BR112019017560A2

BR112019017560A2 - intensificação da imunogenicidade dos conjugados de polissacarídeo-proteína de streptococcus pneumoniae

Info

Publication number: BR112019017560A2
Application number: BR112019017560A
Authority: BR
Inventors: Lancaster Catherine; ABEYGUNAWARDANA Chitrananda; WEN Emily; Pujar Hari; He Jian; E Macnair John; Michael Williams John; G Joyce Joseph; M Skinner Julie; Musey Luwy; A Winters Michael; Mchugh Patrick; J Smith William
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2020-04-07
Also published as: US20240139303A1; US20210330778A1; RU2019129503A; EP3589314A1; JP2023036953A; US20210330777A1; US11090374B2; MX2023001948A; CA3050120A1; WO2018156491A1; EP3589314A4; MX2023001947A; AU2018225099A1; CN110337307A; RU2019129503A3; MX2019009867A; JP2020514326A; KR20190121330A; US20200054733A1; KR20240011879A

Abstract

a presente invenção fornece composições imunogênicas tendo um ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína em que um ou mais polissacarídeos de cápsulas bacterianas de streptococcus pneumoniae estão conjugados com uma proteína carreadora em um solvente aprótico tal como dimetilsulfóxido (dmso). a presente invenção também fornece métodos para fornecer uma resposta imune intensificada a uma vacina pneumocócica de conjugado de polissacarídeo-proteína compreendendo a administração a um indivíduo humano de uma composição imunogênica compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína preparados em condições de dmso.

Description

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, USOS DE UM POLISSACARÍDEO E DE CONJUGADOS DE POLISSACARÍDEO-PROTEÍNA, MÉTODOS PARA PREPARAR UM CONJUGADO PNEUMOCÓCICO DE POLISSACARÍDEO-PROTEÍNA E PARA DETERMINAR O NÍVEL DE ALDEÍDO EM UM POLISSACARÍDEO ATIVADO

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção fornece composições imunogênicas compreendendo pelo menos um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae conjugado à CRM197 usando aminação redutiva e solvente aprótico tal como dimetilsulfóxido (DMSO). A invenção também fornece métodos para intensificação de imunogenicidade de composições imunogênicas com um ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína em que um ou mais polissacarídeos de cápsulas bacterianas de S. pneumoniae estão conjugados a uma proteína carreadora usando uma aminação redutiva realizada em um solvente aprótico tal como DMSO.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O Streptococcus pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva e a causa mais comum de doença bacteriana invasiva (tal como pneumonia, bacteremia e meningite e otite média) em lactentes e crianças pequenas. O pneumococo é encapsulado com um polissacarídeo quimicamente ligado que confere especificidade ao sorotipo. Existem mais de 90 sorotipos conhecidos de pneumococos, e a cápsula é o principal determinante de virulência para pneumococos, já que a cápsula não apenas protege a superfície interna das bactérias contra o complemento, como também é pouco imunogênica. Os polissacarídeos são antígenos independentes de células T e não podem ser processados ou apresentados em moléculas do MHC para interagir com as células T. Eles podem, no entanto, estimular o sistema imunológico através de um mecanismo alternativo que envolve a ligação cruzada de receptores de

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2/73 superfície em células B.

[003] Crianças com menos de 2 anos de idade não montam uma resposta imunológica à maioria das vacinas de polissacarídeos, por isso, foi necessário tornar os polissacarídeos imunogênicos por conjugação química a uma proteína carreadora. O acoplamento do polissacarídeo, um antígeno independente de células T, a uma proteína, um antígeno dependente de células T, confere ao polissacarídeo as propriedades de dependência de células T incluindo comutação de isotipos, maturação de afinidade e indução de memória.

[004] Existem muitas reações de conjugação que têm sido empregadas para ligar covalentemente polissacarídeos a proteínas. Três dos métodos mais comumente empregados incluem: 1) aminação redutiva, em que o grupo aldeído ou cetona em um componente da reação reage com o grupo amino ou hidrazida no outro componente, e a ligação dupla C=N formada é subsequentemente reduzida a uma ligação simples C-N por um agente redutor; 2) conjugação de cianilação, em que o polissacarídeo ativado ou por brometo de cianogênio (CNBr) ou por tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP) para introduzir um grupo cianato no grupo hidroxila, que forma uma ligação covalente com o grupo amina ou hidrazida após adição do componente proteico; e 3) uma reação de carbodiimida, em que a carbodiimida ativa o grupo carboxila em um componente da reação de conjugação e o grupo carbonila ativado reage com o grupo amina ou hidrazida no outro componente. Estas reações também são frequentemente empregadas para ativar os componentes do conjugado antes da reação de conjugação.

[005] A aminação redutiva tem sido usada para conjugar polissacarídeos de S. pneumoniae. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 8,192,746, a Publicação do Pedido de patente U.S. No. 20170021006 e a Publicação do Pedido de Patente Internacional N^os W02011/110381 e W02015/110941. A aminação redutiva

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3/73 envolve duas etapas: (1) oxidação do antígeno e (2) redução do antígeno e uma proteína carreadora para formar um conjugado. A etapa de redução pode ocorrer em um solvente aquoso ou em um solvente aprótico, tal como DMSO. Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO2016/H3644.

SUMARIO DA INVENÇÃO [006] A presente invenção fornece composições imunogênicas compreendendo polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através da qual o polissacarídeo é conjugado à proteína carreadora está em um solvente aprótico. Em uma modalidade, para composições com sorotipos idênticos, um ou mais dos sorotipos preparados em um solvente aprótico possuem imunogenicidade intensificada quando comparados com o mesmo ou mais sorotipos preparados em condições aquosas.

[007] A presente invenção fornece composições imunogênicas compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína preparados a partir de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína são feitos por um processo que compreende a etapa de conjugar o polissacarídeo à proteína carreadora em um solvente aprótico.

[008] A invenção também fornece métodos de conjugação de um polissacarídeo sorotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F ou

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4/73 de S. pneumoniae a uma proteína carreadora, compreendendo a etapa de conjugar o polissacarídeo à proteína carreadora em um solvente aprótico.

[009] A invenção também fornece métodos de tratamento de um indivíduo com uma composição imunogênica compreendendo um ou mais polissacarídeos dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F ou 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que o polissacarídeo é conjugado à proteína carreadora em um solvente aprótico.

[0010] Em certas modalidades, os polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 11A, 12F e 14 de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico. Em certas modalidades, os polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 2, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico.

[0011] Em certas modalidades, os polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 3 e 18C de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico. Em um aspecto dessa modalidade, os polissacarídeos do sorotipo 3 de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico. Em um aspecto dessa modalidade, os polissacarídeos do sorotipo 18C de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico.

[0012] Em certas modalidades, a reação de conjugação usada para conjugar polissacarídeo à proteína carreadora é a aminação redutiva.

[0013] Em certas modalidades, o solvente aprótico é DMSO.

[0014] Em certas modalidades, a proteína carreadora é CRM197.

[0015] Em certas modalidades, os conjugados preparados em DMSO têm

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5/73 um valor de perda de lisina maior que 5,0. Em um aspecto, os conjugados preparados em DMSO têm um valor de perda de lisina inclusive entre 7,0 e 18,0.

[0016] Em certas modalidades, a composição imunogênica compreende ainda polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 10A, 15B, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através da qual o polissacarídeo é conjugado à proteína carreadora está em um solvente aprótico. Em certos aspectos desta modalidade, a reação de conjugação é aminação redutiva. Em certos aspectos, o solvente aprótico é DMSO. Em certos aspectos, a proteína carreadora é CRM 197. Em um aspecto, a composição imunogênica compreende o polissacarídeo de S. pneumoniae sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F, e 23F conjugado a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através do qual o polissacarídeo dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F ou 23F de S. pneumoniae é conjugado à proteína carreadora em um solvente aprótico. Em certos aspectos, o polissacarídeo é dos sorotipos 18C, 19A, 19F ou 23F de S. pneumoniae.

[0017] Em certas modalidades, a composição imunogênica da invenção compreende ainda polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através da qual o polissacarídeo dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F ou 38 de S. pneumoniae é conjugado à proteína carreadora em um solvente aquoso. Em um aspecto, entre 35-100% dos sorotipos na composição imunogênica são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO

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6/73 e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes são preparados em condições aquosas.

[0018] Em uma modalidade específica, a invenção fornece uma composição imunogênica que consiste essencialmente em polissacarídeos dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae conjugados à proteína carreadora CRM197, em que a reação de conjugação para sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F, e 23F de S. pneumoniae é em condições de DMSO e a reação de conjugação para sorotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F e 33F de S. pneumoniae em um solvente aquoso e, opcionalmente, compreendendo ainda cerca de 0,2% m/v de PS-20.

[0019] A presente invenção também fornece métodos para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo humano, compreendendo a administração de qualquer uma das composições imunogênicas da invenção. Em certas modalidades, o indivíduo tem 50 anos ou mais e/ou é imunocomprometido. Em certas modalidades, o indivíduo tem 2 anos ou menos. Em certas modalidades, o indivíduo é imunocomprometido.

[0020] A invenção também fornece métodos para fornecer uma resposta imune intensificada a uma vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína (PnPs) compreendendo a administração a um indivíduo animal de uma composição imunogênica compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína compreendendo polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae de um primeiro conjunto de dois ou mais sorotipos pneumocócicos conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras, em que os dois ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína do primeiro conjunto são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO. Em uma modalidade, referida resposta imune intensificada é relativa a um animal de controle que recebe uma composição imunogênica em que um ou mais conjugados de

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7/73 polissacarídeo-proteína do primeiro conjunto são preparados usando aminação redutiva em condições aquosas. Em uma modalidade, o animal de controle é um camundongo. Em outra modalidade, o animal de controle é um humano. Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína que compreende conjugados de polissacarídeoproteína adicionais compreendendo polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae de um segundo conjunto dos sorotipos pneumocócicos conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras são preparados usando aminação redutiva sob condições aquosas, em que sorotipos do segundo conjunto são diferentes dos sorotipos no primeiro conjunto.

[0021] Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde os sorotipos pneumocócicos são selecionados a partir dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38.

[0022] Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde são preparados conjugados de polissacarídeo-proteína do sorotipo 3 ou 18C usando aminação redutiva sob condições de DMSO.

[0023] Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde os conjugados de polissacarídeo-proteína do primeiro conjunto dos sorotipos pneumocócicos são selecionados dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F.

[0024] Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde conjugados de polissacarídeo-proteína do primeiro conjunto dos sorotipos pneumocócicos compreendem os sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F, que são preparados

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8/73 usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína de um segundo conjunto dos sorotipos são preparados em condições aquosas.

[0025] Em uma modalidade específica, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde os conjugados de polissacarídeo-proteína dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e conjugados de polissacarídeo-proteína dos sorotipos 1, 3,4, 5, 9V, 14, 22F e 33F são preparados sob condições aquosas.

[0026] Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde conjugados de polissacarídeo-proteína entre 35-100% dos sorotipos são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeoproteína restantes são preparados sob condições aquosas. Em um aspecto, os conjugados de polissacarídeo-proteína entre 45-80% dos sorotipos são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes são preparados em condições aquosas. Em outro aspecto, os conjugados de polissacarídeo-proteína entre 75-100% dos sorotipos são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes são preparados em condições aquosas.

[0027] Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em Complexo de Proteína da Membrana Externa de Neisseria meningitides (OMPC), toxóide de tétano, toxóide de difteria, proteína D e CRM197. Em um aspecto, a proteína carreadora é CRM197.

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9/73 [0028] Em certas modalidades, os métodos empregam vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína onde os conjugados preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO têm uma proporção maior de ligações glicopeptídicas formadas como medido pelo valor de perda de proteína lisina maior que 5,0. Em um aspecto dessa modalidade, os conjugados preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO têm um valor de perda de lisina inclusive entre 7,0 e 18. Em outro aspecto, os conjugados preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO têm um valor de perda de lisina maior que 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5 ou 10,0.

[0029] Em outra modalidade específica, a invenção fornece um método para fornecer uma resposta imune intensificada a uma vacina pneumocócica de conjugados de polissacarídeo-proteína (PnPs) que consiste essencialmente em polissacarídeos dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae conjugados à proteína carreadora CRM197, em que o método compreende administrar a um indivíduo humano uma composição imunogênica compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína de um primeiro conjunto e um segundo conjunto dos sorotipos pneumocócicos, em que o primeiro conjunto dos sorotipos consiste em 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F e são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO, e o segundo conjunto dos sorotipos consiste em 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F e 33F e são preparados sob condições aquosas.

[0030] Em certas modalidades, a resposta imune intensificada em animais vacinados com composições imunogênicas produzidas pelos métodos da invenção é medida por IgG no soro ou Titulação de Média Geométrica de anticorpo opsonofagocítico. Em um aspecto, a resposta imune intensificada para um sorotipo pneumocócico é 10% ou mais em comparação com o conjugado de polissacarídeo-proteína do mesmo sorotipo pneumocócico preparado sob

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10/73 condições aquosas. Em uma modalidade, o animal é um camundongo. Em outra modalidade, o animal é um humano.

[0031] Em certas modalidades, os métodos são usados com um indivíduo humano com 50 anos de idade ou mais. Em certas modalidades, os métodos são usados com um indivíduo humano que tem 2 anos de idade ou menos. Em certas modalidades, os métodos são usados com um indivíduo humano que é imunocomprometido.

[0032] A invenção também fornece os métodos de preparação de um conjugado pneumocócico de polissacarídeo-proteína por aminação redutiva, o método compreendendo:

a) reação de um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae selecionado dos sorotipos 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F com uma quantidade de um oxidante (por exemplo, um periodato) para formar um polissacarídeo com um nível de ativação de 0,05 a 0,22;

b) reagir o polissacarídeo ativado com uma proteína carreadora em um solvente aprótico, opcionalmente na presença de um agente redutor para formar um conjugado de polissacarídeo-proteína;

em que o conjugado tem um valor de perda de lisina inclusive entre 7,0 e 18,0.

[0033] Em certas modalidades, o nível de ativação é de 0,09 a 0,22.

[0034] Em certas modalidades, o oxidante é periodato.

[0035] Em certas modalidades, o nível de ativação é medido pela derivativação de aldeídos no polissacarídeo com tiossemicarbazida.

[0036] Em certas modalidades, o agente redutor é um sal cianoborohidreto, tal como cianoborohidreto de sódio.

[0037] Em certas modalidades, a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em toxóide detétano, toxóide de difteria e CRM197. Em uma

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11/73 modalidade, a proteína carreadora é CRM197.

[0038] A presente invenção também fornece um método quantitativo para determinar o nível de aldeído (isto é, o nível de ativação de periodato) em um polissacarídeo ativado compreendendo as etapas de:

a) derivar o polissacarídeo ativado para formar um polissacarídeo derivado, reagindo com um agente de derivativação até a conclusão (ou seja, os platôs de reação);

b) isolar o polissacarídeo derivado por cromatografia de exclusão de tamanho de alta esficiência (para remover o agente de derivativação não reagido e os componentes da matriz);

c) quantificar a absorbância UV do polissacarídeo derivado.

[0039] O agente de derivativação pode ser selecionado do grupo que consiste em tiossemicarbazida, análogos estruturais de tiossemicarbazida, hidrazidas, hidrazina, semicarbazida, análogos estruturais de semicarbazida, compostos amino-óxi ou aminas aromáticas.

