BR112020004410A2 - processos para a formulação de polissacarídeos pneumocócicos para conjugação a uma proteína carreadora - Google Patents
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Abstract
A presente invenção fornece inúmeras melhorias de processo relacionadas à conjugação de polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae a uma proteína carreadora. Esses processos são específicos para um sorotipo e incluem hidrólise ácida, adição de cloreto de sódio à reação de aminação redutiva e adição de sacarose para dissolver polissacarídeos. Os conjugados polissacarídeo-proteína preparados usando os processos da invenção podem ser incluídos em vacinas conjugadas pneumocócicas multivalentes.
Description
[001] A presente invenção fornece inúmeras melhorias de processo relacionadas à conjugação de polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae a uma proteína carreadora. Conjugados polissacarídeo-proteína preparados usando os processos da invenção podem ser incluídos em vacinas conjugadas pneumocócicas multivalentes.
[002] Streptococcus pneumoniae, um exemplo de bactéria encapsulada, é uma causa significativa de doença grave em todo o mundo. Em 1997, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) estimaram que havia 3.000 casos de meningite pneumocócica, 50.000 casos de bacteremia pneumocócica, 7.000.000 casos de otite média pneumocócica e 500.000 casos de pneumonia pneumocócica anualmente nos Estados Unidos. Vide Centros de Controle e Prevenção de Doenças, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46 (RR-8): 1-13. Além disso, as complicações dessas doenças podem ser significativas, em que alguns estudos relatam até 8% de mortalidade e 25% de sequelas neurológicas por meningite pneumocócica. Vide Arditi et al., 1998, Pediatrics 102: 1087-97.
[003] As vacinas de polissacarídeos pneumocócicos multivalentes, que foram licenciadas por muitos anos, provaram ser inestimáveis na prevenção de doença pneumocócica em adultos, particularmente em idosos e pessoas de alto risco. No entanto, bebês e crianças pequenas respondem mal a polissacarídeos pneumocócicos não conjugados. Polissacarídeos bacterianos são imunógenos independentes de célula T, provocando fraca ou nenhuma resposta em bebês. A conjugação química de um imunógeno de polissacarídeo bacteriano a uma proteína carreadora converte a resposta imune a uma resposta dependente de célula T em bebês. O toxoide diftérico (DTx, uma versão quimicamente desintoxicada do DT) e CRM197 foram descritos como proteínas carreadoras de imunógenos de polissacarídeos bacterianos devido à presença de epítopos estimulantes de células T em suas sequências de aminoácidos.
[004] A vacina pneumocócica conjugada, Prevnar®, contendo os 7 sorotipos mais frequentemente isolados (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F), causando doença pneumocócica invasiva em crianças pequenas e bebês na época, foi licenciada pela primeira vez nos Estados Unidos em fevereiro de 2000. Após o uso universal do Prevnar® nos Estados Unidos, houve uma redução significativa na doença pneumocócica invasiva em crianças devido a sorotipos presentes no Prevnar®. Vide Centros de Controle e Prevenção de Doenças, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54 (36): 893-7. No entanto, existem limitações na cobertura de sorotipos com Prevnar® em certas regiões do mundo e algumas evidências de certos sorotipos emergentes nos Estados Unidos (por exemplo, 19A e outros). Vide O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159: 634-44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348: 1737-46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354: 1455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196: 1346-54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48: S181- S189.
[005] Prevnar 13® é uma vacina conjugada de polissacarídeos pneumocócicos-proteína 13-valente, incluindo os sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Americana No. US 2006/0228380 A1, Prymula et al., 2006, Lancet 367: 740-48 e Kieninger et al., Segurança e Não-Inferioridade Imunológica de vacina conjugada pneumocócica 13-valente comparada a vacina conjugada pneumocócica 7- valente, administrada como uma série de 4-doses em bebês e crianças saudáveis, apresentada na 48ª Reunião Anual da ICAAC / ISDA, 46ª Reunião Anual, Washington DC, 25 a 28 de outubro de 2008. Vide também Dagan et al., 1998,
Infect Immun. 66: 2093-2098 e Fattom, 1999, Vaccine 17: 126.
[006] As atuais vacinas conjugadas pneumocócicas multivalentes têm sido eficazes na redução da incidência de doença pneumocócica associada aos sorotipos presentes nas vacinas. No entanto, a prevalência dos sorotipos que expressam pneumococos não presentes na vacina tem aumentado. As condições do processo para novos sorotipos devem ser determinadas para cada sorotipo para eficiência de conjugação e para certos sorotipos, que apresentaram desafios únicos. Consequentemente, é necessário melhorar as condições do processo para conjugação de novos sorotipos pneumocócicos para inclusão em futuras vacinas.
[007] A presente invenção fornece inúmeras alterações de processo na preparação de polissacarídeos (Ps) de Streptococcus pneumoniae que são exclusivos para sorotipos específicos. Essas alterações de processo melhoram as propriedades do polissacarídeo e/ou da dissolução de polissacarídeo, resultando em melhor conjugação.
[008] Em uma modalidade, a invenção fornece condições de processo para a obtenção de polissacarídeos de S. pneumoniae dos sorotipos 12F, 23A, 24F e 31 de tamanho reduzido, que quando conjugados a uma proteína carreadora (Pr) em um solvente aprótico mostram atributos de conjugado desejado. Especificamente, a redução do tamanho de Ps desses sorotipos por hidrólise ácida produz menor massa molecular de Ps para conjugação de proteínas em comparação com a homogeneização, que melhora atributos do conjugado, tais como consumo de lisina, Ps livre ou Pr livre.
[009] Em uma modalidade, a invenção fornece condições de processo para obtenção de atributos de conjugado de polissacarídeo-proteína melhorados após a conjugação em um solvente aprótico, tal como DMSO, usando cloreto de sódio, particularmente para polissacarídeos de S. pneumoniae dos sorotipos 15A, 16F, 17F, 20, 24F e 35B. Especificamente, nesta modalidade, a inclusão de ≥1 mM de cloreto de sódio antes ou durante a reação de conjugação (independentemente de onde no processo o cloreto de sódio é adicionado) resulta em atributos de conjugado melhorados, tais como tamanho maior de conjugado, maior consumo de lisina, menores Ps livre ou Pr livre.
[010] Em uma modalidade, a invenção fornece uma gama de condições de formulação de pré-liofilização para polissacarídeos de S. pneumoniae de sorotipos 3, 8 e 24F, para garantir a dissolução completa após a liofilização. Especificamente, os polissacarídeos são formulados com sacarose e água, de modo que a razão de massa de sacarose para polissacarídeo seja ≥ 30X e otimamente ≥ 40X. Por exemplo, para uma dada concentração de polissacarídeo de pré-liofilização de 2 mg Ps/mL, a concentração de sacarose deve ser minimamente de 60 mg de sacarose / mL (6% p/v de sacarose) e otimamente ser ≥ 80 mg de sacarose / mL (8% p/ v sacarose), para dissolução após liofilização.
[011] Os polissacarídeos formulados dessa maneira permitem conjugação com proteínas após liofilização e redissolução, resultando nas propriedades desejadas.
[012] A figura 1 demonstra o impacto de cloreto de sódio no tamanho de conjugado para o polissacarídeo de S. pneumoniae do sorotipo 20.
[013] A figura 2 demonstra o impacto de cloreto de sódio no consumo de lisina para o polissacarídeo de S. pneumoniae do sorotipo 20
[014] A figura 3 demonstra o impacto do cloreto de sódio em Ps e Pr livres para o polissacarídeo de S. pneumoniae do sorotipo 20.
[015] A presente invenção fornece inúmeras alterações de processo na preparação de polissacarídeos (Ps) de Streptococcus pneumoniae que são exclusivos para sorotipos específicos. Essas alterações de processo melhoram as propriedades do polissacarídeo e/ou da dissolução de polissacarídeo, resultando em melhor conjugação.
[016] Os inventores descobriram que a redução de tamanho de certos polissacarídeos de S. pneumoniae por hidrólise ácida antes da conjugação de proteínas, produz melhores atributos de conjugado, tal como mostrado nos exemplos. Sem estar vinculado a nenhuma teoria em particular, um possível mecanismo para o uso da hidrólise ácida que possa explicar o comportamento observado, é que a conjugação com menor massa molecular de Ps a partir da hidrólise ácida fornece menor impedimento estérico entre as moléculas de Ps e de Pr durante a reação de conjugação, que pode por sua vez, produzir a uma melhor interação e melhor conjugação.
[017] Os inventores descobriram que a dissolução completa de certos polissacarídeos de S. pneumoniae exigiu a presença de sacarose após liofilização, tal como mostrado nos exemplos. Sem estar vinculado a nenhuma teoria em particular, um possível mecanismo para o uso de sacarose que possa explicar o comportamento de dissolução observado é que alguns sorotipos de polissacarídeo, devido à sua estrutura química, se associam mais facilmente do que outros durante a liofilização ou dissolução, e as razões sacarose / polissacarídeo inibem a auto-associação, permitindo a dissolução após a liofilização.
[018] Os inventores descobriram que a inclusão de ≥1 mM de cloreto de sódio antes ou durante a reação de conjugação, particularmente para polissacarídeos de S. pneumoniae dos sorotipos 16F, 20 e 24F (independentemente onde no processo o cloreto de sódio é adicionado ) resulta em atributos de conjugado melhorados, tal como tamanho maior de conjugado,
maior consumo de lisina, menores Ps livre ou Pr livre, tal como mostrado nos exemplos. Sem estar limitado por nenhuma teoria em particular, um possível mecanismo para o uso de cloreto de sódio que possa explicar o comportamento de conjugação observado para o cloreto de sódio é que, para alguns sorotipos de polissacarídeos, devido à sua estrutura química e distribuição de carga, o cloreto de sódio fornece proteção eletrostática, permitindo interação aprimorada com proteínas e possibilitando uma melhor conjugação. O cloreto de sódio também fornece força iônica adicional à mistura de reação, que pode reduzir a exposição da região hidrofóbica das proteínas carreadoras, reduzindo assim a agregação de proteínas.
[019] Como usado na presente invenção, o termo "polissacarídeo" (Ps) deve incluir qualquer elemento antigênico de sacarídeo (ou unidade antigênica) comumente usado no estado da técnica para vacinas imunológicas e bacterianas, incluindo, mas não limitado a, um "sacarídeo", um "oligossacarídeo", um "polissacarídeo", um "lipossacarídeo", um "lipo-oligossacarídeo (LOS)", um "lipopolissacarídeo (LPS)", um "glicosilato", um "glicoconjugado", um "polissacarídeo ou oligossacarídeo derivado ou ativado” e similares. Salvo indicação em contrário, a nomenclatura de polissacarídeos usada na presente invenção segue as recomendações da Comissão Conjunta de Nomenclatura Bioquímica (JCBM) da IUB-IUPAC (1980). Vide JCBN, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3352-3354.
[020] Como usado na presente invenção, "composição imunogênica" refere-se a uma composição que contém um antígeno, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano ou um conjugado polissacarídeo-proteína, que tem a capacidade de obter uma resposta imune em um hospedeiro, tal como um mamífero, seja mediada humoralmente ou celularmente, ou ambos os casos. A composição imunogênica pode servir para sensibilizar o hospedeiro pela apresentação do antígeno em associação com moléculas de MHC na superfície celular. Além disso, células T antígeno-específicas ou anticorpos podem ser geradas para permitir a proteção futura de um hospedeiro imunizado. Desse modo, as composições imunogênicas podem proteger o hospedeiro da infecção por bactérias, gravidade reduzida ou proteger o hospedeiro da morte devido à infecção bacteriana. As composições imunogênicas também podem ser usadas para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais, que podem ser usados para conferir imunidade passiva a um indivíduo. As composições imunogênicas também podem ser usadas para gerar anticorpos funcionais, medidos pela morte de bactérias, seja em um modelo de eficácia animal ou por meio de um ensaio de morte opsonofagocítica.
[021] Como usado na presente invenção, o termo "isolado" em conexão com um polissacarídeo refere-se ao isolamento de polissacarídeo capsular específico do sorotipo de S. pneumoniae a partir de polissacarídeo purificado usando técnicas de purificação conhecidas no estado da técnica, incluindo o uso de centrifugação, filtração de profundidade, precipitação, ultrafiltração, tratamento com carvão ativado, diafiltração e/ou cromatografia em coluna. Geralmente, um polissacarídeo isolado refere-se à remoção parcial de proteínas, ácidos nucleicos e polissacarídeo endógeno não específico (polissacarídeo C). O polissacarídeo isolado contém menos de 10%, 8%, 6%, 4% ou 2% de impurezas proteicas e/ou ácidos nucleicos. O polissacarídeo isolado contém menos de 20% de polissacarídeo C em relação a polissacarídeos de tipo específico.
[022] Como usado na presente invenção, o termo "purificado" em conexão com um polissacarídeo capsular bacteriano refere-se à purificação do polissacarídeo do lisado celular através de meios, tais como centrifugação, precipitação e ultrafiltração. Geralmente, um polissacarídeo purificado refere-se à remoção de detritos celulares e DNA.
[023] Como usado na presente invenção, o termo "Mw" refere-se ao peso molecular médio ponderado e é tipicamente expresso em Da ou kDa. Mw leva em consideração que uma molécula maior contém mais da massa total de uma amostra de polímero do que as moléculas menores. O Mw pode ser determinado por técnicas como espalhamento estático de luz, espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, espalhamento de raios X e velocidade de sedimentação.
[024] Como usado na presente invenção, o termo "Mn" refere-se a um peso molecular médio em número e é tipicamente expresso em Da ou kDa. O Mn é calculado tomando o peso total de uma amostra dividido pelo número de moléculas na amostra e pode ser determinado por técnicas, tais como cromatografia de permeação em gel, viscometria por meio da (equação de Mark – Houwink), métodos coligativos, tais como osmometria de pressão de vapor, determinação de grupo terminal ou NMR de prótons. Mw / Mn reflete polidispersividade.
