CN1703241A - 乙型肝炎病毒表面抗原作为粘膜免疫刺激物和得到的制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于增强对本发明中所描述的制剂中的共同给药抗原的免疫应答的粘膜表面抗原。所说的新制剂获自表面抗原的双重应用，用作免疫刺激剂，并同时用作疫苗抗原。这样，获得乙型肝炎病毒表面抗原和异种抗原的多种制剂是可能的，其免疫原性水平与肠胃外给药后获得的相似，并减少了那些无需使用鼻佐剂的成分，从而把所述抗原转化成能增强对其它的共同给药抗原的应答的成分。所说的乙型肝炎病毒表面抗原的新用途以及所得到的抗原制剂能作为治疗和预防疫苗制剂用于制药工业中。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原作为粘膜免疫刺激物和得到的制剂

技术领域

本发明涉及疫苗开发，具体地涉及由它们的使用而产生的免疫增强剂和疫苗制剂的开发。

本发明的技术目的是增强对在鼻制剂中给药的抗原的免疫应答，并开发通过这种途径给药的疫苗用途的新制剂。

本发明也涉及用于鼻给药的多价疫苗制剂的获得，该多价疫苗制剂具有乙型肝炎表面抗原作为主要抗原，其能增强本发明中表达的制剂中的共同给药抗原的免疫原性。

本发明的多价制剂含有HBsAg和其它的抗原，包括作为类毒素的可溶抗原和它们的缀合物(conjugate)，以及灭活或减毒疫苗微生物。这种具有相同效果和免疫原性水平(体液的和细胞的)的制剂包括商业免疫中常用的其它抗原；这些与传统组合物在肠胃外给药后获得的很相似。这种类型的粘膜制剂的特性是在粘膜上诱导了强的应答，其也是一个附加的优点。另一个重要的方面是这些制剂的成分的节约，因为抗原本身可以增强对其它共同给药的抗原的应答，从而可以不用鼻佐剂。

背景技术

对通过粘膜接种的抗原的强免疫应答的产生，是疫苗研究领域目前的挑战之一。已经证实强的局部应答与对抗所发现的病原体或通过粘膜表面进入的病原体的保护相关(America Academy of Pediatrics.Cholera.Report of the Committee on Infection Diseases.AmericaAcademy of Pediatrics，Elk Grove Village，1991；IL，170)。

胃肠道、呼吸道和生殖泌尿道粘膜表面的表面面积至少为400m²(McKenzie SJ，Halsey J A.1984；J.Immunol.，53：1818)。另一方面，有一个大的专门的免疫系统保护粘膜表面。在一个健康成年人中，这种局部免疫系统至少占整个淋巴细胞的80％，这些淋巴细胞位于该部位或通过几个粘膜相关淋巴组织循环(Report of the Expert Panel VI：Concerted efforts in the field of mucosal immunology.，1996，Vaccine；14：644)。

粘膜免疫系统分为称作活体粘膜相关淋巴组织(O-MALT)的局部诱导物部位和效应物部位(Kraehenbuhl J P and Neutra MN.1992.Physiol.Rev.；72：853)。在如淋巴集结(PP)，阑尾和直肠上丰富的分离淋巴结节等胃肠相关淋巴组织(GALT)里，进行了很多关于O-MALT的研究。PP是这些组织的该机能的一个很好的模型，尽管应该考虑到GALT与鼻相关淋巴组织(NALT)(Walker RI.1994.Vaccine.；4：387)之间的差异。

在呼吸道中，上皮细胞可能是假复层或单层的。在支气管中，单层上皮区，细胞间隙通过紧密结合密封，而且抗原吸收的主要机制是通过M细胞。在扁桃体中复层上皮占优势，抗原吸收的机制与巨噬细胞和骨髓引起的流动树突细胞的网紧密相关，能达到700个细胞/mm²。这些细胞能迁移到O-MALT和淋巴结，在扁桃体表面呈递噬菌作用的已加工抗原。这是正常条件下通过呼吸道MHC-II的抗原呈递的主要机制(Neutra R M.，Pringault E and Kraehenbuhl J P.1996.Annu.Rev.Immunol.14：275)。

在诱导物部位加工和呈递抗原后，受刺激的B和T淋巴细胞通过输出小管离开诱导物部位，并通过胸导管进入血流，到达效应物部位(腺组织，胃肠道粘膜、呼吸道和生殖泌尿道的固有膜，在此它们被选择性的保留。在这些效应物部位，B细胞持续增殖并分化成分泌IgA的浆细胞(plasmatic cell)，随后在外分泌中产生IgA抗体。前面所述的细胞分布系统称作通用粘膜免疫系统(Walker R I.1994.Vaccine.；4：387)。

对于通过肠胃外途径给药的疫苗，疫苗抗原的粘膜接种有很多优点，如增加了安全性和最小化副作用(Editorial.Typhoid vaccination：Weighing the options.1992.Lancet：340-341；Redhead K和GriffithsE.1990.Curr.Opin.Infec.Dis.3：380)，减少合格人员，简化疫苗接种对数(logistic)，以及增加疫苗接种对老年人和新生的儿童的效果。已经证实人全身免疫系统随着年龄降低，但是在小鼠中的研究表明它不随年龄降低(Bergman K-C和Waldman R H.Rev.1988.Infect.Dis.10：939；Szewczuk M R，Campbell R J和Jung LK.1981.J.Immunol.126：2200)。新生儿中母体抗体的持续干扰了肠胃外给药的疫苗，其已经成为疫苗接种年龄降低方面的问题(Szewczuk MR，Campbell R J和Jung L K.1981.J.Immunol.126：2200；WveissR.1992.Science.258：546)。

粘膜免疫也能促进根除由正无症状地定居粘膜表面的病原体引起的某些疾病(Kraehenbuhl J P和Neutra M N.1992.PhysiolRev.72：853)。这是由于这种免疫不但能产生全身应答，还能产生通过肠胃外途径接种所不能获得的粘膜应答的事实。

尽管有前面所述的优点，粘膜免疫所需的抗原的量可能高于肠胃外免疫所需的量，可归因于几个因素，如通过粘膜淋巴组织吸收完整抗原的相对无效，酸性和蛋白水解障碍，肠蠕动等。这就是为什么有必要开发粘膜用途的佐剂或佐剂策略(Faden H等，1990.J.Infect.Dis.162：1291；Shahin RD等，1990.Infect.Immun.58：4063；O’Hagan D T.1990.Curr Opin Infect Dis.3：393)。

来自新的疫苗世代的纯的、重组或合成抗原，比来自获得它们的微生物的抗原安全。但是，它们的免疫原性较差(Alving CR，1992.AIDS Research and Human Retroviruses.8：1427)。因此，发现新的佐剂在疫苗领域是需要的。佐剂是促进、扩大或增强对粘膜或肠胃外接种的抗原的特定免疫应答的物质或程序(Vogel FR.Vdjuvantsin perspective.In：Brown F，Haaheim LR，editors.Modulation of theimmune rasponse to vaccine antigens.Dev.Biol.Stand.Basel.Karger；1998；92：241-248)。它的使用产生或加强了应答的类型，减少了接种的数量与获得并保持保护所需要的抗原的数量。

