BR112012019757B1

BR112012019757B1 - Composição imunogênica, e, uso de uma mistura de conjugado de polissacarídeo-proteína multi valente

Info

Publication number: BR112012019757B1
Application number: BR112012019757-6A
Authority: BR
Inventors: Michael J. Caulfield; Patrick L. Ahl; Jeffrey T. Blue; Jayme L. Cannon
Original assignee: Merck Sharp & Dohme Corp
Priority date: 2010-02-09
Filing date: 2011-02-03
Publication date: 2020-11-17
Also published as: JP2013518891A; AU2011216095B2; AR080122A1; CL2012002195A1; CA2788680C; US20120301502A1; EP2533805A4; CA2788680A1; BR112012019757B8; ECSP12012100A; WO2011100151A1; MA34051B1; PE20121698A1; CN102858365A; RU2012138368A; AU2011216095A1; US8192746B2; KR20120114345A; IL221283A0; SG183199A1

Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, USO DE UMA MISTURA DE CONJUGADO DE POLISSACARÍDEO- PROTEÍNA MULTIVALENTE A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente tendo 15 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos. Cada conjugado consiste de um polissacarídeo capsular preparado a partir de um 14,18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F) conjugado a uma proteína carreadora, preferivelmente CRM197. A composição imunogênica, preferivelmente formulada como uma vacina em um adjuvante com base em alumínio, fornece ampla cobertura contra doença pneumocócica, particularmente em bebês e crianças jovens.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Nenhuma

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente tendo 15 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos. Cada conjugado consiste de um polissacarídeo capsular preparado a partir de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae(1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F) conjugado a uma proteína carreadora, preferivelmente CRMI97. A composição imunogênica, preferivelmente formulada como uma vacina em um adjuvante com base em alumínio, fornece ampla cobertura contra doença pneumocócica, particularmente em bebês e crianças jovens.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Streptococcus pneumoniaeé uma causa significante de doença séria no mundo todo. Em 1997, o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) estimou ter havido 3.000 casos de meningite pneumocócica, 50.000 casos de bacteremia pneumocócica, 7.000.000 de casos de otite média pneumocócica e 500.000 casos de pneumonia pneumocócica anualmente nos Estados Unidos. Ver Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8): 1-13. Além disso, as complicações destas doenças podem ser significante com alguns estudos relatando até 8 % de mortalidade e 25 % de sequelas neurológicas com meningite pneumocócica. Ver Arditi etal., 1998, Pediatrics 102: 1087-97.

As vacinas de polissacarídeo pneumocócico multivalentes que foram licenciadas por muitos anos têm se mostrado valiosas na prevenção da doença pneumocócica em adultos, particularmente, nos idosos e naqueles em alto risco. Entretanto, bebês e crianças jovens respondem insuficientemente aos polissacarídeos pneumocócicos não conjugados. A vacina pneumocócica conjugada, Prevnar®, contendo os 7 sorotipos mais frequentemente isolados (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que causa doença pneumocócica invasiva em crianças jovens e bebês no momento, foi primeiro licenciada nos Estados Unidos em Fevereiro de 2000. A seguir do uso universal de Prevnar® nos Estados Unidos, houve uma redução significante na doença pneumocócica invasiva em crianças devido aos sorotipos presentes no Prevnar®. Ver Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36): 893-7. Entretanto, existem limitações na cobertura de sorotipo com Prevnar® em certas regiões do mundo e alguma evidência de certos sorotipos emergentes nos Estados Unidos (por exemplo, 19A e outros). Ver O’Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159: 634-44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348: 1737-46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354: 1455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196: 1346-54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48: S181- S189.

Publicação do Pedido de Patente US 2006/0228380 Al descreve uma vacina com conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócicos 13-valente incluindo os sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Publicação do Pedido de Patente Chinês N° CN 101590224 A descreve um vacina com conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócicos 14-valente incluindo sorotipos 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19Fe23F.

Outros PCVs têm coberto 7, 10, 11, ou 13 dos sorotipos contidos na PCV-15, mas interferência imune tem sido observada para alguns sorotipos (por exemplo, proteção mais baixa para o sorotipo 3 em PCV-11 da GSK) e taxas de resposta mais baixas para o sorotipo 6B na PCV-13 da Pfizer. Ver Prymula et al., 2006, Lancet 367: 740-48 e Kieninger et al.,Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, apresentado na 48a Anual ICAAC/460encontro Anual ISDA, Washington DC, 25 a 28 de outubro de 2008.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma composição imunogênica que compreende (1) um mistura de conjugado de polissacarídeo-proteína multivalente que consiste de polissacarídeos capsulares de 15 sorotipos diferentes de S. pneumoniaeconjugados a uma proteína carreadora, e (2) um carreador farmaceuticamente aceitável. Mais especificamente, a presente invenção fornece uma composição de vacina com conjugado pneumocócico 15-valente (PCV-15) que compreende uma mistura de conjugado de polissacarídeo-proteína multivalente que consiste de polissacarídeos capsulares dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, e 33F de S. pneumoniaeconjugados a uma proteína carreadora; e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização específica, a composição imunogênica contém polissacarídeos capsulares dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F e a proteína carreadora é CRM197.

Em certas formas de realização, a composição compreende adicionalmente um adjuvante. Em certas formas de realização, o adjuvante é um adjuvante com base em alumínio, tal como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio ou hidróxido de alumínio. Em uma forma de realização particular da invenção, o adjuvante é fosfato de alumínio.

A presente invenção também fornece um método para induzir uma resposta imune a um polissacarídeo capsular de S. pneumoniae,que compreende administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica acima.

A presente invenção fornece ainda uma composição imunogênica administrada como uma dose única de 0,5 ml formulada para conter: 2 pg de cada polissacarídeo, exceto para 6B a 4 pg; cerca de 32 pg de proteína carreadora CRMI97; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); 150 mM de cloreto de sódio e 20 mM de tampão de L-histidina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Comparação de GMCs para PCV-15 relativo ao Prevnar® em Macacos Rhesus Bebês (Prevnar sorotipos, PD-2 e PD-3). As barras de erro indicam 2 erros padrão.

Figura 2: GMCs específicos de sorotipo para sorotipos não Prevnar® em Macacos Rhesus Bebês imunizados com PCV-15. As barras de erro indicam 2 erros padrão.

Figura 3: NZWR-1: Comparação de títulos médios geométricos em coelhos imunizados com PCV-15 sem (OxA) ou com APA (81) (Pós dose 2). As barras de erro indicam 95 % de Cl na diferença de vezes na média geométrica (PCV-15 sem APA /PCV-15 com APA).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende, que consiste essencialmente de, ou altemativamente, que consiste de 15 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados contém um polissacarídeo capsular diferente conjugado a uma proteína carreadora, e em que os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae,juntos com um carreador farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, a proteína carreadora é CRMI97. A composição imunogênica pode compreender ainda um adjuvante, tal como um adjuvante com base em alumínio, tal como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. A presente invenção também fornece um método para induzir uma resposta imune a um polissacarídeo capsular conjugado de S. pneumoniae,que compreende administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica multivalente acima.

Como ilustrado nos Exemplos, abaixo, estudos pré-clínicos em macacos Rhesus bebês demonstraram respostas de anticorpo robustas a todos os 15 sorotipos em PCV-15 que são comparáveis com as respostas para os 7 sorotipos comuns no Prevnar®. A descoberta dos Requerentes de que uma vacina com conjugado pneumocócico 15 valente incluindo a adição de novos conjugados de polissacarídeo-proteína contendo sorotipos 22F e 33F fornece respostas de anticorpo robustas demonstra a praticabilidade de expandir a cobertura de sorotipos pneumocócicos não cobertos pelas vacinas pneumocócicas existentes.

