JP2022515098A - ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖－タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法 - Google Patents

ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖－タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、複数のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物に関するものであり、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は本明細書に定義されているとおりである。幾つかの実施形態においては、多糖タンパク質コンジュゲートの少なくとも１つは、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成される。他の実施形態においては、多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれは、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成される。本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与することを含む、ヒト患者において防御免疫応答を誘導するための方法も提供する。該多価免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染および／またはストレプトコッカス・ニューモニエにより引き起こされる肺炎球菌疾患に対する防御をもたらすのに有用である。本発明の組成物は、肺炎球菌疾患の予防に適応となる多価ワクチンでワクチン接種された患者に補足的防御をもたらす治療レジメンの一部としても有用である。【選択図】図１

Description

発明の分野
本発明は、異なる多糖－タンパク質コンジュゲートを含有する多価免疫原性組成物を提供する。各コンジュゲートは、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌）から製造された莢膜多糖からなる。該免疫原性組成物は肺炎球菌疾患に対して広範な有効範囲をもたらす。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を含む。２０１９年１２月３日付で作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは２４６８３ＷＯＰＣＴ－ＳＥＱＴＸＴ－０３ＤＥＣ２０１９と称され、６キロバイトのサイズを有する。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はグラム陽性菌であり、乳幼児における侵襲性細菌性疾患（例えば、肺炎、細菌血症、髄膜炎および中耳炎）の最も一般的な原因である。肺炎球菌は、血清型特異性をもたらす化学結合多糖で被包されている。肺炎球菌には９０個を超える公知血清型が存在し、莢膜は肺炎球菌の主要な病原性決定因子である。なぜなら、莢膜は細菌の内表面を補体から保護するだけでなく、それ自体は低免疫原性であるからである。多糖はＴ細胞非依存的抗原であり、ほとんどの場合、Ｔ細胞と相互作用するようにプロセシングされたりＭＨＣ分子上に提示されたりすることはない。しかし、それは、Ｂ細胞上の表面受容体の架橋を含む代替メカニズムによって免疫系を刺激しうる。
長年認可されてきた多価肺炎球菌多糖ワクチンは、成人、特に高齢者および高リスク者における肺炎球菌疾患の予防に有用であることが判明している。しかし、乳幼児は非コンジュゲート化肺炎球菌多糖に対する応答が不十分である。乳幼児において侵襲性肺炎球菌疾患を当時引き起こしていた最も頻繁に分離された７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含有する肺炎球菌コンジュゲートワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）が２０００年２月に米国で最初に認可された。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）が米国で広く使用された後、小児における侵襲性肺炎球菌疾患は、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）中に存在する血清型によって、有意に減少している。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５，５４（３６）：８９３－７を参照されたい。しかし、世界の或る地域においてはＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）による血清型の有効範囲が限定され、米国においては、ある新興血清型（例えば、１９Ａなど）の、幾つかの証拠が存在する。Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４－４４；Ｗｈｉｔｎｅｙら，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７－４６；Ｋｙａｗら，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５－６３；Ｈｉｃｋｓら，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６－５４；Ｔｒａｏｒｅら，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１－Ｓ１８９を参照されたい。
米国特許出願公開番号ＵＳ２００６／０２２８３８０は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１３価肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンを記載している。中国特許出願公開番号ＣＮ１０１５９０２２４Ａは、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１４価肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンを記載している。
他のＰＣＶは、ＰＣＶ－１５に含有される７、１０、１１または１３の血清型をカバーしているが（米国特許公開番号２０１１／０１９５０８６）、幾つかの血清型において免疫干渉が観察されており（例えば、ＧＳＫのＰＣＶ－１１における血清型３に関する、より低い防御）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）のＰＣＶ－１３［ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３］においては、血清型６Ｂに対する、より低い応答率が観察されている。Ｐｒｙｍｕｌａら，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０－４８およびＫｉｅｎｉｎｇｅｒら，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４－Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ（４８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，２００８年１０月２５～２８日において発表）を参照されたい。
現在の多価肺炎球菌ワクチンは、ワクチンに存在する血清型に関連する肺炎球菌疾患の発生率を低下させるのに有効である。しかし、現在利用可能なワクチンに存在しない血清型を発現する肺炎球菌の保有率が増加してきている。したがって、現在利用可能なワクチンに存在しない肺炎球菌血清型に対する防御をもたらしうる追加的な肺炎球菌ワクチン組成物が必要とされている。
米国特許出願公開番号ＵＳ２００６／０２２８３８０ 中国特許出願公開番号ＣＮ１０１５９０２２４Ａ 米国特許公開番号２０１１／０１９５０８６
Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４－４４；Ｗｈｉｔｎｅｙら，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７－４６ Ｋｙａｗら，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５－６３ ；Ｈｉｃｋｓら，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６－５４ Ｔｒａｏｒｅら，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１－Ｓ１８９ Ｐｒｙｍｕｌａら，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０－４８ Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒら，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４－Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ（４８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，２００８年１０月２５～２８日において発表）
発明の概括
本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、以下のものからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む：
ａ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｂ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｃ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｄ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｅ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｆ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｇ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｈ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｊ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｋ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｌ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｍ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｎ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｏ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｐ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｑ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｒ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｓ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｔ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｕ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｖ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｗ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｘ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｙ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｚ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；ならびに
ａａ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ。
本発明は、２２個の異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂから製造される。
本発明は、２２個の異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む。
本発明は、２３個の異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂから製造される。
本発明は、２３個の異なるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートは、肺炎球菌のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ由来の多糖を含み、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明は、２４個の異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂから製造される。
本発明は、２４個の異なるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートはそれぞれストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ由来の多糖を含み、キャリアタンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明は、２４個の異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂから製造される。
本発明は、２４個の異なるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートはそれぞれストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ由来の多糖を含み、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明は、３３個までの異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型、更に７Ｃ、９Ｎ、１６Ｆ、２１、２３Ａ、３１、３４、３５Ｆおよび３８から選択される１、２、３、４、５、６、７、８または９個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ血清型を含む群の多糖を含む。
本発明は、３０個までの異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型、更に７Ｃ、９Ｎ、１６Ｆ、２３Ａ、３５Ｆおよび３８から選択される１、２、３、４、５または６個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ血清型を含む群の多糖を含む。
本発明は、３３個までの異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型、更に７Ｃ、９Ｎ、１６Ｆ、２１、２３Ａ、３１、３４、３５Ｆおよび３８から選択される１、２、３、４、５、６、７、８または９個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む。
本発明は、３０個までの異なる多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型、更に７Ｃ、９Ｎ、１６Ｆ、２３Ａ、３５Ｆおよび３８から選択される１、２、３、４、５または６個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む。
幾つかの実施形態においては、多糖タンパク質コンジュゲートの少なくとも１つは、非プロトン性溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むコンジュゲート化反応により形成される。特定の実施形態においては、多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれは、非プロトン性溶媒、例えば（ＤＭＳＯ）を含むコンジュゲート化反応により形成される。 本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与することを含む、ヒト患者において防御免疫応答を誘導するための方法も提供する。本発明の方法の幾つかの実施形態においては、患者は以前に多価肺炎球菌ワクチンで治療されていた。
本発明の多価免疫原性組成物は、異なる補足的肺炎球菌ワクチンによる治療レジメンの一部として使用されうる。したがって、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与すること、そして更に、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与することを、任意の順序で含む、ヒト患者において防御免疫応答を誘導する方法を提供する。特定の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートから構成され、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む。他の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは非コンジュゲート化莢膜多糖から構成されている。 本発明はまた、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの選択された血清型は、他の選択された血清型に対して交差反応性をもたらす。
