CN104958759B - 多价脑膜炎球菌制剂盒、疫苗制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多价脑膜炎球菌产品，包括冻干组分和液体组分，其中，冻干组分和液体组分分别包括A，C，Y或W135群脑膜炎球菌多糖中的1种、2种或3种，且相同的脑膜炎球菌多糖不同时存在于冻干组分和液体组分中，在临床使用时，通过将液体组分和冻干组分相混合得到多价脑膜炎球菌疫苗制剂。本发明多价脑膜炎球菌产品可稳定维持多糖抗原活性，且易于对制剂中有效抗原组分进行检测，便于进行制剂质量控制；此外，制备工艺简单，通过对多糖抗原的冻干工艺及溶解条件进行优化，得到能够稳定保存、抗原活性高的多价脑膜炎球菌产品。

Description

多价脑膜炎球菌制剂盒、疫苗制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及多价疫苗技术领域，特别涉及一种可稳定维持多价脑膜炎球菌疫苗抗原活性的组合制剂及制备方法。

背景技术

脑膜炎球菌(Meningococcus)，又称为脑膜炎奈瑟氏球菌，为流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)的病原菌。根据脑膜炎球菌荚膜多糖的抗原不同，通过血凝试验，将脑膜炎球菌分为A、B、C、D、X、Y、29E、W135、H、I、K群等十多个血清型。常见的流行株主要分布于A群、C群、W135群以及Y群。

预防接种是控制流脑最经济有效的措施，我国从1980年代开始广泛使用A群流脑多糖疫苗，2007年更将A群和A+C群流脑多糖疫苗纳入国家免疫规划，多年临床经验证明，疫苗可有效的防止感染，极大降低致病率。目前，已上市或进入临床阶段的脑膜炎球菌疫苗包括单价疫苗如A群脑膜炎球菌多糖疫苗和C群脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗等，以及多价疫苗(或组合疫苗)如A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗等。

其中，多价疫苗由于含有一种以上病原生物的抗原，相比较单价疫苗具有更广的预防谱，临床优势明显。然而，多价疫苗由于不同有效组分(抗原组分)之间物理和生化性质的不相容性以及免疫干扰性等原因，导致其制造较为困难，且疫苗的稳定性较难保证；此外，多价疫苗质量控制的复杂程度远高于单价疫苗。

现有技术中多价流脑疫苗制剂主要包括液体制剂、冻干制剂、冻干和液体制剂组合。然而，这些制剂虽满足疫苗申报的相关标准，经临床验证不影响产品的免疫原性和稳定性，但是疫苗生产工艺复杂，且不易于成品中多组分抗原含量的分析和质量控制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种多价脑膜炎球菌疫苗制剂，该多价脑膜炎球菌疫苗制剂可稳定维持制剂中抗原活性，且易于对制剂中有效抗原组分活性进行检测。

本发明的另一个目的是提供一种多价脑膜炎球菌疫苗制剂的制备工艺，其工艺简单，且易于制剂中有效抗原组分活性的测定，便于流脑结合疫苗成品中抗原组分的质控。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种多价脑膜炎球菌试剂盒，包括冻干组分和液体组分，所述冻干组分和液体组分分别包括A，C，Y或W135群脑膜炎球菌多糖中的1种、2种或3种，且相同的脑膜炎球菌多糖不同时存在于冻干组分和液体组分中。

本发明还提供一种多价脑膜炎球菌疫苗制剂，包括冻干组分和液体组分，所述冻干组分和液体组分分别包括A，C，Y或W135群脑膜炎球菌多糖中的1种、2种或3种，且相同的脑膜炎球菌多糖不同时存在于冻干组分和液体组分中；通过将液体组分和冻干组分相混合得到多价脑膜炎球菌疫苗制剂。

本发明还提供一种多价脑膜炎球菌疫苗制剂的制备方法，该方法包括将冻干组分和液体组分相混合，所述冻干组分和液体组分分别包括A，C，Y或W135群脑膜炎球菌多糖中的1种、2种或3种，且相同的脑膜炎球菌多糖不同时存在于冻干组分和液体组分中。

