KR20210005158A - 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법 - Google Patents

스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210005158A
KR20210005158A KR1020207033918A KR20207033918A KR20210005158A KR 20210005158 A KR20210005158 A KR 20210005158A KR 1020207033918 A KR1020207033918 A KR 1020207033918A KR 20207033918 A KR20207033918 A KR 20207033918A KR 20210005158 A KR20210005158 A KR 20210005158A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polysaccharide
carrier protein
streptococcus pneumoniae
solutions
dried
Prior art date
Application number
KR1020207033918A
Other languages
English (en)
Inventor
패트릭 레너드 알
아킬레쉬 밤바니
크리스토퍼 존 패럴
패트릭 맥휴
모리사 씨. 존스
다니엘 디. 로쓰
제시카 알. 시나콜라
저스틴 스탄브로
매튜 피. 왓슨
에밀리 웬
마이클 에이. 윈터스
Original Assignee
머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 filed Critical 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Publication of KR20210005158A publication Critical patent/KR20210005158A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

특정한 폐렴구균 혈청형의 1종 이상의 활성화된 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 개별적으로 동결건조시키고, 개별적으로 동결건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성한 다음, 재구성된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 티-혼합에 의해 함께 조합하고 함께 접합시켜 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는, 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 방법이 기재된다. 각각 특정한 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하는 복수의 접합체는 백신에 사용하기 위한 접합체의 조합을 갖는 다가 폐렴구균 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

Description

스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법
본 발명은 특정한 폐렴구균 혈청형의 1종 이상의 활성화된 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 개별적으로 동결건조시키며, 여기서 개별적으로 동결건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고, 이어서 재구성된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 티-혼합에 의해 함께 조합하고 함께 접합시켜 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 것인, 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 각각 특정한 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하는 복수의 접합체는 백신에 사용하기 위한 접합체의 조합을 갖는 다가 폐렴구균 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.
피막화된 박테리아의 한 예인 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)는 전세계적으로 심각한 질환의 유의한 원인이다. 1997년에, 질환 제어 및 예방 센터 (CDC)는 미국에서 매년 3,000건의 폐렴구균성 수막염 사례, 50,000건의 폐렴구균성 박테리아혈증 사례, 7,000,000건의 폐렴구균성 중이염 사례 및 500,000건의 폐렴구균성 폐렴 사례가 존재하는 것으로 추정하였다. 문헌 [Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13]을 참조한다. 추가로, 이들 질환의 합병증은 유의할 수 있으며, 일부 연구는 폐렴구균성 수막염에 의한 최대 8%의 사망률 및 25%의 신경계 후유증을 보고하고 있다. 문헌 [Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97]을 참조한다.
수년 동안 허가되어 온 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 백신은 성인, 특히 고령자 및 고위험자에서 폐렴구균성 질환을 예방하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, 영아 및 소아는 미접합 폐렴구균 폴리사카라이드에 불량하게 반응한다. 박테리아 폴리사카라이드는 T-세포-비의존성 면역원이며, 영아에서 약한 반응을 도출하거나 전혀 반응을 도출하지 않는다. 담체 단백질에 대한 박테리아 폴리사카라이드 면역원의 화학적 접합은 영아에서의 면역 반응을 T-세포-의존성 면역 반응으로 전환시킨다. 디프테리아 톡소이드 (DTx, DT의 화학적으로 해독된 버전) 및 CRM197은 그의 아미노산 서열 내 T-세포-자극 에피토프의 존재로 인해 박테리아 폴리사카라이드 면역원을 위한 담체 단백질로서 설명되어 왔다.
따라서, 담체 단백질에 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신이 개발되었고, 추가의 것이 개발 중이다. 개발된 접합체 백신의 예는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 유형 b (Hib) 접합체 백신 (예를 들어, Hib타이터(HIBTITER)®) 뿐만 아니라 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)에 대한 접합체 백신 (예를 들어, 프리베나르(PREVNAR)® 및 프리베나르 13®) 및 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)에 대한 접합체 백신 (예를 들어, 멘주게이트(MENJUGATE)®)을 포함한다.
담체 단백질에 대한 폴리사카라이드 항원의 접합 시, 반응 혼합물을 정제하여 접합된 단백질을 갖지 않는 유리 폴리사카라이드, 접합된 폴리사카라이드 항원을 갖지 않는 유리 담체 단백질 및 저분자량 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제거할 수 있다. 유리 폴리사카라이드, 유리 단백질 및 저분자량 접합체의 정제를 위한 다양한 방법, 예를 들어 소수성 크로마토그래피, 접선 한외여과, 투석여과 등이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO00/38711, 미국 특허 번호 6,146,902 및 문헌 [Lei et al., 2000, Dev. Biol. 103:259-264]을 참조한다. 유리 폴리사카라이드의 양을 감소시키는 방법은 미국 특허 번호 7,709,001 및 미국 공개 출원 번호 20110201791에 개시된 바와 같은 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 공동-동결건조를 추가로 포함하며, 이들 문헌은 또한, 특히 피막 폴리사카라이드 19A에 관하여, 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 공동-동결건조가 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 개별 동결건조보다 바람직하다는 것을 제시하였다. 그러나, 공동-동결건조는 덜 편리한 취급으로 개별 제제 및 사이클 파라미터를 최적화할 수 없게 하고, 목적하는 용액 크기를 갖는 담체 단백질 및 폴리사카라이드 혈청형 공급물을 생산할 수 없게 한다.
따라서, 유리 폴리사카라이드 및 저분자량 접합체와 같은 불순물이 없는 안정한 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 개선된 방법에 대한 필요성이 계속 존재한다.
본 발명은 폐렴구균 백신으로서 사용하기 위한 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 다양한 승화 공정을 사용하여 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 개별 동결건조물을 제조한 다음, 이를 접합 공정에 사용하여 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조한다. 개별 건조 공정은 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 공동-동결건조에 비해 다양한 이점, 예컨대 비제한적으로, 개별 제제 및 사이클 파라미터를 최적화하는 능력, 편리한 취급, 및 목적하는 용액 크기를 갖는 개별 폴리사카라이드 및 담체 단백질 제제를 생산하는 능력을 제공한다.
본 발명은
(A) 담체 단백질에 공유 연결된 1종의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 건조된 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 건조된 조성물을 제공하는 단계;
(b) 제1 건조된 조성물 및 제2 건조된 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액 및 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액을 제공하는 단계;
(c) 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하여 혼합물을 생산하는 단계; 및
(d) 혼합물에 환원제를 첨가하여, 1종의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함하고;
(B) 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 건조된 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 건조된 조성물을 제공하는 단계;
(b) 제1 건조된 조성물 및 제2 건조된 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액 및 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액을 제공하는 단계;
(c) 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하여 혼합물을 생산하는 단계; 및
(d) 혼합물에 환원제를 첨가하여 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 1종 이상의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함하고;
(C) 담체 단백질에 공유 연결된 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 건조된 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 건조된 조성물을 제공하는 단계;
(b) 제1 건조된 조성물 및 제2 건조된 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여 2종 이상의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액 및 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액을 제공하는 단계;
(c) 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하여 혼합물을 생산하는 단계; 및
(d) 혼합물에 환원제를 첨가하여 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 2종 이상의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함한다.
방법의 특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 건조된 조성물은 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된 승화 건조 공정에 의해 제조된다. 추가 실시양태에서, 승화 건조 공정은 제1 수용액 및 제2 수용액을 케이크 또는 리오스피어 비드의 형태로 동결시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 승화 건조는 금속 트레이, 플라스틱 트레이, 플라스틱 백 및 부류 I 튜빙 바이알로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에서 수행되는 벌크 건조이다.
특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 건조된 조성물은 1종, 2종 또는 그 초과의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 수용액 및 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 제2 수용액을 승화 건조시켜 제1 및 제2 건조된 조성물을 생산함으로써 제조되며, 여기서 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% (w/v) 이상의 수크로스를 포함하고, 여기서 승화 건조는 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 4% 내지 6% (w/v) 수크로스를 포함하고, 제2 수용액은 약 4% 내지 8% (w/v) 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6, 9, 10 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 아세톤 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분으로 포함된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서 제1 및 제2 균질 용액을 제조하기 위한 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 15분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 10분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액은 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하기 전 약 6시간 이하 동안 DMSO 용액 중에 존재한다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는 시트레이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득된다.
특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드이다. 특정한 실시양태에서, 불활성화된 박테리아 톡소이드는 CRM197이다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
본 발명은 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) (i) 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 수용액 및 (ii) 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 제2 수용액을 제공하는 단계;
(b) 제1 수용액 및 제2 수용액을 승화 건조 공정에서 개별적으로 건조시켜 건조된 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 제1 건조된 조성물 및 건조된 담체 단백질을 포함하는 제2 건조된 조성물을 생산하는 단계;
(c) 건조된 조성물에 유기 용매를 첨가하고 혼합하여 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액 및 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액을 제공함으로써, 제1 건조된 조성물 및 제2 건조된 조성물을 개별적으로 재구성하는 단계;
(d) 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하여 혼합물을 생산하는 단계; 및
(e) 혼합물에 환원제를 첨가하여, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함한다.
방법의 특정한 실시양태에서, 승화 건조 공정은 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 승화 건조 공정은 제1 및 제2 수용액을 케이크 또는 리오스피어 비드의 형태로 동결시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 승화 건조는 금속 트레이, 플라스틱 트레이, 플라스틱 백 및 부류 I 튜빙 바이알로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에서 수행되는 벌크 건조이다.
특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% (w/v) 이상의 수크로스를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 4% 내지 6% (w/v) 수크로스를 포함하고, 제2 수용액은 약 4% 내지 8% (w/v) 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6, 9, 10 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 아세톤 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분으로 포함된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서 제1 및 제2 균질 용액을 제조하기 위한 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 혼합은 15분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 혼합은 10분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액은 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하기 전 약 6시간 이하 동안 DMSO 용액 중에 존재한다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는 시트레이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 1종 이상의 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득된다.
특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드이다. 특정한 실시양태에서, 불활성화된 박테리아 톡소이드는 CRM197이다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
본 발명은 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은
(a) (i) 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액; 또는
(ii) 각각 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액
을 제공하는 단계;
(b) 각각 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 2종 이상의 제2 수용액을 제공하고, 여기서 2종 이상의 제2 수용액의 양은 적어도 2종 이상의 제1 수용액의 양에 상응하는 것인 단계;
(c) 2종 이상의 제1 수용액 및 2종 이상의 제2 수용액을 승화 건조 공정에서 개별적으로 건조시켜, 각각 건조된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 건조된 조성물 및 각각 건조된 담체 단백질을 포함하는 2종 이상의 제2 건조된 조성물을 생산하는 단계;
(d) 2종 이상의 제1 건조된 조성물 각각 및 2종 이상의 제2 건조된 조성물 각각을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 독립적으로 (i) 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드 또는 (ii) 2종 이상의 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 균질 용액 및 각각 담체 단백질을 포함하는 2종 이상의 제2 균질 용액을 제공하는 단계;
(e) 각각의 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 티-혼합에 의해 개별적으로 조합하여 복수의 혼합물을 생산하는 단계;
(f) 복수의 혼합물에 환원제를 첨가하여 복수의 접합체 용액을 생산하는 단계; 및
(g) 복수의 접합체 용액 중 2종 이상을 조합하여, 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 포함한다.
방법의 특정한 실시양태에서, 적어도 1종의 접합체 용액은 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조되거나; 또는 적어도 1종의 접합체 용액은 제1 수용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조되거나; 또는 각각의 접합체 용액은 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조되거나; 또는 각각의 접합체 용액은 제1 수용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조된다.
방법의 특정한 실시양태에서, 승화 건조 공정은 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 승화 건조 공정은 제1 및 제2 수용액을 케이크 또는 리오스피어 비드의 형태로 동결시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 건조는 금속 트레이, 플라스틱 트레이, 플라스틱 백 및 부류 I 튜빙 바이알로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에서 수행되는 벌크 건조이다.
특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 건조된 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% (w/v) 이상의 수크로스를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 4% 내지 6% (w/v) 수크로스를 포함하고, 제2 수용액은 약 4% 내지 8% (w/v) 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6, 9, 10 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 아세톤 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분으로 포함된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서 제1 및 제2 균질 용액을 제조하기 위한 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 혼합은 15분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 혼합은 10분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액은 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하기 전 약 6시간 이하 동안 DMSO 용액 중에 존재한다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는 시트레이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득된다.
특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드이다. 특정한 실시양태에서, 불활성화된 박테리아 톡소이드는 CRM197이다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
본 발명은 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법을 추가로 포함하며, 이 방법은
(a) 23종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 23종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 23종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 23종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 23종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 23종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(c) 23종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 23종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 혼합물을 생산하고, 여기서 23종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 23종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 23종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 23종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 23종의 접합체 용액을 조합하여 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F에 대한 다가 면역원성 복합체 또는 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F에 대한 다가 면역원성 복합체 또는 백신을 제조하는 방법을 추가로 포함하며, 이 방법은
(a) 15종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 15종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 15종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 15종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 15종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 15종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계,
(c) 15종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 15종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 혼합물을 생산하고, 여기서 15종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 15종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 15종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 15종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 15종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은
(a) 13종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 13종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 13종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 13종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 13종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 13종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(c) 13종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 13종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 혼합물을 생산하고, 여기서 13종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 13종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 13종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 13종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 13종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은
(a) 10종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 10종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 10종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 10종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 10종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 10종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(c) 10종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 10종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 혼합물을 생산하고, 여기서 10종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 10종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 10종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 10종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 10종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 각각의 건조된 담체 단백질 조성물은 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖고, 각각의 건조된 폴리사카라이드 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
방법의 특정한 실시양태에서, 각각의 건조된 담체 단백질 및 건조된 폴리사카라이드 조성물은 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수를 포함하는 승화 건조 공정에 의해 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 승화 건조는 금속 트레이, 플라스틱 트레이, 플라스틱 백 및 부류 I 튜빙 바이알로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에서 수행되는 벌크 건조이다. 추가 실시양태에서, 승화 건조 공정은 담체 단백질을 포함하는 각각의 수용액 및 폴리사카라이드를 포함하는 각각의 수용액을 케이크 또는 리오스피어 비드의 형태로 개별적으로 동결시키는 것을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 건조된 담체 및 건조된 폴리사카라이드 조성물은 각각 상기 언급된 바와 같은 특정한 열거된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 복수의 개별 수성 폴리사카라이드 용액 및 각각 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 다수의 수성 담체 단백질 용액을 승화 건조시켜 건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질 조성물을 생산함으로써 제조되며, 여기서 수성 담체 단백질 용액의 수는 적어도 수성 폴리사카라이드 용액의 수에 상응하고, 여기서 수성 폴리사카라이드 및 담체 단백질 용액은 각각 약 0.5% (w/v) 이상의 수크로스를 포함하고, 여기서 승화 건조는 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 수성 폴리사카라이드 및 담체 단백질 용액은 각각 약 0.5% (w/v) 이상의 수크로스를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 수성 폴리사카라이드 용액은 각각 약 4% 내지 6% (w/v) 수크로스를 포함하고, 수성 담체 단백질 용액은 각각 약 4% 내지 8% (w/v) 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 수성 폴리사카라이드 용액은 각각 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 수성 담체 단백질 용액은 각각 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 수성 폴리사카라이드 용액은 각각 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 수성 담체 단백질 용액은 각각 약 6, 9, 10 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 아세톤 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분으로 포함된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서 제1 및 제2 균질 용액을 제조하기 위한 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 15분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 단계 (b)에서의 혼합은 10분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액은 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하기 전 약 6시간 이하 동안 DMSO 용액 중에 존재한다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
도 1은 성분 조합, 및 이들이 폴리사카라이드 (Ps) 농도, CRM197 (Pr) 농도의 성분 농도 및 Ps 대 Pr의 비 (Ps:Pr)에 대해, Ps 용액에의 Pr 용액 첨가 동안 나타내는 효과를 보여준다 (성분을 무수 DMSO 중 6 mg/mL로 초기에 용해시키고 1:1의 최종 Ps:Pr 비로 조합하였다).