非アジュバント化ＰＣＶ２２（ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ）またはリン酸アルミニウムアジュバントと共に製剤化されたＰＣＶ２２（ＰＣＶ２２／ＡＰＡ）で免疫化されたマウスに関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、投与後１（ＰＤ１）、２（ＰＤ２）および３（ＰＤ３）ＩｇＧ抗体希釈力価。左から右に、Ｐｒｅ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、Ｐｒｅ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ１ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、ＰＤ１ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ２ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、ＰＤ２ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ３ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊおよびＰＤ３ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ。 ＰＤ３における非アジュバント化ＰＣＶ２２（ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ）と比較したＰＣＶ２２／ＡＰＡのＥＣＬ希釈力価比。 非アジュバント化ＰＣＶ２２（ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ）またはＡＰＡと共に製剤化されたＰＣＶ２２（ＰＣＶ２２／ＡＰＡ）で免疫化されたマウスに関する血清型特異的ＯＰＡ希釈力価（免疫前、ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＤ３）。左から右に、Ｐｒｅ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、Ｐｒｅ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ１ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、ＰＤ１ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ２ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、ＰＤ２ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ３ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊおよびＰＤ３ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ。 ＰＤ３における非アジュバント化ＰＣＶ２２（ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ）と比較したＰＣＶ２２／ＡＰＡのＯＰＡ希釈力価比。 ＰＣＶ２２免疫化マウスはストレプトコッカス・ニューモニエ２４Ｆ気管内チャレンジに対して防御される。 非アジュバント化ＰＣＶ２２またはＰＣＶ２２／ＡＰＡで免疫化されたウサギに関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、ＰＤ１およびＰＤ２ ＩｇＧ抗体希釈力価。エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。左から右に、Ｐｒｅ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、Ｐｒｅ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ１ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ、ＰＤ１ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ、ＰＤ２ ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊおよびＰＤ２ ＰＣＶ２２／ＡＰＡ。 ＰＤ２における非アジュバント化ＰＣＶ２２と比較したＰＣＶ２２／ＡＰＡのＥＣＬ ＧＭＴ比。エラーバーは９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 非アジュバント化ＰＣＶ２２またはＰＣＶ２２／ＡＰＡで免疫化されたウサギに関する血清型特異的ＯＰＡ希釈力価（免疫前「Ｐｒｅ」およびＰＤ２）。エラーバーは５頭のウサギに関する機能的抗体価の変動を表す。 非アジュバント化ＰＣＶ２３で免疫化されたＩＲＭに関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３ ＩｇＧ抗体希釈力価。エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭに関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３ ＩｇＧ抗体希釈力価。エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭに関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３ ＩｇＧ抗体希釈力価。エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭに関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３ ＩｇＧ抗体希釈力価。エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ＡＰＡの存在下または非存在下のＰＣＶ２３でのワクチン接種の後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）におけるＥＣＬ抗体応答の比較。記号はＰＤ１における比率を示す。９５％ＣＩを表すエラーバー付きのＧＭＴ比。 ＡＰＡの存在下または非存在下のＰＣＶ２３でのワクチン接種の後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）におけるＥＣＬ抗体応答の比較。記号はＰＤ２における比率を示す。９５％ＣＩを表すエラーバー付きのＧＭＴ比。 ＡＰＡの存在下または非存在下のＰＣＶ２３でのワクチン接種の後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）におけるＥＣＬ抗体応答の比較。記号はＰＤ３における比率を示す。９５％ＣＩを表すエラーバー付きのＧＭＴ比。 ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡでのワクチン接種の後の又はＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡで共投与されたＩＲＭ（群当たり９頭）におけるＥＣＬ抗体応答の比較。記号はＰＤ１における比を示す。９５％ＣＩを表すエラーバー付きのＧＭＴ比。 ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡでのワクチン接種の後の又はＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡで共投与されたＩＲＭ（群当たり９頭）におけるＥＣＬ抗体応答の比較。記号はＰＤ２における比を示す。９５％ＣＩを表すエラーバー付きのＧＭＴ比。 ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡでのワクチン接種の後の又はＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡで共投与されたＩＲＭ（群当たり９頭）におけるＥＣＬ抗体応答の比較。記号はＰＤ３における比を示す。９５％ＣＩを表すエラーバー付きのＧＭＴ比。 非アジュバント化ＰＣＶ２３、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡ、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡまたはＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡでワクチン接種された後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）における増強したＥＣＬ抗体応答の比較。ＰＤ１／Ｐｒｅ。記号はＧＭＴ比であり、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 非アジュバント化ＰＣＶ２３、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡ、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡまたはＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡでワクチン接種された後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）における増強したＥＣＬ抗体応答の比較。ＰＤ２／Ｐｒｅ。記号はＧＭＴ比であり、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 非アジュバント化ＰＣＶ２３、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡ、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡまたはＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡでワクチン接種された後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）における増強したＥＣＬ抗体応答の比較。ＰＤ３／Ｐｒｅ。記号はＧＭＴ比であり、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 非アジュバント化ＰＣＶ２３、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡ、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡまたはＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡでワクチン接種された後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）における増強したＥＣＬ抗体応答の比較。ＰＤ２／ＰＤ１。記号はＧＭＴ比であり、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 非アジュバント化ＰＣＶ２３、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡ、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡまたはＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡでワクチン接種された後のＩＲＭ（群当たり８～９頭）における増強したＥＣＬ抗体応答の比較。ＰＤ３／ＰＤ２。記号はＧＭＴ比であり、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 リン酸アルミニウムアジュバントと共に製剤化されたＰＣＶ２４（ＰＣＶ２４／ＡＰＡ）で免疫化されたニュージーランド（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）白ウサギに関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、投与後１（ＰＤ１）および２（ＰＤ２）ＩｇＧ抗体希釈力価。エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ＰＣＶ２４／ＡＰＡで免疫化されたＮＺＷＲに関する血清型特異的ＯＰＡ希釈力価（免疫前およびＰＤ２）。エラーバーは８頭のＮＺＷＲに関する機能的抗体価の変動を表す。 リン酸アルミニウムアジュバントと共に製剤化されたＰＣＶ２４（ＰＣＶ２４／ＡＰＡ）で免疫化された乳仔アカゲザル（ＩＲＭ）に関してＥＣＬにより測定された免疫前（Ｐｒｅ）、投与後１（ＰＤ１）、２（ＰＤ２）および３（ＰＤ３）ＩｇＧ抗体希釈力価。エラーバーは幾何平均力価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ＰＣＶ２４／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭに関する血清型特異的ＯＰＡ希釈力価（免疫前およびＰＤ３）。エラーバーは５頭のＩＲＭの機能的抗体価の変動を表す。
発明の詳細な説明
本発明は、肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は本明細書中に定義されているとおりである。
幾つかの実施形態においては、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、以下のものからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む：
ａ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｂ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｃ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｄ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｅ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｆ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｇ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｈ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｊ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｋ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｌ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｍ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｎ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｏ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｐ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｑ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｒ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｓ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｔ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｕ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｖ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｗ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｘ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｙ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｚ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ａａ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｂｂ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｃｃ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｄｄ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｅｅ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｆｆ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｇｇ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｈｈ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｊｊ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｋｋ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｌｌ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｍｍ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｎｎ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｏｏ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｐｐ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｑｑ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｒｒ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｓｓ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｔｔ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｕｕ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｖｖ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｗｗ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｘｘ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｙｙ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｚｚ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ａａａ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；ならびに
ｂｂｂ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９。
幾つかの実施形態においては、多価免疫原性組成物は、ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｖ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型を含む。特定の実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物は複数の肺炎球菌ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型：ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂを含む。該組成物はマウス、ウサギおよび／またはサルにおいて免疫原性であり、試験された全ての用量においてワクチン型細菌株を殺滅する機能的抗体を生成することが判明した。
本発明の多価免疫原性組成物は、ワクチン型ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に対して患者を免疫化するのに、および／または異なる補足的肺炎球菌ワクチンによる治療レジメンの一部として有用である。したがって、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与すること、そして更に、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与することを、任意の順序で含む、ヒト患者において防御免疫応答を誘導する方法を提供する。他の実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物は、異なる多価肺炎球菌ワクチンで以前に免疫化された患者に投与される。
本発明の実施形態においては、少なくとも１つの肺炎球菌血清型に由来するコンジュゲートを、非プロトン性溶媒、例えばＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いて製造する。他の実施形態においては、多価免疫原性組成物は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いてそれぞれが製造される肺炎球菌コンジュゲートを含む。ＤＭＳＯ溶媒の使用は、担体タンパク質の表面上のリジン残基の直接消費により、タンパク質への多糖の共有結合を増強する。共有結合の増強は、ＤＭＳＯ中でコンジュゲート化された多糖抗原を含む多価免疫原性組成物の多糖タンパク質コンジュゲートの安定性の増強に直接的利益をもたらす。
Ｉ．定義および略語
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体において、以下の略語が適用される。
ＡＰＡ リン酸アルミニウムアジュバント
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＣＩ 信頼区間
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＳ 多糖－タンパク質薬物
ＧＭＣ 幾何平均濃度
ＧＭＴ 幾何平均力価
ＨＰＳＥＣ 高速サイズ排除クロマトグラフィー
ＩＭ 筋肉内または筋内
ＩＲＭ 乳仔アカゲザル
ＬＯＳ リポオリゴ糖
ＬＰＳ リポ多糖
ＭＡＬＳ 多角度光散乱
ＭＢＣ 一価バルクコンジュゲート
Ｍｎ 数平均分子量
ＭＯＰＡ 多重オプソニン作用アッセイ
ＭＷ 分子量
ＮＭＷＣＯ 公称分子量カットオフ