粘膜佐剂是那些能提高对通过粘膜途径给药的抗原的免疫应答的佐剂。其中研究得最多的粘膜佐剂是霍乱弧菌(V.cholerae)的肠毒素(CT)和大肠杆菌(E.coli)的热不稳定毒素(LT)。CT的佐剂活性与ADP(腺苷二磷酸)的ribosilation和具有多种细胞效应的AMPc(环腺苷单磷酸盐)的诱导相关(Lycke N等，1991.Scand.J.Immunol.33：691)。CT的B亚基(CTB)能增强鼻给药的异源抗原的上皮渗透性，但是不能增强那些口服给药的抗原的上皮渗透性(Lycke N等，1991.Scand.J.Immunol.33：691；Gizurarson S等，1991.Vaccine.9：825；Gizurarson S等，1991.Vaccine.10：101)。已发现CT在小鼠的肠固有膜内能诱导长期免疫原性记忆(Vajdy M和LyckeNH.1992.免疫学.75：488)。

到现在为止，选择性分离CT的佐剂与毒性作用是不可能的(LyckeN等，1992.Eur.J.Immunol.；22：2277)。不过，以戊二醛为变性剂已经得到了一种突变体，其显示了好的佐剂活性保持，但毒性低1000倍(Liang X等，1989.J Immunol；143：484)。

也通过粘膜途径评估了一些肠胃外使用的佐剂，如免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体，溶血磷脂酰甘油，阿夫立定(Avridine)(一种类似脂肪的胺)和细胞因子(Ruby J等，1992.Vaccine.Res.1：347；O’Hagan DT等，1992.J.Gen Virol；73：2141)。

已证实当免疫刺激复合物通过鼻给药时是有效的佐剂。它们是相对稳定的30-40nm的颗粒，其中使用最广泛的是含有Quil A(从Quillaiasaponaria提取的皂苷的混合物)胆固醇和磷脂，且摩尔比率为1∶1∶1的制剂(Tomasi M等，1996.Mucosal Vaccine.13：175-186)。据报道，ISCOM能调节主要组织相容性复合体(MHC)II的表达，并通过刺激γ干扰素(IFN-γ)的释放起作用(Byars N E和Allison AC.Immunologic Adjuvants：General Properties，Advantages，andLimitations，in Laboratory Method in Immunology，Zola，H.，Ed.，39，1990)。也已经确定它们能刺激局限于MHC I的CD8+T细胞(Bomford RHR.氢氧化铝和皂角苷的不同佐剂活性，传染病的免疫药理学：非特异性抗性的疫苗佐剂和调制物，Madje，J.，Ed.，AlanR.Liss，New York，65，1987)。尽管ISCOM有这些优点，关于插入到膜中的抗原的价格、稳定性和性质，它们也仍然是免疫增强策略的难题。

脂质体，抗原传递系统，是球状囊的水悬浮液，其中它所含的磷脂组成脂质双层。根据它们的亲水或疏水特性，抗原能被分别运送到囊中或它们的表面(Childers N K，Michalek S M.Liposomes，in：D.T.Hagan(Ed.)，Novel Delivery System for Oral Vaccines，CRCPress，Inc.，Boca Raton，Florida，1994)。它们的佐剂活性依赖于层数(Susuki M，等，1994.Clin Immunother.2：121-125)、电荷(HaddenJW.1993.Immunology Today.14：274)、组成(McAnalley BH等inventors(Carrigton Laboratories Inc，assignee.Use of acemannan.US专利229164.1988年8月5日；Giles CH等，J.Soc.Dyers Colour1958；74：647)和生产方法(Giles CH等，J.Soc.Dyers Colour1958；74：647，Walkers GJ，1978.Biochem.Carbohydr.16：75-126)。它们的使用增强了对蛋白质和多糖性质抗原的体液和细胞介导的免疫性(Hadden JW.1993.Immunology Today.14：274；WalkersGJ，1978.Biochem.Carbohydr.16：75-126，Han YW.1990.Adv.Appl.Microbial.35：171-174；Cote G L和Ahegren J A.Metabolism inmicroorganisms Pert I.Levan and levansucrase.Science andtechnology of fructans.1993.pp.141-168.M.Susuki&N.J Charton.BocaRaton编.FL：CRC出版)。另一方面，脂质体内抗原的口服给药产生的粘膜应答高于单独的抗原经过这种途径给药获得的粘膜应答(Janeway CA.1992.Immunology Today.5：3；Paolo C，等，1999.Vaccine.17：12-1263)。脂质体的一个很大的缺陷是它们会被肠脂肪酶和胆汁盐破坏(Okada J，等，1995.Pharm.Res.12：576-582)。

由于其疫苗效果，微胶囊化抗原的使用也已经很突出。微胶囊是带有壳和芯的球体。壳由一种或多种聚合物组成，可生物降解或不能，但芯由抗原组成。如果聚合物是不能生物降解的，微胶囊作为一个带孔的储存器(reservoir)，通过该孔抗原慢慢释放。如果聚合物是可生物降解的，抗原通过微球体的降解释放。后者是比较常见的情况，其一个例子是常用的用乳酸和羟基乙酸(glycolic acid)的共聚物胶囊化微球体。微球体通过鼻(Eyles JE，等，1999.Int J Pharm.189(1)：75-9)、口和肠胃外(Gupta R K，等，1997.疫苗；15(16)：1716-1723)途径使用。

病毒样颗粒(VLP)也用于粘膜免疫策略的抗原传递系统。VLP由病毒壳体和包膜，或其它的蛋白质组成，该蛋白质当装配成超分子结构时它们与病毒类似。它们具有生产和纯化简单的优点，而且作为颗粒抗原，它们比可溶性抗原更好诱导粘膜免疫应答(AndréFE.1990.Vaccine；8(S74))。人乳头瘤病毒颗粒(HPV VLP)的鼻给药很好的产生了体液和细胞应答(Dupuy C，等，1999.Journal ofvirology；73：11：9063-9071；Liu XS，等，.1999.Virology.252：39-45，BalmelliC，等，1998.J of Virol.72：8220-8229)。

尽管存在几个粘膜免疫应答的诱导物部位，但最方便的是NALT。

通过鼻内途径接种活的流感疫苗在儿童和成人中取得了较好的效果。这种途径对当进行口服时对肠胃环境敏感的其它疫苗可能是有用的(Walker R I.1994.Vaccine.4：387)。

1997年首次人体研究表明，通过鼻内途径接种重组霍乱毒素B亚基(rCTB)疫苗，诱导了阴道分泌物中的特异IgA和IgG(Bergquist，Ch.1997.Infection and Immunity.65，2676)。此外，通过这种途径进行动物免疫在阴道分泌物中产生的IgA应答甚至高于通过阴道内途径进行免疫(Di Tommaso A.1996.Infect.Immun.64：974；Gallichan W S和Rosenthal KL.1995.Vaccine.5：1589；Hopkins S，1995.Infect.Immun.63：3279)。

本发明中所用的所有抗原是通常被广泛研究了疫苗用途的，甚至它们中的许多是通过鼻途径研究的。然而，尽管在大量研究中报道过，但这些主要使用肠胃外途径，而从未与HBsAg一起通过鼻内途径使用。