도 2는 성분 조합, 및 이들이 폴리사카라이드 (Ps) 농도, CRM197 (Pr) 농도의 성분 농도 및 Ps 대 Pr의 비 (Ps:Pr)에 대해, Pr 용액에의 Ps 용액 첨가 동안 나타내는 효과를 보여준다 (성분을 무수 DMSO 중 6 mg/mL로 초기에 용해시키고 1:1의 최종 Ps:Pr 비로 조합하였다).
도 3은 성분 조합, 및 이들이 폴리사카라이드 (Ps) 농도, CRM197 (Pr) 농도의 성분 농도 및 Ps 대 Pr의 비 (Ps:Pr)에 대해, Pr 용액에의 동결건조된 Ps 첨가 동안 나타내는 효과를 보여준다 (Pr을 무수 DMSO 중 3 mg/mL로 초기에 용해시키고 이를 사용하여 동결건조된 Ps를 용해시켰다).
도 4는 성분 조합, 및 이들이 폴리사카라이드 (Ps) 농도, CRM197 (Pr) 농도의 성분 농도 및 Ps 대 Pr의 비 (Ps:Pr)에 대해, 개별 접합 용기에의 Pr 용액 및 Ps 용액의 동시 첨가 동안 나타내는 효과를 보여준다 (성분을 무수 DMSO 중 6 mg/mL로 초기에 용해시켰으며, 성분 부피 첨가 속도는 동일하였다).
도 5는 무수 DMSO 중에서 빠른 (2분) 대 느린 (8분) 재구성을 사용한 CRM197의 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 6은 무수 DMSO 중 중간 재구성 (4분)에 이어서 유지 시간의 증가 (30분; 60분; 120분; 180분; 240분; 300분)를 사용한 CRM197의 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 7은 상이한 농도 (10mg/mL; 30mg/mL; 50mg/mL)에서 무수 DMSO 중 빠른 재구성 (2분)을 사용한 CRM197의 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 8a 및 8b는 10 mg/mL (도 8a) 및 30 mg/mL (도 8b)에서 무수 DMSO 중 빠른 재구성 (2분)을 사용한 CRM197의 동적 광 산란 (DLS) 프로파일을 보여준다. 각각의 샘플에 대해 3종의 측정치를 수집하였다 (3종의 트레이스).
도 9는 상이한 수준의 물을 갖는 DMSO (무수 DMSO; 99% DMSO/물; 97% DMSO/물; 95% DMSO/물) 중 빠른 재구성 (2분)을 사용한 CRM197의 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 10은 무수 DMSO 중 빠른 (2분) 대 느린 (8분) 재구성 (빠른 (2분); 느린 (8분))을 사용한 추가의 건조 동결건조된 CRM197의 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 11은 CRM197:폴리사카라이드 혈청형 6B (CRM197-6B) 접합체의 FTIR 스펙트럼을 보여주며, 여기서 CRM197은 폴리사카라이드 6B 접합 전에 빠르게 (2분) 또는 느리게 (8분) 재구성되었다. 또한, 수성 조건 하에 폴리사카라이드 6B에 접합된 CRM197이 제시된다.
도 12는 담체 단백질 (Pr) 폴리사카라이드 (Ps) 접합체를 제조하는 개략도를 보여준다.
도 13은 증가하는 크기의 폴리사카라이드를 사용하는 반응으로부터 생성되는 접합체의 크기를 보여준다. 그래프는 느린 무수 DMSO 첨가가 빠른 무수 DMSO 첨가보다 동일한 크기의 폴리사카라이드로부터 훨씬 더 큰 접합체를 생성한다는 것을 보여준다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "폴리사카라이드" (Ps)는 "사카라이드", "올리고사카라이드", "폴리사카라이드", "리포사카라이드", "리포-올리고사카라이드 (LOS)", "리포폴리사카라이드 (LPS)", "글리코실레이트", "당접합체" 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 면역학적 및 박테리아 백신 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 항원성 사카라이드 요소 (또는 항원성 단위)를 포함하는 것으로 의도된다. 문맥에 따라, Ps는 단수형 또는 복수형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "포함하다"는 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용되는 경우에 임의의 다른 성분 (항원 혼합물에 대해 "로 이루어진"이라는 표현의 제한을 받음), 예컨대 아주반트 및 부형제를 포함함을 지칭한다. 용어 "이루어진"은 다가 폴리사카라이드-단백질 접합체 혼합물과 함께 사용되는 경우에 상기 특정한 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 갖고 상이한 혈청형으로부터의 다른 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체는 갖지 않는 혼합물을 지칭한다.
본원에 정의된 용어 "침전", "침전물", "미립자 형성", "혼탁" 및 "응집"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 폴리사카라이드-단백질 접합체의 응집을 유발하는 임의의 물리적 상호작용 또는 화학 반응을 지칭하는 것으로 의도된다. 응집 (예를 들어, 단백질 응집) 과정은 열, 압력, pH, 교반, 전단력, 동결-해동, 탈수, 중금속, 페놀계 화합물, 실리콘 오일, 변성제 등을 포함한 수많은 물리화학적 스트레스에 의해 유도될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재구성하는" 또는 "재구성"은 건조된 물질에 액체를 첨가하여 건조된 물질을 용해시켜 그 안에 용해된 물질의 용액을 제공하는 것을 지칭한다. 그러나, 재구성에 의해 제공되는 용액은 그 안에 용해된 물질의 농도 구배 또는 층을 가질 수 있다. 따라서, 재구성 후에, 용액을 물리적으로 교반하여 재구성된 물질의 균질 용액을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "혼합"은 진탕, 교반, 요동, 회전 등에 의한 용액의 물리적 교반을 지칭하는 것으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "균질 용액"은 용액 중 성분들 사이에 농도 구배 또는 층이 없도록 모든 성분이 완전히 혼합된 용액을 지칭한다.
본원에 사용된 "리오스피어"는, 예를 들어 비드 또는 구체 또는 다른 형상의 형태를 취하는 동결건조된 물질의 개별 입자이다. 리오스피어는 또한 동결건조입자 구체 또는 리오비드로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리오스피어 직경은 약 2 내지 약 12 mm, 바람직하게는 2 내지 8 mm, 예컨대 2.5 내지 6 mm 또는 2.5 내지 5 mm이다. 일부 실시양태에서, 리오스피어의 부피는 약 20 내지 550 μL, 바람직하게는 20 내지 100 μL, 예컨대 20 내지 50 μL이다. 리오스피어가 실질적으로 구형이 아닌 실시양태에서, 리오스피어의 크기는 더 짧은 치수에 대한 더 긴 치수의 비인 종횡비와 관련하여 기재될 수 있다. 리오스피어의 종횡비는 0.5 내지 2.5, 바람직하게는 0.75 내지 2, 예컨대 1 내지 1.5일 수 있다.
본원에 사용된 "면역원성 조성물"은 1종 이상의 담체 단백질에 접합된 1종 이상의 항원을 함유하는 다가 조성물일 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항원은 피막화된 박테리아로부터의 사카라이드이다. 이러한 조성물에서, 사카라이드는 특정 유형의 박테리아의 표면과 유사한 당 분자의 장쇄로 구성된다. 피막화된 박테리아는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 네이세리아 메닌기티데스 및 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항원은 동일한 유기체로부터의 것일 수 있거나 또는 상이한 유기체로부터의 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항원은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드이다.
본원에 사용된 용어 "방사 에너지 진공 (REV) 탈수"는 또한 마이크로웨이브 진공 건조 (MVD)를 지칭한다.
II. 방법
본 발명은 항-폐렴구균 백신으로서 사용될 수 있는 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 다양한 승화 공정을 사용하여 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 개별 (또는 개별적) 동결건조시키고, 이어서 개별로 동결건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 낮은 수준의 유리 폴리사카라이드 (예를 들어, 15% 미만의 유리 폴리사카라이드)를 갖는 접합체 조성물을 형성하는 조건 하에 혼합한다.
본 발명은 낮은 수준의 유리 폴리사카라이드를 갖는 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 선행 기술의 방법에 비해 개선된 것이다. 미국 특허 번호 7,709,001 및 미국 공개 출원 번호 20110201791에 개시된 것과 같은 선행 기술 방법은 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 공동-동결건조를 사용하는데, 이는 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 함께 공동-동결건조시키는 것이 낮은 유리 폴리사카라이드 (18% 미만)를 갖는 접합체 조성물을 생성하는 것으로 제시된 반면에, 개별로 동결건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 조합함으로써 제제화된 접합체 조성물은 미국 공개 출원 번호 20110201791의 표 1에 제시된 결과에 의해 예시된 바와 같이 약 31% 유리 폴리사카라이드를 갖는 조성물을 생성하기 때문이다.
Figure pct00001
그러나, 본 발명의 발명자들은 특정 조건 하에서 개별로 (또는 개별적으로) 동결건조된 담체 단백질 및 활성화된 폴리사카라이드를 접합시켜 고분자량 접합체를 포함하는 조성물을 제조할 수 있으며 미국 공개 출원 번호 20110201791에서와 달리 이러한 조성물이 낮은 수준의 유리 폴리사카라이드를 갖는다는 것을 발견하였다. 이들 특정 조건은 유기 용매 중 담체 단백질의 용액 및 유기 용매 중 1종 이상의 폴리사카라이드를 포함하는 용액을 제공하고, 여기서 특정한 실시양태에서 유기 용매는 디메틸술폭시드 (DMSO)인 단계 및 두 용액을 티-혼합에 의해 동시에 조합 또는 함께 조합하는 단계를 포함한다. 도 4에 제시된 바와 같이, 두 용액을 티-혼합에 의해 함께 동시에 조합하는 것은, 하나의 용액을 다른 용액에 첨가하거나 건조된 물질을 용액에 용해시킴으로써 두 용액을 조합할 때 전형적으로 발생하는 농도 구배를 실질적으로 감소시키거나 제거하고 (도 1, 2 또는 3 참조), 실시예 10에서 혈청형 19F 폴리사카라이드에 의해 예시된 바와 같이, 다양한 혈청형으로부터 수득된 폴리사카라이드에 대한 겔 형성을 감소시키거나 제거할 수 있다. 본 발명은 단일 조성물로의 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 공동-동결건조에 비해 다양한 이점, 예컨대 비제한적으로, 개별 제제 및 사이클 파라미터를 최적화하는 능력, 편리한 취급, 및 목적하는 용액 크기를 갖는 개별 폴리사카라이드 및 담체 단백질 제제를 생산하는 능력을 제공한다.
본 발명자들은 추가로 모델로서 CRM197을 사용하여, 건조된 담체 단백질의 재구성 동안, 유기 용매, 예컨대 DMSO가 건조된 담체 단백질에 첨가되는 시간 길이 및 재구성된 담체 단백질이 접합 전 저장되는 시간 길이가 담체 단백질의 2차 구조에 영향을 미치고 이에 따라 목적하는 분자량 및 담체 단백질 대 그에 접합된 폴리사카라이드의 비를 갖는 접합체의 수율에 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 도 5-11에 제시된 바와 같이, 예를 들어 8분 미만 또는 약 2분 이하 내에 건조된 담체 단백질에 유기 용매를 첨가하는 빠른 첨가 조건 하에 유기 용매, 예컨대 무수 DMSO 중에서 건조된 담체 단백질을 재구성하는 시간은, 담체 단백질이 완전히 언폴딩되고 푸리에-변환 적외선 분광분석법 (FTIR) 또는 동적 광 산란 (DLS)에 의해 결정시 검출가능한 베타-시트 형성이 없는 재구성된 담체 단백질 용액을 제공한다. 추가로, 유기 용매 중에 존재하는 임의의 검출가능한 물을 갖고/거나 담체 단백질을 12 mg/mL 초과의 담체 단백질의 최종 농도로 갖는 것이 베타-시트 매개된 응집을 유발한다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유기 용매는 100%의 유기 용매를 포함하고, 검출가능한 물을 함유하지 않고 (예를 들어, 무수 유기 용매); 유기 용매는 8분 미만, 바람직하게는 5분 미만, 보다 바람직하게는 2분 이하의 기간에 걸쳐 건조된 담체 단백질에 첨가되고; 담체 단백질은 10 mg/mL 이하 또는 12 mg/mL 이하, 특정한 실시양태에서 약 6 mg/mL의 농도로 유지된다.
특정한 실시양태에서, 건조된 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 완전한 용해를 보장하기 위해, 제1 및 제2 균질 용액은 120분 이하 동안 혼합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 90분 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 60분 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 30분 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 10분 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액은 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하기 전 약 6시간 이하 동안 유지된다. 본 발명자들은 담체 단백질을 무수 유기 용매 중에 6시간 초과 동안 유지하면 담체 단백질의 검출가능한 베타-시트 매개된 응집이 형성될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 DMSO 중에서 6시간 이하 동안 유지된다.