O termo “compreende” quando usado com a composição imunogênica da invenção refere-se à inclusão de qualquer um de outros componentes (submetido às limitações da linguagem “que consiste de” para a mistura de antígeno), tais como adjuvantes e excipientes. O termo “que consiste de’ quando usado com a mistura de conjugado de polissacarídeo- proteína multivalente refere-se a uma mistura tendo estes 15 conjugados de polissacarídeo proteína de S', pneumoniaeparticulares e nenhum outro dos conjugados de polissacarídeo proteína de S. pneumoniaede um sorotipo diferente.

Conjugados de polissacarídeo capsular-proteína de Streptococcus pneumoniae

Os polissacarídeos capsulares de Steptococcus pneumoniae podem ser preparados pelas técnicas padrão conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, os polissacarídeos podem ser isolados de bactérias e podem ser ajustados em algum grau pelos métodos conhecidos (ver, por exemplo, as Patentes Européias EP497524 e EP497525) e preferivelmente pela microfluidização. Os polissacarídeos podem ser ajustados de modo a reduzir a viscosidade em amostras de polissacarídeo e/ou para melhorar a filtrabilidade para os produtos conjugados. Na presente invenção, os polissacarídeos capsulares são preparados a partir de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae.

Em uma forma de realização, cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico é cultivado em um meio com base em soja. Os polissacarídeos individuais são depois purificados através de etapas padrão incluindo centrifugação, precipitação, e ultra-filtração. Ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 2008/0286838 e Pat. US 5.847.112.

As proteínas carreadoras são preferivelmente proteínas que não são tóxicas e não reatogênicas e obteníveis em quantidade e pureza suficientes. Uma proteína carreadora pode ser conjugada ou unida com um polissacarídeo de S. pneumoniaepara realçar a imunogenicidade do polissacarídeo. As proteínas carreadoras devem ser passíveis de procedimentos de conjugação padrão. Em uma forma de realização particular da presente invenção, CRMI97 é usada como a proteína carreadora. Em uma forma de realização, cada polissacarídeo capsular é conjugado à mesma proteína carreadora (cada molécula de polissacarídeo capsular que é conjugado a uma proteína carreadora única). Em uma outra forma de realização, os polissacarídeos capsulares são conjugados a duas ou mais proteínas carreadoras (cada molécula de polissacarídeo capsular sendo conjugado a uma proteína carreadora única). Em uma tal forma de realização, cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é tipicamente conjugado à mesma proteína carreadora.

CRM197 é uma variante não tóxica (isto é, toxóide) da toxina da difteria. Em uma forma de realização, a mesma é isolada de culturas de Corynebacterium diphtheriacepa C7 ((3197) cultivadas em casaminoácidos e meio com base em extrato de levedura. Em uma outra forma de realização, CRM197 é preparado recombinantemente de acordo com os métodos descritos na Pat. US 5.614.382. Tipicamente, CRM497 é purificada através de uma combinação de ultra-filtração, precipitação com sulfato de amónio, e cromatografia de troca iônica. Em algumas formas de realização, CRM197é preparado em Pseudomonas fluorescens usando a Pfenex Expression Technology® (Pfenex Inc., San Diego, CA).

Outras proteínas carreadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas adicionais tais como DT (Toxóide da difteria), TT (toxóide do tétano) ou fragmento C de TT, toxóide da coqueluche, toxóide do cólera (por exemplo, como descrito na Publicação do Pedido de Patente Internacional N2 WO 2004/083251), E. coliLT, E. coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa.Proteínas de membrana externa bacteriana tais como complexo de membrana externa c (OMPC), porinas, proteínas de ligação de transferrina, proteína A de superfície de pneumocócico (PspA; Ver a Publicação do Pedido de Patente Internacional N2 WO 02/091998), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), peptidase C5a de estreptocócicos do Grupo A ou Grupo B, ou proteína D de Haemophilus influenzae,pneumolisina pneumocócica (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13) incluindo ply destoxificada em alguma maneira por exemplo dPLY-GMBS (Ver a Publicação do Pedido de Patente Internacional N2 WO 04/081515) ou dPLY- formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteínas Pht por exemplo fusões de PhtDE, fusões de PhtBE (Ver as Publicações do Pedido de Patente Internacional N~ WO 01/98334 e WO 03/54007), também podem ser usados. Outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis),PD (proteína D de Haemophilus influenzae-,ver, por exemplo, Patente Européia N2 EP 0 594 610 B), ou equivalentes destes imunologicamente funcionais, peptídeos sintéticos (Ver as Patentes Européias N~ EP0378881 e EP0427347), proteínas de choque térmico (Ver as Publicações do Pedido de Patente Internacional N~ WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas da coqueluche (Ver a Publicação do Pedido de Patente Internacional N2 WO 98/58668 e Patentes Européias N2 EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou hormônios (Ver a Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 91/01146), proteínas artificiais que compreendem epítopos de célula T CD4+ humana múltiplos de vários antígenos derivados de patógenos (Ver Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31: 3816-3824) tais como a proteína N19 (Ver Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72: 4884-7), proteínas de captação de ferro (Ver a Publicação do Pedido de Patente Internacional Na WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile(Ver a Publicação de Patente Internacional Na WO 00/61761), e flagelina (Ver Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Left 64:9) também pode ser usado como proteínas carreadoras.

Outros mutantes DT podem ser usados, tais como CRM 176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al., 1973, T Biol Chem 218: 3838-3844); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gin ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações divulgadas na Pat. US 4.709.017 ou Pat. US 4.950.740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações divulgadas na Pat. US 5.917.017 ou Pat. US 6.455.673; ou fragmento divulgado na Pat. US 5.843.711.

Os polissacarídeos purificados são quimicamente ativados para fabricar os sacarídeos capazes de reagir com a proteína carreadora. Uma vez ativado, cada polissacarídeo capsular é separadamente conjugado a uma proteína carreadora para formar um glicoconjugado. Os conjugados de polissacarídeo podem ser preparados pelas técnicas de ligação conhecidas.

Em uma forma de realização, a ativação química dos polissacarídeos e a conjugação subsequente à proteína carreadora são obtidas por meios descritos nas Pat. US 4.365.170, 4.673.574 e 4.902.506. Em resumo, esta química acarreta necessariamente a ativação de polissacarídeo pneumocócico pela reação com qualquer agente de oxidação que oxide um grupo hidroxila terminal para um aldeído, tal como periodato (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio, ou ácido periódico). A reação leva a uma clivagem oxidativa aleatória de grupos hidroxila vicinais dos carboidratos com a formação de grupos aldeídos reativos.

A ligação à proteína carreadora (por exemplo, CRM197) pode ser pela aminação redutiva via aminação direta aos grupos lisila da proteína. Por exemplo, a conjugação é realizada pela reação de uma mistura do polissacarídeo ativado e a proteína carreadora com um agente redutor tal como cianoboroidreto de sódio. Os aldeídos não reagidos são depois encapusados com a adição de um agente redutor forte, tal como boroidreto de sódio.

Em uma outra forma de realização, o método de conjugação pode contar com a ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de l-cian-4- dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O sacarídeo ativado pode ser assim ligado diretamente ou via um grupo espaçador (ligante) a um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para dar um polissacarídeo tiolado que pode ser ligado ao carreador via uma ligação de tioéter obtida depois da reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo usando GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo usando iodoacetimida [por exemplo etil iodoacetimida HCI] ou bromoacetato de N-succinimidila ou STAB, ou STA, ou SBAP). Preferivelmente, o éster de cianato (opcionalmente fabricado pela química de CDAP) é ligado com hexano diamina ou di-hidrazida do ácido adípico (ADH) e o sacarídeo derivado com amino é conjugado à proteína carreadora usando a química da carbodi-imida (por exemplo EDAC ou EDC) via um grupo carboxila no carreador de proteína. Tais conjugados são descritos nas Publicações de Pedido de Patente Internacional N- WO 93/15760, WO 95/08348 e WO 96/29094; e Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40: 245-256.

