BRPI0720738A2 - Composição de conjugado de polissacarídeo- proteína pneumocócico multivalente - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO DE CONJUGADO DE POLISSACARÍDEO-PROTEÍNA PNEUMOCÓCICO MULTIVALENTE".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se de modo geral ao campo da me- dicina, e especificamente a microbiologia, imunologia, vacinas e à prevenção de infecção por um patógeno bacteriano por imunização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Streptococcus pneumoniae é uma causa importante de meningi- te, pneumonia, e doença invasiva grave em bebês e crianças pequenas em todo o mundo. As vacinas multivalentes de polissacarídeos pneumocócicos têm sido licenciadas por muitos anos e se comprovaram valiosas para pre- venir doença pneumocócica em adultos idosos e pacientes de alto risco. No entanto, bebês e crianças pequenas respondem pobremente à maioria dos polissacarídeos pneumocócicos. A vacina de conjugado pneumocócico hep- ta-valente (7vPnC, Prevnar®) foi a primeira deste tipo que se demonstrou ser altamente imunogênica e eficaz contra doença invasiva e otite média em bebês e crianças pequenas. Esta vacina é atualmente aprovada em muitos países em todo o mundo. Prevnar contém os polissacarídeos capsulares dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, cada conjugado a uma proteína de veículo designado CRMi97. Prevnar cobre cerca de 80 a 90%, 60 a 80%, e 40 a 80% das doenças pneumocócicas invasivas (IPD) nos Estados Unidos, na Europa, e em outras regiões do mundo, respectivamente [1,2]. Dados de vigilância obtidos nos anos seguintes à introdução de Prevnar demonstraram claramente uma redução da doença pneumocócica invasiva em bebês nos Estados Unidos conforme esperado (figura 1) [3,4].

A vigilância de doenças pneumocócicas invasivas conduzida em bebês nos Estados Unidos antes da introdução de Prevnar demonstrou que uma porção significativa de doença devida aos sorogrupos 6 e 19 foi devida aos sorotipos 6A (aproximadamente um terço) e 19A (aproximadamente um quarto) [5,6], A vigilância de doenças pneumocócicas invasivas conduzida nos Estados Unidos depois do licenciamento de Prevnar sugere que uma grande carga de doença ainda é atribuível aos sorotipos 6A e 19A (figura 1) [3]. Além disso, estes dois sorotipos são responsáveis pela maioria dos ca- sos de doença invasiva do que os sorotipos 1, 3, 5, e 7F combinados (8,2 vs. 3,3 casos/ 100.000 crianças de 2 anos e menos). Além disso, os sorotipos 5 6A e 19A estão associados com altas taxas de resistência a antibiótico (figu- ra 2) [7,8,9]. Apesar de ser possível que a proteção cruzada contra o soro- grupo venha a resultar em um declínio da doença pelo sorotipo 6A e 19A à medida que mais crianças são imunizadas, há evidência sugerindo que ha- verá um limite para o declínio, e uma significativa carga de doença devida a 10 estes sorotipos permanecerá (vide abaixo).

Dada a relativa carga e a importância de doença pneumocócica invasiva devida aos sorotipos 1, 3, 5, 6A, 7F, e 19A, a adição destes soroti- pos à formulação de Prevnar aumentaria a cobertura para doença invasiva até >90% nos Estados Unidos e Europa, e tão elevada quanto 70% a 80% 15 na Ásia e na América Latina. Esta vacina expandiria significativamente a co- bertura além da vacina Prevnar, e proporcionaria cobertura para 6A e 19A que não é dependente das limitações de proteção cruzada do sorogrupo. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, a presente invenção proporciona geralmente 20 uma composição imunogênica multivalente compreendendo 13 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados contém um capsular polissacarídeo de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado a uma proteína de veículo, junto com um veículo fisiologicamente aceitável. Opcionalmente, um adjuvante, tal como um adjuvante à base de 25 alumínio, é incluído na formulação. Mais especificamente, a presente inven- ção proporciona uma composição de conjugado pneumocócico 13-valente (13vPnC) compreendendo os sete sorotipos na vacina 7vPnC (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) mais seis sorotipos adicionais (1, 3, 5, 6A, 7F e 19A).

A presente invenção também proporciona uma composição imu- nogênica multivalente, em que os polissacarídeos capsulares são dos soro- tipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae e a proteína de veículo é CRM197. A presente invenção proporciona adicionalmente uma composi- ção imunogênica multivalente, em que os polissacarídeos capsulares são dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9v, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Strepto- coccus pneumoniae, a proteína de veículo é CRMi97, e o adjuvante é um 5 adjuvante à base de alumínio, tal como fosfato de alumínio, sulfato de alu- mínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade particular da invenção, o adjuvante é fosfato de alumínio.

A presente invenção também proporciona uma composição imu- nogênica multivalente, compreendendo conjugados de polissacarídeo- 10 proteína junto com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo di- ferente de Streptococcus pneumoniae conjugado a uma proteína de veículo, e os polissacarídeos capsulares são preparados a partir do sorotipo 3 e no mínimo um sorotipo adicional.

Em uma modalidade desta composição imunogênica multivalen-

te, o sorotipo adicional é selecionado entre o grupo consistindo dos sorotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e 23F. Em outra modalidade, a proteína de veículo é CRMig7. Em ainda outra modalidade, a composição compreende um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio sele- 20 cionado entre fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumí- nio. Em uma modalidade particular, o adjuvante é fosfato de alumínio.

A presente invenção também proporciona uma composição imu- nogênica multivalente, compreendendo conjugados de polissacarídeo- proteína junto com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um 25 dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo di- ferente de Streptococcus pneumoniae conjugado a uma proteína de veículo, e os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F e no mínimo um sorotipo adicional.

Em uma modalidade desta composição imunogênica multivalen- te, o sorotipo adicional é selecionado entre o grupo consistindo em sorotipos 1, 3, 5, 6A, 7F, e 19A. Em outra modalidade, a proteína de veículo é CRM197. Em ainda outra modalidade, a composição compreende um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio selecionado entre fosfato de alumí- nio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade particu- lar, o adjuvante é fosfato de alumínio.

A presente invenção também proporciona um método para indu- 5 zir uma reação imune para um conjugado de polissacarídeo capsular de S- treptococcus pneumoniae, compreendendo administrar a um humano uma quantidade imunologicamente eficaz de quaisquer das composições imuno- gênicas descritas.

A presente invenção proporciona adicionalmente que quaisquer 10 das composições imunogênicas administradas é uma única dose de 0,5 mL formulada para conter: 2 pg de cada sacarídeo, exceto por 6B a 4 pg; apro- ximadamente 29 pg CRM-I97 proteína de veículo; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elemental (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão de cloreto de sódio e succinato de sódio como excipientes.

Também são proporcionados métodos para produzir um conju-

gado imunogênico compreendendo polissacarídeo de Streptococcus pneu- moniae sorotipo 19A (Pn 19A) encadeado de modo covalente a uma proteí- na de veículo. Em uma modalidade, o método compreende (i) reagir polissa- carídeo sorotipo 19A purificado com um agente oxidante resultando em um polissacarídeo sorotipo 19A ativado; (ii) combinar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado com uma proteína de veículo; (iii) coliofilizar o o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo; (iv) ressuspender o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo em dimetil sulfóxido (DMSO); (v) reagir o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo com um agente redutor resultando em um conjugado de polissacarídeo sorotipo 19A : proteína de veículo; e (vi) rema- tar aldeídos não reagidos no conjugado de polissacarídeo sorotipo 19A : pro- teína de veículo resultando em um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae sorotipo 19A encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo.

Em uma modalidade adicional, o método para produzir um con- jugado imunogênico compreendendo polissacarídeo de Streptoeoceus pneumoniae sorotipo 19A encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo compreende (i) reagir polissacarídeo sorotipo 19A purificado com periodato de sódio resultando em um polissacarídeo sorotipo 19A ativado; (ii) ajustar o pH do polissacarídeo sorotipo 19A ativado para 6,5 + 0,2; (iii) 5 combinar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado com sucrose; (iv) combinar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado com uma proteína de veículo CRMi97 em uma proporção de 0,8:1; (v) coliofilizar o polissacarídeo sorotipo 19A ati- vado combinado e proteína de veículo; (vi) ressuspender o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo em DMSO; (vii) reagir 10 o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo com cianoborideto de sódio resultando em um conjugado de polissacarídeo soro- tipo 19A : proteína de veículo; e (viii) rematar aldeídos não reagidos no con- jugado de polissacarídeo sorotipo 19A : proteína de veículo com borideto de sódio resultando em um conjugado imunogênico compreendendo polissaca- 15 rídeo de Streptococcus pneumoniae sorotipo 19A encadeado de modo cova- lente a uma proteína de veículo.

Também são proporcionados métodos para produzir um conju- gado imunogênico compreendendo um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo no 20 qual o polissacarídeo compreende uma ligação fosfodiéster entre unidades de repetição. Em uma modalidade, o método compreende (i) reagir o polis- sacarídeo com um agente oxidante resultando em um polissacarídeo ativa- do; (ii) combinar o polissacarídeo ativado com uma proteína de veículo; (iii) coliofilizar o polissacarídeo ativado e proteína de veículo combinados; (iv) 25 ressuspender o polissacarídeo ativado e proteína de veículo combinados em DMSO; (v) reagir o polissacarídeo ativado e proteína de veículo combinados com um agente redutor resultando em um conjugado de polissacarídeo : pro- teína de veículo; e (vi) rematar aldeídos não reagidos no conjugado de polis- sacarídeo : proteína de veículo resultando em um conjugado de imunogênico 30 compreendendo polissacarídeo de Streptoeoceus pneumoniae encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo. Em modalidades adicionais de semelhantes métodos, o polissacarídeo compreendendo uma ligação fos- fodiéster entre unidades de repetição é polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae sorotipo 19A, 19F, 6A, ou 6B. Em uma modalidade adicional, a proteína de veículo é CRMi97.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 representa as alterações na taxa de doenças pneu-

mocócicas invasivas por sorotipo em crianças dos Estados Unidos <2 anos de idade a partir da linha basal (1998/1999) até 2001.

A figura 2 representa a distribuição de isolados pneumocócicos com resistência a penicilina (PCN) em crianças <5 anos de idade (1998).

A figura 3 representa as curvas de distribuição cumulativa reversa

(RCDC) de resultados de OPA pós-terceira dose da prova de D118-P16 Prevnar. DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Inclusão dos Sorotipos 4, 6B. 9V. 14. 18C, 19F, 23F de Prevnar

Dados de vigilância de doenças pneumocócicas invasivas entre 1995 e 1998 estimaram que os sete sorotipos Prevnar foram responsáveis por cerca de 82% das doenças pneumocócicas invasivas em crianças <2 anos de idade [5]. No Norte da Califórnia, o local da prova de eficácia, os sorotipos da Prevnar são responsáveis por 90% de todos os casos de doen- ças pneumocócicas invasivas IPD em bebês e crianças pequenas [10]. Des- de a introdução da vacina Prevnar em 2000, houve uma significativa redução nas taxas globais de doenças pneumocócicas invasivas devido a uma redu- ção na doença devida aos sorotipos da vacina [3,4]. Portanto, não há justifi- cativa no momento para remover quaisquer dos sorotipos de Prevnar da próxima geração de vacinas de conjugados pneumocócicos mas sim de adi- cionar sorotipos para obter cobertura mais ampla.

Inclusão dos Sorotipos 1. 3. 5 e 7F

Nos Estados Unidos, a taxa de doenças pneumocócicas invasi- vas causadas pelo sorotipo 1 em crianças abaixo da idade de 5 anos é <2%, cerca da mesma que para cada um dos tipos 3 e 7F [1,6]. Os sorotipos 1 e 5 30 sao responsáveis por taxas maiores de IPD em populações dos Estados U- nidos em alto risco para doença pneumocócica invasiva. Especificamente, o sorotipo 1 causa 3,5% das doenças pneumocócicas invasivas em crianças nativas do Alasca <2 anos de idade, e 18% em crianças de 2 a 4 anos de idade [11]. Tanto o sorotipo 1 quanto o sorotipo 5 causam significativamente doença em outras partes do mundo e em populações indígenas em países desenvolvidos [12,13,14].

5 O sorotipo 1 também pode ser associado com doença mais gra-

ve comparada com outros sorotipos pneumocócicos [15]. Esta observação se baseia na diferença nas taxas de identificação de caso entre os Estados Unidos e a Europa, e a diferença associada na prática médica. Globalmente, a incidência de doenças pneumocócicas invasivas é menor na Europa do que nos Estados Unidos. No entanto, a percentagem de doenças pneumo- cócicas invasivas causados pelo sorotipo 1 na Europa é desproporcional- mente maior do que nos Estados Unidos (6 a 7%, vs. 1 a 2%, respectiva- mente). Na Europa, são obtidas culturas de sangue predominantemente de crianças hospitalizadas. Nos Estados Unidos, é prática da rotina médica ob- ter culturas de sangue em um ambiente ambulatorial de crianças apresen- tando fever >39°C e contagens de leucócitos elevadas. Dada a diferença na prática médica, postulou-se que a menor percentagem de doenças causadas pelo sorotipo 1 nos Estados Unidos pode ser diluída pelas maiores taxas de outros sorotipos causando doença mais branda, ao passo que a maior per- centagem na Europa reflete doença mais grave. Além disso, estudos de se- roepidemiologia de crianças com complicações de pneumonia demonstram que o sorotipo 1 é representado desproporcionalmente [16,17,18]. Isto suge- re que a inclusão do sorotipo 1 pode reduzir a quantidade de doença pneu- mocócica grave bem como contribuir para uma redução total na doença pneumocócica invasiva.

A adição dos sorotipos 3 e 7F aumenta a cobertura contra doen- ça pneumocócica invasiva na maioria das áreas do mundo por aproximada- mente 3% a 7%, e na Ásia em torno de 9%. Portanto, uma vacina 11-valente cobriria 50% na Ásia e em torno de 80% das doenças pneumocócicas inva- 30 sivas em todas as outras regiões [1,2]. Estes sorotipos também são impor- tantes com respeito à cobertura contra otite média [19]. Em um estudo multi- nacional de sorotipos pneumocócicos causando otite média, Hausdorff et al. descobriram que o sorotipo 3 é o 8o isolado mais comum do fluido do ouvido médio global [20]. O sorotipo 3 é responsável por até 8,7% dos sorotipos pneumocócicos associados com a otite média. Portanto, a importância dos tipos 3 e 7F na otite média, bem como em doenças pneumocócicas invasi- vas, garante sua inclusão em uma vacina de conjugado pneumocócico.