ＮＺＷＲ ニュージーランド白（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）ウサギ
ＯＰＡ オプソニン作用アッセイ
ＰＣＶ 肺炎球菌コンジュゲートワクチン
ＰＤ１ 投与後１
ＰＤ２ 投与後２
ＰＤ３ 投与後３
ＰｎＰｓ 肺炎球菌多糖
Ｐｓ 多糖
ＰＳ－２０ ポリソルベート－２０
ＲＩ 屈折率
ＵＶ 紫外線
ｗ／ｖ 重量／体積
本発明がより容易に理解されうるように、幾つかの科学技術用語を以下に具体的に定義する。本明細書中の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書中で用いる他の全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有する。
本明細書の全体および添付の特許請求の範囲において用いる単数形の語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、その複数対象物を含む。
「または」なる語は、示されている可能性の１つを文脈が明らかに定めている場合を除き、可能性の一方または両方を示す。幾つかの場合においては、一方または両方の可能性を強調するために「および／または」を用いた。
還元的アミノ化のようなコンジュゲート化に関して用いられた場合の「水性溶媒」または「水性条件」なる語は、コンジュゲート化反応のための溶媒としての水の使用を指す。水はバッファーおよび他の成分を含みうるが、ただし、有機溶媒は存在しない。
還元的アミノ化のようなコンジュゲート化に関して用いられた場合の「非プロトン性溶媒」、「ＤＭＳＯ溶媒」または「ＤＭＳＯ条件」なる語は、コンジュゲート化反応用の溶媒としての非プロトン性溶媒または複数の非プロトン性溶媒（または適用可能な場合にはＤＭＳＯ）の組合せの使用を指す。非プロトン性溶媒は、幾らかの水、例えば最大１％、２％、５％、１０％または２０％の水を含有しうる。
本発明の免疫原性組成物に関して用いられた場合の「含む」なる語は、アジュバントおよび賦形剤のような任意の他の成分の包含、または具体的に挙げられていない１以上の多糖－タンパク質コンジュゲートの添加を意味する。多価多糖－タンパク質コンジュゲート混合物に関して用いられた場合の「からなる」なる語は、それらの特定のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含有し、異なる血清型に由来する他のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含有しない混合物を指す。「から実質的になる」およびその派生語、例えば「から実質的になり」または「から実質的になって」は、列挙されている任意の要素または要素群の包含、および列挙要素と類似した又は異なる性質の他の要素であって、特定されている投与レジメン、方法または組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない要素の随意的包含（すなわち、包含されていても包含されていなくてもよい）を示す。
本発明の組成物の「有効量」は、後続チャレンジ中に、微生物、例えばストレプトコッカス・ニューモニエの感染性の可能性または重症度を有意に低下させる抗体を誘導するのに必要な用量を意味する。
本明細書中で用いる「肺炎球菌疾患の予防に適応となる」なる句は、肺炎球菌疾患全般、肺炎球菌肺炎、肺炎球菌髄膜炎、肺炎球菌性菌血症、ストレプトコッカス・ニューモニエにより引き起こされる侵襲性疾患およびストレプトコッカス・ニューモニエにより引き起こされる中耳炎（これらに限定されるものではない）を含むストレプトコッカス・ニューモニエの任意の血清型により引き起こされる１以上の疾患の予防に関して、ワクチンまたは免疫原性組成物が米国食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のような１以上の規制当局により承認されることを意味する。
「多価肺炎球菌ワクチン」は、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型により引き起こされる疾患または病態に対する能動免疫をもたらす複数の活性物質（例えば、肺炎球菌莢膜多糖または肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲート）を含む医薬製剤である。
「多糖」なる語は、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ糖」、「リポオリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコシラート」、「複合糖質」など（これらに限定されるものではない）を含む、免疫学および細菌ワクチン技術で一般に使用される任意の抗原性糖要素（または抗原単位）を含むと意図される。
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物の文脈における「非アジュバント化（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）」なる語は、ＰＣＶ８、ＰＣＶ１５、ＰＣＶ２２、ＰＣＶ２３およびＰＣＶ２４（これらに限定されるものではない）を含む肺炎球菌多糖組成物であって、アジュバントを含有しない組成物を意味する。
「ＰＣＶ８」は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖（ＰｎＰ）血清型－８、－１０Ａ、－１２Ｆ、－１５Ａ、－１５Ｃ、－２３Ｂ、－２４Ｆおよび－３５Ｂを含有する免疫原性組成物を意味する。
「ＰＣＶ１５」は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖（ＰｎＰ）血清型－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－９Ｖ、－１４、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｆおよび－３３Ｆを含有する免疫原性組成物を意味する。
「ＰＣＶ２２」は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖（ＰｎＰ）血清型－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－９Ｖ、－１０Ａ、－１２Ｆ、－１４、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆ、－３３Ｆおよび－３５Ｂを含有する免疫原性組成物を意味する。
「ＰＣＶ２３」は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖（ＰｎＰ）血清型－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－８、－９Ｖ、－１０Ａ、－１２Ｆ、－１４、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆ、－３３Ｆおよび－３５Ｂを含有する免疫原性組成物を意味する。
「ＰＣＶ２４」は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖（ＰｎＰ）血清型－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－８、－９Ｖ、－１０Ａ、－１１Ａ、－１２Ｆ、－１４、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆ、－３３Ｆおよび－３５Ｂを含有する免疫組成物を意味する。
「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」および同様の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含有する６～５０ヌクレオチド長のヌクレオチド分子を意味する。例えば、Ｗａｎｇら，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４２９７を参照されたい。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドには、任意の合成ヌクレオシド間結合、修飾塩基および／または修飾糖を用いた修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。
本明細書中で定義される「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与された場合に弱免疫原性である（例えば、抗体価または細胞性免疫応答を全く又は弱くしか誘導しない）抗原に対する免疫応答を増強し、抗原に対する抗体価を増加させ、および／または個体における免疫応答を達成するのに有効な抗原の用量を減少させうる。したがって、アジュバントは、免疫応答を増強するためにしばしば投与され、当業者によく知られている。
「患者」（あるいは、本明細書においては「対象」とも称される）は、ストレプトコッカス・ニューモニエに感染しうる哺乳動物を意味する。好ましい実施形態においては、患者はヒトである。患者は予防的または治療的に治療されうる。予防的治療は、肺炎球菌疾患またはその影響、例えば肺炎球菌肺炎の可能性または重症度を低下させるのに十分な防御免疫をもたらす。ストレプトコッカス・ニューモニエ感染またはその臨床効果の重症度を低減し、または再発を予防するために、治療的治療が行われうる。予防的治療は、本明細書に記載されているとおり、本発明の多価免疫原性組成物を使用して行われうる。本発明の組成物は、一般集団、または肺炎球菌感染の高リスク者、例えば高齢者または高齢者と同居している若しくは高齢者の世話をしている者に投与されうる。
「治療を要する」者には、以前にストレプトコッカス・ニューモニエに曝露または感染した者、以前にストレプトコッカス・ニューモニエに対してワクチン接種された者、易感染者、または感染可能性の低減が望ましい任意の者、例えば免疫不全者、高齢者、小児、成人または健常個体が含まれる。
「安定」多価免疫原性組成物は、冷蔵温度（例えば、２～８℃または４℃）で少なくとも少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間および／または２４カ月間、有意な変化が観察されない組成物である。また、「安定」組成物は、２５℃および３７℃を含む温度で、１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間および／または２４ヶ月間を含む期間にわたって所望の特徴を示すものを含む。安定性に関する典型的な許容基準は以下のとおりである：以下のうちの１以上において約５％、約１０％、約１５％または約２０％以下の変動：（ａ）組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの数平均分子量（Ｍｎ）、（ｂ）組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの重量平均分子量（Ｍｗ）、（ｃ）組成物における総多糖濃度、（ｄ）特定の励起波長、例えば２８０ナノメートルで固有タンパク質蛍光分光法を用いて測定された、組成物における最大発光、および（ｅ）特定の励起波長で固有タンパク質蛍光分光法を用いて測定された、組成物における蛍光強度。「安定」なる語は、多価免疫原性組成物内の個々の肺炎球菌コンジュゲートに関しても用いられうる。そのような使用において、この用語は、特定の温度において経時的に所望の特性を示すコンジュゲートを指し、そのような特性は、示されている時間にわたって及び示されている温度において約５％、約１０％、約１５％または約２０％以下しか変動しない。
ＩＩ．多価免疫原性組成物
本発明は、複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む。本発明の多価免疫原性組成物の種々の態様および実施形態を以下に記載する。
１つの実施形態（実施形態Ｅ１）においては、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖をそれぞれが含む複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は、ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ、またはｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ、またはｉｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂを含み、またはそれらからなり、またはそれらから実質的になる。実施形態Ｅ１の下位実施形態においては、免疫原性組成物は他のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含まない。
本明細書中で用いる脱Ｏ－アセチル化血清型１５Ｂ（ＤｅＯＡｃ１５Ｂ）肺炎球菌多糖は血清型１５Ｃ肺炎球菌多糖と実質的に同等であり、実質的に同一のＮＭＲスペクトルを有する（データ非表示）。本明細書中で用いる脱Ｏ－アセチル化血清型１５Ｂ肺炎球菌多糖および血清型１５Ｃ肺炎球菌多糖はそれぞれ、反復単位当たり０～５％の範囲または０～４％の範囲または０～３％の範囲または０～２％の範囲または０～１％の範囲または０～０．５％の範囲または０～０．１％の範囲または０％のＯ－アセチル含有量を有する。Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｂ．Ｌ．らの報告によると、肺炎球菌多糖１５Ｃは僅かにＯ－アセチル化されている可能性がある（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃ．Ｉｍｍｕｎｏ．（２０１７）２４（８）：１－１３）。したがって、本明細書における多価免疫原性組成物の実施形態のいずれにおいても、血清型１５Ｃの代わりに脱Ｏアセチル化血清型１５Ｂ（ＤｅＯＡｃ１５Ｂ）が使用されうる。脱Ｏ－アセチル化方法は、例えば、Ｒａｊａｍら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，１４（９）：１２２３－１２２７に記載されているとおり、当技術分野で公知である。
実施形態Ｅ１およびその任意の下位実施形態を含む、本発明の多価免疫原性組成物のいずれかの特定の実施形態においては、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。
交差反応性
１つの実施形態においては、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型６Ｃを含むストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型６Ｃはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型６Ａおよび６Ｂに対する交差反応性をもたらす。
１つの実施形態においては、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型６Ａを含むストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型６Ａはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型６Ｂおよび／または６Ｃに対する交差防御をもたらす。
１つの実施形態においては、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型６Ｂを含むストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型６Ｂはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型６Ａおよび／または６Ｃに対する交差防御をもたらす。
１つの実施形態においては、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型１５Ｃを含むストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１５Ｃはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１５Ｂに対する交差防御をもたらす。
１つの実施形態においては、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型１５Ｂを含むストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１５Ｂはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１５Ｃに対する交差防御をもたらす。
担体タンパク質
本発明の特定の実施形態においては、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を使用する。ＣＲＭ１９７は、以下のアミノ酸配列を有するジフテリア毒素の無毒性変異体（すなわち、トキソイド）である：
Figure 2022515098000002
１つの実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸および酵母エキスベース培地内で増殖したコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。もう１つの実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載されている方法に従い組換え的に製造される。典型的には、ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せにより精製される。幾つかの実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、シュードモナス・フルオレセンス（シュードモナス・フルオレッセンス）において製造される。
他の適切な担体タンパク質には、追加的な不活性化（不活化）細菌毒素、例えばＤＴ（ジフテリアトキソイド）またはＤＴの断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、ＷＯ ２００４／０８３２５１に記載されているもの）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａが含まれる。細菌外膜タンパク質、例えば外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；ＷＯ ０２／０９１９９８を参照されたい）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、群Ａもしくは群Ｂストレプトコッカス由来のＣ５ａペプチダーゼ、またはヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）プロテインＤ、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６－１３）、例えば何らかの様態で解毒されたｐｌｙ、例えばｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（ＷＯ ０４／０８１５１５を参照されたい）もしくはｄＰＬＹ－フォルモール（ｆｏｒｍｏｌ）、ＰｈｔＸ、例えばＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥおよびＰｈｔタンパク質の融合物、例えばＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物（ＷＯ ０１／９８３３４およびＷＯ ０３／５４００７を参照されたい）も使用されうる。他のタンパク質、例えばオボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来）、ＰＤ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ；例えばＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂを参照されたい）、またはその免疫学的に機能的な同等物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１およびＥＰ０４２７３４７を参照されたい）、熱ショックタンパク質（ＷＯ ９３／１７７１２およびＷＯ９４／０３２０８を参照されたい）、百日咳タンパク質（ＷＯ ９８／５８６６８およびＥＰ０４７１１７７を参照されたい）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ ９１／０１１４６を参照されたい）、種々の病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら，２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６－３８２４を参照されたい）、例えばＮ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４－７を参照されたい）、鉄取り込みタンパク質（ＷＯ ０１／７２３３７を参照されたい）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ ００／６１７６１を参照されたい）、およびフラゲリン（Ｂｅｎ－Ｙｅｄｉｄｉａら，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９を参照されたい）も担体タンパク質として使用されうる。