Outras técnicas adequadas usam carbodi-imidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxissuccinimida, S— NHS, EDC, TSTU. Muitas são descritas na Publicação do Pedido de Patente Internacional N2 WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligante de carbonila que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Ver Betell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 2572-4; Heam et al., 1981, J. Chromatogr. 218: 509-18) seguido pela reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isto pode envolver a redução do terminal anomérico a um grupo hidroxila primário, a proteção/desproteção opcional do grupo hidroxila primário, a reação do grupo hidroxila primário com CDI para formar um intermediário de CDI carbamato e ligação do intermediário de CDI carbamato com um grupo amino em uma proteína.

Em uma forma de realização, antes da formulação, cada antígeno de polissacarídeo capsular pneumocócico é individualmente purificado da S. pneumoniae,ativado para formar aldeídos reativos, e depois covalentemente conjugado usando aminação redutiva à proteína carreadora CRM197.

Depois da conjugação do polissacarídeo capsular à proteína carreadora, os conjugados de polissacarídeo-proteína são purificados (enriquecidos com respeito à quantidade de conjugado de polissacarídeo- proteína) por uma ou mais de uma variedade de técnicas. Os exemplos destas técnicas são bem conhecidas pelo técnico habilitado e incluem operações de concentração/diafiltração, ultrafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e filtração profunda. Ver, por exemplo, a Pat. US 6.146.902.

Composições Farmacêuticas/Vacina

A presente invenção fornece ainda composições, incluindo composições farmacêuticas, imunogênicas e de vacina, que compreendem, que consistem essencialmente de, ou altemativamente, que consistem de 15 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados contém um polissacarídeo capsular diferente conjugado a uma proteína carreadora, e em que os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae,juntos com um carreador e um adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. Estes conjugados pneumocócicos são preparados por processos separados e formulados a granel em uma única formulação de dosagem.

Como aqui definido, um “adjuvante” é uma substância que serve para realçar a imunogenicidade de uma composição imunogênica da invenção. Um adjuvante imune pode realçar uma resposta imune a um antígeno que é fracamente imunogênico quando administrado sozinho, por exemplo, não induzindo nenhum ou títulos de anticorpo fracos ou resposta imune mediada por célula, aumenta os títulos de anticorpo para o antígeno, e/ou diminui a dose do antígeno eficaz para se obter uma resposta imune no indivíduo. Assim, adjuvantes são frequentemente administrados para reforçar a resposta imune e são bem conhecidos pelo técnico habilitado. Os adjuvantes adequados para realçar a eficácia da composição incluem, mas não são limitados a: (1) sais de alumínio (alume), tal como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão de óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimuladores específicos tais como muramil peptídeos (definidos abaixo) ou componentes da parede celular bacteriana), tal como, por exemplo, (a) MF59 (Publicação do Pedido de Patente Internacional N2 WO 90/14837), contendo 5 % de Esqualeno, 0,5 % de Tween 80, e 0,5 % de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE) formulada em partículas de submícron usando um microfluidizador tal como o microfluidizador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10 % de Esqualeno, 0,4 % de Tween 80, 5 % de polímero L121 bloqueado com pluronic, e thr-MDP microfluidizado em uma emulsão submicron ou turbilhonado para gerar uma emulsão de tamanho de partícula grande, (c) sistema de adjuvante Ribi® (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2 % de Esqualeno, 0,2 % de Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana do grupo que consiste de monofosforilipídeo A (MPL®) 3-O-desailado descrito na Pat. US 4.912.094, trealose dimicolato (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL+CWS (Detox®); e (d) um Montanide ISA; (3) adjuvantes de saponina, tai como Quil A ou STIMULON® QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (ver, por exemplo, a Pat. US 5.057.540) pode ser usado ou partículas geradas a partir destes tais como ISCOM (complexos imunoestimuladores formados pela combinação de colesterol, saponina, fosfolipídeo, e proteínas antipáticas) e Iscomatrix (tendo essencialmente a mesma estrutura como um ISCOM mas sem a proteína); (4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos de lipídeo A sintéticos tais como compostos de aminoalquil glicosamina fosfato (AGP), ou derivados ou análogos destes, que são disponíveis da Corixa, e que são descritos na Patente US 6.113.918; um tal AGP é 2-[(R)-3-tetra- decanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Desóxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoil] -2- [(R)-3 -tetradecanoiloxitetradecanoil-amino] - b-D-glicopiranosídeo, que também é conhecido como 529 (antigamente conhecido como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável (5) polinucleotídeos sintéticos tais como oligonucleotídeos contendo motivo(s) CpG (Pat. US 6.207.646); e (6) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferons (por exemplo, gama interferon), fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator estimulador de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF), moléculas coestimuladoras B7-1 e B7-2, etc; e (7) complemento, tal como um trímero de componente de complemento Cad.

Em uma outra forma de realização, o adjuvante é uma mistura de 2, 3, ou mais dos adjuvantes acima, por exemplo, SBAS2 (uma emulsão de óleo em água também contendo monofosforil lipídeo A 3-desacilado e QS21).

Os muramil peptídeos incluem, mas não são limitados a, N- acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L- alanina-2-(r-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidróxi-fosforilóxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Em certas formas de realização, o adjuvante é um sal de alumínio. O adjuvante de sal de alumínio pode ser uma vacina precipitada com alume ou uma vacina absorvida com alume. Os adjuvantes de sal de alumínio são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow, E. e D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) e Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143: 489-493). O sal de alumínio inclui, mas não é limitado a, alumina hidratada, hidrato de alumina, tri-hidrato de alumina (ATH), hidrato de alumínio, tri-hidrato de alumínio, alhidrogel, Superfos, Amphogel, hidróxido de alumínio (III), hidroxifosfato sulfato de alumínio (Adjuvante de fosfato de alumínio (APA)), alumina amorfa, alumina tri-hidratada, ou tri- hidroxialuminio.

APA é uma suspensão aquosa de hidroxifosfato de alumínio. APA é fabricado misturando-se cloreto de alumínio e fosfato de sódio em uma razão volumétrica de 1:1 para precipitar hidroxifosfato de alumínio. Depois do processo de mistura, o material é reduzido no tamanho com um misturador de alto cisalhamento para se obter um tamanho de particular agregado alvo na faixa de 2 a 8 pm. O produto é depois diafiltrado contra solução salina fisiológica e esterilizado com vapor.

Em certas formas de realização, um A1(OH)3 comercialmente disponível (por exemplo Alhidrogel ou Superfos da Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) é usado para absorver proteínas em uma razão de 50 a 200 g de proteína/mg de hidróxido de alumínio. A absorção de proteína é dependente, em uma outra forma de realização, do pi (pH Isoelétrico) da proteína e do pH do meio. Uma proteína com um pi mais baixo absorve para o íon alumínio positivamente carregado mais fortemente do que uma proteína com um PI mais alto. Os sais de alumínio podem estabelecer um depósito de Ag que é liberado lentamente em um período de 2 a 3 semanas, estar envolvidos na ativação não específica de macrófagos e ativação de complemento, e/ou estimulam o mecanismo imune inato (possivelmente através da estimulação de ácido úrico). Ver, por exemplo, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21: 23.

Os conjugados aquosos a granel monovalentes são tipicamente misturados entre si e diluídos para alvejar 8 jig/ml para todos os sorotipos exceto o 6B, que será diluído para alvejar 16 pg/ml. Uma vez diluído, o lote será esterilizado por filtração, e um volume igual de adjuvante de fosfato de alumínio adicionado assepticamente para alvejar uma concentração de alumínio final de 250 pg/ml. O lote com adjuvante, formulado será enchido em frascos de uso único a 0,5 ml/dose.