No entanto, tentativas de produzir uma vacina de conjugado pneumocócico multivalente que apresente imunogenicidade significativa com respeito aos polissacarídeos do sorotipo 3 não têm tido êxito. Por exemplo, em um estudo da imunogenicidade e segurança de uma vacina de conjuga- 10 do pneumocócico de proteína D 11-valente (11-Pn-PD), não foi observado efeito de iniciador para o sorotipo 3 em bebês que tinham recebido três do- ses da vacina seguidas por uma dose de reforço ou da mesma vacina ou de uma vacina de polissacarídeos pneumocócicos (Nurkka et al. (2004) Ped. Inf. Dis. J., 23: 1008-1014). Em outro estudo, resultados da prova opsonofa- 15 gocítica (OPA) de bebês que tinham recebido doses de 11-Pn-PD não apre- sentaram reações de anticorpos para o sorotipo 3 em níveis comparáveis a outros sorotipos testados (Gatchalian et al., 17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Dis. (ESPID), Poster N2 4, P1A Poster Session 1, Istambul Turquia, Mar. 27, 2001). Em ainda outro estudo, o qual avaliou a eficácia de 20 uma 11-Pn-PD na prevenção de otite média aguda, a vacina não proporcionou proteção contra episódios causados pelo sorotipo 3 (Prymula et al. (2006) Lan- cet, 367: 740-748). Por conseguinte, uma vacina de conjugado pneumocócico compreendendo polissacarídeos capsulares do sorotipo 3 e capaz de provocar uma resposta imunogênica para polissacarídeos do sorotipo 3 proporciona um 25 aprimoramento significativo em relação ao estado da técnico existente. Inclusão dos Sorotipos 6A e 19A

a. Epidemioloaia dos Sorotipos 6A e 19A

Dados de vigilância na literatura sugerem que os sorotipos 6A e 19A são responsáveis por mais doença pneumocócica invasiva nos Estados Unidos em crianças <2 anos de idade do que os sorotipos 1, 3, 5, e 7F com- binados (figura 1) [1,5]. Além disso, estes sorotipos são comumente associados com resistência a antibiótico (figura 2) e têm um papel importante na otite média [6,19,20]. A capacidade da vacina Prevnar corrente para proteger contra doen- ça devido a 6A e 19A não está clara. O fundamento lógico para inclusão dos componentes 6A e 19A em uma vacina 13vPnC é discutido abaixo.

b. Respostas a 6Ae 19A Induzidas pelos Polissacarídeos 6Be 19F 5 As vacinas de polissacarídeos pneumocócicos não conjugados

licenciadas (para uso em pessoas com no mínimo dois anos de idade) conti- nham polissacarídeo capsular 6A ou 6B mas não ambos [21]. Dados da i- munogenicidade gerada por ocasião da formulação da vacina de polissaca- rídeos pneumocócicos 23-valente demonstraram que uma vacina 6B mono- 10 valente induziu anticorpo tanto para as cápsulas 6A quanto 6B. Os dados de vários experimentos avaliando respostas de IgG e de prova opsonofagocítica (OPA) em uma variedade de populações com vacinas de polissacarídeo livre e com conjugados pneumocócicos sugeriram que reações de IgG para 6A são induzidas por antígenos 6B, mas as reações são geralmente menores, e 15 a atividade da OPA com organismos 6A é diferente de com organismos 6B [22,23,24,25], Além disso, sujeitos respondendo com anticorpo 6B elevado podem ter pouca ou nenhuma atividade contra 6A.

Em contraste com a composição química dos polissacarídeos capsulares 6A e 6B onde existe um alto grau de similaridade, as cápsulas 20 19A e 19F são bastante diferentes devido à presença de duas cadeias late- rais adicionais no polissacarídeo 19A. Não de modo surpreendente, reações imunes medidas em voluntários humanos imunizados com vacina de polis- sacarídeo 19F mostraram que foram induzidas reações a 19F em 80% dos sujeitos, mas somene 20% dos sujeitos tiveram uma reação a 19A [26]. Do 25 mesmo modo também foram documentados baixos níveis de reações a OPA e IgG reativas cruzadas para o sorotipo 19A depois de imunização com o polissacarídeo 19F em experimentos com vacinas de conjugado [24,26].

Foram gerados dados internos sobre reações reativas cruzadas de OPA para 6A e 19A a partir do experimento de bridging 7vPnC (D118- P16) conduzido nos Estados Unidos em bebês (figura 3). Estes estudos es- tão consistentes nos achados de outros, e demonstram indução de anticorpo funcional reativo cruzado para polissacarídeo 6A depois de imunização com polissacarídeo 6B, embora em um nível menor, e muito pouco anticorpo fun- cional para 19A depois de imunização com 19F.

Impacto de Imunização contra 6B e 19F sobre 6Ae 19A em ModeIosAnimais Modelos animais foram usados para avaliar o potencial para pro- teção cruzada com imunização contra polissacarídeos. Em um modelo de otite média desenvolvida por Giebink et al., chinchilas foram imunizados com uma vacina de conjugado tetravalente de proteína da membrana externa (OMP) de polissacarídeos (contendo os sacarídeos 6B, 14, 19F, 23F) ou placebo [27]. Nesta prova pareceu haver alguma proteção cruzada para 6A; no entanto esta não atingiu importância estatística e o nível de proteção foi menor do que com 6B contra otite média. Neste mesmo modelo houve 100% de proteção contra otite média por 19F, mas somente 17% de proteção con- tra otite média por 19A.

Saeland et al. usaram soros de bebês imunizados com uma va- cina de conjugado pneumocócico 8-valente e toxóide tetânico (contendo 6B e 19F) para imunizar passivamente camundongos antes de um estímulo in- tranasal com organismos 6A, em um modelo de infecção pulmonar [28]. Das 59 amostras de soro, 53% protegeram os camundongos contra bacteremia com 6B e 37% protected contra 6A. A camundongos imunizados passiva- mente com soros de bebês imunizados com quatro doses de uma vacina de conjugado pneumocócico 11-valente (contendo 19F conjugado a toxóide tetânico) foi administrados um estímulo intranasal com organismos 19A no mesmo modelo [29]. De 100 camundongos imunizados passivamente e em seguida estimulados, 60 camundongos não tiveram organismos 19A detec- tados em tecido pulmonar, ao passo que foram identificados organismos em todos os camundongos aos quais foi administrado placebo de salina. No en- tanto, a imunização passiva não protegeu contra estímulo com organismos 19F neste modelo; portanto, a relevância do modelo para o sorogropo 19 é questionável. Em geral estes modelos proporcionam evidência de algum im- pacto biológico de imunização de 6B sobre organismos 6A embora o efeito sobre o sorotipo heterólogo não seja tão grande quanto o observado com o sorotipo homólogo. O impacto de imunização com 19F sobre organismos 19Α não é bem entendido a partir destes modelos.

Impacto de Imunização de Conjugado de Polissacarídeos 6B e 19F sobre Doenca por 6A e 19A em Provas de Eficácia / Efetividade

O número de casos de doença devido aos sorotipos 6B, 6A, 19F 5 e 19A em provas da eficácia de 7vPnC e 9vPnC (7vPnC mais sorotipos 1 e 5) é observado na Tabela 1 [30,10,31]. Os números de casos de doença in- vasiva são pequenos demais para permitir que quaisquer conclusões sejam deduzidas para os sorotipos 6A e 19A. No entanto, a prova de otite média finlandesa (Finnish Otitis Media) gerou um grande número de isolados 10 pneumocócicos [32]. Na análise segundo o protocolo de 7vPnC foi 84% (95% Cl 62%, 93%) eficaz contra otite média devido ao sorotipo 6B e 57% (95% Cl 24%, 76%) eficaz contra otite média devida ao sorotipo 6A (Tabela 1). Em contraste, não foi demonstrada eficácia sorotipo-específico com a 7vPnC para otite média devida ou a 19F ou a 19A.

Tabela 1. Casos de Doença Pneumocócica Devida aos Sorotipos 6B, 6A, 19F, e 19A em Provas de Eficácia com as Vacinas 7vPnC e 9vPnC

6B 6A 19F 19A PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. Prova de Eficácia de Kai¬ 1 7 0 1 2* 13 0 1 ser - 7vPnC (ITT) Prova de Eficácia de Na- 0 5 1 0 1 1 1 0 vajo - 7vPnC (ITT) Prova de Eficácia da Áfri¬ 1 2 1 0 0 1 3 1 ca do Sul - 9vPnC HIV (-) (ITT) Prova de Eficácia da Áfri¬ 1 7 3 10 2 3 2 3 ca do Sul - 9vPnC HIV (+) (ITT) Prova de Otite Média 9* 56 19* 45 43 58 17 26 Finlandesa - 7vPnC (PP) * Eficácia estatisticamente significativa demonstrada a partir das referências 30, 10 e 33, e comunicações pessoais Contr = controle

ITT = análise da população alvo do tratamento (N.T.: com intenção de tratar) PP = análise segundo o protocolo 5 Dados de vigilância de doenças pneumocócicas invasivas pós-

comercialização também estão disponíveis a partir de uma prova de caso- controle conduzida pelos Centros para Controle de Doença para avaliar a eficácia de Prevnar [33]. Casos de doença pneumocócica invasiva ocorrendo em criança de 3 a 23 meses de idade foram identificados nos laboratórios de 10 vigilância e combinados com três casos controle por idade e código postal (z/p code). Depois de obter consentimento, foi obtido o histórico médico e de imunização (os sujeitos foram considerados imunizados se tivessem recebido no mínimo uma dose de Prevnar) dos pais e dos provedores médicos para ca- sos e controles. Os resultados preliminares foram apresentados no congresso 15 ICAAC de 2003 e um resumo dos achados para doença por 6B, 19F, 19A e 6A é apresentada na Tabela 2. Estes dados indicam que Prevnar tem a ca- pacidade de prevenir doença devido a 6A, embora em um nível que pode ser um tanto menor do que doença pelo sorotipo 6B. Estes dados também indicam que é limitada a proteção cruzada para doença invasiva devido ao 19A.

Tabela 2. Resultados preliminares de uma Prova de Controle de Caso Reali- zada pelo CDC (apresentada no ICAAC, 2003)

Sorotipo Séries Informativas, n VE* (95% Cl) Tipo de Vacina, Todos 115 94 (87, 97) Relacionado com a Vacina, Todos 36 70 (38, 86) Tipo Não-Vacina, Todos 43 -4 (-106, 48) 6B 27 94 (72, 99) 19F 19 73(16, 92) 6A 15 87 (53, 97) 19A 16 40 (-87, 80) *Eficácia da vacina comparando vacinados (>1 dose) vs. não vacinados, e ajustada para condições subjacentes Referência 40 e comunicação pessoal / confidencial

Uma análise publicada [3] do uso de Prevnar também indicou que os sorotipos 6B e 19F conferiram uma redução moderada em doenças pneumocócicas invasivas causadas pelos sorotipos 6A e 19A entre crianças 5 abaixo de dois anos de idade (Tabela 1 in [3]). As taxas de doença entre adul- tos não imunizados causada pelos sorotipos 6A, 9A, 9L, 9N, 18A, 18B, 18F, 19A, 19B, 19C, 23A e 23B ("todos os sorotipos relacionados com a vacina") foram um tanto reduzidas (Tabela 2 em [3]). Estes dados estabelecem que a imunidade da população do uso de Prevnar em crianças abaixo de dois anos 10 de idade foi modesta para os sorotipos 6A e 19A, e proporcionam uma base para a inclusão dos sorotipos 6A e 19A na vacina 13vPnC desta invenção. Conclusão para adicão de 6Ae 19A

Os dados de vigilância pós-comercialização e os resultados do estudo de caso-controle mencionados na figura 1 e Tabela 2 com a vacina 15 7vPnC sugerem que, consistente nas outras informações sobre reações i- munes e performance nos modelos animais descritos acima, pode haver al- guma proteção cruzada contra doença por 6A, mas em uma menor extensão do que para doença por 6B. Além disso, parece que a proteção contra 19A é limitada. Portanto, uma vacina 13vPnC contendo os sorotipos 6A e 19A pro- 20 porciona cobertura que não é dependente das limitações da proteção cruza- da do sorogrupo pelos sorotipos 6B e 19F.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma compo- sição imunogênica multivalente compreendendo 13 conjugados de polissa- carídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados contém um po- 25 lissacarídeo capsular diferente conjugado a uma proteína de veículo, e em que os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumo- niae, junto com um veículo fisiologicamente aceitável. Uma proteína de veí- culo semelhante é o toxóide diftérico designado CRM197. A composição imu- 30 nogênica pode compreender adicionalmente um adjuvante, tal como um ad- juvante à base de alumínio, tal como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Polissacarídeos capsulares são preparados por técnicas de roti- na de conhecimento dos versados na arte. Na presente invenção, polissaca- rídeos capsulares são preparados a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae. Estes con- 5 jugados de pneumocócicos são preparados por processos isolados e formu- lados em uma formulação de dosagem única. Por exemplo, em uma modali- dade, cada sorotipo de polissacarídeos pneumocócicos é cultivado em um meio à base de soja. Os polissacarídeos individuais são em seguida purifi- cados através de centrifugação, precipitação, ultrafiltração, e cromatografia 10 de coluna. Os polissacarídeos purificados são quimicamente ativados para produzir os sacarídeos capazes de reagir com a proteína de veículo.

Uma vez ativado, cada polissacarídeo capsular é conjugado se- paradamente a uma proteína de veículo para formar um glicoconjugado. Em uma modalidade, cada polissacarídeo capsular é conjugado à mesma prote- ína de veículo. Nesta modalidade, a conjugação é realizada por aminação redutiva.

A ativação química dos polissacarídeos e subsequente conjugação à proteína de veículo são obtidas por meios convencionais. Vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nes 4.673.574 e 4.902.506 [34,35],

Proteínas de veículo são preferencialmente proteínas que são

não-tóxicas e não-reatogênicas e obteníveis em quantidade e pureza sufici- ente. Proteínas de veículo devem ser suscetíveis a procedimentos de conju- gação padrão. Em uma modalidade particular da presente invenção, CRMi97 é usado como a proteína de veículo.

CRMi97 (Wyeth, Sanford, NC) é uma variante não-tóxica (isto é,

toxóide) de toxina diftérica isolada de culturas de Corynebaeterium díphtheria cepa C7 (β197) cultivadas em ácidos casamino e meio à base de extrato de levedura. CRMig7 é purificado através de ultrafiltração, precipitação de sulfa- to de amônio, e cromatografia de permuta iônica. Alternativamente, CRM197 30 é preparado de modo recombinante de acordo com a Patente dos Estados Unidos N2 5.614.382, a qual é por este incorporada por meio de referência. Outros toxóides diftéricos também são adequados para uso como proteínas de veículo.

Outras proteínas de veículo adequadas incluem toxinas bacteria- nas inativadas tais como toxóide tetânico, toxóide pertussis, toxóide do cholera (por exemplo, conforme descrito no Requerimento de Patente Internacional Ns 5 W02004/083251 [38]), E. coli LT, E. coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Também podem ser usadas proteínas da membrana externa bac- teriana tais como complexo c da membrana externa (OMPC), porinas, proteí- nas de ligação de transferrina, pneumolisina, proteína A da superfície pneu- mocócica (PspA), proteína adesina pneumocócica (PsaA), C5a peptidase de 10 estreptococos do Grupo A ou Grupo B, ou proteína D de Haemophilus influ- enzae. Outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de keyhole Iimpet (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou proteína purificada derivada de tuberculina (PPD) também podem ser usadas como proteínas de veículo.

Depois de conjugação do polissacarídeo capsular à proteína de 15 veículo, os conjugados de polissacarídeo-proteína são purificados (enrique- cidos com respeito à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas. Estas técnicas incluem operações de con- centração / diafiltração, precipitação / elutriação, cromatografia de coluna, e filtração de profundidade. Vide os exemplos abaixo.

Depois dos glicoconjugados individuais serem purificados, são

combinados para formular a composição imunogênica da presente invenção, a qual pode ser usada como uma vacina. Formulação da composição imu- nogênica da presente invenção pode ser realizada usando métodos conhe- cidos na arte. Por exemplo, os 13 conjugados pneumocócicos individuais 25 podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para pre- parar a composição. Exemplos de semelhantes veículos incluem, mas não estão limitados a, água, salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e soluções de dextrose.