他のＤＴ突然変異体、例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら，１９７３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８－３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ，Ｆｒａｎｋｅｌ編，Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９９２に記載されている他の突然変異を有するもの；Ｇｌｕ－１４８の欠失またはそれからＡｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒへの突然変異および／またはＡｌａ １５８からＧｌｙへの突然変異およびＵ．Ｓ．４，７０９，０１７またはＵ．Ｓ．４，９５０，７４０に開示されている他の突然変異を有するもの；Ｌｙｓ ５１６、Ｌｙｓ ５２６、Ｐｈｅ ５３０および／またはＬｙｓ ５３４の少なくとも１以上の残基の突然変異およびＵ．Ｓ．５，９１７，０１７号または米国特許第６，４５５，６７３５号に開示されている他の突然変異を有するもの；またはＵ．Ｓ．５，８４３，７１１に開示されている断片も、担体タンパク質として使用されうる。そのようなＤＴ突然変異体は、エピトープ領域を含有するＢ断片を含むＤＴＦＢ変異体を製造するためにも使用されうる。
特定の実施形態においては、担体タンパク質は、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、プロテインＤ（タンパク質Ｄ）およびＣＲＭ１９７からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態においては、多価免疫原性組成物内の多糖タンパク質コンジュゲートの１以上に、第２担体が使用されうる。第２担体タンパク質は、好ましくは、無毒性かつ無反応性であり、十分な量および純度で入手可能なタンパク質である。第２担体タンパク質も、抗原の免疫原性を増強するために高ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖にコンジュゲート化または結合される。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲート化法に適合しているべきである。１つの実施形態においては、第１担体タンパク質にコンジュゲート化されていない各莢膜多糖は、同じ第２担体タンパク質にコンジュゲート化されている（例えば、各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲート化されている）。もう１つの実施形態においては、第１担体タンパク質にコンジュゲート化されていない莢膜多糖は２以上の担体タンパク質にコンジュゲート化されている（各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲート化されている）。そのような実施形態においては、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には、同じ担体タンパク質にコンジュゲート化されている。
実施形態Ｅ１およびその任意の下位実施形態を含む本発明の実施形態においては、多糖血清型の１以上（適用可能な場合には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上を含む）がＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されている。実施形態Ｅ１およびその任意の下位実施形態を含む本発明の他の実施形態においては、多糖血清型のそれぞれがＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されている。
本発明の多糖－タンパク質コンジュゲートの製剤化（処方）は、当技術分野で認められている方法を使用して達成されうる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組成物を製造するために生理的に許容されるビヒクルを使用して製剤化されうる。そのようなビヒクルの例には、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されるものではない。
好ましい実施形態においては、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含有するＬ－ヒスチジンバッファー中で製剤化される。
本発明の幾つかの実施形態においては、多価免疫原性組成物は、担体タンパク質およびアジュバントにコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含む複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型は本明細書に記載されているとおりである。組成物の有効性を増強するための適切なアジュバントには、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）水中油型エマルジョン製剤［他の特定の免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（後記に定義されている）または細菌細胞壁成分を含有する又は含有しない］、例えば、（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子内に製剤化された、５％ スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ（トゥイーン）８０および０．５％ Ｓｐａｎ（スパン）８５（所望により、種々の量のＭＴＰ－ＰＥを含有していてもよい）を含有するＭＦ５９（国際特許出願公開番号ＷＯ ９０／１４８３７）、（ｂ）サブミクロンエマルジョンへとマイクロフルイダイズされた、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成させるためにボルテックスされた、１０％ スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％ プルロニックブロック化ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）Ｒｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）であって、以下のものを含有するもの：２％ スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ８０、および以下のものからなる群からの１以上の細菌細胞壁成分：米国特許第４，９１２，０９４５号に記載されている３－Ｏ－脱アシル化モノリン脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））、ならびに（ｄ）モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ；
（３）サポニンアジュバント、例えばＱｕｉｌ（クイル）ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号を参照されたい）、またはそれから生成された粒子、例えばＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質および両親媒性タンパク質の組合せから形成される免疫刺激複合体）およびＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（タンパク質を含有しないこと以外はＩＳＣＯＭと実質的に同じ構造を有する）が使用されうる；
（４）細菌性リポ多糖、合成リピドＡ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスファート化合物（ＡＧＰ）またはその誘導体もしくは類似体（これらはＣｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；１つのそのようなＡＧＰは２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル ２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－β－Ｄ－グルコピラノシド［これは５２９（以前はＲＣ５２９として公知であった）としても公知であり、水性形態または安定エマルジョンとして製剤化される］である；
（５）合成ポリヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（６）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２など；ならびに
（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体。
もう１つの実施形態においては、アジュバントは、前記アジュバントの２個、３個またはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３－脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１をも含有する水中油型エマルジョン）である。
ムラミルペプチドには、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’、２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ）－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態においては、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントはミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンでありうる。アルミニウム塩アジュバントは当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ならびにＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９－４９３）に記載されている。アルミニウム塩には、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、スーパーホス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）、アンホゲル（Ａｍｐｈｏｇｅｌ）、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）、アモルファスアルミナ、三水和アルミナまたはトリヒドロキシアルミニウムが含まれるが、これらに限定されるものではない。
ＡＰＡはヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の体積比で混合してヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることにより製造される。混合プロセスの後、物質を高せん断ミキサーでサイズ減少させて、単分散粒子サイズ分布を得る。ついで、生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。１つの実施形態においては、アルミニウム塩の用量は１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００または７００μｇ、あるいは１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇまたはそれ以上である。更にもう１つの実施形態においては、前記のミョウバン塩の用量は組換えタンパク質１μｇ当たりである。
特定の実施形態においては、水酸化アルミニウム１ｍｇ当たりタンパク質５０～２００μｇの比でタンパク質を吸着させるために、商業的に入手可能なＡｌ（ＯＨ）３［例えば、Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹのアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）またはスーパーホス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）］を使用する。もう１つの実施形態においては、タンパク質の吸着はタンパク質のｐＩ（等電点ｐＨ）および培地のｐＨに左右される。より低いｐＩを有するタンパク質は、より高いｐＩを有するタンパク質より強く、正荷電アルミニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は、２～３週間にわたってゆっくりと放出される抗原のデポを形成し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、ならびに／または自然免疫機構を刺激しうる（これは、おそらく、尿酸の刺激によるものであろう）。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔら，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照されたい。
一価バルク水性コンジュゲートを、典型的には、一緒に混合し、６Ｂ（これは目標濃度８μｇ／ｍＬに希釈されうる）を除く全ての血清型に関して目標濃度４μｇ／ｍＬに希釈する。希釈したら、バッチを濾過滅菌し、等体積のリン酸アルミニウムアジュバントを無菌的に添加して、２５０μｇ／ｍＬの最終アルミニウム濃度を目標にする。アジュバント化され製剤化されたバッチを、使い捨ての０．５ｍＬ／用量バイアル内に充填する。
特定の実施形態においては、アジュバントはＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えばＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特にＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。もう１つの実施形態においては、アジュバントはＯＤＮ １８２６であり、これはＣｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｏｒｐから入手可能である。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｕｒら，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４－９３；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９－５８；およびＹａｓｕｄａら，２００６，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：８９－１１０に記載されている。
代替的な実施形態においては、免疫原性組成物は、本明細書、例えば実施形態Ｅ１またはその任意の下位実施形態において記載されている複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、アジュバントを含まない。
製剤
本発明の多価免疫原性組成物は単回投与用バイアル、複数回投与用バイアルまたは予充填ガラスもしくはプラスチックシリンジとして製剤化されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物は経口投与され、したがって、経口投与に適した形態で、すなわち、固体または液体製剤として製剤化される。固体経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが含まれる。液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液（エマルジョン）、油などが含まれる。
液体製剤用の薬学的に許容される担体は水性または非水性の溶液、懸濁液、乳濁液または油である。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。水性担体には、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。油の例としては、動物、植物または合成由来のものが挙げられ、例えばピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、他の魚油、またはミルクもしくは卵由来の脂質が挙げられる。
本発明の多価免疫原性組成物は等張性、低張性または高張性でありうる。しかし、注入または注射用の組成物は投与時に実質的に等張性であることがしばしば好ましい。したがって、貯蔵用には、組成物は、好ましくは、等張性または高張性でありうる。組成物が貯蔵用に高張性である場合、それは投与前に等張液となるように希釈されうる。
等張化剤は、イオン性等張化剤、例えば塩、または非イオン性等張化剤、例えば炭水化物ありうる。イオン性等張化剤の例には、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２が含まれるが、これらに限定されるものではない。非イオン性等張化剤の例には、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤がバッファーであることも好ましい。幾つかの目的のにおいては、例えば、医薬組成物が注入または注射を意図したものである場合、該組成物は、４～１０の範囲のｐＨ、例えば５～９のｐＨ、例えば６～８のｐＨに溶液を緩衝化しうるバッファーを含むことがしばしば望ましい。
バッファーは、例えば、ＴＲＩＳ、アセタート、グルタマート、ラクタート、マレアート、タルトラート、ホスファート、シトラート、カルボナート、グリシナート、ヒスチジン、グリシン、スクシナートおよびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択されうる。
バッファーは、特に医薬製剤が非経口用である場合、非経口用のＵＳＰ適合性バッファーから選択されうる。例えば、バッファーは、一塩基酸、例えば酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸；二塩基酸、例えばアコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸；多塩基酸、例えばクエン酸およびリン酸；ならびに塩基、例えばアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびＴＲＩＳからなる群から選択されうる。
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内または筋肉内注射用）には、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液および不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えば、リンゲルデキストロースに基づくものなどが含まれる。例示としては、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加の存在下または非存在下の例えば水および油のような無菌液が挙げられる。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール、ポリソルベート８０（ＰＳ－８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ－２０）およびポロキサマー１８８（Ｐ１８８）が、特に注射可能溶液の場合に、好ましい液体担体である。油の例としては、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、他の魚油、またはミルクもしくは卵由来の脂質が挙げられる。
本発明の製剤は界面活性剤を含みうる。好ましい界面活性剤には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ポロキサマー－１８８（Ｐ１８８；プルロニック；Ｆ６８ ＮＦ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎ（トゥイーン）と称される）、特にＰＳ－２０およびＰＳ－８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール［これは、反復エトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数において様々でありうるが、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に特に関心が持たれる］；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシラート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知である）、例えばソルビタントリオレアート（スパン８５）およびソルビタンモノラウラート。エマルジョン中に配合するための好ましい界面活性剤はＰＳ－８０である。
