KR20040081469A

KR20040081469A - 점막 면역 자극제로서 간염 비 바이러스 표면 항원 및결과물로서의 제제

Info

Publication number: KR20040081469A
Application number: KR10-2004-7011504A
Authority: KR
Inventors: 아귈라루비도줄리오케사르; 알레만잘디바르레지스; 로바이나마토야디라; 파존훼이트롤란도; 뮤지오곤잘레즈베레나루실라; 귈렌니에토게라르도엔리크; 알바레즈오브레곤줄리오케사르; 가르시아곤잘레즈데이미어; 이글레시아스페레즈엔리크; 사르디나스가르시아그리텔; 하아디란도유제니오; 펜톤아리아스에듀아르도; 우르퀴자노아디오슬라이다
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2002-01-24
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2004-09-21
Also published as: WO2003061692A2; WO2003061692A3; EP1493447A2; BR0307121A; CA2471727A1; CU23031A1; AR038311A1; CN1703241A; US20050025780A1; ZA200405140B; MY141983A

Abstract

본 발명은 명세서에서 기술된 제제에서 공동 투여된 항원에 대한 면역 반응에서 향상과 증가를 위하여 사용되는 점막 표면 항원과 관련된다.

상기 새로운 제제는 면역 자극 제제로서 그리고 동시에 백신 항원으로서 표면 항원의 이중 사용으로부터 얻어진다. 위와 같은 방법으로 간염 B 표면 항원의 복수 개의 제제 및 이종 조직의 항원을 얻는 것이 가능하고, 뒤따르는 비경구 투여로서 얻어진 것과 유사한 수준의 면역원성을 얻을 수 있고, 비강 보조제의 사용이 없는 상태로 성분의 감소가 가능하고, 그에 의하여 동일한 항원을 다른 공동 투여되는 항원에 대한 반응에 있어서 증가를 향상시킬 수 있는 성분으로 전환시킬 수 있다.

상기 간염 B 바이러스 표면 항원의 새로운 사용 및 결과로서 발생하는 항원 제제는 치료적으로 약학 산업에서 이용될 수 있고 그리고 예방 백신 제제로서 사용될 수 있다.

Description

점막 면역 자극제로서 간염 비 바이러스 표면 항원 및 결과물로서의 제제{Hepatitis B Virus Surface Antigen as a Mucosal Immunoestimulator and the Resulting Formulations}

변성 독소(toxoids) 및 그들의 접합물(conjugates)을 포함하는 본 발명은HBsAg 및 다른 항원을 함유하는 다면성 제제를 가지고, 그리고 비활성화되고 약화된 미생물을 포함한다.

상업적 면역 방법에서 일반적으로 사용되는 다른 항원은 체액성 및 세포성으로서 동일한 결과, 그리고 면역원 수준으로서 위와 같은 제제에 포함되었다; 이러한 것들은 공지된 제제에서 비경구로 투여된 후에 얻어진 것과 유사하다. 위와 같은 형태의 점막제의 고유한 특징은 점막(mucosa)에서 강한 반응의 유발이고, 이러한 유발은 추가적인 이점이 된다. 다른 중요한 특징은 위와 같은 제제의 경제성이며, 이는 항원 그 자체가 비경구 보조제의 사용을 가능하도록 하면서 다른 공동으로 투여된 항원에 대한 반응의 증가에 유리할 수 있기 때문이다.

점막을 통하여 접종된 항원에 대한 강한 면역 반응의 발생은 백신 분야에서 현재의 중요한 연구 분야 중의 하나이다. 강한 국소 반응은 발견된 또는 점막 표면을 통하여 들어가는 병원체에 대한 보호와 관련된다는 것이 제시되었다(America Academy of Pediatrics. Cholera. Report of the Committee on Infectious Diseases. American Academy of Pediatrics, Elk Grove Village, 1991; IL, 170).

위장, 호흡기 및 비뇨 생식기 관(tracts)의 점막 표면은 적어도 400m²의 표면적을 가진다(McKenzie S J, Halsey J A. 1984; J, Immunol., 53:1818). 다른 한편으로, 큰 규모의 분화된 면역 시스템은 점막 표면을 보호한다. 건강한 성인 각각에 대하여 위와 같은 면역 시스템은 림프구(lymphocytes)의 적어도 80%를 가지고, 상기 림프구는 위와 같은 위치 또는 여러 점막-관련 림프 조직(lymphoid tissues)을 통하여 순환한다(Report of the Expert Panel VI: Concerted efforts in the field of mucosal immunology. 1996. Vaccine; 14:644).

점막 면역 시스템은 조직화된 점막-관련 림프 조직이라 불리는 국소적 유발체 장소(inductor sites)(O-MALT) 및 작동체 장소(effector sites)로 나누어진다(Kraehenbuhl J P and Neutra M N. 1992. Physiol. Rev.; 72:853). O-MALT와 관련된 대부분의 연구는 집합임파소절(Peyer's patches : PP), 맹장 및 직장에 풍부하게 존재하는 림프절(limphatic nodes)과 같은 위장 관련 림프 조직(GALT) 내에서 이루어졌다. 비록 GALT와 비강 관련 림프 조직(NALT) 사이의 차이가 고려되어야 하지만, PP는 위와 같은 조직의 기능에 대한 좋은 모델이 된다.

호흡계에서, 상피(epithelium)는 거짓증층원주상피(pseudostratified)로 되어 있거나 또는 간단한 형태로 되어있다. 간단한 상피 조직인 기관지 계통에서, 세포사이의 공간은 견고한 결합에 의하여 봉해지고 그리고 항원 흡수의 주요 구조(mechanism)는 M 세포를 통하여 이루어진다. 층으로 된 상피는 편도선(tonsil)에서 우세하고, 상기 편도선에서 항원 흡수의 구조는 뼈 골수로부터 발생하는 mm²당 약 700에 이르는 매크로파지의 망(net) 및 이동성 수상 돌기 세포와 밀접하게 관련된다. 위와 같은 세포들은 O-MALT 및 림프절로 이동할 수 있고, 편도선 표면에서 식세포 활동을 당하게되는 형성된 항원(processed antigen)을 나타내게 된다. 위와 같은 것들은 정상 조건에서 호흡계 내에서 MHC-II에 의한 항원 발현의 주요 구조가 된다(Neutra R M., Pringault E and Kraehenbuhl J P. 1996. Annu. Rev.Immunol. 14:275).

유발체 장소(inductor site)에서 항원을 형성하고 나타낸 후에, 자극된 B 및 T 림프구는 원심성 관을 통하여 유발체 장소를 벗어나게 되고 그리고 흉부관을 경유하여 혈관속으로 유입되어 작용체 장소(effector sites)(위와 같은 것들이 선택적으로 유지되는 선세포 조직(glandular tissue), 위장계 점막의 내부 점막(lamina propia), 호흡계 및 비뇨생식기 관)에 도달하게 된다. 위와 같은 작용체 장소에서, B 세포는 증식을 계속하여 내분비성 IgA 혈장 세포로 분화하고, 이후 외분비성 내에서 IgA 항체를 생산한다. 이미 기술된 세포 분포의 위와 같은 시스템은 공통 점막 면역 시스템이라고 명해진다(Walker R I. 1994. Vaccine.; 4:387)).

백신 항원의 점막 접종은 비경구성 경로에 의하여 투여된 백신과 관련하여 많은 이점을 제공하고, 안정성의 증가 및 부작용의 최소화는 위와 같은 이점의 예가 되고(Editorial. Typhoid vaccination: Weighing the options. 1992. Lancet: 340-341; Redhead K and Griffiths E. 1990. Curr. Opin. Infect. Dis. 3:380), 제한된 개인성(qualified personnel)이 감소될 수 있고 그리고 나이가 들고 그리고 새로 태어난 어린이에 대한 접종의 효과가 증가할 뿐만 아니라 접종 과정(logistic of vaccination)이 단순해진다. 인간의 전신 면역 시스템은 나이에 따라 약화되는 반면, 생쥐에 대한 연구는 나이에 따라 아무런 약화가 나타나지 않는다는 것을 보여주었다(Bergman K-C and Waldman R H. Rev. 1998. Infect. Dis. 10: 939; Szewczuk M R, Campbell R J and Jung L K. 1998. J. Immunol. 126: 2200). 새로 태어난 아이의 경우, 모체 항원의 지속성은 비경구적으로 투여된 백신을 방해하고,상기 결과는 접종 나이의 감소에 있어서 문제가 되어 왔다Szewczuk M R, Cambell R J and Jung L K. 1981. J. Immunol. 126:2200; Weiss R. 1992. Science. 258: 546).

점막 면역은 징후가 없이 점막 표면에 서식하는 병원균에 의하여 야기된 어떤 질병의 제거를 이용할 수 있다(Kraehenbuhl J P and Neutra M N. 1992. Physiol Rev. 72:853). 이는 체계적인 반응을 발생시킬 뿐만 아니라, 또한 비경구 경로를 통하여 접종이 없이 얻어질 수 없는 점막 반응을 발생시킨다는 사실로 인한 것이다.

위에서 언급한 이점에도 불구하고 점막 접종을 위하여 필요한 항원의 양은 비경구 면역을 위하여 필요한 양보다 더 높을 수 있고, 이는 아마도 다른 인자 가운데서 점막 림프 조직에 의한 손상되지 않은 항원의 흡수의 상대적인 비효율성, 산성 및 단백질 용해성 장벽(proteolitic barriers), 장의 연동(intestinal peristalitism)과 같은 여러 인자로 인한 것이다. 위와 같은 이유로 보조제(adjuvants) 또는 점막 사용을 위한 보조적인 방법을 개발할 필요가 있다(Faden H, et al. 1990. J. Infect. Dis. 162: 1291; Shahin RD, et al. 1990. Infect. Immun. 58: 4063; O'Hagan D T. 1990. Curr Opin Infect Dis. 3: 393).

새로운 백신 발생으로부터의 순수한 재조합 또는 합성 항원은 채취된 유기체로부터의 항원에 비하여 보다 안전하다. 그러나, 상기 항원은 보다 면역성이 약하다(Alving C R, 1992. ADID Research and Human Retroviruses. 8:1427). 이로 인하여, 새로운 보조제를 발견하는 것이 백신 분야에서 필요하다. 보조제는 점막을 통하여 또는 비경구적으로 접종된 항원에 대하여 특이적 면역 반응을 촉진시키거나, 확장하거나 또는 향상시키는 물질 또는 과정이다(Vogel FR. Adjuvants in perspective. In: Brown F, Haaheim LR, editors. Modulation of the inmune response to vaccine antigens. Dev. Biol. Stand. Basel. Karger; 1998;92:241-248). 보조제의 사용은 반응의 형태를 발생시키나 강력하게 만들고 그리고 접종의 회수 및 보호를 얻고 그리고 유지하기 위한 항원의 수 양쪽 모두를 감소시킨다.