도 12는 담체 단백질 폴리사카라이드 접합체를 제조하는 개략도를 보여주며, 여기서 담체 단백질의 균질 용액은 본원에 교시된 바와 같이 제조되고, 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 균질 용액은 본원에 교시된 바와 같이 티-혼합에 의해 조합된다.
일반적으로, 정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 (Ps) 분말을 개별적으로 물 중에 용해시키고, 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 0.45-마이크로미터 여과한다. 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 균질화하여 Ps의 분자 질량을 감소시킨다. 혈청형 18C를 90℃ 이상에서의 산 가수분해에 의해 크기-감소시킨다. 혈청형 19A는 그의 비교적 낮은 출발 크기로 인해 크기 감소시키지 않는다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 혈청형-특이적 표적에 대해 제어하여 혈청형-특이적 분자 질량을 달성한다. 폴리사카라이드를 각각 0.22-마이크로미터 여과한 다음, 농축시키고, 개방 채널 (유형 5)을 갖는 10 kD 한외여과 막을 사용하여 한외여과 단계 1에서 물에 대해 투석여과하여 투석여과물 1을 생산한다.
이어서 투석여과물 1을 완충제, 예를 들어 아세트산나트륨에 의해 혈청형-특이적 온도 (4-22℃ 사이) 및 pH (4-5)로 조정하여 활성화 단계 동안 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화할 수 있다. 퍼아이오데이트 산화를 통해 폴리사카라이드 활성화를 수행한다. 혈청형 4의 경우, 활성화 전에, 용액을 대략 50℃ 및 pH 4에서 인큐베이션하여 폴리사카라이드를 부분적으로 탈케탈화한다. 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시한다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 혈청형-특이적이며, 폴리사카라이드 반복 단위 몰당 소듐 메타퍼아이오데이트 대략 0.1 내지 0.5 몰의 범위이다. 소듐 메타퍼아이오데이트의 혈청형-특이적 전하는 폴리사카라이드 활성화의 표적 수준 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 알데히드 몰)을 달성하도록 선택된다.
한외여과 단계 2에서, 모든 혈청형에 대해 활성화된 폴리사카라이드를 투석여과한 다음, 개방 채널을 갖는 10 kD 한외여과 막을 사용하여 접선 흐름 한외여과에 의해 농축시켜 투석여과물 2를 생산할 수 있다. 투석여과의 종료 시에, 투석여과물 2를 15 g Ps/L의 표적으로 농축시킬 수 있다. 바람직하게는, 모든 혈청형에 대한 한외여과를 2-8℃에서 수행한다.
이어서 투석여과물 2를 수크로스가 첨가된 물 중에 희석하여 약 4 내지 12 mg/mL 폴리사카라이드 및 0.5% 내지 6% (w/v) 수크로스의 최종 농도를 만들고, 승화 건조 공정에 적용하여 바람직하게는 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는 건조된 폴리사카라이드를 생산한다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 동결건조 전 용액에 첨가되는 수크로스의 양은 혈청형 특이적이고, 동결건조 전 3.0 내지 5.0% (w/v)의 범위일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 2종 이상의 폴리사카라이드를 함께 건조시켜 건조된 폴리사카라이드 혼합물을 생산할 수 있다. 정제된 담체 단백질을 5 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.0 완충제에 대해 투석여과한 다음, 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과한다. 여과된 용액을 수크로스 함유 물 중에 약 6 내지 12 mg/mL 담체 단백질 및 4 내지 10% (v/v) 수크로스의 최종 농도로 희석하고, 공정에서 승화 건조시켜 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는 건조된 담체 단백질을 생산한다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 승화 건조 공정은 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수를 포함할 수 있다.
건조된 폴리사카라이드 또는 건조된 폴리사카라이드 혼합물 및 건조된 담체 단백질을 유기 용매, 예를 들어 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 개별적으로 재구성하거나 재용해시킨다. 특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 약 10 내지 20 mg/mL 또는 약 10 mg/mL 이하의 농도로 재구성된다. 본 발명자들은 DMSO 중 1% (v/v) 이상의 수분이 베타-시트 매개된 응집을 유발할 것임을 발견하였다 (도 9 참조). 따라서, 본 발명은 유기 용매의 수분 함량이 1% (v/v) 미만이거나 또는 유기 용매가 검출가능한 수분을 포함하지 않는 실시양태, 예를 들어 무수 유기 용매 또는 100% (v/v) 유기 용매를 제공한다. 건조된 담체 단백질은 무수 유기 용매를 건조된 담체 단백질에 8분 미만, 바람직하게는 6분 미만 또는 4분 미만 또는 가장 바람직하게는 2분 이하 또는 1분 이하의 기간에 걸쳐 첨가함으로써 재구성된다.
본 발명자들은 또한 모델로서 CRM197을 사용하여, 건조된 담체 단백질에 무수 유기 용매를 첨가하는 첨가 시간이 짧을수록, 푸리에-변환 적외선 분광분석법 (FTIR) 및 동적 광 산란 (DLS) 분석에 기초한 비가역적 베타-시트 매개된 응집의 형성이 덜하다는 것을 발견하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 2분의 무수 DMSO 첨가 시간은 검출가능한 베타-시트 매개된 응집의 형성을 유발하지 않았다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 본 발명은 1% 미만의 수분을 함유하는 유기 용매, 예를 들어 DMSO 또는 검출가능한 수분을 전혀 함유하지 않는 유기 용매, 예를 들어 무수 또는 100% (v/v) 유기 용매 중에서 담체 단백질을 재구성하는 것을 제공하며, 여기서 상기 유기 용매를 건조된 담체 단백질에 2분 또는 2분 미만의 기간에 걸쳐 첨가하여 20 mg/mL 이하 또는 약 12 mg/mL 또는 약 10 mg/mL 이하의 농도의 재구성된 담체 단백질을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 재구성 후에, 혼합물을 30분 이하 동안 혼합하여 담체 단백질의 균질 용액 및 폴리사카라이드의 균질 용액을 제공할 수 있다. 그러나, 특정한 실시양태에서, 혼합은 120분 이하, 90분 이하, 60분 이하, 30분 이하 또는 10분 이하의 기간에 걸쳐 일어날 수 있다. 특정한 실시양태에서, 500 mM 인산나트륨, pH 7.2 완충제를 담체 단백질을 포함하는 균질 용액에 1.0 mM 인산나트륨의 최종 농도로 첨가한다.
담체 단백질의 균질 용액 및 폴리사카라이드 또는 2종 이상의 폴리사카라이드의 균질 용액을 티-혼합에 의해 조합하여 담체 단백질 및 폴리사카라이드 또는 2종 이상의 폴리사카라이드 둘 다를 함유하는 접합 용액을 제공한다. 티-혼합 속도는 가변적일 수 있지만, 일반적으로 10분 이하로 완전한 혼합을 달성하는 속도가 설정된다. 티-혼합은 임의의 온도, 예를 들어 실온 또는 4℃ 또는 18℃ 내지 23℃ 사이에서 수행될 수 있다. 무수 유기 용매 중에서의 재구성 또는 재용해 후에, 폴리사카라이드 및 담체 단백질 균질 용액은 혈청형-특이적 최종 폴리사카라이드 농도 및 폴리사카라이드 대 담체 단백질 비를 표적으로 하여 조합된다. 일반적으로, 담체 단백질 및 폴리사카라이드는 약 0.6 내지 1.3 (w/w)의 최종 접합된 폴리사카라이드:담체 단백질 비를 제공할 양으로 혼합된다.
접합 반응을 수행하기 위해, 물 중 소듐 시아노보로히드라이드의 용액을 제조하고, 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 meq (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 몰)를 접합 용액에 첨가한다. 소듐 시아노보로히드라이드 용액의 몰농도는 접합 동안 용액의 약 0.5% 총 물 함량의 표적 양을 기준으로 한다. 접합 용액을 혈청형-특이적 온도에서 혈청형-특이적 지속기간 동안 반응하도록 하여 담체 단백질:폴리사카라이드 접합체 중간체를 생산한다.
이어서 물 중 소듐 보로히드라이드의 용액을 제조하고, (폴리사카라이드 반복 단위에 대해) 소듐 보로히드라이드 2.0 meq를 접합 용액에 첨가한다. 소듐 보로히드라이드 용액의 몰농도는 보로히드라이드 첨가 후 접합 용액 중 약 1.0% 총 물 함량의 표적 양을 기준으로 한다. 접합 용액을 주위 온도에서 3시간 동안 반응하도록 하여 (2시간 동안 반응하도록 한 특정 혈청형, 예컨대 혈청형 7F 제외) 담체 단백질:폴리사카라이드 접합체를 생산한다.
접합 반응을 켄칭하기 위해, 접합 용액을 특정한 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하는 접합체의 경우에 150 mM 염화나트륨 (0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨)의 용액에 느리게 첨가함으로써 접합 용액을 희석 단계에서 20% (v/v) 이하의 무수 DMSO로 희석하여 켄칭된 접합체 용액을 생산한다. 특정한 실시양태에서, 온도를 희석 단계 동안 15℃ 이하에서 유지한다. 약 1시간 후에, 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0 용액을 25 mM 인산칼륨의 최종 농도로 상기 용액에 첨가할 수 있다. 접합 성능은 전체 폴리사카라이드 및 담체 단백질 소비, 접합체 폴리사카라이드 대 담체 단백질 비, 및 접합체 분자량에 의해 평가할 수 있다.
한외여과 단계 3에서, 켄칭된 접합체 용액을 약 2.5 g/L로 농축시키고, 30 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 또는 150 mM 염화나트륨 중 25 mM 인산칼륨의 최대 약 10 디아볼륨에 대해 투석여과하여 투석여과물 3을 생산할 수 있다. 한외여과 단계 3으로부터의 투석여과물 3 중의 폴리사카라이드 농도는 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC) 자외선 다중-각도 광 산란 굴절률 (UV-MALS-RI)에 의해 결정할 수 있다. 일부 혈청형, 예컨대 혈청형 19F로부터의 폴리사카라이드를 포함하는 접합체의 경우, 투석여과물 3을 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 여과물을 생산할 수 있고, 이를 후속적으로 22℃에서 약 120시간 동안 인큐베이션한다.
한외여과 단계 4에서, 투석여과물 3 또는 한외여과 단계 3으로부터의 여과물을 약 2.5 g/L의 폴리사카라이드 농도로 농축시키고, 300 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘의 20 디아볼륨에 대해 투석여과하여 투석여과물 4를 생산할 수 있다. 특정 혈청형, 예를 들어 혈청형 7F로부터의 폴리사카라이드를 포함하는 접합체의 경우, 접합체를 100 kDa 접선 흐름 한외여과 막에 대해 투석여과할 수 있으며; 예를 들어 혈청형 6A, 6B 및 18C 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 약 3.5 g/L로 농축시키고, 300 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 및 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0을 포함하는 완충제에 대해 투석여과하여 투석여과물 4를 생산할 수 있다. 혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 약 2.0 g/L로 농축시키고, 300 kDa 재생 셀룰로스 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 및 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0을 포함하는 완충제에 대해 투석여과하여 투석여과물 4를 생산할 수 있다. 투석여과물 2 중의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 완충제는 10-50 mM 아세테이트, 포스페이트, TRIS, HEPES 또는 아미노산 완충제, 예컨대 히스티딘일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 완충제는 10 mM L-히스티딘이다.
한외여과 단계 4로부터의 투석여과물 4를 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 제2 여과물을 생산할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 제2 여과물을 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석할 수 있다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC) 또는 1가 약물 물질을 제공한다. MBC를 분취물로 분배하고 -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
혈청형 6A, 6B 및 18C 폴리사카라이드를 포함하는 접합체에 대한 한외여과 단계 4로부터의 투석여과물 4를 이중-막 0.5/0.2-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 제2 여과물을 생산할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 제2 여과물을 150 mM 염화나트륨, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석할 수 있다. 이는 MBC 또는 1가 약물 물질을 제공한다. MBC를 분취물로 분배하고 -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F 폴리사카라이드를 포함하는 접합체에 대한 투석여과물 4를 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 제2 여과물을 생산할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 제2 여과물을 150 mM 염화나트륨, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석할 수 있다. 이는 MBC 또는 1가 약물 물질을 제공한다. MBC를 분취물로 분배하고 -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
III. 폴리사카라이드
스트렙토코쿠스 뉴모니아에로부터의 피막 폴리사카라이드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리사카라이드는 박테리아로부터 단리될 수 있고, 공지된 방법에 의해 어느 정도 크기조정될 수 있고 (예를 들어, 유럽 특허 번호 EP497524 및 EP497525 참조); 특정한 실시양태에서, 균질화기를 사용하여 미세유동화에 의해 또는 화학적 가수분해에 의해 달성된다. 한 실시양태에서, 각각의 폴리사카라이드 혈청형에 상응하는 에스. 뉴모니아에 균주는 대두-기재 배지에서 성장된다. 이어서 개별 폴리사카라이드는 원심분리, 침전 및 한외여과를 포함한 표준 단계를 통해 정제된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0286838 및 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다. 폴리사카라이드는 점도를 감소시키고/거나 후속 접합된 생성물의 여과성을 개선시키기 위해 크기조정될 수 있다. 본 발명에서, 피막 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 및 38 중 1종 이상으로부터 제조된다.
IV. 담체 단백질
본 발명의 특정한 실시양태에서, CRM197이 담체 단백질로서 사용된다. CRM197은 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다. 한 실시양태에서, 이는 카사미노산 및 효모 추출물-기재 배지에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, CRM197은 미국 특허 번호 5,614,382에 기재된 방법에 따라 재조합적으로 제조된다. 전형적으로, CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온-교환 크로마토그래피의 조합을 통해 정제된다. 일부 실시양태에서, CRM197은 페넥스 발현 기술 (페넥스 인크. (Pfenex Inc.), 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 제조된다.