[025] Como usado na presente invenção, o termo "compreende" quando usado com a composição imunogênica da invenção refere-se à inclusão de quaisquer outros componentes (sujeitos a limitações da linguagem "consistindo em" para a mistura de antígeno), como adjuvantes e excipientes. O termo "consistindo em" quando usado com a mistura de conjugado polissacarídeo- proteína multivalente refere-se a uma mistura que possui os conjugados específicos de polissacarídeo de S. pneumoniae – proteína e nenhum outro conjugado de proteína-polissacarídeo de S. pneumoniae de um sorotipo diferente.
[026] A menos que seja especificado de outra forma, todas as faixas fornecidas na presente invenção incluem os limites inferior e superior citados. Polissacarídeos Capsulares
[027] Os polissacarídeos capsulares de Steptococcus pneumoniae do(s)
sorotipo(s) da invenção (por exemplo, sorotipos 23A, 24F e 31) podem ser preparados por técnicas padrão conhecidas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, os polissacarídeos podem ser isolados a partir de bactérias e podem ser dimensionados até certo ponto por métodos conhecidos (vide, por exemplo, as Patentes Européias Nºs EP497524 e EP497525); e preferencialmente por microfluidização realizada pelo uso de um homogeneizador ou por hidrólise química. Em uma modalidade, as cepas de S. pneumoniae correspondentes a cada sorotipo de polissacarídeo são cultivadas em um meio à base de soja. Os polissacarídeos individuais são então purificados através de etapas padrão, incluindo centrifugação, precipitação e ultrafiltração. Vide, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Americana Nº 2008/0286838 e Patente Nº 5,847,112. Os polissacarídeos podem ser dimensionados para reduzir a viscosidade e/ou melhorar a filtrabilidade dos produtos conjugados subsequentes. A hidrólise química pode ser realizada usando ácido acético. O dimensionamento mecânico pode ser realizado usando cisalhamento de homogeneização a alta pressão.
[028] Para os sorotipos 12F, 23A, 24F e 31, verificou-se que a homogeneização do polissacarídeo a partir desses sorotipos não resultou nas características desejadas. Vide EXEMPLO 3. A hidrólise ácida pode ser realizada aquecendo o lote de polissacarídeos a 80-92oC, preferencialmente 90 °C para sorotipos diferentes de 12F, adicionando um ácido, tal como ácido acético, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido cítrico, a uma concentração final de 50 - 200 mM, incubando por pelo menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos ou 50 minutos. Em certas modalidades, a hidrólise ácida ocorre por até 90 minutos, até 150 minutos ou até 155 minutos. No final do período de incubação, o lote é neutralizado adicionando, por exemplo, tampão fosfato de potássio concentrado a pH 7 a uma concentração final de 400 mM e resfriamento a ≤22 ° C. O polissacarídeo de tamanho reduzido é filtrado através de 0,2 mícrons e depois concentrado e diafiltrado em água usando uma membrana de ultrafiltração por fluxo tangencial NMWC de 5-10 kDa.
[029] Em algumas modalidades, os polissacarídeos purificados antes da conjugação têm um peso molecular entre 5 kDa e 4.000 kDa. O peso molecular pode ser calculado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) combinada com detector de espalhamento de luz de ângulo múltiplo (MALS) e detector de índice de refração (RI). Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular médio entre 10 kDa e 4.000 kDa; entre 50 kDa e 4.000 kDa; entre 50 kDa e 3.000 kDa; entre 50 kDa e 2.000 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 100 kDa e 4.000 kDa; entre 100 kDa e 3.000 kDa; 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e
1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 100 e 400 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e
1.000 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Em certas modalidades, o peso molecular médio é de 50 a 300 kDa.
[030] Em certas modalidades, o polissacarídeo tem entre 10 e 10.000, 10 e
5.000, 10 e 4.000 ou 10 e 1000 unidades de repetição. Em certos aspectos, o polissacarídeo possui entre 20 e 400, 30 a 300, 40 a 200 ou 50 a 100 unidades de repetição. Em certos aspectos, o polissacarídeo tem entre 40 e 900 unidades de repetição. Proteína Carreadora
[031] Polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos de S. pneumoniae descritos na presente invenção podem ser conjugados com uma proteína carreadora para melhorar a imunogenicidade em crianças, idosos e/ou indivíduos imunocomprometidos. Quando mais de um sorotipo é usado em uma composição multivalente, os sorotipos podem ser preparados com a mesma proteína carreadora ou com proteínas carreadoras diferentes. Cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é tipicamente conjugado à mesma proteína carreadora.
[032] Em uma modalidade específica da presente invenção, o CRM197 é usado como uma proteína carreadora. CRM197 é uma variante não-tóxica da toxina diftérica (DT). A proteína carreadora CRM197 é uma forma mutante de DT que é tornada não-tóxica por uma única substituição de aminoácido no fragmento A no resíduo 52. Em uma modalidade, a proteína carreadora CRM197 é isolada de culturas da cepa C7 de Corynebacterium diphtheria (β197) cultivada em meio ácido casamino e extrato de levedura. Em outra modalidade, o CRM197 é preparado de forma recombinante de acordo com os métodos descritos na Patente Americana No. 5,614,382. Normalmente, o CRM197 é purificado por meio de uma combinação de ultrafiltração, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica. Em algumas modalidades, o CRM197 é preparado em Pseudomonas fluorescens usando Pfenex Expression Technology ™ (Pfenex Inc., San Diego, CA).
[033] Outras proteínas carreadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas adicionais, como DT, fragmento toxoide diftérico B (DTFB), TT (toxoide tetânico) ou fragmento C de TT, toxoide pertussis, toxoide da cólera (por exemplo, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 2004/083251), E. coli LT (enterotoxina termolábil), E. coli ST (enterotoxina termolábil) e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Proteínas de membrana externa de bactéria, tais como o complexo c de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação à transferrina, proteína A de superfície de pneumococo A (PspA; vide Publicação de Patente de Pedido Internacional Nº WO 02/091998), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), peptidase de C5a de
Streptococcus do Grupo A ou do Grupo B, ou proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13) incluindo dobra desintoxicada de alguma maneira, por exemplo, dPLY- GMBS (Vide Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 04/081515) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteínas Pht, por exemplo, fusões PhtDE, fusões PhtBE (Vide Publicação de Patente Internacional Nos. WO 01/98334 e WO 03/54007), também pode ser usado. Outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de lapa (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou derivado proteico purificado de tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis), DP (proteína D de Haemophilus influenzae; ver, por exemplo, Patente Européia No. EP 0 594 610 B), ou seus equivalentes imunologicamente funcionais, peptídeos sintéticos (Vide Patentes Européias Nos. EP0378881 e EP0427347), proteínas de choque térmico (Vide Publicações Internacionais de Pedido de Patente Nos. WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas pertussis (Vide Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 98/58668 e Patente Europeia No. EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou hormônios de crescimento (Ver Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 91/01146), proteínas artificiais que compreendem múltiplos epítopos de células T CD4 + de vários antígenos derivados de patógenos (vide Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31: 3816-3824), tal como a proteína N19 (vide Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72: 4884-7), proteínas de captação de ferro (Vide Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (Vide Publicação de Patente Internacional No. WO 00/61761) e flagelina (Vide Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64: 9) também podem ser usadas como proteínas carreadoras.
[034] Também podem ser utilizados outros mutantes de DT como proteína carreadora, tais como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol
Chem 218: 3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações divulgadas na Patente 4,709,017 ou Patente No. 4,950,740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações divulgadas na Patente 5,917,017 ou Pat. No. 6,455,673; ou fragmento divulgado na Patente No. 5,843,711.
[035] Onde são utilizadas vacinas multivalentes, uma segunda proteína carreadora pode ser usada para um ou mais dos antígenos. A segunda proteína carreadora é preferencialmente uma proteína que não é tóxica e não reatogênica e pode ser obtida em quantidade e pureza suficientes. A segunda proteína carreadora também é conjugada ou unida a um antígeno, por exemplo, um polissacarídeo de S. pneumoniae para aumentar a imunogenicidade do antígeno. As proteínas carreadoras devem ser passíveis de procedimentos de conjugação padrão. Em uma modalidade, cada polissacarídeo capsular não conjugado com a primeira proteína carreadora é conjugado com a mesma segunda proteína carreadora (por exemplo, cada molécula de polissacarídeo capsular é conjugada com uma única proteína carreadora). Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares não conjugados com a primeira proteína carreadora são conjugados com duas ou mais proteínas carreadoras (cada molécula de polissacarídeo capsular é conjugada com uma única proteína carreadora). Em tais modalidades, cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é tipicamente conjugado à mesma proteína carreadora. Conjugação
[036] A conjugação de polissacarídeos pneumocócicos a proteínas por aminação redutiva em um solvente aprótico como o DMSO é comumente usada.
Polissacarídeos ativados (Ps) e proteínas (Pr) são tipicamente liofilizados, ressuspensos em DMSO e depois combinados com cianoborohidreto de sódio e borohidreto de sódio adicionados para obter a conjugação. Os detalhes do processo são fornecidos abaixo.
[037] Para muitos sorotipos pneumocócicos, esse processo produz conjugados que atendem aos atributos alvo de tamanho, consumo de lisina, polissacarídeo livre e proteína livre. No entanto, para alguns sorotipos, verificou- se que os atributos do conjugado alvo eram mais difíceis de alcançar com esse processo DMSO, mesmo após a otimização de parâmetros de conjugação, tais como concentrações de Ps e Pr e tempo de conjugação. Vide os EXEMPLOS. Conforme descrito abaixo, a presente invenção fornece várias soluções para superar esses problemas.
[038] Antes da conjugação, os polissacarídeos purificados podem ser ativados quimicamente para tornar os sacarídeos capazes de reagir com a proteína carreadora para formar um polissacarídeo ativado. Como usado na presente invenção, o termo "polissacarídeo ativado" refere-se a um polissacarídeo que foi quimicamente modificado, conforme descrito abaixo, para permitir a conjugação com um ligante ou uma proteína carreadora. Os polissacarídeos purificados podem opcionalmente ser ligados a um ligante. Uma vez ativado ou ligado a um ligante, cada polissacarídeo capsular é conjugado separadamente a uma proteína carreadora para formar um glicoconjugado. Os conjugados de polissacarídeos podem ser preparados por técnicas de acoplamento conhecidas.
[039] Em certas modalidades, o polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante para formar um intermediário polissacarídeo-ligante no qual o terminal livre do ligante é um grupo éster. O ligante é, portanto, aquele em que pelo menos um terminal é um grupo éster. O outro terminal é selecionado para que ele possa reagir com o polissacarídeo, a fim de formar o intermediário polissacarídeo-ligante.
[040] Em certas modalidades, o polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante usando um grupo amina primário no polissacarídeo. Neste caso, o ligante tem tipicamente um grupo éster em ambos os terminais. Isto permite que o acoplamento ocorra pela reação de um dos grupos éster com o grupo amina primária no polissacarídeo por substituição nucleofílica acílica. A reação resulta em um intermediário polissacarídeo-ligante no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante por meio de uma ligação amida. O ligante é, portanto, um ligante bifuncional que fornece um primeiro grupo éster para reagir com o grupo amina primária no polissacarídeo e um segundo grupo éster para reagir com o grupo amina primária na molécula carreadora. Um ligante típico é o N- hidroxissuccinimida diéster do ácido adípico (SIDEA).
[041] Em certas modalidades, o acoplamento também pode ocorrer indiretamente, isto é, com um ligante adicional que é usado para derivar o polissacarídeo antes do acoplamento ao ligante. O polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional usando um grupo carbonila no terminal redutor do polissacarídeo. Este acoplamento compreende duas etapas: (a1) reação do grupo carbonila com o ligante adicional; e (a2) reação do terminal livre do ligante adicional com o ligante. Nestas modalidades, o ligante adicional tipicamente tem um grupo amina primária em ambos os terminais, permitindo assim que a etapa (a1) ocorra pela reação de um dos grupos amina primária com o grupo carbonila no polissacarídeo por aminação redutiva. É utilizado um grupo amina primária que é reativo com o grupo carbonila no polissacarídeo. Os grupos hidrazida ou hidroxilamina são adequados. O mesmo grupo amina primária está normalmente presente nos dois terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário polissacarídeo-ligante adicional, no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional por meio de uma ligação C-N.
[042] Em determinadas modalidades, o polissacarídeo pode ser acoplado ao ligante adicional usando um grupo diferente no polissacarídeo, particularmente um grupo carboxila. Este acoplamento compreende duas etapas: (a1) reação do grupo com o ligante adicional; e (a2) reação do terminal livre do ligante adicional com o ligante. Neste caso, o ligante adicional tipicamente possui um grupo amina primária em ambos os terminais, permitindo assim que a etapa (a1) ocorra pela reação de grupos amina primária com o grupo carboxila no polissacarídeo por ativação de EDAC. É usado um grupo amina primária que é reativo com o grupo carboxila ativado por EDAC no polissacarídeo. Um grupo hidrazida é adequado. O mesmo grupo amina primária está normalmente presente nos dois terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário polissacarídeo-ligante adicional, no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional por meio de uma ligação amida.
[043] Em uma modalidade, a ativação química dos polissacarídeos e subsequente conjugação com a proteína carreadora por aminação redutiva pode ser alcançada pelos meios descritos na Patente Americana 4,365,170, 4,673,574 e 4,902,506, Publicações de pedido de patente dos EUA 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 e 2007/0184071 e Publicações de pedido de patente internacional Nos. WO2006 / 110381, WO2008 / 079653 e WO2008 / 143709). A química pode implicar a ativação do polissacarídeo pneumocócico por reação com qualquer agente oxidante que seja um grupo hidroxila primária, formando um aldeído, tal como TEMPO na presença de oxidante (WO2104/097099), ou pela reação de dois grupos hidroxila vicinais formando aldeídos, tais como periodato (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio ou ácido periódico). As reações levam a uma oxidação aleatória de grupos hidroxila primária ou a uma clivagem oxidativa aleatória de grupos hidroxila vicinais dos carboidratos com a formação de grupos aldeídos reativos.