점막 보조제는 점막 경로를 통하여 투여된 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 것들이다. 대부분의 연구된 점막 보조제 중에는 V. 콜레라의 장독소(enterotoxin of V. cholerae : CT) 및 열에 불안정한 E.coli(LT)의 독소(heatlabil toxin of E.coli : LT)가 있다. CT의 보조 활성은 ADP의 단백질 합성 저해(ribosilation)(adenosin biphosphate) 및 AMPc(cyclic adenosin monophosphate)의 유도와 관련되고, 상기 AMPc는 다양한 세포성 효과를 가진다(Lycke N, el al. 1991. Scand. J. Immunol. 33: 691). CT의 B(CTB) 서브 유닛은 비강으로 투여된 이종 조직 항원에 대한 상피 조직의 침투성을 증가시키는 능력을 가지지만, 그러나 경구적으로 투여된 항원에 대해서는 그러하지 않다(Lycke N, et al. 1991. Scand. J. Immunol. 33: 691; Gizurarson S, et al. 1991. Vaccine. 9: 825; Gizurarson S, et al. 1992. Vaccine. 10:101). CT는 쥐의 장 표피 밑에 있는 결합조직 내에서 장기간에 걸친 면역 기억을 유도한다(Vajdy M and Lycke NH. 1992. Immunology. 75: 488).

지금까지, CT의 보조제 및 독소 효과를 선택적으로 분리하는 것은 불가능하였다(Lycke N. et al. 1992. Eur. J. Immnuol.; 22; 2277). 그러나, 변성제로서 그루타르알데히드(glutaraldehyde)를 사용하여 돌연변이 형태가 생성되었고, 좋은 보조적인 성질을 유지하지만 독성은 약 1000배정도 약하게 나타났다(Liang X, et al. 1989. J Immunol; 143:484).

몇몇 비경구적으로 사용된 보조제는 또한 면역 자극 복합제(ISCOMs), 리포솜, 리소포페티딜 글리세롤(lysophophatidyl glycerol), 아브리딘(Avridine)(유지질성 아민(lipoidal amine)) 및 시토킨과 같은 점막 경로를 통하여 평가되었다(Ruby J, et al. 1992. Vaccine. Res. 1:347; O'Hagan DT, et al. 1992. J Gen Virol; 73: 2141).

면역 자극 복합제는 비강으로 투여되는 경우에는 효과적인 것으로 증명되었다. 상기 복합제는 상대적으로 안정된 입자로서 크기가 30 내지 40 nm가 되고, 가장 널리 사용되는 제제는 키일 A(Quil A)(키라야 사포닌(Quillaja saponaria)으로부터 추출된 사포닌의 혼합물), 콜레스테롤 및 인지질을 분자량 비율로서 1 : 1 : 1로 함유하고 있다(Tomasi M, et al. 1996. Mucosal vaccines. 13: 175-186). ISCOMs은 주조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II의 발현을 조절하고 그리고 방출 인터페론 감마(IFN-γ)를 자극하는 것에 의하여 활동할 수 있다(Byars N E and Allison A C. Immunologic Adjuvants: General Properties, Advantages, and limitations, in Laboratory Method in Immunology, Zola, H., Ed., 39, 1990). ISCOMs는 MHC 클래스 I에게 제한된 CD8+ T 세포를 자극할 있다는 사실이 밝혀졌다(Bomford RHR. The differential adjuvant activity of Al(OH)₃and saponin, in Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific resistance, Madje, J., Ed., Alan R. Liss, New York, 65, 1987). ISCOMs의 이점에도 불구하고, 비용, 안정성 및 세포막 내에 삽입되는 항원의 성질과 관련하여, ICOMs는 면역 강화 방법으로는 문제를 지닌 것으로 계속 인식이 되어왔다.

항원 전달 시스템인 리포솜은 회전 타원체형 소수포(spheroide vesicles)의 수용성 서스펜션이고, 리포솜이 포함하는 인지질은 지질의 이중층으로 조직된다. 항원은 친수성 또는 소수성인가에 따라 각각 소수포(vesicles) 또는 그들의 표면 중의 어느 하나로 전달된다(Childers N K, Michalek S M. Liposomes, in: D. T. Hagan(Ed.), Novel Delivery Systems for Oral Vaccines, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1994). 리포솜의 보조성(adjuvanticity)은 층 수(Susuki M, et al. 1994, Clin INmunother. 2:121-125), 전하(Hadden JW. 1993. Immunology Today. 14: 274), 성분(McAnalley BH, et al. inventors Carrigton Laboratories Inc, assignee. Use of acemannan. US patent 229164. 1998 Aug 5; Giles CH, et al. J. Soc. Dyers Colour 1958; 74: 647) 및 생산 방법(Giles CH, et al. J. Soc. Dyers Colour 1958; 74:647, Walkers GJ, 1978. Biochem. Carbohydr. 16:75-126)에 의존한다. 리포솜의 사용은 단백질 및 폴리사카라이드 성의 항원에 대한 체액 또는 세포 매개 면역성 양쪽 모두를 향상시킨다(Hadden JW 1993. Immunology Today. 14:274; Walkers GJ, 1978. Biochem. Carbohydr. 16:75-126, Han YW. 1990. Adv. Appl. Microbial. 35:171-174; Cote G L뭉 Ahegren J A. Metabolism in microorgani는 Pert I. Levan and levansucrase. Science and technology of fructans. 1993. pp. 141-168. Edited by M. Susuki & N. J Charton. Boca Raton, FL:CRC Press). 다른 한편으로, 리포솜 내부로 항원의 경구 투여는 단지 위와 같은 경로만을 통하여 항원을 투여하는 것에 의하여 얻어진 반응에 비하여 보다 높은 점막 반응을 나타낸다(Janeway CA. 1992. Immunol Today. 5: 3; Paolo C, et al. 1999. Vaccine. 17: 12 -1263). 리포솜이 가진 큰 약점은 장 리파아제(intestinal lipases) 및 담즙 염(bile salts)에 의하여 파괴가 된다는 점이다(Okada J, et al. 1995. Pharm. Res. 12 : 576-582).

마이크로캡슐화된 항원은 또한 그것의 백신 효능으로 인하여 탁월하다. 마이크로 캡슐은 덮개와 코어를 가진 구형이 된다. 상기 커버는 생체 분해성인가 아닌가에 따라 하나 또는 그 이상의 폴리머로 구성되는 반면, 상기 코어는 항원으로 이루어진다. 만약 폴리머가 생체 분해성이 아니라면, 이때 마이크로 캡슐은 항원이 천천히 빠져나가는 구멍들(pores)을 가진 저장소로서 역할을 한다. 만약 폴리머가 생체 분해성이라면, 항원은 마이크로캡슐의 분해를 통하여 방출된다. 폴리머가 생체 분해성인 경우가 흔한 경우이며 그리고 이 경우의 실시 예는 락 산(lactic acid) 및 글리콜 산(glycolic acid)의 코-폴리머를 이용하여 갭슐화된 마이크로스피어로서 자주 사용된다. 마이크로스피어는 비강을 통하여(Eyles JE, et al. 1999. Int J Pharm. 189(1):75-9), 경구 및 비경구(Gupta R K, et al. 1997.Vaccine; 15(16):1716-1723)로서 사용된다.

바이러스-유사 입자(VLP)가 또한 점막 면역의 방법을 위한 항원 전달 시스템을 위하여 사용된다. VLP는 바이러스성 캡시드 및 외피 또는 다른 단백질로 이루어지고, 상기 물질들은 초분자 구조 내에서 합성되는 경우 바이러스와 비슷하게 된다. VLP는 간단한 생산 및 정제라는 이점을 가지고, 그리고 미립자로 된 항원으로서 점막 유도 반응의 유도를 위하여 수용성 항원보다 더 좋다(Andre' EF. 1990. Vaccine; 8(S74)). 인두유종 바이러스 입자(HPV VLP)의 비강 투여는 체액 및 세포성 반응을 발생시키는데 있어 좋은 결과를 나타내었다(Dupuy C, et al. 1999. Journal of virology; 73:11:9063-9071; Liu XS, et al. 1999. Virology. 252:39-45, Balmelli C, et al. 1998. J of Virol. 72:8220-8229).

비록 여러 가지의 점막 면역 반응의 유도체 장소가 존재하지만, 가장 편리한 장소는 NALT가 된다.

살아있는 인플루엔자 백신을 이용한 비강 경로를 통한 투여는 어린이와 성인에 대하여 좋은 결과를 가져온다. 위와 같은 경로는 경구적으로 투여되는 경우 위장 상태에 대하여

민감한 다른 백신을 위하여 유용할 수 있다(Walker R I. 1994. Vaccine. 4:387).

1997년에 사람에 대한 첫 번째 연구는 재조합 콜레라 독소 B 서브 유닛(rCTB)을 이용한 비강 경로를 통한 접종은 질분비물 내에서 특이적 IgA 및 IgG를 유도한다는 것을 보여주었다(Bergquist, Ch. 1997. Infection and Immunity. 65, 2676). 더욱이, 위와 같은 경로를 통한 동물 면역은 질내 경로(intravaginalroute)를 통한 면역보다 한층 더 높은 질분비물(vaginal secretions) IgA 반응을 발생시켰다(Di Tommaso A. 1996. Infect. Immun.64: 974; Gallichan W S and 깬두소미 K L. 1995. Vaccine. 5:1589; Hopkins S, 1995. Infect. Immun. 63:3279).

본 발명에서 사용된 모든 항원은 다른 것들 중에서 백신 목적을 위하여 광범위하게 조사되었고, 심지어 이들 중 많은 것은 비강 경로에 의하여 투여된다는 공통점을 가진다. 그러나 많은 연구들이 보고된 것처럼 나타나지만, 위와 같은 것들은 주로 비경구적 투여로서 사용되었고 그리고 이들은 결코 HBsAg를 이용하여 비강을 통하여 사용되지 않았다.

생쥐 내에 대한 비강으로 투여되는 재조합 콜레라 독소 B 서브 유닛(10 ㎍)과 함께 간염 B 표면 항원(HBsAg)의 비강 투여(1 내지 5 ㎍)는 HBsAg에 대하여 체계적인 면역 반응을 유발시킬 뿐만 아니라, 또한 점막 반응이 마찬가지로 비강(nasal cavities), 폐, 소장 및 질(vagina) 내에서 발견된다. 바이러스성 항원에 대하여 특이적인 혈청 IgG1, IgG2a 및 IgG2b의 높은 수준은 위와 같은 조합에 이용하여 얻어진다. 상업적 세트를 사용하여 EIA 샌드위치에 의하여 측정된 혈청 적정 농도는 1000 mIU/ml 보다 더 높은 것으로 나타났다(Isaka M. et al. 2001. Vaccine. 19(11-12):1460-1466).

HBsAg 및 CPG 모티프(CpG ODN)를 가진 올리고데옥시뉴클레오티드를 가진 BALB/c 생쥐의 코 면역은 HBsAg를 가진 CT 또는 LT에 의하여 생산된 것과 동일한 양의 바이러스성 항원에 대한 항체 면역 반응을 생산하고, 그리고 HBsAg를 가진 CTB 또는 LTK63(LT의 돌연변이)의 조합의 반응보다 더 높은 반응을 생산한다. 더욱이, CpG ODN, CT(또는 LT) 및 HBsAg의 비강 경로를 통한 동시적인 사용은 위와 같은 후자의 경우에 대한 항원에 대한 면역 반응에 대하여 상승적인 효과를 만들지만, 독소 대신에 CTB 또는 LTK63이 이용되지 않는 경우이다(McCluskie MJ, et al. 2000. Mol Med Oct; 6(10):867-877). CpG ODN 및 HBsAg의 투여 후에 현저한 이소형태(isotypes)는 IgG1/IgG2a가 되는 한편, CT의 추가적인 투여는 주로 IgG2a가 생산되었다(McCluskie MJ, et al. 1998. J Immunol. Nov 1; 161(9): 4463-4466).