优选的，本发明试剂盒/疫苗制剂可为2、3、4价脑膜炎球菌试剂盒/制剂；所述冻干组分包括A、C或AC群脑膜炎球菌多糖；所述液体组分包括血清群Y、W135、YW135或AYW135群脑膜炎球菌多糖。

在本发明中，A群脑膜炎球菌多糖的功能团为0-乙酰基和磷，C群脑膜炎球菌多糖的官能团为0-乙酰基和唾液酸，W群脑膜炎球菌多糖的官能团为半乳糖和唾液酸，Y群糖的官能团为葡萄糖和唾液酸；本发明所提供的多价脑膜炎球菌疫苗制剂的优势之一是可以根据官能团来测定各多糖的含量，从而获取各自抗原的含量，进行质量监控。本发明按照“官能团互不影响含量测定的原则”将脑膜炎球菌多糖以冻干和液体的形式进行组合得到多价脑膜炎球菌试剂盒，能够方便快捷的对试剂盒中各有效抗原成分进行含量测定。例如，本发明多价脑膜炎球菌试剂盒中冻干组分和液体组分的组合可为(“+”前后分别代表冻干组分和液体组分)：AC+YW135；AC+W135；AC+Y；C+AYW135；C+YW135；C+W135；C+Y；A+YW135；A+W135；A+Y等。

更优选的，本发明试剂盒/疫苗制剂为4价脑膜炎球菌试剂盒/制剂，所述冻干组分为AC群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分为WY135群脑膜炎球菌多糖；或所述冻干组分为C群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分为AYW135群脑膜炎球菌多糖。当选择AC群脑膜炎球菌多糖为冻干组分，每种抗原含量的检测可以通过磷含量和唾液酸含量的测定实现，选择YW135群脑膜炎球菌多糖为液体组分，有效抗原组分可以通过测定半乳糖和葡萄糖实现。其中，磷含量、唾液酸含量、半乳糖和葡糖糖含量的测定可按照《中国药典》(2010)规定的方法进行测定。此处给出的实施方式仅为进行示意性说明本发明。

在本发明中，所述脑膜炎球菌多糖以偶联或未偶联在蛋白载体上的形式存在。即所述脑膜炎球菌多糖以独立的形式存在，或偶联在蛋白载体上以结合的形式存在。优选的，所述脑膜炎球菌多糖以偶联在蛋白载体上的形式存在。

优选的，所述的蛋白载体包括突变无毒白喉毒素(CRM197)、白喉类毒素(DT)和/或破伤风类毒素(TT)。当冻干组分包括一种以上脑膜炎球菌多糖时，各偶联物可采用相同的蛋白载体(例如，当存在两种脑膜炎球菌多糖时，可分别偶联与CRM197上，然后组合)或不同的载体蛋白(例如，一种脑膜炎球菌多糖偶联在CRM197上，另一种偶联在TT上)。

其中，脑膜炎球菌多糖(例如A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖及脑膜炎球菌多糖蛋白偶联物)的制造方法是本领域技术人员所公知的技术，本领域技术人员可通过任何已知的现有方法进行制备，例如独立的脑膜炎球菌多糖采用相应脑膜炎球菌菌种经过发酵培养生产出A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖，其纯化步骤可以为通用的常规步骤(例如超滤、色谱、透析等方法)。与蛋白载体偶联的多糖，例如通过合适的偶联反应(采用活性酯、巯基、碳二亚胺、酰肼、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺等)进行，或者采用各种现有的等同的方法实现偶联过程。此外，本领域技术人员也可采用市售产品得到与蛋白载体偶联或未偶联的脑膜炎球菌多糖。