Em certas formas de realização, o adjuvante é uma sequencia de nucleotídeo contendo CpG, por exemplo, um oligonucleotídeo contendo CpG, em particular, um oligodesóxi-nucleotídeo contendo CpG (CpG ODN). Em uma outra forma de realização, o adjuvante é ODN 1826, que pode ser adquirido da Coley Pharmaceutical Group.

O “nucleotídeo contendo CpG,” “oligonucleotídeo contendo CpG,” “oligonucleotídeo CpG,” e termos similares referem-se a uma molécula de nucleotídeo de 6 a 50 nucleotideos no comprimento que contém uma porção CpG não metilada. Ver, por exemplo, Wang et al., 2003, Vaccine 21: 4297. Em uma outra forma de realização, qualquer outra definição aceita na técnica dos termos é pretendido. Os oligonucleotídeos contendo CpG incluem oligonucleotídeos modificados usando qualquer uma das ligações intemucleosídicas sintéticas, base modificada e/ou açúcar modificado.

Os métodos para o uso de oligonucleotídeos de CpG são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sur et al., 1999, J Immunol. 162: 6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127: 139-58; e Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23: 89-110.

Administração/Dosagem

As composições e formulações da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano suscetível à infecção com pneumocócicos, por meio de administrar a vacina por intermédio de uma via sistêmica ou mucósica. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imune a um polissacarídeo capsular conjugado de S. pneumoniae,que compreende administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um método de vacinar um ser humano contra uma infecção pneumocócica, que compreende a etapa de administrar ao ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção.

“Quantidade eficaz” de uma composição da invenção refere-se a uma dose requerida para evocar anticorpos que significantemente reduzem a probabilidade ou severidade da infectividade de 5. pneumoniaedurante uma inoculação subsequente.

Os métodos da invenção podem ser usados para a prevenção e/ou redução de síndromes clínicas primárias causadas pela S. pneumonia incluindo tanto infecções invasivas (meningite, pneumonia, e bacteremia), quanto infecções não invasivas (otite média aguda, e sinusite).

A administração das composições da invenção podem incluir um ou mais de: injeção por intermédio das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por intermédio da administração mucósica para os tratos oral/alimentar, respiratório ou genitourinário. Em uma forma de realização, a administração intranasal é usada para o tratamento de pneumonia ou otite média (visto que o transporte nasofaríngeo de pneumococos pode ser mais eficazmente prevenida, atenuando assim a infecção no seu estágio mais inicial).

A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunopotetora sem efeitos adversos signifícantes. Tal quantidade pode variar dependendo do sorotipo de pneumocócico. No geral, cada dose compreenderá de 0,1 a 100 pg de cada polissacarídeo, particularmente de 0,1 a 10 pg, e mais particularmente de 1 a 5 pg. Por exemplo, cada dose pode compreender 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, ou 750 ng ou 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 pg.

As quantidades ideais de componentes para uma vacina particular podem ser averiguadas pelos estudos padrão envolvendo a observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em uma outra forma de realização, a dosagem para a vacinação humana é determinada pela extrapolação a partir de estudos de animal para os dados humanos. Em uma outra forma de realização, a dosagem é determinada empiricamente.

Em uma forma de realização, a dose do sal de alumínio é de 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500, ou 700 pg, ou 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 mg ou mais. Ainda em uma outra forma de realização, a dose de sal de alume descrita acima é por pg de proteína recombinante.

Em uma forma de realização particular da presente invenção, a vacina de PCV-15 é uma formulação líquida estéril de polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F individualmente conjugados à CRMI97. Cada 0,5 ml de dose é formulado para conter: 2 pg de cada sacarídeo, exceto para 6B a 4 pg; cerca de 32 pg de proteína carreadora CRM197 (por exemplo, 32 pg ± 5 pg, ± 3 pg, ± 2 pg, ou ± 1 pg); 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de L-histidina. A concentração de cloreto de sódio é de cerca de 150 mM (por exemplo, 150 mM ± 25 mM, 120 mM, ±15 mM, ±10 mM, ou ± 5 mM) e cerca de 20 mM (por exemplo, 20 mM ± 5 mM, 2,5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM, ou ± 0,5 mM) de tampão de L-histidina.

De acordo com qualquer um dos métodos da presente invenção e em uma forma de realização, o indivíduo é o ser humano. Em certas formas de realização, o paciente humano é um bebê (menor do que 1 ano de idade), criança (aproximadamente de 12 a 24 meses), ou criança jovem (aproximada de 2 a 5 anos). Em outras formas de realização, o paciente humano é um paciente idoso (> 65 anos). As composições desta invenção também são adequadas para o uso com crianças mais velhas, adolescentes e adultos (por exemplo, na idade de 18 a 45 anos ou de 18 a 65 anos).

Em uma forma de realização dos métodos da presente invenção, uma composição da presente invenção é administrada como uma inoculação única. Em uma outra forma de realização, a vacina é administrada duas vezes, três vezes ou quatro vezes ou mais, adequadamente espaçadas. Por exemplo, a composição pode ser administrada em intervalos de 1,2, 3, 4, 5, ou 6 meses ou qualquer combinação destes. O programa de imunização pode seguir aquele designado para as vacinas pneumocócicas. Por exemplo, o programa de rotina para bebês e crianças contra a doença invasiva causada pelo S’, pneumoniaeé de 2, 4, 6 e 12 a 15 meses de idade. Assim, em uma forma de realização preferida, a composição é administrada como uma série de 4 doses em 2, 4, 6, e 12 a 15 meses de idade.

As composições desta invenção também podem incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae.Os exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para a inclusão incluem aquelas identificadas nas Publicações do Pedido de Patente Internacional N~ WO 02/083855 e WO 02/053761.

Formulações

As composições da invenção podem ser administradas a um indivíduo por um ou mais métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica, tal como parenteral, transmucósica, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutânea, intra-peritoneal, e formuladas consequentemente.

Em uma forma de realização, as composições da presente invenção são administradas por intermédio da injeção epidérmica, injeção intramuscular, injeção intravenosa, intra-arterial, subcutânea, ou injeção mucósica intra-respiratória de uma preparação líquida. As formulações líquidas para a injeção incluem, soluções e os semelhantes.

A composição da invenção pode ser formulada como frascos de dose única, frascos de dose múltipla ou como seringas pré-enchidas.

Em uma outra forma de realização, as composições da presente invenção são administradas oralmente, e são assim formuladas em uma forma adequada para a administração oral, isto é, como uma preparação sólido ou uma líquida. As formulações orais sólidas incluem tabletes, cápsulas, pílulas, grânulos, pelotas e os semelhantes. As formulações orais líquidas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e os semelhantes.

Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para as formulações líquidas são soluções, suspensões, emulsões ou óleos aquosos ou não aquosos. Os exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila.

Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Os exemplos de óleos são aqueles de origem animal, vegetal, ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, um outro óleo marinho, ou um lipídeo do leite ou ovos.

A composição farmacêutica pode ser isotônica, hipotônica ou hipertônica. Entretanto é frequentemente preferido que uma composição farmacêutica para infusão ou injeção seja essencialmente isotônica, quando a mesma é administrada. Consequentemente, para a armazenagem a composição farmacêutica preferivelmente pode ser isotônica ou hipertônica. Se a composição farmacêutica é hipertônica para a armazenagem, a mesma pode ser diluída para se tomar uma solução isotônica antes da administração.

O agente isotônico pode ser um agente isotônico iônico tal como um sal ou um agente isotônico não iônico tal como um carboidrato. Os exemplos de agentes isotônicos iônicos incluem mas não são limitados a NaCl, CaCl2, KC1 e MgCl2. Os exemplos de agentes isotônicos não iônicos incluem mas não são limitados a manitol, sorbitol e glicerol.