비강 경로에 의하여 HBsAg와 함께 아세마난(식물 알로에 바바덴시스 밀러(Aloe barbadensis Miller)로부터 추출된 만노스의 아세틸레드 폴리머)의 투여는 질분비물 내 IgA 반응뿐만 아니라 명반에 의하여 보조된 항원의 투여를 이용하여 얻어진 반응과 유사한 혈청 IgG 항체 반응을 발생시키고, 콜레라 독소로 보조된 HBsAg의 비강 적용에 의하여 얻어진 반응에 비견된다(Aguilar JC et al. 1998. WO 9839032).

HBsAg 위에서 간염 B 바이러스 코어 항원(HBcAg)에 의하여 미치는 강한 보조 효과가 또한 확인되었고, 상기 경우 두 개의 물질은 비강 경로를 통하여 접종된다. 위와 같은 효과는 동일한 조건 아래에서 CT에 의한 효과의 크기와 유사하고, 그리고 심지어 혈청 IgG 항체 반응의 유도에서 명반(alum)(근육내로 투여된다)에 의하여 나타난 효과에 비하여 더욱 높다는 것이 증명되었다(Aguilar JC, et al. PCT/CU/99/00006). 위와 같은 참조 발명은 본 발명인의 동료들에 의한 것으로서 점막으로 투여되는 경우 서로 다른 VLP 사이에 교차 면역 향상(cross immunoenhancement)에 있어서 증진된 효과의 발생을 보여주었다. HPV, HCV 및 HBV각각의 VLP 조합은 위와 같은 연구에서 사용되었고, HBsAg가 포함되는 VLP의 임의의 가능한 조합에 도달하였다. 이와 같은 방식으로, 강력한 교차 활성 향상이 이미 서로 다른 VLP(HBsAg는 일종의 VLP가 된다)사이에서 증명되었다. 다른 비-VLP 항원이 HBsAg와의 상호 작용으로 인하여 임의의 향상체 효과(enhancer effect)를 받는지 여부는 명백하지 않다. VLP와는 다른 항원을 이용한 HBsAg의 가능한 공식은 기술되지 않았다(Aguilar JC, et al. PCT/CU/00006).

디프테리아 독소(DT)는 현재 백신 관련 문헌에서 중요한 부분을 차지하고, 기본적으로 비경구적 경로에 의하여 투여된다. 비강 경로(nasal route)에 의하여 사용된 몇 개의 논문이 있다. CRM₁₉₇을 가진 비강 효능 촉진제가 수반되는 명반 내 디프테리아 독소를 이용한 비경구 투여의 우세성은 생쥐에 있어서 매우 효과적인 면역 방법으로서 높은 수준의 항-DT IgG를 유도할 수 있으며, 그리고 호흡계 내에서 혈청 및 분비성 IgA 내에서 항체를 중화시킨다(McNeela EA, et al. 2000. Vaccine. Dec 8; 19(9-10):1188-98).

DT와 함께 E.coli의 재조합 열 불안정 엔터로톡신 B 서브유닛(rLTB)이 생쥐에게 비강을 통하여 투여되는 경우, 상기 물질은 비강 및 폐에서 혈청 DT-특이적 IgA의 현저한 자극 및 점막 DT-특이적 IgA의 완화된 유도를 발생시킨다(Kozuka S, et al. 2000. Vaccine. Mar 6; 18(17): 1730-7).

재조합 클레라 독소 B 서브 유닛(CTB)과 함께 DT의 5Lf의 비강 면역 방법은 모든 생쥐 내에서 높은 혈청 DT-특이적 IgG 항체 반응 또는 완화된 특이적 IgA 반응을 그리고 몇몇 생쥐에 대해서는 단지 약간의 IgE 항체 반응을 유도하였다. 게다가, 높은 수준의 혈청 DT-특이적 IgG 항체 반응을 보여주는 생쥐에 대해서는, 0.1 IU/ml 보다 더 큰 충분히 높은 적정 농도의 디프테리아 항독소가 존재하였다. 동일한 실험 조건 아래에서, 현저한 점막 DT-특이적 IgA 항체 반응의 유도가 비강, 폐, 타액, 질 분비물 및 모든 생쥐의 소장 내에서 발생했다(Isaka M, et al. 1999. Vaccine. Nov 12; 18(7-8):743-51).

DT와 함께 생쥐에게 비경구적으로 또는 비강을 통하여 투여되는 모노 올레핀/올레릭 산 소수포(vesicles)를 함유하는 새로운 서스펜션의 사용이 프로인트의 완전한 보조제(Freun's complete adjuvant) 내에 흡수되거나 또는 투여된 명반과 동일한 수준으로 독소 면역성을 증가시키는 것으로 보고되었다(Schroder U, et al. 1998 Vaccine. Apr 9; 17(15-16):2096-103).

DT와 같은 파상풍 독소는 또한 현행 백신 관련 문헌의 중요한 부분을 차지하고, 주로 비경구 면역 방법으로 이루어진다.

비강을 통하여 투여되는 파상풍 독소(TT)와 함께 인터류킨 6 및 12(IL-6, IL-12)를 사용한 점막 IgA 항체 반응의 유도를 측정할 목적으로, TT를 가진 IL-6의 생쥐에 대한 동시 투여는 대조 생쥐에 비하여 보다 높은 혈청 TT-특이적 IgG 항체 반응(주로 IgG1 및 IgG2b)을 유도하지만, 그러나 낮은 분비성 IgA 항체 반응 및 IgE에 대해서는 전혀 항체 반응을 하지 않는다는 것을 보여주는 연구가 실시되었다. 이와 대조적으로, TT와 함께 비강으로 투여된 IL-12는 혈청 IgG의 급격한 증가를 유도할 뿐만 아니라, 또한 점막에서 IgA 항체 반응을 향상시킨다. IL-6, IL-12 및 TT의 동시 투여는 IL-12 및 TT의 조합에 의하여 발생된 반응과 비교할 때 혈청 또는 점막 항체 반응을 증가시키지 않았다(Boyaka PN, et al. 1999. J Immunol. Jan 1;162(1);122-8).

TT 및 CT 보조제를 이용하여 비강을 통하여 면역이 되었던 생쥐에 대한 IL-12의 비강 투여는 TT-특이적 IgG2a 및 IgG3 항체 수준의 증가를 초래하는 반면, IgG1 및 IgE 항체 반응은 현저하게 감소한다. 이에 비하여, TT 및 CT의 혼합물이 경구적으로 투여되면 생쥐에 대하여 비강 투여 IL-12는 CT-유도 혈청 IgG1 및 IgE 항체 반응을 향상시킨다(Marinaro M.et al. 1999. J Immunol. Jan 1; 162(1):114-21).

TT 제제를 이용한 비강 면역 실험에서 명반 내에서 흡수되고 그리고 rCTB로 혼합된 TT를 이용한 생쥐의 체계적인 점막 반응이 시험되었다. 흡수되지 않는 TT의 비강 투여의 경우 5Lf가 단지 rCTB(10㎍)의 존재하는 상태에서 자극을 위하여 필요하였고, 높은 혈청 TT-특이적 IgG가 모든 생쥐에 대하여 실험되고, 그리고 중간 정도의 또는 약한 TT-특이적 IgA 항체반응이 약간의 생쥐의 비강, 폐 및 장 세척(intestinal lavages)에 대하여 시험되었으며, 비근(nasal root)을 통한 면역은 낮아진다는 것을 보여주었다. 그럼에도 불구하고, 면역이 이루어진 후에는 파상풍 독소의 공격에 대하여 저항성을 가질 것이다(Isaka M, et al. 1998 Vaccine. Oct; 16(17):1620-6).

TT는 또한 비독성 돌연변이 CT:CTS61 F와 같은 새로운 보조제를 시험하기 위한 모델로서 사용되었다. 상기 시험은 분리시켜(그들 중 TT) 여러 항원을 가진 위와 같은 단백질의 비강 투여 및 천연 CT 및 rCTB를 이용하여 유사한 프로토콜을 따라 얻어진 것에 의하여 발생된 면역 반응에 대한 연구이다. 점막 분비선 내에서 IgA 항체 반응뿐만 아니라 혈청 TT-특이적 IgG, IgA 및 IgM 반응이 천연 CT를 함유하는 제제 및 돌연변이 CT를 함유하는 제제 양쪽에 대하여 현저하게 증가했다; rCTB는 좋은 보조 활성을 보여주지 않았다(Yamamoto S. et al. 1997. Proc Natl Acad Sci U S A. May 13; 94(10):5267-72).

폴리(L-락산) 마이크로스피어 내에 흡수된 파상풍 독소의 기니-돼지(guinea-pigs)에 대한 비강 투여는 유리 항원(free antigen)을 이용하여 얻어진 것과 관련하여 면역 반응을 향상시켰다; 유리 항원을 이용한 경우 면역되지 않은 동물 내에서 발견된 것과 유사하였다(Almeida AJ, et al. 1993. J Pham Pharmacol. Mar;45(3):198-203).

면역 반응의 결정, 특히 점막 보조 CT의 비강 투여와 관련된 면역 병리 반응의 결정이 연구의 목적이 되었고, 상기 연구에서 TT 및 CT가 결합되고 그리고 BALB/c 생쥐에게 투여되었다. 비강 면역 후, 생쥐는 TT 및 CT 양쪽에 대하여 혈청 내에서 주로 IgG 이소타입, 특히 IgG1 서브 클래스가 우세한 항체 반응을 생산하였다. 항체 반응과 함께, 잠재적으로 치명적이 될 수 있는 염증 반응을 발생시켰다. 더욱이, 유도된 IgE 반응이 존재하고, 상기 반응은 혈청 내에서 인터류킨 5(IL-5) 탐지와 관련된다. 이와 같은 방식으로 CT가 더해진 TT를 이용한 비강 면역은 Th2 세포의 활성을 초래하는 것으로 추측된다는 것이 제안되었고, 상기 Th2 세포의 활성은 폐에서 심각한 면역 병리학에 기여를 할 수 있을 것이다(Simecka JW, et al.2000. Infect Immun. Feb; 68(2): 672-9).

위와 같은 사실은 자원의 절약을 만드는 면역 방법의 합리적인 설계의 중요성을 부각시키고, 예를 들어 서로 다른 경로의 면역 및 효율을 연구하기 위한 모델로서 사용되는 독성 보조제의 대체하지만, 그러나 인간에게는 적용될 수 없는 방법을 위한 연구와 같은 것들의 중요성을 부각시킨다.

인간 백신 내에서 널리 사용되는 또 다른 항원은 포말데하이데-비활성 백일해(formaldehyde-inactivated Bordetella pertussis: Bp)가 된다. BALB/c 생쥐에게 투여된 위와 같은 백신은 혈청 및 브론코알베올라르 액(broncoalveolar fluids) 내에서 IgA, 타액 및 배설물뿐만 아니라 혈청 및 브론코아베올라르(bronchoalveolar) 액 내에서 높은 수준의 IgG 항체를 유도한다. 그러나, 상기 물질이 CT와 함께 투여되는 경우에는, 항-Bp IgG 반응은 향상되지 않는 반면 IgA 반응은 분석된 모든 분비물 내에서 현저하게 감소한다(Berstad AK, et al. 1997. Vaccine. Aug-Sep; 15(12-13):1473-8).