[0040] Em uma modalidade, a quantificação na etapa c) é por comparação com um padrão derivado. Em uma modalidade, a quantificação na etapa c) é medida com base no coeficiente de extinção predeterminado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0041] Figura 1. Extensão da conjugação em diferentes locais de lisina em CRM197 como determinado por mapeamento de peptídeo tríptico. Os conjugados do sorotipo 19A PS-CRM197, preparados por aminação redutiva em solução aquosa ou DMSO, foram digeridos por tripsina e analisados por LC-UVMS. A perda de sinal de peptídeo em comparação com as amostras de controle de CRM 197 foi representada contra os locais de conjugação.

[0042] Figura 2. A imunogenicidade eletroquimioluminescente (ECL) resulta de braços de estudo de camundongos comparando os conjugados do

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12/73 sorotipo 3 Ps-CRMi97 preparados por aminação redutiva em solução aquosa ou DMSO. Conjugados formulados com adjuvante de fosfato de alumínio (APA). São mostrados os resultados pré-vacinação (Pré) e pós-dose 3 (PD3). Os resultados para o controle somente com APA também são mostrados.

[0043] Figura 3. A atividade opsofagocítica da pós-dose 3 (OPA) resulta de braços de estudo de camundongos comparando os conjugados do sorotipo 3 PsCRM 197 preparados por aminação redutiva em solução aquosa ou DMSO. Resultados pré-vacinação de OPA (pré-imune) e para controle apenas com APA também são mostrados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0044] A presente invenção fornece composições imunogênicas compreendendo conjugados pneumocócicos de polissacarídeo-proteína, em que os conjugados de pelo menos um sorotipo pneumocócico são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico tal como DMSO. A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta de que o uso de DMSO como solvente durante a aminação redutiva de conjugados de polissacarídeo-proteína resulta na estabilidade inesperadamente superior e imunogenicidade intensificada para aqueles sorotipos relativos aos mesmos conjugados preparados sob condições aquosas. A presente invenção se refere às vantagens do solvente DMSO no aumento das associações covalentes do polissacarídeo à proteína através do consumo direto de resíduos de lisina na superfície da proteína carreadora. Para a maioria dos sorotipos testados, uma perda de lisina que forneceu uma boa imunogenicidade (> 7,0) poderia ser alcançada com um nível de ativação mais baixo de polissacarídeo (0,05 a 0,22) através de conjugação em um solvente aprótico do que em um tampão aquoso. A associação covalente intensificada tem um benefício direto para aumentar a estabilidade do conjugado de proteína e polissacarídeo e para aumentar a

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13/73 resposta imune a aqueles antígenos de polissacarídeos particulares conjugados em DMSO.

[0045] Sem se ater à qualquer teoria, um mecanismo possível para a imunogenicidade intensificada observada com glicoconjugados preparados em DMSO inclui um número aumentado de ligações entre o carboidrato (polissacarídeo capsular) e resíduos de lisina na superfície da proteína carreadora que resultariam em pontos de ligação adicionais entre a proteína e o polissacarídeo para conferir estabilidade e contra despolimerização química ou quebra da ligação da peptídeo-carboidrato. Ver, por exemplo, Characterization of Saccharide-CRMi97 Conjugate Vaccines in Brown F, Corbel M, Griffiths E (eds): Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines. Dev. Biol. Basel, Karger, 2000, vol 103, pp. 93-104. Um benefício adicional das ligações de polissacarídeo-proteína intensificadas que são criadas durante a conjugação no solvente de DMSO podem ser oportunidades adicionais para a apresentação bem sucedida de peptídeo-carboidrato a células-T. Pode ser apreciado que, devido à variabilidade genética na população humana, resultando em capacidades variadas e sensibilidade de carga ou associação com sequências de peptídeos específicas conjugadas com antígenos de carboidratos, que pontos adicionais de ligação na proteína carreadora permitiríam maiores probabilidades de sucesso da apresentação do antígeno na superfície de uma APC para permitir uma resposta dependente de células T a um antígeno independente de células T. Outro possível mecanismo de imunogenicidade intensificada observado por conjugação no solvente de DMSO pode ser devido à desnaturação de CRM197 em solvente orgânico, que expõe lisinas adicionais para ligações de polissacarídeos dando chances intensificadas para apresentação de glicopeptídeos na superfície de uma APC para respostas dependentes de células T a diferentes epítopos de peptídeos. Ver Avci et al., 2011, Nature Medicine 1T. 1602-1610.

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14/73 [0046] Ainda outro benefício da conjugação em um solvente orgânico gerando CRM197 desnaturada nos conjugados poderia ser a redução da interferência imunológica de anticorpos contra epítopos de CRM197 nativos. Um benefício adicional das ligações intensificadas de polissacarídeo-proteína que são criadas durante a conjugação no solvente de DMSO pode ser a formação de conjugados de polissacarídeo-proteína de tamanho maior resultando em imunogenicidade intensificada. Acredita-se que as composições da invenção fornecem vantagens significativas em induzir uma resposta humana.

[0047] Como mostrado no Exemplo 5, um conjugado de polissacarídeoproteína preparado a partir do sorotipo 3 de S. pneumoniae usando aminação redutiva em DMSO mostrou imunogenicidade intensificada (comparado ao mesmo conjugado preparado usando aminação redutiva em água) em um modelo de camundongo medido por atividade opsofagocítica (OPA). Além disso, como mostrado no Exemplo 6, uma vacina conjugada pneumocócica 15-valente tendo sete sorotipos preparados usando aminação redutiva em DMSO (e os outros oito preparados em um solvente aquoso) tenderam a mostrar imunogenicidade superior em humanos (com 4 sorotipos superiores com significância) para todos os sete sorotipos preparados em DMSO em comparação com o correspondente PCV 15-valente onde todos os 15 sorotipos foram preparados em um solvente aquoso.

[0048] Como mostrado no Exemplo 4, representando graficamente a diminuição do sinal de peptídeo para locais de lisina na proteína CRM197 em conjugados do sorotipo 19A contra possíveis locais de conjugação (comparados com um controle de CRM197) descobertos locais de conjugação adicionais localizados em epítopos de peptídeo de células T humanas comuns previamente identificadas (Ver Raju et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25: 3207-3214, localizado no peptídeo 411-430 e peptídeo 431-450 da sequência de CRM197).

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Consequentemente, em certas modalidades, a presente invenção também é dirigida a composições imunogênicas compreendendo um ou mais conjugados polissacarídeo-CRMi97, em que pelo menos um dos conjugados de polissacarídeo-CRMi97 é preparado em um solvente aprótico e em que um conjugado preparado em um solvente aprótico demonstra uma maior acessibilidade dos resíduos de lisinas nos aminoácidos 411 a 430 ou 431 a 450 da CRM197 em comparação com o mesmo conjugado preparado em um solvente aquoso. Em certas modalidades, a presente invenção também é dirigida a composições imunogênicas compreendendo um ou mais conjugados de polissacarídeo-CRMi97, em que pelo menos um dos conjugados de polissacarídeo-CRMi97 é preparado em um solvente aprótico e em que um ou mais resíduos de lisina dos aminoácidos 411 a 430 ou 431 a 450 da CRM197 em um conjugado preparado em um solvente aprótico são conjugados mais do que 10%. Em certas modalidades, a presente invenção é direcionada a métodos para aumentar a acessibilidade de resíduos de lisina dentro da CRM197, particularmente nos aminoácidos 411 a 430 ou 431 a 450 da CRM197, compreendendo a conjugação de um polissacarídeo à CRM197 em um solvente aprótico. Em certos aspectos desta modalidade, um ou mais resíduos de lisina nos aminoácidos 411 a 430 ou 431 a 450 da CRM197, em um conjugado preparado em um solvente aprótico, são conjugados com mais de 10%. Nestas modalidades, o polissacarídeo pode ser de qualquer organismo adequado para preparar uma composição imunogênica. Em certos aspectos, o polissacarídeo é de N. meningitides ou S. pneumoniae. O polissacarídeo pode ser de qualquer sorotipo desses organismos.

[0049] Como usado na presente invenção, os termos solvente aquoso ou condições aquosas quando usados com conjugação, tal como aminação redutiva, se referem ao uso de água como solvente para a reação de conjugação.

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A água pode conter tampões e outros componentes, exceto que não há solvente orgânico presente.

[0050] Como usado na presente invenção, os termos solvente aprótico, quando usados com conjugação, tal como aminação redutiva, se referem ao uso de um solvente polar aprótico, ou uma combinação de solventes polares apróticos, como o solvente para a reação de conjugação. Exemplos de solventes polares apróticos incluem, mas não se limitam a, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) e hexametilfosforamida (HMPA). O solvente aprótico pode ter alguma água presente, por exemplo, até 1%, 2%, 5%, 10% ou 20%.

[0051] Como usado na presente invenção, solvente de DMSO e condições de DMSO são usados de forma intercambiável.

[0052] Como usado na presente invenção, o termo compreende quando usado com a composição imunogênica da invenção se refere à inclusão de quaisquer outros componentes (sujeito a limitações de consistindo em linguagem para a mistura de antígeno), tais como adjuvantes e excipientes. O termo consistindo em quando usado com a mistura de conjugados de polissacarídeo-proteína multivalente se refere a uma mistura possuindo aqueles conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae particulares e não outros conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae de um sorotipo diferente.

[0053] Como usado na presente invenção, perda de lisina se refere ao consumo de lisina durante a conjugação e é determinado pela diferença entre a quantidade média medida de lisina no conjugado e a quantidade esperada de lisina na proteína de partida. O exemplo 4 descreve um método para determinar perda de lisina.

[0054] Como usado na presente invenção, o termo polissacarídeo pretende incluir qualquer elemento de sacarídeo antigênico (ou unidade

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17/73 antigênica) comumente usado nas técnicas de vacinas imunológicas e bacterianas, incluindo, mas não limitado a, um sacarídeo, um oligossacarídeo, um polissacarídeo, um lipossacarídeo, um lipooligossacarídeo (LOS), um lipopolissacarídeo (LPS), um glicosilato, um glicoconjugado e semelhantes.

[0055] Quando se refere a percentagens dos sorotipos na composição imunogênica a ser preparada em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes sendo preparados sob condições aquosas, pretende-se referir simplesmente o número dos sorotipos preparados em um solvente aprótico dividido pelo número total dos sorotipos na composição.

[0056] Como usado na presente invenção, todas as faixas, por exemplo, pH, temperatura e concentrações, devem ser inclusivas. Por exemplo, uma faixa de pH de 5,0 a 9,0 deve incluir um pH de 5,0 e um pH de 9,0. Da mesma forma, uma faixa de temperatura de 4 a 25°C deve incluir os limites externos da faixa, ou seja, 4°C e 25°C.

Polissacarídeo [0057] Os polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae que podem ser preparados de acordo com os métodos da invenção, isto é aminação redutiva em um solvente aprótico, incluem, mas não se limitam a, sorotipos: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38. Os polissacarídeos podem ser usados na forma de oligossacarídeos. Estes são convenientemente formados por fragmentação do polissacarídeo purificado (por exemplo, por hidrólise), que será geralmente seguido por purificação dos fragmentos do tamanho desejado.

[0058] Em certas modalidades, um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6C,

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6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F e 38 são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certos aspectos, polissacarídeos pneumocócicos de um ou mais dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 11A, 12F e 14 são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certos aspectos, os polissacarídeos pneumocócicos de um ou mais dos sorotipos 2, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 19F, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F e 38 são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certos aspectos, os polissacarídeos pneumocócicos de um ou ambos os sorotipos 3 ou 18C são conjugados a uma proteína carreadora usando aminação redutiva em um solvente aprótico. Os polissacarídeos dos outros sorotipos em uma composição multivalente podem ser conjugados usando aminação redutiva em um solvente aprótico ou em um solvente aquoso. Os polissacarídeos dos outros sorotipos em uma composição multivalente podem também ser conjugados usando outras químicas que podem estar em um solvente aprótico ou em um solvente aquoso.

[0059] Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae podem ser preparados por técnicas convencionais conhecidas dos técnicos no assunto. Por exemplo, os polissacarídeos podem ser isolados a partir de bactérias e podem ser dimensionados até certo ponto por métodos conhecidos (ver, por exemplo, Patentes Européias N^os. EP497524 e EP497525); e de preferência por microfluidização realizada usando um homogeneizador ou por hidrólise química. Em uma modalidade, cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico é cultivado em meio à base de soja. Os polissacarídeos individuais são então purificados através de etapas padrão, incluindo centrifugação, precipitação e ultrafiltração. Ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente US 2008/0286838 e a patente U.S. No. 5,847,112. Os polissacarídeos podem ser dimensionados de

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19/73 modo a reduzir a viscosidade em amostras de polissacarídeos e/ou a melhorar a capacidade de filtração para produtos conjugados usando técnicas tais como dimensionamento mecânico ou químico. A hidrólise química pode ser conduzida usando ácido acético. O dimensionamento mecânico pode ser realizado usando corte de Homogeneização de Alta Pressão.

[0060] Em algumas modalidades, os polissacarídeos purificados antes da conjugação têm um peso molecular entre 5 kDa e 4.000 kDa. O peso molecular pode ser calculado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) combinada com detector de dispersão de luz multiangular (MALS) e detector de índice de refração (RI). Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 10 kDa e 4000 kDa; entre 50 kDa e 4.000 kDa; entre 50 kDa e

3.000 kDa; entre 50 kDa e 2.000 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDae

1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 100 kDae

4.000 kDa; entre 100 kDa e 3.000 kDa; 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDae

1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 100 e 400 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa.

[0061] Os polissacarídeos purificados podem ser quimicamente ativados para fazer os sacarídeos capazes de reagir com a proteína carreadora. Os polissacarídeos purificados podem ser conectados a um ligante. Uma vez ativado ou ligado a um ligante, cada polissacarídeo capsular é conjugado separadamente com uma proteína carreadora para formar um glicoconjugado. Os conjugados polissacarídicos podem ser preparados por técnicas de acoplamento conhecidas.

[0062] O polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante para formar um intermediário ligante-polissacarídeo no qual o terminal livre do ligante é um grupo éster. O ligante é, portanto, um em que pelo menos um terminal é um

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20/73 grupo éster. O outro terminal é selecionado de modo a poder reagir com o polissacarídeo para formar o intermediário ligante-polissacarídeo.

[0063] O polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante usando um grupo amina primária no polissacarídeo. Neste caso, o ligante tipicamente possui um grupo éster em ambos os terminais. Isto permite que o acoplamento ocorra reagindo um dos grupos éster com o grupo amina primária no polissacarídeo por substituição acila nucleofílica. A reação resulta em um intermediário ligantepolissacarídeo no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante através de uma ligação amida. O ligante é, portanto, um ligante bifuncional que fornece um primeiro grupo éster para reagir com o grupo amina primária no polissacarídeo e um segundo grupo éster para reagir com o grupo de amina primária na molécula carreadora. Um ligante típico é o diéster de N-hidróxissuccinimida do ácido adípico (SIDEA).

[0064] O acoplamento também pode ocorrer indiretamente, isto é, com um ligante adicional que é usado para derivar o polissacarídeo antes do acoplamento ao ligante.