다른 적합한 담체 단백질은 추가의 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 DT (디프테리아 톡소이드), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이(E. coli) LT, 이. 콜라이 ST 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A를 포함한다. 박테리아 외막 단백질, 예컨대 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균 표면 단백질 A (PspA; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/091998 참조), 폐렴구균 어드헤신 단백질 (PsaA), A군 또는 B군 스트렙토코쿠스로부터의 C5a 펩티다제, 또는 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D, 폐렴구균 뉴모리신 (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13), 예를 들어 일부 방식으로 해독된 플라이, 예를 들어 dPLY-GMBS (국제 특허 출원 공개 번호 WO 04/081515 참조) 또는 dPLY-포르몰, PhtX, 예를 들어 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE 및 Pht 단백질의 융합체, 예를 들어 PhtDE 융합체, PhtBE 융합체 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/98334 및 WO 03/54007 참조)가 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예컨대 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD), PorB (엔. 메닌기티디스로부터의 것), PD (헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D; 예를 들어 유럽 특허 번호 EP 0 594 610 B 참조) 또는 그의 면역학상 기능적 등가물, 합성 펩티드 (유럽 특허 번호 EP0378881 및 EP0427347 참조), 열 쇼크 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/17712 및 WO 94/03208 참조), 백일해 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/58668 및 유럽 특허 번호 EP0471177 참조), 시토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 91/01146 참조), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (문헌 [Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824] 참조), 예컨대 N19 단백질 (문헌 [Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7] 참조), 철 흡수 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/72337 참조), 씨. 디피실레(C. difficile)의 독소 A 또는 B (국제 특허 공개 번호 WO 00/61761 참조), 및 플라젤린 (문헌 [Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9] 참조)이 또한 담체 단백질로서 사용될 수 있다.
다른 DT 돌연변이체, 예컨대 CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 및 CRM107 및 문헌 [Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기재된 다른 돌연변이; Glu-148의 결실 또는 Asp, Gln 또는 Ser로의 돌연변이 및/또는 Ala 158의 Gly로의 돌연변이 및 미국 특허 번호 4,709,017 또는 미국 특허 번호 4,950,740에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 1개 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 미국 특허 번호 5,917,017 또는 미국 특허 번호 6,455,673에 개시된 다른 돌연변이; 또는 미국 특허 번호 5,843,711에 개시된 단편이 사용될 수 있다.
V. 승화 건조
특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하는 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 조성물을 승화 공정을 사용하여 개별적으로 건조시켜, 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는 건조된 담체 단백질을 포함하는 조성물 및 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 건조된 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다. 건조된 조성물은, 예를 들어 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수 (마이크로웨이브 진공-건조)에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Encyclopedia of Agriculture, Food, and Biological Engineering. Marcel Dekker, Inc or Xu & Sunada, Chem Pharm Bull(Tokyo) 55(11):1545-50 (2007)]을 참조한다. 동결건조된 제제 성분은 동결건조된 물질의 케이크 또는 입자, 예를 들어 펠릿, 비드 또는 구체, 예를 들어 리오스피어의 형태일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [A. S. Mujumdar (2007). Handbook of Industrial Drying. CRC Press]을 참조한다.
리오스피어는, 예를 들어 액적 (예를 들어, 약 20, 50, 100 또는 250 마이크로리터) 형태의 1종 이상의 폴리사카라이드 혈청형을 포함하는 수용액의 분취물을 액적이 무손상 상태로 유지되도록 하는 방식으로 고체의 편평 표면 상에 로딩함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표면은, 예를 들어 약 -180℃ 내지 약 -196℃ 또는 약 -180℃ 내지 약 -273℃의 온도의 플레이트, 예를 들어 금속 플레이트이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 수용액은 분배 팁에 의해 표면 상에 로딩된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 수용액은 약 3 ml/분 내지 약 75 ml/분, 약 5 ml/분 내지 약 75 ml/분; 약 3 ml/분 내지 약 60 ml/분, 약 20 ml/분 내지 약 75 ml/분; 및 약 20 ml/분 내지 약 60 ml/분의 분배 속도로 분배된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분배되는 수용액은 250 마이크로리터이고, 분배 속도는 약 5 mL/분 내지 약 75 mL/분이거나, 또는 분취물은 100 마이크로리터이고, 분배 속도는 약 3 mL/분 내지 약 60 mL/분이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분배 팁과 수용액이 분배되는 표면 사이의 갭은 약 0.1 cm 이상 (예를 들어, 약 0.5 cm 또는 0.1 cm 내지 1 cm 또는 0.1 cm 내지 0.75 cm)이다. 표면 상에 놓이면, 수용액을 동결시킨 다음, 동결건조에 의해 승화 건조시킨다. 리오스피어를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US5656597; WO2013066769; WO2014093206; WO2015057540; WO2015057541 또는 WO2015057548을 참조한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 수용액은 방사 에너지 진공 (REV) 탈수 (마이크로웨이브 진공-건조)에 의해 동결건조된다. REV 탈수는 물의 비점 및 대기의 산소 함량이 보다 낮은 감압 하에 수행되는 건조 방법이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 수용액의 분취물을 고체 표면 상에 단일 액적으로서 침착시키되, 액적이 동결된 펠릿으로서 표면 상에서 접촉하고 동결될 때 그를 단일 액적으로서 유지하는 방식으로 침착시키며, 여기서 표면의 온도는 약 -90℃ 이하이고; 마이크로웨이브 방사선을 대기압 미만의 압력 하에 동결된 펠릿에 적용하여 건조된 펠릿, 예컨대 구체를 생산한다. 또 다른 예에서, 수용액을 트레이 상에 제공하고, 대기압 미만의 압력 하에 마이크로웨이브 방사선 처리하여 건조된 케이크를 생산한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,389,794; 4,664,924; 4,809,596; 4,882,851을 참조한다.
VI. 폴리사카라이드-단백질 접합
정제된 폴리사카라이드를 화학적으로 활성화시켜 담체 단백질과 반응할 수 있는 관능기를 도입한다. 활성화되면, 각각의 피막 폴리사카라이드를 개별적으로 담체 단백질에 접합시켜 본 발명의 방법에 따른 당접합체를 형성한다.
한 실시양태에서, 폴리사카라이드의 화학적 활성화는 미국 특허 번호 4,365,170; 4,673,574; 및 4,902,506에 기재된 수단에 의해 달성할 수 있다. 간략하게, 폐렴구균 폴리사카라이드를 산화제, 예를 들어 퍼아이오데이트-기재 산화제, 예컨대 과아이오딘산나트륨, 과아이오딘산칼륨 또는 과아이오딘산과 반응시켜 이웃자리 히드록실 기의 무작위 산화성 절단을 유발하여 반응성 알데히드 기를 생성한다. 산화된 폴리사카라이드를 단백질 담체 상의 1급 아민 기 (주로 리신 잔기)에 직접 아미노화 커플링시키는 것은 환원성 아미노화에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 접합을 수용액 또는 유기 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 수행할 수 있다. 예를 들어, US2015/0231270 A1, EP 0471 177 B1, US2011/0195086 A1을 참조한다. 접합 반응의 종결 시에, 미반응 알데히드를 강한 환원제, 예컨대 소듐 보로히드라이드의 첨가에 의해 캡핑한다.
한 실시양태에서, 폴리사카라이드의 화학적 활성화 및 후속하여 담체 단백질에의 접합은 미국 특허 번호 4,365,170, 4,673,574 및 4,902,506에 기재된 수단에 의해 달성한다. 간략하게, 폴리사카라이드를 퍼아이오데이트-기재 산화제, 예컨대 과아이오딘산나트륨, 과아이오딘산칼륨 또는 과아이오딘산과 반응시켜 이웃자리 히드록실 기의 무작위 산화성 절단을 유발하여 반응성 알데히드 기를 생성한다. 이어서 산화된 폴리사카라이드를 단백질 담체 상의 1급 아민 기 (주로 리신 잔기)에 직접 아미노화 커플링시키는 것은 환원성 아미노화에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 혼합물을 니켈의 존재 하에 환원제, 예컨대 소듐 시아노보로히드라이드와 반응시킴으로써 접합을 수행한다. 접합 반응은 수용액 또는 유기 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 수행할 수 있다. 예를 들어, US2015/0231270 A1, EP 0471 177 B1, US2011/0195086 A1을 참조한다. 접합 반응의 종결 시에, 미반응 알데히드를 강한 환원제, 예컨대 소듐 보로히드라이드의 첨가에 의해 임의로 환원시킨다.
한 실시양태에서, 제제화 전에, 각각의 폐렴구균 피막 폴리사카라이드를 에스. 뉴모니아에로부터 개별적으로 정제하고, 활성화시켜 반응성 알데히드를 형성하고, 이어서 니켈의 존재 하에 소듐 시아노보로히드라이드에 의한 환원성 아미노화를 사용하여 담체 단백질에 공유 접합시킨다. 니켈은 환원성 아미노화에 사용되는 소듐 시아노보로히드라이드 환원제로부터의 잔류 간섭 시아나이드와 착물을 형성한다. 따라서, 니켈은 보다 큰 접합 반응 효율을 위해 및 유리 시아나이드 제거를 보조하기 위해 본원의 방법에 사용할 수 있다.
전이 금속은 시아나이드와 안정한 착물을 형성하는 것으로 공지되어 있고, 소듐 시아노보로히드라이드에 의한 단백질 아미노 기 및 포름알데히드의 환원성 메틸화를 개선시키는 것으로 공지되어 있다. 문헌 [Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190]을 참조한다. 그러나, 본 출원인은 놀랍게도 잔류 간섭 시아나이드와 착물을 형성함으로써, 니켈의 첨가가 접합 동안 단백질의 소비를 증가시키고 보다 큰, 잠재적으로 보다 면역원성인 접합체의 형성을 유도한다는 것을 발견하였다.
상업용 소듐 시아노보로히드라이드 시약 로트에서의 유리 시아나이드 수준의 변동성은 일관되지 않은 접합 성능을 유도할 수 있으며, 이는 분자 질량 및 폴리사카라이드-대-단백질 비를 포함한 다양한 접합체 속성을 생성한다. 접합 반응에 대한 니켈의 첨가는 유리 시아나이드의 수준을 감소시키고, 따라서 로트-대-로트 접합체 일관성의 정도를 개선시킨다.
또 다른 실시양태에서, 접합 방법은 시아네이트 에스테르를 형성하기 위해 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)에 의한 폴리사카라이드의 활성화를 사용할 수 있다. 활성화된 사카라이드는 담체 단백질 상의 아미노 기에 직접 커플링될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 반응성 동종이관능성 또는 이종이관능성 기는 시아네이트 에스테르를 여러 이용가능한 양식 중 임의의 것과 반응시킴으로써 활성화된 폴리사카라이드 상에 도입될 수 있다. 예를 들어, 시스타민 또는 시스테아민을 사용하여 티올화된 폴리사카라이드를 제조할 수 있으며, 이는 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들어 GMBS를 사용함) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질 (예를 들어 아이오도아세트이미드 [예를 들어, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB 또는 SIA 또는 SBAP를 사용함)과의 반응 후에 수득된 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있다. 이러한 접합체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/29094; 및 문헌 [Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256]에 기재되어 있다.
다른 적합한 접합 방법은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC 및/또는 TSTU를 사용한다. 국제 특허 출원 공개 공보 번호 WO98/42721에 다수가 기재되어 있다. 접합은 사카라이드의 유리 히드록실 기와 CDI의 반응에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 수반할 수 있고 (문헌 [Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18] 참조), 이에 이어서 담체 단백질과 반응하여 카르바메이트 연결을 형성할 수 있다. 이러한 화학은 탄수화물의 아노머 말단의 환원으로 1급 히드록실 기를 형성하고, 이어서 1급 히드록실과 CDI의 반응으로 카르바메이트 중간체를 형성하고, 이어서 단백질 담체 아미노 기에 커플링하는 것으로 이루어진다. 반응은 사카라이드 상의 다른 1급 히드록실 기의 임의적인 보호/탈보호를 필요로 할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 추가의 이해를 촉진하도록 의도된다.
실시예 1
에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F 및 23F의 제조.
폐렴구균의 배양 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52]을 참조한다. 폐렴구균 피막 폴리사카라이드의 제조 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 번호 EP0497524를 참조한다. 폐렴구균 하위유형의 단리물은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능하다. 박테리아는 혈액-한천 상에서 알파-용혈성인 피막화된, 비-운동성, 그람-양성, 란셋-형상 쌍구균으로서 확인된다. 하위유형은 특이적 항혈청을 사용하는 팽화 반응에 기초하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다.
존재하는 에스. 뉴모코쿠스 혈청형 각각을 나타내는 세포 은행을 동결 바이알 내의 것으로 머크 컬쳐 콜렉션(Merck Culture Collection) (뉴저지주 라웨이)으로부터 입수한다. 해동된 시드 배양물을 에스. 뉴모니아에에 적절한 사전-멸균된 성장 배지를 함유하는 시드 발효기로 옮긴다. 배양물을 온도 및 pH 제어 하의 시드 발효기에서 성장시킨다. 시드 발효기의 전체 부피를 사전-멸균된 성장 배지를 함유하는 생산 발효기로 옮긴다. 생산 발효는 공정의 최종 세포 성장 단계이다. 온도, pH 및 교반 속도를 제어한다.
불활성화제의 첨가를 통해 발효 공정을 종결시킨다. 불활성화 후에, 용액을 불활성화 탱크로 옮기고, 여기서 제어된 온도 및 교반 하에 유지한다. 세포 파편을 원심분리 및 여과의 조합을 사용하여 제거한다. 용액을 한외여과하고 투석여과한다. 이어서 용액에 대해 용매-기반 분획화를 실시하여 불순물을 제거하고 폴리사카라이드를 회수한다.
실시예 2
폴리사카라이드 크기 감소 및 활성화를 하기와 같이 수행한다.
약 6 g의 정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 (Ps) 분말을 주사용수 (WFI) 중에 대략 4 g/L의 표적 농도로 실온에서 용해시킨다. 이어서 용액을 0.45-마이크로미터 여과하여 바이오버든을 감소시킨다. 여과된 Ps 용액의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다.
혈청형 18C 및 19A를 제외한 모든 혈청형의 경우, 용액을 대략 2.5 g/L로 희석한 다음, GEA-니로 소아비 판다(Niro Soavi Panda) 2K 균질화기를 사용하여 균질화하여 Ps의 분자 질량을 감소시킨다. 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 균질화하여 폴리사카라이드의 분자 질량을 감소시켰다. 혈청형 19A는 그의 비교적 낮은 출발 크기로 인해 크기 감소시키지 않았다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 혈청형-특이적 표적에 대해 제어하여 (150-1000 bar; 4-7회 통과) 혈청형-특이적 분자 질량을 달성하였다. 크기-감소된 폴리사카라이드를 0.2-마이크로미터 여과한 다음, 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다. 균질화 동안 균질화기의 유출구에 있는 열 교환기로의 냉각수 공급을 사용하여 온도를 제어한다.