Bp의 비강 면역성 및 보조 능력을 시험하기 위한 하나의 연구가 생쥐에 대하여 실시되었고 , 생쥐에 대하여 Bp 항원이 비활성 인플루엔자 바이러스와 함께 비강을 통하여 투여되었다. 상기 바이러스는 단독으로 낮은 수준의 인플루엔자-특이적 혈청 IgG 항체를 유도하였고, 상기 수준은 면역되지 않은 비-면역 대조군에 비하여 현저하게 높았던 반면, 혈청- 및 타액- IgA 반응 사이에는 아무런 차이를 나타내지 않았다. 이와 대조적으로, Bp가 비활성 인플루엔자 바이러스와 함께 투여되었을 때, 혈청 바이러스-특이적 IgA 및 IgG 및 타액성 IgA 반응은 실질적으로 향상되었다(P<0.005). 그러나, 이러한 보조제 효과는 창자(gut) 내(배설물 내에서 항체로서 측정된)에서 동일한 형태의 반응을 위해서는 현저하지 않다. 다른 한편으로, Bp에 대한 항체 반응이 바이러스 백신과 혼합하는 것에 의하여 금지되었다.

Bp에 대항하여 발생된 타액 항체는 뇌 수막염균(Neisseria meningitidis)과 교차 반응을 보여주었다(Berstad AK et al. 200. Vacciine. Mar 17; 18(18):1910-9). 항원 결합으로부터 출발하여 보다 높은 반응이 결합 내에서 존재하는 모든 항원을 위하여 유도되었다는 것이 명백하지 않다는 것을 보여주었기 때문에 위와 같은 사실은 중요하다. Bp는 또한 인간에 대하여 시험되었다. 6명의 성인에 대하여 일주일 간격으로 비강 투여를 통하여 네 번 세포성 백일해 백신(cellular pertussis vaccines)을 투여하였다. 모든 백신 접종자들(vaccinees)이 BP 전-세포(whole-cell) 항원에 대하여 비강 유동 IgA 항원에 있어서 증가되는 것으로 반응하였다. 높은 비강 항체 반응을 가진 세 명의 접종자는 또한 Bp에 대하여 증가된 혈청 IgA 및 IgG 항체 적정 농도(titers)를 발병시켰다. 혈청 및 분비물 내의 항체는 백일해 독소(PT)에 대하여 반응할 뿐만 아니라 타액 항체는 전-세포 항원에 대하여 반응하고 그리고 작대기형 혈구응집소(filamentous haemagglutinin : FHA)는 FHA에 대한 비강 유체 항체 내에서의 중간 정도의 증가를 제외하고는 무시되었다. 예상과는 달리, 동일한 백신 접종자에 대하여 수막염 외부 멤버레인 항원에 대한 비강 및 타액 항체에 대해서는 현저한 증가가 존재한 반면, 대응되는 혈청 IgA 및 IgG 항체는 변화되지 않았다(Berstad AK, et al. 2000, J Med Microbiol. Feb;49(2):157-63). 위와 같은 것은 상기 항원에 대한 비강 제제가 면역 연구에 있어서 각각의 단백질에 대한 반응을 고려해야 하는 이유가 된다.

비록 혈청 박테리아성 항체의 존재는 수막염 질병에 대한 면역과 연관되지만, 통과하는 지점(port of entry)에서의 점막 면역이 또한 중요한 역할을 한다. 이것이 생쥐에게 주어진 비강 백신 제제에 있어서 뇌수막염균 B 외부-멤브레인 복합체(OMPC)의 면역성을 평가하기 위한 연구가 수행되어야 하는 이유가 된다. 위와 같은 연구에서 페에서 강한 국소적 IgA 반응뿐만 아니라 강한 전신(systemic) 박테리아성 항체 반응이 명백히 드러났다. 그러나, 8-부터 10 배 보다 높은 OMPC의 복용이 혈청 내 동일한 박테리아성 항체 반응을 유도하기 위한 복막 내 면역과 비교하여 비강 면역을 위하여 요구된다(Aaunders NB, et al. 1999. Infect Immun Jan; 67(1):113-9).

보조제 없이 비강 투여 후에 인간 내에서 T-세포 반응을 유도하기 위한 수막염 외부 멤브레인 소수포(meningococcal outer membrane vesicle) 백신의 능력이 확인되었다. 위와 같은 것을 이루기 위하여, 12명으로 이루어진 그룹의 각각이 일주일 간격으로 4번의 OMPC(250 ㎍ : protein/dose)을 이용하여 면역되었고, 그리고 5개월 후에 효능 촉진제(a booster)가 투여되었다. OMPC 백신, 정제된 ProA(클래스 I) 단백질, ProB(클래스 3) 단백질 및 하나의 혈연 관계가 없는(unrelated) 대조 항원(Mycobacterium bovis BCG)에 대한 반응에 있어서 T-세포 증식이 면역 전 및 후에 얻어진 말초 혈액 단일핵 세포 내로의 [3H]디미틴 결합에 의하여 측정되었다. OMPC(12명 중의 7명) 및 PorA 항원(12명 중 11명)에 대하여 시험된 경우 OMPC를 이용한 비강 접종이 대부분의 백신 접종자에 대하여 항원-특이적 T-세포 반응을 유도했다(Oftung F, et al. 1999. Infect Immun. Feb;67(2):927-7).

일주일 간격으로 네 번에 걸쳐 점비약(nose drop) 또는 코 흡입기 형태로 투여된 OMPC는 비강 및 타액 IgA 반응의 발병에 이르게 된다는 것이 인간에 대하여 제시되었다. 더욱이, 혈청 IgG 항체의 완만한 증가가 여러 명의 면역된 개인들에 대하여 관찰되었다(Haneberg B, et al. 1998. Infect Immun Apr;66(4):1334-41).

다른 한편으로, 생쥐에 있어서 점막 경로(비강 및 직장)를 통한 CT의 추가적인 사용은 동일한 경로를 통하여 투여된 OMPC 백신과 비교할 때 혈청 항체 반응을 향상시킨다. 그러나, 가장 효과적인 면역은 비강 투여가 되었고 이로 인하여 점막 반응은 CT의 사용에 의존하지 않는다는 점이 제외되었다. 뿐만 아니라, 혈청 박테리아성 활성은 CT에 의하여 유사하게 증가하지 않고, 이는 혈청 IgG 수준에 대한 긍정적인 효과는 박테리아 활성을 포함하지 않는다는 것을 나타낸다(Dalseg R, et al. 1999. Vaccine, May 14;17(19):2336-45).

생쥐에 대한 비강 투여에 의하여 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis)의 리포폴리사카리드(LPS)를 이용한 복합체 내에서의 OMPC의 사용은 두 번의 접종 후 폐 및 비장 내에서의 IgG 및 IgA 항체 분비 세포뿐만 아니라 폐 점막 내에서 높은 수준의 항-LPS IgG 및 IgA을 발생시킨다는 것이 발견되었다. 다른 한편으로, 높은 수준의 혈청 IgG 및 중간 수준의 IgA가 또한 혈청 내에서 발견되었다. 얻어진 뛰어난 IgG1 서브클래스 반응으로 인하여 OMPC는 LPS에 대한 Th2-유사 반응에게 유리할 수 있다는 것이 제안되었다(Van De Verg LL, et al. 1996. Infect Immun Dec; 64(12):5263-8).

서로 다른 병원체로부터 유도된 여러 가지 항원을 포함하는 백신을 가질 가능성이 세계 보건 기구에 의하여 후원된 확장 면역 프로그램(Expanded Immunization Program)의 개발에서 기본적인 사항이 되어왔고, 그리고 간염 B 백신을 포함하기 위한 시도가 제안된다(Chiu HH, et al. 1998. Pediatr Infect Dis J Mar; 17(3):206-11).

만약 HBsAg 백신(10㎍)을 이용하여 출생시 면역된다면, 생후 1.5, 3.5 및 6개월인 건강한 어린이에 대한 HBsAg, DT, TT 및 Bp(5 내지 10 ㎍의 HBsAg)를 포함하는 백신의 투여는 보호적인 혈청 항-HBsAG 항원 적정 농도(10mlU/ml보다 더 많은)를 생산한다(Chiu HH, et al. 1998. Pediatr Infect Dis J Mar; 17(3):206-11).

HBsAg, DT,TT 및 Bp 항원에 대한 항체 반응은 파상풍 독소(PRP-TT), HBsAg, DT, TT 및 Bp 항원에게 결합된 캡슐형 헤모필루스 인플루엔자-형태 b 폴리사카리드(PRP)를 포함하는 백신의 유아에 대하여 비경구적으로 투여되거나 또는 HBsAg, DT, TT 및 Bp 항원을 가진 하나와 단지 PRP-TT를 가진 다른 하나의 두 개의 백신이 동일 경로를 통하여 투여되는 것에 의하여 영향을 받지 않는다. 처음 네 개의 항원에 대한 항체 반응은 재구성되어 감압 동결 건조된 PRP-TT에 대하여 사용된 HBsAg, DT, TT를 포함하는 백신의 혼합물로부터 얻어진 제제의 적용에 의하여 영향을 받지 않는다. 다른 한편으로, 항-PRP 항체 반응은 후자의 경우 현저하게 감소된다(Greenberg DP, et al. 2000. Pediatr Infect Dis J. Dec;19(12):1135-40).

단지 HBsAg 및 PRP(PRP의 경우 N.meningitidis의 OMPC에 결합된)만을 포함하는 제제를 이용하여 상기 항원에 대하여 이미 노출된 적이 있는 건장한 성인에 대한 접종은 상기 항원들에 대한 혈청 항체 수준을 증가시킨다(Bulkow LR, et al. 1993. Arctic Med Res Jul; 52(3): 118-26).

HBsAg, DT, TT, Bp 항원 및 비활성화된 폴리오 바이러스(polio virus)를 포함하는 백신에 대한 PRP의 추가는 두 번째 항원의 면역성의 감소 또는 인간에 대하여 허용 한계 수준의 반응성(reactogenicity)의 증가 중 어떤 것도 발생시키지 않는다. 다른 한편으로, 새로운 제제를 이용하여 생산된 항-PRP 항체 적정 농도는 PRP-특유한 백신(PRP-monovalent vaccines) 또는 유럽 몇 개국에서 허여된 DT, TT 및 Bp 항원과의 PRP의 결합을 이용하여 얻어진 항체 적정 농도(titer)와 유사하다(Schmitt HJ, et al. 2000. J Pediatr Sep; 137(3):304-12).

현재, HBsAg 및 DT, TT, OMPC, Bp, Hib 또는 다른 가용성 항원의 비강 투여와 관련되거나 또는 HBsAg의 향상된 효과를 명백하게 증명하는 바이러스성 또는 박테리아성 비활성으로부터 발생하는 항원적 결합의 연구에 대한 참조 문헌은 존재하지 않는다. 여러 가지 투여 방법 중 한 번에 보다 많은 항원이 각각 하나씩 분리되지 않은 형태로 존재한다는 것은 고려하면 비강 경로를 통하여 결합된 백신의 투여의 이점은 투여의 수를 감소시킬 가능성이 있다는 점이다; 또한, 그 자신에게 부정적으로 현저하게 영향을 미치지 않고 다른 것들의 면역성을 증가시키는 몇몇 항원의 성질에 기초하여 보조제를 포함하지 않을 가능성이 존재하고, 특별한 개인성 및 의학적 물질이 없이도 보조제를 포함하지 않을 수 있고, 상기 개인성 및 의학적 물질은 백신 적용을 복잡하게 만들고 그리고 보다 값비싼 것이 되도록 한다; 침입 방법(invasive method)이 사용되지 않는다는 사실은 면역되는 개인의 생명의 질을증가시키고, 주로 어린이들이 이에 해당된다; 그리고 많은 병원체의 주요 유입 입구(main port of entry of many pathogens)가 되는 점막 수준의 반응을 유발시키기 때문에, 심지어 어린이 또는 노약자와 같은 위험한 나이에 있는 사람에 대해서도 비경구 백신을 통하여 얻어지는 보호에 비하여 동일하거나 더 좋은 보호를 얻을 수 있다.