[044] Nesta modalidade, o acoplamento à proteína carreadora é por aminação redutiva via aminação direta aos grupos lisila da proteína. Por exemplo, a conjugação é realizada ao reagir uma mistura do polissacarídeo ativado e da proteína carreadora com um agente redutor, tal como o cianoborohidreto de sódio, opcionalmente na presença de níquel para conjugação aquosa. A reação de conjugação pode ocorrer sob solução aquosa ou na presença de dimetilsulfóxido (DMSO). Vide, por exemplo, as Publicações de Pedido de Patente Americana Nos. US2015/0231270 e US2011/0195086 e Patente Europeia No. EP 0471 177 B1. Os aldeídos que não reagiram são então capeados com a adição de um agente fortemente redutor, tal como o borohidreto de sódio.
[045] A aminação redutiva envolve duas etapas: (1) oxidação do polissacarídeo para formar aldeídos reativos; (2) redução da imina (base de Schiff) formada entre o polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação conjugada de amina estável. Antes da oxidação, o polissacarídeo é opcionalmente reduzido de tamanho. Podem ser empregados métodos mecânicos (por exemplo, homogeneização) ou hidrólise química. A hidrólise química pode ser realizada usando ácido acético. A etapa de oxidação pode envolver reação com periodato. Para os fins da presente invenção, o termo "periodato" inclui ambos, periodato e ácido periódico; o termo também inclui metaperiodato (IO4-) e ortoperiodato (IO65-) e inclui os vários sais de periodato (por exemplo, periodato de sódio e periodato de potássio). Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de metaperiodato, preferencialmente na presença de periodato de sódio (NaIO4). Em outra modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de ortoperiodato, preferencialmente na presença de ácido periódico.
[046] Em uma modalidade, o agente oxidante é um composto radical de nitroxila ou nitróxido, tais como compostos de piperidina-N-oxi ou pirrolidina-N- oxi, na presença de um oxidante para oxidar seletivamente as hidroxilas primárias (tal como descrito em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2014/097099). Na referida reação, o oxidante real é o sal de N-oxoamônio, em um ciclo catalítico. Em um aspecto, o referido composto radical nitroxila ou nitróxido são compostos de piperidina-N-oxi ou pirrolidina-N- oxi. Em um aspecto, o referido composto estável de radical nitroxila ou nitróxido possui uma porção TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi) ou PROXIL (2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi). Em um aspecto, o referido composto radical nitroxila estável é TEMPO ou um derivado do mesmo. Em um aspecto, o referido oxidante é uma molécula contendo uma porção N-halo. Em um aspecto, o referido oxidante é selecionado a partir do grupo que consiste em N- Clorosuccinimida, N-Bromosuccinimida, N-Iodosuccinimida, ácido dicloroisocianúrico, 1,3,5-tricloro-1,3,5-triazinano-2,4,6- triona, ácido dibromoisocianúrico, 1,3,5-tribromo-1,3,5-triazinano-2,4,6-triona, ácido diiodoisocianúrico e 1, 3,5-triiodo-1, 3,5-triazinano-2, 4,6-triona. Preferencialmente, o referido oxidante é a N-clorossuccinimida.
[047] Em certos aspectos, o agente oxidante é o radical livre 2,2,6,6- tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) e a N-clorosuccinimida (NCS) como o cooxidante (conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO2014/097099). Portanto, em um aspecto, os glicoconjugados de S. pneumoniae são obtidos por um método que compreende as etapas de: a) reação de um sacarídeo com 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) e N- clorosuccinimida (NCS) em um solvente aquoso para produzir um sacarídeo ativado; e b) reação do sacarídeo ativado com uma proteína carreadora compreendendo um ou mais grupos amina (o referido método será doravante designado "aminação redutiva TEMPO / NCS").
[048] Opcionalmente, a reação de oxidação é arrefecida pela adição de um agente de arrefecimento. O agente de arrefecimento pode ser selecionado de dióis vicinais, 1,2-aminoálcoois, aminoácidos, glutationa, sulfito, bissulfato, ditionito, metabissulfito, tiossulfato, fosfitos, hipofosfitos ou ácido fosforoso (tais como glicerol, etileno glicol, propano-1, 2- diol, butan-1, 2-diol ou butan-2,3-diol, ácido ascórbico).
[049] A segunda etapa do processo de conjugação para aminação redutiva é a redução da ligação imina (base de Schiff) entre o polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação conjugada estável (a chamada aminação redutiva), usando um agente redutor. Os agentes redutores que são adequados incluem os cianoborohidretos (tais como cianoborohidreto de sódio) ou borohidreto de sódio. Em uma modalidade, o agente redutor é cianoborohidreto de sódio.
[050] Em certas modalidades dos métodos da invenção, a reação de aminação redutiva é realizada em solvente aprótico (ou uma mistura de solventes apróticos). Em uma modalidade, a reação de redução é realizada em solvente DMSO (dimetilsulfóxido) ou DMF (dimetilformamida). O solvente DMSO ou DMF pode ser usado para reconstituir o polissacarídeo ativado e a proteína carreadora, se liofilizada. Em uma modalidade, o solvente aprótico é DMSO.
[051] A sacarose em até 5%, em uma razão de massa de sacarose: Ps de 25X, tem sido usada para alcançar a dissolução ideal no DMSO após liofilização. Vide, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional Nº WO2017/013548. Para os polissacarídeos de S. pneumoniae obtidos dos sorotipos 3, 8 e 24F, verificou-se que eram necessários níveis mais altos de sacarose para dissolver adequadamente o polissacarídeo antes da conjugação de proteínas em um solvente aprótico. Em algumas modalidades, para esses sorotipos, são usadas concentrações de sacarose superiores a 5% em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, para esses sorotipos, são utilizadas razões de massa de sacarose: Ps acima de 25X, por exemplo, pelo menos 30X, pelo menos 35X ou pelo menos 40X. Em algumas modalidades, a razão de massa pré-liofilização de sacarose para polissacarídeo é maior ou igual a 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50 ou mais. Outros açúcares, como trealose ou manitol, podem ser usados.
[052] Verificou-se também que a presença de cloreto de sódio (NaCl) no processo de conjugação de proteínas, seja em solução aquosa ou em solvente aprótico, pode ser usada para reduzir os níveis de proteína livre, aumentar o peso molecular do conjugado, diminuir o polissacarídeo livre e/ou aumentar o consumo de lisina para polissacarídeos de S. pneumoniae purificados a partir dos sorotipos 15A, 16F, 17F, 20, 23A, 24F e 35B. Assim, a presente invenção pode ser direcionada a um método para preparar um conjugado polissacarídeo-proteína, o método compreendendo a reação de um polissacarídeo de S. pneumoniae dentro de uma primeira solução com uma proteína dentro de uma segunda solução para formar uma terceira solução, na qual a reação do conjugado polissacarídeo-proteína ocorre para formar o conjugado polissacarídeo-proteína, em que a terceira solução compreende pelo menos 1 mM de sal.
[053] O cloreto de sódio pode ser adicionado em qualquer lugar do processo de conjugação, desde a preparação de polissacarídeo e proteína para liofilização antes da reação de conjugação até a própria reação de conjugação, por exemplo, durante a reação de base de Schiff ou durante a aminação redutiva na presença de cianoborohidreto de sódio. Em algumas modalidades, o polissacarídeo e a proteína são liofilizados separadamente e o sal pode ser adicionado à solução de polissacarídeo (primeira solução) ou à solução de proteína (segunda solução) ou a ambas. Em algumas modalidades, o polissacarídeo e a proteína são liofilizados a partir da mesma solução à qual um sal é adicionado (isto é, a primeira e a segunda solução são as mesmas). Em algumas modalidades, o sal é adicionado à solução em que ocorre a reação do conjugado polissacarídeo-proteína (isto é, a terceira solução).
[054] Outros sais podem ser usados, como outros sais de sódio, sais de potássio, como cloreto de potássio, sais de lítio, sais de magnésio e sais de cálcio. Em algumas modalidades, de 1 mM a 100 mM de cloreto de sódio é adicionado à solução de dissolução para o polissacarídeo ou durante a reação de base Schiff, ou durante a reação de aminação redutiva na presença de cianoborohidreto de sódio. Em algumas modalidades, são utilizados pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM de cloreto de sódio. Em alguns aspectos dessas modalidades, não é usado mais do que 100, 75 ou 50 mM de cloreto de sódio.
[055] No final da reação de redução, pode haver grupos aldeídos que não reagiram remanescentes nos conjugados, que podem ser capeados ou arrefecidos usando um agente de capeamento ou de arrefecimento adequado. Em uma modalidade, este agente de capeamento ou de arrefecimento é borohidreto de sódio (NaBH4). Alternativas adequadas incluem triacetoxiborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio ou zinco na presença de ácidos de Bronsted ou Lewis, amina-boranos como piridina-borano, 2-picolina- borano, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina-borano, t-BuMe'PrN-BH3, benzilamina-BH3 ou 5-etil-2-metilpiridina borano (PEMB) ou resina de troca de borohidreto.
[056] Os glicoconjugados preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico são geralmente utilizados em vacinas conjugadas de proteínas pneumocócicas multivalentes. Assim, em certas modalidades de composições multivalentes em que nem todos os sorotipos são preparados em um solvente aprótico, a reação de redução para os demais sorotipos restantes é realizada em solvente aquoso (por exemplo, selecionado a partir de PBS (solução salina tamponada com fosfato), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico), HEPES, (ácido (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfônico), Bis-tris, ADA (ácido N-(2- acetamido) iminodiacético), PIPES (ácido piperazina-N, N‘)-bis(2- etanossulfônico)), MOPSO (ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanossulfônico), BES (ácido N, N-bis (2-hidroxietil) -2-aminoetanossulfônico), MOPS (ácido 3- (N- morfolino) propanossulfônico), DIPSO (ácido 3-bis (2-hidroxietil) amino-2- hidroxipropano-1-sulfônico), MOBS (ácido 4- (N-morfolino) butanossulfônico), HEPPSO (ácido N- (2-hidroxietil) piperazina- N- (2-hidroxipropanossulfônico)), POPSO (ácido piperazina-1,4-bis (2-hidroxi-3-propanossulfônico)), TEA (trietanolamina), EPPS (ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-propanossulfônico), Bicina ou HEPB, a um pH entre 6,0 e 8,5, 7,0 e 8,0 ou 7,0 e 7,5).
[057] Em algumas modalidades, os glicoconjugados da presente invenção compreendem um polissacarídeo com um peso molecular entre 10 kDa e 10.000 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 25 kDa e 5.000 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 1.000 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 70 kDa e 900 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 100 kDa e 800 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 200 kDa e 600 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de 100 kDa a 1000 kDa; 100 kDa a 900 kDa; 100 kDa a 800 kDa; 100 kDa a 700 kDa; 100 kDa a 600 kDa; 100 kDa a 500 kDa; 100 kDa a 400 kDa; 100 kDa a 300 kDa; 150 kDa a
1.000 kDa; 150 kDa a 900 kDa; 150 kDa a 800 kDa; 150 kDa a 700 kDa; 150 kDa a 600 kDa; 150 kDa a 500 kDa; 150 kDa a 400 kDa; 150 kDa a 300 kDa; 200 kDa a
1.000 kDa; 200 kDa a 900 kDa; 200 kDa a 800 kDa; 200 kDa a 700 kDa; 200 kDa a 600 kDa; 200 kDa a 500 kDa; 200 kDa a 400 kDa; 200 kDa a 300; 250 kDa a 1.000 kDa; 250 kDa a 900 kDa; 250 kDa a 800 kDa; 250 kDa a 700 kDa; 250 kDa a 600 kDa; 250 kDa a 500 kDa; 250 kDa a 400 kDa; 250 kDa a 350 kDa; 300 kDa a 1 000 kDa; 300 kDa a 900 kDa; 300 kDa a 800 kDa; 300 kDa a 700 kDa; 300 kDa a 600 kDa; 300 kDa a 500 kDa; 300 kDa a 400 kDa; 400 kDa a 1.000 kDa; 400 kDa a 900 kDa; 400 kDa a 800 kDa; 400 kDa a 700 kDa; 400 kDa a 600 kDa; ou 500 kDa a 600 kDa. Em certas modalidades em que a hidrólise ácida é empregada, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 10 kDa e 200 kDa, 25 kDa e 200 kDa, 50 kDa e 200 kDa, 10 kDa e 150 kDa, 25 kDa e 150 kDa ou 50 kDa e 150 kDa.
[058] Químicas alternativas adequadas incluem a ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O sacarídeo ativado pode assim ser acoplado diretamente ou através de um grupo espaçador (ligante) a um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para produzir um polissacarídeo tiolado que pode ser acoplado ao transportador por meio de uma ligação tioéter obtida após a reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo, usando GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo usando iodoacetimida [por exemplo, iodoacetimida de etila HCl] ou brometo de N-succinimidila SIAB, ou SIA ou SBAP). Preferencialmente, o éster de cianato (opcionalmente produzido pela química CDAP) é acoplado com hexanodiamina ou dihidrazida de ácido adípico (ADH) e o sacarídeo derivado de amino é conjugado à proteína carreadora usando a química de carbodiimida (por exemplo, EDAC ou EDC) por meio de um grupo carboxila na proteína carreadora. Tais conjugados são descritos nas Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 93/15760, WO 95/08348 e WO 96/29094; e Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40: 245-256.
[059] Outras técnicas adequadas utilizam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muitos são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional No.
WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligante carbonila que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (vide Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218: 509-18) seguido de reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isso pode envolver a redução do terminal anomérico em um grupo hidroxila primária, proteção / desproteção opcional do grupo hidroxila primária, reação do grupo hidroxila primária com CDI para formar um intermediário de carbamato de CDI e acoplar o intermediário de carbamato de CDI a um grupo amino em um grupo amino em uma proteína.
[060] Após a conjugação (a reação de redução e, opcionalmente, a reação de capeamento ou arrefecimento), os glicoconjugados podem ser purificados (enriquecidos com relação à quantidade de conjugado polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas conhecidas pelo técnico no assunto. Essas técnicas incluem diálise, operações de concentração/diafiltração, filtração de fluxo tangencial, ultrafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna (cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca iônica multimodal, DEAE ou cromatografia de interação hidrofóbica) e filtração em profundidade. Vide, por exemplo, Patente No. 6,146,902. Em uma modalidade, os glicoconjugados são purificados por diafilitração ou cromatografia de troca iônica ou cromatografia por exclusão de tamanho.