Também é preferido que pelo menos um aditivo farmaceuticamente aceitável seja um tampão. Para alguns propósitos, por exemplo, quando a composição farmacêutica é intencionada para a infusão ou injeção, é frequentemente desejável que a composição compreenda um tampão, que é capaz de tamponar uma solução a um pH na faixa de 4 a 10, tal como de 5 a 9, por exemplo de 6 a 8.

O tampão por exemplo pode ser selecionado do grupo que consiste de tampão de TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato e trietanolamina.

O tampão além disso por exemplo pode ser selecionado de tampões compatíveis USP para o uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para o uso parenteral. Por exemplo o tampão pode ser selecionado do grupo que consiste de ácidos monobásicos tais como acético, benzóico, glicônico, glicérico e láctico; ácidos dibásicos tais como aconítico, adípico, ascórbico, carbônico, glutâmico, málico, succínico e tartárico, ácidos polibásicos tais como cítrico e fosfórico; e bases tais como amónia, dietanolamina, glicina, trietanolamina, e TRIS.

Os veículos parenterais (para a injeção subcutânea, intravenosa, intra-arterial, ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, de Ringer lactado e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutriente, repositores de eletrólito tais como aqueles com base na dextrose de Ringer, e os semelhantes. Os exemplos são líquidos estéreis tais como água e óleos, com ou sem a adição de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. No geral, água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol, e Polissorbato-80 são carreadores líquidos preferidos, particularmente para as soluções injetáveis. Os exemplos de óleos são aqueles de origem animal, vegetal, ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, um outro óleo marinho, ou um lipídeo do leite ou ovos.

As formulações da invenção também podem conter um tensoativo. Os tensoativos preferidos incluem, mas não são limitados a: os tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (habitualmente aludidos como os Tweens), especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), e/ou óxido de butileno (BO), vendido sob a marca DOWFAX®, tal como copolímeros de bloco BO/PO lineares; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etóxi de repetição (óxi-l,2-etanodiíla), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t- octilfenoxipolietoxietanol) sendo de interesse particular; (octilfenóxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídeos tais como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tais como a série Tergitol® NP; éteres graxos de polioxietileno derivados de alcoóis laurílicos, cetílicos, estearílicos e oleílicos (conhecidos como tensoativos Brij), tais como trietileno glicol éter monolaurílico (Brij 30); e ésteres de sorbitano (habitualmente conhecidos como os SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Um tensoativo preferido para incluir na emulsão é Tween 80 (mono-oleato de polioxietileno sorbitano).

As misturas de tensoativos podem ser usadas, por exemplo misturas de Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano tal como monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80) e um octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X- 100) também é adequada. Uma outra combinação útil compreende lauret 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol.

As quantidades preferidas de tensoativos (% em peso) são: ésteres de polioxietileno sorbitano (tal como Tween 80) de 0,01 a 1 %, em particular de cerca de 0,1 %; octil- ou nonilfenóxi-polioxietanóis (tal como Triton X-100, ou outros detergentes na série Triton) de 0,001 a 0,1 %, em particular de 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (tais como lauret 9) de 0,1 a 20 %, preferivelmente de 0,1 a 10 % e em particular de 0,1 a 1 % ou de cerca de 0,5 %.

Em uma outra forma de realização, a composição farmacêutica é liberada em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, o agente pode ser administrado usando infusão intravenosa, um emplastro transdérmico, lipossomas, ou outros modos de administração. Em uma outra forma de realização, materiais poliméricos são usados; por exemplo em microesferas ou um implante.

Também compreendidos pela invenção estão os compostos modificados pela ligação covalente de polímeros solúveis em água tais como polietileno glicol, copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona ou poliprolina. Tais modificações podem aumentar a solubilidade do composto em solução aquosa, eliminar a agregação, realçar a estabilidade física e química do composto, e reduzir enormemente a reatogenicidade do composto. Em uma outra forma de realização, a atividade biológica in vivo desejada é obtida pela administração de tais adutos de polímero-composto menos frequentemente ou em doses mais baixas do que com o composto não modificado.

Em uma forma de realização preferida, a composição de vacina é formulada em tampão de L-histidina com cloreto de sódio.

Tendo descrito as várias formas de realização da invenção com referência à descrição e desenhos anexos, deve ser entendido que a invenção não é limitada a estas formas de realização precisas, e que várias mudanças e modificações podem ser efetuadas nesse ponto por uma pessoa habilitada na técnica sem divergir do escopo ou espírito da invenção como definido nas reivindicações anexas.

Os seguintes exemplos ilustram, mas não limitam a invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Preparação de Polissacarídeos Capsulares X Pneumoniae

Os métodos de cultivar pneumococos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1: 52. Os métodos de preparar polissacarídeos capsulares pneumocócicos também são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente Européia N° EPO497524. Os isolados de subtipos de pneumocócicos são disponíveis da ATCC.

As bactérias são identificadas como diplococos encapsulados, não móveis, Gram positivo, na forma de lanceta que são alfa-hemolítico em sangue-ágar. Os subtipos são diferenciados com base na reação de Quelling usando anti-soros específicos. Ver, por exemplo, a Pat. US 5.847.112.

Bancos de Célula

Os bancos de célula que representam cada um dos sorotipos de S. pneumococcuspresentes no PCV-15 foram obtidos da Merck Culture Collection (Rahway, NJ) em um frasco congelado.

Inoculação

Uma cultura de semente descongelada foi transferida para o fermentador de semente contendo um meio de crescimento pré-esterilizado apropriado.

Fermentação de Semente

A cultura foi cultivada no fermentador de semente com controle de temperatura e pH. O volume inteiro do fermentador de semente foi transferido para o fermentador de produção contendo meio de cultivo pré- esterilizado.

Fermentação de Produção

A fermentação de produção foi o estágio de crescimento de célula final do processo. A temperatura, pH e a taxa de agitação foram controlados.

Inativação

O processo de fermentação foi terminado por intermédio da adição de um agente de inativação. Depois da inativação, o lote foi transferido para o tanque de inativação onde o mesmo foi mantido em temperatura e agitação controlados.

Purificação

Os fragmentos de célula foram removidos usando uma combinação de centrifugação e filtração. O lote foi ultrafiltrado e diafiltrado. O lote foi depois individualizado para o fracionamento com base em solvent que removem impurezas e recuperam o polissacarídeo.

EXEMPLO 2: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de Polissacarídeo- CRMiov Processo de Ativação

Os sacarídeos de sorotipo diferente são individualmente conjugados à proteína carreadora CRM197 purificada usando um fluxo de processo comum. Neste processo o sacarídeo é dissolvido, ajustado a uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado em tampão pela ultrafiltração. A CRM197 purificada é depois conjugada com o sacarídeo ativado e o conjugado resultante é purificado pela ultrafiltração antes de uma filtração em membrana de 0,2 pm final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, tal como pH, temperatura, concentração, e tempo são específicos de sorotipo como descrito neste exemplo.

Etapa 1: Dissolução

O polissacarídeo purificado foi dissolvido em água a uma concentração de 2 a 3 mg/ml. O polissacarídeo dissolvido foi passado através de um homogeneizador mecânico com pressão pré-ajustada de 0 a 1000 bar. A seguir da redução de tamanho, o sacarídeo foi concentrado e diafiltrado com água estéril em um ultrafiltro MWCO de 10 kDa. O permeado foi descartado e o retido foi ajustado a um pH de 4,1 com um tampão de acetato de sódio, concentração final de 50 mM. Para os sorotipos 4 e 5, 100 mM de acetato de sódio no pH 5,0 foi usado. Para o sorotipo 4, a solução foi incubada a 50° ± 2o C. A hidrólise foi interrompida pelo esfriamento de 20 a 24° C.