본 발명은 백신 개발 분야와 관련되고, 특별히 면역 향상제(immunoenhancers) 및 그들의 사용으로부터 만들어지는 백신 제제(vaccine formulations)와 관련된다.

본 발명의 기술적 목적은 비강 제제(nasal formulations)로서 투여되어 항원에 대항하는 면역 반응을 유리하게 만드는 것이고 그리고 위와 같은 경로에 의한 백신 사용을 위한 새로운 제제를 개발하는 것이다.

본 발명은 또한 비강 투여를 위한 다면성(multivalent) 백신 제제를 제조하는 것과 관련되고, 그리고 본 발명은 본 발명에서 발현된 제제 내에서 공동-투여된 항원의 면역원(immunogenicity)을 향상시킬 수 있는 주요 항원으로서 간염 B 바이러스 표면 항원을 가진다.

도 1은 한 가지 실험에서의 IgG 반응의 동역학(kinetics)을 도시한 것으로서 0, 14, 28, 87 째 날에 접종이 행해지고, 출혈(bleedings)은 10, 21, 35, 42, 84 및 97일에 행해졌다.

(A)는 HBsAg에 대한 혈청 IgG 반응의 동역학; (B)은 TT에 대한 혈청 IgG 반응의 동역학; (C)는 TD에 대한 혈청 IgG의 동역학 및 (D)는 Bp에 대한 혈청 IgG의 동역학을 각각 도시한 것이다. 표 1A, B, C 및 D: 해당하는 도면의 그룹 사이에 비교의 통계적인 분석의 결과를 도시한 것이다.

도 2는 97일째 질(vaginal) IgA 반응을 도시한 것이다. (A)는 HBsAg에 대한 반응; (B)는 TT에 대한 IgA 반응; (C)는 DT에 대한 IgA 반응 그리고 (D)는 전체-세포(whole-cell) Bp에 대한 IgA 반응을 각각 도시한 것이다. 표 2A, B, C 및 D: 통계적 분석을 도시한 것이다.

도 3은 97일째 페 IgA 반응을 도시한 것이다. (A)는 HBsAg에 대한 IgA 반응; (B)는 TT에 대한 IgA 반응; (C)는 DT에 대한 IgA 반응 그리고 (D)는 전체 세포 Bp에 대한 IgA 반응을 각각 도시한 것이다. 표 3A, B, C 그리고 D: 통계적 분석을 도시한 것이다.

도 4는 복막 내 또는 비강 경로에 의하여 4가(tetravalent) 제제의 투여 후에, 각각의 Bp 단백질에 대한 혈청 IgG 반응에 대한 평가를 도시한 것이다. (A)는 세 번째의 접종 후 그리고 (B)는 네 번째의 접종 후, 비강 또는 복막 내 4가 제제(tetravalent formulations)(각각 그룹 7 및 13)를 이용하여 발생된 광학 밀도 레벨을 나타낸다.

도 5는 실시 예 1의 비강 4가 제제에서 발견된 항원에 대한 증식 활동의 평가를 도시한 것으로서, 개별적으로 그리고 4가 제제의 범위 내에서 투여되었다.

도 6은 뇌 수막염균 OMPC 상에서 HBsAg의 활성을 향상시키는 것을 도시한 것이다. 양쪽 항원의 결합은 항-OMPC 반응을 현저하게 향상시켰다.

본 발명은 비강 면역에서 면역 향상제로서 간염 B 바이러스 표면 항원의 사용과 관련되고, 위와 같은 항원과 그리고 위와 같은 성질 및 간염 B 바이러스 표면 항원의 위와 같은 성질 및 백신 분야에서 제제의 사용으로부터 이익을 가지는 다른 백신의 결합으로부터 발생하는 백신 제제를 이용한다.

본 발명은 또한 다면적 가치를 가지는 제제와 관련되고, 특히 HBsAg의 위와 같은 성질의 적용으로부터 발생하는 비강 투여를 위한 제제와 관련되고, 상기 비강 투여는 제제 내에 존재하는 다른 항원의 면역 반응의 증가에 유리하다.

간염 B 바이러스 표면 항원과 함께 본 발명의 비강 투여를 위한 백신 제제는 가용성의 하나 또는 그 이상의 단백질 항원을 포함하고, 상기 단백질 항원은 HBsAg의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 수용한다. 위와 같은 것들은 아래와 같은 것들이 될 수 있다: 파상풍균 독소, 디프테리아 독소 또는 단백질-폴리사카리드 접합체들(conjugates)로서 상기 사카리드 부분은 백신 캔디데이터 항 헤모필루스 인플루엔자 형태 b(vaccine candidate anti Haemophilus influenzae type b), 뇌수막염균의 C 폴리사카라이드, 페구균(Pneumococcus pneumoniae)의 백신 폴리사카라리드 또는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 정제된 또는 재조합이 되어 얻어진 관련 백신.

또한 본 발명의 목적의 범위 내에는 비강 투여를 위한 다면 가치의 제제가 포함되고, 상기 비강 투여의 경우 간염 B 바이러스 표면 항원이 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 수용하는 비활성화된 미생물로부터의 백신 캔디데이터와 결합된다. 상기 백신 항원은 백일해 전체 세포(Bordetella pertussis whole-cell)가 될 수 있고, HBsAg와 함께 투여하거나 또는 동일한 성질을 지닌 다른 백신 항원을 단독으로 투여하거나 또는 항원의 복합제 결합을 통합하는 것에 의하여 면역 향상 효과를 수용한다.

포함될 수 있는 다른 백신 항원은 존재하는 비활성 또는 약화된 백신 캔디데이터들이다.

본 발명과 관련된 비강 투여를 위한 백신 제제는 n=1 내지 n=20의 범위에 이르는 서로 다른 종(species)의 미생물로부터의 n 수를 포함하고, 위에서 언급한 성질 중의 어떤 항원적 성질을 가지고 있으며, 접종을 위한 최종 부피 및 항원 양은 각각 50 마이크로리터로부터 2 밀리리터 및 0.1 마이크로그램 내지 2 마이크로그램이 되며, 면역되는 크기 및 종에 의존한다.

본 발명의 제제는 주사를 위하여 PBS, 염수 용액(saline solution), 물에 용해되거나 또는 항원 안정성을 위하여 허용되는 의료 수단 내에서 사용되는 임의의 버퍼 용액 내에서 용해될 수 있고, 상기 용액 내에서의 항원 농도는 위에서 언급된질량 및 부피의 가능한 조합 범위 내가 된다.

마찬가지로, 임의의 다른 전제에 기초하여 접종 연령 또는 다면 가치적인 캔디데이터와 관련하여 관련 캔디데이터에 따라 HBsAg와 함께 혼합될 수 있고, 상기에서 위에서 언급된 하나, 둘 또는 그 이상의 항원 형태가 동결 건조되거나 또는 드롭, 스프레이 또는 가루형태(pulverization)로 투여되는 형태로 존재한다.

본 발명의 백신 제제는 예방 또는 치료적 처치로서 인간 또는 동물 내에서 효과적인 접종을 얻기 위하여 사용될 수 있다.

실시 예 1

HBsAg와 함께 또는 존재하지 않는 상태에서 서로 다른 형태의 항원을 포함하는 여러 개의 제제의 비강 투여 후에 발생되는 항원 반응을 평가할 목적으로, 13개 그룹으로 나누어진 생후 8 내지 10 개월의 암컷 BALB/c 생쥐에 대하여 실험이 실시되었다: 그룹 1 내지 11은 각각 10마리의 생쥐로 이루어지고, 그리고 그룹 12 내지13은 8마리의 생쥐로 이루어졌다. 모든 생쥐가 0, 14, 28 및 87일에 면역되었고 그리고 10, 21, 35, 42, 84 및 97일에 출혈되었다. 생쥐 한 마리 당 투여된 각각의 항원 양이 아래에 표시되었다:

그룹 경로 그룹 당 항원의 투여량

그룹 1 (비강)¹HBsAg 5㎍ + DT 10㎍

그룹 2 (비강) HBsAg 5㎍ + Bp 3.2 UOP*

그룹 3 (비강) HBsAg 5㎍ + TT 10㎍

그룹 4 (비강) HBsAg 5㎍ + TT 10㎍ + Bp 3.2 UOP*

그룹 5 (비강) HBsAg 5㎍ + DT 10㎍ + TT 10㎍

그룹 6 (비강) HBsAg 5㎍ + Bp 3.2 UOP* + TT 10㎍

그룹 7 (비강) HBsAg 5㎍ + DT 10㎍ + TT 10㎍ + Bp 3.2 UOP*

그룹 8 (비강) HBsAg 5㎍

그룹 9 (비강) DT 10㎍

그룹 10 (비강) Bp 3.2 UOP*

그룹 11 (비강) TT 10㎍

그룹 12 (IP)² HBsAg 5㎍ + Al(OH)₃0.125 mg

그룹 13^Ψ(IP) HBsAg 5㎍+DT 49.26 +TT 29.07㎍ + Bp 8.0 UPO* +Al(OH)₃0.125mg

상기에서 (비강)¹그룹은 비강 면역

(IP)²그룹은 복막내 면역

*UOP : 불투명도의 단위(units of opacity); 각각의 경우 위에서 언급된 동일한 양의 양쪽 Bp 스트레인의 UOP가 사용되었다.

Ψ 그룹 13은 비강 그룹으로서 동일한 HBsAg 투여량을 가지는 것으로 관찰될 수 있다. 그러나, 위 실험에서 나머지 항원의 투여량은 상업적 백신이 대조군으로 사용되었기 때문에 보다 높은 값으로 투여되었다. 위와 같은 백신은 변화될 수 없는 각각의 항원의 특정한 투여량을 포함했다. 상기와 같은 것은 표에서 제시된 마이크로그램에 해당한다. 그러므로 비강 경로를 통하여 투여된 TT, DT 및 Bp의 양은 각각 3, 5, 및 2.5 배 더 작다. 그럼에도 불구하고 동일한 양의 HBsAg가 사용되었다.

혈청 항-HBsAg 항체 반응

간염 B 바이러스 표면 항원에 대한 IgG 항체 반응의 결정은 HBsAg, DT, TT 및 Bp(그룹 7)을 이용하여 비강을 통하여 면역된 그룹 내에서 세 번째 투여 후 일주일이 되는 때 그룹 8보다 현저하게 높아진다는 것을 나타냈었고, 그룹 8은 동일한 경로를 통하여 PBS 내에서 단지 HBsAg 만을 수용하였다. 위와 같은 상황은 42일째에도 반복되었다(도 1A).

