BR112020004396A2 - polissacarídeos pneumocócicos e uso dos mesmos em conjugados imunogênicos polissacarídeo-proteína carreadora - Google Patents

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Abstract

A presente invenção fornece polissacarídeos capsulares de sorotipos de Streptococcus pneumoniae identificados com o uso de RMN. A presente invenção fornece, adicionalmente, conjugados de polissacarídeo-proteína em que polissacarídeos capsulares de um ou mais dentre esses sorotipos são conjugados a uma proteína carreadora, tal como CRM197. Os conjugados de polissacarídeo-proteína de um ou mais dentre esses sorotipos podem ser incluídos em vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes que têm polissacarídeos de múltiplos sorotipos adicionais de Steptococcus pneumoniae.

Description

POLISSACARÍDEOS PNEUMOCÓCICOS E USO DOS MESMOS EM CONJUGADOS IMUNOGÊNICOS POLISSACARÍDEO-PROTEÍNA CARREADORA CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção fornece polissacarídeos capsulares purificados de sorotipos 23A e 23B de Streptococcus pneumoniae, e conjugados de polissacarídeo-proteína que têm polissacarídeos de um ou mais dentre esses sorotipos. Os conjugados de polissacarídeo-proteína de um ou mais dentre esses sorotipos podem ser incluídos em vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Streptococcus pneumoniae, um exemplo de uma bactéria encapsulada, é uma causa significativa de doença grave no mundo todo. Em 1997, o Centro de Controle e Prevenção de doença (CDC) estimou que havia
3.000 casos de meningite pneumocócica, 50.000 casos de bacteremia pneumocócica, 7.000.000 casos de otite média pneumocócica e 500.000 casos de pneumonia pneumocócica anualmente nos Estados Unidos. Consulte Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR- 8): 1-13. Além disso, as complicações dessas doenças podem ser significativas com alguns estudos reportando até 8% de mortalidade e 25% de sequela neurológica com meningite pneumocócica. Consulte Arditi et al., 1998, Pediatrics 102: 1.087-97.
[003] As vacinas de polissacarídeo pneumocócico multivalentes que foram licenciadas por muitos anos provaram ser valiosas na prevenção de doença pneumocócica em adultos, particularmente, nos idosos e aqueles em alto risco. Entretanto, lactentes e crianças com pouca idade respondem mal a polissacarídeos pneumocócicos não conjugados. Os polissacarídeos bacterianos são imunógenos independentes de célula T, provocando pouca ou nenhuma resposta em lactentes. A conjugação química de um imunógeno de polissacarídeo bacteriano com uma proteína carreadora converte a resposta imunológica em uma resposta dependente de célula T em lactentes. O toxoide diftérico (DTx, uma versão quimicamente detoxificada de DT) e CRM197 foram descritos como proteínas carreadoras para imunógenos de polissacarídeo bacteriano devido à presença de epítopos estimulantes de célula T em suas sequências de aminoácido.
[004] A vacina pneumocócica conjugada, Prevnar®, contendo os 7 sorotipos mais frequentemente isolados (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que causam doença pneumocócica invasiva em crianças com pouca idade e lactentes à época, foi licenciada pela primeira vez nos Estados Unidos em fevereiro de 2000. Após o uso universal de Prevnar® nos Estados Unidos, houve uma redução significativa em doença pneumocócica invasiva em crianças devido aos sorotipos presentes em Prevnar®. Consulte Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36): 893-7. Entretanto, há limitações em abrangência de sorotipo com Prevnar® em determinadas regiões do mundo e alguma evidência de determinados sorotipos emergentes nos Estados Unidos (por exemplo, 19A e outros). Consulte O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159:634- 44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348:1.737-46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354:1.455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196:1.346-54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48:S181-S189.
[005] Prevnar 13® é uma vacina de conjugado de polissacarídeo- pneumocócico proteína 13-valente que inclui os sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Consulte, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente nº US 2006/0228380 A1, Prymula et al., 2006, Lancet 367:740-748 e Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal
Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, apresentada na 48ª Reunião Anual de ICAAC/ISDA 46ª Reunião Anual, Washington DC, 25 a 28 de outubro de 2008. Consulte também Dagan et al., 1998, Infect Immun. 66:2.093-2.098 e Fattom, 1999, Vaccine 17:126.
[006] S. pneumoniae foi categorizada em mais de noventa sorotipos com base na estrutura do polissacarídeo capsular. Uma lista de estruturas conhecidas de polissacarídeo capsular de pneumococos é fornecida em Geno, 2015, Clinical Microbiology Reviews 28:871-899. O sorotipo 23A foi descrito na patente italiana nº IT 1418572 B1, mas nenhuma estrutura foi fornecida.
[007] As vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes atuais têm sido eficazes na redução da incidência de doença pneumocócica associada àqueles sorotipos presentes nas vacinas, por exemplo, 23F. Entretanto, a prevalência dos sorotipos que expressam pneumococos não presentes na vacina tem aumentado. Ademais, as vacinas pneumocócicas conjugadas que incluem 23F não fornecem proteção cruzada a sorotipos 23A e 23B. Consequentemente, há uma necessidade de identificar e caracterizar sorotipos pneumocócicos emergentes para a inclusão em futuras vacinas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A presente invenção fornece polissacarídeos capsulares purificados de sorotipos 23A e 23B de Streptococcus pneumoniae e conjugados de polissacarídeo e proteína que têm esses sorotipos. A presente invenção se baseia, em parte, na identificação estrutural de polissacarídeos capsulares a partir desses sorotipos.
[009] Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção fornece um polissacarídeo com uma dentre as seguintes unidades de repetição:
[0010] Um polissacarídeo de sorotipo de Streptococcus pneumoniae 23A pode ser representado por em que n representa o número de unidades de repetição.
[0011] Um polissacarídeo de sorotipo 23B de Streptococcus pneumoniae pode ser representado por em que n representa o número de unidades de repetição.
[0012] Em certas modalidades, o polissacarídeo tem entre 10 e 5.000 unidades de repetição. Em certos aspectos, o polissacarídeo tem entre 50 e
3.000, 100 e 2.500 ou 100 a 2.000 unidades de repetição.
[0013] Em certas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de 50 kDa a 4.000 kDa. Em certos aspectos, o polissacarídeo tem um peso molecular de 80 kDa a 2.000 kDa ou 100 kDa a 1.500 kDa.
[0014] A presente invenção fornece adicionalmente polissacarídeos ativados produzidos a partir de qualquer uma das modalidades acima em que o polissacarídeo é ativado com um reagente químico para produzir grupos reativos para conjugação com um ligante ou proteína carreadora. Em certas modalidades, a ativação de polissacarídeo de sorotipo 23A de S. pneumoniae ocorre no α-Rhap ou β-Glcp. Em certas modalidades, a ativação de polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniae ocorre no β-Glcp ou β-Rhap. Em um aspecto desta modalidade, a ativação de polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniae ocorre em mais de 90%, 95% ou 99% no β-Rhap. Em certas modalidades, o polissacarídeo é ativado com periodato. Em certos aspectos desta modalidade, a ativação do polissacarídeo de sorotipo 23A ocorre na 2ª ou 3ª posição de carbono de α-Rhap ou β-Glcp ou a ativação do polissacarídeo de sorotipo 23B ocorre na 2ª ou 3ª posição de carbono de β-Glcp ou β-Rhap. Em um subaspecto deste aspecto, a ativação de periodato do polissacarídeo de sorotipo 23B ocorre em mais de 90%, 95% ou 99% no β-Rhap.
[0015] A presente invenção fornece adicionalmente conjugados de polissacarídeo-proteína em que polissacarídeos ou polissacarídeos ativados, conforme fornecidos acima, são conjugados com uma proteína carreadora. Em certos aspectos, a proteína carreadora é selecionada a partir de CRM197, fragmento B de toxina diftérica (DTFB), DTFB C8, toxoide diftérico (DT), toxoide tetânico (TT), fragmento C de TT, toxoide pertussis, toxoide colérico, E. coli LT, E. coli ST e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Em um aspecto específico, a proteína carreadora é CRM197.
[0016] Em certos aspectos, os conjugados de polissacarídeo-proteína são preparados com o uso de procedimento químico de aminação redutiva sob condições aquosas ou em um solvente aprótico, tal como dimetilsulfóxido (DMSO). Em um aspecto específico, os conjugados de polissacarídeo-proteína são preparados com o uso de procedimento químico de aminação redutiva em DMSO.
[0017] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende polissacarídeos não conjugados ou conjugados de polissacarídeo-proteína a partir de um ou mais dentre os sorotipos 23A e 23B de Streptococcus pneumoniae, e polissacarídeos não conjugados ou conjugados de polissacarídeo-proteína a partir de um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18B, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23F, 24B, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de Streptococcus pneumoniae. Em uma submodalidade, uma composição imunogênica multivalente compreende polissacarídeos não conjugados ou conjugados de polissacarídeo-proteína carreadora, mas não ambos. Em uma submodalidade, uma composição imunogênica multivalente compreende uma mistura de polissacarídeos não conjugados ou conjugados de polissacarídeo-proteína carreadora. Em determinadas submodalidades, uma composição imunogênica multivalente da invenção tem até 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90 sorotipos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0018] As Figuras 1A e 1B são representações gráficas da estrutura de unidade de repetição de polissacarídeos de sorotipo 23A (A) e 23B (B) de S. pneumoniae. Os sítios de ativação disponíveis para periodato são mostrados com setas. Para um polissacarídeo ativado, nem todos os sítios de ativação de unidade de repetição são ativados. Isso reflete a possível ativação do polissacarídeo de sorotipo 23B na 2ª ou 3ª posição de carbono de β-Rhap. 1
[0019] As Figuras 2A e 2B retratam o espectro de RMN de H unidimensional de 600 MHz do polissacarídeo capsular de sorotipo 23A (A) e 23B (B) de S. pneumoniae em óxido de deutério (D2O) a 50°C. Os sinais que surgem a partir de padrões internos (DMSO e DSS-d6), água residual (HOD) e outros componentes residuais do processo de purificação; etanol (EtOH), isopropanol (IPA) e acetato estão marcados. Os sinais secundários marcados por * são devido a resíduos de parede celular de S. pneumoniae, tais como C-polissacarídeo e/ou peptideoglicanos.
[0020] As Figuras 3A e 3B retratam a região de identidade de RMN de 1H unidimensional (1D) a ser usada para identificações de sorotipo de S. pneumoniae de sorotipo 23A (A) e 23B (B). As posições de sinal de cada próton anomérico da unidade de repetição a partir de cada resíduo de monossacarídeo são marcadas.
[0021] As Figuras 4A e 4B retratam espectro parcial de RMN de correlação de múltiplas ligações 1H-13C bidimensional (2D) de sorotipo 23A (A) e 23B (B) de S. pneumoniae que estabelece ligações covalentes entre resíduos de açúcar na estrutura de repetição. As correlações que estabelecem ligações glicosídicas são identificadas na figura.
[0022] As Figuras 5A e 5B retratam estabelecimento de ligações fosfodiéster na unidade de repetição de polissacarídeo capsular de sorotipo 23A (A) e 23B (B) de S. pneumoniae.
[0023] Figura 6: Espectro de RMN de 1H unidimensional de 600 MHz de polissacarídeo capsular oxidado e derivatizado de TSC de sorotipo 23B de S. pneumoniae em óxido de deutério (D2O) a 25°C.
[0024] O inserto é uma expansão dos sinais de imina formados por derivatização com tiossemicarbazida.
[0025] Figura 7: 2D TOCSY de espectro de polissacarídeo capsular oxidado e derivatizado de TSC de sorotipo 23B de S. pneumoniae. Os sinais de correlação entre picos de 7,36 a 7,40 ppm com picos de CH3 de ramnose (~1,32 ppm) são circulados. O inserto é a estrutura para polissacarídeo capsular de sorotipo 23B de S. pneumoniae, o sítio de ativação de periodato foi indicado com uma seta.
[0026] Figura 8A e 8B: 2D gCOSY (A) e NOESY (B) de espectro de polissacarídeo capsular oxidado e derivatizado de TSC de sorotipo 23B de S. pneumoniae.
[0027] Figura 9: Títulos de anticorpo IgG de ELISA (pós-dose 2) para coelhos imunizados com sorotipos de polissacarídeo monovalentes de S. pneumoniae conjugados com CRM197 e formulados com adjuvante fosfato de alumínio (APA). As barras de erro representam o intervalo de confiança de + 95% de média geométrica.
[0028] Figura 10: Títulos de OPA específicos de sorotipo (pós-dose 2) para coelhos imunizados com sorotipos de polissacarídeo monovalentes de S. pneumoniae conjugados com CRM197 e formulados com adjuvante fosfato de alumínio (APA). As barras de erro representam o intervalo de confiança de + 95% de média geométrica.
[0029] Figuras 11A e 11B: A. Títulos de anticorpo IgG PnPs de 23A de ELISA; e B. Títulos de OPA de polissacarídeo de sorotipo 23A de S. pneumoniae (pré- imunização, pós-dose 1 (PD1) e pós-dose 2 (PD2)) para coelhos imunizados com sorotipos 23A, 23B ou 23F de polissacarídeo monovalentes de S. pneumoniae conjugados com CRM197 e formulados com adjuvante fosfato de alumínio (APA). As barras de erro representam o intervalo de confiança de + 95% de média geométrica.
[0030] Figuras 12A e 12B: A. Títulos de anticorpo IgG PnPs de 23B de ELISA; e B. Títulos de OPA de sorotipo 23B de polissacarídeo de S. pneumoniae (pré- imunização, pós-dose 1 (PD1) e pós-dose 2 (PD2)) para coelhos imunizados com sorotipos 23A, 23B ou 23F de polissacarídeo monovalentes de S. pneumoniae conjugados com CRM197 e formulados com adjuvante fosfato de alumínio (APA). As barras de erro representam o intervalo de confiança de + 95% de média geométrica.