界面活性剤の混合物、例えばＰＳ－８０／スパン８５混合物が使用されうる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＰＳ－８０）と、オクトキシノール、例えばｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ－１００）との組合せも好適である。もう１つの有用な組合せは、ラウレス９に加えて、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
界面活性剤の好ましい量（重量％）は以下のとおりである：０．０１～１％、特に約０．１％のポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ＰＳ－８０）；０．００１～０．１％、特に０．００５～０．０２％のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおける他の界面活性剤）；０．１～２０％、好ましくは０．１～１０％、特に０．１～１％または約０．５％のポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）。
特定の実施形態においては、組成物は、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）の存在下、ヒスチジン（２０ｍＭ）、生理食塩水（１５０ｍＭ）および０．２％ ＰＳ－２０（ｐＨ５．８）から実質的になる。ＰＳ－２０は０．００５％～０．３％（ｗ／ｖ）の範囲でありうる。もう１つの実施形態においては、ＰＳ－２０は０．０２５％～０．８％（ｗ／ｖ）の範囲でありうる。もう１つの実施形態においては、ＰＳ－２０は０．０５％～０．８％（ｗ／ｖ）の範囲でありうる。もう１つの実施形態においては、ＰＳ－２０は０．０５％～０．２％（ｗ／ｖ）の範囲でありうる。該方法は、ヒスチジン、生理食塩水およびＰＳ－２０中で最大２４個の血清型の混合物（ブレンド）を一緒にし、ついでこの混合物質を、抗微生物保存剤の存在下または非存在下、ＡＰＡおよび生理食塩水と一緒にすることからなる。
特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物はストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲート、そして更に、２０～８０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．８）および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートにおけるストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は、本明細書に記載されている血清型の組合せのいずれかを含む。幾つかの実施形態においては、多価免疫原性組成物は０．２％～０．８％ ｗ／ｖ ポリソルベート２０を更に含む。
多価免疫原性組成物ＰＣＶ２４は、非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖（ＰｎＰ）血清型－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－８、－９Ｖ、－１０Ａ、－１１Ａ、－１２Ｆ、－１４、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆ、－３３Ｆおよび－３５ＢにＣＲＭ１９７タンパク質を個々にコンジュゲート化することにより製造され、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）中、各多糖血清型４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬ（総多糖濃度はそれぞれ９６μｇ／ｍＬまたは１９２μｇ／ｍＬ）で製剤化され、「ＰＣＶ２４ ｕｎａｄｊ」と称される。もう１つの特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物ＰＣＶ２４は、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）中、更にリン酸アルミニウムアジュバントの形態の［Ａｌ］２５０μｇ／ｍＬを含有させて、各多糖血清型４μｇ／ｍＬ（総多糖濃度は９６μｇ／ｍＬ）で製造される。これは「ＰＣＶ２４／ＡＰＡ」と称される。
界面活性剤の選択は、種々の医薬品および薬物に合わせて最適化されることを要しうる。１５個以上の血清型を含有する多価ワクチンの場合、ＰＳ－２０およびＰ１８８が好ましい。コンジュゲートを製造するために用いられる化学法の選択も製剤の安定化において重要な役割を果たしうる。特に、多価組成物中の種々の多糖タンパク質コンジュゲートを製造するために用いられるコンジュゲート化反応が水性溶媒とＤＭＳＯ溶媒との両方を含む場合、個々の界面活性剤系は安定性における有意差をもたらす。多糖タンパク質コンジュゲートの安定性の改善が、ポリソルベート２０のみ、またはポロキサマー１８８とポリオールとの組合せで認められた。
特定の界面活性剤が生物療法物質をどのようにして保護するのかの厳密なメカニズムは十分には理解されておらず、事前に予測することができない。可能な安定化メカニズムには、優先的水和、優先的排除、生物療法物質と表面との間の気／液界面競合、表面張力、および／または凝集のシード（ｓｅｅｄ）として働く疎水性パッチをマスクするための界面活性剤と生物療法物質との直接的結合が含まれる。
ポロキサマーも本発明の組成物において使用されうる。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）としても公知である。ポリマーブロックの長さはカスタマイズ可能であるため、わずかに異なる特性を有する多数の異なるポロキサマーが存在する。一般的な用語「ポロキサマー」の場合、これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）およびそれに続く３桁の数字として命名され、ここで、最初の２桁の数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量を示し、最後の桁の数字×１０はポリオキシエチレン含有量の百分率を示す（例えば、Ｐ４０７は４，０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子量および７０％のポリオキシエチレン含有量のポロキサマーである）。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）商品名の場合、これらの共重合体の記号は、室温でのその物理的形状を定める文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、２桁または３桁の数字が続く。数字表示部分における最初の桁（３桁数字の場合には２桁）×３００は該疎水性物質のおおよその分子量を示し、最後の桁×１０はポリオキシエチレン含有量の百分率を示す（例えば、Ｌ６１は、１，８００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子量および１０％のポリオキシエチレン含有量を有するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）である）。米国特許第３，７４０，４２１号を参照されたい。
ポロキサマーの具体例は一般式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有し、ここで、ａブロックおよびｂブロックは以下の値を有する。
Figure 2022515098000003
好ましくは、ポロキサマーは、一般に、１，１００～１７，４００Ｄａ、７，５００～１５，０００Ｄａまたは７，５００～１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ポロキサマーはポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７から選択されうる。製剤中のポロキサマーの最終濃度は０．００１％～５％（重量／体積）または０．０２５％～１％（重量／体積）である。特定の態様においては、ポリオールはプロピレングリコールであり、最終濃度は１％～２０％（重量／体積）である。特定の態様においては、ポリオールはポリエチレングリコール４００であり、最終濃度は１％～２０％（重量／体積）である。
本発明の製剤のための適切なポリオールは重合性ポリオール、特にポリエーテルジオール、例えばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（これらに限定されるものではない）である。プロピレングリコールは約４２５～約２，７００の単量体分子量の範囲のものが入手可能である。ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルは約２００～約３５，０００の範囲の分子量範囲のもの、例えばＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ６００、ＰＥＧ ＭＭＥ ２０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ３３５０およびＰＥＧ ＭＭＥ４０００（これらに限定されるものではない）が入手可能である。好ましいポリエチレングリコールはポリエチレングリコール４００である。本発明の製剤におけるポリオールの最終濃度は１％～２０％（重量／体積）または６％～２０％（重量／体積）でありうる。
製剤はｐＨ緩衝食塩水をも含有する。バッファーは、例えば、ＴＲＩＳ、アセタート、グルタマート、ラクタート、マレアート、タルトラート、ホスファート、シトラート、カルボナート、グリシナート、ヒスチジン、グリシン、スクシナート、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択されうる。バッファーは４～１０、５．２～７．５または５．８～７．０の範囲のｐＨに溶液を緩衝化しうる。本発明の特定の態様においては、バッファーは、ホスファート、スクシナート、ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、アセタートまたはシトラートからなる群から選択される。バッファーは更に、例えば、特に医薬製剤が非経口用である場合には、非経口用のＵＳＰ適合性バッファーから選択されうる。１つの実施形態においては、バッファーの濃度は１ｍＭ～１００ｍＭの範囲である。もう１つの実施形態においては、バッファーの濃度は１０ｍＭ～８０ｍＭの範囲である。もう１つの実施形態においては、バッファーの濃度は１ｍＭ～５０ｍＭまたは５ｍＭ～５０ｍＭの範囲である。特定の態様においては、バッファーは５ｍＭ～５０ｍＭの最終濃度のヒスチジンまたは１ｍＭ～１０ｍＭの最終濃度のスクシナートである。特定の態様においては、ヒスチジンバッファーは２０ｍＭ±２ｍＭの最終濃度である。
食塩水（例えば、ＮａＣｌを含有する溶液）が好ましいが、製剤化に適した他の塩には、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２ならびにそれらの組合せ（これらに限定されるものではない）が含まれる。塩の代わりに、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロール（これらに限定されるものではない）を含む非イオン性等張化剤が使用されうる。適切な塩濃度範囲には、２０ｍＭ～５００ｍＭまたは４０ｍＭ～１７０ｍＭが含まれるが、これらに限定されるものではない。１つの態様においては、食塩水はＮａＣｌであり、所望により、２５ｍＭ～１７０ｍＭの濃度で存在しうる。
好ましい実施形態においては、製剤は、塩化ナトリウムを含有するＬ－ヒスチジンバッファーを含む。
もう１つの実施形態においては、医薬組成物はコントロールリリース（制御放出）システムで送達される。例えば、物質は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を用いて投与されうる。もう１つの実施形態においては、例えばミクロスフェアまたはインプラントにおいて、高分子材料が使用される。
組成物の各用量におけるコンジュゲートの量は、有意な有害作用を伴うことなく免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は肺炎球菌血清型に応じて変動しうる。一般に、多糖に基づくコンジュゲートの場合、各用量は０．０８～１００μｇの各多糖を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、各多糖コンジュゲートの用量は０．０８～１０μｇである。他の実施形態においては、各コンジュゲートの用量は１～５μｇ、０．４～４μｇ、０．４～３μｇ、０．４～２μｇまたは０．４～１μｇである。幾つかの実施形態においては、１以上の多糖コンジュゲートの用量は１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００もしくは７５０ｎｇ、または０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇである。
本発明の組成物の幾つかの実施形態においては、多糖コンジュゲートの全ては、同じ量で組成物中に存在する。他の実施形態においては、多糖コンジュゲートは、異なる量で組成物中に存在する（すなわち、少なくとも１つの多糖コンジュゲートは、組成物のその他の多糖コンジュゲートの１以上とは異なる量で存在する）。
個々の免疫原性組成物の成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究により確認されうる。例えば、もう１つの実施形態においては、ヒトワクチン接種の投与量は動物研究からヒトデータへの外挿により決定される。もう１つの実施形態においては、投与量は経験的に決定される。
本発明の組成物はストレプトコッカス・ニューモニエ由来の１以上のタンパク質を含みうる。配合に適したストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質の例には、国際特許出願公開番号ＷＯ ０２／０８３８５５およびＷＯ ０２／０５３７６１において特定されているものが含まれる。
特定の実施形態においては、本発明の組成物は、当業者に公知の１以上の方法により、例えば非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内に、対象に投与され、それに応じて製剤化される。１つの実施形態においては、本発明の組成物は液体製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射または呼吸器内粘膜注射により投与される。注射用の液体製剤には、溶液などが含まれる。
ＩＩＩ．製造方法
ストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な技術により製造されうる。例えば、多糖は細菌から単離可能であり、公知方法により（例えば、欧州特許番号ＥＰ４９７５２４およびＥＰ４９７５２５を参照されたい）、好ましくは、ホモジナイザーを使用して達成されるマイクロフルイダイゼーションにより、または化学的加水分解により、ある程度サイジングされうる。１つの実施形態においては、各ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖血清型を、ダイズに基づく培地内で増殖させる。ついで個々の多糖を、遠心分離、沈殿および限外濾過を含む標準的な工程で精製する。例えば、米国特許出願公開番号２００８／０２８６８３８および米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。多糖サンプルの粘度を低減するために、および／またはコンジュゲート化産物の濾過性を改善するために、機械的または化学的サイジングのような技術を用いて、多糖をサイジングすることが可能である。化学的加水分解は、酢酸を使用して行われうる。機械的サイジングは、高圧均質化せん断を用いて行われうる。
精製された多糖を化学的に活性化して、担体タンパク質と反応しうる多糖を得ることが可能である。精製された多糖はリンカーに連結されうる。各莢膜多糖は、活性化され又はリンカーに連結されたら、タンパク質に個々にコンジュゲート化されて糖コンジュゲート（複合糖質）を形成する。多糖コンジュゲートは、公知のカップリング技術により製造されうる。
多糖はリンカーにカップリング（結合）されて、リンカーの遊離末端がエステル基である多糖－リンカー中間体を形成しうる。したがって、リンカーは、少なくとも１つの末端がエステル基であるリンカーである。他方の末端は、それが多糖と反応して多糖－リンカー中間体を形成しうるように選択される。
多糖は、多糖における第一級アミン基を使用してリンカーにカップリングされうる。この場合、リンカーは、典型的には、両方の末端にエステル基を有する。これは、エステル基の１つを多糖の第一級アミン基と求核アシル置換により反応させることにより、カップリングが生じることを可能にする。該反応は、多糖がアミド結合を介してリンカーにカップリングされた多糖－リンカー中間体を生成する。したがって、該リンカーは、多糖の第一級アミン基と反応するための第１エステル基と、担体分子の第一級アミン基と反応するための第２エステル基とを提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーはアジピン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。
カップリングは間接的に行われることも可能であり、すなわち、リンカーへのカップリングの前に多糖を誘導体化するために使用される追加的リンカーを使用して行われうる。
多糖は、多糖の還元末端におけるカルボニル基を使用して、追加的リンカーにカップリングされる。このカップリングは、以下の２つの工程、すなわち、（ａ１）カルボニル基を追加的リンカーと反応させる工程、および（ａ２）追加的リンカーの遊離末端をリンカーと反応させる工程を含む。これらの実施形態においては、追加的リンカーは、典型的には、両方の末端に第一級アミン基を有し、それにより、第一級アミン基の１つを多糖のカルボニル基と還元的アミノ化により反応させることにより工程（ａ１）を行うことを可能にする。多糖のカルボニル基と反応性である第一級アミン基が使用される。ヒドラジドまたはヒドロキシルアミノ基が好適である。同じ第一級アミン基が、典型的には、追加的リンカーの両方の末端に存在する。該反応は、多糖がＣ－Ｎ結合を介して追加的リンカーにカップリングされた多糖－追加的リンカー中間体を生成する。
多糖は、多糖における異なる基、特にカルボキシル基を使用して、追加的リンカーにカップリングされうる。このカップリングは、以下の２つの工程、すなわち、（ａ１）該基を追加的リンカーと反応させる工程、および（ａ２）追加的リンカーの遊離末端をリンカーと反応させる工程を含む。この場合、追加的リンカーは、典型的には、両方の末端に第一級アミン基を有し、それにより、第一級アミン基の１つを多糖のカルボキシル基とＥＤＡＣ活性化により反応させることにより工程（ａ１）を行うことを可能にする。多糖のＥＤＡＣ活性化カルボキシル基と反応性である第一級アミン基が使用される。ヒドラジド基が好適である。同じ第一級アミン基が、典型的には、追加的リンカーの両方の末端に存在する。該反応は、多糖がアミド結合を介して追加的リンカーにカップリングされた多糖－追加的リンカー中間体を生成する。
１つの実施形態においては、多糖の化学的活性化、およびそれに続く、還元的アミノ化による担体タンパク質へのコンジュゲート化は、米国特許第４，３６５，１７０号，第４，６７３，５７４号および第４，９０２，５０６号、米国特許出願公開番号２００６／０２２８３８０、２００７／１８４０７２、２００７／０２３１３４０および２００７／０１８４０７１、ならびにＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３およびＷＯ２００８／１４３７０９に記載されている手段により達成されうる。該化学法は、末端ヒドロキシル基をアルデヒドへと酸化する任意の酸化剤、例えばペルヨーダート（過ヨウ素酸塩）（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸を含む）との反応による肺炎球菌多糖の活性化を含みうる。該反応は、反応性アルデヒド基の形成と共に、カルボヒドラートの隣接ヒドロキシル基のランダムな酸化的切断をもたらす。
担体タンパク質へのカップリングは、タンパク質のリシル基への直接的アミノ化による還元的アミノ化によるものである。例えば、コンジュゲート化は、活性化多糖と担体タンパク質との混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤と反応させることにより行われうる。コンジュゲート化反応は水溶液またはＤＭＳＯの存在下で生じるうる。例えば、ＵＳ２０１５／０２３１２７０、ＵＳ２０１１／０１９５０８６およびＥＰ ０４７１ １７７ Ｂ１を参照されたい。ついで未反応アルデヒドを水素化ホウ素ナトリウムのような強力な還元剤の添加によりキャップ化（ｃａｐ）する。
