Copolymer besteht.
  24. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 23, worin das Polymer Polymilchsäure-co-glykolsäure (PLGA) ist.
  25. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 24, worin das Gewichtsverhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure in dem Copolymer im Bereich von 1:2 bis 4:1 liegt.
  26. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 24, worin das Gewichtsverhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure in dem Copolymer im Bereich von 1:1 bis 2:1 liegt.
  27. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 24, worin das Gewichtsverhältnis von Milchsäure zu Glykolsäure in dem Copolymer im Bereich von 65:35 liegt.
  28. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 27, worin die Polymermatrix außerdem ein Targeting-Molekül umfasst.
  29. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 28, worin das Mikropartikel oder die Mikropartikel einen Durchmesser von weniger als 11 um aufweisen.
  30. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 29, worin das Mikropartikel oder die Mikropartikel in einer wässrigen Lösung suspendiert ist (sind).
  31. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 30 worin das Mikropartikel oder die Mikropartikel in Form eines trockenen Feststoffes vorliegt (vorliegen).
  32. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 19, worin die Stabilisatorverbindung ein Lipid ist.
  33. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 32, worin das Lipid ein geladenes Lipid ist.
  34. Präparat oder Mikropartikel nach Anspruch 32, worin das Lipid Hexadecyltrimethylammoniumbromid ist.
  35. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 34, worin wenigstens 60% der zirkulären Plasmid-DNA in Supercoil-Form vorliegen.
  36. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 34, worin wenigstens 70% der zirkulären Plasmid-DNA in Supercoil-Form vorliegen.
  37. Präparat oder Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 34, worin wenigstens 80% der zirkulären Plasmid-DNA in Supercoil-Form vorliegen.
  38. Präparat oder Mikropartikel gemäß der Definitionen in einem der Ansprüche 1 bis 37 zur Verwendung als Medikament oder zur Verabreichung von Nukleinsäure an ein tierisches Lebewesen.
  39. Verwendung eines Präparats oder Mikropartikels gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 37 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs oder Autoimmunerkrankungen.
  40. Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln, umfassend (1) die Bereitstellung einer ersten Lösung, umfassend ein in einem organischen Lösungsmittel gelöstes Polymer; (2) die Bereitstellung einer zweiten Lösung, umfassend eine Nukleinsäure, gelöst oder suspendiert in einem polaren oder hydrophilen Lösungsmittel; (3) das Vermischen der ersten und der zweiten Lösung zur Ausbildung einer ersten Emulsion; und (4) das Vermischen der ersten Emulsion mit einer dritten Lösung, umfassend eine organische Verbindung zur Ausbildung einer zweiten Emulsion, umfassend Mikropartikel aus Polymermatrix und Nukleinsäure; wobei die beiden Misch-Schritte so ausgeführt werden, dass ein Scheren der Nukleinsäure vermieden wird, während Mikropartikel produziert werden, die einen zahlenmittleren Durchmesser von weniger als 100 μm aufweisen, so dass wenigstens 50% der Nukleinsäure in den Mikropartikeln aus zirkulärer Plasmid-DNA in Supercoil-Form bestehen.
  41. Verfahren nach Anspruch 40, worin die zweite Lösung durch Reinigen der Nukleinsäure und anschließendes Suspendieren der gereinigten Nukleinsäure in dem polaren oder hydrophilen Lösungsmittel hergestellt wird.
  42. Verfahren nach Anspruch 40, worin die zweite Lösung durch Präzipitieren der Nukleinsäure mit Alkohol und anschließendes Suspendieren der präzipitierten Nukleinsäure in dem polaren oder hydrophilen Lösungsmittel hergestellt wird.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 42, worin die zweite Lösung außerdem eine wässrige Pufferlösung umfasst, welche eine Pufferverbindung, ausgewählt unter Ethylendiamintetraessigsäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder Kombinationen davon, umfasst.
  44. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 43, worin die zweite Lösung außerdem eine Stabilisatorverbindung umfasst.
  45. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 44, worin die zweite Lösung außerdem ein oberflächenaktives Mittel umfasst.
  46. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 45, worin die zweite Lösung außerdem ein DNA-verdichtendes Agens umfasst.
  47. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 46, zusätzlich umfassend die Resuspendierung der Mikropartikel in einer Exzipienten-Lösung.
  48. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 47, worin die zweite Emulsion erhöhter Temperatur ausgesetzt wird.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 48, welches den zusätzlichen Schritt des Vermischens der zweiten Emulsion mit einer vierten Lösung, umfassend eine organische Verbindung, umfasst.
  50. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 49, umfassend den zusätzlichen Schritt des Waschens der Mikropartikel mit einer wässrigen Lösung, wodurch gewaschene Mikropartikel erhalten werden.
  51. Verfahren nach Anspruch 50, umfassend die folgenden Schritte: Aussetzen der gewaschenen Mikropartikel einer Temperatur unter 0°C, wobei man gefrorene Mikropartikel erhält; und Lyophilisieren der gefrorenen Mikropartikel zur Herstellung lyophilisierter Mikropartikel.
  52. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 51, umfassend den zusätzlichen Schritt des Aussiebens der Mikropartikel, um im Wesentlichen all diejenigen zu entfernen, die einen Durchmesser von mehr als 100 μm aufweisen.
  53. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 52, umfassend den zusätzlichen Schritt des Aussiebens der Mikropartikel, um im Wesentlichen all diejenigen zu entfernen, die einen Durchmesser von mehr als 20 μm aufweisen.
  54. Verfahren nach Anspruch 44, worin die Stabilisatorverbindung ein Lipid ist.
  55. Verfahren nach Anspruch 54, worin das Lipid ein geladenes Lipid ist.
  56. Verfahren nach Anspruch 54, worin das Lipid Hexadecyltrimethylammoniumbromid ist.
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