[0031] Figuras 13A e 13B: A. Títulos de anticorpo IgG PnPs de 23F de ELISA; e B. Títulos de OPA de sorotipo 23F de polissacarídeo de S. pneumoniae (pré- imunização, pós-dose 1 (PD1) e pós-dose 2 (PD2)) para coelhos imunizados com sorotipos 23A, 23B ou 23F de polissacarídeo monovalentes de S. pneumoniae conjugados com CRM197 e formulados com adjuvante fosfato de alumínio (APA). As barras de erro representam o intervalo de confiança de + 95% de média geométrica.
[0032] A Figura 14 mostra pré-imunização específica de sorotipo (sorotipos 16F, 23A, 23B, 24F, 31 de S. pneumoniae), títulos de anticorpo de média geométrica de PD1 e PD2 para coelhos imunizados com uma vacina pneumocócica conjugada multivalente (2 μg/PnPs). As barras de erro representam 2 erros padrão do título de média geométrica de cada sorotipo (eixo geométrico X).
[0033] A Figura 15 mostra pré-imunização específica de sorotipo (sorotipos 16F, 23A, 23B, 24F, 31 de S. pneumoniae), títulos de diluição de OPA de PD1 e PD2 para coelhos imunizados com uma vacina pneumocócica conjugada multivalente (2 μg/PnPs). Os símbolos indicam os títulos individuais e as barras de erro representam os intervalos de confiança (CIs) de 95% dos títulos de média geométrica (GMTs).* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, ns=não significativo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0034] A presente invenção se baseia, em parte, na identificação de estruturas inovadoras de polissacarídeo pneumocócico por meio de tecnologia de RMN. Acredita-se que as estruturas fornecidas na presente invenção sejam a primeira identificação ou a primeira identificação correta desses sorotipos de S. pneumoniae 23A e 23B.
[0035] Os polissacarídeos de sorotipos 23A e 23B de S. pneumoniae foram produzidos a partir de suas respectivas cepas e purificados. Os polissacarídeos produzidos (e purificados) foram usados para gerar conjugados de Ps-CRM197 individuais. Os sorotipos 23A e 23B de S. pneumoniae têm uma estrutura de polissacarídeo única, que resulta em um processo de produção de conjugado. Demonstrou-se que os conjugados resultantes são imunogênicos em estudos com animais.
[0036] Conforme usado na presente invenção, o termo "polissacarídeo" (Ps) se destina a incluir qualquer elemento de sacarídeo antigênico (ou unidade antigênica) comumente usado nas técnicas de vacina imunológica e bacteriana, incluindo, mas sem limitação, um "sacarídeo", um "oligossacarídeo", um "polissacarídeo", um "lipossacarídeo", um "lipo-oligossacarídeo (LOS)", um "lipopolissacarídeo (LPS)", um "glicosilato", um "glicoconjugado", um “polissacarídeo ou oligossacarídeo derivatizado ou ativado", e similares. A menos que especificado de outro modo, a nomenclatura de polissacarídeo, usada na presente invenção, segue as Recomendações da IUB-IUPAC Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBM) 1980. Consulte JCBN, 1982, J. Biol. Chem. 257:3.352-3.354.
[0037] Conforme usado na presente invenção, "composição imunogênica" se refere a uma composição contendo um antígeno, tal como um polissacarídeo capsular bacteriano ou um conjugado de polissacarídeo-proteína, que tem a capacidade de provocar uma resposta imunológica em um hospedeiro, tal como um mamífero, mediada de modo humoral ou celular, ou ambos. A composição imunogênica pode servir para sensibilizar o hospedeiro pela apresentação do antígeno em associação a moléculas de MHC em uma superfície celular. Além disso, anticorpos ou células T específicas de antígeno podem ser gerados para permitir a proteção futura de um hospedeiro imunizado. As composições imunogênicas podem proteger o hospedeiro, desse modo, contra infecção pelas bactérias, reduzir severidade ou podem proteger o hospedeiro de morte devido à infecção bacteriana. As composições imunogênicas também podem ser usadas para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais, que podem ser usados para conferir imunidade passiva a um indivíduo. As composições imunogênicas também podem ser usadas para gerar anticorpos que são funcionais, conforme medido pela eliminação de bactérias em um modelo de eficácia em animal ou através de um ensaio de eliminação opsonofagocítica.
[0038] Conforme usado na presente invenção, o termo "isolado", em relação a um polissacarídeo, refere-se ao isolamento de polissacarídeo capsular específico de sorotipo de S. pneumoniae a partir de polissacarídeo purificado com o uso de técnicas de purificação conhecidas na arte, incluindo o uso de centrifugação, filtração profunda, precipitação, ultrafiltração, tratamento com carbono ativado, diafiltração e/ou cromatografia de coluna. De modo geral, um polissacarídeo isolado se refere à remoção parcial de proteínas, ácidos nucleicos e polissacarídeo endógeno não específico (C-polissacarídeo). O polissacarídeo isolado contém menos do que 10%, 8%, 6%, 4% ou 2% de impurezas de proteína e/ou ácidos nucleicos. O polissacarídeo isolado contém menos do que 20% de C- polissacarídeo em relação a polissacarídeos tipo-específicos.
[0039] Conforme usado na presente invenção, o termo "purificado", em relação a um polissacarídeo capsular bacteriano, se refere à purificação do polissacarídeo a partir de lisado celular através de meios, tais como centrifugação, precipitação e ultrafiltração. De modo geral, um polissacarídeo purificado se refere à remoção de resíduos de célula e DNA.
[0040] Conforme usado na presente invenção, o termo "Pm" se refere ao peso molecular ponderal médio e é tipicamente expresso em Da ou kDa. O Pm leva em consideração que uma molécula maior contém mais da massa total de uma amostra de polímero do que as moléculas menores. O Pm pode ser determinado por técnicas, tais como espalhamento de luz estático, espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, espalhamento por raios X e velocidade de sedimentação.
[0041] Conforme usado na presente invenção, o termo "Mn" se refere a um peso molecular numérico médio e é tipicamente expresso em Da ou kDa. O Mn é calculado considerando o peso total de uma amostra dividido pelo número de moléculas na amostra e pode ser determinado por técnicas, tais como cromatografia de permeação em gel, viscometria através da (equação de Mark- Houwink), métodos coligativos, tais como osmometria de pressão de vapor, determinação de grupo final ou RMN de próton. Pm/Mn reflete polidispersividade.
[0042] Conforme usado na presente invenção, o termo “razão molar" é uma fração tipicamente expressa como um decimal para a posição de dezenas ou centenas. Por exemplo, uma razão molar de 0 ou 0,1 a 1,0 expressa em dezenas incluirá qualquer um dentre 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0.
[0043] Conforme usado na presente invenção, a abreviação "PnPs" se refere a polissacarídeo pneumocócico.
[0044] Conforme usado na presente invenção, o termo "compreende”, quando usado com a composição imunogênica da invenção, se refere à inclusão de quaisquer outros componentes (sujeito a limitações de "que consiste em linguagem para a mistura de antígeno), tais como adjuvantes e excipientes. O termo “que consiste em”, quando usado com a mistura de conjugado de polissacarídeo-proteína multivalente da invenção, se refere a uma mistura que tem aqueles conjugados particulares de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae e nenhum outro conjugado de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae de um sorotipo diferente.
[0045] Conforme usado na presente invenção, a expressão “sítio de ativação", em um açúcar, significa que o sítio pode ser quimicamente modificado para formar um grupo reativo. O sítio de ativação leva em consideração a tendência preferencial de um agente de ativação reagir em um sítio específico.
[0046] Conforme usado na presente invenção, a expressão “polissacarídeo ativado" se refere a um polissacarídeo que foi quimicamente modificado para formar grupos reativos em uma cadeia de polissacarídeos. Um polissacarídeo ativado não significa, necessariamente, que todos os sítios de ativação disponíveis foram quimicamente modificados.
[0047] Conforme usado na presente invenção, a expressão "extensão de ativação", em uma cadeia de polissacarídeos, se refere à razão total entre o número de grupo químico ativado e o número de unidades de repetição na cadeia de polissacarídeos.
[0048] A menos que especificado de outro modo, todas as faixas fornecidas na presente invenção são inclusivas dos limites inferiores e superiores citados.
[0049] Dois membros adicionais de sorogrupo 23 de S. pneumoniae, para os quais nenhuma informação de estrutura ou composição estava disponível, foram identificados. O polissacarídeo de sorotipo 23B tem cadeia principal igual a do polissacarídeo de sorotipo 23F, mas está ausente o α-Rhap suspenso. Em comparação ao polissacarídeo de sorotipo 23F, o polissacarídeo de sorotipo 23A tem uma cadeia principal mais curta e uma cadeia secundária mais longa.
[0050] A identificação da estrutura para esses sorotipos pode permitir a sua incorporação em vacinas pneumocócicas, não conjugadas ou como um conjugado de polissacarídeo-proteína. As vacinas conjugadas que compreendem Ps de estreptococos e pneumococos são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, as Patentes US Nos 6.248.570; 5.866.135; e 5.773.007. Polissacarídeos capsulares
[0051] Os polissacarídeos capsulares de Steptococcus pneumoniae do sorotipo(s) da invenção podem ser preparados por meio de técnicas padrão conhecidas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, os polissacarídeos podem ser isolados de bactérias e podem ser dimensionados até certo grau por métodos conhecidos (consulte, por exemplo, as Patentes Nos EP497524 e EP497525); e, de modo preferencial, por microfluidização realizada com o uso de um homogeneizador ou por hidrólise química. Em uma modalidade, as cepas de S. pneumoniae que correspondem a cada sorotipo de polissacarídeo são cultivadas em um meio à base de soja. Os polissacarídeos individuais são, então, purificados através de etapas padrão, incluindo centrifugação, precipitação e ultrafiltração. Consulte, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente no US 2008/0286838 e a Patente nº US 5.847.112. Os polissacarídeos podem ser dimensionados a fim de reduzir a viscosidade e/ou aperfeiçoar a filtrabilidade de produtos conjugados subsequentes. A hidrólise química pode ser conduzida com o uso de ácido acético. O dimensionamento mecânico pode ser conduzido com o uso de Cisalhamento de Homogeneização à Alta Pressão.
[0052] Em algumas modalidades, os polissacarídeos purificados antes da conjugação têm um peso molecular dentre 5 kDa e 4.000 kDa. O peso molecular pode ser calculado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) combinada com detector de espalhamento de luz multiangular (MALS) e detector de índice de refração (RI). Em outras tais modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular médio dentre 10 kDa e 4.000 kDa; entre 50 kDa e 4.000 kDa; entre 50 kDa e 3.000 kDa; entre 50 kDa e 2.000 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 80 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 4.000 kDa; entre 100 kDa e 3.000 kDa; 100 kDa e
2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 100 e 400 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e
1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo de sorotipo 23A tem um peso molecular médio dentre 75 kDa e 200 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo de sorotipo 23B tem um peso molecular médio dentre 150 kDa e 250 kDa.
[0053] Em certas modalidades, o polissacarídeo de sorotipos 23A ou 23B de S. pneumoniae tem entre 10 e 5.000 unidades de repetição. Em certos aspectos, o polissacarídeo tem entre 50 e 3.000, 100 a 2.500 ou 100 a 2.000. Em certas modalidades, o polissacarídeo de sorotipo 23A tem entre 97 e 260 unidades de repetição. Em certas modalidades, o polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniae tem entre 195 e 324 unidades de repetição. Proteína Carreadora
[0054] Os polissacarídeos de um ou mais dentre os sorotipos podem ser conjugados a uma proteína carreadora ("Pr") para aperfeiçoar a imunogenicidade em crianças, nos idosos e/ou indivíduos imunocomprometidos. Quando mais de um sorotipo é usado em uma composição multivalente, os sorotipos podem ser preparados com a mesma proteína carreadora ou proteínas carreadoras diferentes. Cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é, tipicamente, conjugado à mesma proteína carreadora.
[0055] Em uma modalidade particular da presente invenção, CRM197 é usada como uma proteína carreadora. CRM197 é uma variante não tóxica de toxina de difteria (DT). A proteína carreadora CRM197 é uma forma mutante de DT que é considerada não tóxica por uma substituição de único aminoácido no Fragmento A em resíduo 52. Em uma modalidade, a proteína carreadora CRM197 é isolada de culturas de cepa C7 de Corynebacterium diphtheria (β197) desenvolvidas em ácidos casamino e meio à base de extrato de levedura. Em outra modalidade, CRM197 é preparada de modo recombinante em conformidade com os métodos descritos na Patente. Nº U.S. 5.614.382. Tipicamente, CRM197 é purificada através de uma combinação de ultrafiltração, precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica. Em algumas modalidades, CRM197 é preparada em Pseudomonas fluorescens com o uso de Pfenex Expression Technology™ (Pfenex Inc., San Diego, CA).
[0056] Outras proteínas carreadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas adicionais, tais como DT, fragmento B de toxoide diftérico (DTFB), TT (toxoide tetânico) ou fragmento C de TT, toxoide pertussis, toxoide colérico (por exemplo, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 2004/083251), E. coli LT (enterotoxina estável em calor), E. coli ST (enterotoxina estável em calor) e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. As proteínas de membrana externa bacteriana, tais como complexo c de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação com transferrina, proteína de superfície pneumocócica A (PspA; consulte a Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 02/091998), proteína adesina pneumocócica (PsaA), peptidase C5a de estreptococos de Grupo A ou Grupo B, ou proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2.706-13) incluindo ply detoxificado em algum modo, por exemplo, dPLY-GMBS (consulte a Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 04/081515) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteínas Pht, por exemplo, fusões de PhtDE, fusões de PhtBE (consulte a Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 01/98334 e nº WO 03/54007), também podem ser usadas. Outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou proteína purificada derivada de tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D deHaemophilus influenzae; consulte, por exemplo, a Patente nº EP 0
594 610 B), ou equivalentes imunologicamente funcionais dos mesmos, peptídeos sintéticos (consulte as Patentes nos EP0378881 e EP0427347), proteínas de choque térmico (consulte a Publicação de Pedido de Patente Internacional nos WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas de pertussis (consulte a Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 98/58668 e Patente nº EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou hormônios (consulte a Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 91/01146), proteínas artificiais que compreendem múltiplos epítopos de célula T CD4+ humanos de vários antígenos derivados de patógeno (consulte Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3.816-3.824), tais como proteína N19 (consulte Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4.884-7), proteínas de absorção de ferro (consulte a Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (consulte a Publicação de Patente Internacional nº WO 00/61761), e flagelina (consulte Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9) também podem ser usadas como proteínas carreadoras.