다른 비강을 통하여 투여된 그룹(그룹 1 내지 6)은 그룹 7과 동일한 상태를 나타내었고, 세 번째 투여 후 단지 그룹 2를 제외하고 PBS 내에서 HBsAg를 이용하여 얻어진 IgG 레벨 보다 현저하게 보다 높은 IgG 수준을 발생시켰으며, 35일째는 보다 높은 그러나 현저하지 않은(p>0.05) 반응을 가졌다. 그럼에도 불구하고, 상기 그룹은 42일째는 매우 현저한 차이를 가졌고, 이것은 35째에 적정 농도의 광범위한 분산에 의하여 설명될 수 있을 것이다.

HBsAg 및 Bp를 포함하는 제제를 이용하여 비강을 통하여 면역된 그룹; HBsAg, Bp 및 DT를 통하여 면역된 그룹; 및 HBsAg, Bp 및 TT(각각 그룹 2, 4, 및 6)은 두 번째 투여 후 그룹 8에 의하여 나타난 IgG 반응보다 현저하게 높은 IgG 반응을 가졌다.

35일째 HB-DTP 혼합물을 이용하여 비강을 통하여 면역된 그룹의 항-HBsAg IgG 반응은 복막 내 주사(그룹 13)를 통하여 면역된 상동 그룹(homologous group)의 반응과 현저하게 다르지 않았다는 점이 지적되는 것이 좋을 것이다. 동일한 방법으로, 4 번째 투여 후 통계적으로 유사한 값들이 비강을 통하여 투여된 그룹과 항원 조합(도 1)을 사용하여 IP 면역된 그룹 사이에 얻어졌다.

Heberbiovac HB(등록상표) 백신을 이용하여 면역된 그룹(그룹 12) 내에서 발생된 항-HBsAg 적정 농도는 임의의 비강 투여 그룹을 이용하여 얻어진 적정 농도보다 현저하게 높았다. 위와 같은 결과는 HBsAg가 근육 내 및 피하 경로를 통하여 복막 내(IP) 경로로 투여된 경우 보다 높은 HBsAg의 면역성으로 인한 것이다. IP경로의 위와 같은 특징은 실험에서 나타났다. 항-HBsAg 반응의 위와 같은 특징에도 불구하고, HBsAg의 5㎍의 투여에 해당하는-비강 투여와 동일한 가치를 가지는- 생쥐 한 마리 당 250㎕의 접종은 IP경로를 사용하는 것이 필요한 것으로 만든다. 그럼에도 불구하고, 비강 접종에 의하여 발생된 반응은 복막 주사에 의하여 유도된 반응과 동일하다는 것이 나이가 든 생쥐에게서 관찰되었다. 위와 같은 것의 실시 예는 서로 다른 비강 캔디데이터를 통하여 두 번째 실험(실시 예2 참조)에서 나타났다.

비강 경로를 통하여 발생된 보다 낮은 적정 농도에도 불구하고, 그룹 2에서 유도된 항-IgG2 반응 수준은 그룹 12에 의하여 나타난 반응 수준보다 현저하게 높다(데이터는 제시되지 않음)는 것이 최근에 관찰되었다. 이것은 항-HgsAg 항체 반응 상에서 Bp의 조절 반응을 예시하여 주는 것이며, 반응에 있어서 질적인 변화를 도입하고, Th1-유사 반응에게 유리하며, 이러한 사실은 IgG 서브 클래스 프로파일에 의하여 증명되었다. 상기 반응은 명반 내에서 보조된 백신에 의하여 발생된 공통 프로파일과 관련하여 IgG2a의 보다 높은 생산에 의하여 특징이 지워진다.

도 1에서 관찰되는 것처럼, 비강 및 복막 내 항-HBsAg 반응의 나타남(appearance) 및 유지는 매우 유사하고, 시간에 따른 유사한 증가 및 감소를 나타낸다.

혈청 항-파상풍 독소 IgG 항체 반응

파상풍 독소에 대한 HBsAg, DT 및 Bp의 보다 강한 면역 향상 효과가 그룹 7혼합물의 비강 투여 후에 증명되었다. 두 번째, 세 번째 및 네 번째 접종 후에, 위의 그룹의 항-TT IgG 레벨은 그룹 11과 관련하여 보다 현저한 증가를 나타내었고, 동일한 경로에 의하여 PBP 내에서 파상풍 독소를 이용하여 면역되었다.

TT를 포함하는 혼합물을 이용하여 비강을 통하여 접종된 다른 그룹, 특히 그룹 3, 5 및 6은 각각의 출혈(bleeding) 후에 그룹 11에서 유도된 것에 비하여 보다 높은 항체 수준을 보여주었다. 그룹 3의 경우, 그룹 11에 비하여 대략적으로 100배 더 높은 항체가 두 번째 투여 후에 얻어졌다. 이것은 TT와 같은 가용성 항원에 대한 HBsAg의 면역 향상 활성의 첫 번째 예시가 되기 때문에 매우 적절한 것이 된다.

항-HBsAg 내에서 관찰된 것처럼, 파상풍 독소는 또한 항-HBsAg 반응을 증가시켰고, 면역성의 교차-향상과 관련하여 상승적인 상호 작용의 존재를 보여주었다. 이러한 형태의 반응은 이미 HBsAg 및 HBcAg 및 다른 바이러스성 뉴클레오캡시드(nucleocapside) 항원에 대하여 관찰되었지만, 그러나 가용성 항원에 대하여는 발견되지 않았다. TT는 그룹 11에서 명백히 나타나는 것처럼 비강 경로에 의하여 면역성이 아니고 PBS 내에서 독소를 이용하여 면역된다. 그러므로, 위와 같은 효과는 HBsAg 및 TT에 대하여 예상되지 않았다.

HBsAg, TT 및 Bp가 PBS 내 TT를 이용하여 비강 접종(그룹 11)에 의하여 발생된 반응보다 1000배 더 강한 항-TT 반응을 발생시키면서 함께 제조된 경우(그룹 6) 항-TT 반응은 보다 현저하게 강화되었다. 위와 같은 추가적인 증가는 DT, HBsAg 및 TT의 혼합물에 의하여 얻어지지 않았다(그룹 5). 위와 같은 제제는 현저한 변화를생산하지 않지만, 그러나 항-TT 반응과 관련하여 TT 및 HBsAg의 결합의 상태와 유사한 통계적 상태를 보여주었다(도 1B).

그룹 6 및 7의 적정 농도는 현저하게 다르지 않다. Bp 및 HBsAg의 존재를 공통으로 가지는 위와 같은 양쪽 그룹은 1000배 이상 높은 반응을 유도했다. 그러므로, 표면 항원 및 Bp 양쪽은 첫 번째 경우에 매우 현저한 수준까지 그리고 양쪽 혼합물과 관련하여 상당히 현저한 수준까지 적정 농도를 증가시키는 항-TT 반응의 면역 향상을 생산한다. 실험에서 모든 그룹의 비강 조합은 HBsAg를 이용하여 면역이 되었기 때문에, Bp의 향상 효과가 HBsAg와 독립적인지 또는 양쪽 모두가 상승적인 향상 활성을 가지는지 여부를 규정하는 것은 중요하다. 연구된 모든 제제 내에 존재하는 항원의 수가 면역성에 영향을 미치지 않는다는 것은 TT과 관련하여 확신될 있지만, 그러나 상당히 현저한 수준에 도달하면서 증가되었다(도 1B).

각각 비강 및 복막 내 투여에 의하여 4개의 항원을 이용하여 양쪽 모두 면역된 그룹 7 및 13 내에서 유도된 TT-특이적 IgG 수준은 현저한 차이를 보여주지 않았다. 그러나 반응은 현저하게 나타난 것은 아니지만 그룹 3에서 얻어진 반응(도 1B)과 비교할 때 보다 높은 어떤 그룹을 위하여 비강 경로를 통하여 얻어졌다.

HBsAg 및 TT(그룹 3)을 이용하여 면역된 그룹 및 HBsAg, DT 및 TT(그룹 5)를 이용하여 면역된 그룹은 그룹 13에서 얻어진 반응과 서로 다른 IgG 적정 농도를 가지지 않았지만, 두 번째 투여 후 일주일 내에 상기 그룹은 세 번째 및 네 번째 투여 후에 현저하게 더욱 낮아진 반응을 가졌다. 위와 같은 결과는 IP 투여 후 얻어진 수준과 유사한 수준까지 항-TT 반응을 증가시키기 위하여 Bp를 혼합물에 추가하는 것이 중요하다는 것을 명백히 보여주었다. 그럼에도 불구하고, 3배보다 더 높은 TT의 양은 또한 비강 경로에 의해서 투여되기보다는 IP 경로에 의하여 투여되었다는 것을 고려해야 한다.

혈청에 있어서 IgG 항체 항-디프테리아 독소의 반응

HBsAg, TT 및 Bp과 함께 DT의 비강 투여(그룹 7)는 DT가 PBS 내에서 투여된 그룹 9(도 1C)에 의하여 도달된 반응과 비교할 때 DT 면역성에 있어서 상당히 증가를 초래한다.

동일한 형태가 항-DT IgG 수준에서 상당히 현저한 증가로서 DT 결합(그룹 1, 4 및 5)를 이용하여 비강을 통하여 면역된 나머지 그룹 내에서 나타났다. 단지 그룹 1만이 두 번째 투여 후 상당히 뛰어난 결과를 나타내지 않았다. 그러나 세 번째 투여 후 35 및 42번째 되는 날 그룹 1의 반응이 그룹 1의 반응은 PBS 내 디프테리아 독소로서 면역된 그룹(도 1C)과 비교하여 현저하게 높았다.

DT를 포함하는 제제를 이용하여 비강을 통하여 면역된 그룹과 4가 상업 백신(그룹 13)으로 복막 내 투여로서 면역된 그룹 사이의 비교는 항-TT 반응-유사 형태를 보여주었다. 달리 표현하면, 반응은 Bp가 아닌 HBsAg를 포함하는 그룹 내에서 100배 향상된 반면, Bp의 추가는 한층 더 반응이 증가하는 것을 허용하였고, 심지어 DPT-HP 백신으로 IP 경로에 의하여 발생된 반응보다 더욱 높은 수준까지 증가하였다. DT의 위와 같은 형태는 다른 가용성 단백질인 TT를 위하여 발견된 효과를 다시 생산한다. 그러므로, HBsAg는 양쪽 가용성 단백질에 대하여 강한 면역 향상효과를 가지고 그리고 강한 면역 향상 효과가 다시 HBsAg에 영향을 미친다는 것을 확신할 수 있다. DT의 경우, 증진 활동은 또한 혼합물 내부 항원에 대한 면역 반응의 교차 향상과 관련된다는 것이 명백해졌다; 그러므로, 이미 설명이 된 것처럼, 항-표면 항원 IgG 반응은 DT의 추가에 의하여 향상된다. IP의 투여 후 얻어지는 반응과 유사한 수준까지 100배 항-DT 반응을 증가시키는 것을 가능하도록 하는 Bp를 추가할 필요성이 다시 한번 예시되었다. 비록 DT의 양이 5배 더 커졌지만, 반응은 IP 경로를 통하여 얻어진 반응과 유사하다는 것을 다시 상기가 되어야 한다.