還元的アミノ化は、以下の２つの工程、すなわち、（１）多糖を酸化して反応性アルデヒドを形成させる工程、（２）活性化多糖と担体タンパク質との間で形成されたイミン（シッフ塩基）を還元して安定なアミンコンジュゲート結合を形成させる工程を含む。酸化前に、多糖は、所望により、サイズ縮小されうる。機械的方法（例えば、均質化）または化学的加水分解が用いられうる。化学的加水分解は、酢酸を使用して行われうる。酸化工程はペルヨーダートとの反応を含みうる。本発明の目的においては、「ペルヨーダート」なる語は過ヨウ素酸塩（ペルヨーダート）および過ヨウ素酸の両方を含む。この用語はまた、メタペルヨーダート（ＩＯ４－）およびオルトペルヨーダート（ＩＯ６－）の両方を含み、ペルヨーダートの種々の塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）を含む。１つの実施形態においては、莢膜多糖は、メタペルヨーダートの存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化される。もう１つの実施形態においては、莢膜多糖は、オルトペルヨーダートの存在下、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化される。
１つの実施形態においては、酸化剤は、第一級ヒドロキシルを選択的に酸化する酸化剤の存在下の、安定なニトロキシルまたはニトロオキシドラジカル化合物、例えばピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物（ＷＯ ２０１４／０９７０９９に記載されている）である。前記反応においては、実際の酸化剤は触媒サイクルにおけるＮ－オキソアンモニウム塩である。１つの態様においては、前記の安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物はピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物である。１つの態様においては、前記の安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物はＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を含有する。１つの態様においては、前記の安定なニトロキシルラジカル化合物はＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。１つの態様においては、前記酸化剤は、Ｎ－ハロ部分を含有する分子である。１つの態様においては、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシアヌル酸および１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオンからなる群から選択される。好ましくは、前記酸化剤はＮ－クロロスクシンイミドである。
特定の態様においては、酸化剤は２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルおよび共酸化剤としてのＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である（ＷＯ ２０１４／０９７０９９に記載されている）。したがって、１つの態様においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ由来の複合糖質は、ａ）糖を水性溶媒中で２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて活性化糖を得、ｂ）活性化糖を、１以上のアミン基を含む担体タンパク質と反応させる工程を含む方法（以下、該方法は「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化」と称される）により入手可能である。
所望により、酸化反応はクエンチ化剤の添加によりクエンチされる。クエンチ化剤は、隣接ジオール、１，２－アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、スルフィト、ビスルファート、ジチオニト、メタビスルフィト、チオスルファート、ホスフィト、ヒポホスフィトまたは亜リン酸（例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，２－ジオールまたはブタン－２，３－ジオール、アスコルビン酸）から選択されうる。
特定の実施形態においては、本発明は、非プロトン性溶媒中でのコンジュゲート化反応を利用する、血清型８ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖－タンパク質コンジュゲートの製造方法を提供し、ここで、コンジュゲート化反応はシアノボロヒドリドを使用しない。他の実施形態においては、コンジュゲート化反応はシッフ塩基還元または還元的アミノ化である。他の実施形態においては、タンパク質は破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ１９７である。更に他の実施形態においては、タンパク質はＣＲＭ１９７である。他の実施形態においては、コンジュゲート化反応は還元的アミノ化である。他の実施形態においては、還元的アミノ化はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行われる。
幾つかの実施形態においては、コンジュゲート化前の酸化多糖は３０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。分子量は、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）および屈折率検出器（ＲＩ）と組合されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により計算されうる。幾つかの実施形態においては、多糖は５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態においては、多糖は５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。追加的な実施形態においては、多糖は７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、多糖は１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、多糖は２００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、多糖は１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ～９００ｋＤａ、１００ｋＤａ～８００ｋＤａ、１００ｋＤａ～７００ｋＤａ、１００ｋＤａ～６００ｋＤａ、１００ｋＤａ～５００ｋＤａ、１００ｋＤａ～４００ｋＤａ、１００ｋＤａ～３００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～９００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ、１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ、２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ～９００ｋＤａ、２００ｋＤａ～８００ｋＤａ、２００ｋＤａ～７００ｋＤａ、２００ｋＤａ～６００ｋＤａ、２００ｋＤａ～５００ｋＤａ、２００ｋＤａ～４００ｋＤａ、２００ｋＤａ～３００、２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ、２５０ｋＤａ～８００ｋＤａ、２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ、２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ、２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ、２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ、３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、３００ｋＤａ～９００ｋＤａ、３００ｋＤａ～８００ｋＤａ、３００ｋＤａ～７００ｋＤａ、３００ｋＤａ～６００ｋＤａ、３００ｋＤａ～５００ｋＤａ、３００ｋＤａ～４００ｋＤａ、４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、４００ｋＤａ～９００ｋＤａ、４００ｋＤａ～８００ｋＤａ、４００ｋＤａ～７００ｋＤａ、４００ｋＤａ～６００ｋＤａ、または５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。
コンジュゲート化方法の第２工程は、還元剤を使用して、活性化多糖と担体タンパク質との間のイミン（シッフ塩基）結合を還元して、安定なコンジュゲート結合を形成させること（いわゆる還元的アミノ化）である。適切な還元剤には、シアノボロヒドリド（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムなど）が含まれる。１つの実施形態においては、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
特定の実施形態においては、還元的アミノ化反応は非プロトン性溶媒（または非プロトン性溶媒の混合物）中で行われる。１つの実施形態においては、還元反応はＤＭＳＯまたはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。活性化多糖および担体タンパク質が凍結乾燥されている場合には、それらを再構成させるために、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒が使用されうる。１つの実施形態においては、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。
還元反応の終了時に、コンジュゲート内に未反応アルデヒド基が残存している可能性があり、これは、適切なキャップ化剤を使用してキャップ化されうる。１つの実施形態においては、このキャップ化剤は水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。適切な代替物には、ブロンステッドまたはルイス酸の存在下のナトリウムもしくは亜鉛ボロヒドリドまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、アミンボラン、例えばピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ’ＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）またはボロヒドリド交換樹脂が含まれる。コンジュゲート化（還元反応、および所望により行われうるキャップ化）の後、複合糖質は、当業者に公知の種々の技術により精製されうる（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮されうる）。これらの技術には、透析、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、接線流濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）およびデプス濾過が含まれる。１つの実施形態においては、複合糖質はダイアフィルトレーションまたはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。
非プロトン性溶媒中で還元的アミノ化を用いて製造された複合糖質は多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおいて一般に使用される。したがって、全ての血清型が非プロトン性溶媒中で製造されるわけではない多価組成物に関する特定の実施形態においては、残りの血清型のための還元反応は水性溶媒［例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ビス－トリス、ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸））、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－プロパンスルホン酸）またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）（ｐＨ６．０～８．５、７．０～８．０または７．０～７．５）］中で行われる。
非プロトン性溶媒中で還元的アミノ化を用いて製造されうるストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートには、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂが含まれるが、これらに限定されるものではない。多糖はオリゴ糖の形態で使用されうる。これらは精製多糖の断片化（例えば、加水分解によるもの）によって簡便に形成され、ついで、通常、所望のサイズの断片の精製が行われる。
特定の実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂの１以上の肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートは、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて製造される。特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物におけるコンジュゲートのそれぞれは、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて製造される。特定の実施形態においては、本発明の多価組成物における１以上の血清型の多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート化され、１以上の血清型の多糖は、水性溶媒中での還元的アミノ化を用いてコンジュゲート化される。特定の実施形態においては、本発明の多価組成物における２以上の血清型の多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート化される。他の実施形態においては、本発明の多価組成物における３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上または２４個以上の血清型が、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート化される。特定の実施形態においては、本発明の多価組成物における１以上の血清型由来の多糖は、非プロトン性溶媒または水性溶媒に存在しうる他の化学的性質を用いて担体タンパク質にコンジュゲート化される。
したがって、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖をそれぞれが含む複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物に関するものであり、ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は本明細書（すなわち、第ＩＩ節における「多価免疫原性組成物」）に記載されているとおりであり、ここで、１以上の多糖タンパク質コンジュゲートのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖を担体タンパク質にコンジュゲート化するコンジュゲート化反応は非プロトン性溶媒中で行われる。特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物における肺炎球菌血清型の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は非プロトン性溶媒中でコンジュゲート化される。残りの血清型は、代替的化学法を用いて、および／または水性溶媒中でコンジュゲート化される。
多糖－タンパク質コンジュゲートの還元的アミノ化中の溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、それらの血清型に関して、水性条件下で製造された同じコンジュゲートと比較して予想外に優れた安定性および免疫原性の増強をもたらすことが判明した（米国特許出願番号６２／４６３，２１６および６２／５５５，４４４を参照されたい）。
本発明の特定の実施形態においては、組成物における総多糖濃度は約０．０２～約０．２８８ｍｇ／ｍＬである。本発明の特定の実施形態においては、組成物における総多糖濃度は約０．０３～約０．１９２ｍｇ／ｍＬである。本発明の特定の実施形態においては、組成物における総多糖濃度は約０．０４～約０．１９２ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態においては、組成物における総多糖濃度は約０．０６５～約０．０９６ｍｇ／ｍＬ、約０．０７０～約０．０８０ｍｇ／ｍＬ、約０．０６５～約０．０８０ｍｇ／ｍＬ、約０．０７０～約０．０８５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１２８ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１７５ｍｇ／ｍＬ、約０．１０～約０．１７５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１１５～約０．１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１２５ｍｇ／ｍＬ、約０．１５０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１５０～約０．１６５ｍｇ／ｍＬ、約０．１４０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１３０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１５０～約０．１７５ｍｇ／ｍＬ、約０．０７０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．０６５～約０．１７５ｍｇ／ｍＬ、または約０．０６５～約０．１８０ｍｇ／ｍＬである。
多価免疫原性組成物における多糖－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で製造される本発明の実施形態においては、組成物における総多糖濃度は３７℃で４週間以上、２５℃で４週間以上または４℃で１２週間以上安定である。
多価免疫原性組成物における多糖－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で製造される本発明の特定の実施形態においては、組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの全ての平均分子量（Ｍｗ）（組成物における全コンジュゲートの平均）は約２，０００～約６，５００ｋＤａ、約２，５００～約６，０００ｋＤａ、約３，０００～約５，５００ｋＤａ、約３，５００～約５，０００ｋＤａ、約３，５００～約４，５００ｋＤａ、約３，５００～約４，７００ｋＤａ、約３，５００～約４，６００ｋＤａ、約３，５００～約４，５００ｋＤａ、約３，５００～約４，４００ｋＤａ、約３，５００～約４，３００ｋＤａ、約３，５００～約４，２００ｋＤａ、約３，６００～約４，７００ｋＤａ、約３，６００～約４，６００ｋＤａ、約３，６００～約４，５００ｋＤａ、約３，６００～約４，４００ｋＤａ、約３，６００～約４，３００ｋＤａ、約３，６００～約４，２００ｋＤａ、約３，７００～約４，７００ｋＤａ、約３，７００～約４，６００ｋＤａ、約３，７００～約４，５００ｋＤａ、約３，７００～約４，４００ｋＤａ、約３，７００～約４，３００ｋＤａ、約３，７００～約４，２００ｋＤａ、約３，８００～約４，７００ｋＤａ、約３，８００～約４，６００ｋＤａ、約３，８００～約４，５００ｋＤａ、約３，８００～約４，４００ｋＤａ、約３，８００～約４，３００ｋＤａ、約３，８００～約４，２００ｋＤａ、約３，９００～約４，７００ｋＤａ、約３，９００～約４，６００ｋＤａ、約３，９００～約４，５００ｋＤａ、約３，９００～約４，４００ｋＤａ、約３，９００～約４，３００ｋＤａ、または約３，９００～約４，２００ｋＤａである。