[0057] Outros mutantes de DT também podem ser usados como a proteína carreadora, tais como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3.838-3.844); CRM9, CRM45, CRM 102, CRM 103 e CRM 107 e outras mutações descritas por Nicholls and Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed:Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gin ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações reveladas na Patente nº US
4.709.017 ou na Patente nº US 4.950.740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações reveladas na Patente nº US 5.917.017 ou na Patente nº US 6.455.673; ou fragmento revelado na Patente nº US 5.843.711.
[0058] Quando vacinas multivalentes são usadas, uma segunda proteína carreadora pode ser usada para um ou mais dentre os antígenos. A segunda proteína carreadora é, de modo preferencial, uma proteína que é considerada não tóxica e não reatogênica e obtenível em quantidade e pureza suficientes. A segunda proteína carreadora também é conjugada ou unida a um antígeno, por exemplo, um polissacarídeo de S. pneumoniae para aprimorar a imunogenicidade do antígeno. As proteínas carreadoras devem ser favoráveis a procedimentos de conjugação padrão. Em uma modalidade, cada polissacarídeo capsular não conjugado com a primeira proteína carreadora é conjugado com a mesma segunda proteína carreadora (por exemplo, cada molécula de polissacarídeo capsular é conjugada com uma única proteína carreadora). Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares não conjugados com a primeira proteína carreadora são conjugados com duas ou mais proteínas carreadoras (cada molécula de polissacarídeo capsular é conjugada com uma única proteína carreadora). Em tais modalidades, cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é tipicamente conjugado com a mesma proteína carreadora. Conjugação
[0059] Antes da conjugação, os polissacarídeos purificados podem ser quimicamente ativados para tornar os sacarídeos capazes de reagir com a proteína carreadora para formar um polissacarídeo ativado. Conforme usado na presente invenção, o termo “polissacarídeo ativado” se refere a um polissacarídeo que foi quimicamente modificado, conforme descrito abaixo, para possibilitar a conjugação com um ligante ou uma proteína carreadora. Os polissacarídeos purificados podem ser conectados, de maneira opcional, a um ligante. Uma vez ativado ou conectado a um ligante, cada polissacarídeo capsular é conjugado, de maneira separada, com uma proteína carreadora para formar um glicoconjugado. Os conjugados de polissacarídeo podem ser preparados por técnicas de acoplamento conhecidas.
[0060] Em certas modalidades, a ativação de polissacarídeo de sorotipo
23A de S. pneumoniae ocorre no α-Rhap ou β-Glcp. Em certas modalidades, a ativação de polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniae ocorre no β-Glcp ou β-Rhap. Em um aspecto desta modalidade, a ativação de polissacarídeo de sorotipo 23B ocorre em mais de 90%, 95%, 99% ou 100% no β-Rhap. De maneira surpreendente, apesar da disponibilidade de um sítio de ativação adequado em β-Glcp, a ativação ocorre exclusivamente no β-Rhap. Em certas modalidades, o polissacarídeo é ativado com periodato. Em certos aspectos desta modalidade, a ativação de polissacarídeo de sorotipo 23A ocorre na 2ª ou 3ª posição de carbono de α-Rhap ou β-Glcp ou a ativação de polissacarídeo de sorotipo 23B ocorre na 2ª ou 3ª posição de carbono de β-Glcp ou β-Rhap. Em um subaspecto deste aspecto, a extensão de ativação de polissacarídeo de sorotipo 23B na 2ª ou 3ª posição de carbono de β-Rhap é maior do que a extensão de ativação na 2ª ou 3ª posição de carbono de β-Glcp. A extensão de ativação em β-Rhap pode ser pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90%. Em outro subaspecto deste aspecto, a ativação de periodato de polissacarídeo de sorotipo 23B ocorre em mais de 90%, 95%, 99% ou 100% no β-Rhap.
[0061] Em certas modalidades, o polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante para formar um intermediário de polissacarídeo-ligante em que o terminal livre do ligante é um grupo éster. O ligante é, portanto, um em que pelo menos um terminal é um grupo éster. O outro terminal é selecionado de modo que possa reagir com o polissacarídeo para formar o intermediário de polissacarídeo-ligante.
[0062] Em certas modalidades, o polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante com o uso de um grupo amina primária no polissacarídeo. Nesse caso, o ligante tipicamente tem um grupo éster em ambos os terminais. Isso permite que o acoplamento aconteça reagindo-se um dentre os grupos éster com o grupo amina primária no polissacarídeo por meio de substituição nucleofílica acílica. A reação resulta em um intermediário de polissacarídeo-ligante em que o polissacarídeo é acoplado ao ligante por meio de uma ligação de amida. O ligante é, portanto, um ligante bifuncional que fornece um primeiro grupo éster para reagir com o grupo amina primária no polissacarídeo e um segundo grupo éster para reagir com o grupo amina primária na molécula carreadora. Um típico ligante é diéster de N-hidroxisuccinimida de ácido adípico (SIDEA).
[0063] Em certas modalidades, o acoplamento também pode ocorrer indiretamente, isto é, com um ligante adicional que é usado para derivatizar o polissacarídeo antes de acoplamento com o ligante. O polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional com o uso de um grupo carbonila no terminal de redução do polissacarídeo. Esse acoplamento compreende duas etapas: (a1) reagir o grupo carbonila com o ligante adicional; e (a2) reagir o terminal livre do ligante adicional com o ligante. Nessas modalidades, o ligante adicional tipicamente tem um grupo amina primária em ambos os terminais, permitindo, desse modo, que a etapa (a1) aconteça reagindo-se um dentre os grupos amina primária com o grupo carbonila no polissacarídeo por meio de aminação redutiva. Um grupo amina primária é usado o qual é reativo com o grupo carbonila no polissacarídeo. Os grupos hidrazida ou hidroxilamino são adequados. O mesmo grupo amina primária está tipicamente presente em ambos os terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário de polissacarídeo-ligante adicional em que o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional por meio de uma ligação C—N.
[0064] Em certas modalidades, o polissacarídeo pode ser acoplado ao ligante adicional com o uso de um grupo diferente no polissacarídeo, particularmente, um grupo carboxila. Esse acoplamento compreende duas etapas: (a1) reagir o grupo com o ligante adicional; e (a2) reagir o terminal livre do ligante adicional com o ligante. Nesse caso, o ligante adicional tipicamente tem um grupo de amina primária em ambos os terminais, permitindo, desse modo, que a etapa (a1) aconteça reagindo-se um dentre os grupos de amina primária com o grupo carboxila no polissacarídeo por meio de ativação de EDAC. Um grupo de amina primária é usado o qual é reativo com o grupo de carboxila ativada-EDAC no polissacarídeo. Um grupo de hidrazida é adequado. O mesmo grupo de amina primária está tipicamente presente em ambos os terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário de polissacarídeo- ligante adicional em que o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional por meio de uma ligação de amida.
[0065] Em uma modalidade, a ativação química dos polissacarídeos e conjugação subsequente à proteína carreadora por meio de aminação redutiva podem ser alcançadas por meios descritos nas Patentes n os U.S. 4.365.170,
4.673.574 e 4.902.506, Publicação de Pedido de Patente nos US 2006/0228380, US 2007/184072, US 2007/0231340 e US 2007/0184071, e Publicação de Pedido de Patente Internacional nos WO2006/110381, WO2008/079653 e WO2008/143709). A química pode provocar a ativação de polissacarídeo pneumocócico através de reação com qualquer agente de oxidação cujo um grupo de hidroxila primária com um aldeído, tal como TEMPO na presença de oxidante (documento nº W02104/097099), ou reagindo dois grupos de hidroxila vicinal com aldeídos, tais como periodato (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio ou ácido periódico). As reações levam a uma oxidação aleatória de grupos hidroxila primária ou clivagem oxidativa aleatória de grupos hidroxila vicinal dos carboidratos com a formação de grupos de aldeído reativo.
[0066] Nesta modalidade, o acoplamento com a proteína carreadora se dá por aminação redutiva através de aminação direta com os grupos de lisila da proteína. Por exemplo, a conjugação é realizada reagindo-se uma mistura do polissacarídeo ativado e proteína carreadora com um agente de redução, tal como cianoboroidreto de sódio na presença de níquel. A reação de conjugação pode ocorrer sob solução aquosa ou na presença de dimetil sulfóxido (DMSO). Consulte, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente nos US2015/0231270 e US2011/0195086 e Patente nº EP 0471 177 B1. Os aldeídos não reagidos são, então, limitados com a adição de um forte agente de redução, tal como boroidreto de sódio.
[0067] A aminação redutiva envolve duas etapas, (1) oxidação do polissacarídeo para formar aldeídos reativos, (2) redução da imina (base de Schiff) formada entre polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação de conjugado de amina estável. Antes de oxidação, reduz- se, de maneira opcional, o tamanho do polissacarídeo. Métodos mecânicos (por exemplo, homogeneização) ou hidrólise química podem ser empregados. A hidrólise química pode ser conduzida com o uso de ácido acético. A etapa de oxidação pode envolver reação com periodato. Para a finalidade da presente invenção, o termo "periodato” inclui tanto periodato quanto ácido periódico; o termo também inclui tanto metaperiodato (IO4-) quanto ortoperiodato (ΙΟ65-) e inclui os vários sais de periodato (por exemplo, periodato de sódio e periodato de potássio). Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de metaperiodato, de modo preferencial, na presença de periodato de sódio (NaIO4). Em outra modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de ortoperiodato, de modo preferencial, na presença de ácido periódico.
[0068] Em uma modalidade, o agente de oxidação é um composto de radical nitroxila ou nitróxido estável, tal como compostos de piperidina-N-oxi ou pirrolidina-N-oxi, na presença de um oxidante para oxidar, de modo seletivo, hidroxilas primárias (conforme descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 2014/097099). Na referida reação, o oxidante real é o sal de N-oxoamônio, em um ciclo catalítico. Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxila ou nitróxido estável são compostos de piperidina- N-oxi ou pirrolidina-N-oxi. Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxila ou nitróxido estável porta uma porção química de TEMPO (2,2,6,6- tetrametil-1-piperidiniloxi) ou PROXYL (2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi). Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxila estável é TEMPO ou um derivado do mesmo. Em um aspecto, o referido oxidante é uma molécula que porta uma porção química de N-halo. Em um aspecto, o referido oxidante é selecionado a partir do grupo que consiste em N-CloroSuccinimida, N- Bromosuccinimida, N-Iodosuccinimida, ácido Dicloroisocianúrico, 1,3,5-tricloro- 1,3,5-triazinana-2,4,6-triona, ácido Dibromoisocianúrico, 1,3,5-tribromo-1,3,5- triazinana-2,4,6-triona, ácido Diiodoisocianúrico e 1,3,5-triiodo-1,3,5-triazinana- 2,4,6-triona. De modo preferencial, o referido oxidante é N-Clorosuccinimida.
[0069] Em certos aspectos, o agente de oxidação é radical livre 2,2,6,6- Tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) e N- Clorosuccinimida (NCS) como o cooxidante (conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2014/097099). Portanto, em um aspecto, os glicoconjugados de S. pneumoniae são obteníveis por meio de um método que compreende as etapas de: a) reagir um sacarídeo com 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) e N- clorosuccinimida (NCS) em um solvente aquoso para produzir um sacarídeo ativado; e b) reagir o sacarídeo ativado com uma proteína carreadora que compreende um ou mais grupos amina (o referido método é designado “aminação redutiva de TEMPO/NCS" doravante).
[0070] De maneira opcional, a reação de oxidação é arrefecida de maneira brusca através de adição de um agente de arrefecimento. O agente de arrefecimento pode ser selecionado a partir de diois vicinais, 1,2-aminoálcoois, aminoácidos, glutationa, sulfito, bissulfato, ditionito, metabissulfito, tiossulfato,
fosfitos, hipofosfitos ou ácido fosforoso (tal como glicerol, etilenoglicol, propan- 1,2-diol, butan-1,2-diol ou butan-2,3-diol, ácido ascórbico).
[0071] A segunda etapa do processo de conjugação para aminação redutiva é a redução da ligação de imina (base de Schiff) entre polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação de conjugado estável (denominada aminação redutiva), com o uso de um agente de redução. Agentes de redução que são adequados incluem o cianoborohidretos (tais como cianoboroidreto de sódio) ou boroidreto sódio. Em uma modalidade, o agente de redução é cianoborohidreto de sódio.
[0072] Em certas modalidades dos métodos da invenção, a reação de aminação redutiva é realizada em solvente aprótico (ou uma mistura de solventes apróticos). Em uma modalidade, a reação de redução é realizada em solvente de DMSO (dimetil sulfóxido) ou de DMF (dimetilformamida). O solvente de DMSO ou DMF pode ser usado para reconstituir o polissacarídeo ativado e proteína carreadora, caso seja liofilizado. Em uma modalidade, o solvente aprótico é DMSO.
[0073] Ao final da reação de redução, pode haver grupos aldeído não reagidos remanescentes nos conjugados, que podem ser limitados ou arrefecidos bruscamente com o uso de um agente limitante ou de arrefecimento brusco adequado. Em uma modalidade, esse limitante ou agente de arrefecimento é boroidreto de sódio (NaBH4). Alternativas adequadas incluem triacetoxiborohidreto de sódio ou boroidreto de sódio ou zinco na presença de ácidos Bronsted ou Lewis), amina-boranos, tais como piridina borano, 2-Picolina Borano, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina-borano, t-BuMe'PrN-BH3, benzilamina-BH3 ou 5-etil-2-metilpiridina borano (PEMB) ou resina de troca de boroidreto.