균질화 대신 산 가수분해를 사용하여 혈청형 18C Ps의 분자 질량을 감소시킨다. 여과된 혈청형 18C Ps 용액의 온도를 로트 A의 경우 대략 96℃ 및 로트 B의 경우 90℃로 증가시킨다. 이어서 용액을 빙초산 (17.4 M)으로 조정하여 0.2 M의 최종 농도로 표적화하고, 로트 A의 경우 대략 180분 및 로트 B의 경우 160분 동안 유지한다. 1.5 M 인산칼륨, pH 7.0을 0.46 M의 최종 농도로 첨가하여 용액 pH를 증가시킴으로써 산 가수분해를 정지시킨 다음, 용액을 실온으로 냉각시킨다.
혈청형 19A는 0.45-마이크로미터 여과하거나 크기-감소시키지 않는다. 그의 비교적 낮은 출발 크기 때문에, 크기 감소가 요구되지 않는다. 용해 후, 혈청형 19A를 다음 단락에 기재된 바와 같이 0.22-마이크로미터 여과한다.
이어서 한외여과 1 단계 전에, 각각의 용액을 0.22-마이크로미터 필터를 사용하여 여과하여 바이오버든을 감소시킨다. 여과된 Ps를 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 대략 10 g/L로 농축시킨 다음, 주위 온도에서 6 디아볼륨의 WFI에 대해 투석여과하여 한외여과 1 공정 중간체 (UF1-FR)를 생성한다. 혈청형 18C는 10 kDa NMWCO 막 대신에 5 kDa NMWCO 막을 사용하여 산 가수분해에 의해 생성된 보다 저분자량의 Ps를 보유함으로써 Ps 회수를 개선시켰다. UF1-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. WFI를 UF1-FR에 첨가하여 Ps 활성화 전에 대략 10 g/L의 Ps 농도를 달성한다.
이어서 2 M 아세트산나트륨 완충제를 첨가하여 활성화 반응 단계의 pH를 제어한다. Ps 활성화 반응 동안 아세트산나트륨 농도 및 pH 및 온도를 각각의 혈청형에 대한 특이적 값으로 제어한다 (표 2).
퍼아이오데이트 활성화는 PnPs 반복 단위 (RU)의 몰당 퍼아이오데이트의 몰에 기초하여 용액에 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가함으로써 개시한다. 활성화 동안, 이웃자리 디올은 혈청형-특이적 반응 시간에 걸쳐 반응성 알데히드로 산화된다. 이 반응은 활성화된 생성물 (AP) 공정 중간체를 생성하였다. 하전된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양 및 반응 시간을 각각의 혈청형에 대한 특이적 값으로 제어한다 (표 1).
Figure pct00002
Ps 활성화 후에, 용액을 2-8℃에서 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 6 디아볼륨의 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 이어서 추가로 6 디아볼륨의 WFI에 대해 투석여과한다. 혈청형 18C는 10 kDa NMWCO 막 대신에 5 kDa NMWCO 막을 사용하여 산 가수분해에 의해 생성된 보다 저분자량의 Ps를 보유함으로써 Ps 회수를 개선시켰다. 이어서 용액을 농축시켜 한외여과 2 공정 중간체 (UF2-FR)를 생성한다. UF2-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 활성화 정도는 UF2-FR 샘플을 티오세미카르바지드로 유도체화한 다음, UV 검출을 동반한 HPSEC에 의해 티오세미카르바존을 검출함으로써 결정한다.
실시예 3
CRM197 담체 단백질의 제조는 하기와 같이 수행할 수 있다.
이전에 기재된 바와 같이 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/173876 참조) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 동결된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 디아볼륨의 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고 0.22-마이크로미터 여과한다. 특정한 실시양태에서, 5 mM 인산칼륨, pH 6.4 (5 mM 인산나트륨, pH 7.0)를 혈청형 18C에 사용한다. 투석여과된 용액을 수크로스 함유 물 중에 1.0 내지 5.3% (w/v)의 최종 농도로 희석하고, 동결건조시켜 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는 건조된 CRM197을 생산한다. 하기 표 2는 특정한 혈청형 폴리사카라이드에의 접합을 위한 CRM197에 대한 대표적인 수크로스 농도를 제공한다.
실시예 4
폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr)의 동결건조는 하기와 같다.
동결건조 전에, CRM197 및 Ps 용액을 하기 기재된 바와 같이 희석한다.
일부 실시양태에서, CRM197 용액을 WFI, 5 mM 인산나트륨, pH 6.4 (혈청형 18C의 경우 pH 7.0), 및 새로 제조된 WFI 중의 30% (w/v) 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 단백질 농도로 희석한다. UF2-FR Ps 용액을 WFI 및 새로 제조된 WFI 중의 30% w/v 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 Ps 농도로 희석한다.
일부 실시양태에서, CRM197 용액을 WFI, 2 mM 인산나트륨, pH 7.2, 및 새로 제조된 WFI 중의 50% (w/v) 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 단백질 농도로 희석한다. UF2-FR Ps 용액을 WFI 및 새로 제조된 WFI 중의 50% (w/v) 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 Ps 농도로 희석한다.
혈청형-특이적 수크로스 및 포스페이트 농도를 사용한다 (예를 들어, 표 2 참조). 희석된 CRM197 및 UF2-FR 용액을 버티스 제네시스 동결 건조기를 사용하여 동결건조시킨다.
Figure pct00003
실시예 5
본 실시예는 무수 DMSO 중 CRM197의 재구성 시간이 푸리에 변환 적외선 분광분석법 (FTIR)에 의해 측정시 2차 구조에 영향을 미친다는 것을 보여준다.
6 mg/mL, 5% (w/v) 수크로스, 1.25 mM 인산나트륨, pH 7.2에서 동결건조시킨 동결건조된 CRM197을 DMSO (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터의 무수 DMSO, 27655-100 mL) 중에서 10 mg/mL의 최종 농도로 느린 재구성 (8분) 또는 빠른 재구성 (2분)을 사용하여 재구성한 다음 혼합하여 균질 용액을 생산한다. 시점에 도달할 때까지 30초마다 적절한 부피의 DMSO를 첨가함으로써 재구성을 수행한다. 바이오툴스 PROTA-3S로 50mm CaF2 윈도우를 갖는 투과 모드를 사용하여 제어된 온도 (25℃)에서 FTIR 스펙트럼을 수집한다. 50개의 스캔을 4cm-1의 해상도로 수집하고, 평균내고, 완충제 차감하고, 수증기 보정할 수 있다.
빠른 첨가 (2분)에 의해 무수 DMSO 중에서 재구성한 동결건조된 CRM197은 1660cm-1에서 예상되는 유리 카르보닐 아미드 I 피크를 나타내며, 이는 무수 DMSO 중에서 CRM197의 완전한 언폴딩을 입증한다 (도 5). CRM197을 느린 첨가 시간 (8분)으로 무수 DMSO 중에서 재구성한 경우에, 아미드 I 영역 내 제2 피크 (1626cm-1)가 존재한다. 이러한 제2 피크는 분자간 베타-시트 형성에 기인한다.
실시예 6
본 실시예는 중간 재구성 시간 (4분)에서 재구성되고 최대 300분 동안 유지된 CRM197이 유지 시간이 증가함에 따라 분자간 베타-시트의 비율의 증가를 유도한다는 것을 보여준다.
6 mg/mL, 5% (w/v) 수크로스, 1.25 mM 인산나트륨, pH 7.2에서 동결건조시킨 동결건조된 CRM197을 DMSO (시그마-알드리치로부터의 무수 DMSO, 27655-100 mL) 중에서 10mg/mL의 최종 농도로 4분의 과정에 걸쳐 재구성한다. 시점에 도달할 때까지 30초마다 적절한 부피의 DMSO를 첨가함으로써 재구성을 수행한다. 초기 시점을 수집한 후 (T0), 샘플을 FTIR에서 유지하고, 추가의 시점을 수집한다 (30, 60, 120, 180, 240, 300분). 바이오툴스 PROTA-3S로 50mm CaF2 윈도우를 갖는 투과 모드를 사용하여 제어된 온도 (25℃)에서 FTIR 스펙트럼을 수집한다. 50개의 스캔을 4cm-1의 해상도로 수집하고, 평균내고, 완충제 차감하고, 수증기 보정할 수 있다.
중간 시간 (4분)으로의 무수 DMSO 중 CRM197의 재구성은 분자간 베타-시트 아미드 I 피크의 존재에 의해 입증된 바와 같이 단백질 응집을 유도한다 (도 6). 유지 시간을 300분까지 증가시키면 비례적으로 분자간 베타-시트의 양이 증가하고 유리 카르보닐 아미드 I 피크의 양이 감소한다 (도 6).
실시예 7
본 실시예는 분자간 베타-시트의 형성이 농도 의존적임을 보여준다.
6 mg/mL, 5% (w/v) 수크로스, 1.25 mM 인산나트륨, pH 7.2에서 동결건조시킨 동결건조된 CRM197을 DMSO (무수 DMSO는 시그마-알드리치로부터의 것일 수 있음, 27655-100 mL) 중에서 10, 30 또는 50 mg/mL의 최종 농도로 2분의 과정에 걸쳐 재구성한다. 시점에 도달할 때까지 30초마다 적절한 부피의 DMSO를 첨가함으로써 재구성을 수행한다. 바이오툴스 PROTA-3S로 50mm CaF2 윈도우를 갖는 투과 모드를 사용하여 제어된 온도 (25℃)에서 FTIR 스펙트럼을 수집한다. 50개의 스캔을 4cm-1의 해상도로 수집하고, 평균내고, 완충제 차감하고, 수증기 보정할 수 있다. 말번 제타사이저 ZS로 1.996cP의 점도를 사용하여 제조된 농도에서 제어된 온도 (25℃)에서 동적 광 산란 (DLS) 측정치를 수집한다.
CRM197이 10 mg/mL에서 빠르게 재구성되는 경우 (도 7, 2분), 분자간 베타-시트 형성의 증거는 없으며, 이는 이전의 관찰을 확인시켜 준다 (도 5). 더 높은 농도 (30mg/mL, 50mg/mL)에서는, 심지어 빠른 재구성 시간 (2분)에서도 분자간 베타-시트가 형성된다. 이는 느린 재구성 동안 존재하는 증가된 CRM197 농도가 분자간 베타-시트의 형성 원인 중 하나라는 가설을 지지한다. 또한 이러한 농도 가설은, 더 낮은 농도 (도 8a)와 비교하여 더 높은 농도 (도 8b)에서 재구성된 CRM197에서 보다 큰 입자의 비율의 증가를 나타내는 DLS 데이터에 의해 지지되며, 이는 단백질 응집과 일치한다.
실시예 8
CRM197을 재구성하는데 사용된 DMSO 중 물의 농도를 증가시키면 분자간 베타-시트의 형성이 증가한다.
6 mg/mL, 5% (w/v) 수크로스, 1.25 mM 인산나트륨, pH 7.2에서 동결건조시킨 동결건조된 CRM197을 DMSO (무수 DMSO는 시그마-알드리치로부터의 것일 수 있음, 27655-100 mL) 중에서 95%, 97%, 99% (v/v)의 DMSO/물 또는 무수 DMSO 중 10 mg/mL의 최종 농도로 2분의 과정에 걸쳐 재구성한다. 무수 DMSO는 시그마-알드리치 D2438-50mL일 수 있다. 시점에 도달할 때까지 30초마다 적절한 부피의 DMSO를 첨가함으로써 재구성을 수행한다. 바이오툴스 PROTA-3S로 50mm CaF2 윈도우를 갖는 투과 모드를 사용하여 제어된 온도 (25℃)에서 FTIR 스펙트럼을 수집한다. 50개의 스캔을 4 cm-1의 해상도로 수집하고, 평균내고, 완충제 차감하고, 수증기 보정한다.
CRM197이 무수 DMSO 중 10 mg/mL로 빠르게 재구성되는 경우 (도 9), 분자간 베타-시트 형성의 증거는 없으며, 이는 이전의 관찰을 확인시켜 준다 (도 5, 도 7). 매우 소량의 물 (99% DMSO/물)은 분자간 베타-시트의 작은 숄더를 보여주며, 이 양은 물의 증가 (97%, 95% DMSO/물)와 함께 증가한다. 이는 재구성에서의 물의 양의 증가가 분자간 베타-시트의 양의 증가로 이어진다는 가설을 지지한다.
실시예 9
동결건조된 CRM197에서의 수분 수준의 감소는 느린 재구성에 대한 민감도를 감소시키지 않는다.
CRM197은 케이크에 존재하는 수분을 감소시키는 방식으로 동결건조시킨다 (보다 긴 건조 사이클, 보다 낮은 충전 부피) (1.25 mM 포스페이트, pH 7.2 함유 1% (w/v) 수크로스 중 약 6 mg/mL). 동결건조된 CMR197은 DMSO (예를 들어, 시그마-알드리치로부터의 무수 DMSO, D2438-50mL) 중에서 10 mg/mL의 최종 농도로 2 또는 8분에 걸쳐 재구성한다. 시점에 도달할 때까지 30초마다 적절한 부피의 DMSO를 첨가함으로써 재구성을 수행한다. 바이오툴스 PROTA-3S로 50mm CaF2 윈도우를 갖는 투과 모드를 사용하여 제어된 온도 (25℃)에서 FTIR 스펙트럼을 수집한다. 50개의 스캔을 4cm-1의 해상도로 수집하고, 평균내고, 완충제 차감하고, 수증기 보정한다.
CRM197의 DMSO 재구성에서의 물의 증가는 분자간 베타-시트 형성의 비율의 증가를 유도한다 (도 9). 수분 함량을 감소시키는 방식으로 동결건조된 CRM197을 2가지 상이한 속도인 빠른 (2분) 및 느린 (8분) 속도로 무수 DMSO 중에서 재구성한다. 동결건조된 CRM197의 감소된 물 함량은 재구성 시간에 대한 분자간 베타-시트 형성의 민감도를 감소시키지 않는다 (도 10).