同时对小鼠进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(1或5μg)的鼻给药与重组霍乱B亚基(10μg)的鼻给药，不但产生了对HBsAg的全身免疫应答，而且在鼻腔、肺、唾液、小肠和阴道中也发现了粘膜应答。通过这种组合，获得了高水平的特异于病毒抗原的血清IgG1，IgG2a和IgG2b。使用商品化试剂盒通过EIA夹心法测定，几乎所有小鼠的血清滴度都高于1000mIU/ml(Isaka M等，2001.Vaccine.19(11-12)：1460-1466)。

已经证实，用HbsAg和带有CPG基元的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)进行鼻免疫的BALB/c小鼠对病毒抗原产生的抗体免疫应答与用CT或LT和HBsAg一起产生的量相同，并高于HbsAg与CTB或LTK63(LT的突变体)的组合所产生的。而且，CpG ODN、CT(或LT)和HBsAg通过鼻内途径同时使用，对后面的抗原的免疫应答能产生协同作用，但是当使用CTB或LTK63取代毒素时不能产生协同作用(McCluskieMJ，等2000.Mol Med Oct；6(10)：867-877)。在CpG ODN和HBsAg给药后占优势的同种型为IgG1/IgG2a，而CT的附加给药主要产生IgG2a(McCluskie MJ，等，1998.J Immunol.Nov1；161(9)：4463-4466)。

已经发现与以霍乱毒素为佐剂的HBsAg通过鼻内应用相比，乙酰甘露聚糖(acemannan)(从Aloe barbadensis Miller植物中提取的甘露糖的乙酰聚合物)与HBsAg一起通过鼻内途径给药，产生的血清IgG抗体应答与以明矾为佐剂的抗原给药后所获得的相似，在阴道分泌物中也产生了IgA应答(Aguilar JC等，1998.WO9839032)。

已经证实了当它们都通过鼻内途径接种时，乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)对HBsAg的强佐剂作用。已经证实这些作用与在同等条件下的CT的数值相似，甚至高于血清IgG抗体应答诱导中明矾(肌内给药)所显示的数值(Aguilar JA等，PCT/CU/99/000006)。这篇文献，是我们组的一个专利申请，表明当通过粘膜给药时，不同的VLP之间交叉免疫增强中协同作用的存在。该研究中分别使用了HPV、HCV和HBV之间的VLP组合，得到其中包括HBsAg的各种可能VLP的组合。从而证实不同VLP之间潜在的交叉增强活性(HBsAg是一种VLP)。其它的非VLP抗原由于它们与HBsAg的相互作用，得到任何增强剂效果是不明显的。也没有描述的HBsAg与除了VLP之外的其它抗原的可能制剂(Aguilar JA等，PCT/CU/99/000006)。

白喉类毒素(DT)在当前疫苗文献中占据了很重要的部分，基本上是通过肠胃外途径。也有一些论文中是通过鼻途径应用。用明矾中的白喉毒素进行肠胃外致敏(priming)，接着用CRM₁₉₇进行鼻加强，是小鼠中非常有效的一种免疫方法，能诱导高水平的抗DT IgG，而且能中和血清中的抗体和呼吸道中分泌的IgA(McNeela EA等，2000.Vaccine.Dec 8；19(9-10)：1188-98)。

当大肠杆菌的重组热不稳定性肠毒素B亚基与DT一起给小鼠进行鼻给药时，产生了血清DT特异性IgG抗体的非常大的刺激，和鼻腔与肺中粘膜DT特异性IgA的中度诱导(Kozuka S等，2000.Vaccine.Mar6；18(17)：1730-7)。

DT 5Lf与重组霍乱毒素B亚基(CTB)一起的鼻免疫，在所有的小鼠中都诱导了高的血清DT特异性IgG抗体应答或中度的特异性IgA应答，而仅仅在某些小鼠中诱导了轻微的IgE抗体应答。此外，小鼠中超过0.1IU/ml的足够高的白喉抗毒素滴度，表明了高水平的血清DT特异性IgG抗体应答。在相同的试验条件下，所有小鼠的鼻腔、肺、唾液、阴道分泌物及小肠和大肠中，都诱导出现了显著的粘膜DT特异性IgA抗体应答(Isaka M，等，1999.Vaccine.Nov 12；18(7-8)：743-51)。

已报道一种含有甘油-油酸酯/油酸囊的新悬浮液与DT一起使用，对小鼠进行肠胃外或鼻给药，能增加类毒素免疫原性到与弗氏完全佐剂中吸收或给药的明矾相同的水平。该研究表明免疫原性与酰基链长度之间的关联(Schroder U，等，1999.Vaccine.Apr 9；17(15-16)：2096-103)。

破伤风类毒素，象DT一样，也在当前疫苗文献中占据了重要的部分，主要为肠胃外免疫策略。

为了评估白介素6和12(IL-6，IL-12)与破伤风类毒素(TT)一起进行鼻给药时，粘膜IgA抗体应答的诱导，进行的研究显示，用IL-6和TT同时对小鼠给药诱导的血清TT特异性IgG抗体应答(主要是IgG1和IgG2b)比对照小鼠中的高，但分泌的IgA抗体应答低而且没有IgE。相反地，IL-12与TT一起进行鼻给药，不但诱导了显著增加的血清IgG，而且增强了粘膜中的IgA抗体应答。与IL-12和TT的组合所产生的抗体应答相比，IL-6、IL-12和TT的共同给药没有增强血清或粘膜的抗体应答(Boyaka PN，等，1999.J Immunol.Jan 1；162(1)：122-8)。

对已经用TT和CT佐剂进行过鼻免疫的小鼠，用IL-12进行鼻给药，导致了TT特异性IgG2a和IgG3抗体水平的增加，而IgG1和IgE抗体应答的显著降低。相反地，IL-12的鼻给药，增强了口服TT和CT混合物的小鼠中CT诱导的血清IgG1和IgE抗体应答(Marinaro M.等，1999.JImmunol.Jan 1；162(1)：114-21)。

用TT制剂进行鼻免疫的试验中，检测了用明矾中吸收的并与rCTB混合的TT进行免疫的小鼠的全身和粘膜应答。非吸收性TT 5Lf的鼻给药对刺激是必需的情形中，仅仅当rCTB(10μg)存在时，在所有检测的小鼠中都有高水平的血清TT特异性IgG，并在几只小鼠的鼻、肺和肠道灌洗中有中度或轻微的TT特异性IgA抗体应答，表明通过鼻根进行时它的免疫原性较差。然而，在得到以后，它能抵抗破伤风毒素的攻击(Isaka M，等，1998.Vaccine.Oct；16(17)：1620-6)。

TT也在测试新佐剂如无毒性突变体CT：CTS61F中用作模型。进行了该蛋白分别和几种抗原(尤其是TT)一起进行鼻给药所产生的免疫应答，与天然CT与rCTB用相似的方案所获得的免疫应答的比较研究。含有天然CT的制剂和含有突变体CT的制剂中，血清TT特异性IgG、IgA和IgM应答，以及粘膜分泌物中IgA抗体应答显著增加；rCTB没有显示好的佐剂活性(Yamamoto等，1997.Proc Natl Acad Sci U S A.May13；94(10)：5267-72)。

用聚(L-乳酸)微球中吸收的破伤风类毒素对豚鼠进行鼻给药，与用游离抗原所获得的免疫应答相比，增强了免疫应答；后者与在非免疫动物中发现的相似(Almeida AJ.等，1993.J PharmPharmacol.Mar；45(3)：198-203)。