优选的，所述冻干组分还可包括保护剂，所述保护剂包括乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种或多种，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。更优选的，所述保护剂为低浓度(以水为溶剂浓度为10～100mg/mL)蔗糖/甘露醇的混合物；更优选的，甘露醇的含量为每剂不高于10mg，例如5-10mg，优选为10mg；蔗糖的含量为每剂不高于5mg，例如2-5mg，优选为5mg。

优选的，所述冻干组分通过如下步骤制备：取经纯化的脑膜炎球菌多糖和/或保护剂，在温度为-45±5℃下预冻120～300分钟；抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35±5℃下真空干燥720～960分钟；升温至35±5℃，普通干燥300～600分钟。

更优选的，所述冻干组分通过如下步骤制备：取脑膜炎球菌多糖和/或保护剂，在温度为-45℃下预冻240～300分钟；抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35℃下真空干燥840～960分钟；升温至35℃，普通干燥300～600分钟。采用本发明制备工艺得到的冻干组分，冻干效果好，冻干组分平整无塌陷且呈蜂窝状，无萎缩现象，且含水量小。

优选的，所述试剂盒/疫苗制剂还包括稀释剂，所述稀释剂选自磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，硼酸盐缓冲液，琥珀酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液、PBS缓冲液、氯化钠溶液或柠檬酸缓冲液中的一种或多种；更优选的，所述稀释剂为0.45％氯化钠水溶液和10mM磷酸盐缓冲液。采用氯化钠和磷酸盐作为缓冲液安全可靠，且0.45％的氯化钠水溶液和10mM磷酸盐缓冲液可有效的溶解冻干组分，保证溶解后的多价脑膜炎球菌疫苗澄明透亮、眼观无异物。

本领域技术人员可以知晓，稀释剂可以预先与液体组分相混合的形式存在，在临床使用前，将冻干组分与含稀释剂的液体组分相混合(例如通过注射器)；稀释剂也可以独立的形式存在于试剂盒中，在临床使用前，将冻干组分、液体组分与稀释剂相混合。

本发明试剂盒/疫苗制剂在临床使用前，将固体组分采用液体组分溶解，溶解后的制剂渗透压为280～320mOsmol/kg，PH为6-7；属于人体可接受范围内，溶解后的且可长时间维持其的稳定性。

优选的，所述液体组分可包括佐剂或不包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝或磷酸铝或硫酸铝等铝盐。

优选的，所述冻干组分和液体组分还可包括一种或多种药学上可接受的药物载体和/或赋形剂。

优选的，所述试剂盒/疫苗制剂中液体组分和冻干组分在使用前保持相互分离。例如，液体组分和冻干组分各自保存在独立的容器中；或者液体组分和冻干组分可包装在单一容器的不同腔室内。更优选的，冻干组分可保存在密封小瓶中，液体组分可保存在小瓶或注射器中；所述小瓶可采用玻璃、塑料材质等，所述注射器可采用玻璃、塑料注射器等。本领域技术人员可以知晓，小瓶可带有开口，采用胶塞或盖进行密封，以方便取出小瓶内的组分或者使注射器能够插入小瓶中；注射器可以带针头，也可以与独立针头组合使用，注射器及针头的尺寸本领域技术人员可以根据实际需求进行选取。本领域技术人员还可以知晓，将液体组分或冻干组分加入容器前，容器进行灭菌。

优选的，本发明疫苗制剂的剂量可按照本领域所公知的技术标准(例如注射途径、接种年龄、多糖抗原存在形式等)来确定；优选的，当多糖抗原以独立形式存在于疫苗中，每中多糖每剂含量为10～100μg，更优选为30～70μg，最优选的为40～60μg，例如50μg；优选的，当多糖抗原以和蛋白载体偶联的结合形式存在于疫苗中，每种多糖(按多糖含量算)每剂含量为0.1～40μg，更优选为1～20μg，最优选为4～15μg。

优选的，本发明疫苗制剂接种途径包括皮内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射等。

本发明有益效果：

(1)现有技术中的多价脑膜炎球菌疫苗制剂质量控制难度大，制剂中有效抗原活性检测的步骤复杂。本发明惊喜的发现，当将制剂中的多糖抗原制备成液体制剂和冻干制剂相结合的形式，不仅可稳定维持多糖抗原活性，且易于对制剂中有效抗原组分活性进行检测，便于进行制剂质量控制。