Em algumas modalidades, a composição imunogênica compre- enderá um ou mais adjuvantes. Conforme definido aqui, neste requerimento de patente, um "adjuvante" é uma substância que serve para reforçar a imu- nogenicidade de uma composição imunogênica desta invenção. Deste mo- do, adjuvantes são frequentemente administrados para reforçar a reação imune e são de conhecimento geral do técnico versado. Adjuvantes adequados para reforçar a eficácia da composição incluem, mas não estão limitados a:

(1) sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, e etc.;

(2) formulações de emulsão de óleo-em-água (com ou sem ou- tros agentes imunoestimulantes específicos tais como peptídeos muramil (definidos abaixo) ou componentes da parede celular bacteriana), tais como, por exemplo,

(a) MF59 (requerimento de patente internacional publicado PCT

Ns WO 90/14837), contendo 5% de Squalene, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE (vide a- baixo, embora não requerido)) formuladas em partículas submicron usando um microfluidificador tal como microfluidificador Modelo 11OY (Microfiuidics, Newton, MA),

(b) SAF, contendo 10% de Squalene, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado com pluronic, e thr-MDP (vide abaixo) ou micro- fluidificado em uma emulsão submicron ou turbilhonado para gerar uma e- mulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante Ribi® (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) con-

tendo 2% de Squalene, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana entre o grupo consistindo em monofosforilipídeo A 3-O-deailado (MPL®) descrito na Patente dos Estados Unidos Na 4.912.094 (Corixa), trealose dimicolato (TDM), e esqueleto da parede celualr (CWS), preferencialmente MPL + CWS (Detox®);

(3) adjuvantes de saponina, tais como Quil A ou STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente dos Estados Unidos N2 5.057.540) podem ser usados ou partículas geradas a partir dos mesmos tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes);

(4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos sintéticos de lipí-

deo A tais como compostos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), ou derivados ou análogos dos mesmos, os quais estão disponíveis na Cori- xa, e os quais são descritos na Patente dos Estados Unidos N2 6.113.918; um AGP semelhante é 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2- Deóxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranosídeo, o qual também é 5 conhecido como 529 (conhecido anteriormente como RC529), o qual é for- mulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável, polinucleo- tídeos sintéticos tais como oligonucleotídeos contendo um ou mais motivos CpG (Patente dos Estados Unidos N2 6.207.646);

(5) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, e etc.), interferons (por exemplo, gama

interferon), fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos (GM- CSF), fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimulatórias B7-1 e B7-2, e etc.;

(6) mutantes detoxificados de uma toxina ADP-ribosilante bacte- riana tal como uma toxina do cólera (CT) quer em uma forma selvagem ou

mutante, por exemplo, onde o ácido glutâmico na posição de aminoácido 29 é substituído por outro aminoácido, preferencialmente uma histidina, de a- cordo com o Requerimento de Patente Internacional publicado N2 WO 00/18434 (vide também o Requerimento de Patente Internacional N2 WO 20 02/098368 e o Requerimento de Patente Internacional N2 WO 02/098369), uma toxina pertussis (PT), ou uma toxina termo lábil de E. coli (LT), particu- larmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (vide, por exemplo, o Re- querimento de Patente Internacional N2 WO 93/13302 e o Requerimento de Patente Internacional N2 WO 92/19265); e 25 (7) outras substâncias que agem como agentes imunoestimulan-

tes para reforçar a eficácia da composição.

Peptídeos muramil incluem, mas não estão limitados a, N-acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2- (1’-2’ dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE), e etc.

As formulações de vacina da presente invenção podem ser usa-

das para proteger ou tratar um humano suscetível a infecção pneumocócica, por meio de administração da vacina através de uma via sistêmica ou muco- sa. Estas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscu- lar, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou através de administração mucosa aos tratos oral / alimentar, respiratório ou genitourinário. Em uma modalidade, administração intranasal é usada para o tratamento de pneu- 5 monia ou otite média (uma vez que o transporte nasofaringeano de pneumo- cocos pode ser prevenido de modo mais eficaz, deste modo atenuando a infecção em seu estágio inicial).

A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma reação imunoprotetora sem efeitos ad- versos significativos. A quantidade referida pode variar dependendo do soro- tipo pneumocócico. Geralmente, cada dose compreenderá 0,1 a 100 pg de polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 pg, e mais particularmente 1 a 5 pg.

Quantidades ótimas de componentes para uma vacina particular podem ser determinadas por estudos de rotina envolvendo observação de reações imunes apropriadas em sujeitos. Depois de uma vacinação inicial, os sujeitos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequa- damente espaçadas.

Em uma modalidade particular da presente invenção, a vacina 13vPnC é uma formulação líquida esteril de polissacarídeos capsulares 20 pneumocócicos dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e 23F individualmente conjugados a CRMi97. Cada dose de 0,5 mL é formula- da para conter: 2 pg de cada sacarídeo, exceto por 6B a 4 pg; aproximada- mente 29 pg de proteína de veículo CRMi97; 0,125 mg adjuvante de alumínio elemental (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão de cloreto de sódio e 25 succinato de sódio como excipientes. O líquido é enchido em seringas de dose única sem um preservante. Depois de agitar, a vacina é uma suspen- são branca e homogênea pronta para administração intramuscular.

A escolha do nível de dose para a vacina 13vPnC é similar à vacina 7vPnC comercializada (Prevnar). O nível de dose de 2 μg de sacarí- deo foi selecionado para todos os sorotipos, exceto para 6B, o qual é a 4 pg por dose. A vacina 7vPnC apresentou desejável segurança, imunogenicida- de, e eficácia contra doença pneumocócica invasiva no nível de dose de 2 pg de sacarídeo para os sorotipos 4, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, e na dose de 4 pg para 6B.

O esquema de imunização pode seguir o designado para a vaci- na 7vPnC. Por exemplo, o esquema de rotina para bebês e crianças come- 5 çando a andar contra doença invasiva causada pelo S. pneumoniae devido aos sorotipos incluídos na vacina 13vPnC é2,4, 6e12a15 meses de ida- de. As composições desta invenção também são adequadas para uso com crianças maiores, adolescentes e adultos.

As composições desta invenção podem incluir adicionalmente um ou mais antígenos adicionais para uso contra otite média causada por infecção com outras bactérias. As bactérias referidas incluem Haemophilus influenza não tipável, Moraxella catarrhalis (conhecida anteriormente como Branhamella catarrhalis) e Alloiococcus otitidis.

Exemplos de antígenos de Haemophilus influenzae não tipávei 15 adequados para inclusão incluem a proteína P4, também conhecida como proteína "e" (Patente dos Estados Unidos N- 5.601.831; o Requerimento de Patente Internacional Nq W003/078453), a proteína P6, também conhecida como a proteína PAL ou a proteína PBOMP-1 (Patente dos Estados Unidos Ns 5.110.908; Requerimento de Patente Internacional Nq W00100790), a 20 proteína P5 (a Reemissão de Patente dos Estados Unidos N- 37.741), a pro- teína de adesão e de penetração de Haemophilus (Patentes dos Estados Unidos N2s 6.245.337 e 6.676.948), a proteína LKP tip adesina (Patente dos Estados Unidos N2 5.643.725) e a proteína NucA (Patente dos Estados Uni- dos N2 6.221.365).

Exemplos de antígenos de Moraxella catarrhalis adequados para

inclusão incluem a proteína UspA2 (Patentes dos Estados Unidos N2s 5.552.146, 6.310.190), a proteína CD (Patente dos Estados Unidos N2 5.725.862), a proteína E (Patente dos Estados Unidos N2 5.948.412) e a pro- teína da membrana externa de 74 quilodalton (Patente dos Estados Unidos N2 6.899.885).

Exemplos de antígenos de Alloiococcus otitidis adequados para inclusão incluem os identificados no Requerimento de Patente Internacional N2 W003/048304.

As composições desta invenção também podem incluir uma ou mais proteínas de Streptococcus pneumoniae. Exemplos de proteínas de Streptococcus pneumoniae adequadas para inclusão incluem as identifica- 5 das no Requerimento de Patente Internacional N2 W002/083855, bem como as descritas no Requerimento de Patente Internacional Ns W002/053761.

As composições desta invenção podem incluir adicionalmente uma ou mais proteínas de Neisseria meningitidis tipo B. Exemplos de proteínas de Neisseria meningitidis tipo B adequadas para inclusão incluem as identificadas nos Requerimentos de Patente Internacional N2s W003/063766, W02004/ 094596, W001 /85772, W002/16612 e W001 /87939.

Processo de Coliofilizaeão e Conjugação para Polissacarídeo de S. oneu- moniae Sorotipo 19A

O sorotipo 19A é muito mais propenso a degradação térmica do que outros sorotipos de S. pneumoniae devido à presença de ligações fosfo- diéster entre suas subunidades. De modo a melhorar a eficiência da conju- gação e a controlar a estabilidade do polissacarídeo sorotipo 19A inerente- mente lábil, um processo de coliofilização e conjugação na presença de di- metil sulfóxido (DMSO) é usado na conjugação do polissacarídeo sorotipo 19A à proteína de veículo CRMi97. Este processo proporciona características de conjugado aprimoradas em termos de tamanho molecular e da percenta- gem de sacarídeo livre para sorotipo 19A comparada ao uso de processos de conjugação envolvendo discreta liofilização de polissacarídeos e proteí- nas de veículo em DMSO ou processos envolvendo coliofilização aquosa de polissacarídeos e proteínas de veículo sem DMSO.

Conforme descrito em mais detalhes no Exemplo 17 abaixo, a conjugação do polissacarídeo sorotipo 19A à proteína de veículo, CRMi97, é um processo de duas etapas de reação. A primeira etapa envolve oxidação de periodato (ativação) para gerar grupamentos aldeído reativos sobre o po- 30 lissacarídeo. O polissacarídeo ativado é então purificado por ultrafiltração para remover fragmentos de sacarídeo e subprodutos da reação de molécu- la pequena. O polissacarídeo ativado e CRMi97 são então combinados e co- Iiofilizados com sucrose como um crioprotetor. A etapa de conjugação é rea- lizada em DMSO através de um mecanismo de aminação redutiva na pre- sença de cianoboro-hidreto de sódio. Grupamentos aldeído não reagidos são reduzidos (rematados) pela adição de boro-hidreto de sódio. O conjuga- 5 do é então purificado para remover CRM197 não reagido e fragmentos de sacarídeo (por exemplo, por diafiltração versus tampão de fosfato seguido por salina tamponada), dando um concentrado da massa final do glicoconju- gado em salina tamponada.

Embora uma proteína de veículo preferencial dentro do processo descrito acima seja a toxina diftérica mutada CRM197, outras proteínas de veículo podem ser usadas para conjugação com o polissacarídeo sorotipo 19A dentro dos presentes métodos. As proteínas de veículo são escolhidas para aumentar a imunogenicidade do polissacarídeo sorotipo 19A ligado e/ou produzir anticorpos contra a proteína de veículo os quais são benéficos diagnosticamente, analitica e/ou terapeuticamente. Ligação covalente de uma molécula antigênica (por exemplo, um polissacarídeo) a um veículo confere reforço da imunogenicidade e dependência de células T (Pozsgay et al. (1999) PNAS, 96: 5194-97; Lee et al. (1976) J. Immunol., 116: 1711-18; Dintzis et al. (1976) PNAS, 73: 3671-75). Conforme descrito aqui, neste re- querimento de patente, proteínas de veículo úteis incluem toxinas bacteria- nas inativadas tais como toxóide tetânico, toxóide pertussis, toxóide do cóle- ra (por exemplo, conforme descrito no Requerimento de Patente Internacio- nal N- W02004/083251), E. coli LT, E. coli ST, e exotoxina A de Pseudomo- nas aeruginosa. Proteínas da membrana externa bacteriana tais como com- plexo c da membrana externa, porinas, proteínas de ligação de transferrina, pneumolisina, proteína A da superfície pneumocóccica, proteína adesina pneumocóccica, C5a peptidase de streptococcus Grupo A ou Grupo B, ou proteína D de Haemophilus influenzae, também podem ser usadas. Outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de keyhole limpet, albumina sérica bovina, ou derivado de proteína purificada de tuberculina também po- dem ser usadas como proteínas de veículo.

Embora este processo de coliofilização e conjugação em DMSO seja descrita para uso com o polissacarídeo sorotipo 19A, este processo também pode ser usado para sorotipos que sejam estruturalmente similares ao sorotipo 19A, tais como 6A, 6B, e 19F os quais também contêm ligações fosfodiéster entre suas unidades de repetição.

5 A descoberta acima descreve de modo geral a presente inven-

ção. Um entendimento mais completo pode ser obtido por referência aos seguintes exemplos específicos. Estes exemplos são descritos somente pa- ra os fins de ilustração e não se pretende que limitem o âmbito da invenção. EXEMPLOS Exemplo 1

Preparação de Polissacarídeo Capsular de S. Pneumoniae Sorotipo 1 Preparação de Bancos de Célular Mestres e de Trabalho

O sorotipo 1 de S. pneumoniae foi obtido da ATCC1 American Type Culture Collection, cepa 6301. Várias gerações de estoques de semen- tes foram criadas de modo a expandir a cepa e remover componentes de origem animal (gerações F1, F2, e F3). Foram produzidas duas gerações adicionais de estoques de sementes. A primeira geração adicional foi prepa- rada a partir de um frasco de F3, e a geração subsequente foi preparada a partir de um frasco da primeira geração adicional. Frascos de semente foram armazenados congelados (<-70°C) com glicerol sintético como um criopre- servante. Além de frascos congelados, frascos Iiofilizados foram preparados para a geração F4. Para a preparação do banco de células, todas as cultu- ras foram cultivadas em um meio à base de soja. Antes de congelar, as célu- las foram concentradas por centrifugação, meio gasto foi removido, e péletes celulares foram ressuspendidos em meio fresco contendo um criopreservan- te, tal como glicerol sintético.

Fermentação e Coleta

Culturas do banco de células de trabahho foram usadas para inocular frascos de semente contendo um meio à base de soja. Os frascos foram incubados a 36°C ± 2° C sem agitação até terem sido satisfeitos os requisitos de crescimento. Um frasco de sementes foi usado para inocular um fermentador de semente contendo meio à base de soja. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com solução estéril de carbonato de sódio. Depois de ter sido atingida a densidade ótica alvo, o fermentador de semente foi usado para inocular o fermentador da produção contendo meio à base de soja. O pH foi mantido com solução estéril de carbonato de sódio. A fermentação foi 5 terminada depois de cessar o crescimento ou quando foi atingido o volume de trabalho do fermentador. Uma quantidade apropriada de sódio deoxicola- to estéril a 12% foi adicionada à cultura para Iisar as células bacterianas e liberar polissacarídeo associado a células. Depois de lisar, os conteúdos do fermentador foram resfriados. O pH do caldo de cultura Iisado foi ajustado 10 para aproximadamente pH 6,6 com ácido acético. O Iisado foi clarificado por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtração de profundidade e mi- crofiltração a 0,45 pm.

Em um processo alternativo, o pH da fermentação de cerca de

7,0 foi mantido com NaOH a 3 N. Depois de ter sido atingida a densidade ótica alvo, o fermentador de semente foi usado para inocular o fermentador da produção contendo meio à base de soja. O pH foi mantido com NaOH a 3 N. A fermentação foi terminada depois de cessar o crescimento ou quando foi atingido o volume de trabalho do fermentador. Uma quantidade apropria- da de sódio deoxicolato estéril a 12% foi adicionada à cultura para obter uma concentração a 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e liberar polissacarídeo associado às células. Depois da lisar, os conteúdos do fer- mentador foram mantidos, com agitação, por um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas em uma temperatura entre 7oC e 13°C, para assegurar que tives- se ocorrido Iise celular completa e liberação de polissacarídeo. Agitação du- rante este período de retenção evitou que o sedimento do Iisado assentasse sobre as paredes do fermentador e sonda de pH, deste modo permitindo que fosse mantida a integridade da sonda de pH. Em seguida, o pH do caldo de cultura Iisada foi ajustado para aproximadamente pH 5,0 com 50% de ácido acético. Depois de um tempo de retenção sem agitação, por um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas em uma temperatura entre 15°C e 25°C, uma porção significativa das proteínas previamente solúveis desapareceu da so- lução como um precipitado sólido com pouca perda ou degradação do polis- sacarídeo, o qual permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi em seguida clarificada por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtra- ção de profundidade e microfiltração a 0,45 μιτι.