Etapa 2: Reação de Periodato

Os equivalentes molares de periodato de sódio requeridos para a ativação de sacarídeo pneumocócico foram determinados usando o teor de sacarídeo total. Com mistura completa, a oxidação foi deixada processar entre 3 e 20 horas de 20 a 24° C para todos os sorotipos exceto 5, 7F, e 19F para os quais a temperatura foi de 2 a 6o C.

Etapa 3: Ultrafíltração

O sacarídeo oxidado foi concentrado e diafiltrado com fosfato de potássio a 10 mM, pH 6,4 (10 mM de acetato de sódio, pH 4,3 para o sorotipo 5) em um ultrafiltro MWCO de 10 kDa. O permeado foi descartado e o retido foi ajustado a um pH de 6,3 a 8,4 pela adição de tampão de fosfato de potássio a 3 M.

Processo de Conjugação Etapa 1: Reação de Conjugação

O sacarídeo concentrado foi misturado com proteína carreadora CRM497 em uma razão de carga de 0,2 a 2 para 1. A mistura de sacarídeo-CRMi97 misturada foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A reação de conjugação foi iniciada pela adição de uma solução de cianoboroidreto de sódio para se obter de 1,8 a 2,0 moles de cianoboroidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura de reação foi incubada por 48 a 120 horas de 20 a 24° C (8 a 12° C para os sorotipos 3, 5, 6A, 7F, 19A, e 19F).

Etapa 2: Reação de Boroidreto

No final da incubação de conjugação a mistura de reação foi ajustada de 4 a 8o C, e um pH de 8 a 10 com tampão de bicarbonato de sódio 1,2 M ou tampão de fosfato de potássio 3 M (exceto para o sorotipo 5). A reação de conjugação foi interrompida pela adição da solução de boroidreto de sódio para se obter de 0,6 a 1,0 mol de boroidreto de sódio por mol de sacarídeo (0 mol de boroidreto adicionado para o sorotipo 5). A mistura de reação foi incubada por 45 a 60 minutos.

Etapa 3: Etapas de Ultrafíltração

A mistura de reação foi diafiltrada em um ultrafiltro MWCO de 100 kDa com um mínimo de 20 volumes de tampão de fosfato de potássio a 100 mM, pH 8,4. O retido do ultrafiltro de 100 kDa foi diafiltrado em um ultrafiltro MWCO de 300 kDa com um mínimo de 20 diavolumes de cloreto de sódio a 150 mM de 20 a 24° C. O permeado foi descartado.

Etapa 4: Filtração Estéril

O retido da diafiltração MWCO de 300 kDa foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm e enchido em recipientes de vidro de borossilicato em volumes apropriados para testar a liberação, controles em processo, e formulação (exceto sorotipo 19F). O conjugado de sorotipo 19F foi passado através de um filtro de 0,2 pm em um tanque de contenção e incubado de 20 a 24° C. A seguir da incubação, o conjugado foi diafiltrado em um ultrafiltro MWCO de 300 kDa com um mínimo de 20 diavolumes de cloreto de sódio a 150 mM de 20 a 24° C. O permeado foi descartado, e o retido foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm e enchido em recipientes de vidro de borossilicato em volumes apropriados para o teste de liberação, controles em processo, e formulação. Os concentrados a granel finais foram armazenados de 2 a 8o C.

EXEMPLO 3: Formulação de uma Vacina de Conjugado Pneumocócico 15- valente

Os volumes requeridos de concentrados a granel foram calculados com base no volume de lote e nas concentrações de sacarídeo a granel. Os 15 conjugados combinados foram diluídos ainda a uma concentração de absorção alvo pela adição de um tampão contendo cloreto de sódio e L-histidina, pH 5,8. Depois de misturar suficientemente, a mistura foi filtrada estéril através de uma membrana de 0,2 pm. O grosso formulado estéril foi misturado suavemente durante e a seguir da sua mistura com fosfato de alumínio a granel. A vacina formulada foi armazenada de 2 a 8o C.

Em um processo alternativo, os 15 conjugados combinados foram diluídos ainda a uma concentração alvo pela adição de um tampão contendo cloreto de sódio e L-histidina, pH 5,8. Polissorbato 80 foi adicionado até uma concentração final de 0,005 %, à mistura de conjugado tamponado diluída antes da filtração estéril. A seguir da filtração estéril, a vacina formulada foi armazenada de 2 a 8o C. A Tabela 1 mostra a composição final das formas com adjuvante e sem adjuvante de PCV-15. Tabela 1: Composição de Formulações de Vacina de Conjugado Pneumocócico 15-ValenteComAdjuvanteeSemAdjuvante

EXEMPLO 4: Estudos de Imunogenicidade

Os experimentos foram planejados para avaliar a imunogenicidade de formulações múltiplas de vacinas conjugadas com pneumocócico nos modelos de animal de macacos Rhesus bebês (IRM) e Coelhos Brancos New Zealand (NZWR). Os experimentos em macacos Rhesus bebês foram planejados para se igualar intimamente com o programa recomendado para a vacina de conjugado pneumocócico nos Estados Unidos, com a série de bebê dada em 2, 4, e 6 meses de idade. Assim, os macacos rhesus bebês foram imunizados partindo em 2 a 3 meses de idade e vacina administrada em intervalos de 2 meses. A 4a dose, que também é parte do programa recomendado para as crianças americanas não foi administrada. Os coelhos adultos (NZWR) foram usados para avaliar as formulações de vacina múltiplas. Estudos NZWR foram realizados usando duas doses de vacina dadas em um regime de imunização acelerada (intervalo de 2 semanas). Para a avaliação pré-clínica de respostas imunes, uma dose humana completa foi liberada aos coelhos ao passo que os macacos bebês receberam uma meia dose humana. O fundamento lógico para selecionar uma meia dose humana para macacos bebês foi devido às limitações no volume que pode ser administrado aos macacos Rhesus bebês em um único sítio intramuscular.

Avaliação de Respostas IgG Específico de Sorotipo

Um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexada (ECL) foi desenvolvido para o uso com soro de coelho e macaco rhesus com base em um ensaio humano usando a tecnologia Meso Scale Discovery (MSD) que utiliza um rótulo SULFO-TAG® que emite luz na estimulação eletroquímica. Ver Marchese et al., 2009, Clin Vaccine Immunol 16: 387-96. Usando uma leitora de placa ECL dedicada, uma corrente elétrica é colocada através dos elétrodos associados com a placa que resultam em uma série de reações eletricamente induzidas que levam ao sinal luminescente. A configuração de multi-ponto usada no desenvolvimento e validação foi de 10 pontos/reservatório em um formato de placa de 96 reservatórios, e cada reservatório foi revestido com 5 ng de polissacarídeo (Ps) pneumocócico (Pn) por ponto. Dois formatos de placa foram usados para garantir que polissacarídeos que reagem cruzado (isto é, 6A e 6B, e 19A e 19F) fossem testados em placas separadas. O formato de placa 1 conteve sorotipos 3, 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F ao passo que o formato de placa 2 conteve os sorotipos 1, 5, 6A, 7F, 19A, 22F e 33F. Cada reservatório também conteve dois pontos de albumina sérica bovina (BSA) que foram usados para avaliar a reatividade de fundo do ensaio (isto é, a resposta associada com o soro e anticorpo secundário rotulado na ausência de PnPs). O padrão de ensaio (89SF-2), controles, e soros de teste foram diluídos aos níveis apropriados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,05 % de Tween 20, 1 % de BSA, 5 pg/ml de C-polissacarídeo (CPs), 10 pg/ml de polissacarídeo do sorotipo 25 (PnPs25) e 10 pg/ml de polissacarídeo do sorotipo 72 (PnPs72) e incubado durante a noite a 4o C (2 a 8o C) ou na temperatura ambiente por 45 minutos. Os reagentes e padrões de anticorpo humano foram usados quando do teste de amostras de macaco bebê ao passo que IgG anti-coelho rotulado com SULFO-TAG® foi usado como o anticorpo secundário quando do teste das amostras de soro de coelho. Cada placa revestida com antígeno foi incubada na temperatura ambiente por 1 hora em uma plataforma agitadora com agente de bloqueio. As placas foram lavadas com 0,05 % de PBS-T e 25 pl por reservatório dos soros de teste pré-absorvidos e diluídos foram adicionados e incubados por 45 min na temperatura ambiente em uma plataforma agitadora. As placas foram lavadas com 0,05 % de PBS-T e depois anticorpo secundário IgG anti-ser humano de cabra rotulado com MSD SULFO-TAG® (para soro de macaco rhesus) e anticorpo secundário IgG anti- coelho de cabra rotulado (para soro de coelho) foram adicionados a cada reservatório e incubados 1 hora na temperatura ambiente em uma plataforma agitadora. As placas foram lavadas com 0,05 % de PBS-T e 150 pl de Tampão de Leitura MSD-T 4X (com tensoativo) diluído 1:4 em água adicionado a cada reservatório. As placas foram lidas usando um MSD Sector Imager Modelo N2 2400 ou 6000. Para estudos com coelho, os resultados são apresentados como títulos médios geométricos (GMTs) ou razões de GMTs. Para os estudos com macaco rhesus bebê, os resultados foram expressados como concentrações médias geométricas lidas a partir de uma curva padrão usando as concentrações de IgG específicas de sorotipo planejadas para o padrão de referência humana (89 SF-2).