[0074] Os glicoconjugados preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico são usados, de modo geral, em vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes. Desse modo, em certas modalidades, para composições multivalentes em que nem todos os sorotipos são preparados em um solvente aprótico, a reação de redução para os sorotipos remanescentes é realizada em solvente aquoso (por exemplo, selecionado a partir de PBS (solução salina tamponada com fosfato), MES ácido (2-(N-morfolino)etanosulfônico), HEPES, ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico), Bis-tris, ADA ácido (N-(2-Acetamido)iminodiacético), PIPES ácido (piperazina-N,N'-bis(2- etanosulfônico)), MOPSO ácido (3-Morfolino-2-hidroxipropanosulfônico), BES ácido (N,N-bis(2 -hidroxietil)-2-aminoetanosulfônico), MOPS ácido (3-(Ν- morfolino)propanosulfônico), DIPSO ácido (3-Bis(2-hidroxi etil) amino-2- hidroxipropano-1-sulfônico), MOBS ácido (4-(N-morfolino)butanosulfônico), HEPPSO ácido (N-(2-Hidroxietil)piperazina-N-(2-hidroxipropanosulfônico)), POPSO ácido (Piperazina-1,4-bis(2-hidroxi-3-propanosulfônico)), TEA (trietanolamina), EPPS ácido (4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-propanosulfônico), Bicina ou HEPB, a um pH entre 6,0 e 8,5, 7,0 e 8,0 ou 7,0 e 7,5).
[0075] Em algumas modalidades, os glicoconjugados da presente invenção compreendem um polissacarídeo que tem um peso molecular dentre 10 kDa e
10.000 kDa. Em outras tais modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular dentre 25 kDa e 5.000 kDa. Em outras tais modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular dentre 50 kDa e 1.000 kDa. Em outras tais modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular dentre 70 kDa e 900 kDa. Em outras tais modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular dentre 100 kDa e 800 kDa. Em outras tais modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular dentre 200 kDa e 600 kDa. Em tais modalidades adicionais, o polissacarídeo tem um peso molecular de 100 kDa a 1.000 kDa; 100 kDa a 900 kDa; 100 kDa a 800 kDa; 100 kDa a 700 kDa; 100 kDa a 600 kDa; 100 kDa a 500 kDa; 100 kDa a 400 kDa; 100 kDa a 300 kDa; 150 kDa a 1.000 kDa; 150 kDa a 900 kDa; 150 kDa a 800 kDa; 150 kDa a 700 kDa; 150 kDa a 600 kDa; 150 kDa a 500 kDa; 150 kDa a 400 kDa; 150 kDa a 300 kDa; 200 kDa a 1.000 kDa; 200 kDa a 900 kDa; 200 kDa a 800 kDa; 200 kDa a 700 kDa; 200 kDa a 600 kDa; 200 kDa a 500 kDa; 200 kDa a 400 kDa; 200 kDa a 300; 250 kDa a 1.000 kDa; 250 kDa a 900 kDa; 250 kDa a 800 kDa; 250 kDa a 700 kDa; 250 kDa a 600 kDa; 250 kDa a 500 kDa; 250 kDa a 400 kDa; 250 kDa a 350 kDa; 300 kDa a 1.000 kDa; 300 kDa a 900 kDa; 300 kDa a 800 kDa; 300 kDa a 700 kDa; 300 kDa a 600 kDa; 300 kDa a 500 kDa; 300 kDa a 400 kDa; 400 kDa a 1.000 kDa; 400 kDa a 900 kDa; 400 kDa a 800 kDa; 400 kDa a 700 kDa; 400 kDa a 600 kDa; ou 500 kDa a 600 kDa.
[0076] Em certas modalidades, a reação de conjugação é realizada por aminação redutiva em que níquel é usado para maior eficiência de reação de conjugação e para auxiliar na remoção de cianeto livre. Os metais de transição são conhecidos por formar complexos estáveis com cianeto e são conhecidos por aperfeiçoar a metilação redutiva de grupos amino de proteína e formaldeído com cianoboroidreto de sódio (S Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190). Complexando-se cianeto inibitório residual, a adição de níquel aumenta o consumo de proteína durante a conjugação e leva à formação de conjugados maiores potencialmente mais imunogênicos.
[0077] Procedimentos químicos alternativos adequados incluem a ativação do sacarídeo com 1-ciano-4-dimetilamino piridinia tetrafluoroborato (CDAP) para formar um éster de cianato. O sacarídeo ativado pode ser acoplado, desse modo, diretamente ou através de um grupo de espaçador (ligante) a um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para gerar um polissacarídeo tiolado que pode ser acoplado ao carreador por meio de uma ligação de tioéter obtida após reação com uma maleimida-proteína carreadora ativada (por exemplo, com o uso de GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo, com o uso de iodoacetimida [por exemplo, etil HCl de iodoacetimida] ou bromoacetato de N- succinimidila ou SIAB ou SIA ou SBAP). De modo preferencial, o éster de cianato (produzido, de maneira opcional, por procedimento químico com CDAP) é acoplado a hexanodiamina ou dihidrazida de ácido adípico (ADH) e o sacarídeo amino derivatizado é conjugado com a proteína carreadora com o uso de procedimento químico com carbodiimida (por exemplo, EDAC ou EDC) através de um grupo carboxila na proteína carreadora. Tais conjugados são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional nos WO 93/15760, WO 95/08348 e WO 96/29094; e Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256.
[0078] Outras técnicas adequadas usam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S--NHS, EDC, TSTU. Muitas são descritas na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligante de carbonila que pode ser formado através de reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (consulte Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2.572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18) seguido de reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isso pode envolver redução do terminal anomérico para um grupo hidroxila primária, proteção/desproteção opcional do grupo hidroxila primária, reação do grupo hidroxila primária com CDI para formar um intermediário de CDI carbamato e acoplar o intermediário de CDI carbamato com um grupo amino em uma proteína.
[0079] Após a conjugação (a reação de redução e, de maneira opcional, a reação de arrefecimento brusco ou limitado), os glicoconjugados podem ser purificados (enriquecidos em relação à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) através de uma variedade de técnicas conhecidas pelo técnico no assunto. Essas técnicas incluem diálise, operações de concentração/diafiltração, filtração por fluxo tangencial, ultrafiltração, precipitação/eluição, cromatografia de coluna (cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca iônica multimodal, DEAE ou cromatografia de interação hidrofóbica) e filtração profunda. Consulte, por exemplo, a Patente nº US
6.146.902. Em uma modalidade, os glicoconjugados são purificados por diafiltração ou cromatografia de troca iônica ou cromatografia de exclusão de tamanho.
[0080] Um modo de caracterizar os glicoconjugados da invenção é pelo número de resíduos de lisina na proteína carreadora (por exemplo, CRM197) que se tornam conjugados ao sacarídeo, que podem ser caracterizados como uma faixa de lisinas conjugadas (grau de conjugação). A evidência para modificação de lisina da proteína carreadora, devido a ligações covalentes com os polissacarídeos, pode ser obtida por análise de aminoácido com o uso de métodos habituais conhecidos pelos técnicos no assunto. A conjugação resulta em uma redução no número de resíduos de lisina recuperados, quando comparado ao material de partida de proteína carreadora usado para gerar os materiais conjugados. Em uma modalidade preferencial, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção está entre 2 e 15, entre 2 e 13, entre 2 e 10, entre 2 e 8, entre 2 e 6, entre 2 e 5, entre 2 e 4, entre 3 e 15, entre 3 e 13, entre 3 e 10, entre 3 e 8, entre 3 e 6, entre 3 e 5, entre 3 e 4, entre 5 e 15, entre 5 e 10, entre 8 e 15, entre 8 e 12, entre 10 e 15 ou entre 10 e 12. Em uma modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15. Em uma modalidade preferencial, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção está entre 4 e 7. Em algumas tais modalidades, a proteína carreadora é CRM197.
[0081] Os glicoconjugados da invenção também podem ser caracterizados pela razão (peso/peso) entre sacarídeo e proteína carreadora. Em algumas modalidades, a razão entre polissacarídeo e proteína carreadora no glicoconjugado (p/p) está entre 0,5 e 3,0 (por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1 , cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1 , cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9 ou cerca de 3,0). Em outras modalidades, a razão entre sacarídeo e proteína carreadora (p/p) está entre 0,5 e 2,0, entre 0,5 e 1,5, entre 0,8 e 1,2, entre 0,5 e 1,0, entre 1,0 e 1,5 ou entre 1,0 e 2,0. Em modalidades adicionais, a razão entre sacarídeo e proteína carreadora (p/p) está entre 0,8 e 1,2. Em uma modalidade preferencial, a razão entre polissacarídeo capsular e proteína carreadora no conjugado está entre 0,9 e 1,1. Em algumas tais modalidades, a proteína carreadora é CRM197. Os glicoconjugados e composições imunogênicas da invenção podem conter sacarídeo livre que não é conjugado de modo covalente à proteína carreadora, mas ainda sim está presente na composição de glicoconjugado. O sacarídeo livre pode ser associado a, de modo não covalente, (isto é, ligado, adsorvido ou preso, de modo não covalente, em ou com) o glicoconjugado.
[0082] Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos do que cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ou 15% de polissacarídeo livre, quando comparado à quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos do que cerca de 25% de polissacarídeo livre, quando comparado à quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos do que cerca de 20% de polissacarídeo livre, quando comparado à quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos do que cerca de 15% de polissacarídeo livre, quando comparado à quantidade total de polissacarídeo. Vacinas de conjugado de polissacarídeo-proteína multivalentes
[0083] Em certas modalidades da invenção, as vacinas de polissacarídeo multivalentes compreendem polissacarídeos não conjugados ou conjugados de polissacarídeo-proteína de um ou mais dentre sorotipos 23A e 23B de Streptococcus pneumoniae e polissacarídeos capsulares de um ou mais dentre sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18B, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23F, 24B, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de S. pneumoniae tanto como polissacarídeos livres, um componente de um conjugado de polissacarídeo- proteína ou uma combinação dos mesmos, para fornecer uma vacina pneumocócica multivalente. Em certas modalidades da invenção, a composição imunogênica compreende, consiste essencialmente em ou consiste em polissacarídeos capsulares de sorotipos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou 44 de S. pneumoniae individualmente conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras. De modo preferencial, os sacarídeos de um sorotipo particular não são conjugados com mais de uma proteína carreadora.
[0084] Após os glicoconjugados individuais serem purificados, os mesmos são unidos para formular a composição imunogênica da presente invenção. Esses conjugados de pneumococo são preparados por processos separados e formulados a granel em uma formulação de dosagem única.
[0085] Para determinados sorotipos dentro do sorogrupo 23 de S. pneumoniae, a proteção cruzada pode ser vista. Em outras palavras, os polissacarídeos de um sorotipo particular podem induzir uma resposta imunológica que é protetora contra outro sorotipo. Tipicamente, o outro sorotipo está dentro do mesmo sorogrupo, mas em alguns casos, um sorotipo pode fornecer proteção para um sorotipo em um sorogrupo diferente. Por outro lado, por vezes, a proteção cruzada não é vista nem no mesmo sorogrupo em que polissacarídeos desses sorotipos têm estruturas similares. Os EXEMPLOS demonstram, de maneira inesperada, que polissacarídeos de sorotipos 23A e 23F de S. pneumoniae oferecem proteção cruzada fraca contra sorotipo 23B de S. pneumoniae (enquanto fornecem proteção cruzada robusta um contra o outro). Desse modo, a fim de obter proteção contra sorotipos 23A, 23B e 23F, uma composição multivalente que compreende sorotipos 23A ou 23F de polissacarídeo precisa incluir polissacarídeo de sorotipo 23B. Consequentemente, em certas modalidades da invenção, uma composição multivalente compreende polissacarídeos de sorotipos 23A e 23B. Em outras modalidades da invenção, uma composição multivalente compreende polissacarídeos de sorotipos 23F e 23B. Composições Farmacêuticas/Vacinas
[0086] A presente invenção fornece, adicionalmente, composições, incluindo composições farmacêuticas, imunogênicas e de vacina, que compreendem, consistem essencialmente em ou, de modo alternativo, consistem em qualquer uma dentre as combinações de sorotipo de S. pneumoniae de polissacarídeo descritas acima em conjunto com um carreador farmaceuticamente aceitável e um adjuvante.
[0087] A formulação dos conjugados de polissacarídeo-proteína da presente invenção pode ser alcançada com o uso de métodos reconhecidos na técnica. Por exemplo, conjugados pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas sem limitação, água,
solução salina tamponada, poliois (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e soluções de dextrose.
[0088] Em uma modalidade preferencial, a composição de vacina é formulada em tampão de L-histidina com cloreto de sódio.