[061] Uma maneira de caracterizar os glicoconjugados da invenção é pelo número de resíduos de lisina na proteína carreadora (por exemplo, CRM197) que se conjugam com o sacarídeo, que pode ser caracterizado como uma gama de lisinas conjugadas (grau de conjugação). A evidência para a modificação da lisina da proteína carreadora, devido a ligações covalentes aos polissacarídeos, pode ser obtida por análise de aminoácidos usando métodos de rotina conhecidos pelos técnicos no assunto. A conjugação resulta em uma redução no número de resíduos de lisina recuperados, em comparação com o material de partida da proteína carreadora usado para gerar os materiais conjugados. Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção situa-se entre 2 e 15, entre 2 e 13, entre 2 e 10, entre 2 e 8, entre 2 e 8, entre 2 e 6, entre 2 e 5, entre 2 e 4 , entre 3 e 15, entre 3 e 13, entre 3 e 10, entre 3 e 8, entre 3 e 6, entre 3 e 5, entre 3 e 4, entre 5 e 15, entre 5 e 10, entre 8 e 15 , entre 8 e 12, entre 10 e 15 ou entre 10 e 12. Em uma modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é de cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15. Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção situa-se entre 7 e 12. Em algumas dessas modalidades, a proteína carreadora é CRM197.
[062] Os glicoconjugados da invenção também podem ser caracterizados pela razão (peso/peso) de sacarídeo para proteína carreadora. Em algumas modalidades, a razão de polissacarídeo para proteína carreadora no glicoconjugado (p/p) está entre 0,5 e 3,0 (por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2 , cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9 ou cerca de 3,0). Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p /p) está entre 0,5 e 2,0, entre 0,5 e 1,5, entre 0,8 e 1,2, entre 0,5 e 1,0, entre 0,5 e 1,0, entre 1,0 e 1,5 ou entre 1,0 e 2,0. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) está entre 0,8 e 1,2. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo capsular para proteína carreadora no conjugado está entre 1 e 2. Em algumas dessas modalidades, a proteína carreadora é CRM197. Os glicoconjugados e composições imunogênicas da invenção podem conter sacarídeo livre que não é covalentemente conjugado com a proteína carreadora, mas está presente na composição de glicoconjugados. O sacarídeo livre pode ser associado não covalentemente (isto é, ligado não covalentemente ao, adsorvido ou encapsulado no ou com) ao glicoconjugado.
[063] Em uma modalidade preferida, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ou 15% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferida, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 25% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferida, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 20% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferida, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 15% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo Vacinas conjugadas polissacarídeo-proteína multivalentes
[064] Os conjugados polissacarídeo-proteína preparados usando os métodos da invenção podem ser utilizados em vacinas conjugadas polissacarídeo-proteína multivalentes. Em certas modalidades, as vacinas conjugadas polissacarídeo-proteína multivalentes compreendem polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8 de S. pneumoniae , 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18B, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 27 , 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 como polissacarídeos livres, um componente de um conjugado polissacarídeo-proteína ou uma combinação dos mesmos, para fornecer uma vacina pneumocócica multivalente. Em certas modalidades, a composição imunogênica compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae de 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou 44 sorotipos de S. pneumoniae conjugados individualmente a uma ou mais proteínas carreadoras. Preferencialmente, sacarídeos de um sorotipo específico não são conjugados com mais de uma proteína carreadora.
[065] Depois dos glicoconjugados individuais serem purificados, eles são misturados para formular a composição imunogênica da presente invenção. Estes conjugados pneumocócicos são preparados por processos separados e formulados em lote em uma única formulação de dosagem. Composições farmacêuticas / de vacina
[066] A presente invenção fornece ainda composições, incluindo composições farmacêuticas, imunogênicas e de vacina, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente, consistindo em qualquer uma das combinações de sorotipo de polissacarídeo de S. pneumoniae descritas acima, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável e um adjuvante.
[067] A formulação dos conjugados polissacarídeo-proteína pode ser realizada usando métodos reconhecidos no estado da técnica. Por exemplo, conjugados pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e soluções de dextrose.
[068] Em uma formulação preferida, a composição da vacina é formulada em tampão L-histidina com cloreto de sódio.
[069] Como definido na presente invenção, um "adjuvante" é uma substância que serve para aumentar a imunogenicidade de uma composição imunogênica da invenção.
Um adjuvante imune pode melhorar uma resposta imune a um antígeno, que é fracamente imunogênico quando administrado isoladamente, por exemplo, por indução de títulos de anticorpos fracos ou resposta imune mediada por células, aumentando os títulos de anticorpos para o antígeno e/ou diminuindo a dose do antígeno eficaz para obter uma resposta imune no indivíduo.
Assim, os adjuvantes são frequentemente produzidos para aumentar a resposta imune e são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.
Adjuvantes adequados para aumentar a eficácia da composição incluem, mas não estão limitados a: (1) sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão de óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como peptídeos de muramila (definidos abaixo) ou componentes da parede celular bacteriana), tais como, por exemplo, (a) MF59 (Publicação de Pedido de Patente Internacional No.
WO90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE) formulados em partículas submicrônicas usando um microfluidizador, tal como o microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b ) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween, 80, 5% de polímero bloqueado por plurônico L121 e thr-MDP microfluidizado em uma emulsão em submicron ou submetida a turbilhonamento, para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, (c) sistema adjuvante Ribi ™ (RAS ), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes bacterianos da parede celular do grupo que consiste em monofosforilipídeo 3-O-desacilado A (MPL ™) descrito na Patente Americana No. 4.912.094, dimecolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferencialmente MPL + CWS (Detox ™); e
(d) um Montanide ISA. (3) adjuvantes de saponina, tais como Quil A ou STIMULON ™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (vide, por exemplo, Patente Americana No.
5.057.540), podem ser usados ou partículas geradas a partir deles, tais como ISCOM (complexos imunoestimulantes formados pela combinação de colesterol, saponina, fosfolipídios e proteínas anfipáticas) e Iscomatrix® (tendo essencialmente a mesma estrutura que um ISCOM, mas sem a proteína). (4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos sintéticos do lipídeo A, tais como compostos de glucosamina fosfato de aminoalquila (AGP), ou derivados ou análogos dos mesmos, que são disponibilizados pela Corixa, e são descritos na Patente Americana No. 6,113,918; um desses AGP é 2-Desóxi-4-O-fosfino-3-O- [(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranosídeo de 2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etila, também conhecido como 529 (anteriormente conhecido como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável. (5) polinucleotídeos sintéticos tais como oligonucleotídeos contendo motivo(s) de CpG (Patente Americana 6,207,646); (6) citocinas, como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferons (por exemplo, interferon gama), fator estimulador de colônias de macrófagos granulocitários (GM-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), fator estimulador de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimuladoras B7-1 e B7-2, etc; e (7) complemento, tal como um trímero do componente C3d de complemento.
[070] Em outra modalidade, o adjuvante é uma mistura de 2, 3 ou mais dos adjuvantes acima, por exemplo, SBAS2 (uma emulsão de óleo em água também contendo monofosforil lipídio A e QS21 3-desacilado).
[071] Os peptídeos de muramila incluem, mas não estão limitados a, N- acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L- alanina-2- (1 ', 2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (MTP-PE), etc.
[072] Em certas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio. O adjuvante de sal de alumínio pode ser uma vacina precipitada com alúmen ou uma vacina adsorvida com alúmen. Os adjuvantes de sal de alumínio são bem conhecidos no estado da técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow, E. e D. Lane (1988; Anticorpos: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) e Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143: 489-493). O sal de alumínio inclui, mas não está limitado a, alumina hidratada, hidrato de alumina, trihidrato de alumina (ATH), hidrato de alumínio, trihidrato de alumínio, Alhydrogel®, Superfos, Amphogel®, hidróxido de alumínio (III), hidroxifosfato de alumínio (adjuvante de fosfato de alumínio ( APA)), alumina amorfa, alumina tri- hidratada ou tri-hidroxialumínio.
[073] O APA é fabricado misturando cloreto de alumínio e fosfato de sódio em uma razão volumétrica de 1:1 para precipitar o hidroxifosfato de alumínio. Após o processo de mistura, o material é reduzido em tamanho com um misturador de alto cisalhamento para obter uma distribuição de tamanho de partícula monodispersa. O produto é então diafiltrado contra solução salina fisiológica e esterilizado a vapor.
[074] Em certas modalidades, um Al(OH)3 disponível comercialmente (por exemplo, Alhydrogel® ou Superfos da Dinamarca/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) é usado para adsorver proteínas. A adsorção de proteína depende, em outra modalidade, do pI (pH isoelétrico) da proteína e do pH do meio. Uma proteína com um pI mais baixo adsorve o íon de alumínio com carga positiva mais fortemente do que uma proteína com um pI mais alto. Os sais de alumínio podem estabelecer um depósito de Ag que é liberado lentamente por um período de 2-3 semanas, ser envolvido na ativação não-específica de macrófagos e ativação do complemento e/ou estimular o mecanismo imunológico inato (possivelmente através da estimulação do ácido úrico). Ver, por exemplo, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.
[075] Os conjugados aquosos monovalentes em lote são tipicamente misturados e diluídos. Uma vez diluído, o lote é filtrado estéril. O adjuvante fosfato de alumínio é adicionado assepticamente para atingir uma concentração final de 4 µg/mL para todos os sorotipos de S. pneumoniae, exceto o sorotipo 6B, que é diluído para um alvo de 8 µg / mL e uma concentração final de alumínio de 250 µg / mL. O lote formulado com adjuvante será introduzido em frascos ou seringas.
[076] Em certas modalidades, o adjuvante é uma sequência de nucleotídeos contendo CpG, por exemplo, um oligonucleotídeo contendo CpG, em particular, um oligodesoxinucleotídeo contendo CpG (CpG ODN). Em outra modalidade, o adjuvante é ODN 1826, que pode ser adquirido pela Coley Pharmaceutical Group.
[077] "Nucleotídeo contendo CpG", "Oligonucleotídeo contendo CpG", "Oligonucleotídeo CpG" e termos semelhantes se referem a uma molécula de nucleotídeo com 6-50 nucleotídeos de comprimento que contém uma fração CpG não metilada. Ver, por exemplo, Wang et al., 2003, Vaccine 21: 4297. Em outra modalidade, é pretendida qualquer outra definição aceita no estado da técnica dos termos. Os oligonucleotídeos contendo CpG incluem oligonucleotídeos modificados usando quaisquer ligações internucleosídeos sintéticos, base modificada e/ou açúcar modificado.
[078] Os métodos para o uso de oligonucleotídeos CpG são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sur et al., 1999, J. Immunol. 162:
6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127: 139-58; e Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23: 89-110. Administração/Dosagem
[079] As composições e formulações descritas na presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano suscetível à infecção, por exemplo, uma infecção pneumocócica, por meio da administração da vacina por uma via sistêmica ou mucosa. Por exemplo, as composições e formulações descrita na presente invenção podem ser usadas em um método para induzir uma resposta imune a um conjugado de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae, compreendendo administração a um humano, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição ou formulação imunogênica descrita na presente invenção. Em outro exemplo, as composições e formulações descrita na presente invenção podem ser usadas em um método de vacinação de um ser humano contra uma infecção pneumocócica, compreendendo a etapa de administração ao ser humano, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição ou formulação imunogênica descrita na presente invenção.
[080] Quantidades ótimas de componentes para uma determinada vacina podem ser determinadas por estudos padrão envolvendo a observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação a partir de estudos em animais para dados em humanos. Em outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.
[081] "Quantidade eficaz" de uma composição da invenção refere-se a uma dose necessária para desencadear anticorpos que reduzem significativamente a probabilidade ou gravidade de infectividade de um micróbio, por exemplo, S. pneumoniae, durante um desafio subsequente.
[082] Os métodos que utilizam as composições e formulações descrita na presente invenção podem ser utilizados para a prevenção e/ou redução de síndromes clínicas primárias causadas por micróbios, por exemplo, S. pneumoniae, incluindo infecções invasivas (meningite, pneumonia e bacteremia) e infecções não invasivas (otite média aguda e sinusite).
[083] A administração das composições e formulação descritas na presente invenção pode incluir um ou mais de: injeção por via intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou via administração mucosa ao trato oral / alimentar, respiratório ou geniturinário. Em uma modalidade, a administração intranasal é usada para o tratamento de pneumonia ou otite média (como o transporte de pneumococos nasofaríngeo pode ser mais eficazmente prevenido, atenuando a infecção em seu estágio inicial).
[084] A quantidade de conjugado em cada dose da vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos adversos significativos. Essa quantidade pode variar dependendo do sorotipo pneumocócico. Geralmente, para conjugados à base de polissacarídeos, cada dose compreenderá 0,1 a 100 µg de cada polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 µg, e mais particularmente 1 a 5 µg. Por exemplo, cada dose pode compreender 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 ou 750 µg ou 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 µg de cada polissacarídeo.
[085] Quantidades ótimas de componentes para uma vacina específica podem ser determinadas por estudos padrão que envolvem a observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação a partir de estudos em animais para dados em humanos. Em outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.
[086] Em uma modalidade, a dose do sal de alumínio é 10, 15, 20, 25, 30,
50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 ou 700 µg ou 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 mg ou mais. Em ainda outra modalidade, a dose de sal de alumínio descrita acima é por µg de proteína recombinante.
[087] Geralmente, cada dose de 0,5 mL é formulada para conter: 2 µg de cada polissacarídeo de S. pneumoniae, exceto o polissacarídeo do sorotipo 6B a 4 µg; cerca de 32 µg de proteína carreadora CRM197 (por exemplo, 32 µg ± 5 µg, ± 3 µg, ± 2 µg ou ± 1 µg); 0,125 mg de adjuvante elementar de alumínio (0,5 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão L-histidina. A concentração de cloreto de sódio é de cerca de 150 mM (por exemplo, 150 mM ± 25 mM, ± 20 mM, ± 15 mM, ± 10 mM ou ± 5 mM) e cerca de 20 mM (por exemplo, 20 mM ± 5 mM, ± 2,5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM ou ± 0,5 mM) L-histidina.