免疫应答，尤其是与粘膜佐剂CT的鼻给药相关的免疫病理学反应的确定，是用TT与CT的组合对BALB/c小鼠给药的研究的目的。鼻免疫之后，小鼠在血清中产生了对TT和CT的抗体应答，主要是IgG同种型，占优势的IgG1亚类。与抗体应答一起，在肺中出现了可能致死的炎症反应。而且，诱导了与血清中白介素5(IL-5)检测有关的IgE应答。因此，它暗示用TT和CT进行鼻免疫，可能造成导致肺中严重的免疫病理学反应的Th2细胞的激活(Simecka JW等，2000.InfectImmun.Feb；68(2)：672-9)。这表明了应合理设计节约资源的免疫策略的重要，如寻找替代用作不同途径的免疫原性和功效的研究模型的有毒佐剂的策略，但是这些策略中有的组合不能用于人体。

另一种普遍用于人疫苗中的抗原是甲醛灭活百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertusis)(Bp)。该菌苗，通过鼻内途径对BALB/c小鼠给药，在血清和支气管肺泡液中诱导了高水平的IgG抗体，同时在血清和支气管肺泡液中、唾液和排泄物中诱导了IgA。但是，当它与CT一起给药时，抗Bp IgG应答没有增强，而IgA应答在所有分析的分泌物中显著降低(Berstad AK等，1997.Vaccine.Aug-Sep；15(12-13)：1473-8)。

为了测试Bp的鼻免疫原性和佐剂活性，在小鼠中进行了一个研究，其中该抗原与灭活的流感病毒一起进行鼻给药。单独的病毒诱导了低水平的流感特异性血清IgG抗体，虽然它们显著的高于非免疫的对照，但血清与唾液IgA应答之间没有差异。相反地，当Bp与灭活的流感病毒一起给药时，显著增强了血清病毒特异性IgA和IgG与唾液IgA应答(P＜0.005)。但是，这种佐剂作用在肠(测定排泄物中的抗体)的同样类型的应答中是不显著的。另一方面，与病毒疫苗混合时，对Bp的抗体应答被抑制。产生的针对Bp的唾液抗体显示了与脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)之间的交叉反应(Berstad AK等，2000.Vaccine.Mar 17；18(18)：1910-9)。这是重要的，因为它证实了从抗原组合开始，针对组合中的所有抗原诱导高水平的应答不是显而易见的。在人体中也测试了Bp。用细胞百日咳菌苗通过鼻途径对6个成年人间隔一周进行4次给药。所有菌苗接种者中对Bp全细胞抗原的鼻液IgA抗体都增加了。三个有高水平鼻抗体应答的菌苗接种者，也增加了对Bp的血清IgA和IgG抗体的滴度。除了在鼻液中对FHA的抗体的中度增长外，对全细胞抗原的唾液抗体应答，以及在血清和分泌物中对百日咳毒素(PT)与丝状血细胞凝集素(FHA)的抗体是可以忽略的。出乎意料地，在相同菌苗接种者中，对脑膜炎球菌外膜抗原的鼻和唾液抗体有显著的升高，而相应的血清IgA和IgG抗体没有变化(BerstadAK，等，2000，J Med Microbiol.Feb；49(2)：157-63)。这就是针对该抗原的鼻制剂，在免疫原性研究中必须考虑对单个蛋白的应答的原因。

尽管血清杀菌抗体的存在与对脑膜炎球菌疾病的免疫性相关，在入口处的粘膜免疫也起很重要的作用。这就是对给予小鼠的鼻疫苗制剂中的脑膜炎奈瑟氏球菌B外膜复合物(OMPC)的免疫原性进行评估研究的原因。在该研究中，证实了强的全身杀菌抗体应答及肺中强的局部IgA应答。但是，要引起血清中同等的杀菌抗体应答，与腹膜内免疫相比，在鼻免疫中需要高8到10倍剂量的OMPC(Saunders NB，等，1999.Infect Immun.Jan；67(1)：113-9)。

已经证实，挪威群体B脑膜炎球菌外膜囊疫苗在没有添加佐剂进行鼻给药后，在人体中能诱导T细胞应答。为了达到这个目的，每隔一周用4剂量的OMPC(250μg蛋白/剂量)对由12个个体组成的小组进行免疫，5个月后使用加强剂量。由于OMPC疫苗、纯PorA(1类)蛋白、PorB(3类)蛋白和一个不相关的对照抗原(牛分枝杆菌BCG)引起的T细胞增殖，通过免疫之前和之后获得的外周血单核细胞中的[3H]胸苷掺入进行了测定。用OMPC进行鼻免疫，当针对OMPC(12个中有7个)和PorA抗原(12个中有11个)进行测试时，大多数疫苗接种者中都诱导了抗原特异性T细胞应答；在初始4剂量后，没有任何疫苗接种者显示对PorB抗原的疫苗诱导T细胞应答(Oftung F等1999.Infect Immun Feb；67(2)：921-7)。

已经证实，在人体中，OMPC以鼻滴剂或鼻腔喷雾的形式每隔一周给药4次，引起了鼻和唾液IgA应答。而且，在几个免疫的个体中观察到了血清IgG抗体的中度增加(Haneberg B等，1998.Infect ImmunApr；66(4)：1334-41)。

另一方面，通过粘膜途径(鼻和直肠)对小鼠附加使用CT，与通过相同途径进行给药的OMPC疫苗相比，增强了血清抗体应答。但是，最有效的免疫是鼻免疫，因此推测粘膜应答不依赖于CT的使用。此外，同样地CT也没有增强血清的杀菌活性，这表明对血清IgG水平的正效应不包括杀菌活性(Dalseg R等，1999.疫苗，May 14；17(19)：2336-45)。

已经看到使用OMPC与马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)脂多糖(LPS)的复合物，对小鼠进行鼻给药，在肺粘膜中产生了高水平的抗LPS IgG和IgA，在接种2个剂量后肺和脾中也产生了IgG和IgA抗体分泌细胞。另一方面，血清中也发现了高水平的血清IgG和中等水平的IgA。这说明，由于获得了显著的IgG1亚类应答，OMPC可能产生了对LPS的Th2样应答(Van De Verg LL等，1996.Infect Immun Dec；64(12)：5263-8)。

含有几种分离自不同病原体的抗原的疫苗，实际上已经在世界卫生组织发起的扩展免疫计划的研制中，这里，意欲包括乙型肝炎疫苗(Chiu HH等，1998.Pediatr Infect Dis J Mar；17(3)：206-11)。

已经证实，用含有HBsAg、DT、TT和Bp(5到10μg的HBsAg)的疫苗对年龄为1.5、3.5和6个月的儿童给药，如果他们出生的时候就用HBsAg疫苗(10μg)进行过免疫，能产生保护性血清抗HBsAg抗体滴度(大于10mlU/ml)(Chiu HH等，1998.Pediatr Infect Dis JMar；17(3)：206-11)。