[0089] Conforme definido na presente invenção, um "adjuvante" é uma substância que serve para aprimorar a imunogenicidade de uma composição imunogênica da invenção. Um adjuvante imunológico pode aprimorar uma resposta imunológica a um antígeno que é pouco imunogênico quando administrado sozinho, por exemplo, induzindo pouca ou nenhuma resposta imunológica mediada por célula ou títulos de anticorpo, aumentar títulos de anticorpo para o antígeno e/ou diminuir a dose do antígeno eficaz para alcançar uma resposta imunológica no indivíduo. Desse modo, os adjuvantes são frequentemente fornecidos para aumentar a resposta imunológica e são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Os adjuvantes adequados para aprimorar a eficácia da composição incluem, mas sem limitação: (1) sais de alumínio (alum), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) As formulações de emulsão óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como peptídeos muramil (definidos abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), tais como, por exemplo, (a) MF59 (Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 90/14837), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (contendo, de maneira opcional, várias quantidades de MTP-PE) formuladas em partículas de submícrons com o uso de um microfluidizador, tal como microfluidizador Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado por plurônico L121, e thr-MDP microfluidizado em uma emulsão de submícrons ou em vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, (c) sistema de adjuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de Esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana a partir do grupo que consiste em monofosforilipídio A 3-O-deacilado (MPL™) descrito na Patente no US4.912.094, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto de parede celular (CWS), de modo preferencial, MPL+CWS (Detox™); e (d) um Montanide ISA; (3) adjuvantes de saponina, tais como Quil A ou STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (consulte, por exemplo, a Patente nº US
5.057.540) podem ser usados ou partículas geradas a partir dos mesmos, tais como ISCOM (complexos imunoestimulantes formados pela combinação de colesterol, saponina, fosfolipídio e proteínas anfipáticas) e Iscomatrix® (que tem, essencialmente, a mesma estrutura de um ISCOM, mas sem a proteína); (4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos de lipídio sintético A, tais como compostos de glucosamina fosfato de aminoalquila (AGP), ou derivados ou análogos dos mesmos, que estão disponíveis junto a Corixa, e que são descritos na Patente nº US 6.113.918; um tal AGP é 2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-Deoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]- b-D-glucopiranosídeo, que também é conhecido como 529 (conhecido anteriormente como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável; (5) polinucleotídeos sintéticos, tais como oligonucleotídeos contendo motivo(s) CpG (Patente nº US 6.207.646); (6) citosinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferons (por exemplo, interferão gama), fator estimulante de colônia de macrófago granulócito (GM-CSF), fator estimulante de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimulatórias B7-1 e B7-2, etc; e (7) complemento, tal como um trímero de componente de complemento C3d.
[0090] Em outra modalidade, o adjuvante é uma mistura de 2, 3 ou mais dentre os adjuvantes acima, por exemplo, SBAS2 (uma emulsão óleo em água que também contém monofosforil lipídio A 3-deacilado e QS21).
[0091] Os peptídeos muramil incluem, mas sem limitação, N-acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2- (1',2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
[0092] Em certas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio. O adjuvante sal de alumínio pode ser uma vacina precipitada por alúmen ou uma vacina adsorvida por alúmen. Os adjuvantes de sal de alumínio são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow, E. and D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) e Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493). O sal de alumínio inclui, mas sem limitação, alumina hidratada, hidrato de alumina, trihidrato de alumina (ATH), hidrato de alumínio, trihidrato de alumínio, Alhydrogel®, Superfos, Amphogel®, hidróxido de alumínio (III), hidroxifosfato de alumínio (Adjuvante Fosfato de Alumínio (APA)), alumina amorfa, alumina trihidratada ou alumínio trihidroxi.
[0093] O APA é uma suspensão aquosa de hidroxifosfato de alumínio. O APA é fabricado mesclando-se cloreto alumínio e fosfato de sódio em uma razão volumétrica 1:1 para precipitar hidroxifosfato de alumínio. Após o processo de mescla, o material tem tamanho reduzido com um misturador de alto cisalhamento para alcançar uma distribuição de tamanho de partícula monodispersa. O produto é, então, diafiltrado contra solução salina fisiológica e esterilizado a vapor.
[0094] Em certas modalidades, um Al(OH)3 comercialmente disponível (por exemplo, Alhydrogel® ou Superfos of Denmark/ Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) é usado para adsorver proteínas. A adsorção de proteína é dependente, em outra modalidade, do pI (pH Isoelétrico) da proteína e do pH do meio. Uma proteína com um pI inferior adsorve ao íon de alumínio positivamente carregado mais fortemente do que uma proteína com um pI superior. Os sais de alumínio podem estabelecer um acúmulo de Ag que é liberado lentamente ao longo de um período de 2 a 3 semanas, estar envolvidos em ativação não específica de macrófagos e ativação complementar e/ou estimular mecanismo imune inato (possivelmente através de estímulo de ácido úrico). Consulte, por exemplo, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.
[0095] Os conjugados aquosos bulk monovalentes são, tipicamente, mesclados em conjunto e diluídos. Uma vez diluída, a batelada é filtrada de modo estéril. O adjuvante fosfato de alumínio é adicionado, de modo asséptico, para alvejar uma concentração final de 4 μg/mL para todos os sorotipos de S. pneumoniae, excepto o sorotipo 6B, que é diluído a um alvo de 8 μg/mL, e uma concentração final de alumínio de 250 μg/mL. A batelada formulada adjuvantada será preenchida em frascos ou seringas.
[0096] Em certas modalidades, o adjuvante é uma sequência de nucleotídeos contendo CpG, por exemplo, um oligonucleotídeo contendo CpG, em particular, um oligodesoxinucleotídeo contendo CpG (CpG ODN). Em outra modalidade, o adjuvante é ODN 1826, que pode ser adquirido junto a Coley Pharmaceutical Group.
[0097] “Nucleotídeo contendo CpG", “oligonucleotídeo contendo CpG", “oligonucleotídeo de CpG" e termos similares se referem a uma molécula de nucleotídeo de 6 a 50 nucleotídeos de comprimento que contém uma porção química de CpG não metilada. Consulte, por exemplo, Wang et al., 2003, Vaccine
21:4.297. Em outra modalidade, qualquer outra definição dos termos aceita pela técnica é desejada. Os oligonucleotídeos contendo CpG incluem oligonucleotídeos modificados com o uso de quaisquer ligações entre nucleosídeos sintéticas, base modificada e/ou açúcar modificado.
[0098] Os métodos para uso de oligonucleotídeos de CpG são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6.284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127: 139-58; e Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110. Administração/Dosagem
[0099] As composições e formulações da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano suscetível à infecção, por exemplo, uma infecção pneumocócica, por meio de administração da vacina por uma via sistêmica ou por mucosa. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de indução de uma resposta imunológica a um conjugado de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae, que compreende administrar, em um ser humano, uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de vacinação de um ser humano contra uma infecção pneumocócica, que compreende a etapa de administrar, no ser humano, uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção.
[00100] Quantidades ideais de componentes para uma vacina particular podem ser determinadas por estudos padrão envolvendo observação de respostas imunológicas apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação a partir de estudos com animais a dados humanos. Em outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.
[00101] “Quantidade eficaz" de uma composição da invenção se refere a uma dose necessária para gerar anticorpos que reduzem, de maneira significativa, a probabilidade ou severidade de infecciosidade de um micróbio, por exemplo, S. pneumoniae, durante um desafio subsequente.
[00102] Os métodos da invenção podem ser usados para a prevenção e/ou redução de síndromes clínicas primárias causadas por micróbios, por exemplo, S. pneumoniae, incluindo tanto infecções invasivas (meningite, pneumonia e bacteremia) quanto infecções não invasivas (otite média aguda e sinusite).
[00103] A administração das composições da invenção pode incluir um ou mais dentre: injeção através das vias intramuscular, intraperitonial, intradérmica ou subcutânea; ou por meio de administração em mucosa nos tratos oral/alimentar, respiratório ou genito-urinário. Em uma modalidade, a administração intranasal é usada para o tratamento de pneumonia ou otite média (visto que transporte nasofaríngeo de pneumococos pode ser prevenido de maneira mais eficaz, atenuando, desse modo, a infecção em seu estágio inicial).
[00104] A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos adversos relevantes. Tal quantidade pode variar dependendo do sorotipo de pneumococo. De modo geral, para conjugados à base de polissacarídeo, cada dose compreenderá 0,1 a 100 μg de cada polissacarídeo, particularmente, 0,1 a 10 μg e, mais particularmente, 1 a 5 μg. Por exemplo, cada dose pode compreender 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 ou 750 ng ou 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 μg de cada polissacarídeo.
[00105] Quantidades ideais de componentes para uma vacina particular podem ser determinadas por estudos padrão envolvendo observação de respostas imunológicas apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação a partir de estudos com animais a dados humanos. Em outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.
[00106] Em uma modalidade, a dose do sal de alumínio é 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 ou 700 μg, ou 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 mg ou mais. Em ainda outra modalidade, a dose de sal de alumínio descrita acima é por μg de proteína recombinante.
[00107] De modo geral, cada dose de 0,5 mL é formulada para conter: 2 μg de cada polissacarídeo de S. pneumoniae, exceto polissacarídeo de sorotipo 6B a 4 μg; cerca de 32 μg de proteína carreadora CRM197 (por exemplo, 32 μg ± 5 μg, ± 3 μg, ± 2 μg ou ± 1 μg); 0,125 mg de adjuvante alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão de cloreto de sódio e L-histidina. A concentração de cloreto de sódio é cerca de 150 mM (por exemplo, 150 mM ± 25 mM, ± 20 mM, ± 15 mM, ± 10 mM ou ± 5 mM) e cerca de 20 mM (por exemplo, 20 mM ± 5 mM, ± 2.5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM ou ± 0,5 mM) de tampão de L- histidina.
[00108] De acordo com qualquer um dos métodos da presente invenção e em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano. Em certas modalidades, o paciente humano é um bebê lactente (menos de 1 ano de idade), criança lactente (aproximadamente 12 a 24 meses) ou criança com pouca idade (aproximadamente 2 a 5 anos). Em outras modalidades, o paciente humano é um paciente idoso (> 65 anos). As composições desta invenção também são adequadas para uso em crianças mais velhas, adolescentes e adultos (por exemplo, de 18 a 45 anos ou 18 a 65 anos).
[00109] Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, uma composição da presente invenção é administrada como uma única inoculação.
Em outra modalidade, a composição é administrada duas, três ou quatro vezes ou mais, em intervalos adequados. Por exemplo, a composição pode ser administrada em intervalos de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses ou qualquer combinação dos mesmos. O calendário de imunização pode seguir aquele designado para vacinas pneumocócicas. Por exemplo, o calendário habitual para lactentes e crianças contra doença invasiva causada por S. pneumoniae é 2, 4, 6 e 12 a 15 meses de vida. Desse modo, em uma modalidade preferencial, a composição é administrada como uma série de 4 doses com 2, 4, 6 e 12 a 15 meses de idade.
[00110] As composições desta invenção também podem incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae. Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para a inclusão incluem aquelas identificadas na Publicação de Pedido de Patente Internacional nos WO 02/083855 e WO 02/053761. Formulações
[00111] As composições da invenção podem ser administradas em um indivíduo através de um ou mais métodos conhecidos por um técnico no assunto, tal como via parenteral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenoso, intradérmico, intra-nasal, subcutânea, intraperitonial e formuladas em conformidade.
[00112] Em uma modalidade, as composições da presente invenção são administradas por meio de injeção epidérmica, injeção intramuscular, intravenosa, intra-arterial, injeção subcutânea ou injeção por mucosa intra- respiratória de uma preparação líquida. As formulações líquidas para injeção incluem soluções e similares.
[00113] A composição da invenção pode ser formulada como frascos de dose única, frascos de múltiplas doses ou como seringas pré-enchidas.
[00114] Em outra modalidade, as composições da presente invenção são administradas de modo oral, e são formuladas, desse modo, em uma forma adequada para administração oral, isto é, como uma preparação sólida ou líquida. As formulações orais sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, péletes e similares. As formulações orais líquidas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e similares.
[00115] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para formulações líquidas são soluções aquosas ou não aquosas, suspensões, emulsões ou óleos. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila.
[00116] Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Exemplos de óleos são aqueles de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou um lipídio de leite ou ovos.
[00117] A composição farmacêutica pode ser isotônica, hipotônica ou hipertônica. Entretanto, é frequentemente preferencial que uma composição farmacêutica para infusão ou injeção seja essencialmente isotônica quando é administrada. Portanto, para armazenamento, a composição farmacêutica pode ser, de modo preferencial, isotônica ou hipertônica. Se a composição farmacêutica for hipertônica para armazenamento, a mesma pode ser diluída para se tornar uma solução isotônica antes de administração.
[00118] O agente isotônico pode ser um agente isotônico iônico, tal como um sal, ou um agente isotônico não iônico, tal como um carboidrato. Exemplos de agentes isotônicos iônicos incluem, mas sem limitação, NaCl, CaCl2, KCl e MgCl2. Exemplos de agentes isotônicos não iônicos incluem, mas sem limitação, sacarose, trealose, manitol, sorbitol e glicerol.
[00119] Também é preferencial que pelo menos um aditivo farmaceuticamente aceitável seja um tampão. Para algumas finalidades, por exemplo, quando a composição farmacêutica é destinada para infusão ou injeção, é frequentemente desejável que a composição compreenda um tampão, que tem a capacidade de tamponar uma solução a um pH na faixa de 4 a 10, tal como 5 a 9, por exemplo 6 a 8.
[00120] O tampão pode ser selecionado, por exemplo, a partir do grupo que consiste em tampão de Tris, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartrato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, L-histidina, glicina, succinato e trietanolamina.
[00121] O tampão pode ser selecionado, adicionalmente, por exemplo, a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. Por exemplo, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos monobásicos, tais como acético, benzoico, glucônico, glicérico e láctico; ácidos dibásicos, tais como aconítico, adípico, ascórbico, carbônico, glutâmico, málico, succínico e tartárico, ácidos polibásicos, tais como cítrico e fosfórico; e bases, tais como amônia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e Tris.
[00122] Os veículos parenterais (para injeção subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer com lactato e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutriente, repositores de eletrólito, tais como aqueles com base em dextrose de Ringer, e similares. Exemplos são líquidos estéreis, tais como água e óleos, com ou sem a adição de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em geral, água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, glicois, tais como propilenoglicois ou polietilenoglicol, Polissorbato 80 (PS-80), Polissorbato 20 (PS-20) e Poloxâmero 188 (P188) são carreadores líquidos preferenciais, particularmente para soluções injetáveis. Exemplos de óleos são aqueles de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou um lipídio de leite ou ovos.
[00123] As formulações também podem conter um tensoativo. Os tensoativos preferenciais incluem, mas sem limitação: os tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (comumente denominados Tweens), especialmente PS-20 e PS-80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de butileno (BO), comercializados sob a denominação DOWFAX™, tais como copolímeros de bloco EO/PO linear; octoxinois, que podem variar no número de grupos de etóxi (oxi-1,2-etanodiil) de repetição, sendo que octoxinol- 9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipoli etóxi etanol) é de interesse particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídios, tais como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilados de nonilfenol, tais como as séries NP de Tergitol™; éteres de ácido graxo de polioxietileno derivados de álcoois laurílico, cetílico, estearílico e oleílico (conhecidos como tensoativos Brij), tais como trietilenoglicol monolauril éter (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Um tensoativo preferencial para incluir na emulsão é PS-20 ou PS-80.