Purificação

A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu em vá-

rias operações de concentração / diafiltração, precipitação / elutriação, cro- matografia de coluna, e etapas de filtração de profundidade. Todos os pro- cedimentos foram realizados em temperatura ambiente a menos que especi- ficado de modo diverso.

Caldo clarificado das culturas do fermentador de S. pneumoniae

sorotipo 1 foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de 100 kDa de MWCO (corte de peso molecular em quilodalton). Foi realizada diafiltração usando tampão de fosfato de sódio em pH neutro. Diafiltração removeu os compo- nentes médios de baixo peso molecular dos biopolímeros de maior peso mo- Ieculartais como ácido nucleico, proteína e polissacarídeo.

O polissacarídeo foi precipitado da solução concentrada e diafil- trada adicionando brometo de hexadeciltrimetil amônio (HB) de uma solução de matéria-prima para dar uma concentração final de 1% de brometo de he- xadeciltrimetil amônio (em peso / vol). O precipitado de polissacarídeo / bro- 20 meto de hexadeciltrimetil amônio foi capturado sobre um filtro de profundida- de e o filtrado foi descartado. O precipitado de polissacarídeo foi ressolubili- zado e elutriado recirculando uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo precipitado. Os filtros foram em seguida en- xaguadas com solução adicional de cloreto de sódio.

Iodeto de sódio (NaI) foi adicionado à solução de polissacarídeo

de uma solução de Nal de matéria-prima para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar brometo de hexadeciltrimetil amônio. O precipitado foi removido por filtração de profundidade. O filtrado contém o polissacarídeo alvo. O vaso de precipitação e o filtro foram enxaguados com uma solução 30 de NaCI/Nal e o enxague foi combinado com a solução de polissacarídeo parcialmente purificada. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi então filtrado através de um filtro de 0,2 μιτι. A solução de polissacarídeo foi concentrada sobre um ultrafiltro de 30 kDa de MWCO e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio.

A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi adicio- nalmente purificada por filtração através de um filtro de profundidade im- 5 pregnado com carbono ativado. Depois de filtração, o filtro de carbono foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O enxague é combinado com a solução de polissacarídeo, a qual é então filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada sobre um ultrafiltro de 30 kDa de MWCO e ajustada com um tampão de fosfato de sódio a 1 M para atingir uma concentração final de 0,025 M de fosfato de sódio. O pH foi checado e ajustado para 7,0 ± 0,2.

A coluna de hidroxiapatita cerâmica (HA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutivi- 15 dade apropriada (<15 pS). A solução de polissacarídeo foi em seguida car- regada sobre a coluna. Sob estas condições, impurezas ligaram à resina e o polissacarídeo foi recuperado no fluxo direto da coluna. A solução de polis- sacarídeo foi filtrada através de filtros inline de 0,2 pm localizados antes e depois da coluna.

A solução de polissacarídeo foi concentrada usando um filtro de

30 kDa de MWCO. O concentrado foi em seguida diafiltrado com água para injeção (WFI, Water for Injection).

A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 pm para dentro de frascos de polipropileno. Amos- tras foram removidas para experimentação da liberação e o polissacarídeo purificado foi armazenado congelado a -25° ± 5°C.

Caracterização

Os dados de 1H-RMN foram consistentes com a estrutura quí- mica pela atribuição de sinais atribuídos aos prótons da molécula de polissa- carídeo. O espectro de 1H-RMN apresentou uma série de sinais bem resol- vidos (prótons do grupamento metila) para a quantificação do grupamento funcional O-acetil no polissacarídeo. A identidade do polissacarídeo monovalente foi confirmada por imunoeletroforese contracorrente usando anti-soros específicos.

Cromatografia de filtração por gel de alta performance acoplada com detectores do índice refrativo e de dispersão da Iuz de laser multiângulo 5 (MALLS) foi usada em combinação com a concentração da amostra para calcular o peso molecular.

Meio de cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B) foi usado para traçar o perfil da distribuição de peso molecular relativo do polissacarídeo. Exemplo 2

Preparação de Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Sorotipo 1 - CRMip7 Ativação e Conjugação

Recipientes de polissacarídeo purificado foram degelados e combinados em um recipiente de reação. Ao recipiente, carbonato de sódio a 0,2 M, pH 9,0 foi adicionado para deacetilação parcial (hidrólise) por 3 ho- 15 ras a 50°C. A reação foi resfriada até 20°C e foi realizada neutralização por ácido acético a 0,2 M. Oxidação na presença de periodato de sódio foi reali- zada por incubação a 2 a 8°C, e a mistura foi agitada por 15 a 21 horas.

A mistura da reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com NaCI a 0,9% usando uma membrana de 30 K de MWCO. O retentado foi filtrado a 0,2 pm. O sacarídeo ativado foi enchido em frascos de Iiofiliza- ção de vidro de 100 mL e congelado com revestimento a -75°C e liofilizado.

"Congelamento com revestimento" é um método para preparar a mostrasx para liofilização (secagem por congelamento). Os frascos são au- tomaticamente girados por rolos acionados a motor em um lote refrigerado 25 contendo álcool ou qualquer outro fluido apropriado. Uma camada delgada de produto é congelada uniformemente em torno do "revestimento" ("sheir) interior de um frasco, permitindo que um maior volume de material seja pro- cessado com segurança durante cada rodada de secagem por congelamen- to. Estas unidades refrigeradas automáticas proporcionam um meio simples 30 e eficaz para pré-conger muitos frascos de uma vez, produzindo os revesti- mentos desejados internos, e proporcionando área superficial suficiente para secagem por congelamento eficaz. Frascos de material Iiofilizado foram trazidos até a temperatura ambiente e ressuspendidos em solução de CRMig7 em uma proporção de sacarídeo / proteína de 2:1. À mistura de sacarídeo / proteína foi adicionado tampão de fosfato de sódio a 1 M para uma força iônica final de 0,2 M e um 5 pH de 7,5, em seguida cianoboro-hidreto de sódio foi adicionado. A reação foi incubada a 23°C por 18 horas, sedguida por uma segunda incubação a 37°C por 72 horas. Depois das incubações em cianoboro-hidreto, a mistura da reação foi diluída com salina fria seguida pela adição de carbonato de sódio a 1 M para ajustar a mistura da reação para pH 9,0. Aldeídos não rea- 10 gidos foram extintos por adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23°C por 3 a 6 horas.

A mistura da reação foi diluída 2 vezes com salina e transferida através de um pré-filtro de 0,45 a 5 pm para dentro de um vaso de retentado. A mistura da reação é diafiltrada 30x com tampão de fosfato a 0,15 M, pH 6, e 20x com salina. O retentado foi filtrado através de um filtro a 0,2 pm.

A solução do conjugado foi diluída até um alvo de 0,5 mg/mL em salina a 0,9%, e em seguida filtrada estéril para dentro de recipientes de concentrado de massa final (FBC) em uma coifa Class 100. O conjugado foi armazenado a 2 a 8°C.

Caracterização

Meio de cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B) foi usa- do para traçar o perfil da distribuição de tamanho molecular relativo do con- jugado.

A identidade do conjugado foi confirmada pela prova de slot blot usando antissoros específicos.

As concentrações de sacarídeos e de proteínas foram determi- nadas pelas provas de ácido urônico e de Lowry, respectivamente. A propor- ção de sacarídeo para proteína no complexo de conjugado ligado de modo covalente foi obtida pelo cálculo:

pg/ml_ de sacarídeo

Proporção =-----------------------

pg/mL de proteína O teor de O-acetil foi medido pelo método de Hestrin (Hestrin et. al., J. Biol. Chem. 1949, 180, p. 249). A proporção da concentração de O-acetil para concentração de sacarídeo total deu pmols de O-acetil por mg de saca- rídeo.

5 Exemplo 3

Preparação de Polissacarídeo Capsular de S. Pneumoniae Sorotipo 3 Preparação de Bancos de Células Mestres e de Trabalho

S. pneumoniae sorotipo 3 foi obtido do Dr. Robert Austrian, Uni- versity of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania. Para preparação do sis- tema de banco de células, vide o Exemplo 1.

Fermentação e Coleta

Culturas do banco de células de trabalho foram usadas para ino- cular frascos de sementes contendo meio à base de soja. Os frascos foram incubados a 36°C ± 2o C sem agitação até terem sido satisfeitos os requisi- 15 tos de crescimento. Um frasco de sementes foi usado para inocular um fer- mentador de semente contendo meio à base de soja. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com solução estéril de carbonato de sódio. Depois de ter sido atingida a densidade ótica alvo, o fermentador de semente foi usado para inocular um fermentador intermediário de semente. Depois de ter sido atingi- 20 da a densidade ótica alvo, o fermentador intermediário de semente foi usado para inocular o fermentador da produção. O pH foi mantido com solução es- téril de carbonato de sódio. A fermentação foi terminada depois de ter sido atingido o volume de trabalho do fermentador. Uma quantidade apropriada de deoxicolato de sódio estéril a 12% foi adicionada à cultura para lisar as 25 células bacterianas e liberar polissacarídeo associado com células. Depois de lisar, os conteúdos do fermentador foram resfriados. O pH do caldo de cultura Iisado foi ajustado para aproximadamente pH 6,6 com ácido acético. O Iisado foi clarificado por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtra- ção de profundidade e microfiltração a 0,45 pm.

Purificação

A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu de vá- rias operações de concentração / diafiltração, precipitação / elutriação, cro- matografia de coluna, e etapas de filtração de profundidade. Todos os pro- cedimentos foram realizados em temperatura ambiente a menos que especi- ficado de modo diverso.

Caldo clarificado das culturas do fermentador de S. pneumoniae 5 sorotipo 3 foram concentrados e diafiltrados usando um filtro a 100 kDa de MWCO. Foi realizada diafiltração usando tampão de fosfato de sódio em pH neutro. Diafiltração removeu os componentes médios de baixo peso molecu- lar dos biopolímeros de maior peso molecular tais como ácido nucleico, pro- teína e polissacarídeo.

Antes da adição de brometo de hexadeciltrimetil amônio (HB),

um volume calculado de uma solução de matéria-prima de NaCI foi adicio- nado à solução de polissacarídeo concentrada e diafiltrada para dar uma concentração final de NaCI a 0,25 M. O polissacarídeo foi em seguida preci- pitado adicionando brometo de hexadeciltrimetil amônio a partir de uma so- 15 lução de matéria-prima para dar uma concentração final de brometo de he- xadeciltrimetil amônio a 1% (em peso/ vol). O precipitado de polissacarídeo / brometo de hexadeciltrimetil amônio foi capturado sobre um filtro de profun- didade e o filtrado foi descartado. O precipitado de polissacarídeo foi resso- Iubilizado e elutriado recirculando uma solução de cloreto de sódio através 20 do filtro de profundidade contendo precipitado. Os filtros foram em seguida enxaguados com solução de cloreto de sódio adicional.

Iodeto de sódio (NaI) foi adicionado à solução de polissacarídeo de uma solução de matéria-prima de Nal para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar brometo de hexadeciltrimetil amônio. O precipitado 25 foi removido por filtração de profundidade. O filtrado continha o polissacarí- deo alvo. O recipiente da precipitação e o filtro foram enxaguados com uma solução de NaCI/Nal e o enxague foi combinado com a solução de polissa- carídeo parcialmente purificada. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi em seguida filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada sobre um ultrafiltro

de 30 kDa de MWCO e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio.

A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi adicio- nalmente purificada por filtração através de um filtro de profundidade im- pregnado com carbono ativado. Depois de filtração, o filtro de carbono foi enxaguados com uma solução de cloreto de sódio. O enxague foi combinado com a solução de polissacarídeo, a qual foi em seguida filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada sobre um ultrafiltro de 30 kDa de MWCO e ajustada com um tampão de fosfato de sódio a 1 M para atingir uma concentração final de 0,025 M de fosfato de sódio. O pH foi checado e ajustado para 7,0 ± 0,2.

A coluna de hidroxiapatita cerâmica (HA) foi equilibrada com

tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutivida- de apropriada (15 pS). A solução de polissacarídeo foi em seguida carregada sobre a coluna. Sob estas condições, impurezas ligaram à resina e o polis- sacarídeo foi recuperado no fluxo direto da coluna. O polissacarídeo foi jateado

através da coluna com tampão e foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada usando um filtro de 30 kDa de MWCO. O concentrado foi em seguida diafiltrado com WFI.

A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 pm para dentro de recipientes de aço inoxidável. As amostras foram removidas para experimentação da liberação e o polissa- carídeo purificado foi armazenado congelado a -25° ± 5°C.

Caracterização

Os dados de 1H-RMN foram consistentes com a estrutura quí- mica pela atribuição de sinais atribuídos aos prótons da molécula de polissa- carídeo.

A identidade do polissacarídeo monovalente foi confirmada por imunoeletroforese contracorrente usando antissoros específicos.

Cromatografia de filtração por gel de alta performance, acoplada com detectores do índice refrativo e da dispersão da Iuz de laser multiângulo (MALLS), foi usada em combinação com a concentração da amostra para calcular o peso molecular.

Meios de cromatografia por exclusão de tamanho (CL-4B) foi usado para traçar o perfil da distribuição de peso molecular relativa do polis- sacarídeo.

Exemplo 4

Preparação de Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Sorotipo 3 - CRMiq7 5 Ativação e Conjugação

Recipientes de sacarídeo sorotipo 3 purificado foram degelados e combinados em um vaso de reação. Ao recipiente, WFI e ácido acético a 2 M foram adicionados para uma concentração final de 0,2 M e 2 mg/mL de sacarídeo. A temperatura da solução foi aumentada para 85°C por uma hora 10 para hidrolisar o polissacarídeo. A reação foi resfriada até <25°C e cloreto de magnésio a 1 M foi adicionado para uma concentração final de 0,1 M. Oxidação na presença de periodato de sódio foi realizada por incubação por

16 a 24 horas a 23°C.

A mistura da reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com WFI usando uma membrana de 100 K de MWCO. O retentado foi filtra- do através de um filtro de 0,2 pm.

Para combinar, fosfato de sódio a 0,2 M, pH 7.0, foi adicionado ao sacarídeo ativado até uma concentração final de 10 mM e um pH de 6,0 a 6,5. Proteína de veículo CRMi97 foi misturada com a solução de sacarídeo 20 para uma proporção de 2 g de sacarídeo por 1 g de CRMi97. A solução de sacarídeo / proteína combinados foi enchida em de vidro de 100 mL frascos de liofilização com um enchimento alvo de 50 mL, congelados com revesti- mento a -75°C, e liofilizados.

Frascos de material coliofilizado de sacarídeo / proteína foram 25 trazidos até a temperatura ambiente e ressuspendidos em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M, pH 7,0, para uma concentração de sacarídeo final de 20 mg/mL. O pH foi ajustado para 6,5 e em seguida foi adicionado um equiva- lente 0,5 molar de cianoboro-hidreto de sódio. A reação foi incubada a 37°C por 48 horas. Depois da incubação com cianoboro-hidreto, a mistura da rea- 30 ção foi diluída com tampão frio a 5 mM de succinato / salina a 0,9%. Aldeí- dos não reagidos foram extintos pela adição de boro-hidreto de sódio e incu- bação a 23°C por 3 a 6 horas. A mistura da reação foi transferida através de um pré-filtro de 0,45 a 5 pm para dentro de um vaso de retentado. A mistura da reação foi diafiltrada 30x com tampão de fosfato a 0,1 M (pH 9), 20x com tampão de fosfato a 0,15 M (pH 6), e 20x com 5 mM de succinato / salina a 0,9%. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução do conjugado foi diluída para um sacarídeo alvo de 0,5 mg/mL, e em seguida filtrada estéril para dentro de reciepientes de con- centrado de massa final em uma coifa Class 100. O conjugado foi armaze- nado em 2 a 8°C.