多価免疫原性組成物における多糖－タンパク質コンジュゲートが非プロトン性溶媒中で製造される本発明の特定の実施形態においては、（単一血清型に関する）組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれのＭｗは約１，０００～約１０，０００ｋＤａ、約１５００～約５，５００ｋＤａ、約１５００～約５，６００ｋＤａ、約１５００～約５，７００ｋＤａ、約１５００～約５，８００ｋＤａ、約１５００～約５，９００ｋＤａ、約１５００～約６０００ｋＤａ、約１，０００～約５，５００ｋＤａ、約１，０００～約５，０００ｋＤａ、約１，０００～約４，０００ｋＤａ、約１，０００～約４，５００ｋＤａ、約１，０００～約４，０００ｋＤａ、または約１，０００～約３，５００ｋＤａである。他の実施形態においては、組成物における単一血清型からのコンジュゲートのＭｗは約１，０００ｋＤａ、約１，１００ｋＤａ、約１２００ｋＤａ、約１，３００ｋＤａ、約１，４００ｋＤａ、約１，５００ｋＤａ、約１，６００ｋＤａ、約１，７００ｋＤａ、１，８００ｋＤａ、約１，９００ｋＤａ、約２，０００ｋＤａ、約２，１００ｋＤａ、約２，２００ｋＤａ、約２，３００ｋＤａ、約２，４００ｋＤａ、約２，５００ｋＤａ、約２，６００ｋＤａ、約２，７００ｋＤａ、約２，８００ｋＤａ、約２，９００ｋＤａ、約３，０００ｋＤａ、約３，１００ｋＤａ、約３，２００ｋＤａ、約３，３００ｋＤａ、約３，４００ｋＤａ、約３，５００ｋＤａ、約３，６００ｋＤａ、約３，７００ｋＤａ、約３，８００ｋＤａ、約３，９００ｋＤａ、約４，０００ｋＤａ、約４，１００ｋＤａ、約４，２００ｋＤａ、約４，３００ｋＤａ、約４，４００ｋＤａ、約４，５００ｋＤａ、約４，６００ｋＤａ、約４，７００ｋＤａ、約４，８００ｋＤａ、約４，９００ｋＤａ、約５，０００ｋＤａ、約５，１００ｋＤａ、約５，２００ｋＤａ、約５，３００ｋＤａ、約５，４００ｋＤａまたは約５，５００ｋＤａである。
本発明の特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物における多糖－タンパク質コンジュゲートは非プロトン性溶媒中で製造される。特定の実施形態においては、非プロトン性溶媒中で製造されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型特異的コンジュゲートの割合（非プロトン性溶媒中で製造された多糖血清型の数を多糖血清型の総数で割り算することにより計算されたもの；ここで、総数は、非プロトン性溶媒またはプロトン性溶媒中で製造されたものを含む）は５０％超（すなわち、５０％を超える）または６０％超または７０％超または８０％超または９０％超または１００％でありうる。
本発明の特定の実施形態においては、組成物における血清型３多糖－タンパク質コンジュゲートは非プロトン性溶媒中で製造され、該コンジュゲートのＭｗは約１，０００～約５，０００ｋＤａ、または約１，０００～約４０００ｋＤａ、または１，０００～約３，０００ｋＤａ、または約１，０００～約２，５００ｋＤａ、または約１，０００～約２，０００ｋＤａである。
多価免疫原性組成物における多糖－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で製造される本発明の特定の実施形態においては、組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの数平均分子量（Ｍｎ）（組成における全コンジュゲートの平均）は約９００～約３，０００ｋＤａ、約１，０００～約３，０００ｋＤａ、約１，０００～約２，５００ｋＤａ、約１，５００～約２，５００ｋＤａ、約１，８００～約２，５００ｋＤａ、約１，９００～約２，５００ｋＤａ、または約２，０００～約２，５００ｋＤａである。
多価免疫原性組成物における多糖－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で製造される本発明の特定の実施形態においては、組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれのＭｎ（単一血清型に関するもの）は約７００～約７，０００ｋＤａ、約１，０００～約６，０００ｋＤａ、約１，０００～約５，０００ｋＤａ、約１，０００～約４，０００ｋＤａ、約１，０００～約３，０００ｋＤａ、約９００～約５，５００ｋＤａ、約９００～約５，０００ｋＤａ、約９００～約４，５００ｋＤａ、約９００～約４，０００ｋＤａ、約９００～約３，５００ｋＤａ、または約９００～約３，０００ｋＤａである。
本発明の実施形態においては、組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートのＭｗおよび／またはＭｎは３７℃で４週間以上、２５℃で４週間以上および／または４℃で１２週間以上安定である。
本発明の実施形態においては、多糖濃度、Ｍｗおよび／またはＭｎは、ＨＰＳＥＣ ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩを用いて決定される。
多価免疫原性組成物における多糖－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で製造される本発明の幾つかの実施形態においては、２８０ナノメートル（ｎｍ）の励起波長で内部タンパク質蛍光分光法を用いて測定された組成物の最大発光は約３３５ｎｍ～約３４２ｎｍである。幾つかの実施形態においては、最大発光は約３３５ｎｍ～約３４２ｎｍのままであり、蛍光強度は３７℃で少なくとも１週間安定である。幾つかの実施形態においては、最大発光は約３３５ｎｍ～約３４２ｎｍのままであり、蛍光強度は３７℃で１週間安定である。
幾つかの実施形態においては、多価組成物における肺炎球菌多糖コンジュゲートの全ては、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化を用いて製造される。特定の下位実施形態においては、ＤＭＳＯを使用して全てが製造された多糖コンジュゲートを含む多価組成物はアジュバントを含まない。
いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、ＤＭＳＯ中で製造された複合糖質で観察される免疫原性の増強に関する１つの可能なメカニズムは炭水化物（莢膜多糖）と担体タンパク質の表面上のリジン残基との間の結合の数の増加を含み、これは、該タンパク質と多糖との間の追加的な結合点をもたらして、安定性を付与し、ペプチド炭水化物結合の化学的解重合または分解に対抗するであろう。例えば、Ｈｓｉｅｈ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ＣＲＭ１９７ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ｆ，Ｃｏｒｂｅｌ Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｅ（編）：Ｐｈｙｓｉｃｏ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，２０００，ｖｏｌ １０３，ｐｐ．９３－１０４を参照されたい。ＤＭＳＯ溶媒中のコンジュゲート化中に生成される多糖－タンパク質結合の増加の追加的な利点はＴ細胞へのペプチド－炭水化物の提示の成功のための追加的な機会であろう。ＤＭＳＯ溶媒中のコンジュゲート化により観察される免疫原性の増強の可能なメカニズムは有機溶媒中のＣＲＭ１９７の変性によるものであろう。これは多糖結合のための追加的なリジンを露出させて、種々のペプチドエピトープに対するＴ細胞依存性応答のためのＡＰＣ表面における糖ペプチド提示の可能性を増大させる。Ａｖｃｉら，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７：１６０２－１６１０を参照されたい。
コンジュゲートにおいて変性ＣＲＭ１９７を生成する、有機溶媒中のコンジュゲート化の更にもう１つの利点は、天然ＣＲＭ１９７エピトープに対する抗体の免疫学的干渉の低減であろう。ＤＭＳＯ溶媒中のコンジュゲート化中に生成される多糖－タンパク質結合の増加のもう１つの利点は、免疫原性の増強をもたらす、より大きなサイズの多糖タンパク質コンジュゲートの形成であろう。本発明の組成物は、ヒトでの応答の誘導において重要な利点をもたらすと考えられている。
特定の実施形態においては、コンジュゲート化反応は還元的アミノ化により行われ、この場合、より大きなコンジュゲート化反応効率のために、および遊離シアニドの除去を促進させるために、ニッケルが使用される。遷移金属はシアニドとの安定錯体を形成することが公知であり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるタンパク質アミノ基およびホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが公知である（Ｓ Ｇｉｄｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８２，２０３：３３１－３３４；Ｊｅｎｔｏｆｔら Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０，１０６：１８６－１９０）。ニッケルの添加は、残留抑制性シアニドを錯化することにより、コンジュゲート化中のタンパク質の消費を増加させ、より大きな、潜在的に、より免疫原性のコンジュゲートの形成をもたらす。
シアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロットにおける初期シアニドレベルの差異もコンジュゲート化性能の非一貫性をもたらして、コンジュゲートサイズおよびコンジュゲートＰｓ対ＣＲＭ１９７比のような産物特性の変動をもたらす。ニッケルの添加は、シアニドを錯化してシアノ水素化ホウ素ナトリウムのロットにおける差異を排除することにより、コンジュゲート化の非一貫性を低減した。
適切な代替的化学法は１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）での糖の活性化によるシアナートエステルの形成を含む。したがって、活性化された糖は、直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介して、担体タンパク質上のアミノ基にカップリングされうる。例えば、スペーサーは、マレイミド活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］またはＮ－スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを使用）との反応の後で得られるチオエーテル結合により担体にカップリングされうるチオール化多糖を得るためのシスタミンまたはシステアミンでありうる。好ましくは、シアナートエステル（所望により、ＣＤＡＰ化学法により調製されうる）はヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）にカップリングされ、アミノ誘導体化糖は、カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学法を用いて、タンパク質担体上のカルボキシル基を介して担体タンパク質にコンジュゲート化される。そのようなコンジュゲートは国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１５７６０、ＷＯ ９５／０８３４８およびＷＯ ９６／２９０９４、ならびにＣｈｕら，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５－２５６に記載されている。
他の適切なコンジュゲート化技術はカルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボルナン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。多数が国際特許出願公開番号ＷＯ ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲート化は、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応により形成されうるカルボニルリンカー（Ｂｅｔｈｅｌｌら，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２－４；Ｈｅａｒｎら，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９－１８を参照されたい）を含むことが可能であり、ついでこれはタンパク質と反応してカルバマート結合を形成する。これは第一級ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、所望により実施してもよい第一級ヒドロキシル基の保護／脱保護、第一級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバマート中間体の形成、およびタンパク質上のアミノ基へのＣＤＩカルバマート中間体のカップリングを含みうる。
莢膜多糖を担体タンパク質にコンジュゲート化した後、多糖－タンパク質コンジュゲートを１以上の種々の技術により精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮する）。これらの技術の例は当業者によく知られており、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィーおよびデプス濾過を含む。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号を参照されたい。
個々の複合糖質を精製した後、それらを配合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。これらの肺炎球菌コンジュゲートは別々の方法により製造可能であり、単一剤形にバルク製剤化されうる。
本発明の複合糖質を特徴づけるための代替的方法は、糖にコンジュゲート化される担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）におけるリジン残基の数によるものであり、これはコンジュゲート化リジンの範囲（コンジュゲート化の度合）として特徴づけられうる。多糖への共有結合による担体タンパク質のリジン修飾の証拠は、当業者に公知の常套的方法を用いるアミノ酸分析により得られうる。コンジュゲート化は、コンジュゲート物質の生成に使用される担体タンパク質出発物質と比較して、回収されるリジン残基の数の減少をもたらす。好ましい実施形態においては、本発明の複合糖質のリジン消費により測定されるコンジュゲート化の度合は２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５、または１０～１２である。１つの実施形態においては、本発明の複合糖質のコンジュゲート化の度合は約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。もう１つの実施形態においては、本発明の複合糖質のコンジュゲート化の度合は４～７である。幾つかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明の組成物の複合糖質は多糖対担体タンパク質（Ｐｓ：Ｐｒ）の比（重量／重量）によっても特徴づけられうる。幾つかの実施形態においては、組成物における複合糖質の多糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は０．５～３．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９または約３．０）である。他の実施形態においては、多糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は０．５～２．５、０．５～１．５、０．８～２．５、０．５～１．０、１．０～１．５、１．０～２．０、０．８～２．４、０．８～２．３、０．８～２．２、０．８～２．１、０．８～２．０、０．８～１．９、０．８～１．８、０．８～１．７、０．８～１．６、０．８～１．５、０．８～１．４、０．８～１．３、０．９～２．４、０．９～２．３、０．９～２．２、０．９～２．１、０．９～２．０、０．９～１．９、０．９～１．８、０．９～１．７、０．９～１．６、０．９～１．５、０．９～１．４、０．９～１．３、０．９～１．２、１．０～２．４、１．０～２．３、１．０～２．２、１．０～２．１、１．０～２．０、１．０～１．９、１．０～１．８、１．０～１．７、１．０～１．６、１．０～１．５、１．０～１．４、１．０～１．３または１．０～１．２である。他の実施形態においては、糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は０．８～１．２である。幾つかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。担体タンパク質に共有結合（共有結合コンジュゲート化）していないが、それでも複合糖質組成物に存在する遊離糖を本発明の複合糖質および免疫原性組成物は含有しうる。遊離糖は複合糖質に非共有結合的に会合していてもよい（例えば、複合糖質に非共有結合的に結合していても、吸着されていても、その内部に又はそれにより取り込まれていてもよい）。
特定の実施形態においては、血清型１５Ａコンジュゲートの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．０～約２．０、約１．２５～約１．７５または約１．３～約１．７である。他の実施形態においては、血清型１５Ａの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７または１．８である。
特定の実施形態においては、血清型１５Ｃコンジュゲートの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．０～約２．０、約１．２５～約１．７５または約１．３～約１．７である。他の実施形態においては、血清型１５Ｃの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７または１．８である。
特定の実施形態においては、血清型３３Ｆコンジュゲートの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．０～約２．０、約１．２５～約１．７５または約１．３～約１．７である。他の実施形態においては、血清型３３Ｆの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７または１．８である。
特定の実施形態においては、血清型３５Ｂコンジュゲートの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．２５～約２．２５、約１．２５～約２．０または約１．３～約１．８である。他の実施形態においては、血清型３５Ｂの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０である。
特定の実施形態においては、血清型２４Ｆコンジュゲートの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約０．５～約１．５、約０．７５～約１．２５または約０．８～約１．０である。他の実施形態においては、血清型２４Ｆの糖対担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０である。
好ましい実施形態においては、複合糖質組成物は、多糖の総量と比較して、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態においては、複合糖質組成物は、多糖の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態においては、複合糖質組成物は、多糖の総量と比較して、約２０％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態においては、複合糖質組成物は、多糖の総量と比較して、約１５％未満の遊離多糖を含む。
ＩＶ．使用方法
本発明の実施形態はまた、（ｉ）（ａ）治療（例えば、人体の治療）、（ｂ）医薬、（ｃ）ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染の抑制、（ｄ）ストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫応答または防御免疫応答の誘導、（ｅ）ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染の予防、（ｆ）ストレプトコッカス・ニューモニエ感染の再発の予防、（ｇ）脳損傷、難聴および発作を含む関連合併症の予防を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染に関連する病的症状の進行、発症または重症度の低減、（ｈ）ストレプトコッカス・ニューモニエ感染の可能性の低減、または、（ｉ）肺炎球菌肺炎、肺炎球菌細菌血症、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎および副鼻腔炎を含む肺炎球菌疾患の治療、予防または発症、重症化もしくは進行の遅延における使用のための、（ｉｉ）それらのための医薬または組成物としての使用のための、または（ｉｉｉ）それらのための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載されている多価免疫原性組成物の１以上を含む。これらの使用においては、本発明の多価肺炎球菌多糖－コンジュゲート組成物は、所望により、１以上のアジュバントと組合せて、またはアジュバント無しで使用されうる。