含有与破伤风类毒素缀合的胶囊b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)多糖(PRP)(PRP-TT)、HBsAg、DT、TT和Bp抗原的疫苗，通过肠胃外途径对婴儿给药，或当两种疫苗通过同样的途径给药时，其中一个具有HBsAg、DT、TT和Bp抗原，另一个仅含有PRP-TT，不影响对HBsAg、DT、TT和Bp抗原的抗体应答。获自含有用于重组冻干的PRP-TT的HBsAg、DT、TT和Bp抗原的疫苗混合物的制剂的应用，不影响对前面4种抗原的抗体应答。另一方面，在后者的情况下，抗PRP的抗体应答显著较低(Greenberg DP等，2000.Pediatr Infect DisJ.Dec；19(12)：1135-40)。

用只含HBsAg和PRP(后者与脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC结合)的制剂，给以前已经暴露于这些抗原的健康成年人接种，增加了对这些抗原的血清抗体水平(Bulkow LR等，1993.Arctic Med ResJul；52(3)：118-26)。

把PRP添加到含有HBsAg、DT、TT、Bp抗原和灭活的脊髓灰质炎病毒的疫苗中，既没有降低第二种抗原的免疫原性，也没有增加在人体中的反应原性。另一方面，用新制剂所产生的抗PRP的抗体滴度，与用PRP单价疫苗，或在某些欧洲国家已经得到许可的PRP与DT、TT和Bp抗原的组合所获得的抗PRP的抗体滴度相似(Schmitt HJ等，2000.J Pediatr Sep；137(3)：304-12)。

目前，没有关于涉及HBsAg和DT、TT、OMPC、Bp、Hib或其它的可溶性抗原，或由病毒或细菌灭活产生的进行鼻给药的抗原组合，并证实HBsAg的增强作用的研究文献。组合疫苗通过鼻内途径给药的优点，是可能会减少给药的次数，记住可能会同时使用多个抗原而不是每个分离地使用；而且，基于一些抗原能增加其它的抗原的免疫原性而且不明显消极地影响它自身的特性，也可能不包括佐剂，不需要使疫苗应用变得复杂并更昂贵的专门人员和医学材料而进行的可能性；使用无侵染性方法的事实，提高了将进行免疫的人主要是儿童的生活质量；而且可能获得与通过肠胃外疫苗所获得的相同或更好的保护，甚至在孩童时期和高龄的关键年龄，由于许多病原体的主要入口的粘膜水平应答的产生。

发明详述

本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原在用该抗原和其它受益于乙型肝炎病毒表面抗原的该特性和该特性的应用的其它疫苗抗原的组合产生的疫苗制剂的鼻免疫中作为免疫增强剂的用途，，以及制剂在疫苗领域的应用。

本发明也涉及多价制剂，特别是由HBsAg的该特性的应用产生的鼻给药，增加了该制剂中其它抗原的免疫应答。

本发明与乙型肝炎病毒表面抗原一起进行鼻给药的疫苗制剂，可能含有一种或多种可溶性蛋白质抗原，由于它与HBsAg的同时给药得到了免疫增强效果。它们可以是：破伤风类毒素，白喉类毒素或蛋白质-多糖的缀合体，其中糖类部分相应于疫苗候补物质抗b型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌的C多糖、肺炎性肺炎球菌(Pneumococcuspneumoniae)的疫苗多糖，或总体来说，一种或多种纯化的或重组获得的目的疫苗的可溶性蛋白质。

其中乙型肝炎病毒表面抗原与来自灭活微生物的疫苗候补物质组合的用于鼻给药的多价制剂也在本发明的目的之内，所述疫苗修补物质由于它与HBsAg的同时给药获得了免疫增强效果。疫苗抗原可以是百日咳博德特氏菌全细胞，由于它与HBsAg同时给药产生了免疫增强效果或其它单独或抗原的整合复合物组合具有相同性质的疫苗抗原。

可包含的其它疫苗抗原为目前灭活或减毒的疫苗候补物质。

本发明涉及的通过鼻给药的疫苗组合物，可包含来自不同物种的微生物并具有前面所述的抗原活性的n个抗原，n的范围为n＝1到n＝20，接种的终体积和抗原量，根据将进行免疫的大小和物种，分别为50微升到2毫升，和0.1微克到2mg。

本发明的制剂可以前面所述的重量和体积的可能组合内的抗原浓度，溶于PBS、盐水溶液、注射用水或医学实践中使用的可使抗原稳定的任何缓冲液。

同样地，抗原成分可以根据涉及接种疫苗的年龄的目的候补物质或基于任何其它前提的多价候补物质与HBsAg混合，其中前面所述的一种、两种或多种抗原类型可以是冻干的或以滴剂，喷雾或粉末的形式给药。

本发明的疫苗组合物能用于作为预防性或治疗性治疗，在人体或动物中达到有效的免疫。

附图简述

图1.在第0、14、28、87天接种，并于-10、21、35、42、84和97天放血的实验的IgG应答的动力学。(A)针对HBsAg的血清IgG应答的动力学；(B)针对TT的血清IgG应答的动力学；(C)针对TD的血清IgG应答的动力学和(D)针对Bp的血清IgG应答的动力学。表1A、B、C和D：相应图的组之间进行比较的统计分析结果。

图2.第97天的阴道IgA应答。(A)针对HBsAg的IgA应答；(B)针对TT的IgA应答；(C)针对DT的IgA应答和(D)针对全细胞Bp的IgA应答。表2A、B、C和D：统计分析。

图3.第97天的肺IgA应答。(A)针对HBsAg的IgA应答；(B)针对TT的IgA应答；(C)针对DT的IgA应答和(D)针对全细胞Bp的IgA应答。表3A、B、C和D：统计分析。

图4.四价制剂通过腹膜内或鼻途径给药后，评估Bp单个蛋白质的血清IgG应答。在(A)第三次接种和(B)第四次接种之后，用鼻或腹膜内四价制剂免疫的每组中单个血清产生的光密度水平(分别为7组和13组)。

图5.对实施例1的鼻四价制剂的针对抗原的增殖活性评估，分别给药以及在四价制剂中。

图6.HBsAg对脑膜炎奈瑟氏球菌OMPC的增强活性。两种抗原的组合显著增加了抗OMPC应答。

实施例

实施例1

为了评估几种含有不同类型抗原和带有或不带HBsAg的制剂，在进行鼻给药后产生的抗体应答，设计了一个实验，有126只8到10周龄的雌性BALA/c小鼠，划分成13个组：1到11组每个组都有10只动物，12和13组每组有8只动物。所有的小鼠在第0、14、28和87天进行免疫，并于第-10、21、35、42、84和97天放血。对每只小鼠给药的每个抗原的剂量如下所示：