(2)本发明相比现有技术，制备工艺简单，对多糖抗原的冻干工艺进行优化(例如冻干保护剂的选择和冻干曲线的优化)，冻干效果好，冻干组分平整无塌陷且呈蜂窝状，无萎缩现象，且含水量小，冻干后的抗原能够长时间保持高活性；此外通过对稀释、溶剂参数进行优化，可有效的溶解冻干组分，保证溶解后的多价脑膜炎球菌疫苗澄明透亮、渗透压符合人体可接受范围且溶液长时间保持稳定。

附图说明

图1为本发明实施例中不同保护剂下冻干制剂外观图

图2为本发明实施例中不同冻干曲线下冻干制剂外观图

图3为本发明实施例中冻干和液体疫苗原性对比图

图4为本发明实施例中四价脑膜炎球菌疫苗原性柱状图

具体实施方式

本发明通过如下实施例，但非限制，进一步对本发明进行阐述，所述实施例阐述本发明几个优选的实施方案，本发明的其它实施例在不背离本发明的核心的前提下为本领域技术人员所预见。

实施例1

A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖或多糖蛋白结合原液的制备

A、C、W135、Y群脑膜炎球菌工作种子复苏后，接种发酵培养基，发酵结束后离心收集菌体。弃掉菌体沉淀，上清中分离提纯荚膜多糖抗原。

多糖的纯化采用超滤浓缩，膜包洗杂，凝胶分离等步骤，去除了传统工艺中使用的苯酚、氯仿，蛋白酶等对人体明显有害的试剂。

检测合格的纯化多糖，按一定比例稀释后进行配制即可得到A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液。

多糖蛋白结合原液配制前首先需要进行多糖蛋白的结合。本实施例中多糖蛋白结合为本技术领域人员知晓的胺还原法。

用于结合疫苗蛋白载体，本发明以CRM197为例进行说明，CRM197为本公司构建的拥有自主知识产权的高产白喉类毒素CRM197的白喉杆菌工程菌株，同时开发了可适应该菌株高密度生长的无动物源的发酵培养基。

A群结合物的制备是先将A群纯化多糖以H₂O₂进行水解，然后加入己二酸二酰肼(ADH)进行衍生，通过氰基硼氢化钠偶联CRM197载体蛋白。而C、W135、Y群结合物的制备则直接以高碘酸钠对多糖进行活化和衍生，然后通过氰基硼氢化钠偶联CRM197载体蛋白。

实施例2：

四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)制剂的制备

取10μg A群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物结合原液、10μg C群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物结合原液置于西林瓶中，加入冻干保护剂(20mg甘露醇和5mg蔗糖)，半加塞后放入冻干机腔体中，在温度为-45℃下预冻240～300分钟，将温度降至-35℃抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35℃下真空干燥840～960分钟，升温至35℃，普通干燥300～600分钟，制备成冻干组分；

取10μg Y群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物结合原液、10μg W135群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物结合原液置于西林瓶中，加入由10mmol磷酸盐缓冲液和0.45％生理氯化钠溶液的混合物构成的稀释剂，制备成含稀释剂的液体组分；

在临床使用时，将冻干组分和液体组分相混合，制备成四价疫苗结合制剂，具体操作中，可采用注射器吸取液体组分(≥0.5mL)，揭开瓶盖的塑料顶，将注射器从瓶塞穿刺注入，进行混合。

本领域技术人员知晓，冻干组分、液体组分和/或稀释剂可以试剂盒的形式存在；其中，稀释剂可以预先与液体组分相混合的形式存在，在临床使用前，将冻干组分与含稀释剂的液体组分相混合；稀释剂也可以独立的形式存在于试剂盒中，在临床使用前，将冻干组分、液体组分与稀释剂相混合。