[00124] As misturas de tensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas de PS-80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano, tal como polioxietileno sorbitano monooleato (PS-80) e um octoxinol, tal como t-octilfenoxipoli etóxi etanol (Triton X-100) também é adequada. Outra combinação útil compreende lauril 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol.
[00125] As quantidades preferenciais de tensoativos são: ésteres de polioxietileno sorbitano (tais como PS-80) 0,01 a 1% p/v, em particular, cerca de 0,1% p/v; octil- ou nonilfenoxi polioxietanois (tais como Triton X-100, ou outros detergentes na série Triton) 0,001 a 0,1% p/v, em particular, 0,005 a 0,02% p/v; éteres de polioxietileno (tais como lauril 9) 0,1 a 20% p/v, de modo preferencial, 0,1 a 10% p/v e, em particular, 0,1 a 1% p/v ou cerca de 0,5% p/v.
[00126] Em certas modalidades, a composição consiste, essencialmente, em L-histidina (20 mM), solução salina (150 mM) e 0,2% p/v de PS-20 a um pH de 5,8 com 250 μg/mL de APA (Adjuvante Fosfato de Alumínio). PS-20 pode estar na faixa de 0,005 a 0,1% p/v com a presença de PS-20 ou PS-80 em formulação com controle de agregação durante fabricação simulada e em transporte com o uso de acondicionamento primário. O processo consiste em combinar mescla de até 44 sorotipos de polissacarídeo de S. pneumoniae em L-histidina, cloreto de sódio e PS-20, então, combinar esse material mesclado com APA e cloreto de sódio com ou sem preservantes antimicrobianos.
[00127] A escolha de tensoativo pode precisar ser otimizada para diferentes produtos de fármaco e substâncias de fármaco. Para vacinas multivalentes contendo 15 ou mais sorotipos de polissacarídeo de S. pneumoniae, PS-20 e P188 são preferenciais. A escolha de substâncias químicas usadas para preparar o conjugado também pode influenciar a estabilização da formulação. Em particular, conforme exemplificado abaixo, conjugados de polissacarídeo-proteína de pneumococo preparados em solvente aquoso ou DMSO e combinados em uma composição multivalente mostram diferenças significativas em estabilidade dependendo dos sistemas de tensoativo particulares usados para a formulação.
[00128] Para as formulações descritas na presente invenção, um poloxâmero tem, de modo geral, um peso molecular na faixa de 1.100 Da a
17.400 Da, de 7.500 Da a 15.000 Da ou de 7.500 Da a 10.000 Da. O poloxâmero pode ser selecionado a partir de poloxâmero 188 ou poloxâmero 407. A concentração final do poloxâmero nas formulações da invenção é de 0,001 a 5% p/v ou 0,025 a 1% p/v. Um sistema de tensoativo que compreende um poloxâmero precisa compreender, adicionalmente, um poliol. Em certos aspectos, o poliol é propilenoglicol e está em uma concentração final de 1 a 20% p/v. Em certos aspectos, o poliol é polietilenoglicol 400 e está em uma concentração final de 1 a 20% p/v.
[00129] Os poliois adequados para as formulações são poliois poliméricos, particularmente, diois de poliéter incluindo, mas sem limitação, propilenoglicol e polietilenoglicol, éteres monometílicos de polietilenoglicol. O propilenoglicol está disponível em uma faixa de pesos moleculares do monômero de ~425 Da a ~2.700 Da. O polietilenoglicol e éter monometílico de polietilenoglicol também estão disponíveis em uma faixa de pesos moleculares de ~200 Da a ~35.000 Da incluindo, mas sem limitação, PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 e PEG MME 4000. Um polietilenoglicol preferencial é polietilenoglicol 400. A concentração final do poliol nas formulações pode ser 1 a 20% p/v ou 6 a 20% p/v.
[00130] A formulação também contém uma solução salina tamponada com pH. O tampão pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em tampão de Tris, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartrato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, L-histidina, glicina, succinato, HEPES ácido (4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico), MOPS ácido (3-(N- morfolino)propanosulfônico), MES ácido (2-(N- morfolino)etanosulfônico) e trietanolamina. O tampão tem a capacidade de tamponar uma solução a um pH na faixa de 4 a 10, 5,2 a 7,5 ou 5,8 a 7,0. Em certos aspectos, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato, succinato, L-histidina, MES, MOPS, HEPES, acetato ou citrato. O tampão pode ser selecionado,
adicionalmente, por exemplo, a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. As concentrações de tampão estão na faixa de 1 mM a 50 mM ou 5 mM a 50 mM. Em certos aspectos, o tampão é L-histidina em uma concentração final de 5 mM a 50 mM, ou succinato em uma concentração final de 1 mM a 10 mM. Em certos aspectos, a L-histidina está em uma concentração final de 20 mM ± 2 mM.
[00131] Embora a solução salina (isto é, uma solução contendo NaCl) seja preferencial, outros sais adequados para a formulação incluem, mas sem limitação, CaCl2, KCl e MgCl2 e combinações dos mesmos. Os agentes isotônicos não iônicos que incluem, mas sem limitação, sacarose, trealose, manitol, sorbitol e glicerol, podem ser usados em vez de um sal. As faixas de sal adequadas incluem, mas sem limitação, 25 mM a 500 mM ou 40 mM a 170 mM. Em um aspecto, a solução salina é NaCl, presente, de maneira opcional, em uma concentração de 20 mM a 170 mM.
[00132] Em uma modalidade preferencial, as formulações compreendem um tampão de L-histidina com cloreto de sódio.
[00133] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é entregue em um sistema de liberação controlada. Por exemplo, o agente pode ser administrado com o uso de infusão intravenosa, um emplastro transdérmico, lipossomas ou outros modos de administração. Em outra modalidade, materiais poliméricos são usados; por exemplo, em microesferas em ou um implante.
[00134] As composições desta invenção também podem incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae. Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para a inclusão incluem aquelas identificadas na Publicação de Pedido de Patente Internacional nos WO 02/083855 e WO 02/053761. Métodos Analíticos
Análise de peso molecular e concentração de conjugados com o uso de ensaio de HPSEC/UV/MALS/RI
[00135] As amostras conjugadas são injetadas e separadas por cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (HPSEC). A detecção é realizada com detectores de ultravioleta (UV), espalhamento de luz multiangular (MALS) e índice de refração (RI) em série. A concentração de proteína é calculada a partir de UV280 com o uso de um coeficiente de extinção. A concentração de polissacarídeo é deconvoluída do sinal de RI (contribuído tanto por proteína quanto polissacarídeo) com o uso dos fatores dn/dc que são a mudança em um índice refrativo de solução com uma mudança na concentração de soluto reportada em mL/g. O peso molecular médio das amostras é calculado por Astra software (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) com o uso das informações de concentração medida e de espalhamento de luz através de todo o pico de amostra. Há múltiplas formas de promediar valores do peso molecular para moléculas polidispersas. Por exemplo, peso molecular numérico médio Mn, peso molecular ponderal médio Pm e peso molecular z médio Mz (Molecules, 2015, 20:10.313-10.341). A menos que especificado, o termo "peso molecular", conforme usado ao longo do relatório descritivo, é o peso molecular ponderal médio. Determinação de consumo de lisina em proteína conjugada como uma medida do número de uniões covalentes entre polissacarídeo e proteína carreadora
[00136] A análise de aminoácido (AAA) Waters AccQ-Tag é usada para medir a extensão de conjugação em amostras de conjugado. As amostras são hidrolisadas com o uso de hidrólise de ácido de fase de vapor na estação de trabalho Eldex, para quebrar as proteínas carreadoras em seus componentes aminoácidos. Os aminoácidos livres são derivatizados com o uso de 6-
aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC). As amostras derivatizadas são, então, analisadas com o uso de UPLC com detecção UV em uma coluna C18. A concentração de proteína média é obtida com o uso de aminoácidos representativos diferentes de lisina. O consumo de lisina durante a conjugação (isto é, perda de lisina) é determinado pela diferença entre a quantidade medida média de lisina no conjugado e a quantidade esperada de lisina na proteína de partida. Teste de polissacarídeo livre
[00137] O polissacarídeo livre (isto é, polissacarídeo que não é conjugado com CRM197) na amostra de conjugado é medido primeiro precipitando-se proteína livre e conjugados com desoxicolato (DOC) e ácido clorídrico. Os precipitados são, então, removidos por filtração e os filtrados são analisados pela concentração de polissacarídeo livre através de HPSEC/UV/MALS/RI. O polissacarídeo livre é calculado como uma percentagem de polissacarídeo total medido através de HPSEC/UV/MALS/RI. Teste de proteína livre
[00138] O polissacarídeo livre, conjugado de polissacarídeo-CRM197 e CRM197 livre nas amostras de conjugado são separados por eletroforese capilar em modo de cromatografia eletrocinética micelar (MEKC). De maneira breve, as amostras são misturadas com tampão de corrida de MEKC contendo 25 mM de borato, 100 mM de SDS, pH 9,3, e são separadas em um capilar de sílica fundida simples pré-condicionado. A separação é monitorada a 200 nm e CRM197 livre é quantificada com uma curva padrão de CRM197. Os resultados de proteína livre são relatados como uma percentagem de teor total de proteína determinado pelo procedimento de HPSEC/UV/MALS/RI.
[00139] Após várias modalidades da invenção terem sido descritas com referência à descrição e desenhos anexos, deve-se entender que a invenção não se limita a essas modalidades precisas, e que várias mudanças e modificações podem ser efetuadas nas mesmas por um técnico no assunto sem se afastar do escopo ou espírito da invenção, conforme definido nas reivindicações anexas.
[00140] Os exemplos a seguir ilustram, mas não limitam a invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Preparação de Polissacarídeos Capsulares de S. pneumoniae
[00141] Os métodos de cultivo de pneumococos são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Os métodos para preparar polissacarídeos capsulares de pneumococos também são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, a Patente nº EP 0 497 524 B1. O processo descrito abaixo segue, de modo geral, o método descrito na Patente nº EP 0 497 524 B1 e é aplicável, de modo geral, a todos os sorotipos de pneumococos, exceto quando modificado de maneira específica.
[00142] Os isolados de pneumococos subtipos 23A e 23F foram obtidos junto a Merck Culture Collection. A cepa para o sorotipo 23B foi obtida junto ao Centro para Controle e Prevenção de Doenças (Atlanta, GA). Quando necessário, os subtipos podem ser diferenciados com base em reação de Quellung com o uso de antissoro específico. Consulte, por exemplo, a Patente nº US 5.847.112. Os isolados obtidos foram adicionalmente isolados de modo clonal plaqueando- se, em série, em dois estágios em placas de ágar que consistem em um meio livre de componente animal contendo peptona de soja, extrato de levedura e glicose sem hemina (exceto sorotipo 23F, que continha hemina). Os isolados clonais, para cada sorotipo, foram expandidos, de modo adicional, em cultura líquida com o uso de meios livres de componente animal contendo peptona de soja, extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de potássio, glicose e glicerol para preparar os bancos de célula pré-mestre.
[00143] A produção de cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico consistiu em uma expansão celular e fermentação de produção em batelada seguido de inativação química antes da purificação descendente. Para sorotipos diferentes de 23F, um frasco de banco celular descongelado de cada sorotipo foi expandido com o uso de um frasco de agitação orbital ou garrafa para cultura celular contendo um meio de crescimento livre de componente animal pré- esterilizado contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou ultrafiltrado de extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de potássio e glicose. A cultura de expansão celular foi desenvolvida em uma garrafa ou frasco de agitação vedado para minimizar a troca gasosa com controle de temperatura e agitação. Para o sorotipo 23F, um frasco de banco celular descongelado foi expandido com o uso de um reator biológico contendo o mesmo meio. Durante a expansão celular de sorotipo 23F, temperatura, pH, pressão e agitação foram controlados. A camada de fluxo de ar também foi controlada, visto que aspersão não foi usada.
[00144] Após alcançar uma densidade de cultura especificada, conforme medido por densidade óptica a 600 nm, uma porção da cultura de expansão celular foi transferida para um reator biológico de produção contendo meios de crescimento livres de componente animal pré-esterilizados contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou ultrafiltrado de extrato de levedura, cloreto de sódio, fosfato de potássio e glicose. A temperatura, pH, pressão e agitação foram controlados. A camada de fluxo de ar também foi controlada, visto que aspersão não foi usada.
[00145] A fermentação em batelada foi concluída através da adição de um agente de inativação químico, fenol, quando a glicose estava quase se esgotando. Fenol puro foi adicionado a uma concentração final de 0,8-1,2% para inativar as células e liberar o polissacarídeo capsular da parede celular. A inativação primária ocorre durante um tempo especificado dentro do reator biológico onde temperatura e agitação contínua devem ser controladas. Após a inativação primária, a batelada foi transferida para outro vaso onde a mesma foi mantida durante um tempo especificado adicional com temperatura e agitação controladas para inativação completa. Isso foi confirmado por técnicas de plaqueamento microbiano ou por verificação da concentração de fenol e tempo especificado. O caldo inativado foi, então, purificado. Purificação de Ps
[00146] A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu em diversas etapas de centrifugação, filtração profunda, operações de concentração/diafiltração e precipitação. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado de outro modo.