组       途径      每组中抗原的剂量

第1组    (鼻)¹     5μg HBsAg+10μg DT

第2组    (鼻)      5μg HBsAg+3.2UOP Bp^*

第3组    (鼻)      5μg HBsAg+10μg TT

第4组    (鼻)      5μg HBsAg+10μg DT+3.2UOP Bp^*

第5组    (鼻)      5μg HBsAg+10μg DT+10μg TT

第6组     (鼻)    5μg HBsAg+3.2UOP Bp^*+10μg TT

第7组     (鼻)    5μg HBsAg+10μg DT+10μg TT+3.2UOP

                  Bp^*

第8组     (鼻)    5μg HBsAg

第9组     (鼻)    10μg DT

第10组    (鼻)    3.2UOP Bp^*

第11组    (鼻)    10μg TT

第12组    (IP)²   5μg HBsAg+0.125mg Al(OH)₃

第13组^φ  (IP)    5μg HBsAg+49.26μg DT+29.07μg TT+

                  8.0UOP Bp^*+0.125mg Al(OH)₃

(鼻)¹用鼻免疫的组

(IP)²用腹膜内免疫的组

^*UOP：混浊度单位；在每种情况中都使用等量的前述Bp菌株的UOP。

φ可以观察到第13组与鼻给药组的HBsAg剂量相同。但是，由于使用一个商业疫苗组合物作对照，此处其余的抗原的剂量较高。该疫苗含有不可改变的每个疫苗的特定剂量。这些与表格中提供的微克相对应。因此，TT、DT和Bp通过鼻内途径使用的量分别低3、5和2.5倍。但HBsAg使用相同的量。

血清抗HBsAg抗体应答

针对乙型肝炎病毒表面抗原的IgG抗体应答的测定显示，第三次给药一周之后，在用HBsAg、DT、TT和Bp进行鼻免疫的组中(第7组)，它显著高于仅仅把溶于PBS的HBsAg通过相同的途径进行免疫的第8组。这种特点在第42天重现(图1A)。

其它的鼻免疫组(第1-6组)显示了与第7组同样的特点，在3次给药后，IgG的水平显著高于用溶于PBS的HBsAg所获得的，除了第2组之外，其在第35天较高，但没有显著的(p＞0.05)应答。不过，该组在第42天确实有很显著的差异，它可以通过第35天滴度的宽分布进行说明。

用含有HBsAg和Bp；HBsAg、Bp和DT；以及HBsAg、Bp和TT的制剂进行鼻免疫的组(分别为第2，4和6组)，在第2次给药后，有显著高于第8组的IgG应答。

应当指出在第35天，用HB-DTP混合物进行鼻免疫的组的抗HBsAg IgG应答，与通过腹膜内注射进行免疫的同源组没有显著差异(第13组)。同样方式，在4次给药后，使用抗原组合的鼻免疫组与IP免疫组之间获得了统计上相似的值(图1)。

用Heberbiovac HB^疫苗免疫的组(第12组)产生的抗HBsAg滴度，显著高于任何鼻免疫组。该结果是由于当HBsAg通过腹膜内(IP)途径给药时，比肌肉和皮下途径具有更高的免疫原性。我们的实验中已经显示了IP的这种特性。不考虑抗HBsAg应答的这种特性，对每个小鼠接种250μl疫苗，对应于等于鼻剂量的5μg HBsAg剂量，对使用IP途径是必需的。然而，在年龄较大的动物中观察到，通过鼻接种产生的应答与通过腹膜内注射诱导的应答相等。这样的实施例见第2个实验(见实施例2)，尽管鼻候补物质不同。

尽管通过鼻途径产生的滴度密度较低，但最近已经观察到，第2组中诱导的抗IgG2a应答水平显著高于第12组中所示的(数据没有显示)。这证实了，Bp对抗HBsAg抗体应答的调节作用，在应答中引入了一个质的变化，产生了可由IgG亚类特性证实的Th1样的应答。与以明钒为佐剂的疫苗产生的常规特征相比，该应管的特征在于IgG2a抗体的高产量。

如图1所示，鼻和腹膜内抗HBsAg应答的出现和持续是很相似的，有相似的随时间的增强和降低。

血清抗破伤风类毒素IgG抗体应答

在用第7组的混合物进行鼻给药之后，证实了HBsAg、DT和Bp对破伤风类毒素的较强的免疫增强作用。在第2，3和4次接种后，与用PBS中的破伤风类毒素通过相同途径进行免疫的第11组相比，该组的抗TT IgG水平很显著地升高。

用含有TT的混合物通过鼻接种疫苗的其它组，特别是第3，5和6组，分别取血后，显示了比第11组所诱导的更高的抗体水平。第2次给药后，第3组的抗体水平大约比第11组高100倍。这是有非常重大意义的，因为这是HBsAg对可溶性抗原如TT的免疫增强活性的首次证明。

如在抗HBsAg应答中观察到的，破伤风类毒素也增强了抗HBsAg应答，表明相对于免疫原性的交叉增强，我们获得协同相互作用。已经在HBsAg和HbcAg及其它病毒核壳抗原中观察到这种现象，但是在可溶性抗原中还从未观察到。在用溶于PBS中的类毒素进行免疫的第11组中，已经证实TT通过鼻途径是没有免疫原性的。因此，HBsAg和TT的这种作用是出乎意料的。

抗TT应答被显著增强，当HBsAg、TT和Bp配制到一起(第6组)时产生的抗TT应答，比用PBS中的TT(第11组)通过鼻内途径进行免疫所产生的强1000倍。用DT、HBsAg和TT(第5组)的混合物没有获得这种额外的增强。该制剂没有产生显著的改变，但是显示了与TT和HBsAg的组合在抗TT应答方面相似的统计学特征(图1B)。

第6和7组的滴度没有显著差异。但是这些组中都存在Bp和HBsAg，诱导的应答高1000倍。因此，我们认为表面抗原和Bp都产生了抗TT应答的免疫增强，其在第1种情况中使滴度增加到非常显著的水平，而且用二者的混合物使滴度增加到了很显著的水平。由于实验中鼻内组合物的所有组都用HBsAg进行免疫，确定Bp的增强作用是否独立于HBsAg，或是否都有协同增强活性是很重要的。对于TT可以肯定的是，研究的所有制剂中的抗原数不影响它的免疫原性，但是它还是被增强并达到非常显著的水平(图1B)。

分别都用4种抗原通过鼻内和腹膜内给药进行免疫的第7和13组诱导的TT特异性IgG水平没有显著差异。然而，与第13组获得的应答相比，对于某些组，通过鼻内途径获得的应答较高，尽管不显著(图.1B)。

虽然在第2次给药一周后，用HBsAg和TT(第3组)与用HBsAg、DT和TT(第5组)进行免疫的组的IgG滴度与第13组没有差异，但是在第3和4次给药后它们的应答显著较低。该结果证实，把Bp添加到混合物中，以增加抗TT应答到与进行IP给药后所获得的相似的水平是重要的。不过，也应该考虑到通过IP途径给药的TT量比通过鼻途径给药要高3倍。

血清中抗白喉类毒素的IgG抗体应答

与用PBS中的DT给药的第9组得到的应答相比，DT与HBsAg、TT和Bp一起进行鼻给药(第7组)，相当大地增强了DT的免疫原性(图1C)。

在用DT组合物进行鼻免疫的其余组(第1，4和5组)中，显示了相似的行为，抗DT IgG水平非常显著地增强。只有第1组在第2次给药后没有显示显著较好的结果，但是，在第3次给药后的第35和42天，与用PBS中的白喉类毒素进行免疫的组相比，第1组的应答是非常显著的(图1C)。