[088] De acordo com qualquer um dos métodos que utilizam uma composição ou formulação descrita na presente invenção, e em uma modalidade, o indivíduo é humano. Em certas modalidades, o paciente humano é uma bebê (menos de 1 ano de idade), criança (aproximadamente 12 a 24 meses) ou criança pequena (aproximadamente 2 a 5 anos). Em outras modalidades, o paciente humano é um paciente idoso (> 65 anos). As composições desta invenção também são adequadas para uso com crianças mais velhas, adolescentes e adultos (por exemplo, com idades entre 18 a 45 anos ou 18 a 65 anos).
[089] Em uma modalidade dos métodos usando uma composição ou formulação descrita na presente invenção, uma composição ou formulação é administrada como uma única inoculação. Em outra modalidade, a composição ou formulação é administrada duas, três ou quatro vezes ou mais, adequadamente espaçadas. Por exemplo, a composição ou formulação pode ser administrada em intervalos de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses ou qualquer combinação dos mesmos. O esquema de imunização pode seguir aquele designado para vacinas pneumocócicas. Por exemplo, o cronograma de rotina de bebês e crianças contra doenças invasivas causadas por S. pneumoniae é de 2, 4, 6 e 12 a 15 meses de idade. Assim, em uma modalidade preferida, a composição é administrada como uma série de 4 doses aos 2, 4, 6 e 12-15 meses de idade.
[090] As composições descritas na presente invenção também podem incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae. Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para inclusão incluem aquelas identificadas nas Publicações de Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 02/083855 e WO 02/053761. Formulações
[091] As composições descritas na presente invenção podem ser administradas a um indivíduo por um ou mais métodos conhecidos por um técnico no assunto, tais como por via parenteral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutânea, intra- peritoneal, e formulada em conformidade.
[092] Em uma modalidade, as composições descritas na presente invenção são administradas por injeção epidérmica, injeção intramuscular, injeção intravenosa, intra-arterial, subcutânea ou mucosa intrarespiratória de uma preparação líquida. As formulações líquidas para injeção incluem soluções e similares.
[093] A composição pode ser formulada como frascos para doses unitárias, frascos para doses múltiplas ou como seringas previamente preenchidas.
[094] Em outra modalidade, as composições são administradas por via oral e, portanto, são formuladas em uma forma adequada para administração oral, isto é, como uma preparação sólida ou líquida. As formulações orais sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, pastilhas e similares. As formulações orais líquidas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e similares.
[095] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para formulações líquidas são soluções, suspensões, emulsões ou óleos aquosos ou não aquosos. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas / aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Exemplos de óleos são os de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou lipídio derivado de leite ou ovos.
[096] A composição farmacêutica pode ser isotônica, hipotônica ou hipertônica. No entanto, é frequentemente preferido que uma composição farmacêutica para infusão ou injeção seja essencialmente isotônica quando administrada. Portanto, para armazenamento, a composição farmacêutica pode preferencialmente ser isotônica ou hipertônica. Se a composição farmacêutica for hipertônica para armazenamento, ela poderá ser diluída para se tornar uma solução isotônica antes da administração.
[097] O agente isotônico pode ser um agente isotônico iônico, como um sal, ou um agente isotônico não iônico, como um carboidrato. Exemplos de agentes isotônicos iônicos incluem, mas não estão limitados a, NaCl, CaCl2, KCl e MgCl. Exemplos de agentes isotônicos não iônicos incluem, entre outros, sacarose, trealose, manitol, sorbitol e glicerol.
[098] Também é preferido que pelo menos um aditivo farmaceuticamente aceitável seja um tampão. Para algumas finalidades, por exemplo, quando a composição farmacêutica se destina à infusão ou injeção, é frequentemente desejável que a composição compreenda um tampão, capaz de tamponar uma solução para um pH na faixa de 4 a 10, tal como 5 para 9, por exemplo 6 para 8.
[099] O tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em tampão Tris, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, L-histidina, glicina, succinato e trietanolamina.
[0100] Além disso, o tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. Por exemplo, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos monobásicos tais como ácido acético, benzóico, glucônico, glicérico e lático; ácidos dibásicos, tais como ácidos acíticos, adípicos, ascórbicos, carbônicos, glutâmicos, málicos, succínicos e tartáricos, ácidos polibásicos tais como ácido cítrico e fosfórico; e bases, tais como amônia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e Tris.
[0101] Os veículos parenterais (para injeção subcutânea, intravenosa, intra- arterial ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer com lactato e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como aqueles à base de dextrose de Ringer e similares. Exemplos são líquidos estéreis, tais como água e óleos, com ou sem a adição de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em geral, água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, glicóis, tais como propilenoglicóis ou polietilenoglicol, Polissorbato 80 (PS-80), Polissorbato 20 (PS-20) e Poloxamer 188 (P188) são carreadores líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis. Exemplos de óleos são os de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou lipídios derivados do leite ou ovos.
[0102] As formulações também podem conter um tensoativo. Os tensoativos preferidos incluem, mas não estão limitados a: os tensoativos dos ésteres de polioxietileno sorbitano (comumente referidos como os Tweens),
especialmente PS-20 e PS-80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de butileno (BO), vendidos sob a marca comercial DOWFAX ™, tais como copolímeros lineares em bloco EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiil) repetidos, com octoxinol-9 (Triton X-100 ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular interesse; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA-630 / NP-40); fosfolipídeos tais como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tais como a série Tergitol ™ NP; éteres graxos de polioxietileno derivados de álcoois laurílico, cetílico, estearílico e oleílico (conhecidos como tensoativos Brij), tais como monolauril éter de trietilenoglicol (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Um tensoativo preferido para inclusão na emulsão é o PS-20 ou PS-80.
[0103] Podem ser utilizadas misturas de tensoativos, por exemplo, misturas de PS-80 / Span 85. Também é adequada uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano, tais como monooleato de polioxietileno sorbitano (PS- 80) e um octoxinol, tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol.
[0104] Quantidades preferidas de tensoativos são: ésteres de polioxietileno sorbitano (tal como PS-80) 0,01 a 1% p/v, em particular cerca de 0,1% p/v; octil- ou nonilfenoxi-polioxietanóis (tal como Triton X-100 ou outros detergentes nas séries Triton) 0,001 a 0,1% p/v, em particular 0,005 a 0,02% p/v; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) 0,1 a 20% p/v, preferencialmente 0,1 a 10% p/v e em particular 0,1 a 1% p/v ou cerca de 0,5% p/v.
[0105] Em certas modalidades, a composição consiste essencialmente em L-histidina (20 mM), solução salina (150 mM) e 0,2% p/v de PS-20 a um pH de 5,8 com 250 µg / mL de APA (adjuvante de fosfato de alumínio). O PS-20 pode variar de 0,005 a 0,1% p/v com a presença de PS-20 ou PS-80 na formulação que controla a agregação durante a fabricação simulada e no transporte usando embalagem primária. O processo consiste em combinar a mistura de até 44 sorotipos de polissacarídeos de S. pneumoniae em L-histidina, cloreto de sódio e PS-20 e, em seguida, combinar esse material misturado com APA e cloreto de sódio com ou sem conservantes antimicrobianos.
[0106] A escolha do tensoativo pode precisar ser otimizada para diferentes fármacos e substâncias farmacêuticas. Para vacinas multivalentes contendo 15 ou mais sorotipos de polissacarídeos de S. pneumoniae, são preferidos PS-20 e P188. A escolha da química usada para preparar o conjugado também pode influenciar a estabilização da formulação. Em particular, como exemplificado abaixo, os conjugados pneumocócicos polissacarídeo-proteína preparados em solvente aquoso ou DMSO e combinados em uma composição multivalente mostram diferenças significativas na estabilidade, dependendo dos sistemas de tensoativos usados para a formulação.
[0107] Para as formulações descritas na presente invenção, um poloxâmero geralmente tem um peso molecular na faixa de 1.100 Da a 17.400 Da, de 7.500 Da a 15.000 Da ou de 7.500 Da a 10.000 Da. O poloxâmero pode ser selecionado entre o poloxâmero 188 ou o poloxâmero 407. A concentração final do poloxâmero nas formulações da invenção é de 0,001 a 5% p/v, ou 0,025 a 1% p/v. Um sistema de tensoativo compreendendo um poloxâmero deve compreender ainda um poliol. Em certos aspectos, o poliol é propilenoglicol e está na concentração final de 1 a 20% p/v. Em certos aspectos, o poliol é o polietilenoglicol 400 e está na concentração final de 1 a 20% p/v.
[0108] Os polióis adequados para as formulações são os polióis poliméricos, particularmente os poliéter-dióis, incluindo, entre outros, propilenoglicol e polietilenoglicol, polietilenoglicol monometil éter. O propilenoglicol está disponível em uma variedade de pesos moleculares do monômero de ~ 425 Da a ~ 2.700 Da. O polietilenoglicol e o polietilenoglicol monometil éter também estão disponíveis em uma variedade de pesos moleculares que variam de ~ 200 Da a ~ 35.000 Da, incluindo, entre outros, PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 e PEG MME 4000. Um polietilenoglicol preferido é o polietilenoglicol 400. A concentração final do poliol nas formulações pode ser de 1 a 20% p/v ou 6 a 20% p/v.
[0109] A formulação também contém uma solução salina tamponada. O tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em Tris, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, L-histidina, glicina, succinato, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanossulfônico), MOPS (ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico), MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico) e tampão trietanolamina. O tampão é capaz de tamponar uma solução para um pH na faixa de 4 a 10, 5,2 a 7,5 ou 5,8 a 7,0. Em certos aspectos, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato, succinato, L-histidina, MES, MOPS, HEPES, acetato ou citrato. Além disso, o tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. As concentrações de tampão variarão de 1 mM a 50 mM ou 5 mM a 50 mM. Em certos aspectos, o tampão é L-histidina a uma concentração final de 5 mM a 50 mM ou succinato a uma concentração final de 1 mM a 10 mM. Em certos aspectos, a L-histidina está em uma concentração final de 20 mM ± 2 mM.
[0110] Embora a solução salina (isto é, uma solução contendo NaCl) seja preferida, outros sais adequados para a formulação incluem, mas não estão limitados a, CaCl2, KCl e MgCl2 e combinações dos mesmos. Agentes isotônicos não iônicos, incluindo, mas não limitados a, sacarose, trealose, manitol, sorbitol e glicerol, podem ser usados no lugar de um sal. As faixas de sal adequadas incluem, entre outros, 25 mM a 500 mM ou 40 mM a 170 mM. Em um aspecto, a solução salina é NaCl, opcionalmente presente em uma concentração de 20 mM a 170 mM.
[0111] Em uma modalidade preferida, as formulações compreendem um tampão de L-histidina com cloreto de sódio.
[0112] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é liberada em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, o agente pode ser administrado usando infusão intravenosa, um adesivo transdérmico, lipossomas ou outros modos de administração. Em outra modalidade, são utilizados materiais poliméricos; por exemplo, em microesferas ou em um implante.
[0113] As composições descritas na presente invenção também podem incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae. Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para inclusão incluem aquelas identificadas nas Publicações de Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 02/083855 e WO 02/053761. Métodos Analíticos Análise de peso molecular e concentração de conjugados usando ensaio HPSEC / UV / MALS / RI
[0114] As amostras de conjugado são injetadas e separadas por cromatografia de exclusão por tamanho de alta eficiência (HPSEC). A detecção é realizada com detectores ultravioleta (UV), espalhamento de luz de ângulo múltiplo (MALS) e índice de refração (RI) em série. A concentração de proteína é calculada a partir de UV280 usando um coeficiente de extinção. A concentração de polissacarídeo é desconvoluída a partir do sinal RI (contribuído por proteínas e polissacarídeo) usando os fatores dn / dc que são a alteração em um índice de refração de uma solução com uma alteração na concentração de soluto indicada em mL / g. O peso molecular médio das amostras é calculado pelo software Astra (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) usando as informações de concentração medidas e espalhamento de luz em todo o pico da amostra. Existem várias formas de valores médios de peso molecular para moléculas polidispersas. Por exemplo, peso molecular médio numérico Mn, peso molecular médio ponderado Mw e peso molecular médio z Mz (Molecules, 2015, 20: 10313-10341). A menos que especificado, o termo "peso molecular", conforme usado em toda a descrição, é o peso molecular médio ponderado. Determinação do consumo de lisina em proteína conjugada como uma medida do número de ligações covalentes entre polissacarídeo e proteína carreadora
[0115] A análise de aminoácidos Waters AccQ-Tag (AAA) é usada para medir a extensão da conjugação em amostras de conjugados. As amostras são hidrolisadas usando hidrólise ácida em fase de vapor na estação de trabalho Eldex, para quebrar as proteínas carreadoras em seus aminoácidos componentes. Os aminoácidos livres são derivatizados usando carbamato de 6-aminoquinolil- N-hidroxissuccinimidila (AQC). As amostras derivatizadas são então analisadas usando UPLC com detecção UV em uma coluna C18. A concentração média de proteína é obtida usando aminoácidos representativos que não a lisina. O consumo de lisina durante a conjugação (isto é, perda de lisina) é determinado pela diferença entre a quantidade média medida de lisina no conjugado e a quantidade esperada de lisina na proteína inicial. Testes de Polissacarídeo Livre
[0116] O polissacarídeo livre (isto é, polissacarídeo que não é conjugado com CRM197) na amostra de conjugado é medido pela primeira precipitação de proteína livre e conjugados com deoxicolato (DOC) e ácido clorídrico. Os precipitados são então filtrados e os filtrados são analisados quanto à concentração de polissacarídeo livre por HPSEC / UV / MALS / RI. O polissacarídeo livre é calculado como uma porcentagem do polissacarídeo total medido por HPSEC / UV / MALS / RI. Testes de Proteína Livre
[0117] O polissacarídeo livre, o conjugado polissacarídeo-CRM197 e o CRM197 livre nas amostras conjugadas são separados por eletroforese capilar no modo de cromatografia eletrocinética micelar (MEKC). Resumidamente, as amostras são misturadas com tampão de corrida MEKC contendo borato a 25 mM, SDS a 100 mM, pH 9,3 e são separadas em um capilar de sílica pré- condicionada sem condensação. A separação é monitorada a 200 nm e o CRM197 livre é quantificado com uma curva padrão de CRM197. Os resultados de proteínas livres são relatados como sendo uma porcentagem do teor total de proteínas determinado pelo procedimento HPSEC / UV / MALS / RI.