혈청 내에서 항-B 백일해 전체 세포 IgG 항체 반응(Anti-B pertussis whole cell IgG antibody response in the serum)

모든 항-Bp 반응은 강도 및 거의 포화 상태에 가까운 수준까지 빠른 증가라는 특징을 가진다(도 1D). 결과로서 발생하는 균일성에도 불구하고, 통계적 분석은 그룹 사이에 현저한 차이의 발생 가능성을 밝혀내었다.

세 번째 투여 후 4가 결합을 이용하여 비강을 통하여 면역된 그룹은 동일한 경로를 통하여 Bp 단독으로 면역된 그룹(그룹 10)에서 얻어진 반응보다 현저하게 더 높은 반응을 발생시켰다. 그러나 이 효과는 빠르게 적정 농도(titer)의 포화 상태에 도달하기 때문에 네 번째 접종 후에는 사라진다.

하나 또는 그 이상의 항원과 함께 Bp를 포함하는 정제를 이용하여 비강으로 투여된 다른 그룹은 강한 반응을 가지고, 이는 35일째 날에 HBsAg 및 Bp가 투여된 그룹의 경우에 현저하게 커지고, HBsAg의 면역 향상 효과가 또한 가용성 단백질에대하여 알려진 효과에 추가하여 비활성 세포 내에서 발생된다는 것을 명확히 보여준다. 그룹 2 및 그룹 4 양쪽은 42일째 되는 날 위와 같은 통계적 차이를 유지하는 한편, 그룹 6 및 7(보다 복잡한 결합으로 투여된 그룹)은 그룹 10과 다르지 않았다. 모든 비강 그룹의 IP 그룹에 대한 비교는 두 번째 및 세 번째 투여 후에 현저한 차이를 나타내지 않았으며, 높은 적정 농도가 전체 세포를 이용하여 비강 면역에 의하여 얻어질 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.

실시 예 2

HBsAg의 비강 다면 제제의 점막 반응의 결정(Determination of mucosal response of the nasal multivalent formulations of HBsAg)

비강으로 투여된 항원에 대한 보다 강한 반응이 점막 및 전신 수준(mucosal and systemic levels)에서 발생될 수 있는가 여부에 의존한다는 사실을 고려하여, 질(vaginal) 및 폐 세척(lung lavages) 내에서 IgA 항체 반응이 실시 예 1에서 설명된 면역된 그룹 내에서 결정되었다.

질(Vaginal) 항-HBsAg 반응

네 번째 투여 후, 10일째 되는 날, 4가 제제를 이용하여 비강 면역된 그룹의 질 세척 내에서 유도된 HBsAg-특이적 IgA 반응은 동일한 경로를 통하여 HBsAg를 이용하여 배타적으로 면역된 생쥐에서 발견된 반응과 현저하게 다르지 아니하였다. 현 시점에서 혈청 항-HBsAg IgG 적정 농도는 촉진 작용에 의하여 PBS 내에서 HBsAg를 이용하여 면역된 그룹 내에서 발생된 강한 반응으로 인하여 다르지 않다. 그러나 20%이상의 혈청 전환(seroconversion)이 첫 번째 그룹에서 발견되었다. 비록 아무런 차이도 발견되지 않았지만, 상기와 같은 큰 양의 항원은 질 항-HBsAg 반응에 영향을 미치는 것으로 강조되어야 한다.

다른 한편으로, 비강 또는 복막 내 경로 중의 어느 하나를 통하여 4개의 항원의 결합을 수용하는 그룹(각각 그룹 7 및 13) 내에서 유도된 IgA 수준을 포함하는 경우 점막 경로를 통하여 면역된 그룹 내에서 발생된 질 분비물 내에서 우세한 항체의 수준은 비경구적으로 면역된 그룹의 수준에 비하여 현저하게 높다. HBsAg를 이용하여 복막 내 접종은 비록 낮은 값이지만 SC 및 IM 경로에 의하여 얻어진 수준(데이터는 제시되지 않음)에 비하여 더 높은 결과를 초래했다는 점이 강조되어야 한다. 위와 같은 것들이 IP 면역 후에 질 세척 내에서 발견된 반응이 중요한 이유가 된다. 일반적으로, 비강 면역은 기대했던 것처럼 IP를 능가했다.

질 항-파상풍 독소 반응

4번의 투여 후 질 TT-특이적 IgA 수준의 결정은 HBsAg, DT, Bp 및 TT의 결합을 이용하여 비강을 통하여 면역된 그룹(그룹 7)은 단지 TT를 이용하여 면역된 그룹 내에서 유도된 반응에 비하여 보다 크고 그리고 현저하게 중요한 반응을 발생시켰고, 0%의 혈정 전환이 이루어졌다. 서로 다른 항원 혼합물 내에서 TT를 이용하여 비강으로 접종된 다른 그룹은 동일한 형태를 가졌다. 위와 같은 결과로부터 그리고 그룹 3의 반응(HBsAg 및 TT를 포함하는)을 염두에 두면, HBsAg는 다른 혼합물과 같은 수준에서 질 항-TT IgA 반응을 향상시킨다(도 2B).

비강에 의하여 접종된 모든 그룹은 복막 내 주사를 통하여 HB-DTP를 이용하여 면역된 그룹과 비교하여 보다 크고 그리고 매우 현저한 반응을 나타내었다. 위와 같은 그룹은 단지 14%의 혈청 전환만을 가졌다. 이리하여, IP 경로를 통하여 투여된 모든 항원이 질 반응을 나타내는 것은 아니라는 것을 확신시켰다. 상기 질 반응은 HBsAg를 포함하는 몇몇 항원의 배타적인 성질인 것으로 추측된다.

질 항-디프테리아 독소 반응

DT를 포함하는 다른 비강 결합물(combinations)을 이용하여 면역된 그룹 내에서뿐만 아니라 비강 4가 제제를 이용하여 면역된 그룹 내에서 유도된 항-DT IgA는 PPS 내에서 DT의 대조 표본으로 주어졌던 그룹 9 내에서 발생된 것에 비하여 더 크게 나타났다(p<0.001)(도 2C).

더욱이, 비강으로 네 개의 항원이 주어진 그룹에 의하여 발생된 반응은 복막 내 투여 4가 백신의 그룹 내에서 발생된 반응에 비하여 더 크게 나타난다; TT의 반응과 유사한 형태.

일반적으로, 점막으로 면역된 그룹은 4 개의 항원 IP로 주어진 그룹의 반응보다 현저하게 보다 더 높은 질 IgA 수준을 발생시켰다.

그룹 1에 속하는 항-DT IgA 수준은 보다 높은 면역성을 가지는 그룹에 의하여 얻어진 수준과 다르지 않았고, 이미 TT에 대하여 확인된 것처럼 HBsAg는 PBS 내에서 독소가 투여되었던 그룹 9(도 2C)와 비교할 때 질 항 DT 반응의 매우 현저한향상을 유도한다는 것을 명백히 보여주었다. 위에서 이미 언급한 것처럼, 위와 같은 결과는 파상풍 및 디프테리아에 대항한 보호에 대하여 직접적인 이익을 가질 수 없을 가능성을 가진다. 그러나 TT 및 DT 모델을 평가한 후에 다른 병원균으로부터 유사한 성질-미립자는 아니지만 가용성인-의 항원을 이용하여 비강을 통하여 투여된 HBsAg의 결합은 자유로운 또는 고정된(free or anchored) 위와 같은 단백질은 질 수준에서 면역 반응의 증가를 발생시킬 수 있었다.

질 항-백일해 반응(Vaginal anti-Bordetella pertussis response)

질 항-Bp 반응은 두 개의 수준으로 나누어지고, PBS에서 Bp를 이용하여 면역된 그룹이 보다 낮은 그룹(a lower one)에 위치하고, 그리고 다른 보다 높은 그룹(upper one)은 모든 연구된 결합물을 이용하여 면역된 그룹에 해당한다. 보다 크고 그리고 매우 현저한 항-Bp 반응은 결합된 면역 반응(모두 HBsAg를 포함한다)에 의하여 얻어진다. 그럼에도 불구하고, Bp 단독으로 발생된 반응은 거의 1:100의 수준을 유도했고, 이는 항원 혼합물 내에서 면역된 후에 거의 혈청 전환이 발생하지 않고 그리고 단지 강한 반응에만 도달하는 파상풍 및 디프테리아와 다른 점이다.

Bp의 경우 IP 접종은 임의의 질 IgA 반응을 발생하는 것으로 관찰되지 않았다. 그러므로, IP 접종은 TT-유사 형태를 가지고, IP 경로에 의하여 발생된 반응은 질 세척 내에서 무시할 수 있는 IgA 반응이 된다. 다른 두 개의 항원 HBsAg 및 DT 단독으로 사용된 경우는 각각 70 및 60 %의 혈청 전환을 가지는 약하지만 중요한 반응을 발생시켰다.

폐 IgA 반응

질 반응이 병원균 중의 하나에 대한 보호에 있어서 중요한 것과 마찬가지로, 호흡기 관(respiratory tract)에서의 반응은 Bp 및 디프테리아 세균(corynebacterium diphtheriae)을 위하여 매우 중요하다. 이것은 그룹 7의 4가 제제를 이용한 비강 면역 후 점막 면역의 수준에 관한 일반적인 지식을 위한 항-TT 및 항-HBsAg 반응에 대한 연구를 제외하지 않는다.

폐 항-HBsAg 반응(Lung anti-HbsAg responses)

폐 세척 내에서 HBsAg-특이적 IgA 반응을 결정한 후에, 4가 결합(그룹 7)을 이용하여 비강을 통하여 면역된 그룹에 의하여 발생된 반응과 동일한 경로에 의하여 HBsAg 만을 수용하는 그룹(그룹 8)에 의하여 발생된 반응 사이에는 아무런 현저한 차이가 발생하지 않는다고 결론을 내렸다. 폐에서의 IgA 수준의 평가 과정에서 PBS 내에서 혼합물 또는 HBsAg 중 어느 하나를 이용하여 면역된 그룹 내에서 유사한 혈청 IgG 수준이 존재하였다. 그러나 반응은 강하고 그리고 큰 양의 항원(DT, TT 및 Bp)의 투여에 의하여 PBS 내에서 HBsAg에 의하여 발생된 반응에 의하여 영향을 받지 않았으며 경로의 높은 능력을 명백해 보여주었다(도 3A).

동일한 도면에서 IP 경로는 폐 세척에서 현저한 반응을 유도하지 않았고 그리고 비강 그룹과의 비교는 후자에게 넓은 범위에서 유리하였다(p<0.001).

폐 항-파상풍 독소 반응

4가 비강 제제의 항 TT IgA 반응은 동일한 경로에 의하여 PBS 내에서 TT 또는 명반 내 HBsAg, DT 및 Bp를 함께 복막 내 경로를 이용하여 얻어진 반응보다 훨씬 높았다(p<0.001). 위와 같은 두 개의 후자의 대조 그룹에 의하여 나타난 반응은 거의 무시할 수 있는 정도였다(도 3B).