比较用含有DT的制剂进行鼻免疫的组与用腹膜内给药的组之间的抗DT IgG水平，四价商业疫苗(第13组)显示了抗TT应答样特征。换句话说，在含有HBsAg但没有Bp的组中应答增强了100倍，而添加Bp更加增强了应答，甚至达到高于用DPT-HB疫苗通过IP途径所产生的应答的水平。DT的这种行为再现了在其它可溶性蛋白TT中所发现的这种作用。因此，我们可以肯定，HBsAg对两种可溶性蛋白都有免疫增强作用，反之亦然。在DT的情形中，已经证实了关于针对混合物中抗原的免疫应答交叉增强的协同活性；因此，如前面所说明的，添加DT增强了抗表面抗原IgG应答。再次证实需要添加Bp能增强抗DT应答100倍，达到与进行IP给药后获得的相似的水平。必须记住的是，该应答与通过IP途径所获得的相似，但是在那种情况中DT的量要多5倍。

血清中抗百日咳博德特氏菌全细胞IgG抗体应答

所有抗Bp应答的特征在于它们的强度并很快增强到接近饱和水平(图1D)。不考虑结果的一致性，统计分析揭示了组之间产生显著差异的可能性。

在第3次给药之后，用四价组合物进行鼻免疫的组产生的应答，显著高于只用Bp通过相同途径进行免疫的组所获得的应答(第10组)。但是，这种作用在第4次接种后消失，因为它很快达到了滴度饱和的状态。

用含有Bp一种或多种抗原的制剂与进行鼻免疫的其它组有强的应答，给予HBsAg和Bp的组在第35天的应答从显著到非常显著的增强，证实在灭活细胞中也能产生HBsAg的免疫增强作用，除了对可溶性蛋白的已知作用以外。第2组和第4组在第42天都保持了这种统计上的差异，而第6组和第7组(用更复杂的复合物给药)与第10组没有差异。比较所有的鼻内组与IP组，显示在第2和3给药后没有显著差异，证实用全细胞通过鼻途径进行免疫能获得高的滴度。

实施例2.

HBsAg的鼻多价制剂的粘膜应答测定

考虑到对鼻给药的抗原较强的应答依赖于在粘膜和全身水平能否产生强的应答，我们测定了实施例1中所述的免疫组的阴道和肺灌洗(lavages)中的IgA抗体应答。

阴道抗HBsAg应答

第4次给药之后，在第100天，用四价制剂进行鼻免疫的组的阴道灌洗中诱导的HBsAg特异性IgA应答，与在用HBsAg通过相同途径进行专门免疫的小鼠中发现的没有显著差别。应当指出，由于用PBS中的HBsAg进行加强免疫的组产生的强应答，血清抗HBsAg IgG滴度也没有差异。但在第一个组中发现了高20％的血清转化(seroconversion)。尽管没有差异，必须强调的是，如此大的抗原量对阴道抗HBsAg应答没有影响。

另一方面，比较用4种抗原的组合通过鼻内或腹膜内途径给药的组(分别为第7和第13组)诱导的IgA水平，证实在通过粘膜途径进行免疫的组中产生的阴道分泌物中占优势的抗体的水平，显著高于通过肠胃外免疫的组。必须强调的是，用HBsAg制剂进行腹膜内接种导致了一个虽然低的阴道IgA水平，但它的值高于通过SC和IM途径所获得的(数据没有显示)。这就是为什么在进行IP免疫后于阴道灌洗中发现显著应答的原因。总的来说，如同预期的，鼻内免疫胜过IP免疫。

阴道抗破伤风类毒素应答

在4次给药后阴道TT特异性IgA水平的测定证实，与只用TT进行免疫的组所诱导(其中一个的血清转化为0％)的相比，用HBsAg、DT、Bp和TT进行鼻免疫的组(第7组)产生了更强并非常显著的应答。用在不同抗原混合物中的TT进行鼻接种的其它组有相似的行为。从该结果中可看出，并记住第3组(含有HBsAg和TT)的应答，表明HBsAg在与其它混合物相同水平增强阴道抗TT IgA应答是可能的(图2B)。

通过鼻内途径接种的所有组，显示了比用HB-DTP通过腹膜内注射免疫的组更强并非常显著的应答。该组只有14％的血清转化。因此，可以肯定，不是所有的抗原通过IP途径给药都能产生阴道应答。它似乎是包括HBsAg在内的某些抗原的专有特性。

阴道抗白喉类毒素应答

用鼻四价制剂进行免疫的组和用含有DT的其它鼻制剂进行免疫的组诱导的抗DT IgA应答，高于(p＜0.001)用作为对照的PBS中的DT进行免疫的第9组(图2C)。

此外，通过鼻给予四种抗原的组产生的应答也强于用四价疫苗进行腹膜内给药的组；与TT有相似的行为。

总的来说，可以看出，进行粘膜免疫的组产生的阴道IgA水平显著的高于给予4种抗原的IP组。

第1组的抗DT IgA水平与免疫原性较高的组没有差异，证明如前面对TT所证实的，与用PBS中的类毒素给药的第9组相比，HBsAg诱导了非常显著地增强的阴道抗DT应答(图2C)。如我们前面评论的，该结果可能在保护对抗破伤风和白喉上没有直接的益处。但是，在评估TT和DT模型之后，认为HBsAg与性质相似的来自其它病原体不是颗粒的但可溶的抗原(游离或固着于这些蛋白)的组合物通过鼻给药，能增强阴道水平的免疫应答。

阴道抗百日咳博德特氏菌应答

阴道抗Bp应答分为两个水平，较低水平是用PBS中的Bp进行免疫的组，较高水平的是对应于用所有研究的组合物进行免疫的组。通过组合免疫(所有的都含有HBsAg)获得了更强并非常显著的抗Bp应答。然而，必须注意的是，Bp单独产生的应答诱导的水平接近1∶100，不像破伤风和白喉类毒素几乎没有血清转化，并只在用抗原混合物免疫后达到了强的应答。

在Bp的例子中，没有观察到IP接种产生了任何阴道IgA应答。因此，它有TT样的行为，其中一个通过IP途径在阴道灌洗中产生了可以忽略的IgA应答。其它的两种抗原，HBsAg和DT单独产生了微弱但显著的应答，分别有70％和60％的血清转化。

肺IgA应答

阴道应答在保护对抗病原体之一上是重要的，同样地，呼吸道的应答对对抗病原体Bp和白喉棒状杆菌(Coynebacterium diphtheriae)是很重要的。这不排斥在用第7组四价进行鼻内免疫之后，关于粘膜免疫激活水平的抗TT和抗HBsAg应答常识的研究。

肺抗HBsAg应答

在测定肺灌洗中的HBsAg特异性IgA应答后，得出的结论是，用四价制剂进行鼻免疫的组(第7组)产生的应答，与只用HbsAg通过相同途径进行免疫的组(第8组)产生的应答之间没有显著差异。应当指出在肺的IgA水平评估期间，用混合物或用PBS中的HBsAg进行免疫的组之间的血清IgG水平相似。第8组中，第4次给药的强的加强作用能引发抗HBsAg IgA水平。但该应答是强的并不受PBS中的HBsAg通过大量抗原(DT、TT和Bp)的给药所产生的应答的影响，证实该途径很强的能力(图3A)。

在同一图中，可以观察到IP途径在肺灌洗中没有诱导显著的应答，而且与鼻内途径组的比较相当大的支持了后者(p＜0.001)。

肺抗破伤风类毒素应答

四价鼻制剂的抗TT IgA应答，比用PBS中的TT通过同样途径所获得的，或用明钒中的HBsAg、DT和Bp一起进行腹膜内给药所获得的应答要高得多。后面的这两个对照组显示的应答几乎是可以忽略的(图3B)。