本实施例中，液体组分和冻干组分存储于西比瓶中，本领域技术人员也可以知晓，液体组分也可以直接存储在注射器中，在配制时，直接将注射器从瓶塞穿刺注入；存储液体组分和冻干组分的容器不用于限定本发明。

实施例3：

四价脑膜炎球菌疫苗(多糖疫苗)制剂的制备

取50μg A群脑膜炎球菌多糖原液、50μg C群脑膜炎球菌多糖原液置于西林瓶中，加入冻干保护剂(20mg甘露醇和5mg蔗糖)，半加塞后放入冻干机腔体中，在温度为-45℃下预冻240～300分钟，将温度降至-35℃抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35℃下真空干燥840～960分钟，升温至35℃，普通干燥300～600分钟，制备成冻干组分；

取50μg Y群脑膜炎球菌多糖原液、50μg W135群脑膜炎球菌多糖原液置于西林瓶中，加入由10mmol磷酸盐缓冲液和0.45％生理氯化钠溶液的混合物构成的稀释剂，制备成含稀释剂的液体组分；

在临床使用时，将冻干组分和液体组分相混合，制备成四价疫苗结合制剂，具体操作中，可采用注射器吸取0.5ml液体组分，揭开瓶盖的塑料顶，将注射器从瓶塞穿刺注入，进行混合。

实施例4：

四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)制剂的制备

同本发明实施例2的方法制备，制剂组分及含量调整为：冻干组分包括C群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(10μg)；液体组分包括、A群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物(10μg)、Y群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(10μg)、W群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物(10μg)。

实施例5：

三价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)制剂的制备

同本发明实施例2的方法制备，制剂组分及含量调整为：冻干组分包括A群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(10μg)、C群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物(10μg)；液体组分包括Y群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(10μg)。

实施例6：

三价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)制剂的制备

同本发明实施例2的方法制备，制剂组分及含量调整为：冻干组分包括A群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(10μg)；液体组分包括Y群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(10μg)、W135群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物(10μg)。

实施例7：

四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)制剂的制备

同本发明实施例2的方法制备，制剂组分及含量调整为：冻干组分包括A群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物(5μg)、C群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(5μg)；液体组分包括Y群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物(5μg)、W群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物(5μg)。

实施例8：

冻干保护剂的选择

同本发明实施例2的方法制备四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)，对制剂冻干保护剂及用量进行调整，保护剂及用量参见下表1：通过观察制品的外观和溶解性，优化保护剂类型。

表1 保护剂组合以及含量

冻干结束后，观察制品外观，结果如附图1-1至1-7所示，结果表明，采用甘露醇与蔗糖的组合作为保护剂，冻干效果最好，冻干制剂平整无塌陷且蜂窝状，无萎缩现象。

对冻干组分溶解速度进行测定，将7组冻干产品每组各取三瓶用0.9％生理盐水溶解，记录溶解时间、观察溶解度，结果如下表2所示。溶解时间的计算方法：取每批次样品各三支，揭开瓶盖的塑料顶，分别用注射器从瓶塞穿刺注入0.5ml稀释液，混匀并用秒表记录溶解时间，取平均值，溶解度现象参考《中国药典》(2010版)。

表2 冻干制剂的溶解时间

实验结果表明，采用上述保护剂制备而成的冻干制剂在0.9％的生理盐水中均易容，通过溶解时间可知，1-3组(甘露醇和蔗糖组合物)的溶解时间明显快于4-7组。上述1-3组保护所使用的甘露醇和蔗糖的配方中，第2组的使用量最低，从经济效益考虑，可以选用此保护剂(10mg甘露醇和5mg蔗糖/每剂)配方工艺。

实施例9：

冻干曲线优化

按实施例2方法配制保护剂溶液，将配制好的保护剂溶液分装到2mL西林瓶中，每瓶0.6mL，然后将西林瓶进行半压塞，随后转移至(东富龙)真空冷冻干燥系统。按照表3所示的冻干曲线配方进行参数的设置并冻干，冻干结束后将样品进行轧盖，并于2-8℃保存。考察冻干产品的外观及水分含量。