Caracterização

Meio de cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B) foi usa- do para traçar o perfil da distribuição de tamanho molecular relativo do con- jugado.

A identidade do conjugado foi confirmada pela prova de slot blot usando antissoros específicos.

As concentrações de sacarídeos e de proteínas foram determi- nadas pelas provas de Anthrone e Lowry, respectivamente. A proporção de sacarídeo para proteína no complexo de conjugado ligado de modo covalen- te foi obtida pelo cálculo:

pg/mL de sacarídeo

Proporção =---------------------------------

pg/mL de proteína

Exemplo 5

Preparação de Polissacarídeo Capsular de S. Pneumoniae Sorotipo 5

S. pneumoniae sorotipo 5 foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da State University de New York, Brooklyn, New York. Para preparação do sis- tema de banco de células, vide o Exemplo 1. Para fermentação, coleta, puri- ficação e caracterização do polissacarídeo, vide o Exemplo 1.

Processo de Fermentação Alternativo

Culturas do banco de células de trabalho foram usadas para ino- cular frascos de sementes contendo um meio à base de soja e uma solução a estéril a 10 mM de NaHCO3. Os frascos foram incubados a 36°C ± 2° C sem agitação até terem sido satisfeitos os requisitos de crescimento. Um frasco de sementes foi usado para inocular um fermentador de semente con- tendo meio à base de soja e uma solução estéril a 10 mM de NaHC03. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com NaOH a 3 N. Depois de ter sido atingida a densidade ótica alvo, o fermentador de semente foi usado para inocular o fermentador da produção contendo meio à base de soja com uma concen- tração de 10 mM de NaHCO3. O pH foi mantido com NaOH a 3 N. A fermen- tação foi terminada depois de cessar o crescimento ou quando tiver sido a- tingido o volume de trabalho do fermentador. Uma quantidade apropriada de sódio deoxicolato estéril a 12% foi adicionada à cultura para obter uma con- centração de 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e liberar po- lissacarídeo associado com células. Depois de lisar, os conteúdos do fer- mentador foram mantidos, com agitação, por um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas em uma temperatura entre 7°C e 13°C para assegurar que tives- sem ocorrido Iise celular completa e liberação de polissacarídeo. Agitação durante este período de retenção evitou que o sedimento do Iisado assen- tasse sobre as paredes do fermentador e sonda de pH, deste modo permi- tindo que fosse mantida a integridade da sonda de pH. Em seguida, o pH do caldo de cultura Iisada foi ajustado para aproximadamente pH 4,5 com 50% de ácido acético. Depois de um tempo de retenção sem agitação, por um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas em uma temperatura entre 15°C e 25°C, uma porção significativa das proteínas previamente solúveis desapa- receu da solução como um precipitado sólido com pouca perda ou degrada- ção do polissacarídeo, o qual permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi em seguida clarificada por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtração de profundidade e microfiltração a 0,45 pm.

Exemplo 6

Preparação de Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Sorotipo 5- CRMig7 Ativação e Conjugação

Recipientes de sacarídeo sorotipo 5 foram degelados e combi- nados em um vaso de reação. Ao vaso, acetato de sódio a 0,1 M, pH 4,7, foi adiiconado seguido por oxidação na presença de periodato de sódio por in- cubação por 16 a 22 horas a 23°C. A mistura da reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com WFI usando uma membrana de 100 K de MWCO. O retentado foi filtra- do através de um filtro de 0,2 pm.

O sacarídeo sorotipo 5 ativado foi combinado com CRM197 em 5 uma proporção de 0,8:1. A solução de sacarídeo / proteína combinados foi enchida dentro de frascos de liofilização de vidro de 100 mL (enchimento alvo de 50 mL), congelada com revestimento a -75°C, e coliofilizada.

Frascos de material Iiofilizado foram trazidos até a temperatura ambiente e ressuspendidos em 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,5, e cianobo- ro-hidreto de sódio foi adicionado. A reação foi incubada a 30°C por 72 ho- ras, seguida por uma segunda adição de cianoboro-hidreto e incubada a 30°C por 20 a 28 horas.

Depois das incubações de cianoboro-hidreto, a mistura da rea- ção foi diluída 2 vezes com salina e transferida através de um pré-filtro de 15 0,45 a 5 pm para dentro de um vaso de retentado. A mistura da reação foi diafiltrada 30x com tampão de fosfato a 0,01 M, pH 8, 20x com tampão de fosfato a 0,15 M, pH 6, e 20x com salina. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução do conjugado foi diluída para um sacarídeo alvo de 0,5 mg/mL, e em seguida filtrada estéril para dentro de recipientes de con- centrado de massa final em uma coifa Class 100. O conjugado foi armaze- nado em 2 a 8°C.

Para a caracterização do conjugado, vide o Exemplo 2.

Exemplo 7

Preparação de Polissacarídeo Capsular de S. Pneumoniae Sorotipo 6A

S. pneumoniae sorotipo 6A foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da State University of New York, Brooklyn, New York. Para preparação do sis- tema de banco de células, vide o Exemplo 1. Para fermentação, coleta e purificação do polissacarídeo, vide o Exemplo 1, exceto que durante purifi- 30 cação, é omitida a etapa de concentração a 30 kDa de MWCO, antes da e- tapa de cromatografia. Exemplo 8

Preparação de Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Sorotipo 6A- CRMia7 Ativação e Conjugação

Polissacarídeo sorotipo 6A é um polímero de alto peso molecular 5 que teve de ser reduzido de tamanho antes da oxidação. Recipientes de sa- carídeo sorotipo 6A foram degelados e combinados em um vaso de reação. Ao vaso, ácido acético a 2 M foi adicionado para uma concentração final de 0,1 M para hidrólise por 1,5 horas a 60°C. A reação foi resfriada até 23°C e foi realizada neutralização ajustando a mistura da reação com NaOH a 1 M 10 para pH 6. Oxidação na presença de periodato de sódio foi realizada por incubação a 23°C por 14 a 22 horas.

A mistura da reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com WFI usando uma membrana de 100 K de MWCO. O retentado foi filtra- do através de um filtro de 0,2 pm.

Sorotipo 6A foi combinado com sucrose e enchido dentro de

frascos de liofilização de vidro de 100 mL (enchimento alvo de 50 mL) e congelado com revestimento a -75°C e liofilizado.

Frascos de material liofilizado foram trazidos até a temperatura ambiente e ressuspendidos em dimetilsulfóxido (DMSO) em uma proporção 20 de sacarídeo / proteína de 1:1. Depois da adição de cianoboro-hidreto de sódio, a mistura da reação foi incubada a 23°C por 18 horas. Depois da in- cubação com cianoboro-hidreto, a mistura da reação foi diluída com salina fria. Aldeídos não reagidos foram extintos por adição de boro-hidreto de só- dio por incubação a 23°C por 3 a 20 horas.

A mistura da reação diluída foi transferida através de um pré-

filtro de 5 pm para dentro de um vaso de retentado. A mistura da reação foi diafiltrada 10x com NaCI a 0,9% e 30x com NaCI tamponado com succinato. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução do conjugado foi diluída para um sacarídeo alvo de 0,5 mg/mL, e em seguida filtrada estéril para dentro de recipientes de con- centrado de massa final em uma coifa Class 100. O conjugado foi armaze- nado em 2 a 8°C. Para a caracterização do conjugado, vide o Exemplo 2. Exemplo 9

Preparação de Polissacarídeo Capsular de S. Pneumoniae Sorotipo 7F

S. pneumoniae sorotipo 7F foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da State University of New York, Brooklyn, New York. Para preparação do sis- tema de banco de células, e para fermentação e coleta do polissacarídeo, vide o Exemplo 3. Para um processo de fermentação e coleta alternativo, vide o processo alternativo descrito no Exemplo 1.

Purificação

A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu de vá- rias operações de concentração / diafiltração, precipitação / elutriação, cro- matografia de coluna, e etapas de filtração de profundidade. Todos os pro- cedimentos foram realizados em temperatura ambiente a menos que especi- ficado de modo diverso.

Caldo clarificado de culturas do fermentador de S. pneumoniae sorotipo 7F foram concentrados e diafiltrados usando um filtro de 100 kDa de MWCO. Foi realizada diafiltração usando tampão de fosfato de sódio em pH neutro. Diafiltração removeu os componentes médios de baixo peso molecu- lar dos biopolímeros de maior peso molecular tais como ácido nucleico, pro- teína e polissacarídeo.

O sorotipo 7F não forma um precipitado com brometo de hexa- deciltrimetil amônio. Ao invés, impurezas foram precipitadas da solução con- centrada e diafiltrada adicionando o brometo de hexadeciltrimetil amônio a partir de uma solução de matéria-prima até uma concentração final de 1% de brometo de hexadeciltrimetil amônio. O precipitado foi capturado sobre um filtro de profundidade e o filtro foi descartado. O polissacarídeo foi contido no filtrado.

Iodeto de sódio (NaI) foi adicionado à solução de polissacarídeo a partir de uma solução de Nal de matéria-prima para atingir uma concentra- ção final de 0,5% para precipitar brometo de hexadeciltrimetil amônio. O pre- cipitado foi removido por filtração de profundidade. O filtrado continha o po- lissacarídeo alvo. O vaso de precipitação e o filtro foram enxaguados com uma solução de NaCI/Nal e os enxagues foram combinados com a solução de polissacarídeo parcialmente purificado. O filtro foi descartado. O polissa- carídeo foi em seguida filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada sobre um ultrafiltro de 30 kDa de MWCO e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio.

A solução de polissacarídeo parcialmente purificado foi adicio- nalmente purificada por filtração através de um filtro de profundidade im- pregnado com carbono ativado. Depois da filtração, o filtro de carbono foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O enxague foi combinado 10 com a solução de polissacarídeo, a qual foi então filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada em um ultrafiltro de kDa de MWCO e ajustado com um tampão de fosfato de sódio a 1 M para obter uma concentração final de fosfato a sódio a 0,025 M. O pH foi checado e ajustado para 7,0 ± 0,2.

A coluna de hidroxiapatita cerâmica (HA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutivi- dade apropriada (15 pS). A solução de polissacarídeo foi em seguida carre- gada sobre a coluna. Sob estas condições, impurezas ligadas à resina e o 20 polissacarídeo foi recuperado no fluxo direto da coluna. O polissacarídeo foi jateado através da coluna com tampão e foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada usando um filtro de 30 kDa de MWCO. O concentrado foi em seguida diafiltrado com WFI.

A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um

filtro de membrana de 0,2 pm para dentro de recipientes de aço inoxidável. Amostras foram removidas para prova de liberação e o polissacarídeo purifi- cado foi armazenado em 2° a 8°C.

Para caracterização do polissacarídeo, vide o Exemplo 3. Exemplo 10

Preparação de Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Sorotipo 7F- CRMia7 Ativação e Conjugação

Oxidação na presença de periodato de sódio foi realizada por incubação por 16 a 24 horas a 23°C.

A mistura da reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com NaOAc a 10 mM, pH 4,5, usando uma membrana de 100 K de MWCO. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

Sorotipo 7F foi enchido em frascos de liofilização de vidro de 100 mL (preenchimento alvo de 50 mL) e congelado com revestimento a -75°C e liofilizado.

Frascos de sorotipo liofilizado 7F e CRM197 foram trazidos até a temperatura ambiente e ressuspendidos em DMSO em uma proporção de sacarídeo / proteína de 1,5:1. Depois da adição de cianoboro-hidreto de só- 15 dio, a reação foi incubada a 23°C por 8 a 10 horas. Aldeídos não reagidos foram extintos pela adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23°C por 16 horas.

A mistura da reação foi diluída 10 vezes com salina fria e transferi- da através de um pré-filtro de 5 pm para dentro de um vaso de retentado. A mistura da reação foi diafiltrada 10x com salina a 0,9% e 30x com salina tam- ponada com succinato. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução do conjugado foi diluída para um sacarídeo alvo de 0,5 mg/mL de salina a 0,9%, e em seguida filtrada estéril para dentro de re- ciepientes de concentrado de massa final em uma coifa Class 100. O conju- gado foi armazenado em 2 a 8°C.

Para caracterização do conjugado, vide o Exemplo 4.

Exemplo 11

Preparação de Polissacarídeo Capsular de S. Pneumoniae Sorotipo 19A

S. pneumoniae sorotipo 19A foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da State University of New York, Brooklyn, New York. Para preparação do sistema de banco de células, vide o Exemplo 1. Para fermentação, coleta e purificação do polissacarídeo, vide o Exemplo 7. Para caracterização, vide o Exemplo 3.

Exemplo 12

Preparação de Sacarídeo Pneumocócico Sorotipo 19A- CRMiq7 Conjugado Ativação e Conjugação Recipientes de sacarídeo sorotipo 19A foram degelados e com-

binados em um recipiente de reação. Acetato de sódio foi adicionado a 10 mM (pH 5,0) e foi realizada oxidação na presença de periodato de sódio por incubação por 16 a 24 horas a 23°C.

A mistura da reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com 10 mM de acetato, pH 5,0, usando uma membrana de 100 K de MWCO. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

O sacarídeo ativado foi combinado com sucrose seguido pela adição de CRM197. A mistura de sacarídeo ativado sorotipo 19A e CRM197 (proporção a 0,8:1) foi enchida em frascos de liofilização de vidro de 100 mL (preenchimento alvo de 50 mL) e congelada com revestimento a -75°C e liofilizada.

Frascos de material liofilizado foram trazidos até a temperatura ambiente e ressuspendidos em DMSO. À mistura de sacarídeo / proteína, foi adicionado cianoboro-hidreto de sódio (100 mg/ml). A reação foi incubada a 20 23°C por 15 horas. Depois da incubação de cianoboro-hidreto, aldeídos não reagidos foram extintos pela adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23°C por 3 a 20 horas.

A mistura da reação foi diluída 10 vezes com salina a frio e transferida através de um pré-filtro de 5 pm para dentro de um vaso de re- tentado. A mistura da reação foi diafiltrada 10x com 0,9% de NaCI, filtrada por 0,45 pm, e 30x com diafiltração usando 5 mM de succinato / 0,9% de tampão de NaCI, pH 6. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução do conjugado foi diluída para um alvo de 0,5 mg/mL usando 5 mM de succinato / salina a 0,9%, e em seguida filtrada estéril para dentro de recipientes de concentrado de massa final em uma coifa Class 100. O conjugado foi armazenado a 2 - 8°C.

Para caracterização do conjugado, vide o Exemplo 4. Exemplo 13

Preparação de Polissacarídeo Capsularde S. Pneumoniae Sorotipos 4. 6B. 9V. 14. 18C. 19F e 23F Preparação da Cultura de Semente de S. pneumoniae 5 S. pneumoniae sorotipos 4, 6B, 9V, 18C, 19F e 23F foram obti-

dos do Dr. Gerald Schiffman1 State University of New York, Brooklyn1 New York. S. pneumoniae sorotipo 14 foi obtido da ATCC1 cepa 6314.

Separadamente, um frasco de cada um dos sorotipos de Strep- tococcus pneumoniae desejados foi usado para iniciar um lote de fermenta- 10 ção. Dois frascos contendo um meio à base de soja e vermelho fenol foram ajustados a uma faixa de pH de 7,4 ± 0,2 usando carbonato de sódio, e o volume requerido de solução a 50% de dextrose / 1 % de sulfato de magné- sio foi em seguida adicionado aos frascos. Os dois frascos foram inoculados com diferentes quantidades de semente. Os frascos foram incubados a 36° ± 15 2°C até o meio ficar amarelo. Depois da incubação, as amostras foram re- movidas de cada frasco e testadas para densidade ótica (OD) (0,3 a 0,9) e pH (4,6 a 5,5). Um dos dois frascos foi selecionado para inoculação do fer- mentador de semente.