실시예 10
접합을 위한 준비로, 동결건조된 폴리사카라이드 (Ps) 및 동결건조된 CRM197 단백질 (Pr)을 각각 상기와 같이 무수 DMSO 중에 개별적으로 용해시킨다. 이어서 이들 두 용액을 특정 Ps 대 Pr의 비 (Ps:Pr) 및 최종 Ps 농도를 표적으로 하여 함께 조합한다. 소듐 시아노보로히드라이드를 이 Ps:Pr 접합체 용액에 첨가하고, 용액을 요구되는 접합 온도에서 적절한 반응 시간 동안 인큐베이션하며, 이들 둘 다는 Pr에 접합되는 Ps 혈청형에 대해 특이적이다. 생성된 접합체 크기의 크기는 Ps 농도에 의해 유의하게 영향을 받는 것으로 나타났다.
접합 성분 (Ps 및 Pr)을 조합할 수 있는 여러 수단이 존재한다. 도 1-4는 여러 조합 전략 및 성분을 함께 조합하는 동안 이들이 성분 농도 및 Ps:Pr에 대해 나타내는 효과를 상술한다. Pr을 Ps 용액에 첨가하거나 (도 1) 또는 Ps를 Pr 용액에 첨가하는 (도 2) 경우에, 다른 성분을 함유하는 용액에 첨가되는 성분 및 다른 성분의 농도는 둘 다 시간 경과에 따라, 특히 두 용액 사이의 계면에서 변화한다. 시간 경과에 따른 농도의 변화는 첨가 과정 동안 Ps 농도 및 Ps:Pr 비의 변화를 유발하여 접합체 크기에 영향을 미친다. 동결건조된 Ps를 Pr 용액 중에 용해시키는 경우에 (도 3), 분말 및 액체의 계면에서의 Ps 농도 및 Ps:Pr 비는 높게 시작하고 (Ps의 용해도 한계에 있음), 이어서 폴리사카라이드가 용해됨에 따라 표적 값으로 떨어진다.
그러나, 두 성분을 티-혼합에 의해 개별 접합 용기에 동시에 첨가하는 것 (도 4)은 이러한 농도 구배를 제거하고, 두 성분의 비를 첨가 전반에 걸쳐 일정하게 유지하여 접합체 크기에 대한 잠재적 영향을 유의하게 감소시킨다. 챔버 내 두 성분을 조합하기 위한 펌프의 사용 (티-혼합)은 다른 동시 전달 모드와 비교하여 높은 수준의 제어 및 확장성을 제공한다.
혈청형 19F에 대한 여러 개발 용액에서, 표 3에 요약된 바와 같이 접합 동안 점성 겔이 형성되며: 겔 형성은 큰, 고도로 네트워킹된 접합체의 형성을 나타낸다. 이들 용액에서, 접합을 위해 높은 Ps 농도를 표적으로 한다. 겔화된 용액에서, 건조된 Ps를 Pr 용액 중에 용해시키거나 Ps 용액을 Pr 용액에 첨가한다. 이들 조합 전략 둘 다는 높은 초기 Ps 농도 및 Ps:Pr을 가지면서 첨가 동안 Ps 농도 구배를 나타낸다 (도 1 및 도 3). 농도 구배를 갖지 않은 배치 (도 4) 또는 초기 Ps 농도 및 Ps:Pr 비가 낮은 농도 구배를 가진 배치 (도 2)는 겔 형성을 나타내지 않았다. 이는 높은 Ps 농도 및 Ps:Pr 비가 매우 큰 접합체를 생산하여 점성 겔의 형성을 유발할 수 있다는 가설을 지지한다.
Figure pct00004
실시예 11
동결건조된 Ps 및 동결건조된 CRM197 (Pr)을 동일 부피의 무수 DMSO를 사용하여 주위 온도에서 재용해시켜 Ps 및 Pr 균질 용액을 제조한다. CRM197을 2분의 빠른 속도로 재용해시킨다. 일부 실시양태에서, 500 mM 인산나트륨, pH 7.2 완충제를 DMSO-재용해된 단백질 용액 중에 1.0 mM 인산나트륨의 최종 농도로 스파이킹한다. DMSO 중에 재용해시킨 후에, Ps 및 CRM197 용액을 혈청형-특이적 최종 Ps 농도 및 Ps:CRM197 비 (표 4)를 표적으로 하여 상기 기재된 바와 같이 티-혼합에 의해 조합한다.
WFI 중 소듐 시아노보로히드라이드의 용액을 제조하고, 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 meq (Ps 반복 단위 몰당 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 몰)를 용액에 첨가한다. 소듐 시아노보로히드라이드 용액의 몰농도 (표 4)는 접합 동안 용액의 대략 0.5% 총 물 함량의 표적을 기준으로 한다. 용액을 혈청형-특이적 온도에서 혈청형-특이적 지속기간 (표 4) 동안 반응시켜, 접합된 생성물 중간체 (CP)를 생성한다.
WFI 중 소듐 보로히드라이드의 용액을 제조하고, (Ps 반복 단위에 대해) 소듐 보로히드라이드 2.0 meq를 용액에 첨가한다. 소듐 보로히드라이드 용액의 몰농도 (표 4)는 보로히드라이드 첨가 후 용액 중 대략 1.0% 총 물 함량의 표적을 기준으로 한다. 용액을 주위 온도에서 2-3시간 동안 반응하도록 하여, 접합체 생성물 켄칭된 중간체 (CPQ)를 생성한다.
Figure pct00005
이어서 접합 용액을 150 mM 염화나트륨 (일부 실시양태에서 접합체의 경우 0.025% w/v 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨)에 느리게 첨가함으로써 접합 용액을 20% 이하 (v/v)의 무수 DMSO로 희석한다. 용액 온도를 희석 단계 동안 15℃ 미만으로 유지한다. 약 1시간 후, 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0을 용액에 25 mM 인산칼륨의 최종 농도로 첨가한다. 접합 성능을 전체 Ps 및 CRM197 소비, 접합체 Ps 대 CRM197 비 및 접합체 분자량에 의해 평가한다.
접합 용액을 대략 2.5 g/L로 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 또는 150 mM 염화나트륨 중 25 mM 인산칼륨의 10 디아볼륨에 대해 투석여과한다. 이는 한외여과 3 공정 중간체 (UF3-FR)를 생성하였다. UF3-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다.
19F의 경우, 일부 실시양태에서, UF3-FR을 0.22-마이크로미터 여과하고, 후속적으로 22℃에서 대략 120시간 동안 인큐베이션한다.
이어서 UF3-FR 용액을 한외여과 4 단계에서 처리한다. 한외여과 4 단계 동안, 일부 실시양태에서, 용액을 대략 2.5 g/L의 Ps 농도로 농축시키고, 300 kDa NMWCO 바이오맥스 PES 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘의 20 디아볼륨에 대해 투석여과한다. 혈청형 7F는 한외여과 4 단계에 100 kDa NMWCO 막을 사용하였다. 혈청형 6A, 6B 및 18C의 경우, UF3-FR 용액을 대략 3.5 g/L로 농축시키고, 300 kDa NMWCO 바이오맥스 PES 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, 0.03% w/v PS-20, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과한다. 일부 실시양태에서, 혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F UF3-FR 용액을 대략 2.0 g/L로 농축시키고, 300 kDa NMWCO 울트라셀, 재생 셀룰로스, 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, 0.015% w/v PS-20, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과한다. 이는 한외여과 4 공정 중간체 (UF4-FR)를 생성하였다. UF4-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다.
UF4-FR을 PVDF 필터를 통해 0.22-마이크로미터 여과한다. 여과물의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 여과물의 Ps 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 여과물을 이어서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘을 사용하여 1.0 g/L의 Ps 농도로 희석한다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC)를 생성하였다. MBC를 분취물로 분배하고, -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킨다.
혈청형 6A, 6B 및 18C에 대한 UF4-FR을 이중-막 PES 필터를 통해 0.5/0.2-마이크로미터 여과한다. 여과물의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 여과물의 Ps 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 여과물을 이어서 150 mM 염화나트륨, 0.03% w/v PS-20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘을 사용하여 1.0 g/L의 Ps 농도로 희석한다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC)를 생성하였다. MBC를 분취물로 분배하고, -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킨다.
혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F에 대한 UF4-FR을 PVDF 필터를 통해 0.22-마이크로미터 여과한다. 여과물의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 여과물의 Ps 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 여과물을 이어서 150 mM 염화나트륨, 0.015% w/v PS-20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘을 사용하여 1.0 g/L의 Ps 농도로 희석한다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC)를 생성하였다. MBC를 분취물로 분배하고, -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킨다.
실시예 12
CRM197을 무수 DMSO 중에 느리게 재구성하고 (8분) 후속적으로 6B 폴리사카라이드에 접합시킨 경우에 접합 후 분자간 베타-시트가 존재한다.
CRM197을 DMSO 중에서 빠르게 (2분) 또는 느리게 (8분) 재구성하고, 후속적으로 이전에 논의된 바와 같이 6B 폴리사카라이드에 접합시키고, 이전에 논의된 바와 같이 정제하고, (10 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH7) 중 약 1mg/mL의 농도로 투석여과한다. 이어서 샘플을 아미콘 울트라 11K MWCO 필터로 농축시켜 FTIR 측정을 가능하게 한다. 바이오툴스 PROTA-3S로 50 mm CaF2 윈도우를 갖는 투과 모드를 사용하여 제어된 온도 (25℃)에서 FTIR 스펙트럼을 수집한다. 50개의 스캔을 4 cm-1의 해상도로 수집하고, 평균내고, 완충제 차감하고, 수증기 보정한다. 후속적으로 데이터를 오믹 소프트웨어 (써모피셔(ThermoFisher))를 사용하여 분석한다.
DMSO 중에서 느리게 재구성된 CRM197로 제조된 CRM197-6B 접합체 (도 11)는 분자간 베타-시트 형성의 증거를 제시하며, 이는 재구성 후에도 CRM197 응집이 존재함을 입증한다. 빠르게 재구성된 CRM197로 제조된 CRM197-6B 접합체 (도 11)는 예상된 유리 C=O 아미드를 나타내고 명백한 베타-시트 형성이 없는 것으로 나타낸다.
실시예 13
본 실시예는 무수 DMSO 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 또는 38로부터의 Ps를 CRM197 (Pr)에 접합시키는 방법을 보여준다. 상이한 혈청형 폴리사카라이드를 공통 공정 흐름을 사용하여 정제된 CRM197 담체 단백질에 개별적으로 접합시킨다.
이전에 기재된 바와 같이 제조된 건조된 CRM197을 무수 DMSO 중에, 건조된 CRM197에 대한 무수 DMSO의 2분에 걸친 빠른 첨가에 의해 재구성하고, Ps를 각각 개별적으로 무수 DMSO 중에서 재구성하여 Pr 및 Ps 균질 용액을 제조한다. Ps 및 Pr을 각각 총 접합 반응 부피의 절반으로 재구성한다. 따라서, DMSO 재구성 후의 Ps 농도는 표 3으로부터 계산된 2.2 내지 7.6 g/L의 2x 접합 동안의 Ps 농도 범위이다. DMSO 재구성 후의 Pr 농도는 1.5 내지 5.7 g/L의 2x (접합 동안의 Ps 농도/Ps:Pr 비) 범위이다. 이어서 Pr 균질 용액 및 Ps 균질 용액을 티-혼합에 의해 함께 조합한다. 이어서 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 1 몰)를 혼합물에 첨가하고, 혈청형-특이적 지속기간 (1 내지 48시간) 동안 접합을 진행시켜 표적으로 하는 접합체 크기를 달성한다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
접합 반응 후에 소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 2 몰)를 첨가하고, 용액을 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 용액을 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨, 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20 중으로 희석한다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시킨다. 용액을 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨에 대해 대략 4℃에서 투석여과한다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 각각의 용액을 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과한다. 보유물 용액을 0.22-마이크로미터 여과한다.
혈청형 19F를 대략 5일 동안 인큐베이션하고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하고, 0.22-마이크로미터 여과한다. 혈청형 18C를 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하고, 0.22-마이크로미터 여과한다.
용액을 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘으로 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시킨다.
실시예 14
본 실시예는 상이한 계면활성제 및 안정화제를 사용한 15가 폐렴구균 접합체 백신의 제제화를 보여준다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 갖는 15가 폐렴구균 접합체 백신 (PCV15)의 제제화에 사용한다.
이전에 논의된 바와 같이 DMSO 중에서 환원성 아미노화에 의해 생성된 폐렴구균 폴리사카라이드-CRM197 접합체를 사용하여 제제를 제조한다. 개별 혈청형의 표적 최종 농도를 수득하는데 필요한 벌크 접합체의 요구되는 부피를 용액 부피 및 벌크 폴리사카라이드 농도에 기초하여 계산한다. 15종의 접합체를 염화나트륨, L-히스티딘, pH 5.8 완충제와 폴리소르베이트 (PS)-20, PS-80 또는 폴록사머 (P)188로부터 선택된 부형제와 조합한다.
멸균 제제화된 벌크를 벌크 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)와 프로필렌 글리콜 (PG) 및 폴리에틸렌 글리콜 400 (PEG400)의 존재 또는 부재 하에 조합하는 동안 및 그 후에 부드럽게 혼합한다. 다양한 제제에서 2가지 농도의 접합체 및 APA를 연구한다. 하나는 8 μg/mL 혈청형 6B 폴리사카라이드, 모든 다른 혈청형에 대해서는 4μg/mL 폴리사카라이드 및 250 μg/mL APA를 함유하였다. 다른 것은 16 μg/mL 혈청형 6B 폴리사카라이드, 모든 다른 혈청형에 대해서는 8 μg/mL 폴리사카라이드 및 500 μg/mL APA를 함유하였다. 제제화된 백신을 2-8℃에서 저장한다.
APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 수성 현탁액이다. APA는 염화알루미늄 및 인산나트륨을 1:1 부피 비로 조합하여 알루미늄 히드록시포스페이트를 침전시킴으로써 제조한다. 조합 공정 후에, 물질을 고-전단 혼합기로 크기-감소시켜 단분산 입자 크기 분포를 달성한다. 이어서 생성물을 생리 염수에 대해 투석여과하고, 증기 멸균한다.