肺抗白喉类毒素应答

白喉类毒素与鼻给药的HBsAg、TT和Bp的组合，极大地增强了它的免疫原性。这是基于下列事实，抗DT IgA抗体应答的测定结果表明，用四种抗原的组合物通过粘膜途径进行免疫的组(第7组)与第9和13组(分别对应于用PBS中的DT进行鼻给药和四价疫苗通过腹膜内途径的对照)之间，有非常显著的差异(p＜0.001)。在第9组中，以1∶100稀释没有小鼠是DT特异性IgA阳性的。在IP组中只检测到一只阳性小鼠。因此，这种差的应答与四价混合物所获得的形成了强烈的对比，同时在相同组中对TT获得的应答上也有一个对比(图3C和3B)。

肺抗百日咳博德特氏菌应答

在比较用四价组合物通过鼻内途径进行免疫的组(第7组)，与用灭活的Bp细胞通过同样的途径进行专门免疫的组(第10组)得到的抗Bp IgA应答之后，发现它们之间没有差异。但是，当把这些组的每个应答，与以明钒为佐剂的四种成分的混合物通过腹膜内途径给予的组产生的应答进行比较时，两个IgA应答都有非常显著的优势，又一次证明只有粘膜接种强烈增强了肺灌洗中的IgA应答(图3D)。

虽然使用混合物肺灌洗中的抗Bp应答没有如在阴道灌洗中的一样增强，但没有发现增加抗原数对免疫原性的负面影响。应该注意，第7和10组的抗Bp应答是非常高的，滴度的几何平均数达到了104。该结果表明，Bp是通过鼻内途径诱导肺IgA应答的极好的免疫原。抗体水平上观察到的效果是最大的缩小了间隔，证明了它们的饱和。因为仅仅在第7组中进行了肺灌洗，没有比较第2组与第10组来研究结合HBsAg与Bp的效果，但我们设想，考虑到滴度水平和应答的特性，如果有差异的话，差异也将是很小的。

实施例3.

在实施例1的第7和13组的组合物进行鼻和全身给药后对FHA蛋白和百日咳类毒素的抗体应答的比较

因为在说明书中提到的以前的报道表明为引起对Bp单个蛋白：FHA和百日咳毒素的应答的鼻内途径的能力较低，对它们的应答的评估在第7和13组中进行，分别对应于用四价制剂通过鼻和肠胃外途径给药。在第3次和第4次接种后完成了评估。评估的放血之应答的统计分析证实，鼻组和肠胃外组之间没有显著差异。因此，我们可以作出结论，在鼻的四价制剂中诱导持续，甚至在接种低于2.5倍的Bp量之后(图4)。

实施例4.

鼻给药后脾中的淋巴增殖反应

为了研究实施例1的抗原产生的脾的增殖应答，在第100天选择第7和13组，从每组至少4只小鼠中摘出脾，制备淋巴细胞的混合物，在免疫它们的抗原存在下培养。以四价制剂进行鼻给药的抗原的增殖能力的评估结果，分别显示于图5中。腹膜内组用作对照途径。

该实验结果证实了，针对制剂中的所有抗原获得显著的细胞应答是可能的，来自多抗原制剂的的鼻给药中的一些甚至更高，图5。

实施例5.

HBsAg也作为来自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜囊的蛋白复合物(OMPC)的免疫原性增强剂

为了探究HBsAg是否能增强对共同给药的抗原的应答，进行了一个实验，其中8只8到10周龄的BALB/c小鼠的组用HBsAg、OMPC进行免疫，相应的对照组单独用抗原进行免疫。该实验证实，表面抗原能显著地增强对OMPC的免疫应答，反之亦然(图6)。

其它的共接种抗原由于表面抗原的增强活性，对它们的免疫原性产生了相似的影响。它们中的一些是灭活的病毒、减毒微生物和病毒表面蛋白以及可溶性蛋白和菌苗。

实施例6.

一些真正的组合物。可能的和组合方法

一些多组合物，其已经证实了单个成分的免疫原性，而且对其中存在的高百分比抗原产生了增强的应答，如下表所示。它们能总体上配制成用于鼻给药的液体或冻干的形式。

1-Hb-D    6-Hb-PT       11-Hb-DPT-Hib

2-Hb-P    7-Hb-DPT      12-Hb-(IPV)

3-Hb-T    8-Hb-(Hib)    13-Hb-DPT-Hib-(IPV)

4-Hb-DP   9-Hb-(OMPC)

5-Hb-DT   10-Hb-(减毒或灭活病毒，

          天然的或重组体)

在能与HBsAg混合的抗原性组合物中，选择能根据它们在年龄组中的应用(老年人、青少年或新生儿童)，并根据粘膜疾病的种类配制的抗原。这里包括的抗原是通过粘膜进入的抗原，其中粘膜免疫是重要的。它们可以根据抗原混合物对预防性病呼吸道或口腔-肠内疾病的用途，根据冒险组或旅行者的需要，根据器官(organ)(例如：HBV、HCV和HAV)，或根据疾病的种类(例如：慢性性传播疾病、病毒性性传播疾病等等)来选择。

Claims (20)

1.一种用于鼻给药的多价疫苗制剂，含有作为可溶性抗原、菌苗和灭活病毒的粘膜免疫增强剂的乙型肝炎病毒表面抗原。

2.权利要求1的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中制剂抗原之一为乙型肝炎病毒表面抗原本身。

3.权利要求1和2的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中包括与乙型肝炎病毒表面抗原一起的n个其它抗原，由于它们与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用，其中n为1到20。

4.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含破伤风类毒素抗原，由于它与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

5.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含白喉类毒素抗原，由于它与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

6.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含相应于疫苗抗原抗b型流感嗜血杆菌的缀合蛋白-多糖，由于它与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

7.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含相应于缀合于载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖的缀合蛋白-多糖，由于它与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

8.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含其多糖部分相应于肺炎性肺炎球菌疫苗多糖的缀合蛋白-多糖，由于它与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

9.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含作为疫苗抗原的灭活微生物，由于它与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

10.权利要求9的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中疫苗抗原可以是百日咳博德特氏菌菌苗，由于它与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

11.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含作为疫苗抗原的灭活病毒，由于它们与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

12.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含作为疫苗抗原的减毒病毒，由于它们与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

13.权利要求1到3的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中n包含前面权利要求4到12中所述的一种或多种抗原，或它们的混合物及其它的抗原类型，由于它们与HBsAg的共同给药获得了免疫增强作用。

14.权利要求1到13的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中根据将被免疫的大小和品种，最终的制剂体积为50微升至2毫升。

15.权利要求1到14的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中根据抗原的种类和将被免疫的品种，接种的抗原量为0.1微克至2毫克。

16.权利要求1到15的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中抗原混合物溶解于PBS、盐水溶液、注射用水或任何用于医学实践或允许抗原稳定的缓冲溶液中。

17.权利要求1到16的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中的成分是液体的或冻干的。

18.权利要求1到17的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其中通过点滴、喷雾或粉末进行给药。

19.权利要求1到18的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其特征在于其用于人体或动物中。

20.权利要求1到19的用于鼻给药的多价疫苗制剂，其特征在于其预防或治疗用途。

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