Meio à base de soja foi transferido para o fermentador de se- mente e esterilizado. Em seguida um volume de solução de 50% de dextrose / 1% de sulfato de magnésio foi adicionado ao fermentador. O pH e a agita- ção do fermentador de semente foram monitorados e controlados (pH 6,7 a

7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2°C. O inóculo de sementes (frasco) foi asseticamente conectado ao fermentador de semente e o inóculo foi 25 transferido. O fermentador foi mantido em controle de pH e as amostras fo- ram periodicamente removidas e testadas para OD e pH. Quando a OD de- sejada de 0,5 a 600 nm foi atingida, o fermentador intermediário foi inocula- do com o caldo de fermentação do fermentador de semente.

Meio à base de soja foi transferido para o fermentador interme- diário e esterilizado. Em seguida um volume de solução a 50% de dextrose / 1% de sulfato de magnésio foi adicionado ao fermentador. O pH e a agitação do fermentador intermediário foram monitorados e controlados (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2°C. 0 conteúdo do fermentador de semente foi transferido para o fermentador intermediário. O fermentador foi mantido em pH controle e as amostras foram periodicamente removidas e testadas para OD e pH. Quando a OD desejada de 0,5 a 600 nm foi atingida, 5 o fermentador da produção foi inoculado com o caldo de fermentação do fermentador intermediário.

Meio à base de soja foi transferido para o fermentador da produ- ção e esterilizado. Em seguida um volume de solução a 50% de dextrose /

1 % de sulfato de magnésio foi adicionado ao fermentador. O pH e a agitação do fermentador da produção foram monitorados e controlados (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2°C. O fermentador foi mantido em pH controle e as amostras foram periodicamente removidas e testadas para OD epH, até a fermentação estar completa.

Sódio deoxicolato foi adicionado ao fermentador até uma con- 15 centração final de cerca de 0,12% em peso/ vol. A cultura foi misturada por um mínimo de trinta minutos e o ponto de ajuste da temperatura foi reduzido para 10°C. A cultura foi incubada de um dia para o outro e depois de confir- mação da inativação, o pH da cultura foi ajustado para entre 6,4 e 6,8, con- forme necessário, com 50% de ácido acético. A temperatura do fermentador 20 foi aumentada para 20° ± 5°C e os conteúdos foram transferidos para o tan- que de retenção de clarificação.

Os conteúdos do tanque de retenção de clarificação (incluindo os debris celulares) foram processados através de uma centrífuga em uma taxa de fluxo entre 25 e 600 litros por hora (exceto o Sorotipo 4, em que os 25 debris celulares foram descartados e a taxa de fluxo foi comprimida até entre 25 e 250 litros por hora). Amostras do sobrenadante foram removidas e tes- tadas para OD. A OD desejada durante a centrifugação foi < 0,15.

Inicialmente, o sobrenadante foi recirculado através de uma montagem de filtro de profundidade até ser obtida uma OD de 0,05 ± 0,03. Em seguida o sobrenadante foi passado através da montagem de filtro de profundidade e através de um filtro de membrana de 0,45 μιτι para o tanque de retenção do filtrado. Subsequentemente, o produto foi transferido através de tubos fechados para a área de purificação para processamento.

Todas as operações acima (centrifugação, filtração e transferência) foram realizadas entre 10°C a 30°C.

5 Para um processo de fermentação e coleta alternativo para os

sorotipos 4 e 6B, vide o processo alternativo descrito no Exemplo 1. Purificação

A purificação de cada polissacarídeo pneumocócico consistiu de várias operações de concentração / diafiltração, precipitação / elutriação, cromatografia de coluna, e etapas de filtração de profundidade. Todos os procedimentos foram realizadas em temperatura ambiente a mentos que especificado de modo diverso.

Caldo clarificado das culturas do fermentador do sorotipo de S. pneumoniae desejado foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de 100 15 kDa de MWCO. Diafiltração foi realizada usando tampão de fosfato de sódio a pH < 9,0. Diafiltração removeu os componentes médios de baixo peso mo- lecular dos biopolímeros de maior peso molecular tais como ácido nucleico, proteína e polissacarídeo.

O polissacarídeo foi precipitado da solução concentrada e diafil- 20 trada adicionando brometo de hexadeciltrimetil amônio de uma solução de matéria-prima para dar uma concentração final de 1% de brometo de hexa- deciltrimetil amônio (em peso/ vol) (exceto o Sorotipo 23F, o qual tinha uma concentração final de 2,5%). O precipitado de polissacarídeo / brometo de hexadeciltrimetil amônio foi capturado sobre um filtro de profundidade e o 25 filtrado foi descartado. (Nota: O sorotipo 14 não precipita; portanto o filtrado foi retido.) O precipitado de polissacarídeo foi ressolubilizado e elutriado re- circulando uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo precipitado. Os filtros foram em seguida enxaguados com solução adicional de cloreto de sódio.

Iodeto de sódio (NaI) foi adicionado à solução de polissacarídeo

de uma solução de Nal de matéria-prima para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar brometo de hexadeciltrimetil amônio (exceto pelo Sorotipo 6B, o qual tinha uma concentração final de 0,25%). O precipitado foi removido por filtração de profundidade. O filtrado continha o polissacarídeo alvo. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi em seguida filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada sobre um ultrafiltro

de 30 kDa de MWCO e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio.

A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi adicio- nalmente purificada oir filtração através de um filtro de profundidade impreg- nado com carbono ativado. Depois da filtração, o filtro de carbono foi enxa- 10 guado com uma solução de cloreto de sódio. O enxague foi combinado com a solução de polissacarídeo, a qual foi em seguida filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada sobre um ultrafiltro de 30 kDa de MWCO e o filtro foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O pH foi checado e ajustado para 7,0 ± 0,3.

A coluna de hidroxiapatita cerâmica (HA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio até o pH ser 7,0 ± 0,3 e a condutividade foi de 26 + 4 pS. A solução de polissacarídeo foi em se- guida carregada sobre a coluna. Sob estas condições, impurezas ligaram à 20 resina e o polissacarídeo foi recpuerado no fluxo através da coluna. A solu- ção de polissacarídeo foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada usando um filtro de 30 kDa de MWCO. O concentrado foi em seguida diafiltrado com WFI até a condutividade ser < 15pS.

A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um

filtro de membrana de 0,2 pm para dentro de recipientes em massa e arna- zenada em 2 a 8°C.

Exemplo 14

Preparação dos Conjugados de Sacarídeos Pneumocócicos - CRMiq7 Para os Sorotipos 4. 6B, 9V, 14. 18C. 19F e 23F Processo de Ativação

Os sacarídeos de sorotipos diferentes seguem diferentes cami- nhos para ativação (hidrólise ou sem hidrólise antes da ativação) e conjuga- ção (reações aquosas ou de DMSO) conforme descrito neste exemplo.

Polissacarídeo foi transferido dos recipientes em massa para o vaso do reator. O polissacarídeo foi em seguida diluído em WFI e fosfato de sódio para uma faixa de concentração final de 1,6 a 2,4 mg/mL.

Etapa 1.

Para os sorotipos 6B, 9V, 14, 19F e 23F, pH foi ajustado para pH

6,0 ±0,3.

Para o sorotipo 4, ácido clorídrico (concentração final de ácido de 0,01 M) foi adicionado e a solução foi incubada por 25 a 35 minutos a 45° ± 2°C. Hidrólise foi interrompida resfriando até 21 a 25°C e adicionando fos- fato de sódio a 1 M para um alvo de pH 6,7 ± 0,2. Um teste in-process foi feito para confirmar um nível apropriado de despiruvilação.

Para o sorotipo 18C, ácido acético glacial (concentração de áci- do final de 0,2 M) foi adicionado e a solução foi incubada por 205 a 215 mi- nutos a 94° ± 2°C. A temperatura foi em seguida reduzida para 21 a 25°C e fosfato de sódio a 1 a 2 M foi adicionado a um alvo de pH 6,8 ± 0,2.

Etapa 2: Reação de Periodato

Os equivalentes molares de periodato de sódio requeridos para 20 ativação de sacarídeo pneumocócico foi determinado usando teor total de sacarídeo (exceto pelo sorotipo 4). Para o sorotipo 4, foi usada uma propor- ção de 0,8 a 1,2 mois de periodato de sódio por mol de sacarídeo. Com completa mistura, a reação de oxidação foi deixada para prosseguir entre 16 a 20 horas em 21 a 25°C para todos os sorotipos exceto 19F para o qual a 25 temperatura foi < 15°C.

Etapa 3: Ultrafiltração

O sacarídeo oxidado foi concentrado e diafiltrado com WFI (tam- pão de fosfato de sódio a 0,01 M pH 6,0 para o sorotipo 19F) sobre um ultra- filtro de 100 kDa de MWCO (ultrafiltro de 5 kDa por 18C). O permeado foi descartado e o retentado foi filtrado através de um filtro de 0,22 μιτι.

Etapa 4: Liofilização

Para os sorotipos 4, 9V, e 14 o sacarídeo concentrado foi mistu- rado com proteína de veículo CRM197, enchido dentro de frascos de vidro, congelado com revestimento e armazenado a < -65°C. O concentrado de Sacarideo-CRM197 congelado foi liofilizado e em seguida armazenado a -25° ±5°C.

Para os sorotipos 6B, 19F, e 23F uma quantidade especificada

de sucrose foi adicionada a qual foi calculada para obter uma concentração de sucrose de 5% ± 3% na mistura da reação de conjugação. O sorotipo 18C não necessitou de adição de sucrose. O sacarídeo concentrado foi em seguida enchido dentro de frascos de vidro, congelado com revestimento e 10 armazenado a < -65°C. O sacarídeo concentrado congelado foi liofilizado e em seguida armazenado a -25° ± 5°C.

Processo de Conjugação

Foram usados dois processos de conjugação: conjugação aquo- sa para os sorotipos 4, 9V, 14 e 18C, e conjugação de DMSO para os soro- tipos 6B, 19F e 23F.

Conjugação Aguosa Etapa 1: Dissolução

Para os sorotipos 4, 9V e 14, a mistura de sacarídeo ativado lio- filizado -CRM197 foi degelada e equilibrada em temperatura ambiente. O sa- carídeo ativado liofilizado -CRM197 foi em seguida reconstituído em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M em uma proporção típica de:

• 1 L de tampão por 16 a 24 g de sacarídeo para o sorotipo 4 e 9V

• 1 L de tampão por 6 a 10 g de sacarídeo para o sorotipo 14

A mistura da reação foi incubada a 37° ± 2°C até dissolução total para o sorotipo 9V e a 23° ± 2°C para os sorotipos 4 e 14.

Para o sorotipo 18C, o sacarídeo liofilizado foi reconstituído em uma solução de CRM197 em fosfato de sódio dibásico a 1 M em uma propor- ção típica de 0,11 L de fosfato de sódio por 1 L de solução de CRM197. A mistura da reação (8 a 12 g/L de concentração de sacarídeo) foi incubada a 23° ± 2°C até dissolução total.

O pH foi testado como um controle in-process neste estágio. Etapa 2: Reação de Conjugação Para os sorotipos 4 e 9V, a reação de conjugação foi iniciada adicionando a solução de cianoboro-hidreto de sódio (100 mg/mL) para obter

1,0 a 1,4 mois de cianoboro-hidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura da reação foi incubada por 44 a 52 horas a 37° ± 2°C. A temperatura foi em 5 seguida reduzida para 23° ± 2°C e cloreto de sódio a 0,9% foi adicionado ao reator. Solução de boro-hidreto de sódio (100 mg/mL) foi adicionado para obter 1,8 a 2,2 equivalentes molares de boro-hidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura foi incubada por 3 a 6 horas a 23° ± 2°C. A mistura foi diluída com cloreto de sódio a 0,9% e o reator foi enxaguado. A mistura da 10 conjugação diluída foi filtrada usando um pré-filtro de 1,2 μιτι para dentro de um vaso de retenção.

Para os sorotipos 14 e 18C, a reação de conjugação foi iniciada adicionando a solução de cianoboro-hidreto (100 mg/mL) para obter 1,0 a 1,4 mois de cianoboro-hidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura da 15 reação foi incubada por 12 a 24 horas a 23° ± 2°C. A temperatura foi aumen- tada para 37° ± 2°C e a reação foi incubada por 72 a 96 horas. A temperatu- ra foi em seguida reduzida para 23° ± 2°C e 0,9% de cloreto de sódio foi adi- cionado ao reator. Solução de boro-hidreto de sódio (100 mg/mL) foi adiico- nada para obter 1,8 a 2,2 equivalentes molares de boro-hidreto de sódio por 20 mol de sacarídeo. A mistura foi incubada por 3 a 6 horas a 23° ± 2°C. A mis- tura foi diluída com 0,9% de cloreto de sódio e o reator foi enxaguado. A mis- tura de conjugação diluída foi em seguida filtrada usando um pré-filtro de 1,2 μιτι para dentro de um vaso de retenção.

Etapa 3: 100 kDa de Ultrafiltração A mistura de conjugação diluída foi concentrada e diafiltrada so-

bre um ultrafiltro de 100 kDa de MWCO com ou um mínimo de 15 volumes (sorotipo 4) ou 40 volumes (sorotipos 9V, 14, e 18C) de cloreto de sódio a 0,9%.

O permeado foi descartado.

Para o sorotipo 4, o retentado foi filtrado através de um filtro de

0,45 μιτι.

Um controle in-process (teor de sacarídeo) foi realizado nesta etapa.

Etapa 4: Purificação de Coluna de HA

Esta etapa foi realizada somente para o conjugado do sorotipo 4.

A coluna de HA foi primeiro neutralizada usando tampão de fos- 5 fato de sódio a 0,5 M (pH 7,0 ± 0,3) e em seguida equilibrada com cloreto de sódio a 0,9%. O retentado filtrado (sorotipo 4) foi carregado sobre a coluna em uma taxa de fluxo de 1,0 L/min. A coluna foi lavada com cloreto de sódio a 0,9% em uma taxa de fluxo de < 2,0 L/min. O produto foi em seguida elu- triado com tampão de fosfato de sódio a 0,5 M em uma taxa de fluxo de < 10 2,0 L/min.

A fração de HA foi em seguida concentrada e diafiltrada sobre uma membrana de 100 kDa de MWCO com um mínimo de 20 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado.

Etapa 5: Filtração Estéril O retentado depois da diafiltração a 100 kDa de MWCO foi filtra-

do através de um filtro de 0,22 μιτι. Controles in-process (teor de sacarídeo, proteína livre, sacarídeo livre e cianeto) foram realizados sobre o produto filtrado. Controles in-process sobre o retentado do filtrado foram realizados para determinar se foram necessárias concentração, diafiltração, e/ou dilui- 20 ção adicionais para satisfazer os alvos de concentrado de massa final. Estes testes e testes adicionais foram repetidos em amostras de concentrado de massa final.

Conforme necessário, o conjugado filtrado foi diluído com cloreto de sódio a 0,9% de modo a obter uma concentração final de menos de 0,55 g/L. Testes de liberação para teor de sacarídeo, teor de proteína e proporção de sacarídeo : proteína foram realizados neste estágio.

Finalmente, o conjugado foi filtrado (0,22 μιτι) e enchido dentro de latas de aço inoxidável de 10 L em uma quantidade típica de 2,64 g/ lata. Neste estágio, a produção, teor de sacarídeo, teor de proteína, pH, propor- 30 ção de sacarídeo : proteína e teor de Iisina foram realizadas como controles in-process. Provas de liberação (aspecto, proteína livre, sacarídeo livre, en- dotoxina, determinação do peso molecular, cianeto residual, identidade de sacarídeo, identidade de CRMig7) foram realizadas neste estágio. Conjugação de DMSO Etapa I: Dissolução

Os sorotipos de sacarídeos ativados Iiofilizados 6B, 19F, 23F e a 5 proteína de veículo CRMig7 Iiofilizada foram equilibrados em temperatura ambiente e reconstituídos em DMSO. A concentração de dissolução tipica- mente variou de 2 a 3 gramas de sacarídeo (2 a 2,5 g de proteína) por litro de DMSO.