실시예 15
본 실시예에서, 상기 논의된 바와 같이 제조된 6B 폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr)을 REV에 의해 개별로 동결건조시켜 건조된 케이크를 형성한다. 건조된 케이크를 DMSO 중에서 재구성하고, 본원에 논의된 바와 같이 접합시킨다.
표적 Ps:Pr 비 (w/w)는 0.9 내지 1.5이고, 접합체의 표적 분자량 (MW)은 1500 내지 3500 kD이다. 표적 유리 Ps는 15% 이하이고, 유리 리신 손실은 5 몰/몰 초과이다. 결과는 표 5에 제시된다. 본 발명에 따라 제조된 REV 건조된 물질은 표적 범위 내의 접합체 MW, 표적 범위 내의 Ps:Pr 비, 표적 범위 내의 유리 Ps 및 표적 범위 내의 유리 리신을 갖는다.
Figure pct00006
표 5에서의 접합체 Mw, 접합체 Mn, 접합체 Ps:Pr에 대한 검정.
HPSEC/UV/MALS/RI 검정을 사용하는 접합체의 분자량 및 농도 분석. 접합체 샘플을 주입하고, 고성능 크기-배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 의해 분리하였다. 자외선 (UV), 다중-각도 광 산란 (MALS) 및 굴절률 (RI) 검출기를 연속으로 사용하여 검출을 수행하였다. UV280으로부터 흡광 계수를 사용하여 단백질 농도를 계산하였다. mL/g으로 보고된 용질 농도의 변화에 대한 용액의 굴절률의 변화인 dn/dc 인자를 사용하여 폴리사카라이드 농도를 RI 신호 (단백질 및 폴리사카라이드 둘 다에 의해 기여됨)로부터 디컨볼루션하였다. 전체 샘플 피크에 걸쳐 측정된 농도 및 광 산란 정보를 사용하여 아스트라 소프트웨어 (와이어트 테크놀로지 코포레이션(Wyatt Technology Corporation), 캘리포니아주 산타 바바라)에 의해 샘플의 평균 분자량을 계산하였다.
표 5에서의 리신 손실에 대한 검정.
폴리사카라이드와 담체 단백질 사이의 공유 부착의 수의 척도로서 접합된 단백질 내의 리신 소비의 결정.
워터스 AccQ-태그 아미노산 분석 (AAA)을 사용하여 접합체 샘플에서의 접합 정도를 측정하였다. 엘덱스 워크스테이션에서 증기 상 산 가수분해를 사용하여 샘플을 가수분해시켜, 담체 단백질을 그의 성분 아미노산으로 분해하였다. 6-아미노퀴놀릴-N-히드록시숙신이미딜 카르바메이트 (AQC)를 사용하여 유리 아미노산을 유도체화하였다. 이어서 C18 칼럼 상에서 UV 검출 동반 UPLC를 사용하여 유도체화된 샘플을 분석하였다. 리신 이외의 대표적인 아미노산을 사용하여 평균 단백질 농도를 얻었다. 접합 동안 리신 소비 (즉, 리신 손실)를 접합체 내 리신의 평균 측정량과 출발 단백질 내 리신의 예상량 사이의 차이에 의해 결정하였다.
표 5에서의 유리 Ps에 대한 검정
유리 폴리사카라이드 (CRM197과 접합되지 않은 폴리사카라이드)는 먼저 유리 단백질 및 접합체를 데옥시콜레이트 (DOC) 및 염산으로 침전시킴으로써 측정한다. 이어서 침전물을 여과하고, 여과물을 HPSEC/UV/MALS/RI에 의해 유리 폴리사카라이드 농도에 대해 분석한다. 유리 폴리사카라이드를 HPSEC/UV/MALS/RI에 의해 측정된 총 폴리사카라이드의 백분율로서 계산한다.
표 5에서의 유리 Pr에 대한 검정
접합체 샘플 내의 유리 폴리사카라이드, 폴리사카라이드-CRM197 접합체 및 유리 CRM197을 모세관 전기영동에 의해 미셀 동전기적 크로마토그래피 (MEKC) 모드로 분리한다. 간략하게, 샘플을 25mM 보레이트, 100mM SDS, pH 9.3을 함유하는 MEKC 전개 완충제와 혼합하고, 사전조건화 무가공-융합 20 실리카 모세관에서 분리한다. 분리를 200 nm에서 모니터링하고, 유리 CRM197을 CRM197 표준 곡선으로 정량화한다. 유리 단백질 결과를 HPSEC/UV/MALS/RI 절차에 의해 결정된 총 단백질 함량의 백분율로서 보고한다.
실시예 16
본 실시예에서, 6A 폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr) 샘플을 본 발명에 따라 개별적으로 (개별로) 제조하고 동결건조시키거나 또는 조합하고 동결건조시킨다. 동결건조된 샘플을 후속적으로 본원에 논의된 바와 같이 DMSO 중에서 재구성하고 접합시킨다.
비드를 건조시키기 위해 2가지 상이한 MVD 사이클을 시험하였다 (표 6). 두 사이클에서, 압력을 50 내지 60 mTorr의 범위로 유지하였다. 온도는 25 내지 30℃의 범위에 머무르면서 얼마나 많은 전력이 인가되는지에 좌우되었다.
Figure pct00007
예비 건조 사이클 (Lyo1)은 표 7에 제시된 바와 같이 18시간이 소요되었다.
Figure pct00008
표 8에 제시된 바와 같이, 2차 건조 사이클을 추가하고 1차 건조 시간을 증가시킴으로써 건조 사이클을 변형시켰다 (Lyo 2).
Figure pct00009
표적 Ps:Pr 비 (w/w)는 0.9 내지 1.5이고, 접합체의 표적 분자량 (MW)은 1500 내지 3500 kD이다. 결과가 표 9에 제시된다.
Figure pct00010
실시예 17
본 실시예에서, 23F 폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr) 샘플을 본 발명에 따라 개별적으로 (개별로) 제조하고 동결건조시키거나 또는 조합하고 동결건조시킨다. 동결건조된 샘플을 후속적으로 본원에서 이전에 논의된 바와 같이 DMSO 중에서 재구성하고 접합시킨다.
표적 Ps:Pr 비 (w/w)는 0.9 내지 1.5이고, 접합체의 표적 분자량 (MW)은 1500 내지 3500 kD이다. 결과가 표 10에 제시되며, 이는 2.4의 비를 가진 샘플 B2를 제외하고는 개별적으로 동결건조된 샘플에 대해 Ps 및 Pr이 예상된 표적에 있었음을 보여준다.
Figure pct00011
실시예 18
본 실시예는 6A 폴리사카라이드 (Ps)를 사용한 접합체 크기에 대한 동결건조된 담체 단백질 CRM197 (Pr)에의 DMSO 첨가 시간의 영향을 보여준다. 이전에 논의된 바와 같이, DMSO를 동결건조된 Pr에 빠르게 (2분) 및 느리게 (8분) 첨가하고, 혼합한 다음, DMSO 중에서 재구성된 활성화된 Ps에 접합시켰다.
도 13은 증가하는 크기의 폴리사카라이드를 사용하는 접합 반응으로부터 생성되는 접합체의 크기를 보여준다. 통상적인 관계는 접합 반응에 사용되는 폴리사카라이드 (UF2 크기)가 클수록 그로부터 생성되는 접합체가 더 크다는 것이다. 각각의 폴리사카라이드 크기에 대해, 동결건조 후 Pr에 대한 느린 및 빠른 DMSO 첨가 속도를 비교하였다. 그래프는 느린 DMSO 첨가가 빠른 DMSO 첨가보다 동일한 크기의 폴리사카라이드로부터 훨씬 더 큰 접합체를 생성한다는 것을 보여준다.
실시예 19
본 실시예는 폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr; CRM) 리오스피어를 생산하기 위한 동결건조기 조건의 개발을 보여준다.
CRM 및 혈청형 6A 및 23F로부터의 활성화된 폴리사카라이드의 개별 용액을 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 및 본 실시예의 표에 제시된 바와 같이 Ps, CRM 및 수크로스 농도를 갖도록 제조하였다.
변형된 바이오멕 FX 피펫팅 로봇 (크리오멕(Cryomek))을 사용하여 크리오멕의 편평 동결 표면 상에 용액의 50 μL 분취물을 분배한다. 임의의 균열을 유발하지 않으면서 작은 차가운 용기 상에 비드를 분배하는데 셔블링 메카니즘을 사용할 수 있다. 각각의 상이한 용액에 대해 사이클을 완료한 후에, 비드를 중간 저장 용기 내로 옮기고, 동결건조기에서의 승화 건조까지 또는 마이크로웨이브 진공 건조에 의할 때까지 -70℃에서 유지한다. 동결건조기 건조를 위해, 비드를 건조 트레이 내에 단일 층으로 분배한다. 캐비넷 압력, 선반 온도 및 사이클 시간을 설정한다. 비드를 건조시킨 후, 리오스피어를 2 내지 8℃에서 저장한다. (특정 파라미터에 대해서는 실시예 5 참조)
예비 건조 사이클 (Lyo1)은 표 19.1에 제시된 바와 같이 18시간이 소요되었다. 칼 피셔 적정에 의해 측정된 리오스피어의 잔류 수분 함량이 표 19.2에 제시되어 있다.
Figure pct00012
Figure pct00013
결과는 리오스피어 중 높은 수분 함량을 보여준다. 추가로, 리오스피어는 매우 취약하고 흡습성이었다. 고체 함량은 표 20.2에 제시된 바와 같이 폴리사카라이드, 단백질 및 수크로스 농도를 증가시킴으로써 증가되었다. 표 20.1에 제시된 바와 같이, 2차 건조 사이클을 추가하고 1차 건조 시간을 증가시킴으로써 건조 사이클을 변형시켰다 (Lyo 2).
Figure pct00014
Figure pct00015
개선된 건조 사이클로 인해 Lyo2로부터의 잔류 수분 함량은 Lyo1보다 유의하게 더 낮았다. 2차 건조는 모든 얼음이 승화된 후에도 생성물에 여전히 존재하는 결합된 수분의 제거를 개선시킨다. 2차 건조는 1차 건조 (15℃)보다 더 높은 온도 (30℃)를 요구하였다.
이 시점에서, 동결건조기 총 건조 사이클 시간은 45시간이었다. 건조 사이클 시간을 훨씬 더 감소시키기 위해 여러 파라미터, 예컨대 압력 및 온도를 변화시켰다 (방법: Lyo 3) 표 21.1 및 21.2.
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 20
본 실시예는 폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr; CRM) 리오스피어를 생산하기 위한 방사 에너지 진공 (REV) 탈수 (마이크로웨이브 진공 건조 (MVD)) 조건의 개발을 보여준다.
CRM 및 혈청형 6A 및 23F로부터의 활성화된 폴리사카라이드의 용액을 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 및 표 22.1 및 22.2에 제시된 바와 같은 Ps, CRM 및 수크로스 농도를 갖도록 제조하였다.
변형된 바이오멕 FX 피펫팅 로봇 (크리오멕)을 사용하여 크리오멕의 편평 동결 표면 상에 용액의 50 μL 분취물을 분배한다. 임의의 균열을 유발하지 않으면서 작은 차가운 용기 상에 비드를 분배하는데 셔블링 메카니즘을 사용할 수 있다. 각각의 상이한 용액에 대해 사이클을 완료한 후에, 비드를 중간 저장 용기 내로 옮기고, 동결건조기에서의 승화 건조까지 또는 마이크로웨이브 진공 건조에 의할 때까지 -70℃에서 유지한다. 마이크로웨이브 건조를 위해, 비드를 용기 내에 단일 층으로 분배하였다. 전력, 압력 및 사이클 시간을 설정하였다. 비드를 건조시킨 후, 리오스피어를 2 내지 8℃에서 저장하였다. (특정 파라미터에 대해 실시예 6 참조).
비드를 건조시키기 위해 2가지 상이한 MVD 사이클을 시험하였다. 두 사이클에서, 압력을 50 내지 60 mTorr의 범위로 유지하였다. 온도는 25 내지 30℃의 범위에 머무르면서 얼마나 많은 전력이 인가되는지에 좌우되었다.
Figure pct00018
Figure pct00019
MVD1 사이클은 4시간 30분이 소요되었지만 잔류 수분 함량을 2%까지 감소시키기에는 충분하지 않았다. MVD2 사이클은 더 높은 전력에서 더 오래 소요되었으며, 따라서 유의하게 더 낮은 잔류 수분 함량을 제공하였다.
본 발명은 예시된 실시양태를 참조하여 본원에 기재되어 있으나, 본 발명이 이에 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술을 갖고 본원의 교시에 접근할 수 있는 자는 추가의 변형 및 그의 범주 내의 실시양태를 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (37)

  1. 담체 단백질에 공유 연결된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며,
    (a) 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 건조된 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 건조된 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 제1 건조된 조성물 및 제2 건조된 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 제1 균질 용액 및 담체 단백질을 포함하는 제2 균질 용액을 제공하는 단계;
    (c) 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 티-혼합에 의해 조합하여 혼합물을 생산하는 단계; 및
    (d) 혼합물에 환원제를 첨가하여 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 1종 이상의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 건조된 조성물이 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된 승화 건조 공정에 의해 제조되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 승화 건조 공정이 제1 및 제2 수용액을 케이크 또는 리오스피어 비드의 형태로 동결시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 승화 건조가 금속 트레이, 플라스틱 트레이, 플라스틱 백 및 부류 I 튜빙 바이알로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에서 수행되는 벌크 건조인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 건조된 조성물이 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수를 포함하는 승화 건조 공정에 의해 제조되며, 이는 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 수용액 및 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 제2 수용액을 제공하고, 여기서 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% (w/v) 이상의 수크로스를 포함하는 것인 단계, 및 제1 및 제2 수용액을 승화 건조 공정에 적용하여 제1 및 제2 건조된 조성물을 생산하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는 시트레이트 완충제인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 건조된 조성물이 6% 미만의 수분 함량을 갖는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 유기 용매가 디메틸술폭시드 (DMSO)인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 재구성이 8분 이하로 포함되고, 혼합이 120분 이하로 포함되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 각각의 접합체 용액이 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 접합체 용액이 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 양을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 1종 이상의 폴리사카라이드가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 불활성화된 박테리아 톡소이드가 CRM197인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 접합체 용액이 멸균 여과되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드가 산화제와의 반응에 의해 활성화되는 것인 방법.