[0065] O polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional usando um grupo carbonila no terminal redutor do polissacarídeo. Este acoplamento compreende duas etapas: (al) reagir o grupo carbonila com o ligante adicional; e (a2) reagir o terminal livre do ligante adicional com o ligante. Nestas modalidades, o ligante adicional tem tipicamente um grupo amina primária em ambos os terminais, permitindo assim que a etapa (al) ocorra reagindo um dos grupos amina primária com o grupo carbonila no polissacarídeo por aminação redutiva. Utilizase um grupo de amina primária que reage com o grupo carbonila no polissacarídeo. Grupos hidrazida ou hidroxilamino são adequados. O mesmo grupo de amina primária está tipicamente presente em ambos os terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário ligante-polissacarídeo

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21/73 no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante através de uma ligação C—N.

[0066] O polissacarídeo pode ser acoplado ao ligante adicional usando um grupo diferente no polissacarídeo, particularmente um grupo carboxila. Este acoplamento compreende duas etapas: (al) reagir o grupo com o ligante adicional; e (a2) reagir o terminal livre do ligante adicional com o ligante. Neste caso, o ligante adicional tem tipicamente um grupo amina primária em ambos os terminais, permitindo assim que a etapa (al) ocorra reagindo um dos grupos de amina primária com o grupo carboxila no polissacarídeo por ativação de EDAC. Utiliza-se um grupo amina primária que é reativa com o grupo carboxila ativado por EDAC no polissacarídeo. Um grupo hidrazida é adequado. O mesmo grupo de amina primária está tipicamente presente em ambos os terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário ligante-polissacarídeo no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante através de uma ligação amida.

[0067] Em uma modalidade, a ativação química dos polissacarídeos e conjugação subsequente à proteína carreadora por aminação redutiva pode ser alcançada por meios descritos nas Pat. U.S.4,365,170, 4,673,574 e 4,902,506, Publicações do Pedido de Patente U.S. N^os. 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 e 2007/0184071 e Publicações do Pedido de Patente Internacional N^os. W02006/110381, W02008/079653 e W02008/143709). A química pode implicar a ativação de polissacarídeo pneumocócico por reação com qualquer agente oxidante que oxide um grupo hidroxila terminal em um aldeído, tal como periodato (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio ou ácido periódico). A reação leva a uma divagem oxidativa aleatória de grupos hidroxila vicinais dos carboidratos com a formação de grupos aldeídos reativos.

[0068] Em uma modalidade, o polissacarídeo reage com 0,01 a 10,0, 0,05 a 5,0, 0,1 a 1,0, 0,5 a 1,0, 0,7 a 0,8, 0,05 a 0,5, 0,1 a 0,3 equivalentes molares de agente oxidante. Em uma modalidade, o polissacarídeo reage com cerca de 0,1,

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0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 equivalentes molares de agente oxidante. É geralmente preferencial utilizar quantidades menores de periodato para ativação, por exemplo, 0,1 a 0,3 Meq, de modo a conseguir uma ativação de polissacarídeo limitada (por exemplo, 0,05 a 0,22 ou 0,09 a 0,22 moles de aldeído/mole da unidade de repetição do polissacarídeo). Como usado na presente invenção, nível de ativação se refere a moles de aldeído/mole de unidade de repetição de polissacarídeos. Menos ativação de polissacarídeo resulta em um polissacarídeo mais nativo como, ou seja, menos grupos hidroxila são convertidos em aldeídos.

[0069] Em outra modalidade, a duração da reação de oxidação é entre 1 hora e 50 horas, entre 10 horas e 30 horas, entre 15 horas e 20 horas, entre 15 horas e 17 horas ou cerca de 16 horas.

[0070] Em outra modalidade, a temperatura da reação de oxidação mantida entre 15°C e 45°C, entre 15°C e 30°C, entre 20°C e 25°C. Em outra modalidade, a temperatura da reação mantida a cerca de 23°C.

[0071] O acoplamento à proteína carreadora é por aminação redutiva via aminação direta aos grupos lisila da proteína. Por exemplo, a conjugação é realizada reagindo uma mistura do polissacarídeo ativado e proteína carreadora com um agente redutor tal como cianoborohidreto de sódio na presença de níquel. A reação de conjugação pode ocorrer sob solução aquosa ou na presença de dimetilsulfóxido (DMSO). Ver, por exemplo, as Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. US2015/0231270 e US2011/0195086 e Patente Européia No. EP 0471 177 Bl. Os aldeídos que não reagiram são então tapados com a adição de um agente redutor forte, tal como borohidreto de sódio.

[0072] A aminação redutiva envolve duas etapas, (1) oxidação do polissacarídeo para formar aldeídos reativos, e (2) redução da imina (base de Schiff) formada entre polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para

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23/73 formar uma ligação conjugada de amina estável. Antes da oxidação, o polissacarídeo é opcionalmente reduzido em tamanho. Os métodos mecânicos (por exemplo, homogeneização) ou hidrólise química podem ser empregados. A hidrólise química pode ser conduzida usando ácido acético. A etapa de oxidação pode envolver reação com periodato. Para o propósito da presente invenção, o termo periodato inclui ácido periodato e periódico; o termo também inclui metaperiodato (IO4 ) e ortoperiodato (IOg) e inclui os vários sais de periodato (por exemplo, periodato de sódio e periodato de potássio). Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de metaperiodato, de preferência na presença de periodato de sódio (NalCh). Em outra modalidade, o polissacarídeo capsular oxidado na presença de ortoperiodato, de preferência na presença de ácido periódico.

[0073] Em uma modalidade, o agente oxidante é um composto radical nitroxila ou nitróxido estável, tal como compostos piperidina-N-óxi ou pirrolidina-N-óxi, na presença de um oxidante para oxidar seletivamente hidroxilas primárias (como descrito em WO 2014/097099). Na referida reação, o oxidante real é o sal de N-oxoamônio, em um ciclo catalítico. Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxila ou nitróxido estável são compostos de piperidina-N-óxi ou pirrolidina-N-óxi. Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxila ou nitróxido estável possui uma porção TEMPO (2,2,6,6tetrametil-l-piperidinilóxi) ou PROXILA (2,2,5,5-tetrametil-l-pirrolidinilóxi). Em um aspecto, o dito composto radical de nitroxila estável é TEMPO ou um derivado do mesmo. Em um aspecto, o dito oxidante é uma molécula que tem uma porção N-halo. Em um aspecto, o referido oxidante é selecionado do grupo que consiste em N-clorosuccinimida, N-Bromossuccinimida, N-iodossuccinimida, Ácido dicloroisocianúrico, l,3,5-tricloro-l,3,5-triazinano-2,4,6-triona, ácido dibromoisocianúrico, l,3,5-tribromo-l,3,5-triazinano-2,4,6-triona, ácido

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24/73 diiodoisocianúrico e l,3,5-triiodo-l,3,5-triazinano-2,4,6-triona.

[0074] Em certos aspectos, o agente oxidante é o radical livre 2,2,6,6tetrametil-l-piperidinilóxi (TEMPO) e a N-clorosuccinimida (NCS) como cooxidante (como descrito na Publicação do Pedido de Patente Internacional No. W02014/097099). Portanto, em um aspecto, os glicoconjugados de S. pneumoniae são obtidos por um método que compreende as etapas de: a) reagir um sacarídeo com 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidinilóxi (TEMPO) e Nclorossuccinimida (NCS) em um solvente aquoso para produzir um sacarídeo ativado; e b) reagir o sacarídeo ativado com uma proteína carreadora compreendendo um ou mais grupos amina (o referido modo designado por aminação redutiva de TEMPO/NCS depois disso).

[0075] Opcionalmente a reação de oxidação é extinta por adição de um agente de extinção. O agente de extinção pode ser selecionado de dióis vicinais, 1,2-aminoálcoois, aminoácidos, glutationa, sulfito, bissulfato, ditionita, metabissulfito, tiossulfato, fosfitos, hipofosfitos ou ácido fosforoso (como glicerol, etilenoglicol, propan-l,2-diol, butan-l,2-diol ou butan-2,3-diol, ácido ascórbico).

[0076] A segunda etapa do processo de conjugação é a redução da ligação de imina (base de Schiff) entre polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação conjugada estável (chamada aminação redutiva), usando um agente redutor. Os agentes redutores que são adequados incluem os cianoborohidretos (tais como cianoborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio). Em uma modalidade, o agente redutor é cianoborohidreto de sódio.

[0077] Em certas modalidades dos métodos da invenção, a reação de aminação redutiva é realizada em um solvente aprótico (ou em uma mistura de solventes apróticos). Em uma modalidade, a reação de redução é realizada em solvente DMSO ou DMF (dimetilformamida). O solvente DMSO ou DMF pode ser

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25/73 usado para reconstituir o polissacarídeo e proteína carreadora, se liofilizado. Em uma modalidade, o solvente aprótico é DMSO.

[0078] No final da reação de redução, podem existir grupos aldeído que não reagiram nos conjugados, que podem ser protegidos usando um agente de proteção adequado. Em uma modalidade, este agente de proteção é o borohidreto de sódio (NaBHzi). Alternativas adequadas incluem triacetoxiborohidreto de sódio ou borohidreto de sódio ou zinco na presença de ácidos de Bronsted ou de Lewis, amina boranos tais como piridina-borano, 2picolina-borano, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina-borano, t-BuMe'PrN-Bhh, benzilamina-BHs ou 5-etil-2-metilpiridina-borano (PEMB) ou resina de troca de borohidreto. Após a conjugação (a reação de redução e opcionalmente a proteção), os glicoconjugados podem ser purificados (enriquecidos em relação à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas conhecidas dos técnicos no assunto. Estas técnicas incluem diálise, operações de concentração/diafiltração, filtração de fluxo tangencial, precipitação/eluição, cromatografia em coluna (cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca iônica multimodal, DEAE ou cromatografia de interação hidrofóbica) e filtração em profundidade. Em uma modalidade, os glicoconjugados são purificados por diafilitração ou cromatografia de troca iônica ou cromatografia de exclusão de tamanho.

[0079] Os glicoconjugados preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico são geralmente usados em vacinas conjugadas pneumocócicas multivalentes. Assim, em certas modalidades para composições multivalentes em que nem todos os sorotipos são preparados em um solvente aprótico, a reação de redução para os sorotipos restantes é realizada em solvente aquoso (por exemplo, selecionado de PBS (solução salina tamponada com fosfato), MES (Ácido 2-(/V-morfolino)etanossulfônico), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-l

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26/73 piperazinoetanossulfônico), Bis-tris, ADA (ácido N-(2acetamido)iminodiacético), PIPES (acido piperazina-N,N'-bis(2etanossulfônico)), MOPSO (ácido 3-morfolino-2-hidróxipropanossulfônico), BES (ácido N,N-bis(2-hidróxietil)-2-aminoetanossulfônico), MOPS (ácido 3-(Nmorfolino)propanossulfônico), DIPSO (ácido 3-bis(2-hidróxietil)amino-2hidróxipropano-l-sulfônico), MOBS (ácido 4-(N-morfolino)butanossulfônico), HEPPSO (ácido N-(2-Hidróxietil)piperazina-N-(2-hidróxipropanossulfônico)), POPSO (ácido piperazina-l,4-bis(2-hidróxi-3-propanossulfônico)), TEA (trietanolamina), EPPS (ácido 4-(2-hidróxietil)piperazina-l-propanossulfônico), Bicina ou HEPB, a um pH entre 6,0 e 8,5, 7,0 e 8,0, ou 7,0 e 7,5).

[0080] Em algumas modalidades, os glicoconjugados da presente invenção compreendem um polissacarídeo com um peso molecular entre 10 kDa e 10.000 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 25 kDa e 5.000 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 1.000 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 70 kDa e 900 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 100 kDa e 800 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 200 kDa e 600 kDa. Ainda em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de 100 kDa a 1.000 kDa; 100 kDa a 900 kDa; 100 kDa a 800 kDa; 100 kDa a 700 kDa; 100 kDa a 600 kDa; 100 kDa a 500 kDa; 100 kDa a 400 kDa; 100 kDa a 300 kDa; 150 kDa a 1.000 kDa; 150 kDa a 900 kDa; 150 kDa a 800 kDa; 150 kDa a 700 kDa; 150 kDa a 600 kDa; 150 kDa a 500 kDa; 150 kDa a 400 kDa; 150 kDa a 300 kDa; 200 kDa a 1.000 kDa; 200 kDa a 900 kDa; 200 kDa a 800 kDa; 200 kDa a 700 kDa; 200 kDa a 600 kDa; 200 kDa a 500 kDa; 200 kDa a 400 kDa; 200 kDa a 300; 250 kDa a 1.000 kDa; 250 kDa a 900 kDa; 250 kDa a 800 kDa; 250 kDa a 700 kDa; 250 kDa a 600 kDa; 250 kDa a 500 kDa; 250 kDa a 400 kDa; 250 kDa a

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350 kDa; 300 kDa a 1.000 kDa; 300 kDa a 900 kDa; 300 kDa a 800 kDa; 300 kDa a 700 kDa; 300 kDa a 600 kDa; 300 kDa a 500 kDa; 300 kDa a 400 kDa; 400 kDa a 1.000 kDa; 400 kDa a 900 kDa; 400 kDa a 800 kDa; 400 kDa a 700 kDa; 400 kDa a 600 kDa; 500 kDa a 600 kDa.

[0081] Em algumas modalidades, os glicoconjugados da presente invenção têm um peso molecular entre 1.000 kDa e 10.000 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 1.000 kDa e 7.000 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 1.000 kDa e 6.000 kDa.

[0082] Em certas modalidades, a reação de conjugação é realizada por aminação redutiva em que o níquel é usado para maior eficiência de reação de conjugação e para auxiliar na remoção de cianeto livre. Os metais de transição são complexos estáveis com cianeto conhecidos e são conhecidos por melhorar a metilação redutiva de grupos amino de proteína e formaldeído com cianoborohidreto de sódio (S Gidley etal., BiochemJ. 1982, 203: 331-334; Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190). Ao complexar o cianeto inibitório residual, a adição de níquel aumenta o consumo de proteína durante a conjugação e leva à formação de conjugados maiores, potencialmente mais imunogênicos.

[0083] As diferenças nos níveis de cianeto de partida nos lotes reagentes de cianoborohidreto de sódio também levam a um desempenho de conjugação inconsistente, resultando em atributos variáveis do produto, como o tamanho do conjugado e a razão do conjugado Ps-to-CRMi97. A adição de níquel reduziu a inconsistência da conjugação pela complexação do cianeto, eliminando as diferenças nos lotes de cianoborohidreto de sódio.

[0084] As químicas alternativas adequadas incluem a ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP) para formar

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28/73 um éster de cianato. 0 sacarídeo ativado pode assim ser acoplado diretamente ou através de um grupo espaçador (ligante) a um grupo amina na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para fornecer um polissacarídeo tiolado que pode ser acoplado ao carreador através de uma ligação tioéter obtida após reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo usando GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo usando iodoacetimida [por exemplo, iodoacetimida de HCI etílico] ou bromoacetato de /V-succinimidila ou SIAB, ou SIA, ou SBAP). Por exemplo, o éster cianato (opcionalmente produzido pela química CDAP) é acoplado a hexanodiamina ou di-hidrazida de ácido adípico (ADH) e o sacarídeo derivado de amino é conjugado à proteína carreadora usando química carbodiimida (por exemplo, EDAC ou EDC) via um grupo carboxila no transportador de proteína. Tais conjugados são descritos nas Publicações do Pedido de Patente Internacional N^os. WO 93/15760, WO 95/08348 e WO 96/29094; e Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40: 245-256.