[0118] Ao serem descritas as várias modalidades da invenção com referência à descrição e desenhos anexos, deve ser entendido que a invenção não está limitada a essas modalidades precisas e que várias alterações e modificações poderão ser efetuadas por um técnico no assunto, sem sair do escopo ou espírito da invenção, conforme definido nas reivindicações anexas.
[0119] Os exemplos a seguir ilustram, mas não limitam a invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Preparação de polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae
[0120] Os métodos de cultura de pneumococos são bem conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Os métodos de preparação de polissacarídeos capsulares pneumocócicos também são bem conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Patente Europeia No. EP 0 497 524 B1. O processo descrito abaixo segue geralmente o método descrito na Patente Europeia No. EP 0 497
524 B1 e é geralmente aplicável a todos os sorotipos pneumocócicos, exceto quando especificamente modificado.
[0121] Os isolados dos sorotipos pneumocócicos 3, 8, 12F foram obtidos na Universidade da Pensilvânia (Dr. Robert Austrian). Isolados dos sorotipos pneumocócicos 15A, 16F, 23A, 24F, 35B foram obtidos da Merck Culture Collection. Isolados dos sorotipos pneumocócicos 23B e 31 foram obtidos nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Atlanta, GA). O isolado do sorotipo 17F pneumocócico foi obtido no Escritório de Biologia da FDA (Dr. John Robbins). O isolado do sorotipo 20 pneumocócico foi obtido da ATCC. Onde necessário, os subtipos podem ser diferenciados com base na reação de Quelling usando anti- soros específicos. Vide, por exemplo, Patente US No. 5,847,112. Os isolados obtidos foram isolados por clonagem em seguida, pelo plaqueamento em série em duas etapas em placas de ágar, consistindo em um meio livre de componente de origem animal contendo peptona de soja, extrato de levedura e glicose sem hemina. Os isolados clonais para cada sorotipo foram expandidos ainda mais na cultura líquida usando meios livres de componente de origem animal contendo peptona de soja, extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de potássio, glicose e glicerol para preparar os bancos de células pré-master.
[0122] A produção de cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico consistiu em uma expansão celular e fermentação da produção em batelada seguida de inativação química antes da purificação a jusante. Um frasco de banco de células descongelado de cada sorotipo foi expandido usando um frasco de agitação ou frasco de cultura contendo um meio de crescimento livre de componente de origem animal pré-esterilizado contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou ultrafiltrado de extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio , fosfato de potássio e glicose. A cultura de expansão celular cresceu em uma garrafa ou frasco de agitação vedado para minimizar as trocas gasosas com controle de temperatura e agitação. Após atingir uma densidade de cultura especificada, medida pela densidade óptica a 600 nm, uma porção da cultura de expansão celular foi transferida para um fermentador de produção contendo meio de crescimento livre pré-esterilizado de componente de origem animal contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou extrato de levedura ultrafiltrado, cloreto de sódio, fosfato de potássio e glicose. Temperatura, pH, pressão e agitação foram controlados. A sobreposição do fluxo de ar também foi controlada, pois não foi utilizada a aspersão.
[0123] A fermentação em batelada foi terminada através da adição de um agente de inativação química, fenol, quando a glicose estava quase esgotada. Foi adicionado fenol puro a uma concentração final de 0,8 - 1,2% para inativar as células e liberar o polissacarídeo capsular da parede celular. A inativação primária ocorre por um tempo especificado no fermentador, onde a temperatura e a agitação continuam sendo controladas. Após a inativação primária, o lote foi transferido para outro recipiente, onde foi mantido por um tempo especificado adicional sob temperatura e agitação controlada para inativação completa. Isto foi confirmado por técnicas de plaqueamento microbiano ou por verificação da concentração de fenol e tempo especificado. O caldo inativado foi então purificado. Purificação de Ps
[0124] A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu em várias etapas de centrifugação, filtração em profundidade, operações de concentração/diafiltração e precipitação. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, salvo indicado o contrário.
[0125] O caldo inativado das culturas de fermentador de S. pneumoniae foi floculado com um polímero catiônico (como BPA-1000, Petrolite "Tretolite" e "Spectrum 8160" e poli(etilenoimina), "Millipore pDADMAC"). Os polímeros catiônicos se ligam à proteína da impureza, ácidos nucléicos e resíduos celulares. Após a etapa de floculação e um período de envelhecimento, os sólidos floculados foram removidos por centrifugação e várias etapas de filtração em profundidade. O caldo clarificado foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de 100 kDa a 500 kDa MWCO (corte de peso molecular). A diafiltração foi realizada usando Tris, tampão MgCl2 e tampão fosfato de sódio. A diafiltração removeu ácido nucleico e proteína residuais.
[0126] A remoção adicional de impurezas foi realizada por reprecipitação do polissacarídeo em acetato de sódio e fenol com álcool desnaturado e/ou isopropanol. Durante a etapa de precipitação do fenol, o acetato de sódio em tampão salino de fosfato de sódio e o fenol (fenóis liquefeitos ou fenóis sólidos) foram carregados na porção retida diafiltrada. O fracionamento de álcool do polissacarídeo foi então realizado em duas etapas. Na primeira etapa, um baixo percentual de álcool foi adicionado à preparação para precipitar detritos celulares e outras impurezas indesejadas, enquanto o polissacarídeo bruto permaneceu em solução. As impurezas foram removidas através de uma etapa de filtração em profundidade. O polissacarídeo foi então recuperado da solução adicionando-se isopropanol adicional ou álcool desnaturado ao lote. O sedimento precipitado de polissacarídeo foi recuperado por centrifugação, triturado e seco como um pó e armazenado congelado a -70oC. EXEMPLO 2: MÉTODOS GERAIS DE CONJUGAÇÃO Redução do tamanho de polissacarídeos e oxidação
[0127] O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado por 0,45 mícrons. A menos que especificado de outro modo, os polissacarídeos foram homogeneizados para reduzir a massa molecular do polissacarídeo. A pressão de homogeneização e o número de passagens através do homogeneizador foram controlados para alvos específicos de sorotipo (150-1000 bar; 4-7 passagens).
[0128] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi filtrado em 0,2 mícrons e depois concentrado e diafiltrado contra água destilada usando uma membrana de ultrafiltração por fluxo tangencial NMWCO de 5 kDa ou 10 kDa.
[0129] A solução de polissacarídeo foi então ajustada para 22 ° C e pH 5 com um tampão acetato de sódio para minimizar a redução do tamanho do polissacarídeo devido à ativação.
[0130] Os polissacarídeos purificados foram preparados para conjugação, isto é, ativados usando oxidação com metaperiodato de sódio (Vide Anderson et al., 1986, J. Immunol. 137: 1181-1186; e Publicação do Pedido de Patente US No. US20110195086). Uma solução de metaperiodato de sódio a 100mM foi adicionada à solução de polissacarídeo em acetato de sódio a 50 M. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi específica para o sorotipo, variando de aproximadamente 0,1 a 0,5 moles de metaperiodato de sódio por mole da unidade de repetição de polissacarídeos, para atingir um nível alvo de ativação de polissacarídeos (moles de aldeído por mole de unidade de repetição de polissacarídeos). A amostra foi misturada durante um tempo de incubação alvo protegido da luz.
[0131] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de água destilada usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 5 kDa ou 10 kDa, seguida por diafiltração adicional contra água. A ultrafiltração para todos os sorotipos foi realizada a 2-8 ° C. Conjugação
[0132] O CRM197 purificado, obtido por expressão em Pseudomonas fluorescens como descrito anteriormente (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato a 2 mM, tamponado a pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração por fluxo tangencial NMWCO de 5 kDa e filtro de 0,2 mícron.
[0133] Polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 1-6 mg Ps/mL com concentração de sacarose de 0,5-30% p/v. O CRM197 foi formulado para liofilização a 6 mg Pr/mL com concentração de sacarose de 1% p/v.
[0134] As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram liofilizadas individualmente. Os materiais liofilizados de Ps e CRM197 foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram combinadas para atingir uma concentração alvo de polissacarídeo e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante. Foi adicionado cianoborohidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeos) e a conjugação prosseguiu durante um tempo de incubação alvo a 22 ° C. Redução com borohidreto de sódio
[0135] Adicionou-se borohidreto de sódio (2 moles por mol da unidade de repetição de polissacarídeos) após a reação de conjugação. O lote foi diluído em cloreto de sódio a 150 mM com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 ° C. Foi adicionado tampão fosfato de potássio para neutralizar o pH. Filtração final e armazenamento do produto
[0136] Os conjugados foram então dialisados contra cloreto de sódio a 150 mM com 0,015% (p/v) 20 de polisorbato 20 a aproximadamente 4 ° C usando uma membrana NMWC de 300 kDa ou diafiltrados contra cloreto de sódio a 150 mM, com ou sem fosfato de potássio a 25 mM, p.H 7 usando uma membrana de ultrafiltração por fluxo tangencial NMWC de 30 kDa, seguida de concentração e diafiltração contra de histidina a 10mM em cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 ° C usando membrana de ultrafiltração por fluxo tangencial NMWC de 300 kDa. O lote retido foi diluído com histidina a 10 mM adicional em cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,0 e filtro de 0,2 mícron. A solução final do conjugado foi dispensada em alíquotas e congelada a ≤ -60 ° C. EXEMPLO 3: Hidrólise ácida de polissacarídeos dos sorotipos 12F, 23A, 24F e 31
[0137] A conjugação de polissacarídeos pneumocócicos a proteínas por aminação redutiva em um solvente aprótico como o DMSO foi descrita anteriormente. Polissacarídeos ativados (Ps) e proteínas (Pr) são tipicamente liofilizados, ressuspensos em DMSO, depois misturados e incubados com cianoborohidreto de sódio e borohidreto de sódio para obter a conjugação. Os polissacarídeos podem ser mecanicamente reduzidos em tamanho (por exemplo, por homogeneização) antes da oxidação para reduzir a massa molecular de Ps e fornecer um tamanho consistente de Ps para conjugação. Para muitos sorotipos pneumocócicos, a conjugação de Ps oxidado e com tamanho reduzido produz conjugados que atendem aos atributos de tamanho, consumo de lisina, polissacarídeo livre e proteína livre. No entanto, para alguns sorotipos, verificou- se que os atributos de conjugado alvo eram difíceis de obter com esse processo, mesmo após a otimização dos parâmetros do processo. Redução de Tamanho de Ps
[0138] O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado dos sorotipos 23A, 24F e 31 foi dissolvido em água. Diferentes braços de testes foram processados mecanicamente por homogeneização ou quimicamente por hidrólise ácida para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogeneização e o número de passagens através do homogeneizador foram controlados para alvos específicos de sorotipo (150-1000 bar; 4-7 passagens). A hidrólise ácida foi realizada aquecendo o lote a 90-92 ° C, adicionando ácido acético concentrado a uma concentração final de 200 mM, depois incubando por até 90 minutos. No final do período de incubação, o lote foi neutralizado pela adição de tampão fosfato de potássio concentrado pH 7 a uma concentração final de 400 mM e resfriamento a ≤22 ° C. O polissacarídeo de tamanho reduzido foi filtrado em 0,2 mícrons e depois concentrado e diafiltrado em água usando uma membrana de ultrafiltração por fluxo tangencial NMWC de 5 kDa ou 10 kDa.
[0139] Os polissacarídeos foram conjugados como descrito no Exemplo 2.
[0140] Condições e resultados de teste estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resumo dos braços de teste, redução de tamanho de Ps por homogeneização vs hidrólise ácida, para os sorotipos 23A, 24F e 31 de S. pneumoniae Conjugado fração de Os livre / Pr Método de redução de tamanho (mg/mL) / Ps:Pr / tempo (hrs) / [NaCl] Condições de conjugação, [Ps] Conjugado perda de lisina Condições de redução de Mw de Ps oxidado(kD) Carga de NaIO4 (MEq) Mw de conjugado(kD) Sorotipo (mol/mol) tamanho (mM) livre 600 bar / Homoge 7% / 3 0,20 319 3 / 1,5 / 3 / 25 6774 8,4 neizado 18% 23A passagens Hidrólise 90°C / 90 11% / 0,20 97 3 / 1,5 / 2 / 25 2996 12,6 ácida min <3% 600 bar / Homoge 2 / 1,5 / 17 / 51% / 24F 5 0,18 227 8727 10,6 neizado 25 15% passagens
Hidrólise 92°C / 90 2 / 1,5/ 15 / 22% / 0,18 100 5816 9,0 ácida min 25 2% 400 bar / Homoge 18% / 5 0,12 186 4 / 1,5 / 4 / 25 3323 11,5 neizado 3% 31 passagens Hidrólise 90°C / 30 2% / 0,16 119 4 / 1,2 / 4 / 25 3201 13,3 ácida min <2%
[0141] Como observado na Tabela 1, a redução de tamanho por hidrólise ácida forneceu um meio para obter maior perda de lisina (sorotipo 23A), menor Ps livre (sorotipo 24F e 31) ou menor Pr livre (sorotipos 23A, 24F e 31) comparados à homogeneização. Para os sorotipos 23A e 24F, os níveis mais altos de proteína livre para homogeneização podem ter sido associados a formas agregadas que, por sua vez, podem ter contribuído para os níveis mais altos medidos de Mw de conjugado.