表3 不同冻干曲线的参数设置

不同冻干曲线下，冻干粉针外观如图2-1至附图2-10所示，结果表明，除第1、2两批的外观出现萎缩、塌陷现象，其他批次产品外观满足中国药典要求。

检测上述第3-10批次的冻干产品的水分含量，结果参见下表4：

表4 不同批次冻干产品的含水量

结果表明，第3-6四批的水分含量较高，因此排除这四条冻干曲线。在剩余的四条冻干曲线含水量较低，满足中国药典的要求，以第10批次产品代表的冻干曲线作为最终的曲线为例，具体的操作步骤如下，即：将搁板温度降至-45℃；制品预冻300分钟；将冷阱温度降至-50℃后开始抽真空；待真空度到0.2±0.02mBar时升温至-35℃进入一次干燥程序；持续960分钟后缓慢升温至35℃，不再控制真空；在35℃下进行解析干燥600分钟，冻干后期进行压力升测试，压力升测试通过，冻干结束。

实施例10：

稀释剂的选择

同本发明实施例2的方法制备四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)，对稀释剂及用量进行调整，通过考察不同稀释剂对冻干组分的溶解时间及渗透压，优化稀释剂类型及用量。

冻干制品，分别用磷酸缓冲液、0.9％生理盐水、0.45％NaCl+10Mm磷酸盐溶液和注射水四种稀释液溶解，每批各取9支制剂，参见下表5和6，记录溶解时间计算平均值，测量渗透压摩尔浓度。溶解时间的计算方法：取每批次样品，揭开瓶盖的塑料顶，分别用注射器从瓶塞穿刺注入0.5ml稀释液，混匀并用秒表记录溶解时间。

表5 不同稀释液溶解冻干制剂的溶解时间

四种稀释剂即磷酸盐缓冲液、0.9％生理盐水、0.45％氯化钠溶液+10Mm PB和注射水溶解后均澄清透明，无聚集体出现，且溶解时间无差异。

表6 不同稀释液溶解冻干制剂后渗透压摩尔浓度

《中国药典》(2010版)附录中规定在制备注射剂等药物制剂时必须考虑其渗透压。人体正常耐受渗透压为280～320mOsmol/kg，使用0.45％NaCl溶液+10Mm PB稀释冻干制剂后的渗透压摩尔浓度符合中国药典的规定。因此优选0.45％NaCl溶液+10Mm PB作为稀释液。

实施例11：

冻干前后免疫原性试验

同本发明实施例2的方法制备四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)，考察AC群脑膜炎球菌多糖(多糖蛋白结合疫苗)冻干前后免疫原性变化，试验材料参见下表7。

表7 供试品信息

选取健康状况良好的BALB/C小鼠(SPF级)30只，随机分成3组，每组10只。分别于第0天、14天皮下注射样品。每次注射剂量125μl，于第28天摘眼球取血，8000rpm离心10分钟，分离血清。间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度，以0.9％氯化钠注射液对照组小鼠血清OD值为Cutoff值，计算各组小鼠免疫血清抗体滴度。比较两种剂型对A、C群免疫原性的影响。

ELISA法操作流程为：将抗原包被于微量96孔酶标板内，室温过夜，洗涤包被板甩干。加待测血清，37℃孵育后，洗涤酶标板，甩干。加入抗鼠酶标二抗，37℃孵育后，洗涤酶标板，加新配制的底物溶液，37℃孵育后，加终止液，终止反应，用酶标仪测定OD值。

将血清检测结果进行统计分析，结果参见附图3及表8。

表8 不同剂型免疫原性统计分析

冻干剂型中A群多糖结合物的免疫原性和液体剂型中A群多糖结合物的免疫原性差异不显著。冻干剂型中C群多糖结合物的免疫原性优于液体剂型中C群多糖结合物产生的免疫原性。冻干过程没有促使AC结合物免疫原性发生较大变化。