[0085] Outras técnicas adequadas utilizam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muitos são descritos na publicação do pedido de patente internacional n ° WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligante carbonila que pode ser formado por reação de um grupo de hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Ver Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218: 509-18) seguido por reação de uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isto pode envolver a redução do terminal anomérico a um grupo de hidroxila primária, proteção/desproteção opcional do grupo de hidroxila primária, reação do grupo de hidroxila primária com CDI para formar um intermediário CDI-carbamato e acoplamento do intermediário CDIcarbamato com um grupo amina em uma proteína.

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29/73 [0086] Após conjugação do polissacarídeo capsular à proteína carreadora, os conjugados de polissacarídeo-proteína são purificados (enriquecidos em relação à quantidade de conjugados de polissacarídeo-proteína) por uma ou mais de uma variedade de técnicas. Exemplos destas técnicas são bem conhecidos do técnico no assunto e incluem operações de concentração/diafiltração, ultrafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna e filtração em profundidade. Ver, por exemplo, Patente US n°. 6,146,902.

[0087] Outra maneira de caracterizar os glicoconjugados da invenção é pelo número de resíduos de lisina na proteína carreadora (por exemplo, CRM197) que se conjugam ao sacarídeo que pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas (grau de conjugação). A evidência para modificação de lisina da proteína carreadora, devido a ligações covalentes aos polissacarídeos, pode ser obtida por análise de aminoácidos usando métodos de rotina conhecidos dos técnicos no assunto. A conjugação resulta em uma redução no número de resíduos de lisina recuperados, em comparação com o material de partida de proteína carreadora usado para gerar os materiais conjugados. Em uma modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é entre 2 e 18, entre 2 e 13, entre 2 e 10, entre 2 e 8, entre 2 e 6, entre 2 e 5, entre 2 e 4, entre 3 e 15, entre 3 e 13, entre 3 e 10, entre 3 e 8, entre 3 e 6, entre 3 e 5, entre 3 e 4, entre 5 e 18, entre 5 e 13, entre 7 e 18, entre 7 e 13, entre 8 e 18, entre 8 e 13, entre 10 e 18 ou entre 10 e 13. Em uma modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 14 ou cerca de 15. Em uma modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é entre 7 e 18. Em algumas dessas modalidades, a proteína carreadora é CRM197.

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30/73 [0088] Os glicoconjugados da invenção podem também ser caracterizados pela razão (massa/massa) de sacarídeo para proteína carreadora. Em algumas modalidades, a razão de polissacarídeo para proteína carreadora no glicoconjugado (m/m) está entre 0,5 e 3,0 (por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de

1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de

1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de

2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9 ou cerca de 3,0). Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (m/m) situa-se entre 0,5 e 2,0, entre 0,5 e 1,5, entre 0,8 e 1,2, entre 0,5 e 1,0, entre 1,0 e 1,5 ou entre 1,0 e 2,0. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (m/m) está entre 0,8 e 1,2. Em uma modalidade, a razão de polissacarídeo capsular para proteína carreadora no conjugado está entre 0,9 e 1,1. Em algumas dessas modalidades, a proteína carreadora é CRM197. Os glicoconjugados e composições imunogênicas da invenção podem conter sacarídeo livre que não é covalentemente conjugado à proteína carreadora, mas está, no entanto, presente na composição de glicoconjugados. O sacarídeo livre pode estar associado de forma não covalente (isto é, ligado não covalentemente a, adsorvido a, ou aprisionado em ou com) o glicoconjugado.

[0089] Em uma modalidade, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ou 15% de polissacarídeo livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 25% de polissacarídeo livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 20% de polissacarídeo livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 15% de polissacarídeo livre

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31/73 comparado com a quantidade total de polissacarideo.

Vacinas de conjugados de polissacarideo-proteina multivalentes [0090] As composições imunogênicas pneumocócicas multivalentes podem compreender polissacarídeos capsulares do sorotipo de S. pneumoniae selecionados de pelo menos um de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A. 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 conjugados com uma ou mais proteínas carreadoras, em que um polissacarideo de pelo menos um sorotipo preparado usando aminação redutiva em um solvente aprótico, tal como DMSO. A presente invenção contempla composições imunogênicas pneumocócicas multivalentes com polissacarídeos de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 sorotipos. De preferência, os sacarídeos de um sorotipo particular não estão conjugados com mais do que uma proteína carreadora.

[0091] Em certas modalidades, os polissacarídeos de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 sorotipos são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico tal como DMSO.

[0092] Em certas modalidades, um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F ou 23F são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certos aspectos desta modalidade, um ou ambos os sorotipos 3 ou 18C são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico.

[0093] Em certas modalidades, pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% dos sorotipos em uma composição multivalente são preparados em um solvente aprótico. Os sorotipos restantes são preparados usando uma química alternativa e/ou em um solvente aquoso.

[0094] Em certas modalidades, um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A,

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23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F e 38 são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certos aspectos, de um ou mais dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 11A, 12F e 14 são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certos aspectos, um ou mais dos sorotipos 2, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 19F, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35B, 35F e 38 são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico.

[0095] Em uma modalidade, uma composição multivalente consiste em polissacarídeos dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico tal como DMSO e polissacarídeos dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F e 33F preparados usando aminação redutiva em um solvente aquoso.

[0096] Depois dos glicoconjugados individuais serem purificados, eles são compostos para formular a composição imunogênica da presente invenção. Estes conjugados pneumocócicos são preparados por processos separados e formulados a granel em uma formulação de dosagem única.

Proteína Carreadora [0097] Em uma modalidade particular da presente invenção, CRM197 é usada como proteína carreadora. A CRM197 é uma variante não tóxica (isto é, toxóide) da toxina da difteria. Em uma modalidade, é isolado a partir de culturas de Corynebacterium diphtheriae cepa C7 (β197) cultivada em meio de casamino e extrato de levedura. Em outra modalidade, CRM197 é preparada de forma recombinante de acordo com os métodos descritos na Patente US No. 5,614,382. Tipicamente, CRM197 é purificada através de uma combinação de ultrafiltração, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica. Em algumas modalidades, CRM197 é preparada em Pseudomonas fluorescens usando Pfenex Expression Technology ™ (Pfenex Inc., San Diego, CA).

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33/73 [0098] Outras proteínas carreadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas adicionais tais como DT (toxóide de difteria) ou fragmento B de DT (DTFB), TT (toxóide de tétano) ou fragmento C de TT, toxóide pertussis, toxóide de cólera (por exemplo, como descrito no Pedido Internacional de Patente publicação N ° WO 2004/083251), LT de E. coli, ST de E. coli, e a exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. As proteínas da membrana externa, tais como complexo c de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação de transferrina, proteína A de superfície pneumocócica (PspA; Ver Publicação de pedido de patente Internacional n² WO 02/091998), proteína adesina pneumocócica (PsaA), peptidase C5a de Streptococcus do Grupo A ou Grupo B, ou proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13) incluindo dobras desintoxicadas de alguma forma, por exemplo, dPLY-GMBS (Ver, por exemplo, WO 04/081515) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteínas Pht por exemplo fusões PhtDE, fusões PhtBE (Ver Publicações do Pedido de Patente Internacional n^os. WO 01/98334 e WO 03/54007) também pode ser usado. Outras proteínas, como ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou proteína purificada derivada de tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D de Haemophilus influenzae; Ver, por exemplo, Patente Européia n°. EP 0 594 610 B), ou os equivalentes imunologicamente funcionais das mesmas, peptídeos sintéticos (Ver Patentes Européias n^os. EP0378881 e EP0427347), proteínas de choque térmico (Ver Publicações do Pedido Internacional de Patente WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas pertussis (Ver Publicação do Pedido de Patente Internacional n°. WO 98/58668 e Patente Européia n°. EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou hormônios (ver Publicação do Pedido de Patente Internacional N°. WO 91/01146), proteínas artificiais compreendendo múltiplos epítopos de

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34/73 células T CD4⁺ humanas de vários antígenos derivados de patógenos (ver Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31: 3816-3824) tais como proteína N19 (Ver Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72: 4884-7), proteínas de absorção de ferro (Ver Publicação de Pedido de Patente International n°. WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (Ver Publicação de Patente Internacional n°. WO 00/61761), e flagelina (Ver Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64: 9) também pode ser usado como proteínas carreadoras.

[0099] Outros mutantes DT podem ser usados como a segunda proteína carreadora, tal como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Toxinas Geneticamente Desenvolvidas, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 a Asp, Gin ou Ser e/ou Ala 158 a Gly e outras mutações divulgadas na Patente US n°. 4,709,017 ou Patente US n°. 4,950,740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações divulgadas na Patente US n°. 5,917,017 ou Patente US n°. 6,455,673; ou fragmento divulgado na Patente US n°. 5,843,711. Tais mutantes DT também podem ser usados para fazer variantes DTFB onde as variantes compreendem o fragmento B contêm as regiões do epítopo.

[00100] Onde vacinas multivalentes são usadas, um segundo carreador pode ser usado para um ou mais dos antígenos em uma vacina multivalente. A segunda proteína carreadora é, de preferência, uma proteína que é não tóxica e não-reatogênica e obtenível em quantidade e pureza suficientes. A segunda proteína carreadora é também conjugada ou ligada a um antígeno, por exemplo, um polissacarídeo de S. pneumoniae para aumentar a imunogenicidade do antígeno. Proteínas carreadoras devem ser passíveis de procedimentos de conjugação padrão. Em uma modalidade, cada polissacarídeo capsular não

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35/73 conjugado à primeira proteína carreadora é conjugado à mesma segunda proteína carreadora (por exemplo, cada molécula de polissacarídeo capsular sendo conjugada a uma única proteína carreadora). Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares não conjugados à primeira proteína carreadora estão conjugados a duas ou mais proteínas carreadoras (sendo cada molécula de polissacarídeo capsular conjugada a uma única proteína carreadora). Em tais modalidades, cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é tipicamente conjugado à mesma proteína carreadora.

Composições Farmacêuticas/Vacinas [00101] A presente invenção fornece ainda composições, incluindo composições farmacêuticas, imunogênicas e de vacinas, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente, consistindo em qualquer das combinações de sorotipo de polissacarídeos descritos acima juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável e um adjuvante.

[00102] A formulação dos conjugados de polissacarídeo-proteína da presente invenção pode ser realizada usando métodos reconhecidos na técnica. Por exemplo, os conjugados pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e soluções de dextrose.

[00103] Em uma modalidade, a composição de vacina é formulada em tampão de L-histidina com cloreto de sódio.

[00104] Como definido na presente invenção, um adjuvante é uma substância que serve para intensificar a imunogenicidade de uma composição imunogênica da invenção. Um adjuvante imunológico pode intensificar uma resposta imune a um antígeno que é fracamente imunogênico quando

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36/73 administrado isoladamente, por exemplo, induzir títulos de anticorpos não ou fracos ou resposta imune mediada por células, intensificar títulos de anticorpos para o antígeno e/ou reduzir a dose do antígeno eficaz para alcançar uma resposta imune no indivíduo. Assim, os adjuvantes são frequentemente administrados para estimular a resposta imune e são bem conhecidos do técnico no assunto. Adjuvantes adequados para intensificar a eficácia da composição incluem, mas não estão limitados a:

1) sais de alumínio (alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.;

2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como peptídeos de muramila (definidos abaixo) ou componentes da parede celular bacteriana), tais como, por exemplo, (a) MF59 (Pedido de Patente Internacional WO 90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (contendo opcionalmente várias quantidades de MTP-PE) formuladas em partículas submicrônicas usando um microfluidificador, tal como o microfluidificador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA) (b) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado por pluronic e o thr-MDP microfluidizado em uma emulsão submicrônica ou sujeito a vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo que consiste em monofosforilipídeo A 3-Odesacilado (MPL™) descrito na Patente US n°. 4,912,094, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox™); e (d) uma Montanide ISA;

3) adjuvantes de saponina, tais como Quil A ou STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (ver, por exemplo, Patente US n°. 5,057,540) pode

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37/73 ser usado ou partículas geradas daí, tais como ISCOM (complexos imunoestimuladores formados pela combinação de colesterol, saponina, fosfolipídeo, e proteínas anfipáticas) e Iscomatrix® (que tem essencialmente a mesma estrutura que uma ISCOM, mas sem a proteína);

4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos do lipídeo A sintéticos, tais como compostos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), ou derivados ou análogos dos mesmos, que estão disponíveis na Corixa, e que são descritos na Patente US n°. 6,113,918; um tal AGP é 2-[(R)-3tetradecanoilóxitetradecanoilamino]etil 2-Desóxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3tetradecanoilóxitetradecanoil]-2-[(R)-3--tetradecanoilóxitetradecanoamino]-bD-glucopiranosídeo, que também é conhecido como 529 (anteriormente conhecido como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável;

5) polinucleotídeos sintéticos, tais como oligonucleotideos contendo motivo(s) CpG (Patente US n°. 6,207,646);

6) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferons (por exemplo, interferon gama), fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas co-estimuladoras B7-1 e B7-2, etc; e

7) complemento, tal como um trímero do componente do complemento C3d.

[00105] Em outra modalidade, o adjuvante é uma mistura de 2, 3 ou mais dos adjuvantes anteriores, por exemplo, SBAS2 (uma emulsão de óleo em água contendo também monofosforil lipídeo A 3-desacilado e QS21).

[00106] Os peptídeos de muramila incluem, mas não estão limitados a, Nacetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L

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38/73 alan ina-2-( l'-2'dipalmitoil-sn-gl icerol-3-hidróxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

[00107] Em certas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio. Ο adjuvante de sal de alumínio pode ser uma vacina precipitada com alume ou uma vacina adsorvida a alume. Os adjuvantes de sal de alumínio são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow, E. e D. Lane (1988; Antibodies: Um Laboratório Cold Spring Harbor Laboratory Manual) e Nicklas, W. (1992; sais de alumínio. Research in Immunology 143:489-493). 0 sal de alumínio inclui, mas não está limitado a, alumina hidratada, hidrato de alumina, tri-hidrato de alumina (ATH), hidrato de alumínio, tri-hidrato de alumínio, alhydrogel, Superfos, Amphogel, hidróxido de alumínio (III), sulfato de hidróxifosfato de alumínio, adjuvante de fosfato de alumínio (APA), alumina amorfa, alumina tri-hidratada ou tri-hidróxialumínio.

[00108] APA é uma suspensão aquosa de hidróxifosfato de alumínio. Ο APA é fabricado misturando cloreto de alumínio e fosfato de sódio em uma proporção volumétrica de 1:1 para precipitar o hidróxifosfato de alumínio. Após o processo de mistura, o material é reduzido em tamanho com um misturador de alto cisalhamento para obter uma distribuição de tamanho de partícula monodispersa. O produto é então diafiltrado contra soro fisiológico e esterilizado por vapor.

[00109] Em certas modalidades, um AI(OH)3 comercialmente disponível (eg Alhydrogel ou Superfos da Dinamarca/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) é usado para adsorver proteínas em uma proporção de 50-200 g de proteína/mg de hidróxido de alumínio. A adsorção de proteína é dependente, em outra modalidade, do pl (pH isoelétrico) da proteína e do pH do meio. Uma proteína com um pl mais baixo adsorve mais fortemente ao íon de alumínio com carga positiva do que uma proteína com um pl mais alto. Os sais de alumínio

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39/73 podem estabelecer um depósito de antígeno que é liberado lentamente durante um período de 2 a 3 semanas, estar envolvido na ativação inespecífica dos macrófagos e ativar o complemento, e/ou estimular o mecanismo imune inato (possivelmente através da estimulação do ácido úrico). Ver, por exemplo, Lambrecht et a!., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.