[0142] Sem estar vinculado a nenhuma teoria em particular, os dados sugerem que o menor peso molecular do polissacarídeo oxidado (preferencialmente inferior a 150 KDa) alcançado por hidrólise ácida ajudou a melhorar a conjugação (menor Ps livre ou Pr livre). Acredita-se que processos alternativos de redução de tamanho (por exemplo, por hidrólise ácida) possam ser utilizados para obter polissacarídeo nessa faixa de tamanho preferida para obter benefícios de conjugação semelhantes. Impacto do tipo ácido, mantendo o pH constante na hidrólise ácida do sorotipo 12F
[0143] Para determinar se o tipo de ácido teve um impacto no tamanho do polissacarídeo, a hidrólise ácida usando ácido clorídrico foi comparada ao ácido acético. O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado do sorotipo 12F de S. pneumoniae foi dissolvido em água e filtrado por 0,45 µm. O lote foi diluído para 2,5 g Ps / L e dividido em dois braços. A hidrólise ácida foi realizada em ambos os braços, primeiro aquecendo-os a 80 ° C. Foi adicionado ácido para manter um pH semelhante nos dois braços. A um braço, foi adicionado ácido acético glacial a uma concentração final de 200 mM, pH 2,6. Ao outro braço, foi adicionado ácido clorídrico a 1N a uma concentração final de 2,5 mM, pH 2,7. Ambos os braços foram então incubados por 155 minutos. No final do período de incubação, os braços foram neutralizados adicionando tampão fosfato de potássio concentrado pH 7 a uma concentração final de aproximadamente 400 mM e resfriando a 4 ° C. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2: Hidrólise ácida do polissacarídeo 12F de S. pneumoniae usando ácido clorídrico Tempo Temp. da da pH da Conc. de Mn Mw Polidispe Descrição hidrólise hidrólise hidrólise Ps (kD) (kD) rsividade ácida (°C) ácida ácida (mg/mL) (min) Alimentação da hidrólise N/A N/A N/A 349,7 448,6 1,283 2,496 ácida Ácido hidrolizado
80.0 +/- com ácido 155 2.64 75,2 104,4 1,388 1,866
0.5 acético a 200 mM Ácido hidrolizado
80.0 +/- com ácido 155 2.70 76,5 106,6 1,393 1,856
0.5 clorídrico a 2,5 mM
[0144] Ambas as condições de hidrólise ácida produziram polissacarídeos de tamanho semelhante.
EXEMPLO 4: Impacto da razão de massa de sacarose para polissacarídeo na dissolução de polissacarídeos a partir de sorotipos 3, 8 e 24F de S. pneumoniae em DMSO
[0145] Na preparação para a conjugação de polissacarídeos a proteínas em um solvente aprótico, as soluções de polissacarídeo e proteína são tipicamente liofilizadas. Para a maioria dos sorotipos pneumocócicos, a formulação de polissacarídeos ativados (Ps) para liofilização em solução aquosa a 6 mg Ps / mL com concentração de sacarose de 5% p/v (50 mg de sacarose / mL) resultou em material liofilizado adequado para redissolução em DMSO e conjugação. Para os sorotipos 3, 8 e 24F, foi descoberto que essa formulação (6 mg Ps / mL, 50 mg de sacarose / mL, razão de massa de sacarose: Ps = 8,3) produzia material liofilizado que não se dissolveu no DMSO.
[0146] Foram realizados testes para otimizar a formulação de liofilização de polissacarídeo ativado para dissolução em DMSO. Os polissacarídeos ativados foram formulados em uma variedade de concentrações de polissacarídeos (1-6 mg Ps/mL) e concentrações de sacarose (50 - 300 mg sacarose/mL) em recipientes de polipropileno. As soluções foram liofilizadas para remover a água e, em seguida, foi adicionado DMSO à temperatura ambiente com mistura para redissolver polissacarídeos. A dissolução bem sucedida foi determinada por observação visual.
[0147] Os resultados para o sorotipo 3, 24F e 8 são mostrados nas tabelas 3, 4 e 5, respectivamente. Tabela 3. Testes de formulação e dissolução de liofilização do sorotipo 3 Condição Polissacarídeo Condições de formulação de pré- Adição de DMSO Pós- experimental liofilização liofilização [Ps], [sacarose], Razão de [Ps], Mw (kD) Dissolução (mg/mL) (mg/mL) massaSacarose: mg/mL
Ps
1 211 6,0 30 5,0 2,0 Não
2 211 6,0 40 6,7 4,0 Não
3 211 6,0 50 8,3 6,0 Não
4 212 1,0 5.0 5,0 2,0 Não
5 212 1,0 10 10 2,0 Não
6 212 1,0 20 20 2,0 Não
7 212 1,0 50 50 2,0 Sim
8 212 1,0 100 100 2,0 Sim
9 212 6,0 50 8.3 6,0 Não
10 212 4,0 200 50 6,0 Sim
11 212 3,0 150 50 6,0 Sim
12 212 2,0 100 50 6,0 Sim
13 212 4,0 200 50 3,0 Sim
2,0 – 5,0 Sim (todos 14 257 2,0 100 50 (múltiplos os braços) braços)
15 253 2,0 40 20 3,0 Não
16 253 2,0 60 30 3,0 Sim
17 253 2,0 80 40 3,0 Sim
18 253 2,0 100 50 3,0 Sim
19 253 4,0 80 20 3,0 Não
20 253 4,0 120 30 3,0 Não totalmente dissolvido
21 253 4,0 160 40 3,0 Sim
22 253 4,0 200 50 3,0 Sim
Tabela 4. Testes de formulação e dissolução de liofilização do sorotipo 24F
Condição Condições de formulação de pré- Adição de DMSO pós- Polissacarídeo experimental liofilização liofilização
Razão de [Ps], [sacarose], [Ps], Mw (kD) massa de Dissolução (mg/mL) (mg/mL) mg/mL Sacarose:Ps
2,0-8,0 1 142 6 50 8.3 (múltiplos Não braços)
2 142 6 50 8.3 4,0 Não
3 142 6 300 50 6,0 Sim
4 142 4 200 50 4,0 Sim*
5 142 3 150 50 4,0 Sim
6 142 2 100 50 4,0 Sim
4,0-8,0 7 142 2 100 50 (múltiplos Sim braços)
4,0-8,0 8 132 6 50 8,3 (múltiplos Não braços)
4,0-8,0 9 132 2 100 50 Sim (múltiplos braços)
3,0-4,0 10 142 2 100 50 (múltiplos Sim braços)
2,0-6,0 11 227 2 100 50 (múltiplos Sim braços)
3,0-4,0 12 63 6 50 8.3 (múltiplos Não braços)
3,0-5,0 13 63 2 100 50 (múltiplos Sim braços)
* Na condição experimental 4, observou-se uma única partícula visível pequena que não parece ser devido à dissolução incompleta Tabela 5: Testes de formulação e dissolução de liofilização do sorotipo 8
Condição Condições de formulação de Adição de DMSO pós- Polissacarídeo experimental pré-liofilização liofilização
Razão de [Ps], [sacarose], Mw (kD) massa de [Ps], mg/mL Dissolução (mg/mL) (mg/mL) Sacarose:Ps
4,0-8,0 1 233 6,0 50 8,3 (múltiplos Não braços)
4,0-8,0 2 233 2,0 100 50 (múltiplos Sim braços)
4,0-8,0 3 252 2,0 100 50 (múltiplos sim braços)
[0148] Para esses sorotipos, observou-se dissolução completa em toda a faixa de concentrações de polissacarídeos estudada (para liofilização e dissolução), no entanto, a dissolução dependia das concentrações de polissacarídeo e sacarose. Especificamente, quando a razão de massa de sacarose era menor que 30X a do polissacarídeo, não foi alcançada a dissolução em DMSO após liofilização. Os resultados de dissolução mais consistentes foram encontrados quando a razão de massa de sacarose era pelo menos 40X a do polissacarídeo.
[0149] Vários braços das condições positivas de dissolução foram conjugados com sucesso ao CRM197, como descrito no Exemplo 2. Impacto do tipo de açúcar e da taxa de massa açúcar / polissacarídeo na dissolução do polissacarídeo de S. pneumoniae do sorotipo 3 no DMSO
[0150] Realizaram-se experimentos para avaliar o impacto do tipo de açúcar e da razão de massa de açúcar: polissacarídeo na dissolução liofilizada de polissacarídeo ativado em DMSO. O polissacarídeo do sorotipo 3 ativado foi formulado em 2,5 ou 6 mg Ps / mL e em uma faixa de concentrações de açúcar (50 - 150 mg de açúcar / mL) em recipientes de polipropileno. Os açúcares testados foram sacarose, trealose e manitol. As soluções foram liofilizadas para remover a água e, em seguida, foi adicionado DMSO à temperatura ambiente com mistura para redissolver polissacarídeos. A dissolução bem sucedida foi determinada por observação visual. Os resultados são mostrados na Tabela 6. Tabela 6: Impacto do tipo de açúcar no polissacarídeo do sorotipo 3 Condição Condições de formulação de pré- Adição de DMSO Polissacarídeo experimental liofilização pós-liofilização
Razão de [Ps], Tipo de [açúcar], [Ps], Mw (kD) massa Dissolução (mg/mL) açucar (mg/mL) mg/mL açúcar:Ps A1 171 6,0 Sacarose 50 8,3 4,4 Não A2 171 2,5 Sacarose 50 20 4,4 Não A3 171 2,5 Sacarose 75 30 4,4 Sim A4 171 2,5 Sacarose 100 40 4,4 Sim A5 171 2,5 Sacarose 125 50 4,4 Sim A6 171 2,5 Sacarose 150 60 4,4 Sim B1 171 6,0 Trealose 50 8,3 4,4 Não B2 171 2,5 Trealose 50 20 4,4 Não B3 171 2,5 Trealose 75 30 4,4 Sim B4 171 2,5 Trealose 100 40 4,4 Sim B5 171 2,5 Trealose 125 50 4,4 Sim B6 171 2,5 Trealose 150 60 4,4 Sim C1 171 6,0 Manitol 50 8,3 4,4 Não C2 171 2,5 Manitol 50 20 4,4 Não C3 171 2,5 Manitol 75 30 4,4 Sim* C4 171 2,5 Manitol 100 40 4,4 Sim C5 171 2,5 Manitol 125 50 4,4 Sim C6 171 2,5 Manitol 150 60 4,4 Não * viscoso
[0151] Para todos os açúcares utilizados, a dissolução no DMSO foi alcançada para razões de massa de açúcar de 30X e superiores, com exceção do manitol, que parecia atingir o limite de solubilidade no DMSO em 60X. Os resultados de dissolução mais consistentes foram encontrados quando a razão de massa de açúcar era pelo menos 40X maior do que a do polissacarídeo.
[0152] Outro experimento foi realizado com o uso de combinações de açúcares em formulações de liofilização de polissacarídeos do sorotipo 3 ativados. Todos os braços foram formulados com uma razão de massa total de açúcar a 40X, uma vez que essa razão produziu dissolução consistente em DMSO. O peso molecular do polissacarídeo foi de 171 kD. Todos os braços usavam sacarose, isoladamente, com trealose ou com manitol. As soluções foram liofilizadas para remover a água e, em seguida, foi adicionado DMSO à temperatura ambiente com mistura para redissolver polissacarídeos. A dissolução bem sucedida foi determinada por observação visual. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Tabela 7: Combinações de açúcar para dissolução de polissacarídeos em
DMSO Adição pós- Condições de formulação de pré-liofilização liofilização de DMSO Razão Razão Razão de de Tipo 2 [açúcar de [Ps], [Sacarose] massa massa [Ps], de 2] massa Dissolução (mg/mL) (mg/mL) Sacarose total mg/mL açúcar (mg/mL) açúcar :Ps açúcar: 2:Ps Ps 2,5 100 40 N/A 0 0 40 4,4 Sim 2,5 75 30 Trealose 25 10 40 4,4 Sim 2,5 50 20 Trealose 50 20 40 4,4 Sim 2,5 75 30 Manitol 25 10 40 4,4 Sim
[0153] A dissolução no DMSO foi alcançada para todos os braços testados. EXEMPLO 5: Efeito do cloreto de sódio na conjugação dos sorotipos 15A, 16F, 17F, 20, 24F e 35B de S. pneumoniae usando aminação redutiva em DMSO
[0154] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 2-6 mg Ps/mL com concentrações de sacarose de 5-10% p/v em recipientes de polipropileno. O CRM197 foi formulado para liofilização a 6 mg Pr/mL com concentração de sacarose de 1% p/v.
[0155] As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram liofilizadas individualmente. Os materiais liofilizados de Ps e CRM197 foram redissolvidos em DMSO. Para alguns braços, uma solução-mãe de cloreto de sódio a 5M foi utilizada para aumentar a solução CRM197 antes da liofilização ou a solução Ps redissolvida para atingir concentrações finais durante a conjugação de cloreto de sódio a 10-100 mM. Outros parâmetros do processo foram mantidos constantes nesses testes.
[0156] As soluções Ps e CRM197 redissolvidas foram mescladas e misturadas para atingir as concentrações de polissacarídeo e proteína específicas do sorotipo. Adicionou-se cianoborohidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeos) e a conjugação prosseguiu por uma duração específica de sorotipo. A redução com borohidreto de sódio e a filtração final foram realizadas como descrito no Exemplo 2. Resultados
[0157] Resultados de testes para polissacarídeo do sorotipo 20 de S. pneumoniae mostrando o impacto do cloreto de sódio durante a conjugação em atributos de conjugado são mostrados nas Figuras 1, 2 e 3. Resultados de teste para os sorotipos 16F e 24F de S. pneumoniae são mostrados na Tabela 8.