实施例12：

四价流脑结合疫苗免疫原性的研究

同本发明实施例2的方法制备四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)，考察四价流脑结合疫苗免疫原性。

选取健康状况良好的小鼠(SPF级)30只，随机分成3组，每组10只。每一试验疫苗用两组，分别于第0天、14天皮下注射疫苗，阴性对照组注射0.9％无菌生理氯化钠。每次注射剂量125μl，于第28天摘眼球取血，8000rpm离心10分钟，分离血清。用间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度，以0.9％氯化钠注射液对照组小鼠血清OD值的2.1倍为Cutoff值，计算各组小鼠免疫血清抗体滴度。

ELISA法操作流程为：将抗原包被于微量96孔酶标板内，室温过夜，洗涤包被板甩干。加待测血清，37℃孵育后，洗涤酶标板，甩干。加入抗鼠酶标二抗，37℃孵育后，洗涤酶标板，加新配制的底物溶液，37℃孵育后，加终止液，终止反应，用酶标仪测定OD值。

试验结果参见附图4，结果表明，冻干后的A、C群滴度均高于5，能够产生明显的免疫应答。

实施例13

生产制备工艺中四价流脑结合疫苗制剂多糖含量的检测

在中试生产车间取适量A群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物结合原液和C群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物结合原液，加入冻干保护剂，半加塞后放入冻干机腔体中，在温度为-45℃下预冻240～300分钟，将温度降至-35℃抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35℃下真空干燥840～960分钟，升温至35℃，普通干燥300～600分钟，制备成冻干组分，将制备好的冻干组分分装至西林瓶中。

取适量Y群脑膜炎球菌多糖-CRM197偶联物结合原液和W135群脑膜炎球菌多糖CRM197偶联物结合原液，加入由10mmol磷酸盐缓冲液和0.45％生理氯化钠溶液的混合物构成的稀释剂，制备成含稀释剂的液体组分，将制备好的液体组分分装至西林瓶中。

检测分装好的四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)中单个抗原的含量。

四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)采用AB管制剂方式，其中A管冻干粉含有A、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物，B管液体含有W、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物。四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)制剂中抗原检测时，分别检测A管中A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物含量。检测B管中W群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物和Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物含量。

A管中的检测方法为分别测定磷和唾液酸的含量，即可得到A群和C群结合物多糖含量，检测方法为本领域技术人员所熟知的技术方法，可在中国药典中查询到相应的试验方法。B管中将多糖完全水解后通过离子色谱分别检测半乳糖和葡萄糖的含量，即可得到W和Y群结合物多糖含量，检测方法为本领域技术人员所熟悉的试验方法。

检测结果如下表9所示：

表9：四价脑膜炎球菌疫苗(多糖蛋白结合疫苗)多糖含量

由检测结果可知，A、C、W135、Y群多糖含量处于四价脑膜炎疫苗中多糖含量的范围(通常为4～15μg)内。采用本发明冻干组分、液体组分分别保存的方法，能够快速、准确的对制剂中的多糖含量进行检测，利于制剂在生产过程中的质量控制。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种多价脑膜炎球菌试剂盒，包括冻干组分和液体组分，所述多价脑膜炎球菌试剂盒为4价脑膜炎球菌试剂盒；

所述冻干组分包括AC群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分包括WY135群脑膜炎球菌多糖；

或者，所述冻干组分包括C群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分包括AYW135群脑膜炎球菌多糖；

且相同的脑膜炎球菌多糖不同时存在于冻干组分和液体组分中，

所述脑膜炎球菌多糖以偶联或未偶联在蛋白载体上的形式存在；

所述冻干组分还包括保护剂，所述保护剂为蔗糖和甘露醇的混合物，其中蔗糖的含量为每剂5mg，甘露醇的含量为每剂10mg或20mg；

所述冻干组分通过如下步骤制备：取经纯化的脑膜炎球菌多糖和保护剂，在温度为-45±5℃下预冻120～300分钟；抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35±5℃下真空干燥720～960分钟；升温至35±5℃，普通干燥300～600分钟。