Avaliação de Respostas Funcionais (Opsonofagocíticas)

As amostras do estudo 2 de macacos rhesus bebês foram testados em um ensaio MOPA 4-plexado (MOPA-4). Ver Burton et al., 2006, Clin Vaccine Immunol 13: 1004-9. O ensaio usa cepas bacterianas selecionadas por serem resistentes a um de 4 antibióticos de modo que a primeira parte do ensaio (opsonização e captação em células HL-60 diferenciadas) pode ser realizada com até 4 sorotipos de uma vez. A leitura para a morte bacteriana é feita em paralelo na presença de cada um dos 4 antibióticos para os quais as cepas correspondentes são resistentes de modo a determinar os títulos de morte para cada sorotipo específico. Os resultados são expressados como a diluição recíproca em que 50 % de morte é observada (depois da interpolação).

Metodologia Estatística para Estudos Pré-clínicos

Ambos os modelos de animal tiveram limitações relacionadas com o tamanho da amostra. No geral, 8 macacos bebês ou 8 coelhos foram usados por ramificação de estudo. Com 8 animais por ramificação uma diferença de vezes crítica no título médio geométrico entre as ramificações de tratamento de 2,5 vezes foi considerado como um limiar de resposta significativa. A diferença de 2,5 vezes foi determinada com base na suposição de que para cada sorotipo, o desvio padrão dos títulos transformados em log natural dentro de uma ramificação de tratamento é ln(2). Permitindo que Cj indique a média dos títulos transformados em ln na ia ramificação de tratamento, n\ o número de animais dentro da ia ramificação de tratamento, Oj2 a variação conhecida dos títulos transformados em ln entre os animais dentro da ia ramificação de tratamento, e ajustando n; = 8 e o; = (Zn(2)) para todos i,

Então o valor de 2,5 é obtido resolvendo-se e °J ‘ Dkonde

= Z0_995, e ZO,995 indica o inverso da distribuição acumulativa normal padrão, com uma probabilidade de 0,995 (isto é, Z0,995 = 2,576). Observe que o valor calculado de 2,44 é arredondado para 2,5 visto que 2,5 também fornece uma recíproca conveniente em 0,4.

Resposta de IgG Específico de Sorotipo de Macacos Rhesus Bebês (IRMs) ao PCV-15

Um estudo de imunogenicidade piloto (IRM-1) foi conduzido para determinar se macacos Rhesus bebês (IRMs) seriam um bom modelo em que para avaliar as vacinas conjugadas ao polissacarídeo Pn CRM197. A meta primária do experimento foi determinar se IRMs (como os bebês humanos) seriam não responsivos aos polissacarídeos Pn livres mas responderiam bem às vacinas conjugadas. Grupos de 5 IRMs foram injetados partindo em 2 a 3 meses de idade com polissacarídeo Pn, Prevnar® ou PCV-15. Três doses de vacina foram administradas intramuscularmente (IM) em intervalos de 2 meses, e as respostas de IgG específicas de sorotipo foram medidas antes da primeira dose e em 1 mês após a dose 2 e em 1 mês após a dose 3 usando um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) de arranjo múltiplo (dados não mostrados).

Os resultados indicaram que os IRMs responderam deficientemente, se não de maneira nenhuma, ao polissacarídeo Pn livre mas muito bem às vacinas conjugado. Os resultados indicaram que a indução de uma resposta de IgG aos polissacarídeos Pn em macacos Rhesus bebês foi dependente da conjugação dos polissacarídeos a uma proteína carreadora e portanto foi uma resposta dependente de célula T clássica. Assim, o modelo IRM foi determinado ser adequado para avaliar formulações de PCV-15.

Um segundo estudo (IRM-2) foi conduzido para avaliar uma formulação de PCV-15 usando um processo de conjugação de batelada que minimizou polissacarídeo livre (não conjugado) e CRM197 não conjugada. A Figura 1 mostra as respostas de IgG na pós dose 2 (PD-2) e pós dose 3 (PD-3) para PCV-15 versus Prevnar® para os 7 sorotipos contidos no Prevnar® (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F). As respostas de PD-2 para PCV-15 foram equivalentes ou levemente mais baixas do que as respostas correspondentes para Prevnar® ao passo que as respostas de PD-3 ao PCV-15 foram um pouco mais altas do que aquelas evocadas pelo Prevnar® para quase todos os sorotipos.

As respostas de IRM aos sorotipos não Prevnar em PCV-15 são mostradas na Figura 2. As respostas de PD-2 aos sorotipos não Prevnar em PCV-15 foram todos pelos menos 10 vezes mais altas do que a linha de base concentrações de IgG (pré-vacinação), e os títulos continuaram a se elevar em PD-3.

Os resultados indicam que as respostas de anticorpo ao PCV- 15 e Prevnar® foram comparáveis para os 7 sorotipos comuns e que as respostas de pós vacinação ao PCV-15 foram >10 vezes mais altas do que a linha de base para os 8 sorotipos adicionados.

Resposta Imune Funcional (Opsonofagocítico) de IRMs ao PCV-15

De modo a determinar se PCV-15 induziu respostas de anticorpo funcional em macacos bebês, um ensaio de morte opsonofagocítica (OPA) foi realizado nos soros de IRM-2. As respostas na pré-vacinação, PD- 2, e PD-3 ao PCV-15 e Prevnar® são mostradas na Tabela 2. Os resultados mostrados são os GMTs de amostras séricas de 7 a 8 macacos por ponto de tempo ensaiado em duplicata. Também são mostrados os respondedores percentuais (isto é, aqueles com títulos OPA > 8) no ponto de tempo PD-3. PCV-15 induziu um GMT de PD-2 alto para todos os sorotipos exceto os tipos 1 e 33F. Depois de 3 doses de vacina, PCV-15 induziu GMTs de OPA altos para cada sorotipo e uma taxa de resposta de OPA de 100 % para todos os 15 sorotipos contidos na vacina. Importante, PCV-15 também induziu uma boa resposta de OPA reativa cruzada ao sorotipo 6C, que não está na vacina. Prevnar® induziu títulos de OPA altos e uma taxa de resposta de 100 % para todos os sorotipos contidos nesta vacina, mas o mesmo induziu apenas uma resposta reativa cruzada fraca aos sorotipos 6A e 6C em uma fração de macacos. Tabela 2: GMTs de OPA Específicos de Sorotipo em Macacos Rhesus Bebês DepoisdaVacinaçãocomPCV-15ouPrevnar® (títulos médios geométricos ng—pre-vacmaçao,—PD-2.respondedores percentuais PD-3 coiXLum título >8)

Avaliação de Formulações de PCV-15 em Coelhos Brancos New Zgaland

As formulações de PCV-15 foram avaliadas em 4 estudos em Coelhos Brancos New Zealand (NZWRs) adultos usando um regime de imunização comprimido em que os coelhos receberam uma dose humana completa de vacina no dia 0 e dia 14, e o soro foi coletado nos dias 0, 14 e 28 para a análise. Todos os estudos foram comparados com Prevnar , e como resumido na Tabela 3 (Experimentos com NZWR de 1 a 4).