[00110] Conjugados aquosos a granel monovalentes são tipicamente misturados e diluídos para atingir 8 pg/mL para todos os sorotipos, exceto 6B, que será diluído para atingir 16 pg/mL. Uma vez diluído, o lote será esterilizado por filtração e um volume igual de adjuvante de fosfato de alumínio adicionado assepticamente para atingir uma concentração final de alumínio de 250 pg/mL. O lote formulado com adjuvante será introduzido em frascos de dose única de 0,5 mL/dose.

[00111] Em certas modalidades, o adjuvante é uma sequência de nucleotídeos contendo CpG, por exemplo, um oligonucleotídeo contendo CpG, em particular, um oligodesóxinucleotídeo contendo CpG (CpG ODN). Em outra modalidade, o adjuvante é ODN 1826, que pode ser adquirido da Coley Pharmaceutical Group.

[00112] Nucleotídeo contendo CpG, oligonucleotídeo contendo CpG, oligonucleotídeo CpG e termos semelhantes se referem a uma molécula de nucleotídeo de 6 a 50 nucleotídeos de comprimento que contém uma porção de CpG não metilada. Ver, por exemplo, Wang et a!., 2003, Vaccine 21: 4297. Em outra modalidade, qualquer outra definição dos termos aceita pela técnica é pretendida. Os oligonucleotídeos contendo CpG incluem oligonucleotídeos modificados usando quaisquer ligações de internucleotídeos sintéticas, base modificada e/ou açúcar modificado.

[00113] Os métodos para utilização de oligonucleotídeos CpG são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sur et a!., 1999, J

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Immunol. 162: 6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127: 139-58; e Yasuda etal., 2006, Crit Rev Ther Drug Transport Syst. 23: 89-110.

Administração/dose [00114] As composições e formulações da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano susceptível a infecção, por exemplo, uma infecção pneumocócica, por meio da administração da vacina por via sistêmica ou mucosa. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de indução de uma resposta imune a um conjugado de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae, compreendendo administrar a um humano uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de vacinação de um humano contra uma infecção pneumocócica, compreendendo a etapa de administrar ao humano uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção.

[00115] Quantidades ideais de componentes para uma vacina particular podem ser determinadas por estudos padrões envolvendo a observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em outra modalidade, a dose para vacinação humana é determinada por extrapolação de estudos em animais para dados humanos. Em outra modalidade, a dose é determinada empiricamente. Nós demonstramos que a vacina é imunogênica em dados de animais infantis do macaco Rhesus.

[00116] Quantidade eficaz de uma composição da invenção se refere a uma dose necessária para induzir anticorpos que reduzam significativamente a probabilidade ou gravidade de infectividade de um micróbio, por exemplo, S. pneumoniae, durante um desafio subsequente.

[00117] Os métodos da invenção podem ser usados para a prevenção

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41/73 e/ou redução de síndromes clínicas primárias causadas por micróbios, por exemplo, S. pneumoniae, incluindo ambas as infecções invasivas (meningite, pneumonia e bacteremia), e infecções não invasivas (otite média aguda, e sinusite).

[00118] A administração das composições da invenção pode incluir uma ou mais das seguintes: injeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou atráves de administração de mucosa aos tratos oral/alimentar, respiratório ou genitourinário. Em uma modalidade, a administração intranasal é usada para o tratamento de pneumonia ou otite média (uma vez que o transporte nasofaríngeo de pneumococos pode ser prevenido de forma mais eficaz, atenuando assim a infecção na sua fase inicial).

[00119] A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos adversos significativos. Essa quantidade pode variar dependendo do sorotipo pneumocócico. Geralmente, para conjugados à base de polissacarídeos, cada dose irá compreender 0,1 a 100 pg de cada polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 pg, e mais particularmente 1 a 5 pg. Por exemplo, cada dose pode compreender 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 ou 750 ng ou 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 pg.

[00120] Quantidades ideais de componentes para uma vacina em particular podem ser determinadas por estudos padrões envolvendo a observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em outra modalidade, a dose para vacinação humana é determinada por extrapolação de estudos em animais para dados humanos. Em outra modalidade, a dose é determinada empiricamente.

[00121] Em uma modalidade, a dose do sal de alumínio é 10, 15, 20, 25,

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30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 ou 700 pg, ou 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 mg ou mais. Ainda em outra modalidade, a dose de sal de alumínio descrita acima é por pg de proteína recombinante.

[00122] De acordo com qualquer um dos métodos da presente invenção e em uma modalidade, o indivíduo é humano. Em certas modalidades, o indivíduo humano é um lactente (menos de 1 ano de idade), criança pequena (aproximadamente 12 a 24 meses) ou criança jovem (aproximadamente 2 a 5 anos). Em outras modalidades, o indivíduo humano é um indivíduo idoso (por exemplo,> 50 anos de idade ou > 65 anos de idade). As composições desta invenção são também adequadas para uso com crianças mais velhas, adolescentes e adultos (por exemplo, com idades entre 18 e 45 anos ou 18 a 65 anos).

[00123] Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, uma composição da presente invenção é administrada como uma única inoculação. Em outra modalidade, a vacina é administrada duas vezes, três vezes ou quatro vezes ou mais, adequadamente espaçadas. Por exemplo, a composição pode ser administrada em intervalos de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses ou qualquer combinação dos mesmos. O cronograma de imunização pode seguir o designado para vacinas pneumocócicas. Por exemplo, o cronograma de rotina para bebês e crianças pequenas contra a doença invasiva causada por S. pneumoniae é de 2, 4, 6 e 12 a 15 meses de idade. Assim, em uma modalidade, a composição é administrada como uma série de 4 doses aos 2, 4, 6 e 12 15 meses de idade.

[00124] As composições desta invenção podem também incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae. Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para inclusão incluem as identificadas nas Publicações de Pedido de Patente Internacional N^os. WO 02/083855 e WO 02/053761.

Formulações

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43/73 [00125] As composições da invenção podem ser administradas a um indivíduo por um ou mais métodos conhecidos por um técnico no assunto, tais como por via parenteral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutânea, intraperitoneal, e formulado em conformidade.

[00126] Em uma modalidade, as composições da presente invenção são administradas através de injeção epidérmica, injeção intramuscular, intravenosa, intra-arterial, injeção subcutânea ou injeção de mucosa intrarespiratória de uma preparação líquida. As formulações líquidas para injeção incluem soluções e semelhantes.

[00127] A composição da invenção pode ser formulada como frascos de dose única, frascos de múltiplas doses ou como seringas preenchidas.

[00128] Em outra modalidade, as composições da presente invenção são administradas oralmente e são assim formuladas em uma forma adequada para administração oral, isto é como uma preparação sólida ou líquida. Formulações orais sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, pastilhas e semelhantes. As formulações orais líquidas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e semelhantes.

[00129] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para formulações líquidas são soluções aquosas ou não aquosas, suspensões, emulsões ou óleos. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Exemplos de óleos são os de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou um lipídeo de leite ou ovos.

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44/73 [00130] A composição farmacêutica pode ser isotônica, hipotônica ou hipertônica. Contudo, é frequentemente preferido que uma composição farmacêutica para infusão ou injeção seja essencialmente isotônica, quando ela for administrada. Assim, para armazenamento, a composição farmacêutica pode de preferência ser isotônica ou hipertônica. Se a composição farmacêutica for hipertônica para armazenamento, ela pode ser diluída para se tornar uma solução isotônica antes da administração.

[00131] O agente isotônico pode ser um agente isotônico iônico, tal como um sal ou um agente isotônico não iônico, tal como um carboidrato. Exemplos de agentes isotônicos iônicos incluem, mas não estão limitados a NaCI, CaCh, KCI e MgCb. Exemplos de agentes isotônicos não iônicos incluem mas não estão limitados a manitol, sorbitol e glicerol.

[00132] É também preferencial que pelo menos um aditivo farmaceuticamente aceitável seja um tampão. Para algumas finalidades, por exemplo, quando a composição farmacêutica se destina a infusão ou injeção, é frequentemente desejável que a composição compreenda um tampão, que seja capaz de tamponar uma solução a um pH na faixa de 4 a 10, tal como 5 a 9, por exemplo, 6 a 8.

[00133] O tampão pode, por exemplo, ser selecionado do grupo que consiste em tampão TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato e trietanolamina.

[00134] O tampão pode ser selecionado além disso, por exemplo, a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. Por exemplo, o tampão pode ser selecionado do grupo que consiste em ácidos monobásicos, tais como ácido acético, benzóico, glucônico, glicérico e láctico; ácidos dibásicos tais como ácidos

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45/73 aconítico, adípico, ascórbico, carbônico, glutâmico, málico, succínico e tartárico, ácidos polibásicos, tais como ácidos cítrico e fosfórico; e bases tais como amônia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e TRIS.

[00135] Os veículos parenterais (para injeção subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos tais como os baseados em dextrose de Ringer e semelhantes. Exemplos são líquidos estéreis tais como água e óleos, com ou sem a adição de um surfactante e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em geral, a água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, glicóis como propilenoglicóis ou polietilenoglicol, Polissorbato 80 (PS-80), Polissorbato 20 (PS-20) e Poloxâmero 188 (P188) são veículos líquidos preferenciais, particularmente para soluções injetáveis. Exemplos de óleos são os de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou um lipídeo de leite ou ovos.

[00136] As formulações da invenção podem também conter um surfactante. Os surfactantes incluem, mas não estão limitados a: os surfactantes de ésteres de polióxietileno sorbitano e (comumente designados por Tweens), especialmente PS-20 e PS-80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de butileno (BO), comercializados sob o nome comercial DOWFAX™, tais como copolímeros em bloco de EO/PO lineares; octoxinóis, que podem variar no número de repetição de grupos etóxi (óxi-1,2etanodi-il), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenóxipolietóxietanol) sendo de particular interesse; (octilfenóxi)polietóxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídeos tais como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tais

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46/73 como a série Tergitol™ NP; éteres graxos de polióxietileno derivados de álcoois laurílico, cetílico, estearílico e oleílico (conhecidos como surfactantes Brij), tais como éter monolaurílico de trietilenoglicol (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como os SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Um surfactante preferencial para incluir na emulsão é o PS-80.

[00137] Misturas de surfactantes podem ser usadas, por exemplo, misturas de PS-80/Span 85. Uma combinação de um éster de polióxietileno sorbitano tal como mono-oleato de polióxietileno sorbitano (PS-80) e um octóxinol tal como t-octilfenóxi polietóxi etanol (Triton X-100) é também adequada. Outra combinação útil compreende lauret 9 mais um éster de polióxietileno sorbitano e/ou um octóxinol.

[00138] As quantidades preferenciais de surfactantes (% em massa) são: ésteres de polióxietileno sorbitano (tais como PS-80) a 0,01 a 1%, em particular cerca de 0,1%; polióxietanóis de octil- ou nonil-fenóxi (tais como Triton X-100, ou outros detergentes da série Triton) a 0,001 a 0,1%, em particular, 0,005 a 0,02%; éteres de polióxietileno (tais como lauret 9) a 0,1 a 20%, de preferência, 0,1 a 10% e, em particular, 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%.

[00139] Em certas modalidades, a composição consiste essencialmente em histidina (20 mM), solução salina (150 mM) e 0,02% de PS-20 ou 0,04% de PS-80 a um pH de 5,8 com 250 ug/mL de APA (Adjuvante de Fosfato de Alumínio). O PS-20 pode variar de 0,005% a 0,1% (m/v) com a presença de PS-20 ou PS-80 na formulação controlando a agregação durante a fabricação simulada e no transporte usando a embalagem primária. O processo consiste em combinar a mistura de até 24 sorotipos em histidina, solução salina e PS-20 ou PS-80, então, combinando este material misturado com APA e solução salina com ou sem conservantes antimicrobianos.

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47/73 [00140] A escolha do surfactante pode precisar ser otimizada para diferentes produtos de fármaco e substâncias de fármaco. Para vacinas multivalentes com 15 ou mais sorotipos, são preferenciais PS-20 e P188. A escolha da química usada para fazer o conjugado também pode desempenhar um papel importante na estabilização da formulação. Em particular, quando as reações de conjugação usadas para preparar diferentes conjugados de polissacarídeo-proteína em uma composição multivalente incluem o solvente aquoso e o solvente de DMSO, verificou-se que sistemas de surfactantes particulares fornecem diferenças significativas na estabilidade. A estabilidade melhorada dos conjugados de polissacarídeo-proteína foi observada apenas com o polissorbato 20 ou com o poloxâmero 188 em combinação com um poliol.

[00141] O mecanismo exato de como um detergente específico protege um bioterapêutico é pouco compreendido e não pode ser previsto a priori. Possíveis mecanismos de estabilização incluem hidratação preferencial, exclusão preferencial, competição de interface ar/líquido entre bioterapêuticos e a superfície, tensão superficial, e/ou associação direta do detergente com o bioterápico para mascarar pensos hidrofóbicos que servem como sementes para agregação.

[00142] O poloxâmero também pode ser usado nas composições da invenção. Um poloxâmero é um copolímero de tribloco não iônico composto por uma cadeia hidrofóbica central de polióxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)). Os poloxâmeros também são conhecidos pelo nome comercial Pluronic®. Como os comprimentos dos blocos de polímero podem ser personalizados, existem muitos poloxâmeros diferentes que possuem propriedades ligeiramente diferentes. Para o termo genérico poloxâmero, esses copolímeros são comumente nomeados com a letra P (para poloxâmero)

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48/73 seguido por três dígitos, os dois primeiros dígitos x 100 dão a massa molecular aproximada do núcleo de polióxipropileno e o último dígito x 10 dá a porcentagem de teor de polióxietileno (por exemplo, P407 = Poloxâmero com uma massa molecular de polióxipropileno de 4000 g/mol e um teor de 70% de polióxietileno). Para a marca registrada Pluronic®, a codificação destes copolímeros começa com uma letra para definir a sua forma física, à temperatura ambiente (L = líquido, P = pasta, F = floco (sólido)) seguido por dois ou três dígitos. O primeiro dígito (dois dígitos em um número de três dígitos) na designação em numérica, multiplicado por 300, indica o peso molecular aproximado do hidrófobo; e o último dígito x 10 dá a porcentagem do teor de polióxietileno (por exemplo, L61 = Pluronic® com uma massa molecular de polióxipropileno de 1800 g/mol e um teor de polióxietileno de 10%). Ver Patente US n°. 3,740,421.

Exemplos de poloxâmeros têm a fórmula geral: HO(C2H4O)a(C₃H₆O)b(C2H₄O)aH, em que os blocos a e b têm os seguintes valores:

Pluronic®	Poloxâmero	a	b	Peso Molecular
L31		2	16	1100 (média)
L35				1900 (média)
L44NF	124	12	20	2090 a 2360
L64				2900 (média)
L81				2800 (média)
L121				4400 (média)
P123		20	70	5750 (média)
F68NF	188	80	27	7680 a 9510
F87NF	237	64	37	6840 a 8830

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F108NF	338	141	44	12700 a 17400
F127NF	407	101	56	9840 a 14600

[00143] As unidades de peso molecular, como aqui usadas, estão em Dalton (Da) ou g/mol.