폐 항-디프테리아 독소 반응

디프테리아 독소의 비강으로 투여된 HBsAg, TT 및 Bp와의 결합은 면역성을 매우 크게 향상시켰다. 이것은 항-DT IgA 항체 반응의 결정의 결과는 점막 경로에 의한 4개의 항원결합으로 면역된 그룹(그룹 7) 및 비강으로 투여된 PBS 내의 DT에 해당하는 그룹 9 및 그룹 13 그리고 복막 내 경로를 통하여 투여된 4가 백신의 대조군 사이에는 매우 현저한 차이(p<0.001)가 존재했다. 그룹 9의 경우에, 어떤 생쥐도 1:100의 희석 내에서 DT-특이적 IgA에 대하여 양성 반응을 나타내지 않았다. IP 그룹 내에서 단지 하나의 양성 반응을 나타내는 생쥐만이 발견되었다. 그러므로, 위와 같은 약한 반응은 4가 혼합물에 의하여 얻어진 반응과 크게 대조되는 한편, 또한 균일한 그룹 내에서 TT에 대하여 얻어진 반응 내에서도 대비가 된다(도 3C 및 도 3B).

폐 항-백일해 반응(Lung anti-bordetella pertussis responses)

비강 경로에 의하여 4가 결합물을 이용하여 면역된 그룹 내에서 발생된 항-Bp IgA 반응(그룹 7) 및 동일한 경로에 의하여 비활성화된 Bp를 이용하여 배타적으로 면역된 그룹(그룹 10)을 비교한 결과, 그들 사이에는 아무런 차이도 나타나지 않았다. 그러나 위와 같은 그룹으로부터의 각각의 반응이 복막 내 경로를 통하여 4개의 요소들의 명반-보조된 혼합물로 주어진 그룹에 의하여 발생된 반응과 비교할 때, 양쪽 IgA 반응의 우월성은 매우 현저하였고, 또 다시 단지 점막 접종만이 폐 세척 내에서 탐지된 IgA 반응 내에서 강한 증가에 유리하다는 것을 제시해 주었다.

비록 폐 세척 내에서 항-Bp 반응이 질 세척 내 반응으로서 혼합물을 이용하여 향상되지 않았지만, 항원 수에 있어서의 증가는 면역성에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 항-Bp 반응은 10⁴에 이르는 기하학적 평균이 적정농도에 대하여 그룹 7 및 그룹 10 내에서 매우 높다는 것이 주목되어야 한다. 위와 같은 결과는 Bp는 폐 IgA 반응을 유도하는 비강 경로를 의한 뛰어난 면역원이라는 것을 보여준다. 항체 수준에서 관찰된 효과는 간격을 최대한 좁히는 것이었고, 포화 상태를 명백히 보여주었다. 폐 세척은 단지 그룹 7로서만 실행되었고, 그리고 더 나아가 그룹 2는 HBsAg 및 Bp를 결합하는 효과를 연구하기 위하여 그룹 10과 비교하지 않았지만, 그러나 적정 농도 수준과 반응의 특징을 고려했기 때문에, 차이가 존재한다고 할지라도 매우 작았다.

실시 예 3

실시 예 1의 그룹 7 및 그룹 13에 대한 제제의 비강 및 조직 계통의 투여 후에 단백질 FHA 및 백일해 독소에 대한 항체 반응의 비교.

명세서에서 언급된 위의 보고로 인하여 Bp의 각각의 단백질에 대한 반응을 유도하기 위하여 비강 경로의 보다 낮은 능력을 제안했다: FHA 및 백일해 독소, 이들에 대한 반응의 평가가 그룹 7 및 그룹 13 내에서 행해졌고, 이들 그룹은 각각 비강 및 비경구에 의하여 투여된 4가 제제에 해당한다. 위와 같은 평가는 3번 및 4번의 접종 후에 이루어졌다. 평가된 출혈(bleedings)의 반응의 통계적 분석은 비강 그룹 및 경구 그룹 사이에는 현저한 차이가 없다는 것을 제시하여 주었다. 그러므로, 비강 4가 제제에 있어서 유도(induction)는 심지어

보다 낮은 Bp 양으로 2.5 배의 접종(도 4) 후에도 계속된다고 결론을 내릴 수 있었다.

실시 예 4

비강 투여 후 비장 내에서 임파 증식 반응(Lymphoproliferative response in the spleen after nasal administration)

실시 예 1의 항원에 의하여 발생된 비장의 증식 반응을 연구하기 위하여, 그룹 7 내지 13이 100일째 선택되고, 그룹 당 적어도 4마리 생쥐로부터 비장이 추출되고, 림프구 풀을 형성하면서, 비장이 면역된 항원의 존재 아래에서 배양되었다. 4가 제제 내에서 비강으로 투여된 증식 능력의 평가의 결과는 도 5에서 각각 강조된 형태로 도시되어 있다. 복막 내 그룹은 대조 경로로서 역할을 하였다.

실험의 결과로서, 표본 내에서 존재하는 모든 항원에 대하여 현저한 세포 반응을 얻는 것이 가능하다는 것이 명확히 밝혀졌고, 그리고 도 5의 항원의 복수 개의 제제의 비강 투여로부터 그들 중의 몇몇에 대해서는 심지어 보다 높은 세포 반응을 얻는 것이 가능하다는 것이 명백히 드러났다.

실시 예 5

HBsAg는 또한 뇌 수막염균(OMPC)의 외부 막 소수포(the outer membrane vesicles)로부터 단백질 복합체의 면역성 향상제로서 작용한다.

HBsAg가 공동 투여된 항원에 대한 반응을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 생후 8 내지 10주의 8 BALB/c 생쥐들이 HBsAg, OMPC로서 면역이 되고 그리고 항원 단독으로 해당하는 대조 그룹이 면역되는 실험이 행해졌다. 위와 같은 실험은 표면 항원은 OMPC에 대한 면역 반응을 현저하게 향상시키고 그리고 상기 반응이 표면 항원을 향상시킬 수 있다는 것을 명확하게 보여주었다(도 6).

표면 항원의 향상 활성으로 인하여 다른 공통 접종된 항원은 다른 면역원성에 대한 유사한 효과를 수용하였다. 그들 중의 몇몇은 비활성화된 바이러스, 약화된 미생물 및 바이러스 성 표면 단백질이고 추가적으로 가용성 단백질 및 세균 백신이 된다.

실시 예 6

몇몇 정확한 결합. 강력하고 그리고 결합적인 방법(Potential and combinationmethods).

각각의 성분의 면역원성을 예시해주었고 그리고 그들 내에 존재하는 항원의 높은 비율에 대한 증가된 반응을 발생시킨 몇몇 복수 개의 결합이 아래의 표에 제시되어 있다. 상기 복수 개의 결합은 비강 투여를 위하여 액체 또는 동결 건조된 형태로 제조될 수 있다.

1-Hb-D 6-Hb-PT 11-Hb-DPT-Hib

2-Hb-P 7-Hb-DPT 12-Hb-(IPV)

3-Hb-T 8-Hb-(Hib) 13-Hb-DPT-Hib-(IPV)

4-Hb-DP 9-Hb-(OMPC)

5-Hb-DT 10-Hb-(약화된 바이러스 또는 비활성화된 바이러스, 자연 또는 재조합)

HBsAg와 혼합될 수 있는 항원 조합 중, 항원이 나이 그룹 내에서 그들의 적용에 따라 제조될 수 있는 것 중에서 선택될 수 있다: 나이든 사람, 청년층 또는 새로 태어난 어린이, 그리고 점막 질병에 따라 제조될 수 있는 것 중에 선택될 수 있다. 점막 면역이 중요한 점막을 통하여 유입될 수 있는 항원이 이에 포함된다. 이들 항원은 성, 호흡기 또는 입-장에 따른 질병을 방지하기 위하여 항원 혼합물의 사용에 따라, 위험 그룹 또는 치료자의 선택에 따라, 유기체에 따라(예를 들어: HBV, HCV 및 HAV) 또는 질병의 종류에 EK라 선택될 수 있다(예를 들어 만성적 성에따라 전염되는 질병, 바이러성 성-전염 질병 등).

표 1A

표 1B

표 1C

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표 2A

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표 3A

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표 3D

본 발명은 백신 개발 분야와 관련되고, 특별히 면역 향상제(immunoenhancers) 및 그들의 사용으로부터 발생하는 백신 제제(vaccine formulations)와 관련된 것으로서, 본 발명의 백신 제제는 예방 또는 치료적 처치로서 인간 또는 동물 내에서 효과적인 접종을 얻기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 목적은 비강 제제(nasal formulations)로서 투여되어 항원에 대항하는 면역 반응을 유리하게 만드는 것이고 그리고 위와 같은 경로에 의한 백신 사용을 위한 새로운 제제를 개발하는 것이다.

Claims

가용성 항원, 세균 백신 및 비활성 바이러스의 점막 면역 향상제로서 간염 B 바이러스 표면 항원을 포함하는 비강 투여를 위한 다면성 백신 제제.
청구항 1에 있어서,

제제 항원 중의 하나는 간염 B 바이러스 표면 항원 그 자체가 되는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

간염 B 바이러스 표면 항원과 함께 n 개의 다른 항원이 포함되어 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 받고, 상기에서 n은 1 내지 20이 되는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 다른 항원은 파상풍 독소 항원을 포함하고, 상기 독소 항원은 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 받는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 다른 항원은 디프테리아 독소 항원을 포함하고, 상기 독소 항원은 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 받는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 항원은 백신 항원 항-헤모필루스 인플루엔자 형태 b에 해당하는 접합 단백질-폴리사카리드를 포함하고, 상기 폴리사카리드는 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 받는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 항원은 캐리어 단백질에 접합된 뇌수막염균의 폴리사카리드 C에 해당하는 접합 단백질-폴리사카리드를 포함하고, 상기 폴리사카리드는 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 받는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 항원은 접합 단백질-폴리사카리드를 포함하고, 상기 단백질-폴리사카리드의 폴리사카리드 부분은 폐렴 구균의 백신 폴리사카리드에 해당하고, 상기 백신 폴리사카리드는 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 받는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 하나의 항에 있어서,

상기 n개의 항원은 백신 항원으로서 비활성화된 미생물을 포함하고, 상기 미생물은 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 9에 있어서,

백신 항원은 세균 백신 백일해(bacterin Bordetella pertussis)를 포함하고, 상기 백일해는 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 항원은 백신 항원으로서 비활성화된 바이러스를 포함하고, 상기 바이러스는 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 항원은 백신 항원으로서 약화된 바이러스를 포함하고, 상기 바이러스는 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 하나에 있어서,

상기 n개의 항원은 청구항 4 내지 청구항 12에서 기술된 하나 또는 그 이상의 항원 또는 그들이 혼합물 그리고 다른 항원 형태를 포함하고, 상기 항원은 HBsAg와의 공동 투여로 인하여 면역 향상 효과를 받는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 13 중의 어느 하나에 있어서,

최종 제제의 부피는 면역이 되어야할 크기와 종에 따라 50 마이크로미터 내지 2 밀리리터의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 14 중의 어느 하나에 있어서,

면역되어야할 항원의 종류의 종에 따라 접종되어야 할 항원의 양은 0.1 마이크로그램 내지 2 밀리그램이 되는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 15 중의 어느 하나에 있어서,

항원 혼합물은 주사를 위하여 PBS, 염수 용액, 물 또는 의학적 치료에서 사용되는 임의의 버퍼 용액 또는 항원의 안정성을 허용하는 용액 내에서 용해되는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 16 중의 어느 하나에 있어서,

상기 성분들은 액체 또는 동결 건조된 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 17 중의 어느 하나에 있어서,

투여는 드롭, 스프레이 또는 가루 형태로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 18 중의 어느 하나에 있어서,

인간 또는 동물에 사용되는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.
청구항 1 내지 청구항 19 중의 어느 하나에 있어서,

예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 다면성 백신 제제.