Etapa II: Reação de Conjugação O sacarídeo ativado e proteína de veículo CRM197 foram mistu-

rados por 60 a 75 minutos a 23° ± 2°C em uma faixa de proporçlão de 0,6 g a 1,0 g de sacarídeo/g CRMig7 para os sorotipos 6B e 19F ou 1,2 a 1,8 g de sacarídeo/g de CRM197 para o sorotipo 23F.

A reação de conjugação foi iniciada adicionando a solução de cianoboro-hidreto de sódio (100 mg/mL) em uma proporção de 0,8 a 1,2 e- guivalentes molares de cianoboro-hidreto de sódio para um mol de sacarí- deo ativado. WFI foi adicionado à mistura da reação para um alvo de 1% (v/v) e a mistura foi incubada por mais de 40 horas a 23° ± 2°C.

Solução de boro-hidreto de sódio, 100 mg/mL (típico 1,8 a 2,2 20 equivalentes molares de boro-hidreto de sódio por mol de sacarídeo ativado) e WFI (alvo 5% em v/v) foram adicionados à reação e a mistura foi incubada por 3 a 6 horas a 23° ± 2°C. Este procedimento reduziu quaisquer aldeídos não reagidos presentes sobre os sacarídeos. Em seguida a mistura da rea- ção foi transferida para um tanque de diluição contendo cloreto de sódio a 25 0,9% a < 15°C.

Etapa III: Ultrafiltração de 100 kDa

A mistura de conjugado diluído foi filtrada através de um filtro de 1,2 μιτι e concentrada e diafiltrada sobre uma membrana de 100 kDa de MWCO com um mínimo de 15 volumes de cloreto de sódio a 0,9% (tampão 30 de de 0,01 M de fosfato de sódio / 0,05 M de NaCI foi usado para o sorotipo 23F). O permeado foi descartado. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,45 μιτι. Uma amostra do conteúdo de sacarídeo in-process foi colhida neste estágio.

Etapa IV: Purificação de Coluna de DEAE

Esta etapa foi realizada somente para o sorotipo 23F.

A coluna de DEAE foi equilibrada com tampão de 0,01 M de fos- 5 fato de sódio I 0,05 M de cloreto de sódio. O retentado filtrado (sorotipo 23F) foi carregado sobre a coluna e lavado com tampão de 0,01 M de fosfato de sódio / 0,05 M de cloreto de sódio. A coluna foi em seguida lavada com tam- pão de 0,01 M de fosfato de sódio / 0,9% de NaCI. O produto foi em seguida elutriado com tampão de 0,01 M de fosfato de sódio / 0,5 M de cloreto de 10 sódio.

Etapa V: Ultrafiltração a 100 kDa

O retentado de 6B e 19F foi concentrado e diafiltrado com no mínimo 30 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado.

O elutriado do sorotipo 23F foi concentrado e diafiltrado com um mínimo de 20 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descar- tado.

Etapa VI: Filtração Estéril

O retentado depois da diafiltração a 100 kDa de MWCO foi filtra- do através de filtro de 0,22 μιτι. Controles in-process (teor de sacarídeo, 20 proteína livre, sacarídeo livre, DMSO residual e cianeto residual) foram reali- zados sobre o produto filtrado. Controles in-process sobre retentado filtrado foram realizados para determinar se foram necessárias concentração, diafil- tração, e/ou diluição adicionaispara satisfazer os alvos de concentrado de massa final. Estes testes e testes adicionais foram repetidos em amostras de 25 concentrado de massa final.

Conforme necessário, o conjugado filtrado foi diluído com cloreto de sódio a 0,9% par obter uma concentração final de menos de 0,55 g/L. Testes de liberação para teor de sacarídeo, teor de proteína e proporção de sacarídeo : proteína foram realizados neste estágio.

Finalmente, o conjugado foi filtrado (0,22 μιη) e enchidos em

latas de aço inoxidável de 10 L em uma quantidade de 2,64 g/ lata. Neste estágio, foram realizados produção, teor de sacarídeo, teor de proteína, pH, proporção de sacarídeo : proteína e teor de Iisina como controles in-process. Prova de liberação (aspecto, proteína livre, sacarídeo livre, endotoxina, de- terminação do peso molecular, cianeto residual, DMSO residual, identidade do sacarídeo e identidade da CRMi97) foi realizada neste estágio.

5 Exemplo 15

Formulação de uma Vacina de Conjugado Pneumocócico Multivalente

Os concentrados de massa final dos 13 conjugados contêm 0,85% de cloreto de sódio, concentrados de massa tipo 3, 6A, 7F e 19A também contêm 5 mM de tampão de succinato de sódio a pH 5,8. Os volu- 10 mes requeridos de concentrados de massa foram calculados com base no volume do lote e nas concentrações de sacarídeo em massa. Depois de 80% do cloreto de sódio a 0,85% (fsalina fisiológica) e da quantidade reque- rida de tampão de succinato serem adicionados ao vaso de formulação pré- etiquetado, concentrados em massa foram adicionados. A preparação foi em 15 seguida filtrada estéril através de uma membrana de 0,22 pm para dentro de um segundo recipiente usando uma unidade de filtro de membrana Millipore Durapore. O primeiro recipiente foi lavado com os restantes 20% de cloreto de sódio a 0,85% e a solução foi passada através do mesmo filtro e coletada dentro do segundo recipiente. A massa formulada foi misturada gentilmente 20 durante e depois da adição de fosfato de alumínio em massa. O pH foi che- cado e ajustado caso necessário. O produto em massa formulado foi arma- zenado em 2 a 8°C.

O produto de massa formulado foi enchido em seringas de vidro de borossilicato Tipo 1 obtidas da Becton Dickinson. A vacina foi monitorada em intervalos regulares para turbidez para assegurar a uniformidade da ope- ração de enchimento. A vacina enchida (Produto Final) foi armazenada em 2 a 8°C.

Exemplo 16

Imunogenicidade da Vacina de Conjugado 13-Valente Até o momento, os estudos pré-clínicos realizados sobre a vaci-

na 13vPnC têm sido em coelhos. Os estudos ns HT01-0021 e ne HT01-0036 foram desenhados para examinar de modo independente o efeito da coniu- gação química de polissacarídeos capsulares (PSs) de S. pneumoniae a CRM197 e o efeito de adjuvante de fosfato de alumínio (AIPO4) sobre a rea- ção imune à vacina 13vPnC em coelhos. Estes efeitos foram caracterizados por ELISA antígeno-específico para concentrações séricas de IgG e para 5 função de anticorpos por prova opsonofagocítica (OPA).

Estudo n° HT01-0021

O estudo η- HT01-0021 examinou a capacidade da vacina 13vPnC com adjuvante AIPO4 para provocar reações imunes específicas para os sorotipos da vacina. Os sorotipos pneumocócicos representados na 10 vacina 13vPnC incluem os tipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Objetivos secundários incluíram uma avaliação da cinética e da du- ração da reação de anticorpos. Coelhos New Zealand White foram imuniza- dos por via intramuscular na semana 0 e na semana 2 com a dose clínica humana planejada de cada polissacarídeo (2 pg de cada PS, exceto 4 pg de 15 6B) formulada com ou sem AIPO4 (100 pg /dose). Soros foram coletado em vários pontos de tempo. IgG sorotipo específica foi medida por ELISA e a atividade funcional foi avaliada por OPA.

A Tabela 3 mostra o título médio geométrico (GMT) obtido em amostras de soro reunidas, depois de duas doses da vacina de 13vPnC. 20 Uma proporção das IgG GMTs foi usada para comparar respostas da sema- na 4 à semana 0. Estes dados demonstram que a inclusão de AIPO4 na for- mulação 13vPnC provocou maiores níveis de anticorpo IgG em comparação com a mesma vacina sem adjuvante. Embora as reações de anticorpos te- nham sido maiores quando AIPO4 foi incluído na formulação, estes aumentos 25 não foram estatisticamente significativos.

Reações de anticorpos funcionais também foram avaliadas em coelhos depois de imunização com as duas formulações de 13vPnC (Tabela 4). Ao comparar formulações de vacina com ou sem adjuvante, foram obser- vadas maiores GMTs em OPA no grupo de tratamento das vacinas 13vPnC 30 + AIPO4. Títulos OPA foram detectados em grupos de soro da semana 4 pa- ra todos os sorotipos da vacina em ambos os grupos. Para a maoria dos so- rotipos, os títulos OPA medidos na semana 4 foram no mínimo 4 vezes mai- ores do que os títulos na semana 0 (linha basal).

As reações cinéticas para cada um dos sorotipos de vacina 13vPnC foram avaliadas from serum pools de ambos os grupos de tratamen- to. Títulos de IgG para cada sorotipo foram medidos de coletas de sangue 5 na semana 0 e semanas 1, 2, 3, 4, 8, 12, 26, e 39 e em seguida compara- dos. Com a exceção do sorotipo 1, reações de anticorpos em animais rece- bendo vacina com adjuvante foram superiores às que receberam vacina sem adjuvante e tiveram pico na semana 2 do esquema de imunização (dados não mostrados).

Globalmente, os dados indicam que a vacina 13vPnC formulada

com fosfato de alumínio é imunogênica em coelhos, provocando reações de anticorpos substanciais para os polissacarídeos capsulares pneumocócicos contidos na vacina e estas reações estão associadas com atividade funcio- nal. As reações observadas para os sete sorotipos de núcleo depois de i- 15 munização com 13vPnC + AIPO4 são consistentes com reações históricas de coelhos para a formulação heptavalente. Tabela 3. Reações Imunes de IgG de Coelho (GMTs) Depois de Imunização com Duas Doses de Glicoconjugado Pneumocócico 13-valente

Diluente com ALPO43 13vPnCa

Proporção Semana 4

Sorotipo Semana O Semana 4 Semana 4: Semana O (95% Cl)

Semana O

Proporção

Semana 4: Semana 0

Semana 0

13vPnC + ALPO43 Semana 4 (95% Cl)

Proporção

Semana 4: Semana 0

6A

6B

7F

<100

<100

<100

134

141

<100

3.859

<100

<100

<100

<100

<100

<100

579

1,0

1,0

1,0

0,4

0,4

1,0

0,2

50 5.926 119

(2.758-12.733)

50 6.647 133

(2.773-15.932)

50 13.554 271

(8.031-22.875)

50 5.859 117

(2.450-14.009)

74 22.415 303

(11.987-41.914)

57 8.108 142

(3.564-18.444)

171 43.591 444

(26.931-70.557)

50 11.091 222

(5.327-23.093)

58 16.443 284

(7.096-38.106)

50 29.183 584

(15.342-55.508)

50 16.714 334

(6.959-40.140)

83 63.734 768

(21.141-192.146)

54 23.505 435

(11.286-48.955)

143 84.888 496

(46.445-155.151)

cn

CO Tabela 3. -continuação- Sorotipo Diluente com ALPO43 Semana 0 13vPnCa Proporção Semana 0 13vPnC + ALPO43 Proporção Proporção Semana 4 Semana 4: Semana 4 Semana 4: Semana 0 Semana 4 Semana 4 : (95% Cl) Semana 0 (95% Cl) Semana 0 Semana 0 9V 289 995 3,4 205 15.780 125 208 43.331b 217 (7.193-34.616) (23.256-71.510) 14 437 177 0,4 61 6.906 113 70 16.076 322 (3.416-13.962) (9.649-26.785) 18C <100 <100 1,0 50 21.283 426 50 35.040 701 (15.770-28.725) (24.708-49.692) 19A <100 <100 1,0 121 113.599 939 144 280.976 1.951 (54.518-236.707) (119.587-660.167) 19F <100 <100 1,0 50 14.365 287 50 24.912 498 (7.346-28.090) (9.243-67.141) 23F <100 <100 1,0 50 5.323 106 50 15.041 301 (1.894-14.962) (4.711-48.018) a: GMTs de soros reunidos consistiu de volumes iguais de soro de cada coelho individual dentro de um grupo b: Estatisticamente diferente (p = 0,022) do grupo de tratamento sem ALPO4 Tabela 4. OPA GMTs de S. pneumoniae para Pools de Soro de Coelho NZW Depois de Imunização com Duas Doses de Glicoconjugado Pneumocócico 13-valente

Sorotipo Semana O 13vPnCa Proporção de Semana 4 : Semana O 13vPnC + ALPOa2 Proporção de Semana 4 : Semana 4 Semana O Semana 4 Semana O 1 <8 64 16 <8 64 16 3 <8 8 2 <8 16 4 4 <8 16 4 <8 32 8 <8 128 32 <8 512 128 6A 8 128 16 8 512 64 6B <8 256 64 8 1.024 128 7F 8 64 8 8 128 16 9V 8 64 8 8 128 16 14 16 32 2 16 32 2 18C 8 256 32 <8 256 64 19A <8 256 64 <8 1.024 256 19F <8 128 32 <8 512 128 23F 8 64 8 <8 256 64 A: Os pools consistiram de volumes iguais de soro de coelhos individuais dentro de um grupo de tratamento (n = 12) Estudo rf HT01-0036

O estudo η2 HT01-0036 comparou reações imunes de coelho com os polissacarídeos (PSs) contidos na vacina, depois de imunização com a vacina 13vPnC com ou sem conjugação com a proteína CRMi97. Coelhos 5 New Zealand White foram imunizados por via intramuscular na semana 0 e na semana 2 com uma dose de 2,2 μg de cada PS (exceto 4,4 μg de 6B). Os animais receberam uma de três preparações de vacina: (a) 13vPnC (PS di- retamente conjugado a CRMi97), (b) 13vPnPS, (PS livre) ou (c) 13vPnPS + CRMi97 (PS livre misto com CRMi97). Todas as preparações de vacina con- 10 tinham AIPO4 como o adjuvante em 125 μg/ dose.

Reações imunes específicas do sorotipo para todas as prepara- ções de vacina foram avaliadas em um ELISA de IgG e OPA mediado pelo complemento medindo anticorpos funcionais. As reações imunes foram comparadas entre os grupos de tratamento.

A Tabela 5 apresenta dados de GMT obtidos de sangrias da

semana 4 analisadas em ELISAs de IgG antígeno específicas. Análises adi- cionais mostram a proporção de valores de GMT na semana 4 para a sema- na 0. Os dados indicam que a preparação de vacina conjugada provocou títulos séricos de IgG maiores do que PS ou vacina de CRMi97 +PS livre. 20 Com a exceção de S. pneumoniae tipo 14, a vacina 13vPnC foi capaz de induzir anticorpos funcionais para as cepas típicas de S. pneumoniae em um OPA (Tabela 6). Depois de duas imunizações com ou a vacina 13vPnPS ou 13vPnPS + CRMi97, nenhuma pode induzir títulos OPA > 8 vezes na semana 4 em relação à semana O para 10 dos 13 sorotipos medidos (Tabela 6).