[00147] O caldo inativado das culturas de reator biológico de S. pneumoniae foi floculado com um polímero catiônico (tal como BPA-1000, Petrolite "Tretolite" e "Espectro 8160" e poli(etilenoimina), "Millipore pDADMAC"). Os polímeros catiônicos se ligaram à proteína de impureza, ácidos nucleicos e resíduos celulares. Após a etapa de floculação e um período de envelhecimento, os sólidos floculados foram removidos por meio de centrifugação e múltiplas etapas de filtração profunda. O caldo clarificado foi concentrado e diafiltrado com o uso de um filtro de 100 kDa a 500 kDa MWCO (peso molecular de corte). A diafiltração foi realizada com o uso de tampão de Tris, MgCl2 e tampão de fosfato de sódio. A diafiltração removeu ácido nucleico e proteína residuais.
[00148] A remoção adicional de impurezas foi realizada por reprecipitação do polissacarídeo em acetato de sódio e fenol com isopropanol e/ou álcool desnaturado. Durante a etapa de precipitação de fenol, acetato de sódio em tampão de solução salina de fosfato de sódio e fenol (fenois liquefeitos ou fenois sólidos) foi carregado para o retentado diafiltrado. O fracionamento de álcool do polissacarídeo foi, então, conduzido em dois estágios. No primeiro estágio, um álcool de baixo percentual foi adicionado à preparação para precipitar resíduos celulares e outras impurezas indesejadas, enquanto o polissacarídeo cru permaneceu na solução. As impurezas foram removidas por meio de centrifugação seguida de uma etapa de filtração profunda. O polissacarídeo foi, então, recuperado da solução acrescentando-se isopropanol adicional ou álcool desnaturado à batelada. O pélete de polissacarídeo precipitado foi recuperado por centrifugação, triturado e seco como um pó e armazenado congelado a - 70°C. EXEMPLO 2: Análises de Estrutura de RMN de Polissacarídeos
[00149] A estratégia para determinar a estrutura de polissacarídeo envolveu um processo de múltiplas etapas realizado substancialmente conforme descrito em Abeygunawardana et al., Determination of the Chemical Structure of Complex Polysaccharides by Heteronuclear NMR Spectroscopy in Advances in Biophysical Chemistry 1993, Vol 3, páginas 199-249, JAI Press Inc. Os polissacarídeos purificados foram examinados com o uso de técnicas de RMN 1D e 2D padrão. Por fim, os polissacarídeos foram examinados pela presença de fosfato com o uso de RMN de 31P.
[00150] As atribuições dos resíduos de monossacarídeo foram realizadas através de 1H-1H COSY, COSY homonuclear filtrado de quantum duplo e espectroscopia de correlação total (TOCSY). Os deslocamentos químicos de 13C foram atribuídos por espectroscopia de coerência heteronuclear de quantum simples (HSQC) e combinação HSQC-TOCSY. HSQC com multiplicidade editada foi usada para distinguir metileno de grupos metino. As ligações entre resíduos foram determinadas através de uma combinação de espectroscopia de HMBC e NOESY. A configuração anomérica dos resíduos foi determinada a partir dos deslocamentos químicos de carbono e próton anomérico, valores 3JH1,H2 e 1JH1,C1.
[00151] A espectroscopia de Fósforo por RMN 1D indicou que polissacarídeos de sorotipos 23A e 23B de S. pneumoniae continham fósforo na estrutura. A atribuição do sítio de ligação de fósforo foi determinada através de HMBC de 1Η-31Ρ.
[00152] Com base nos dados de RMN, nas Figuras 2 a 5, a estrutura para polissacarídeo de sorotipo 23A de S. pneumoniae foi determinada da seguinte forma: em que n representa o número de unidades de repetição que constitui o polissacarídeo. Consulte também a Figura 1A.
[00153] Com base nos dados de RMN, nas Figuras 2-5, a estrutura para polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniae foi determinada ser da seguinte forma: em que n representa o número de unidades de repetição que constitui o polissacarídeo. Consulte também a Figura 1B.
[00154] Os resíduos de açúcar para polissacarídeos de sorotipo 23A e 23B de S. pneumoniae incluem ramnose (Rha), galactose (Gal), glicose (Glc) e glicerol.
[00155] As letras em itálico (p e f) se referem a piranose (um anel fechado que consiste em seis átomos) e furanose (um anel fechado que consiste em cinco átomos).
[00156] α e β se referem à configuração do próton unida ao carbono anomérico da unidade de açúcar. O carbono anomérico é sempre número 1 ao identificar o átomo de carbono em uma unidade de açúcar (normalmente 1 a 6). α significa que o próton anomérico está na posição equatorial na estrutura 3D, β significa que o próton anomérico está na posição axial.
[00157] Os números associados às setas se referem a como as unidades de açúcar individuais são conectadas umas às outras. Por exemplo, a nomenclatura α-Rhap-(1→3)-α-Glcp- significa que o carbono número 1 de Ramnose está ligado ao carbono número 3 de Glicose (p significa que os mesmos são, ambos, anéis de piranose). Identificação de Sítios de Ativação
[00158] Os sítios de ativação foram identificados reagindo-se os aldeídos (normalmente hidratados) com tiossemicarbazida (TSC) em 5 mM de tampão citrato. TSC reage com aldeídos (bem como aldeídos hidratados) para formar uma imina (aldimina secundária). O próton imina formado tem um deslocamento químico único que é descendente aos sinais de polissacarídeo e foi usado para sondar os sítios de oxidação do polissacarídeo.
[00159] O polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniae oxidado foi diluído com tampão de citrato de sódio, então, reagido com tiossemicarbazida, misturado continuamente à temperatura ambiente e, então, liofilizado. A amostra liofilizada foi dissolvida com 0,9 mL de óxido de deutério para análise de RMN.
[00160] Os experimentos de RMN foram realizados a 600 MHz à temperatura de sonda de 25°C com o uso de uma sonda criogenicamente resfriada. Um espectro de próton 1D foi adquirido com o uso de um pulso de 90 graus com 16 transientes e um atraso de 10 segundos entre pulsos (incluindo 3 segundos de tempo de aquisição). Os dados de TOCSY e Gradient COSY foram adquiridos com 4 transientes na primeira dimensão e 256 e 512 incrementos na segunda dimensão, respectivamente. Os dados de NOESY foram adquiridos com 16 transientes na primeira dimensão e 256 incrementos na segunda dimensão.
[00161] Após a derivatização de TSC, todos os aldeídos ativados foram transformados em imina. O deslocamento químico de prótons de aldeído foi movido para 7-8 ppm, Figura 6. O resultado de experimento sugeriu que dois grupos de picos são formados entre 7,0 ppm e 7,5 ppm (7,28 ppm e 7,36-7,40 ppm). 2D TOCSY indicou uma correlação entre os picos 7,36-7.40 ppm com picos de CH3 de ramnose (~1,32 ppm; Figura 7), sugerindo que esses picos (7,36-7,40 ppm) são sinais de próton de ramnose 23B derivatizada de TSC. De acordo com a estrutura de polissacarídeo de sorotipo 23B não ativado, o único próton possível para picos de 7,36-7,40 ppm no anel de ramnose é H3.
[00162] Os dados de gCOSY indicaram que os picos a 5,46 ppm se correlacionam a picos a 7,28 ppm. Os dados de NOESY indicaram que os picos a 5,46 ppm estão em estreita proximidade com o pico a 7,37 ppm (H3). Esses dados sugeriram que os picos a 5,46 ppm pertencem a H1 de ramnose derivatizado de TSC, e os picos a 7,28 ppm pertencem a H2 de ramnose derivatizado de TSC, Figura 8.
[00163] De acordo com os dados acima, o principal sítio de ativação para o polissacarídeo de sorotipo 23B é na posição C2/C3 de ramnose, conforme indicado na Figura 1B. EXEMPLO 3: Conjugação de Polissacarídeo de sorotipo 23A de S. pneumoniae com CRM197 com o uso de Aminação Redutiva em Dimetilsulfóxido
[00164] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e tampão trocado por meio de ultrafiltração. O polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO). As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas, conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícrons. Diversos parâmetros de processo dentro de cada etapa, tais como pH, temperatura, concentração e tempo, foram controlados para render conjugados com atributos desejados. Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo
[00165] O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado a 0,45 mícrons. O polissacarídeo dissolvido teve o tamanho reduzido por hidrólise ácida ou por meio de homogeneização. A hidrólise ácida foi realizada adicionando-se ácido acético a 200 mM, incubando a 90°C durante 1,5 horas, então, neutralizando por meio de adição de tampão de fosfato de potássio frio pH 7 a 400 mM. Para homogeneização, pressão e número de passes através do homogeneizador foram controlados para 800-1.000 bar/5 passes (80- 100 Mpa/5 passes).
[00166] O polissacarídeo com tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 5 kDa NMWCO.
[00167] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22°C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de 100 mM de metaperiodato de sódio. O metaperiodato de sódio adicionado foi 0,20-0,24 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível alvo de ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu durante 2 horas a 22°C.
[00168] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 5 kDa NMWCO. A ultrafiltração foi conduzida a 2-8°C. Conjugação de polissacarídeo com CRM197
[00169] CRM197 purificada, obtida através de expressão em Pseudomonas fluorescens, conforme previamente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,0 com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 5 kDa NMWCO e filtrada a 0,2 mícrons.
[00170] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg Pr/mL com concentração de sacarose de 1% p/v.
[00171] As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi fortificada com cloreto de sódio para uma concentração de 25-50 mM. As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,8-3,0 g de Ps/L (gramas de polissacarídeo/litro) e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado e a conjugação prosseguiu durante 2 a 4 horas a 22°C. Redução com boroidreto de sódio
[00172] O boroidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado durante 1-3 horas a 22°C. A batelada foi diluída em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4°C. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. Para algumas bateladas, a batelada foi concentrada e diafiltrada a aproximadamente 4°C contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 30 kD NMWCO. Filtração Final e armazenamento de produto
[00173] A batelada foi, então, concentrada e diafiltrada contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4°C com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 300 kDa NMWCO.
[00174] A batelada de retentado foi filtrada a 0,2 mícrons, então, diluída com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, dispensada em alíquotas e congelada a ≤ -60°C.
[00175] A tabela 1 mostra os atributos de conjugado de sorotipo 23A preparado em DMSO. Tabela 1. Atributos de conjugado de sorotipo 23A de S. pneumoniae de conjugação de DMSO Ps oxidado Conjugado Ps:Pr Consumo Ps livre / Proteína Pm Pm de Lisina Ps total livre/Proteína (mol/mol total CRM197) 97 kD 3.837 kD 1,20 11,8 0,2% 0,6% 190 kD 5.620 kD 1,07 11,1 2,7% 3,0% EXEMPLO 4: Conjugação de Polissacarídeos de sorotipo 23B de S. pneumoniae com CRM197 com o uso de Aminação Redutiva em Dimetilsulfóxido
[00176] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e tampão trocado por meio de ultrafiltração. O polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO). As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas, conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícrons. Diversos parâmetros de processo dentro de cada etapa, tais como pH, temperatura, concentração e tempo, foram controlados para render conjugados com atributos desejados. Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo
[00177] O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado a 0,45 mícrons. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogeneização e o número de passes através do homogeneizador foram controlados para 400 bar/5 passes (40 Mpa/5 passes).
[00178] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 10 kDa NMWCO.
[00179] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22°C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de 100 mM de metaperiodato de sódio. O metaperiodato de sódio foi adicionado a 0,10-0,13 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível alvo de ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo).
[00180] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 10 kDa NMWCO. A ultrafiltração foi conduzida a 2-8°C. Conjugação de polissacarídeo com CRM197
[00181] CRM197 purificada, obtida através de expressão em Pseudomonas fluorescens, conforme previamente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,0 com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 5 kDa NMWCO e filtrada a 0,2 mícrons.
[00182] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg Pr/mL com concentração de sacarose de 1% p/v.
[00183] As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi fortificada com cloreto de sódio para uma concentração final de 0-50 mM. As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu durante 2-4 horas a 22°C. Redução com boroidreto de sódio
[00184] O boroidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado durante 1 hora a 22°C. A batelada foi diluída em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4°C. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. A batelada foi concentrada e diafiltrada a aproximadamente 4°C contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 30 kD NMWCO. Filtração Final e armazenamento de produto
[00185] A batelada foi, então, concentrada e diafiltrada contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4°C com o uso de uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de 300 kDa NMWCO.
[00186] A batelada de retentado foi filtrada a 0,2 mícrons, então, diluída com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, dispensada em alíquotas e congelada a ≤ -60°C.
[00187] A Tabela 2 mostra os atributos de conjugado de polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniaepreparado em DMSO. Tabela 2. Atributos de conjugado de polissacarídeo de sorotipo 23B de S. pneumoniae de conjugação de DMSO Ps oxidado Conjugado Ps:Pr Consumo Ps livre / Proteína Pm Pm de Lisina Ps total livre/Proteína (mol/mol total CRM197) 179 kD 3.299 kD 1,28 6,2 13% 5,1% Exemplo 5: Formulação de Conjugados Monovalentes
[00188] Os conjugados de polissacarídeo pneumocócico-CRM197 de sorotipos 23A e 23B foram preparados conforme descrito nos Exemplos 3 e 4. Os conjugados de polissacarídeo pneumocócico-CRM 197 de sorotipo 23F foram preparados conforme descrito na Patente nº US 8.192.746. O volume exigido de conjugados bulk necessários para obter a concentração alvo de sorotipos individuais foi calculado com base em volume de batelada e concentração de polissacarídeo bulk individual. Os conjugados bulk dos sorotipos de S. pneumoniae (23A, 23B e 23F) foram combinados com excipientes, filtrados de modo estéril e adicionados a APA sob condições de mistura. A concentração final de cada vacina conjugada monovalente foi 4 μg/mL (p/v PnPs) com 20 mM de histidina, 150 mM de NaCl, 0,2% (p/v) de PS-20 e 0,250 mg/mL (p/v A1) na forma de APA. EXEMPLO 6: Estudo de Imunogenicidade em Coelho Branco da Nova Zelândia de Conjugado Monovalente
[00189] A imunogenicidade dos conjugados monovalentes foi avaliada em um modelo de Coelho Branco da Nova Zelândia (NZWR). Os coelhos brancos da Nova Zelândia adultos (NZWR, n=3/grupo) foram imunizados de modo intramuscular (IM) com 0,25 mL de respectiva vacina conjugada monovalente no dia 0 e dia 14 (lados alternados). A vacina pneumocócica conjugada monovalente foi dosada a 1 μg de PnPs (polissacarídeo de sorotipo 23A ou 23B de S. pneumoniae conjugado, cada um, com CRM197) com 62,5 μg de adjuvante fosfato de alumínio (APA) por imunização. Soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós-dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos uma vez ao dia, por equipe treinada em cuidados com animais, em busca de quaisquer sinais de doença ou estresse. As formulações de vacina em NZWRs foram consideradas seguras e bem toleradas. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animal tanto em Merck & Co., Inc (Kenilworth, NJ) quanto Covance (Denver, PA).