Os resultados são mostrados na Tabela 3 para as respostas de pós-dose 2 de coelhos brancos New Zealand expressados como uma razão das respostas de IgG médias geométricas para Merck PCV-15 em relação ao Prevnar® para os sorotipos em comum entre as vacinas. Tabela 3 Razões de Resposta de IgG na Pós-dose 2 (PCV-15:Prevnar®) de Formulações de PCV-15 Iniciais Testadas em NZWR

As respostas de IgG específicas de sorotipo foram no geral dentro de 2,5 vezes das respostas correspondentes ao Prevnar . Uma exceção foi o sorotipo (23F), que foi > 2,5 vezes mais baixa do que aquela para o Prevnar® em 2 de 4 experimentos. As vezes de elevação nos níveis de anticorpo para os sorotipos não Prevnar® do Dia 0 ao Dia 28 (após a dose 2, PD-2) são resumidos na Tabela 4. Tabela 4 Vezes de elevação (após a dose 2: Pré-dose 1) nas Respostas IgG aos Sorotipos que não de Prevnar® de Formulações Iniciais de PCV-15 Testadas em NZWR

Efeito da Dose de Vacina de Polissacarídeo Conjugado sobre a Imunogenícidade em NZWRs

A imunogenícidade de uma dose aumentada (dose dupla, 2x) de conjugados de polissacarídeo também foi avaliada para todos os sorotipos contidos no PCV-15 comparado com a dose humana planejada (lx) da vacina. Para a formulação de conjugado de polissacarídeo 2x, a concentração de APA foi aumentada em l,5x de modo a garantir que a maior parte do conjugado estaria ligado ao adjuvante de alumínio. Como mostrado na Tabela 5, não pareceu ser um benefício significante em aumentar a quantidade de conjugado de polissacarídeo na vacina. As diferenças em todos os sorotipos foram dentro de 2 vezes, e a razão em vezes média geométrica (lx PCV-1512X PCV-15 +1,5X APA) foi de 1,1. Tabela 5 Títulos de IgG Médios Geométricos na Pós-dose 2 (95 % de intervalos de confidência) com Prevnar®, lx a dose humana de PCV-15 ou 2x a Dose Humana de PCV-15f em NZWR

*Formulado com lx adjuvante de alumínio (APA) t Formulada com l,5x APA

Efeito de Adjuvante de Alumínio sobre a Imunogenícidade de PCV-15 em NZWRs

O impacto do adjuvante de alumínio (APA) sobre as respostas 10 de anticorpo foi avaliado em um estudo de coelho. PCV-15 formulado com a dose humana planejada de APA (PCV-15 lx APA), com a dose humana planejada dupla de APA (PCV-15 2x APA), e sem nenhum adjuvante de alumínio (PCV-15 0x APA), foram testados. Um grupo de Prevnar® também foi incluído no estudo.

Os resultados de PD-2 indicaram que a duplicação da concentração de APA teve pouco impacto sobre a resposta de IgG específica de sorotipo ao PCV-15. As vezes de diferença no título (lx APA/2x APA) variou de 0,6 (sorotipo 6B) para 2,3 (sorotipo 22F) e a razão em vezes média 5 geométrica através dos 15 sorotipos foi de 1,1. Na ausência de adjuvante de alumínio, os títulos de anticorpo pareceram mais baixos para muitos dos sorotipos relativos ao PCV-15 com lx APA. As vezes de diferença no título (lx/0x) variou de 0,5 (sorotipo 5) a 2,9 (sorotipo 23F) e a razão em vezes média geométrica através dos 15 sorotipos foi de 1,4. No geral, não pareceu 10 haver uma vantagem genuína para duplicar o nível de adjuvante de alumínio e parece haver uma desvantagem para eliminar o adjuvante (Tabela 6) neste modelo de animal.

Os resultados de PD-2 indicaram que houve uma diminuição nos títulos de anticorpo para muitos dos sorotipos na ramificação que não 15 conteve Adjuvante de Fosfato de Alumínio (APA) quando comparado com PCV-15 contendo APA (Figura 3) indicando uma exigência quanto a inclusão de um adjuvante de alumínio para a imunogenícidade de PCV-15 ideal em coelhos. Além disso, nenhum benefício foi descoberto quando a duplicação da quantidade de APA foi incluída na vacina (dados não mostrados). Tabela 6 Títulos de IgG Médios Geométricos no Pós-dose 2 (95 % de intervalos de confidência) de PCV-15 Formulado com lx, 2x ou Ox Adjuvante de Alumínio (APA) em NZWR

Debate e Conclusões

Os dados pré-clínicos demonstram que uma formulação de PCV-15 (formulada em APA) é altamente imunogênica em duas espécies (macacos Rhesus bebês e coelhos). As respostas específicas de sorotipo ao 5 PCV-15 foram comparáveis àquelas evocadas pelo Prevnar® para os 7 sorotipos em comum entre as vacinas. Para os 8 novos sorotipos em PCV-15, houve uma resposta robusta evocada tanto em macacos Rhesus bebês quanto em coelhos, com elevação >10 vezes nas respostas de IgG para todos os sorotipos depois de 2 doses de vacina em ambas as espécies. Experimentos de 10 variação de dose limitada indicaram que um aumento de 2 vezes na quantidade de conjugados de polissacarídeo não resulta em uma resposta de anticorpo aumentada. Similarmente, um aumento de 2 vezes na concentração do adjuvante de alumínio não pareceu melhorar significantemente o perfil de imunogenicidade de PCV-15. A eliminação do adjuvante, entretanto, resultou 15 em respostas mais baixas para alguns sorotipos sugerindo a necessidade potencial quanto a um adjuvante em seres humanos. As respostas de anticorpo funcionais (OPA) foram evocadas pelo PCV-15 para todos os 15 sorotipos na vacina assim como para o sorotipo 6C, que não é um componente de PCV-15.

Claims

1. Composição imunogênica, caracterizadapelo fato de que compreende: (1) uma mistura de conjugado de polissacarídeo-proteína multivalente tendo polissacarídeos capsulares dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, e 33F de Streptococcus pneumoniae conjugados a CRM197 e nenhum outro conjugado de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniaede um sorotipo diferente; e (2) um carreador farmaceuticamente aceitável.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que compreende adicionalmente um adjuvante.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que o adjuvante é um adjuvante com base em alumínio.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que consiste de fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizadapelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.

6. Uso de uma mistura de conjugado de polissacarídeo-proteína multivalente, caracterizadopelo fato de que é para a preparação de uma composição imunogênica como definida na reivindicação 1 para induzir uma resposta imune a um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que a composição imunogênica é uma dose única de 0,5 ml formulada para conter: 2 pg de cada sacarídeo, exceto para 6B a 4 pg; cerca de 32 pg de proteína carreadora CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); 150 mM de cloreto de sódio e 20 mM de tampão de L-histidina.