[00144] De preferência, o poloxâmero tem geralmente um peso molecular na faixa a partir de 1.100 a 17.400 Da, a partir de 7.500 a 15.000 Da, ou a partir de 7.500 a 10.000 Da. O poloxâmero pode ser selecionado de poloxâmero 188 ou poloxâmero 407. A concentração final do poloxâmero nas formulações é de 0,001% a 5% em massa/volume, ou 0,025% a 1% em massa/volume. Em certos aspectos, o poliol é o propilenoglicol e está na concentração final de 1% a 20% em massa/volume. Em certos aspectos, o poliol é o polietilenoglicol e está na concentração final de 1% a 20% em massa/volume.

[00145] Os polióis adequados para as formulações da invenção são polióis poliméricos, particularmente, poliéter dióis incluindo, mas não se limitando a, propilenoglicol e polietilenoglicol, éteres monometílicos de polietilenoglicol. O propilenoglicol está disponível em uma faixa de pesos moleculares do monômero a partir de ~ 425 a ~ 2700. O propilenoglicol e o éter monometílico de propilenoglicol também estão disponíveis em uma faixa de pesos moleculares variando a partir de ~ 200 a ~ 35000 incluindo mas não limitados a, PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 e PEG MME 4000. Um propilenoglicol preferencial é o propilenoglicol 400. A concentração final do poliol nas formulações da invenção pode ser de 1% a 20% em massa/volume ou 6% a 20% em massa/volume.

[00146] A formulação também contém uma solução salina tamponada. O tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato,

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50/73 glicinato, histidina, glicina, succinato, HEPES (ácido 4-(2-h id róxietil)-lpiperazinaetanossulfônico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico) e tampão de trietanolamina. O tampão é capaz de tamponar uma solução a um pH na faixa de 4 a 10, 5,2 a 7,5 ou 5,8 a 7,0. Em certos aspectos da invenção, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato, succinato, histidina, MES, MOPS, HEPES, acetato ou citrato. O tampão pode além disso, por exemplo, ser selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parentérico, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parentérico. As concentrações do tampão irão variar de 1 mM a 50 mM ou 5 mM a 50 mM. Em certos aspectos, o tampão é histidina a uma concentração final de 5 mM a 50 mM, ou succinato a uma concentração final de 1 mM a 10 mM. Em certos aspectos, a histidina está a uma concentração final de 20 mM ± 2 mM.

[00147] Embora a solução salina (isto é, uma solução contendo NaCI) seja preferencial, outros sais adequados para a formulação incluem, mas não estão limitados a, CaCb, KCI e MgCb e combinações dos mesmos. Agentes isotônicos não iônicos incluindo mas não limitados a sacarose, trealose, manitol, sorbitol e glicerol podem ser usados em vez de um sal. As faixas de sal adequadas incluem, mas não estão limitadas a 25 mM a 500 mM ou 40 mM a 170 mM. Em um aspecto, a solução salina é NaCI, opcionalmente presente em uma concentração de 20 mM a 170 mM.

[00148] Em uma modalidade, as formulações compreendem um tampão de L-histidina com cloreto de sódio.

[00149] Em certas modalidades das formulações descritas na presente invenção, os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem um ou mais polissacarídeos pneumocócicos conjugados a uma proteína carreadora. A proteína carreadora pode ser selecionada a partir de CRM197, fragmento B da

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51/73 toxina da difteria (DTFB), DTFBC8, Toxóide da difteria (DT), Toxóide de tétano (TT), fragmento C de TT, Toxóide pertussis, Toxóide da cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa e combinações dos mesmos. Em um aspecto, todos os conjugados de polissacarídeo-proteína são preparados com o uso de química aquosa. Em outro aspecto, um ou mais dos conjugados de polissacarídeo-proteína são preparados com o uso de solvente de DMSO. Como exemplo, a formulação de conjugado de polissacarídeo-proteína pode ser uma formulação conjugada pneumocócica 15-valente (15vPnC) em que os conjugados de polissacarídeo-proteína dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F são preparados usando o solvente de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína dos sorotipos 1, 3,4, 5, 9V, 14, 22F e 33F são preparados usando o solvente aquoso.

[00150] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é liberada em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, o agente pode ser administrado usando infusão intravenosa, um emplastro transdérmico, lipossomas ou outros modos de administração. Em outra modalidade, são usados materiais poliméricos; por exemplo, em microesferas ou em um implante.

[00151] As composições desta invenção podem também incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae. Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para inclusão incluem as identificadas nas Publicações de Pedido de Patente Internacional N^os. WO 02/083855 e WO 02/053761.

[00152] Tendo descrito várias modalidades da invenção com referência à descrição e figuras anexas, deve ser entendido que a invenção não está limitada às modalidades precisas, e que várias alterações e modificações podem ser realizadas por um técnico no assunto sem se distanciar do escopo ou espírito da invenção como definido nas reivindicações anexas.

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52/73 [00153] Os exemplos seguintes ilustram, mas não limitam a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação de polissacarídeos capsulares de 5. pneumoniae [00154] Os métodos de cultura de pneumococos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Os métodos de preparação de polissacarídeos capsulares pneumocócicos são também bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente Européia n°. EP0497524. Isolados de subtipos pneumocócicos estão disponíveis na American Type Culture Collection (Manassas, VA). As bactérias são identificadas como diplococos encapsulados, não móveis, Grampositivos, em formato de lanceta, que são alfa-hemolíticos em ágar-sangue. Os subtipos podem ser diferenciados com base na reação de Quelling usando antissoros específicos. Ver, por exemplo, Patente US n°. 5,847,112.

[00155] Os bancos de células que representam cada um dos sorotipos de S. pneumococcus presentes foram obtidos da Merck Culture Collection (Rahway, NJ) em um frasco congelado. Uma cultura de semente descongelada foi transferida para o fermentador de sementes contendo um meio de crescimento pré-esterilizado apropriado para S. pneumoniae. A cultura foi cultivada no fermentador de sementes com controle de temperatura e pH. Todo o volume do fermentador de sementes foi transferido para um fermentador de produção contendo meios de crescimento pré-esterilizados. A fermentação de produção foi o estágio final de crescimento celular do processo. A temperatura, o pH e a taxa de agitação foram controlados.

[00156] O processo de fermentação foi terminado através da adição de um agente de inativação. Após a inativação, o lote foi transferido para o tanque de inativação onde foi mantido em temperatura e agitação controladas. Os detritos de células foram removidos usando uma combinação de centrifugação

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53/73 e filtração. O lote foi ultrafiltrado e diafiltrado. O lote foi então submetido a fracionamentos à base de solvente que removem as impurezas e recuperam o polissacarídeo.

Exemplo 2: A conjugação dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F para CRM 197 usando aminação redutiva em solução aquosa [00157] Os diferentes sorotipos de polissacarídeos foram conjugados individualmente à proteína carreadora CRM197 purificada usando um fluxo de processo comum. O polissacarídeo foi dissolvido, reduzido de tamanho, ativado quimicamente e trocado de tampão por ultrafiltração. À CRM197 purificada foi então conjugado com o polissacarídeo ativado usando N1CI2 (2 mM) na mistura de reação e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 micron. Vários parâmetros do processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para valores específicos de sorotipo na seção abaixo.

Redução do tamanho do polissacarídeo e oxidação [00158] O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e todos os sorotipos, exceto o sorotipo 19A, foram filtrados com 0,45 micron. Todos os sorotipos, exceto o sorotipo 19A, foram homogeneizados para reduzir a massa molecular do polissacarídeo. O sorotipo 19A não foi reduzido em tamanho devido ao seu tamanho inicial relativamente baixo. A pressão de homogeneização e o número de passagens através do homogeneizador foram controlados para alvos específicos do sorotipo (1501000 bar; 4-7 passagens) para obter uma massa molecular específica do sorotipo. O polissacarídeo de tamanho reduzido foi filtrado com 0,2 micron e depois foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 10 kDa.

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54/73 [00159] A solução de polissacarídeo foi então ajustada para uma temperatura específica do sorotipo (4-22°C) e pH (4-5) com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução do tamanho do polissacarídeo devido à ativação. Para todos os sorotipos (exceto o sorotipo 4), a ativação do polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionada foi específica do sorotipo, variando de aproximadamente 0,1 a 0,5 mois de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo. A carga específica do sorotipo de metaperiodato de sódio foi para atingir um nível de alvo de ativação de polissacarídeos (mois de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeos). Para o sorotipo 4, antes da adição de metaperiodato de sódio, o lote foi incubado a aproximadamente 50°C e pH 4,1 para remover parcialmente o grupo cetal do polissacarídeo.

[00160] Para todos os sorotipos, com exceção dos sorotipos 5 e 7F, o produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 10 kDa. Os sorotipos 5 e 7F foram diafiltrados contra acetato de sódio 10 mM. A ultrafiltração para todos os sorotipos foi conduzida a 2-8°C.

Conjugação de Polissacarídeo à CRM197 [00161] A solução de polissacarídeo oxidado foi misturada com água e fosfato de potássio a 1,5 M, pH 6,0 ou pH 7,0, dependendo do sorotipo. O pH do tampão selecionado foi para melhorar a estabilidade do polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação. A CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens como previamente descrito (WO 2012/173876 Al), foi filtrada a 0,2 micron e combinada com a solução de polissacarídeo tamponada em uma razão de massa de polissacarídeo a CRM197 variando de 0,4 a 1,0 m/m dependendo no sorotipo. A razão de massa foi

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55/73 selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante. As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram específicas do sorotipo, variando de 3,6 a 10,0 g/L e 100 a 150 mM, respectivamente, dependendo do sorotipo. A concentração de polissacarídeo específico de sorotipo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante. A solução foi então filtrada a 0,2 micron. Cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel a 100 mM. Cianoborohidreto de sódio (2 mois por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. A conjugação prosseguiu durante uma duração específica do sorotipo (72 a 120 horas) para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com borohidreto de sódio [00162] Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriado para 28°C e filtrado com 1,2 micron. Todos os sorotipos (exceto o sorotipo 5) foram diafiltrados contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2-8°C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 100 kDa. O lote, recuperado no retentado, foi então diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e ajustado ao pH com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. Borohidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. Adicionou-se mais tarde fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0. O sorotipo 5 foi diafiltrado contra fosfato de potássio 300 mM usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 100 kDa.

Filtração final e armazenamento de produtos [00163] O lote foi então concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4°C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 300 kDa. O lote de retentado foi

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56/73 filtrado com 0,2 micron.

[00164] O conjugado de sorotipo 19F foi incubado por aproximadamente 7 dias aos 22°C, diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4°C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 100 kDa e filtrado a 0,2 micron.

[00165] O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a < -60°C.

Exemplo 3: Métodos para a conjugação dos sorotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F para CRM197 usando aminação redutiva em dimetilsulfóxido [00166] Os diferentes sorotipos de polissacarídeos 3,4, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F foram conjugados individualmente com a proteína carreadora CRM197 purificada usando um fluxo de processo comum. O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, ativado quimicamente e trocado de tampão por ultrafiltração. O polissacarídeo ativado e a CRM197 purificada foram liofilizados e redissolvidos individualmente em dimetilsulfóxido (DMSO). Soluções de polissacarídeo redissolvido e CRM197 foram então combinadas e conjugadas como descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 micron. Vários parâmetros do processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para valores específicos de sorotipo na seção abaixo.

Redução do tamanho do polissacarídeo e oxidação [00167] O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e todos os sorotipos, exceto o sorotipo 19A, foram filtrados com 0,45 micron. Todos os sorotipos, exceto os sorotipos 18C e 19A, foram

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57/73 homogeneizados para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogeneização e o número de passagens através do homogeneizador foram controlados para alvos específicos do sorotipo (150-1000 bar; 4-7 passagens). O sorotipo 18C foi reduzido em tamanho por hidrólise ácida a > 90°C.

[00168] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi filtrado com 0,2 micron e depois foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial NMWCO de 10 kDa. Uma membrana de NMWCO de 5 kDa foi usada para o sorotipo 18C.

[00169] A solução de polissacarídeo foi então ajustada para uma temperatura específica do sorotipo (4-22°C) e pH (4-5) com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução do tamanho do polissacarídeo devido à ativação. Para todos os sorotipos (exceto o sorotipo 4), a ativação do polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionada foi específica do sorotipo, variando de aproximadamente 0,1 a 0,5 rnols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo. A carga específica do sorotipo de metaperiodato de sódio foi para atingir um nível de alvo de ativação de polissacarídeos (rnols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeos). Para o sorotipo 4, antes da adição de metaperiodato de sódio, o lote foi incubado a aproximadamente 50°C e pH 4,1 para remover parcialmente o grupo cetal do polissacarídeo.

[00170] O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa, depois diafiltrado ou dialisado contra água usando uma membrana de NMWCO de 10 kDa. Uma membrana de NMWCO de 5 kDa foi usada para o sorotipo 18C. A ultrafiltração ou diálise para todos os sorotipos foi conduzida a 2-8°C.

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Conjugação de polissacarídeo À CRM197 [00171] A CRM 197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 Al), foi diafiltrado contra tampão de fosfato 2-5 mM, pH 7,0 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado a 0,2 micron.

[00172] Para os sorotipos diferentes do sorotipo 3, os polissacarídeos oxidados foram formulados a 6 mg de Ps/mL e 5% m/v de sacarose (50 mg sacarose/mL) em água. Para o sorotipo 3, o polissacarídeo oxidado foi formulado a 2 mg de Ps/mL e 10% m/v de sacarose (100 mg de sacarose/mL) em água. A solução de proteína foi formulada a 6 mg de Pr/mL com 1% m/v de sacarose (10 mg sacarose/mL) em tampão de fosfato.

[00173] As soluções formuladas de Ps e CRM197 foram individualmente liofilizadas. Os materiais liofilizados de Ps e CRM197 foram redissolvidos em DMSO e combinados usando uma mistura tee. Cianoborohidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado e a conjugação prosseguiu durante uma duração específica do sorotipo (1 a 48 horas) para atingir um tamanho de conjugado alvo.

Redução com borohidreto de sódio [00174] O borohidreto de sódio (2 mois por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação. O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com ou sem aproximadamente 0,025% (m/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4°C. O tampão de fosfato de potássio foi então adicionado para neutralizar o pH. Para os sorotipos 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, e 33F, o lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4°C contra cloreto de sódio 150 mM, com ou sem fosfato de potássio 25 mM, pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

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Filtração final e armazenamento de produtos [00175] Os sorotipos 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, 22F, 23F e 33F foram concentrados e diafiltrados contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com ou sem 0,015% (m/v) de polissorbato 20, a 4°C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa. O lote de retentado foi filtrado com 0,2 micron.

[00176] O sorotipo 19F foi incubado durante aproximadamente 5 dias, diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a aproximadamente 4°C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa e filtrado a 0,2 micron.

[00177] Os sorotipos 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F foram diluídos com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, dispensados em alíquotas e congelados a < -60°C.

[00178] Os sorotipos 4 e 14 foram dialisados contra cloreto de sódio 150 mM a aproximadamente 4°C usando uma membrana NMWCO de 300 kDa, filtrados a 0,2 micron, dispensados em alíquotas e congelados a < -60°C.