  18. 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며,
    (a) (i) 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액; 또는
    (ii) 각각 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액
    을 제공하는 단계;
    (b) 각각 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 2종 이상의 제2 수용액을 제공하고, 여기서 2종 이상의 제2 수용액의 양은 적어도 2종 이상의 제1 수용액의 양에 상응하는 것인 단계;
    (c) 2종 이상의 제1 수용액 및 2종 이상의 제2 수용액을 승화 건조 공정에서 개별적으로 건조시켜, 각각 건조된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 건조된 조성물 및 각각 건조된 담체 단백질을 포함하는 2종 이상의 제2 건조된 조성물을 생산하는 단계;
    (d) 2종 이상의 제1 건조된 조성물 각각 및 2종 이상의 제2 건조된 조성물 각각을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 독립적으로 (i) 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드 또는 (ii) 2종 이상의 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 균질 용액 및 각각 담체 단백질을 포함하는 2종 이상의 제2 균질 용액을 제공하는 단계;
    (e) 각각의 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 티-혼합에 의해 개별적으로 조합하여 복수의 혼합물을 생산하는 단계;
    (f) 복수의 혼합물에 환원제를 첨가하여 복수의 접합체 용액을 생산하는 단계; 및
    (g) 복수의 접합체 용액 중 2종 이상을 조합하여, 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 적어도 1종의 접합체 용액이 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조되거나; 또는
    적어도 1종의 접합체 용액이 제1 수용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조되거나; 또는
    각각의 접합체 용액이 제1 균질 용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조되거나; 또는
    각각의 접합체 용액이 제1 수용액을 제2 균질 용액과 개별적으로 티-혼합하여 복수의 접합체 용액을 생산함으로써 제조되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 승화 건조 공정이 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수를 포함하는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 승화 건조 공정이 제1 및 제2 수용액을 케이크 또는 리오스피어 비드의 형태로 동결시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 승화 건조가 금속 트레이, 플라스틱 트레이, 플라스틱 백 및 부류 I 튜빙 바이알로 이루어진 군으로부터 선택된 용기에서 수행되는 벌크 건조인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 제1 및 제2 수용액이 약 0.5% (w/v) 이상의 수크로스를 포함하는 것인 방법.
  24. 제18항에 있어서, 유기 용매가 디메틸술폭시드 (DMSO)인 방법.
  25. 제18항에 있어서, 재구성이 8분 이하로 포함되고, 혼합이 120분 이하로 포함되는 것인 방법.
  26. 제18항에 있어서, 각각의 접합체 용액이 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함하는 것인 방법.
  27. 제18항에 있어서, 각각의 접합체 용액이 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 양을 포함하는 것인 방법.
  28. 제18항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제인 방법.
  29. 제18항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는 시트레이트 완충제인 방법.
  30. 제18항에 있어서, 1종 이상의 폴리사카라이드가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3 중 적어도 1종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득되는 것인 방법.
  31. 제18항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 불활성화된 박테리아 톡소이드가 CRM197인 방법.
  33. 제18항에 있어서, 접합체 용액이 멸균 여과되는 것인 방법.
  34. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 23종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 23종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 23종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 23종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 23종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 23종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (c) 23종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 23종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 혼합물을 생산하고, 여기서 23종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 23종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 23종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 23종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 23종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  35. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 15종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 15종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 15종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 15종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 15종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 15종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계,
    (c) 15종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 15종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 혼합물을 생산하고, 여기서 15종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 15종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 15종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 15종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 15종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  36. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 13종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 13종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 13종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 13종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 13종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 13종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (c) 13종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 13종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 혼합물을 생산하고, 여기서 13종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 13종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 13종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 13종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 13종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  37. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 10종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 각각 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하고, 여기서 10종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 10종의 건조된 담체 단백질 조성물 및 10종의 건조된 활성화된 폴리사카라이드 조성물을 유기 용매 중에서 개별적으로 재구성하고 혼합하여, 각각 담체 단백질을 포함하는 10종의 균질 담체 단백질 용액 및 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 균질 활성화된 폴리사카라이드 용액을 제공하고, 여기서 10종의 균질 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (c) 10종의 균질 담체 단백질 용액 각각을 10종의 활성화된 폴리사카라이드 균질 용액 중 1종과 티-혼합에 의해 조합하여, 각각 담체 단백질 및 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 혼합물을 생산하고, 여기서 10종의 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 10종의 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 10종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 10종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 10종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
KR1020207033918A 2018-04-30 2019-04-25 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법 KR20210005158A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862664590P 2018-04-30 2018-04-30
US62/664,590 2018-04-30
PCT/US2019/029048 WO2019212846A1 (en) 2018-04-30 2019-04-25 Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210005158A true KR20210005158A (ko) 2021-01-13

Family

ID=68386725

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207033918A KR20210005158A (ko) 2018-04-30 2019-04-25 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20210252125A1 (ko)
EP (1) EP3787673A4 (ko)
JP (1) JP2021522288A (ko)
KR (1) KR20210005158A (ko)
CN (1) CN112074293A (ko)
WO (1) WO2019212846A1 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
EP3576759A4 (en) 2017-01-31 2020-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. PROCESS FOR THE PREPARATION OF CAPSULE POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATES FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTYPE 19F
US11197921B2 (en) 2017-01-31 2021-12-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for making polysaccharide-protein conjugates
KR20240011879A (ko) 2017-02-24 2024-01-26 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체의 면역원성의 증진
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
AU2018328035B2 (en) 2017-09-07 2024-03-07 Chitrananda Abeygunawardana Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
KR20200051005A (ko) 2017-09-07 2020-05-12 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 폐렴구균 폴리사카라이드 및 면역원성 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체에서의 그의 용도
AR114154A1 (es) 2017-12-06 2020-07-29 Merck Sharp & Dohme Composiciones que comprenden conjugados de polisacárido de streptococcus pneumoniae con proteína y métodos de uso de estos
JP2021522288A (ja) 2018-04-30 2021-08-30 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 肺炎球菌莢膜多糖類担体タンパク質複合体の製造方法
KR20210002641A (ko) 2018-04-30 2021-01-08 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 디메틸술폭시드 중의 동결건조된 돌연변이체 디프테리아 독소의 균질 용액을 제공하는 방법
CA3123414A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
CN113930356B (zh) * 2021-09-23 2022-08-05 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种发酵生产白喉毒素无毒形式crm197蛋白菌种的冻干方法

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6146902A (en) 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
US6517526B1 (en) 2000-12-29 2003-02-11 Yehuda Tamari Container for lyophilizing biological products
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7718791B2 (en) 2005-04-08 2010-05-18 Wyeth Llc Separation of contaminants from Streptococcus pneumoniae polysaccharide by pH manipulation
CA2604363C (en) 2005-04-08 2015-06-16 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US9005654B2 (en) 2005-07-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
NO346529B1 (no) * 2005-12-22 2022-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bruk av et immunogenpreparat for småbarn, omfattende 22F sakkaridkonjugat
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
RU2460539C2 (ru) 2006-10-10 2012-09-10 Вайет СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЛИСАХАРИДОВ Streptococcus pneumoniae 3 ТИПА (ВАРИАНТЫ)
ES2922132T3 (es) 2007-03-23 2022-09-08 Wyeth Llc Procedimiento abreviado de purificación para la producción de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae
EP2167528B1 (en) 2007-06-21 2018-01-10 Angelica Therapeutics, INC. Modified toxins
US8540955B2 (en) 2007-07-10 2013-09-24 Wyeth Llc Process for producing aluminum phosphate
WO2010045431A2 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Dry powder formulations, vaccines and methods
PL2385981T3 (pl) 2008-12-18 2020-01-31 Wyeth Llc Sposób kontroli masy cząsteczkowej polisacharydów streptococcus pneumoniae z zastosowaniem węgla
DK2379734T3 (en) 2008-12-18 2018-04-23 Wyeth Llc Method for Controlling the Molecular Weight of Polysaccharide of Streptococcus Pneumoniae Serotype 19A
EP3461496B1 (en) 2009-06-22 2023-08-23 Wyeth LLC Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
TW201136603A (en) 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
SI3170508T1 (sl) 2010-06-04 2020-01-31 Wyeth Llc Formulacije cepiva
RU2013131795A (ru) 2010-12-10 2015-01-20 Мерк Шарп Энд Домэ Корп. Новые композиции, которые уменьшают вызываемую встряхиванием агрегацию иммуногенных композиций
CN102068690A (zh) * 2010-12-31 2011-05-25 北京民海生物科技有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法
PL3363806T3 (pl) 2012-12-20 2022-12-19 Pfizer Inc. Sposób glikokoniugacji
EP2968450A4 (en) 2013-03-15 2016-10-26 Angelica Therapeutics Inc MODIFIED TOXINS
WO2015057540A1 (en) * 2013-10-16 2015-04-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Method of microwave vacuum drying spherical-shaped pellets of biological materials
CN105934251A (zh) 2014-01-21 2016-09-07 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
HRP20231504T1 (hr) * 2014-01-21 2024-03-01 Pfizer Inc. Polisaharidi kapsule iz bakterije streptococcus pneumoniae i njihovi konjugati
US11160855B2 (en) * 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
NZ759686A (en) * 2014-01-21 2023-07-28 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US10289547B2 (en) * 2014-02-14 2019-05-14 Western Digital Technologies, Inc. Method and apparatus for a network connected storage system
HUE062499T2 (hu) 2015-01-15 2023-11-28 Pfizer Pneumococcus-vakcinákban történõ alkalmazásra szolgáló immunogén készítmények
IL255106B2 (en) 2015-05-04 2023-04-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses
RU2721128C2 (ru) 2015-07-21 2020-05-18 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные антигены капсульного сахарида, наборы, содержащие эти композиции, и их применения
RU2761633C2 (ru) 2015-11-17 2021-12-13 Пфайзер Инк. Среды и способы ферментации для производства полисахаридов в бактериальной клеточной культуре
WO2017085586A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
RU2762723C2 (ru) 2017-01-20 2021-12-22 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции для применения в пневмококковых вакцинах
EP3576759A4 (en) 2017-01-31 2020-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. PROCESS FOR THE PREPARATION OF CAPSULE POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATES FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTYPE 19F
US11197921B2 (en) 2017-01-31 2021-12-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for making polysaccharide-protein conjugates
KR20240011879A (ko) 2017-02-24 2024-01-26 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체의 면역원성의 증진
US11219680B2 (en) 2017-02-24 2022-01-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Polysaccharide-protein conjugates utilizing diphtheria toxin fragment B as a carrier
WO2019050818A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. METHODS OF FORMULATING PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES FOR CONJUGATION TO A CARRIER PROTEIN
EP3585803A4 (en) 2017-02-24 2020-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. PNEUMOCOCCIC CONJUGATE VACCINE FORMULATIONS
WO2018156467A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for improving filterability of polysaccharide-protein conjugate reactions
CN110996992A (zh) 2017-08-16 2020-04-10 默沙东公司 肺炎球菌缀合物疫苗制剂
BR112020004509A8 (pt) 2017-09-07 2023-01-31 Merck Sharp & Dohme Conjugado polissacarídeo-proteína carreadora, composição imunogênica compreendendo o mesmo e uso do referido conjugado
EP3678655A4 (en) 2017-09-07 2021-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTIPNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN POLYSACCHARIDE-CARRIER PROTEIN IMMUNOGENIC CONJUGATES
AU2018328035B2 (en) 2017-09-07 2024-03-07 Chitrananda Abeygunawardana Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
KR20200051005A (ko) 2017-09-07 2020-05-12 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 폐렴구균 폴리사카라이드 및 면역원성 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체에서의 그의 용도
WO2019083865A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Merck Sharp & Dohme Corp. VACCINES WITH ADJUVANT
AR114154A1 (es) 2017-12-06 2020-07-29 Merck Sharp & Dohme Composiciones que comprenden conjugados de polisacárido de streptococcus pneumoniae con proteína y métodos de uso de estos
KR20210002641A (ko) 2018-04-30 2021-01-08 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 디메틸술폭시드 중의 동결건조된 돌연변이체 디프테리아 독소의 균질 용액을 제공하는 방법
JP2021522288A (ja) 2018-04-30 2021-08-30 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 肺炎球菌莢膜多糖類担体タンパク質複合体の製造方法
US20210236646A1 (en) 2018-04-30 2021-08-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates from lyospheres
WO2019217183A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Lyophilization bag
WO2019236435A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Lyosphere critical reagent kit
EP3893926A1 (en) 2018-12-12 2021-10-20 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
CA3123414A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
WO2020208502A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
BR112021024393A8 (pt) 2019-06-05 2023-01-31 Merck Sharp & Dohme Um conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócico de sorotipo 35b imunogênico e processo de conjugação para fabricar o mesmo
US20220218812A1 (en) 2019-06-05 2022-07-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods of treating patients with an immunogenic composition that protects against s. pneumoniae serotype 29

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019212846A1 (en) 2019-11-07
CN112074293A (zh) 2020-12-11
US20210252125A1 (en) 2021-08-19
EP3787673A1 (en) 2021-03-10
US20230077640A1 (en) 2023-03-16
EP3787673A4 (en) 2022-04-27
US11992521B2 (en) 2024-05-28
JP2021522288A (ja) 2021-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11992521B2 (en) Methods for producing Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates
JP7489324B2 (ja) リオスフィアから肺炎連鎖球菌莢膜多糖類キャリアタンパク質コンジュゲートを生産する方法
US11896656B2 (en) Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
CN111093649B (zh) 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
CN111065387B (zh) 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
CN110392690B (zh) 肺炎球菌缀合物疫苗制剂
US20220105169A1 (en) Pneumococcal conjugate vaccine formulations
CN111050794A (zh) 将肺炎球菌多糖与载体蛋白缀合的配制方法
BR112020004396A2 (pt) polissacarídeos pneumocócicos e uso dos mesmos em conjugados imunogênicos polissacarídeo-proteína carreadora
CA2828787C (en) Conjugation of anitigen to carrier protein using triacetoxyborohydride
JP2022515098A (ja) ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖－タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法
HUE027621T2 (en) A method for conjugating bacterial polysaccharides to carrier proteins
CN112041435B (zh) 提供冻干的突变白喉毒素在二甲基亚砜中的均质溶液的方法
RU2789546C2 (ru) Состав пневмококковой конъюгатной вакцины