Em conclusão, estes resultados indicam que a conjugação dos

polissacarídeos da vacina pneumocócica 13-valente produz maiores títulos séricos de IgG e maior atividade de anticorpos funcionais global do que a vista com polissacarídeo livre somente ou misto com CRMi97 não conjugado. Tabela 5. Reações de IgG de Coelho (GMTs) a PnPS por ELISA Depois de Imunização com Duas Doses de Glicoconjugado Pneumocócico 13-valente

Sorotipo

1

3

4

5

6A

6B

Semana O

13vPnPS (PS livre)

Semana 4 Proporção (95% Cl) Semana 4 : Semana O Semana O

13vPnPS = CRM197 (PS mixed com CRMig) Semana 4 (95% Cl)

13vPnC

Proporção Semana 4 Proporção

Semana 4 : Semana 0 (95% Cl) Semana 4 :

Semana 0 Semana 0

378

57

50

343

154

63

2.290 (843-5.790) 240 (64-908) 379 (150-959) 226 (113-450) 466 (316-688) 727 (384-1.375)

5,8

4,2

7,6

4,5

3,0

11,6

395

89

50

50

98

62

1.959 (809-4.739) 163 (74-358) 607 (313-1.178) 321 (147-701) 210 (95-464) 745 (384-1.440)

5,0

1,8

12,1

6,4

2,1

12,0

472 35.970 76,2

(29.130-44.417)

50 10.414 208,3

(10.414-16.676)

50 12.890 257,8

(9.117-18.224)

50 35.264 705,3

(24.467-50.824)

163 234.245 1.437,1

(167.152-328.283)

131 33.599 256,5

(22.934-49.222)

Oi

-J Tabela 5. -continuação- Sorotipo Semana 0 13vPnPS Proporção Semana 0 13vPnPS = CRM197 Proporção Semana 0 13vPnC Proporção (PS livre) Semana 4: (PS mixed com CRM»?) Semana 4: Semana 4 Semana 4: Semana 4 Semana 0 Semana 4 Semana 0 (95% Cl) Semana 0 (95% Cl) (95% Cl) 7F 50 61 1,2 50 72 1,4 50 35.702 714,0 (39-95) (47-111) (24.350-52.347) 9V 50 104 2,1 55 169 3,0 50 50.033 1.000,7 (48-195) (74-390) (34.765-72.007) 14 66 298 4,5 50 195 3,9 50 20.121 402,4 (117-757) (71-535) (12.087-32.138) 18C 89 1.555 17,5 66 761 11,5 101 71.451 707,4 (655-3.688) (300-1.935) (32.745-124.641) 19A 50 89 1,8 50 80 1,6 50 23.485 469,7 (44-179) (39-163) (12.857-42.723) 19F 61 1.362 22,3 61 991 16,3 67 19.358 288,9 (559-3.317) (370-2.654) (12.553-33.173) 23F 73 1.085 14,9 121 638 5,3 68 45.972 676,1 (487-2.420) (311-1.311) (25.134-84.089) Tabela 6. Títulos de S. pneumoniae OPA para Grupos Séricos de Coelho Depois de Imunização com Duas Doses de Vacinas Pneumocócicas 13-valentes

Títulos de OPA Sem Tratamento 13vPnPS (PS livre) 13vPnPS +CRM197 13vPnC (PS livre misturado com CRMi97) Sorotipo Semana 0a Semana 4 Proporção Semana 4 Proporção Semana 4 Proporção Semana 4: Semana 4: Semana 4: Semana 0 Semana 0 Semana 0 1 4 16 4 16 4 8 32 3 4 4 1 4 1 4 8 4 4 4 1 4 1 4 64 5 4 32 8 16 4 16 64 6A 8 64 8 32 4 32 664 6B 8 64 8 32 4 32 32 7F 16 32 2 16 1 16 16 9V 16 16 1 32 2 32 8 14 16 16 1 16 1 16 2 18C 4 16 4 16 4 8 64 19A 8 8 1 8 1 16 64 19F 4 4 1 4 1 8 64 23F 16 32 2 16 1 32 32 a: Usado como valores da semana O para todos os grupos Exemplo 17

Procedimento Alternativo para Conjugação de Sacarídeo Pneumocócico So- rotipo 19A - CRM-IQ7 Visão Geral

5 O exemplo seguinte descreve um processo para produzir um

conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae sorotipo 19A encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo. Em geral, depois de oxidação por periodato (ativação) para gerar grupamentos aldeído reativos sobre o polissacarídeo, o polissacarídeo soro- 10 tipo 19A foi coliofilizado com a proteína de veículo e foi realizada conjugação em dimetil sulfóxido (DMSO) através de um mecanismo de aminação reduti- va na presença de cianoboro-hidreto de sódio. Ao contrário dos processos de conjugação envolvendo discreta liofilização de polissacarídeos e proteí- nas de veículo em DMSO, ou processos envolvendo coliofilização aquosa de

polissacarídeos e proteínas de veículo sem DMSO, o aprimoramento do pro- cesso seguinte proporcionou aprimorada eficiência da conjugação e controle sobre a estabilidade dos polissacarídeos sorotipo 19A conforme medido pelo tamanho molecular e pela percentagem de sacarídeo livre. Embora este pro- cesso seja descrito para o polissacarídeo sorotipo 19A, este processo tam- 20 bém pode ser usado para sorotipos que são estruturalmente similares ao sorotipo 19A, tais como 6A, 6B, e 19F os quais também contêm ligações fos- fodiéster entre suas unidades de repetição.

Ativação

Recipientes de polissacarídeo sorotipo 19A foram degelados e 25 combinados em um vaso de reação. Foram realizadas reações de oxidação em acetato de sódio a 10 mM (pH 5) pela adição de tampão de acetato de sódio a 100 mM (pH 5) em uma concentração de polissacarídeo de 2 mg/mL. Foi realizada oxidação na presença de periodato de sódio por incu- bação em 23 + 2 0C por 16 a 24 horas com centrifugação a 150 rpm.

Purificação de Polissacarídeo Ativado

Concentração e diafiltração do polissacarídeo ativado sorotipo 19A foi realizada com cassetes de ultrafiltração de 0,093 m2 (1 ft2) de polis- sulfona Pall Centramate de 30K ou 100K de MWCO. Foi usado um estímulo de membrana alvo de 2 gramas de polissacarídeo por 0,093 m2 (ft2) de área de membrana para purificação do polissacarídeo ativado. O sistema de ultra- filtração foi equilibrado em tampão de acetato de sódio a 10 mM (pH 5) antes 5 da adição da solução da reação de oxidação. A solução da reação de oxida- ção foi então concentrada e diafiltrada contra acetato de sódio a 10 mM (pH 5). O polissacarídeo ativado foi então armazenado em 5 + 3°C por até 14 dias anes do material ser combinado para liofilização.

Processo de Coliofilização e Conjugação O pH do polissacarídeo ativado sorotipo 19A foi ajustado para

pH 6,5 + 0,2 pela adição de fosfato de sódio a 1 M dibásico. O polissacarí- deo ativado foi combinado com sucrose em uma proporção de 25 gramas de sucrose por grama de polissacarídeo, seguida por combinação com CRMi97 em uma proporção de 0,8 sacarídeo / proteína. Depois de congelamento 15 com revestimento (shell freezing), os frascos de vidro de 100 ml_ foram dis- postos em armazenamento em -25°C.

Os frascos de polissacarídeo / CRMig7 coliofilizados foram re- movidos do freezer a -25°C e deixados para equilibrar até a temperatura ambiente em uma coifa de fluxo laminar. Os frascos foram amostrados alea- 20 toriamente para análise da umidade. Dissolução do material de polissacarí- deo ativado / CRMig7 coliofilizado em DMSO foi realizada a 2 mg/mL nos fracos de liofilização. A solução de polissacarídeo ativado / CRM197 DMSO foi então transferida para o vaso de conjugação e agitada por 60 a 75 min em 23 + 2°C a 70 a 120 rpm. Com agitação, um equivalente molar de ciano- 25 boro-hidreto de sódio foi então adicionado, seguido por 1% de WFI. A solu- ção da reação foi então agitada em 23 + 2°C por 8 a 16 horas. Um equiva- lente molar de boro-hidreto de sódio foi adicionado ao vaso de conjugação para a reação de capeamento e a solução foi agitada em 23 + 2°C por 3 a

16 horas. A solução da reação foi em seguida diluída 10 vezes em cloreto de sódio a 0,9% frio (2 a 8°C).

A solução da reação diluída 10 vezes foi passada através de um filtro de de 1,2/5,0 μιτι e em seguida concentrada até 1 a 2 g/L sobre um sis- tema de ultrafiltração equipado com with uma membrana de 0,093 m2 (1 ft2) de celulose regenerada de 300 K ou 1000 K de MWCO. Um estímulo de filtro de 1 a 2 gramas de polissacarídeo por 0,093 m2 (1 ft2) de área de membrana foi usado para a purificação. Em seguida foi realizada uma diafiltração de 5 10X da solução do conjugado contra cloreto de sódio a 0,9%. Na limpeza da membrana, uma diafiltração de 30X da solução do conjugado foi em seguida realizada contra tampão a 5 mM de succinato de sódio / 0,9% de cloreto de sódio (pH 6). O conjugado purificado foi então passado através de um filtro de 0,22 μιτι e foram removidas amostras para experimentação pré-FBC. A 10 solução do conjugado foi então armazenada em 5 + 3°C por até 30 dias até preparação do Concentrado da Massa Final (FBC).

Preparação do Concentrado da Massa Final

A solução do conjugado pré-FBC foi diluída até uma concentra- ção alvo de 0,5 g/L usando tampão a 5 mM de succinato de sódio / 0,9% de 15 cloreto de sódio. A solução foi misturada com agitação magnética por apro- ximadamente 15 minutos e em seguida passada através de um filtro de 0,22 μιτι para dentro de frascos de FBC de polipropileno estéreis. A solução do conjugado de FBC foi então armazenada em 5 + 3°C.

Foi realizada caracterização do conjugado conforme descrito no

Exemplo 4.

Coliofilização vs. Discreta Liofilização em DMSO

Foram produzidos doze lotes de 1 a 6 gramas de conjugado de sorotipo 19A, com seis produzidos usando o método de co-liofiilização com DMSO descrito acima e seis produzidos usando um método de discreta Iiofi- 25 lização com DMSO conforme descrito no Exemplo 8 acima. Foi realizada caracterização do conjugado conforme descrito no Exemplo 4, incluindo o uso de meios de cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B) para traçar o perfil da distribuição de tamanho molecular relativo do conjugado e uma prova de ácido urônico para medir a concentração de sacarídeo. Com res- 30 peito à estabilidade de longo termo do conjugado de sorotipo 19A, uma re- dução no tamanho molecular de cerca de 10% com um aumento concomi- tante nos níveis de sacarídeo livre de cerca de 10% é esperada durante um período de 18 meses. Por conseguinte, na produção de conjugados do soro- tipo 19A, um valor preferencial para tamanho molecular do conjugado é cer- ca de 70% de 0,3 Kd, com um nível de sacarídeo livre preferencial abaixo de cerca de 20 a 25%.

Conforme mostrado na Tabela 7, a caracterização dos conjuga- dos de sorotipo 19A produzidos por ambos os métodos mostrou que o pro- cesso de coliofilização proporcionou características de conjugado significati- vamente aprimoradas em termos tanto de tamanho molecular bem como da percentagem de sacarídeo livre comparado com o processo de discreta liofi- lização.

Tabela 7. Comparações de Características de Conjugado Chave para Colio- filização do Sorotipo 19A em DMSO vs. Discreta Liofilização

Coliofilizac pão (n = 6) Discreta Liofilização (n = 6) Característica Média Desvio Média Desvio Padrão Padrão % 0,3 Kd (CL-4B) 67 7,2 58 13,0 sacarídeo Sacarídeo Livre (%) <18 <3,5 31 9,2 Deve ser entendido que a discussão e os exemplos precedentes

simplesmente apresentam uma descrição detalhada de algumas modalida- des. Portanto deve ser evidente para aqueles com conhecimento regular da técnica que várias modificações e equivalentes podem ser produzidos sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção.

Todos os artigos de periódicos, outras referências, patentes e requerimentos de patente que são identificados neste requerimento de pa- tente são incorporados por meio de referência em sua totalidade. REFERENCIAS

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34. Patente dos Estados Unidos Ns 4.673.574.

35. Patente dos Estados Unidos N2 4.902.506.

Claims (15)

1. Método para produzir um conjugado imunogênico compreen- dendo polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae sorotipo 19A encadea- do de modo covalente a uma proteína de veículo, o método compreendendo: (a) reagir polissacarídeo sorotipo 19A purificado com um agente oxidante resultando em um polissacarídeo sorotipo 19A ativado; (b) combinar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado com uma proteína de veículo; (c) coliofilizar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo; - (d) ressuspender o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combi- nado e proteína de veículo em dimetil sulfóxido (DMSO); (e) reagir o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo com um agente redutor resultando em um conjugado de polissacarídeo sorotipo 19A : proteína de veículo; e (f) rematar aldeídos não reagidos no conjugado de polissacarí- deo sorotipo 19A : proteína de veículo resultando em um conjugado imuno- gênico compreendendo polissacarídeo de Streptoeoceus pneumoniae soroti- po 19A encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de veículo é CRM197.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o polissaca- rídeo sorotipo 19A ativado e CRM197 são combinados em uma proporção de 0,8:1.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o pH do po- lissacarídeo sorotipo 19A ativado é ajustado para 6,5 + 0,2 antes de combi- nar com a proteína de veículo.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polissaca- rídeo sorotipo 19A ativado é combinado com sucrose antes de combinar com a proteína de veículo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a- dicionalmente purificar o conjugado imunogênico.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente oxidante é periodato de sódio.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente redutor é cia no boro-hidreto de sódio.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que rematar al- deídos não reagidos compreende reagir o conjugado de polissacarídeo soro- tipo 19A : proteína de veículo com boro-hidreto de sódio.

10. Método para produzir um conjugado imunogênico compre- endendo polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae sorotipo 19A enca- deado de modo covalente a uma proteína de veículo, o método compreen- dendo: (a) reagir polissacarídeo sorotipo 19A purificado com periodato de sódio resultando em um polissacarídeo sorotipo 19A ativado; (b) ajustar o pH do polissacarídeo sorotipo 19A ativado para 6,5 ±0,2; (c) combinar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado com sucrose; (d) combinar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado com uma proteína de veículo em uma proporção de 0,8:1; (e) coliofilizar o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo; (f) ressuspender o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combina- do e proteína de veículo em dimetil sulfóxido (DMSO); (g) reagir o polissacarídeo sorotipo 19A ativado combinado e proteína de veículo com cianoboro-hidreto de sódio resultando em um con- jugado de polissacarídeo sorotipo 19A : proteína de veículo; e (h) rematar aldeídos não reagidos no conjugado de polissacarí- deo sorotipo 19A : proteína de veículo com boro-hidreto de sódio resultando em um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo de Strepto- eoceus pneumoniae sorotipo 19A encadeado de modo covalente a uma pro- teína de veículo.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de veículo é CRMig7.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente purificar o conjugado imunogênico.

13. Método para produzir um conjugado imunogênico compre- endendo um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo em que o referido polissacarídeo compreende uma ligação fosfodiéster entre unidades de repetição, o método compreendendo: (a) reagir o referido polissacarídeo com um agente oxidante re- sultando em um polissacarídeo ativado; (b) combinar o polissacarídeo ativado com uma proteína de veí- culo; (c) coliofilizar o polissacarídeo ativado combinado e proteína de veículo; (d) ressuspender o polissacarídeo ativado combinado e proteína de veículo em dimetil sulfóxido (DMSO); (e) reagir o polissacarídeo ativado combinado e proteína de veículo com um agente redutor resultando em um conjugado de polissacarídeo : prote- ína de veículo; e (f) rematar aldeídos não reagidos no conjugado de polissacarí- deo : proteína de veículo resultando em um conjugado imunogênico com- preendendo polissacarídeo de Streptoeoceus pneumoniae encadeado de modo covalente a uma proteína de veículo.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido polissacarídeo compreendendo uma ligação fosfodiéster entre unidades de repetição é polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae sorotipo 19A, 19F,6A, ou 6B.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a proteína de veículo é CRMi97.