[0158] Como mostrado na figura 1 para o sorotipo 20, o aumento da concentração de cloreto de sódio durante a conjugação (até cerca de 50 mM) aumentou o tamanho do conjugado. Como mostrado na figura 2, o aumento da concentração de cloreto de sódio (até ca. 25 mM) aumentou o consumo de lisina e, como mostrado na figura 3, o aumento da concentração de cloreto de sódio (até ca. 50 mM) reduziu Ps livre e Pr livre. Tabela 8. Impacto do cloreto de sódio nos atributos de conjugado dos sorotipos 16F e 24F de S. pneumoniae Sorotipo Concentração de Conjugado Consumo de Fração de Fração de NaCl durante Mn / Mw (kD) lisina Ps livre Pr livre conjugação (mM) (mol/mol) 0 438 / 1040 9,3 23% 7% 16F 25 1161 / 3944 11,0 7% 4% 0 2534 / 6478 1.,8 85% 24% 24F 25 2059 / 3402 4,5 59% 10% 0 954 / 1343 7,8 51% 23% 15A 25 1748 / 3371 8,9 23% 7% 0 N/R >32% 35B 25 32% 5%
[0159] Como mostrado na Tabela 8 para o sorotipo 16F, a inclusão de cloreto de sódio a 25 mM durante a conjugação aumentou o tamanho do conjugado e o consumo de lisina, enquanto reduziu o Ps livre e o Pr livre. Conforme mostrado na Tabela 8 para o sorotipo 24F, a inclusão de cloreto de sódio a 25 mM durante a conjugação aumentou o consumo de lisina, enquanto reduziu o Ps livre e o Pr livre.
[0160] Resultados semelhantes foram encontrados para os sorotipos 15A e 35B. Para o sorotipo 15A, a inclusão de cloreto de sódio a 25 mM durante a conjugação aumentou o tamanho do conjugado e o consumo de lisina, enquanto reduziu o polissacarídeo livre e a proteína livre em comparação com nenhum sal durante a conjugação. Para o sorotipo 35B, a inclusão de cloreto de sódio a 25 mM durante a conjugação aumentou o tamanho do conjugado e o consumo de lisina (dados não mostrados), enquanto reduziu a proteína livre em comparação com nenhum sal durante a conjugação.
[0161] Efeito do tipo e concentração de sal na conjugação do sorotipo 17F de S. pneumoniae usando aminação redutiva em DMSO.
[0162] O polissacarídeo do sorotipo 17F ativado foi formulado para liofilização a 6 mg Ps / mL com concentrações de sacarose de 5% p/v em recipientes de polipropileno. O CRM197 foi formulado para liofilização a 6 mg Pr
/ mL com concentração de sacarose de 1% p/v.
[0163] As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram liofilizadas individualmente. Os materiais liofilizados de Ps e CRM197 foram redissolvidos em DMSO. Para alguns braços, as soluções de sal concentradas foram adicionadas à solução Ps redissolvida ou à mistura Ps-CRM para obter concentrações finais durante a conjugação de 1-100 mM de sal. As soluções de estoque utilizadas incluíram 1M ou 5M de cloreto de sódio, 1M ou 3M de cloreto de potássio e 1M de cloreto de magnésio. Outros parâmetros do processo foram mantidos constantes nesses testes.
[0164] As soluções Ps e CRM197 redissolvidas foram mescladas e misturadas a 2,7 g de Ps / mL e 1,8 mg de CRM197 / mL. Adicionou-se cianoborohidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeos) e a conjugação prosseguiu por 1 hora. Adicionou-se borohidreto de sódio (2 moles por mole da unidade de repetição de polissacarídeos) após a reação de conjugação. O lote foi diluído em cloreto de sódio a 150 mM com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 ° C. Foi adicionado tampão fosfato de potássio para neutralizar o pH.
[0165] Os conjugados foram então dialisados contra cloreto de sódio a 150 mM com polissorbato 20 a 0,05% (p/v) 20 a aproximadamente 4 ° C usando uma membrana NMWC de 300 kDa. A solução final do conjugado foi dispensada em alíquotas e mantida a 4 ° C. Resultados
[0166] Os resultados são mostrados na Tabela 9. 2% é o limite de detecção. % de Consumo % de Conc. de Conjugado Conjugado Tipo de sal Ps de lisina proteína sal (mM) Mn (kD) Mw (Kd) livre (mol/mol) livre 0 N/A 966 1419 8% 6,5 7%
1 NaCl 1041 1671 10% 8,1 6% 2 NaCl 1318 2113 10% 7,8 5% 5 NaCl 1964 2933 5% 8,8 3% 10 NaCl 2407 3640 8% 9,4 2%
12.5 NaCl 2529 3749 7% 9,6 < 2% 25 NaCl 2657 3772 4% 8,8 4% 50 NaCl 3036 4198 3% 9,5 < 2% 100 NaCl 3031 4249 3% 9,4 < 2% 0 N/A 1012 1339 9% 6,8 7% 1 KCl 1189 1653 9% 7,0 6% 2 KCl 1533 2018 5% 7,5 4% 5 KCl 1862 2474 4% 8,7 3% 10 KCl 2416 3278 6% 9,1 3%
12.5 KCl 2654 3532 4% 9,2 2% 25 KCl 2641 3446 3% 9,6 3% 0 N/A 900 1335 9% 6,3 7% 25 MgCl2 2878 4361 9% 8,2 16% 50 MgCl2 1374 1994 12% 6,6 18% 100 MgCl2 798 1175 29% 4,0 34%
[0167] Para condições de cloreto de sódio e cloreto de potássio, o aumento da concentração de sal durante a conjugação aumentou o tamanho do conjugado e o consumo de lisina e reduziu o Ps livre e o Pr livre. Esses efeitos atingiram um platô de aproximadamente 12,5 mM para ambos os tipos de sal. 25 mM e 50 mM de cloreto de magnésio mostraram um aumento no tamanho do conjugado e no consumo de lisina em comparação com a condição sem sal. No entanto, parece haver um aumento nos níveis de polissacarídeo livre e de proteína livre e menor extensão da conjugação (medida pela perda de lisina e tamanho do conjugado) com o aumento da concentração de cloreto de magnésio de 25 mM para 100 mM. Portanto, pode ser preferido manter o cloreto de magnésio na faixa de concentração de 0-50 mM. EXEMPLO 6: Formulação de conjugados monovalentes
[0168] Os conjugados de polissacarídeo pneumocócico-CRM197 foram preparados como descrito nos exemplos 2-5. O volume requerido de conjugados em lote necessários para obter a concentração alvo de sorotipos individuais foi calculado com base no volume de lote e na concentração das concentrações individuais de polissacarídeos em lote. Os sorotipos individuais (12F, 15A, 16F, 17F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B) foram combinados com excipientes, filtrados estéreis e adicionados ao APA sob condições de mistura. A concentração final de cada vacina conjugada monovalente foi de 4 µg / mL (p/v PnPs) com 20 mM de histidina, de NaCl a 150 mM, 0,2% (p/v) de PS-20 e 0,250 mg / mL (p/v Al) sob a forma de APA. EXEMPLO 7: Estudo de imunogenicidade do coelho branco do Nova Zelândia do conjugado monovalente (15A, 16F, 17F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B)
[0169] A imungenicidade dos conjugados monovalentes foi avaliada em um modelo de coelho branco da Nova Zelândia (NZWR). Coelhos brancos adultos da Nova Zelândia (NZWR, n = 3 / grupo) foram imunizados por via intramuscular (IM) com 0,25 ml da respectiva vacina conjugada monovalente no dia 0 e dia 14 (alternando os lados). A vacina pneumocócica monovalente foi dosada em 1 µg de PnPs (15A, 16F, 17F, 23A, 23B, 24F, 31 ou 35B, cada um conjugado com CRM197) com 62,5 µg de adjuvante de fosfato de alumínio (APA) por imunização. Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós-dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos diariamente por funcionários treinados em cuidados com animais quanto a quaisquer sinais de doença ou inquietação. As formulações de vacina nos NZWRs foram consideradas seguras e bem toleradas. Todos os testes com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do
Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo de teste do NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da Merck & Co., Inc (Kenilworth, NJ) e Covance (Denver, PA).
[0170] Os soros NZWR foram testados em ensaios ELISA para avaliar a imunogenicidade de IgG usando uma concentração de revestimento de PnPs correspondente a 1-2 mg / ml. O anticorpo funcional foi determinado através de testes de opsonofagocitose (OPA) com base em protocolos descritos anteriormente. Vide, por exemplo, Caro-Aguilar et al., 2017, Vaccine 35: 865-72 e Burton et al., 2006, Clin Vaccine Immunol 13 (9): 1004-9.
[0171] Verificou-se que todas as vacinas conjugadas pneumocócicas monovalentes são imunogênicas em coelhos e geram anticorpo funcional que mata a respectiva cepa bacteriana (dados não mostrados). O sorotipo 12F foi considerado imunogênico em camundongos (dados não mostrados).
Claims (47)
1. Um método para reduzir o tamanho de um polissacarídeo de S. pneumoniae do sorotipo 12F, 23A, 24F ou 31, o método compreendendo submeter o polissacarídeo a uma reação de hidrólise ácida para obter um produto de polissacarídeo de tamanho reduzido.
2. O método da reivindicação 1, em que a hidrólise ácida é realizada na presença de pelo menos um ácido.
3. O método da reivindicação 1 ou 2, em que o pH da reação de hidrólise ácida é de 1,0 a 5,0.
4. O método da reivindicação 3, em que o pH é de 2,0 a 4,0.
5. O método da reivindicação 3, em que o pH é de 2,5 a 3,0.
6. O método da reivindicação 2, em que o ácido é ácido acético, ácido clorídrico, ácido fosfórico ou ácido cítrico, ou uma mistura dos mesmos.
7. O método da reivindicação 6, em que o ácido é ácido acético.
8. O método da reivindicação 6, em que a concentração de ácido acético é de 50 a 200 mM ou a concentração de ácido clorídrico é de 1 a 5 mM.
9. O método de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a hidrólise ácida é realizada a uma temperatura de 80 °C a 92 °C.
10. O método de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a reação de polissacarídeo de tamanho reduzido é neutralizada pela adição de fosfato de potássio.
11. O método de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o produto da reação de polissacarídeo de tamanho reduzido está sujeito a filtração estéril e / ou diafiltração.
12. O método de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o produto da reação de polissacarídeo de tamanho reduzido contém polissacarídeos com um peso molecular médio abaixo de 150 kDa.
13. O método para preparar um conjugado polissacarídeo-proteína, o método compreendendo reagir um polissacarídeo em uma primeira solução com uma proteína em uma segunda solução para formar uma terceira solução, na qual a reação de conjugação de polissacarídeo-proteína ocorre para formar o conjugado polissacarídeo-proteína, em que a terceira solução compreende pelo menos 1 mM de sal.
14. O método da reivindicação 13, em que o sal compreende um cátion monovalente ou divalente.
15. O método da reivindicação 14, em que o sal é um sal de sódio, sal de potássio, sal de lítio, sal de magnésio ou sal de cálcio.
16. O método da reivindicação 15, em que o sal é cloreto de sódio.
17. O método da reivindicação 16, em que a concentração de cloreto de sódio na terceira solução é de 1 a 100 mM.
18. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que o sal está presente na primeira solução.
19. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que o sal está presente na segunda solução compreendendo a proteína.
20. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que a primeira solução e a segunda solução são as mesmas.
21. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que o sal é adicionado à terceira solução.
22. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que a terceira solução é uma solução aquosa.
23. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 17, em que a terceira solução contém um solvente aprótico.
24. O método da reivindicação 23, em que o solvente aprótico é DMSO.
25. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 24, em que a reação de conjugação é uma redução de base de Schiff ou uma aminação redutiva.
26. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 25, em que o polissacarídeo é de S. pneumoniae.
27. O método da reivindicação 26, em que o polissacarídeo de S. pneumoniae é do sorotipo 15A, 16F, 17F, 20, 23A, 24F ou 35B.
28. O método de qualquer uma das reivindicações 13 a 27, em que a proteína é toxoide tetânico, toxoide diftérico ou CRM197.
29. O método da reivindicação 28, em que a proteína é CRM197.
30. Um método para liofilizar uma solução compreendendo polissacarídeo, o método compreendendo: a) adicionar um açúcar à solução compreendendo polissacarídeo para obter uma razão de massa de açúcar: polissacarídeo de pelo menos 30; e b) liofilizar a solução compreendendo polissacarídeo.
31. O método da reivindicação 30, em que o açúcar é um açúcar não redutor.
32. O método da reivindicação 30, em que o açúcar é um monossacarídeo ou dissacarídeo.
33. O método da reivindicação 32, em que o açúcar é manitol, sacarose, trealose ou uma combinação dos mesmos.
34. O método de qualquer uma das reivindicações 30 a 33, em que o polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em polissacarídeos meningocócicos, polissacarídeos pneumocócicos, polissacarídeo de Hemophilus influenzae tipo b, polissacarídeo Vi de Salmonnella typhi e polissacarídeos de Streptococcus do grupo B.
35. O método da reivindicação 34, em que o polissacarídeo é um polissacarídeo de S. pneumoniae.
36. O método da reivindicação 35, em que o polissacarídeo de S. pneumoniae não se dissolve sob condições onde a razão de massa de açúcar:polissacarídeo é de 25.
37. O método da reivindicação 35, em que o polissacarídeo de S. pneumoniae é do sorotipo 3, 8 ou 24F.
38. O método de qualquer uma das reivindicações 30 a 37, em que a razão de massa de açúcar: polissacarídeo é de pelo menos 40 ou pelo menos 50.
39. O método de qualquer uma das reivindicações 30 a 38, em que a concentração de açúcar é superior a 5%.
40. O método de qualquer uma das reivindicações 30 a 39, em que a solução compreendendo polissacarídeo compreende adicionalmente uma proteína.
41. O método da reivindicação 40, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em toxoide tetânico, toxoide diftérico e CRM197.
42. O método de qualquer uma das reivindicações 30 a 41, compreendendo adicionalmente a conjugação do polissacarídeo com uma proteína.
43. O método da reivindicação 42, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em toxoide tetânico, toxoide diftérico e CRM197.
44. O método da reivindicação 43, em que a proteína é CRM197.
45. O método de qualquer uma das reivindicações 42 a 44, em que a referida conjugação é por aminação redutiva.
46. O método da reivindicação 45, em que a aminação redutiva é realizada sob condições aquosas.
47. O método da reivindicação 45, em que a aminação redutiva é realizada em dimetilsulfóxido (DMSO).
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