Exemplo 4: Análise de Conjugados

Peso molecular e análise de concentração de conjugados usando ensaio de HPSEC/UV/MALS/RI [00179] As amostras conjugadas foram injetadas e separadas por cromatografia de exclusão de tamanho de alta eficiência (HPSEC). A detecção foi realizada com detectores de ultravioleta (UV), de dispersão de luz de múltiplos ângulos (MALS) e de índice de refração (RI) em série. A concentração de proteína foi calculada a partir de UV280 usando um coeficiente de extinção. A concentração de polissacarídeo foi desconvoluída a partir do sinal de RI (contribuído pela proteína e polissacarídeo) usando os fatores de dn/dc que são a mudança no índice de refração de uma solução com uma mudança na

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60/73 concentração de soluto relatada em mL/g. O peso molecular médio das amostras foi calculado pelo software Astra (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) usando a concentração medida e as informações de dispersão da luz ao longo de todo o pico da amostra.

Grau de polissacarídeo do ensaio de ativação [00180] A conjugação ocorre através de aminação redutiva entre os aldeídos ativados e principalmente os resíduos de lisina na proteína carreadora. O nível de ativação, representado por mois de aldeído por mois de unidade de repetição de polissacarídeos, é importante para controlar as reações de conjugação. Um ensaio para medir o grau de ativação está descrito na Publicação do Pedido de Patente n° US 2017/0021006.

[00181] Um ensaio interno foi desenvolvido para medir o grau de ativação baseado na reação de grupos aldeídos (criados durante a oxidação do periodato de polissacarídeo) com tiossemicarbazida (disponível em fontes comerciais).

[00182] A quantificação pode ser conseguida por RMN (ressonância magnética nuclear) ou por comparação do polissacarídeo derivado a padrões de referência apropriados e/ou através do uso de coeficientes de extinção do derivado. O uso de coeficientes de extinção para este ensaio é semelhante ao seu uso no método de HPSEC/UV/MALS/RI.

[00183] Geralmente, o ensaio pode ser executado sob as seguintes condições de reação:

Tempo: 0,5 h a 35 h (isto é específico do sorotipo, mas a reação é seguida até a conclusão, ou seja, patamares em um curso de tempo)

Temperatura: 15°C a 37°C, de preferência, em torno de 21-27°C

Concentração de TSC: 1 a 5 mg/mL pH da reação: pH 3 a 5,5, de preferência, 4,0 [00184] Para o Exemplo 4, o polissacarídeo foi derivado com 1,25 a 2,5

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61/73 mg/mL de tiossemicarbazida (TSC) a pH 4,0 para introduzir um cromóforo (a derivatização do polissacarídeo ativado para os sorotipos 1, 5 e 9V usa 1,25 mg/mL de TSC). A reação de derivatização foi deixada prosseguir para alcançar um patamar. O tempo real variou dependendo da velocidade de reação para cada sorotipo. O TSC-Ps foi então separado de TSC e de outros componentes de baixo peso molecular por cromatografia de exclusão de tamanho de alta eficiência. O sinal foi detectado por absorbância de UV a 266 nm. O nível de aldeído ativado é calculado contra injeções de curva padrão de Mono-TSC ou diretamente usando coeficientes de extinção pré-determinados. Mono-TSC é um derivado de tiossemicarbazona sintetizado de monossacarídeo. O nível de aldeído é então convertido em mols de aldeído por mol de unidade de repetição (Ald/RU) usando a concentração de Ps medida pelo ensaio de HPSEC/UV/MALS/RI.

[00185] Derivatização semelhante pode ser conduzida com análogos estruturais de tiossemicarbazida, hidrazidas, hidrazina, semicarbazida, análogos estruturais de semicarbazida, compostos de amino-óxi ou aminas aromáticas desde que os derivados tenham absorbância UV significativa. A absorbância UV pode ser do cromóforo ligado aos agentes de derivatização, ou de um cromóforo gerado como resultado da derivatização de aldeído, como o caso da tiossemicarbazida.

Determinação do consumo de lisina em proteínas conjugadas como uma medida do número de ligações covalentes entre o polissacarídeo e a proteína carreadora [00186] A análise de aminoácidos por Waters AccQ-Tag (AAA) foi usada para medir a extensão da conjugação em amostras conjugadas. As amostras foram hidrolisadas usando hidrólise ácida em fase de vapor na estação de trabalho Eldex, para quebrar as proteínas carreadoras em seus aminoácidos

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62/73 componentes. Os aminoácidos livres foram derivados usando 6-aminoquinolilN-hidróxisuccinimidilcarbamato (AQC). As amostras derivatizadas foram então analisadas usando UPLC com detecção UV em uma coluna de C18. A concentração média de proteína foi obtida usando aminoácidos representativos diferentes da lisina. O consumo de lisina durante a conjugação (isto é, perda de lisina) foi determinado pela diferença entre a quantidade média medida de lisina no conjugado e a quantidade esperada de lisina na proteína de partida.

Atributos de conjugados feitos usando aminação redutiva em soluções aquosas e DMSO [00187] Os resultados de ativação de polissacarídeo e consumo de lisina (isto é, perda de lisina) para conjugados gerados usando os processos descritos nos Exemplos 2 e 3 estão listados na Tabela 1. Existe uma clara distinção de que os conjugados feitos em DMSO (Exemplo 3) tiveram maior consumo de lisina com menor ativação de polissacarídeos do que os conjugados feitos em solução aquosa (Exemplo 2). Isto sugere que preparar os conjugados em solução de DMSO permite que o polissacarídeo se ligue a mais sítios de conjugação na proteína carreadora com menos ativação ou destruição em estruturas de polissacarídeos nativos. Como resultado, os conjugados, em média, contêm mais glicopeptídeo por unidade de repetição de polissacarídeo devido à maior reticulação em conjugados preparados em solução de DMSO do que em solução aquosa. Acredita-se que o glicopeptídeo é o domínio antigênico para o qual é gerada uma resposta imune. Consequentemente, espera-se que os conjugados gerados em DMSO sejam mais imunogênicos que os conjugados gerados em solução aquosa.

[00188] O peso molecular médio (Mw) dos conjugados na Tabela 1 foi medido pelo ensaio de HPSEC UV-MALS-RI. Conjugados gerados por aminação redutiva em solução aquosa variaram de 990 a 3410 kDa. Os conjugados gerados

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63/73 em DMSO eram geralmente maiores com tamanhos variando de 1300 a 5822 kDa.

Tabela 1: Perda de lisina para os conjugados de sorotipo pneumocócicos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 14,18C, 19A, 19F e 23F CRM197 feitos usando aminação redutiva em solução aquosa ou em DMSO.

Conjugado	n°. do Lote de Conjugado	Reação de conjugação em solução aquosa ou DMSO	Ativação de polissacarídeos (mol de aldeido/mol de unidade de repetição)	Perda de lisina (mol/mol de proteína)
Sorotipo 3- CRM197	1	Aquoso	0,10	3,1
2	0,10	2,5
3	0,10	3,1
4	DMSO	0,092	16,3
5	0,053	9,6
Sorotipo 4- CRM197	1	Aquoso	0,43	2,7
2	DMSO	0,25	3,0
Sorotipo 6A-CRM197	1	Aquoso	0,19	4,5
2	DMSO	0,11	9,1
Sorotipo 6B-CRM197	1	Aquoso	0,18	4,6
2	DMSO	0,11	9,6
Sorotipo 7F-CRM197	1	Aquoso	0,26	2,0
2	DMSO	0,22	10,6
Sorotipo 9V-CRM197	1	Aquoso	0,30	4,7
2	DMSO	0,15	7,9

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ÇA/73

Sorotipo 14-CRM197	1	Aquoso	0,22	6,4
2	DMSO	0,22	12,7
Sorotipo 18C- CRM197	1	Aquoso	0,12	3,5
2	DMSO	0,11	9,2
Sorotipo 19A- CRM197	1	Aquoso	0,38	4,9
2	DMSO	0,14	9,5
Sorotipo 19F- CRM197	1	Aquoso	0,13	2,7
2	DMSO	0,15	9,6
Sorotipo 22F- CRM197	1	Aquoso	0,12	1,7
2	DMSO	0,15	7,2
3	0,15	7,0
Sorotipo 23F- CRM197	1	Aquoso	0,39	3,2
2	DMSO	0,19	10,8
Sorotipo 33F- CRM197	1	Aquoso	0,23	4,5
2	DMSO	0,14	7,0

Quantificação da extensão da conjugação em diferentes locais na CRM197 [00189] O polissacarídeo pode ser conjugado ao grupo amina na porção N-terminal da proteína carreadora ou a qualquer uma das cadeias laterais dos 39 resíduos de lisina na CRM197. A sequência de aminoácidos da CRM197 é fornecida na Tabela 2, em que as lisinas (abreviadas como K) estão sublinhadas e em negrito. Para localizar e quantificar a extensão da conjugação de polissacarídeos nos diferentes locais na proteína CRM197, um método de

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65/73 mapeamento de peptídeo LC/UV/MS foi usado. Amostras conjugadas representativas (preparadas com DMSO ou solução aquosa) foram digeridas em duplicata com tripsina, produzindo peptídeos trípticos. As misturas foram então separadas em uma coluna de C18 de fase reversa e analisadas por espectrômetro UV e de massa. Uma amostra de proteína CRM197 (não conjugada com um polissacarídeo) foi também processada em triplicata ao mesmo tempo que um controle. Uma vez que a tripsina cliva uma proteína no lado C-terminal dos resíduos de lisina e arginina, a conjugação em um resíduo de lisina torna esse sítio resistente a proteinases. A extensão da conjugação em um determinado local foi determinada calculando-se uma diminuição da intensidade do pico de um peptídeo tríptico em comparação com um controle de CRM197. Dependendo dos sítios de divagem e das sequências, a diminuição do sinal de um determinado peptídeo pode ser devido à divagem errônea das lisinas no peptídeo anterior, ou divagem da lisina na extremidade do peptídeo, ou conjugação no meio de a sequência de peptídeo.

[00190] As porcentagens relativas da diminuição do sinal de peptídeo para os conjugados do sorotipo 19A, em comparação com o controle de CRM197, foram plotados contra possíveis sítios de conjugação na Figura 1. As localizações de lisina listadas no eixo x foram numeradas com base na sua ordem na sequência da proteína CRM197 e representam possíveis sítios de conjugação dos peptídeos analisados. Por exemplo, 33 significa que a diminuição da sinalização do peptídeo foi devido à conjugação na 33^ lisina; e 6, 7 significa que a diminuição da sinalização de peptídeo é devido à conjugação na 6², ou na 7², ou ambas as lisinas. Os dados da Figura 1 sugeriram que não apenas a extensão da conjugação em cada local era geralmente mais elevada para os conjugados preparados em DMSO em comparação com a solução aquosa, mas também havia mais sítios de conjugação em DMSO. Esses sítios de conjugação

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66/73 adicionais incluem as 29², 30², 31² e 32² lisinas, que eram apenas lisinas localizadas em epítopos de peptídeos de células T humanas comuns previamente identificadas (Ver Raju et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:3207-3214, located in peptide 411-430 and peptide 431-450 of CRM197 sequence). Resultados semelhantes foram observados com outros sorotipos testados.

Tabela 2: Sequência de aminoácidos de CRM197

Aminoácido

Sequência de aminoácidos

1-535

GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS (SEQ ID NO: 1)

Exemplo 5: Estudos de imunogenicidade de camundongos comparando conjugados de sorotipo 3 PS-CRM197 preparados em solução aquosa versus

DMSO [00191] Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita

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67/73 conformidade com as recomendações do Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), MRL, West Point, PA.

[00192] Camundongos CD1 fêmeas com oito semanas de idade foram alojados em gaiolas microisoladoras (n = 10/gaiola) nas instalações para animais em MRL, West Point, PA. Comida e água estavam disponíveis ad libitum. Os camundongos (n = 10/grupo) foram imunizados por via intramuscular (IM) com conjugados de ST3-CRM197 (0,4 pg de polissacarídeo de ST3), formulados com adjuvante de fosfato de alumínio (APA) como descrito na Tabela 3. Os animais de controle negativo receberam apenas APA. As imunizações foram realizadas nos dias 0, 14 e 28. O sangue foi coletado em tubos separadores de soro (BD, Franklin Lakes, NJ) através da veia da cauda nos dias 6 e 34.

Tabela 3: Braços de estudo de camundongo comparando conjugados de sorotipo de 3 PS-CRM197 preparados em solução aquosa versus solução de DMSO.

n° do Braç 0	Braço	Descrição do conjugado	Descrição da formulação
1	APA	Controle, nenhum conjugado usado	250 pg/mL de APA, Lhistidina 20 mM, pH 5,8 e NaCI 150 mM com 0,2% m/v de PS-20
2	ST3- CRMi97(aquoso)/APA	Conjugado monovalente de ST3CRM197 (Lote n° 1 na Tabela 1) preparado por aminação redutiva	0,4 pg de ST3-CRM197, 250 pg/mL de APA, Lhistidina 20 mM, pH 5,8 e NaCI 150 mM com 0,2% m/v de PS-20

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		em solução aquosa como descrito no Exemplo 2
3	ST3- CRMi9₇(DMSO)/APA	Conjugado monovalente de ST3CRM197 (Lote n° 4 na Tabela 1) preparado por aminação redutiva em DMSO como descrito no Exemplo 3	0,4 pg de ST3-CRM197, 250 pg/mL de APA, Lhistidina 20 mM, pH 5,8 e NaCI 150 mM com 0,2% m/v de PS-20

Ensaios de imunogenicidade eletroquimioluminescentes (ECL) [00193] As respostas de anticorpo de camundongo foram medidas em ensaios eletroquimioluminescentes multiplexados de 96 poços, como descrito anteriormente com ligeiras modificações. Ver Marchese etal., 2009, Clin Vaccine Immunol 16(3):387-96; Skinner et al., 2011, Vaccine 29(48):8870-6; e CaroAguilar et al., 2017 Vaccine 35(6):865-72. Resumidamente, após o teste de incubação de soro durante 1 hora em placas Meso-Scale Discovery (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) e lavagem, 25 pl de uma IgG anti-camundongo de cabra marcada com tag-Sulfo a 2 pg/ml (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) foi adicionada a cada poço. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente enquanto eram agitadas e depois processadas como descrito anteriormente e lidas em um MESO Sector S600.

[00194] A titulação de ECL foi calculada como o recíproco da diluição interpolada linearmente correspondente ao valor de corte (sinal médio geométrico de ECL de polissacarídeo pneumocócico de soros de camundongo agrupados de controle positivo pré-determinados). A interpolação foi realizada usando escalonamento logarítmico para ECL e a diluição. A titulação foi então

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69/73 obtida por transformação inversa da diluição linearmente interpolada. As titulações foram extrapoladas para amostras fora da faixa de diluição estudado de 100 a 1.562.500, com base na extrapolação linear (na escala de log-log) usando o intercepto e o coeficiente angular dos últimos 3 pontos de dados de ECL para a curva de amostra completamente acima da linha de corte ou usando o intercepto e o coeficiente angular dos primeiros 2 pontos de dados de ECL para a curva de amostra completamente abaixo da linha de corte. A titulação foi então obtida por transformação inversa da diluição linearmente extrapolada.