[00190] Os soros de NZWR foram testados em ensaios ELISA para avaliar a imunogenicidade de IgG com o uso de uma concentração de revestimento de 1 a 2 mg/mL de respectivo PnPs. O anticorpo funcional foi determinado por meio de ensaios de opsonofagocitose (OPA) com base em protocolos previamente descritos. Consulte, por exemplo, Caro-Aguilar et al., 2017, Vaccine 35:865-72 e
Burton et al., 2006, Clin Vaccine Immunol 13(9):1.004-9.
[00191] Constatou-se que as vacinas conjugadas de polissacarídeo pneumocócico monovalentes de S. pneumoniae de sorotipos 23A e 23B são imunogênicas em coelhos (Figura 9) e geram anticorpo funcional que exterminou a respectiva cepa bacteriana (Figura 10). EXEMPLO 7: Estudo de Imunogenicidade em Coelho Branco da Nova Zelândia de Conjugado Monovalente (proteção cruzada de 23A, 23B, 23F)
[00192] Os coelhos foram imunizados com 23A-CRM197/APA, 23B- CRM197/APA ou 23F-CRM197/APA para avaliar a reatividade cruzada entre cada sorotipo de S. pneumoniae.
[00193] De modo geral, os coelhos imunizados com vacinas conjugadas monovalentes de sorogrupo 23 de S. pneumoniae tiveram os maiores títulos de IgG e OPA para o polissacarídeo homólogo e cepa bacteriana, respectivamente (Figuras 11A-B, 12A-B, 13A-13B). 23A-CRM197/APA e 23F-CRM197/APA mostraram pouca/nenhuma reatividade cruzada para PnPs de sorogrupo 23B de S. pneumoniae e cepa bacteriana quando comparado aos coelhos imunizados com o conjugado 23B-CRM197/APA (Figuras 12A-B). Com o uso de múltiplos testes de comparação de Dunnett, os coelhos imunizados com 23B- CRM197/APA tiveram imunogenicidade de IgG significativamente maior quando comparado aos coelhos imunizados com 23A-CRM197/APA e 23F- CRM197/APA (P= 0,007 e 0,016, respectivamente) (Figura 12A). Do mesmo modo, os coelhos imunizados com 23B-CRM197/APA tiveram anticorpo funcional significativamente maior quando comparado aos coelhos imunizados com 23A- CRM197/APA e 23F-CRM197/APA (P= 0,0002 e 0,002, respectivamente) (Figura 12B). Para abranger o sorogrupo 23 de S. pneumoniae, uma vacina de conjugado de polissacarídeo pneumocócico deve compreender pelo menos polissacarídeos de sorotipo 23A/23F e polissacarídeo de sorotipo 23B para proteger contra sorotipos 23A, 23B e 23F de S. pneumoniae. EXEMPLO 8: Formulação de Vacinas Pneumocócicas Conjugadas para Estudo Polivalente em Coelho
[00194] Uma vacina pneumocócica conjugada multivalente que consiste em diferentes preparações de mescla bulk de conjugado (incluindo sorotipos de S. pneumoniae 16F, 23A, 23B, 24F e 31) foi preparada com o uso de conjugados de polissacarídeo pneumocócico-CRM197 e foi formulada em 20 mM de histidina pH 5,8 e 150 mM de cloreto de sódio e 0,1% p/v de polissorbato-20 (PS- 20) a 4 μg/mL de cada sorotipo para uma concentração total de polissacarídeo de 84 μg/mL. Os conjugados foram preparados conjugando-se, individualmente, a proteína CRM197 com tipos de polissacarídeo pneumocócico (PnPs) (incluindo sorotipos de S. pneumoniae 16F, 23A, 23B, 24F e 31). O volume exigido de conjugados bulk necessários para obter a concentração alvo de sorotipos individuais foi calculado com base em volume de batelada e concentração de polissacarídeo bulk individual. Os conjugados individuais foram adicionados a uma solução de histidina, cloreto de sódio e Polissorbato-20 (PS-20) para criar a mescla de conjugado. O vaso de formulação contendo a mescla de conjugado foi misturado com o uso de uma barra de agitação magnética, e filtrado de modo estéril em outro vaso. As formulações foram, então, preenchidas em seringas plásticas, seringas de vidro ou frascos, e armazenadas a 2-8°C. EXEMPLO 9: Imunogenicidade de uma Vacina Pneumocócica Conjugada Multivalente em Coelhos Brancos da Nova Zelândia
[00195] Os coelhos brancos da Nova Zelândia adultos (NZWR, n=5/grupo) foram imunizados de modo intramuscular (IM) com 0,5 mL da vacina pneumocócica conjugada multivalente, descrita no Exemplo 8, no dia 0 e dia 14 (lados alternados). A vacina pneumocócica conjugada multivalente foi dosada a 2 μg de cada PnPs conjugado por imunização. Soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós-dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos uma vez ao dia, por equipe treinada em cuidados com animais, em busca de quaisquer sinais de doença ou estresse. As formulações de vacina em NZWRs foram consideradas seguras e bem toleradas. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animal tanto em Merck & Co., Inc quanto Covance (Denver, PA).
[00196] Os soros de NZWR foram avaliados pela imunogenicidade de IgG com o uso de um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexado (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soro de coelho com base no ensaio humano descrito por Marchese et al. (Optimization and validation of a multiplex, electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in human serum. Clin Vaccine Immunol. 16(3): 387-96 (2009)) com o uso de tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão de MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) que utiliza uma identificação SULFO-TAG™ que emite luz mediante estímulo eletroquímico. IgG de anti-coelho identificado como SULFO- TAG™ foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de NZWR. O anticorpo funcional foi determinado por meio de ensaios opsonofagocítico multiplexados (MOPA) com base em protocolos previamente descritos disponíveis on-line no Bacterial Respiratory Pathogen Reference Laboratory na Universidade do Alabama em Birmingham com o uso de Opsotiter® 3 software (UAB Research Foundation, Caro-Aguilar et al., 2017, supra, Burton et al., 2006, supra).
[00197] Constatou-se que os conjugados de polissacarídeo-proteína preparados a partir de sorotipos 16F, 23A, 23B, 24F e 31 de S. pneumoniae em uma vacina pneumocócica conjugada multivalente são imunogênicos tanto para pós-dose 1 (PD1) quanto pós-dose 2 (PD2) em coelhos (Figura 14). Os mesmos também geraram anticorpo funcional que exterminou cepas bacterianas do tipo da vacina (Figura 15). Os coelhos imunizados com a vacina pneumocócica conjugada multivalente na dose de 2 μg tiveram títulos de PD1 MOPA significativamente maiores para quatro sorotipos quando comparado a soros de coelho pré-imunes (Figura 15). Os coelhos imunizados com a vacina pneumocócica conjugada multivalente na dose de 2 μg tiveram títulos de PD2 MOP A significativamente maiores para todos os cinco sorotipos quando comparado a soros de coelho pré-imunes (Figura 15). Os dados transformados por log foram analisados por One-way ANOVA com teste de Dunnett para determinar a significância.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES
1. Um polissacarídeo purificado compreendendo uma unidade de repetição que tem uma das seguintes estruturas: sorotipo 23A: ou sorotipo 23B:
2. O polissacarídeo da reivindicação 1, em que o polissacarídeo tem entre 10 e 5000 unidades de repetição.
3. O polissacarídeo da reivindicação 1, em que o polissacarídeo tem entre 100 e 2500 unidades de repetição.
4. O polissacarídeo da reivindicação 1, em que o polissacarídeo tem um peso molecular médio de 50 kDa a 4000 kDa conforme determinado por MALS.
5. O polissacarídeo da reivindicação 1, em que o polissacarídeo tem um peso molecular de 80 kDa a 2000 kDa conforme determinado por MALS.
6. O polissacarídeo da reivindicação 1, compreendendo uma unidade de repetição de:
7. O polissacarídeo da reivindicação 1, compreendendo uma unidade de repetição de:
8. Um polissacarídeo ativado produzido a partir de um polissacarídeo que tem uma unidade de repetição de uma das seguintes estruturas: sorotipo 23 A: ou sorotipo 23B:
em que o polissacarídeo é ativado com um reagente químico para produzir grupos reativos para conjugação com um ligante ou proteína carreadora.
9. O polissacarídeo ativado da reivindicação 8, em que a ativação de sorotipo 23A ocorre na α-Rhap ou β-Glcp ou a ativação de 23B ocorre na β-Glcp ou β-Rhap.
10. O polissacarídeo ativado da reivindicação 8, em que o polissacarídeo é ativado com periodato.
11. O polissacarídeo ativado da reivindicação 10, em que a ativação de sorotipo 23A ocorre na 2a ou 3a posição de carbono de α-Rhap ou β-Glcp ou a ativação de sorotipo 23B ocorre na 2a ou 3a posição de carbono de β-Glcp ou β- Rhap.
12. O polissacarídeo ativado da reivindicação 11, em que extensão de ativação de sorotipo 23B na 2a ou 3a posição de carbono de β-Rhap é maior do que a extensão de ativação na 2a ou 3a posição de carbono de β-Glcp.
13. Um conjugado polissacarídeo-proteína com um polissacarídeo que tem uma unidade de repetição de uma dentre as seguintes estruturas: sorotipo 23 A:
ou sorotipo 23B: conjugada a proteína carreadora.
14. O conjugado polissacarídeo-proteína da reivindicação 13, em que a proteína carreadora é CRM197, fragmento B de toxina diftérica (DTFB), DTFB C8, toxoide diftérico (DT), toxoide tetânico (TT), fragmento C de TT, toxoide pertussis, toxoide colérico, E. coli LT, E. coli ST ou exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa.
15. O conjugado polissacarídeo-proteína da reivindicação 14, em que a proteína carreadora é CRM197.
16. O conjugado polissacarídeo-proteína da reivindicação 15, em que o conjugado de polissacarídeo-proteína tem um peso molecular de 1.000 kDa a
10.000 kDa.
17. O conjugado polissacarídeo-proteína da reivindicação 15, em que o conjugado de polissacarídeo-proteína tem uma razão entre polissacarídeo e proteína de 0,4 a 2,0.
18. O conjugado polissacarídeo-proteína da reivindicação 13, em que a proteína é conjugada ao polissacarídeo de sorotipo 23B através do 2o ou 3o carbono do açúcar ramnose.
19. Uma composição imunogênica compreendendo o conjugado polissacarídeo-proteína de qualquer uma das reivindicações 13 a 18; e um carreador farmaceuticamente aceitável.
20. A composição imunogênica da reivindicação 19, compreendendo adicionalmente um conjugado polissacarídeo-proteína que compreende polissacarídeos capsulares de pelo menos um dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F e 38 de Streptococcus pneumoniae conjugado à CRM 197.
21. A composição imunogênica da reivindicação 19, compreendendo conjugados polissacarídeo-proteína que compreendem polissacarídeos capsulares dos sorotipos 23A e 23B.
22. A composição imunogênica da reivindicação 20, compreendendo conjugados polissacarídeo-proteína que compreendem polissacarídeos capsulares de sorotipos 23B e 23F.
23. A composição imunogênica da reivindicação 20, que é formulada para conter: 0,4 a 4 μg/mL de cada polissacarídeo, exceto pelo polissacarídeo de sorotipo 6B que, caso presente, contém 0,8 a 8 μg/mL de polissacarídeo; e proteína carreadora CRM197 em uma quantidade de cerca de 0,5x a 3x a quantidade total de polissacarídeo.
24. A composição imunogênica da reivindicação 23, compreendendo adicionalmente 150 mM de cloreto de sódio, 20 mM de tampão de L-histidina e 0,05 a 2% p/v de tensoativo.
25. A composição imunogênica da reivindicação 24, compreendendo adicionalmente um adjuvante.
26. A composição imunogênica da reivindicação 25, em que o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio.
27. A composição imunogênica da reivindicação 26, em que o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.
28. A composição imunogênica da reivindicação 27, em que o adjuvante é fosfato de alumínio.
29. A composição imunogênica da reivindicação 28, em que o adjuvante fosfato de alumínio está presente em uma concentração de 0,05 a 0,5 mg/mL.
30. A composição imunogênica da reivindicação 28, compreendendo adicionalmente 150 mM de cloreto de sódio, 20 mM de tampão de L-histidina e 0,05 a 2% p/v de tensoativo.
31. Um método para induzir uma resposta imunológica a um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, compreendendo administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica de qualquer uma das reivindicações 19 a 30.
32. O método da reivindicação 31, em que a composição imunogênica é uma dose única de 0,5 mL formulada para conter: 2 μg de cada polissacarídeo, exceto pelo polissacarídeo de sorotipo 6B que, caso presente, está a 4 μg; cerca de 32 μg de proteína carreadora CRM197; 0,125 mg de adjuvante fosfato de alumínio; 150 mM de cloreto de sódio, 20 mM de tampão de L-histidina e 0,2% p/v de PS-20.
33. Um método para prevenir uma infecção, doença ou condição por Steptococcus pneumoniae associada ao sorotipo 23F de S. pneumoniae em um indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar uma quantidade profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica da reivindicação 21.
34. Um método para prevenir uma infecção, doença ou condição por Steptococcus pneumoniae associada ao sorotipo 23A de S. pneumoniae em um indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar uma quantidade profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica da reivindicação 22.
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