2.如权利要求1所述的多价脑膜炎球菌试剂盒，其特征在于：所述脑膜炎球菌多糖以偶联在蛋白载体上的形式存在，所述的蛋白载体包括突变无毒白喉毒素、白喉类毒素和/或破伤风类毒素。

3.如权利要求1所述的多价脑膜炎球菌试剂盒，其特征在于：所述多价脑膜炎球菌试剂盒还包括稀释剂，所述稀释剂选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、氯化钠溶液和柠檬酸缓冲液中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的多价脑膜炎球菌试剂盒，其特征在于：所述稀释剂为0.45％氯化钠水溶液和10mM磷酸盐缓冲液的混合物。

5.一种多价脑膜炎球菌疫苗制剂，包括冻干组分和液体组分，所述多价脑膜炎球菌疫苗制剂为4价脑膜炎球菌疫苗制剂；

所述冻干组分包括AC群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分包括WY135群脑膜炎球菌多糖；

或者，所述冻干组分包括C群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分包括AYW135群脑膜炎球菌多糖；

且相同的脑膜炎球菌多糖不同时存在于冻干组分和液体组分中，

所述脑膜炎球菌多糖以偶联或未偶联在蛋白载体上的形式存在，所述液体组分和冻干组分在使用前保持相互分离，在临床使用前将液体组分和冻干组分相混合；

所述冻干组分还包括保护剂，所述保护剂为蔗糖和甘露醇的混合物，其中蔗糖的含量为每剂5mg，甘露醇的含量为每剂10mg或20mg；

所述冻干组分通过如下步骤制备：取经纯化的脑膜炎球菌多糖和保护剂，在温度为-45±5℃下预冻120～300分钟；抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35±5℃下真空干燥720～960分钟；升温至35±5℃，普通干燥300～600分钟。

6.如权利要求5所述的多价脑膜炎球菌疫苗制剂，其特征在于：所述脑膜炎球菌多糖以偶联在蛋白载体上的形式存在。

7.如权利要求6所述的多价脑膜炎球菌疫苗制剂，其特征在于：所述将液体组分和冻干组分相混合包括：将冻干组分溶解在含稀释剂的液体组分中得到多价脑膜炎球菌疫苗制剂，溶解后的疫苗制剂渗透压为280～320mOsmol/kg，PH为6-7。

8.一种多价脑膜炎球菌疫苗制剂的制备方法，该方法包括将冻干组分和液体组分相混合，所述多价脑膜炎球菌疫苗制剂为4价脑膜炎球菌疫苗制剂；

所述冻干组分包括AC群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分包括WY135群脑膜炎球菌多糖；

或者，所述冻干组分包括C群脑膜炎球菌多糖，所述液体组分包括AYW135群脑膜炎球菌多糖；

且相同的脑膜炎球菌多糖不同时存在于冻干组分和液体组分中，

所述脑膜炎球菌多糖以偶联或未偶联在蛋白载体上的形式存在；

所述冻干组分还包括保护剂，所述保护剂为蔗糖和甘露醇的混合物，其中蔗糖的含量为每剂5mg，甘露醇的含量为每剂10mg或20mg；

所述冻干组分通过如下步骤制备：取经纯化的脑膜炎球菌多糖和保护剂，在温度为-45±5℃下预冻120～300分钟；抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35±5℃下真空干燥720～960分钟；升温至35±5℃，普通干燥300～600分钟。

9.如权利要求8所述的多价脑膜炎球菌疫苗制剂的制备方法，其特征在于：所述冻干组分通过如下步骤制备：取脑膜炎球菌多糖和保护剂，在温度为-45℃下预冻240～300分钟；抽真空，保持真空度0.2±0.02mBar，在温度为-35℃下真空干燥840～960分钟；升温至35℃，普通干燥300～600分钟。