Ensaio de morte opsonofagocítica (OPA) [00195] Os ensaios de morte opsonofagocítica (OPA) do sorotipo 3 pneumocócico foram realizados como descrito anteriormente com ligeiras modificações (Caro-Aguilar et al., 2017 Vaccine 35(6):865-72; e Burton et al., 2006, Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9). Após incubação dos soros, bactérias, complemento e células HL-60, 10 pL da reação opsonofagocítica foram transferidos para um poço individual em uma placa de filtro de 96 poços da Millipore contendo 200 pL/poço de água esterilizada. A placa foi filtrada por vácuo e 100 pL de caldo de extrato de levedura Todd Hewett (THYE, Teknova) foram adicionados. O meio foi filtrado e a placa úmida foi colocada em um saco plástico selado de um dia para o outro a 27°C. Os filtros de placa foram então corados com 100 pL/poço de uma solução de Coomassie blue a 0,1% (Bio-Rad, Hercules, CA). O produto corado foi filtrado através da placa, as colônias foram descoradas com solução de descoloração de Coomassie (Bio-Rad) e filtradas a vácuo novamente até secar. As colônias bacterianas coradas foram contadas em um leitor CTL Immunospot (Shaker Heights, OH). A titulação de OPK foi definida como o recíproco da diluição do soro com pelo menos 50% de morte, comparado ao crescimento médio nos poços de controle do complemento (sem controle de soro) e foi calculada interpolando-se linearmente entre as diluições consecutivas

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70/73 cujos sinais suportam 50% de morte.

[00196] Os resultados da pré-imunização e após a dose 3 estão ilustrados na Figura 2 e na Tabela 4 para imunogencidade de ECL, e na Figura 3 para OPA. Ambos os conjugados preparados por processos usando as soluções aquosas e de DMSO são imunogênicos e fornecem atividades de morte funcional contra as bactérias. Curiosamente, o conjugado preparado pelo processo usando a solução de DMSO gerou respostas de imunogenicidade de ECL e de OPA mais altas do que o conjugado preparado usando solução aquosa. A diferença de imunogenicidade de ECL é estatisticamente significativa. A razão de GMT do braço 3 em relação ao Braço 2 é de 3,41 (com intervalo de confiança de 95% inferior e superior de 1,26 e 9,26).

Tabela 4: Resultados de imunogenicidade de ECL após a dose 3 dos braços de estudo de camundongo comparando conjugados de sorotipo 3 PS-CRM197 preparados em solução aquosa versus solução de DMSO.

n° do Braço	Braço	Titulação média geométrica, GMT	Intervalo de confiança inferior a 95%	Intervalo de confiança superior a 95%
1	APA	368	227	596
2	ST3- CRMi97(aquoso)/APA	355.207	187.905	671.466
3	ST3-CRMi9₇(DMSO)/APA	1.211.654	719.297	2.041.028

Exemplo 6: Estudos de imunogenicidade em adultos humanos comparando conjugados pneumocócicos de polissacarídeos-proteína preparados com aminação redutiva em solução aquosa versus DMSO [00197] A imunogenicidade e a segurança de duas vacinas conjugadas pneumocócicas 15-valente (PCV15) em adultos saudáveis, com 50 anos de idade, não sujeitos a vacinas pneumocócicas, são descritas neste exemplo.

Modelo de teste

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71/73 [00198] Um estudo randomizado, duplo-cego, de múltiplos sítios foi realizado para comparar a segurança, tolerabilidade e imunogenicidade de uma dose única de 2 diferentes formulações de PCV15 (PCV15-A e PCV15-B) e Prevnar 13™ (Vacina Pneumocócica de conjugado 13-valente [Proteína CRM197 de Difteria], Wyeth Pharmaceuticals Inc., uma subsidiária da Pfizer Inc., Filadélfia, PA, EUA) em adultos com 50 anos de idade ou mais com boa saúde (qualquer doença crônica subjacente deve ser documentada como condição estável), a ser realizada em conformidade com as Boas Práticas Clínicas.

[00199] Um total de 690 indivíduos saudáveis, não sujeitos a vacinas pneumocócicas, com 50 anos de idade ou mais, foram incluídos e randomizados em três diferentes grupos de vacinação: Prevnar 13™, PCV15-A e PCV15-B com a razão de 1:1:1. A randomização foi estratificada pela idade no início do estudo (50 a 64 anos, 65 a 74 anos e >75 anos).

[00200] PCV15 continha uma dose de 2 pg/0,5mL de cada um dos seguintes sorotipos de polissacarídeos pneumocócicos conjugados a CRM197 (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 33F), 4 pg/0,5mL de dose do polissacarídeo pneumocócico do sorotipo 6B conjugado a CRM197,125 pg/0,5mL de dose de adjuvante de fosfato de alumínio, L-histidina 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 5,8. O PCV15-A foi formulado com 0,2% m/v de P188. O PCV15-B foi formulado com 0,1% m/v de PS-20.

[00201] Para PCV15-A, todos os 15 sorotipos de polissacarídeos (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F) foram conjugados com CRM 197 usando aminação redutiva em solução aquosa como descrito no Exemplo

2. Os atributos para alguns destes conjugados (Materiais do Lote η² 1 de Conjugado) estão listados na Tabela 1.

[00202] PCV15-B, sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F foram conjugados com CRM197 usando aminação redutiva em DMSO descrita no

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Exemplo 3. Os atributos para estes conjugados (Materiais do Lote n² 2 de Conjugado) estão listados na Tabela 1. Os conjugados para os restantes sorotipos (1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F e 33F) são os mesmos conjugados que foram usados em PCV15-A.

[00203] Ambas as formulações de PCV15 tinham perfis de segurança geralmente comparáveis aos de Prevnar 13™ com base na avaliação de segurança cumulativa (dados não mostrados). Os IgG GMCs e OPA GMTs específicos para sorotipo foram medidos no dia 30. (Resultados de OPA não incluídos).

Resultados [00204] As concentrações médias geométricas de IgG (GMCs) e os intervalos de confiança (Cl) estão resumidos na Tabela 6. Os conjugados do sorotipo 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F em PCV15-A e PCV15-B foram feitos com diferentes processos de conjugação como descrito acima. Consistente com os resultados mostrados na Tabela 4, as respostas de imunogenicidade para cada um dos sorotipos mostrados na Tabela 6 foram melhoradas quando os sorotipos de polissacarídeos foram conjugados com CRM197 em DMSO. Os GMCs para os sorotipos 18C, 19A, 19F e 23F no PCV15-B foram significativamente maiores do que aqueles no PCV15-A (alfa de 2 lados = 0,05). Estes dados demonstram fortemente a vantagem de conjugar em DMSO para melhorar a imunogenicidade. Esta descoberta não foi previamente demonstrada para vacinas pneumocócicas ou outras vacinas conjugadas.

Tabela 6: Resumo das respostas de anticorpos IgG de formulação de PCV15A e PCV15-B para os sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F. Os conjugados destes sorotipos foram feitos usando aminação redutiva em solução aquosa (PCV15-A) ou por aminação redutiva em DMSO (PCV15-B).

Sorotip

PCV15-A (N = 231),

PCV15-B (N = 231),

Razão de GMC

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73/73

os	GMC* (Dia 30)	GMC* (Dia 30)	estimada* [PCV15- B/PCV15-A]
n	Resposta estimada	n	Resposta estimada	(95% de Cl) *
6A	217	3,74	217	4,93	1,32 (0,96, 1,81)
6B	217	3,69	217	4,95	1,34 (0,98, 1,85)
7F	217	4,09	217	4,53	1,11 (0,86, 1,43)
18C	217	6,61	217	10,99	1,66 (1,27, 2,18)
19A	217	8,77	217	13,83	1,58 (1,23, 2,02)
19F	217	4,11	217	6,80	1,66 (1,26, 2,17)
23F	217	3,92	217	5,53	1,41 (1,04, 1,91)

+ GMCs estimados, razão de GMC e Cl de 95% são obtidos a partir de um modelo de cLDA.

N = Número de indivíduos randomizados e vacinados.

n = Número de indivíduos com resultados de sorologia para o dia 30 após a vacinação, contribuindo para a análise.

GMC = Concentração Média Geométrica.

Cl = Intervalo de confiança.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende polissacarídeo de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através da qual o polissacarídeo é conjugado à proteína carreadora é em um solvente aprótico.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos

1, 3, 4, 5, 9V, 11A, 12F e 14 de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico.
3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos

2, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico.
4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 3 e 18C de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico.
5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos do sorotipo 3 de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente aprótico.
6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos do sorotipo 18C de S. pneumoniae são conjugados a uma proteína carreadora em um solvente

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2/10 aprótico.
7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda polissacarídeo de um ou mais dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 10A, 15B, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através da qual o polissacarídeo é conjugado à proteína carreadora é em um solvente aprótico.
8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a reação de conjugação é aminação redutiva.
9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o solvente aprótico é dimetilsulfóxido (DMSO).
10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora é

CRM197.
11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que os conjugados preparados em DMSO têm um valor de perda de lisina maior que 5,0.
12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que os conjugados preparados em DMSO têm um valor de perda de lisina inclusive entre 7,0 e 18,0.
13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende polissacarídeo dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através da qual o polissacarídeo dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F ou 23F de S. pneumoniae

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3/10 é conjugado à proteína carreadora é em um solvente aprótico.
14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende ainda polissacarídeos de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, em que a reação de conjugação através da qual o polissacarídeo de sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35B, 35F ou 38 de S. pneumoniae é conjugado à proteína carreadora é em um solvente aquoso.
15. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que entre 35-100% dos sorotipos são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes são preparados sob condições aquosas.
16. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que consiste essencialmente em polissacarídeo dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae conjugados à proteína carreadora CRM197, em que a reação de conjugação para os sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F de S. pneumoniae é em um solvente aprótico, em que o solvente aprótico é DMSO, e a reação de conjugação para os sorotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F e 33F de S. pneumoniae é em um solvente aquoso, e compreendendo ainda cerca de 0,2% p/v de PS-20.
17. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a razão do polissacarídeo para proteína carreadora no conjugado (p/p) é entre 0,5 e 3,0.
18. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das

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4/10 reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante imunogênico, um tampão e/ou um tensoativo.
19. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de ser formulada para administração parenteral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutânea, intraperitoneal, epidérmica, intra-arterial, intra-respiratória ou oral.
20. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de ser formulada como frascos de dose única, frascos de múltiplas doses ou como seringas preenchidas.
21. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de ser formulada como um sistema de liberação controlada.
22. Uso de um polissacarídeo de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição imunogênica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo humano.
23. Uso de um polissacarídeo de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae conjugados a uma proteína carreadora, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição imunogênica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 para a prevenção e/ou redução de síndromes clínicas primárias causadas porS. pneumoniae.

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24. Uso de conjugados de polissacarídeo-proteína compreendendo polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae de um primeiro conjunto de dois ou mais sorotipos pneumocócicos conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição imunogênica para fornecer uma resposta imune intensificada a um indivíduo animal, em que os dois ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína do primeiro conjunto são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO.
25. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica compreende ainda conjugados de polissacarídeoproteína compreendendo polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae de um segundo conjunto de dois ou mais sorotipos pneumocócicos conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras, em que os dois ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína do segundo conjunto são preparados usando aminação redutiva sob condições aquosas, em que os sorotipos do segundo conjunto são diferentes dos sorotipos no primeiro conjunto.
26. Uso de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que os sorotipos pneumocócicos são selecionados dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 33F, 34, 35B, 35F, e 38.
27. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que os conjugados de polissacarídeo-proteína do sorotipo 3 ou 18C são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO.
28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que os conjugados de polissacarídeo-proteína do primeiro conjunto de sorotipos pneumocócicos são selecionados dos sorotipos

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6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F.
29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que os conjugados de polissacarídeo-proteína dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e conjugados de polissacarídeo-proteína de um segundo conjunto de sorotipos são preparados sob condições aquosas.
30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica consiste essencialmente em polissacarídeos dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F de S. pneumoniae conjugados à proteína carreadora CRM197, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína dos sorotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F e 23F são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e conjugados de polissacarídeo-proteína dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F e 33F são preparados sob condições aquosas.
31. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os conjugados de polissacarídeo-proteína entre 35-100% dos sorotipos na composição imunogênica são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes são preparados sob condições aquosas.
32. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os conjugados de polissacarídeo-proteína entre 45-80% dos sorotipos são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes são preparados em condições aquosas.
33. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os conjugados de polissacarídeo-proteína entre 60-100% dos sorotipos são preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO e os conjugados de polissacarídeo-proteína restantes são preparados sob condições aquosas.

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34. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 33, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em Complexo de Proteína da Membrana Externa (OMPC), toxóide de tétano, toxóide de difteria, proteína D e CRM197.
35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é CRM197.
36. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 35, caracterizado pelo fato de que os conjugados preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO têm um valor de perda de lisina maior que 5,0.
37. Uso de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que os conjugados preparados usando aminação redutiva sob condições de DMSO têm um valor de perda de lisina entre 7,0 e 18 inclusive.
38. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 37, caracterizado pelo fato de que a referida resposta imune intensificada é medida por Titulação Média Geométrica.
39. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 38, caracterizado pelo fato de que a resposta imune intensificada para um sorotipo pneumocócico é 10% maior ou mais em comparação com o conjugado de polissacarídeo-proteína do mesmo sorotipo pneumocócico preparado sob condições aquosas.
40. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 39, caracterizado pelo fato de que o indivíduo animal é um indivíduo humano de 50 anos de idade ou mais.
41. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 39, caracterizado pelo fato de que o indivíduo animal é um indivíduo humano de 2 anos de idade ou menos.
42. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 39,

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8/10 caracterizado pelo fato de que o indivíduo animal é um humano imunocomprometido.
43. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a resposta imune intensificada é medida relativamente a um animal de controle que recebe uma composição imunogênica em que um ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína do primeiro conjunto são preparados usando aminação redutiva em condições aquosas.
44. Uso de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o animal de controle é um camundongo.
45. Uso de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o animal de controle é um humano.
46. Método para preparar um conjugado pneumocócico de polissacarídeoproteína por aminação redutiva, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) reagir um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae selecionado dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 com uma quantidade de um oxidante para formar um polissacarídeo ativado com um nível de ativação de 0,05 a 0,22; e

b) reagir o polissacarídeo ativado com uma proteína carreadora em um solvente aprótico para formar um conjugado de polissacarídeo-proteína;

em que o conjugado de polissacarídeo-proteína resultante tem um valor de perda de lisina maior que 5,0.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o nível de ativação é de 0,09 a 0,22.
48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o oxidante é periodato.
49. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de

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9/10 que a etapa a) compreende ainda uma etapa de extinção por adição de um agente de extinção.
50. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a reação na etapa b) é na presença de um agente redutor.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é um sal de cianoborohidreto.
52. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende ainda uma etapa de proteção.
53. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a reação na etapa b) é na presença de níquel.
54. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em toxóide de tétano, toxóide de difteria e CRM197.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é CRM197.
56. Método de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que o nível de ativação é medido por derivatização de aldeídos no polissacarídeo com tiossemicarbazida.
57. Método para determinar o nível de aldeído em um polissacarídeo ativado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a) derivar o polissacarídeo ativado para formar um polissacarídeo derivado, reagindo com um agente de derivatização até a conclusão;

b) isolar o polissacarídeo derivado por cromatografia de exclusão de tamanho de alta eficiência;

c) quantificar a absorbância UV do polissacarídeo derivado, em que o agente de derivatização é selecionado do grupo que consiste em tiossemicarbazida, análogos estruturais de tiossemicarbazida, hidrazidas,

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10/10 hidrazina, semicarbazida, análogos estruturais de semicarbazida, compostos amino-óxi ou aminas aromáticas.
58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o agente de derivatização é tiossemicarbazida.
59. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a quantificação na etapa c) é por comparação a um padrão derivado.
60. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a quantificação na etapa c) é medida em relação ao coeficiente de extinção predeterminado.
61. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.