したがって、本発明は、治療を要する患者に本発明の多価免疫原性肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲート組成物の１以上を投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染または肺炎球菌疾患（すなわち、それに対する防御）の予防的治療方法を提供する。
本発明の組成物および製剤は、そのような組成物または製剤を全身または粘膜経路により投与することにより、感染、例えば肺炎球菌感染に感受性であるヒトを防御または治療するために使用されうる。
１つの実施形態においては、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物の免疫学的有効量を患者に投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。もう１つの実施形態においては、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物の免疫学的有効量をヒトに投与する工程を含む、肺炎球菌感染に対してヒトにワクチン接種する方法を提供する。
したがって、１つの態様においては、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物（すなわち、本明細書に記載されている任意の多価免疫原性組成物、例えば、前記の「多価免疫原性組成物」と題された第ＩＩ節に記載されている多価免疫原性組成物）を患者に投与することを含む（１）ヒト患者において免疫応答を誘導する、（２）ヒト患者において防御免疫応答を誘導する、（３）ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染に対してヒト患者にワクチン接種する、または（４）ヒト患者におけるストレプトコッカス・ニューモニエ感染の可能性を低減するための方法を提供する。
１つの実施形態においては、本発明は乳児（１歳未満）、幼児（約１２～２４月齢）または小児（約２～５歳）における肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
もう１つの実施形態においては、本発明は６週齢～１７歳の患者における肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
もう１つの実施形態においては、本発明は６月齢～１７歳の患者における肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
もう１つの実施形態においては、本発明は１８歳以上の成人における肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
もう１つの実施形態においては、本発明は５０歳以上の成人における肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
もう１つの実施形態においては、本発明は６５歳以上の成人における肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
もう１つの実施形態においては、本発明は、以下のストレプトコッカス・ニューモニエ株、すなわち、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂの１以上により引き起こされる肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
前記方法の１つの実施形態においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂまたは血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂを含む。前記方法のもう１つの実施形態においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂまたは血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる。前記方法の１つの実施形態においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂまたは血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂを含む。前記方法のもう１つの実施形態においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂまたは血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる。前記方法の１つの実施形態においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂを含む。前記方法のもう１つの実施形態においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂまたは血清型を含む。
血清型６Ａ多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンは血清型６Ｃに対して幾らかの交差防御をもたらしうることが示されている（Ｃｏｏｐｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（２０１１）７２０７－７２１１）。したがって、前記方法の幾つかの実施形態においては、本発明はまた、血清型６Ｃ多糖コンジュゲートを含まないが、代わりに血清型６Ａ多糖コンジュゲートまたは血清型６Ａおよび６Ｂ多糖コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態においては、免疫原性組成物は血清型６Ａ、６Ｂおよび６Ｃの肺炎球菌多糖コンジュゲートを含む。
前記方法の特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物は、以下のものからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートを含む：
ａ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｂ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｃ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｄ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｅ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｆ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｇ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｈ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｊ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｋ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｌ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｍ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｎ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｏ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｐ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｑ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｒ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｓ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｔ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｕ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｖ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｗ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｘ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｙ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
ｚ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；ならびに
ａａ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ。
前記方法の他の実施形態においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型：ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；またはｉｖ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂを含む。
血清型１０Ａ多糖を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンは血清型３９に対する幾らかの交差防御をもたらしうることも示されている（ＷＯ ２０１７／０８５５８６を参照されたい）。したがって、前記方法の幾つかの実施形態においては、本発明はまた、血清型１０Ａ多糖コンジュゲートを含まないが、代わりに血清型３９多糖コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態においては、免疫原性組成物は血清型１０Ａおよび３９の肺炎球菌多糖コンジュゲートを含む。前記方法の特定の実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は、以下のものからなる群から選択される血清型の群を含む：
ｂｂ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｃｃ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｄｄ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｅｅ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｆｆ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｇｇ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｈｈ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｊｊ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｋｋ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｌｌ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｍｍ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｎｎ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｏｏ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｐｐ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｑｑ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｒｒ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｓｓ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｔｔ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｕｕ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｖｖ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｗｗ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｘｘ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｙｙ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ｚｚ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
ａａａ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；ならびに
ｂｂｂ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９。
担体タンパク質に共有結合したストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートは血清型１５Ｃおよび／または血清型１５Ａに対する幾らかの交差防御をもたらしうることも示されている（ＷＯ ２０１５／１１０９４２を参照されたい）。したがって、前記方法の幾つかの実施形態においては、本発明はまた、血清型１５Ｃ（または脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ）多糖コンジュゲートを含まないが、代わりに血清型１５Ｂ多糖コンジュゲートを含む（すなわち、血清型１５Ｂ多糖は実質的に脱Ｏ－アセチル化されていない）多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態においては、免疫原性組成物は血清型１５Ｂおよび１５Ｃ（または脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ）の肺炎球菌多糖コンジュゲートを含む。
本発明の組成物は、以前に多価肺炎球菌ワクチンを接種された患者においてストレプトコッカス・ニューモニエに対する補完的防御を付与するための方法において有用である。この使用においては、本発明の組成物は、患者が以前にワクチン接種されていない特定のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に対する防御をもたらすことが可能であり、患者が以前にワクチン接種されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に対する追加的な防御をもたらすことが可能であり、あるいは、患者が以前にワクチン接種されていないストレプトコッカス・ニューモニエ血清型と、患者が以前にワクチン接種されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の両方に対する防御をもたらすことが可能である。
したがって、本発明は、多価免疫原性組成物を患者に投与することを含む、患者においてストレプトコッカス・ニューモニエに対して免疫応答を誘導する、またはワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法を提供し、該組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、患者は以前にストレプトコッカス・ニューモニエに対してワクチン接種されている。本発明のこの態様の実施形態においては、多価免疫原性組成物は、本明細書に記載されている任意の多価免疫原性組成物でありうる。本発明の方法の特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物は、多価肺炎球菌ワクチンで以前に治療された患者に投与される。多価免疫原性ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型により引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる任意のワクチンでありうる。
前記方法の特定の実施形態においては、患者は、
ｉ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｉｉ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆおよび１９Ａ；
ｉｉｉ．１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｉｖ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ；
ｖ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０；ならびに
ｖｉ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆおよび１５Ｂ
からなる群から選択される血清型の群内の１以上のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型により引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる多価肺炎球菌ワクチンで以前に治療されていた。
前記方法の特定の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは複数の多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む。他の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲート化されていない複数の肺炎球菌莢膜多糖を含む。
前記方法の追加的な実施形態においては、患者はＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３［肺炎球菌１３価コンジュゲートワクチン（ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質），Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ］で以前に治療されていた。
前記方法の他の実施形態においては、患者は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３［肺炎球菌ワクチン多価（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｏｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ），Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ］で以前に治療されていた。
前記方法の更にもう１つの実施形態においては、患者はＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）［肺炎球菌多糖コンジュゲートワクチン（吸着），ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｓ．ａ．，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ］で以前に治療されていた。
前記方法の実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物は、医療専門家、例えば医師により提供される治療レジメンに従い、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けた後の任意の時点で患者に投与される。特定の実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物は、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けてから約１ヶ月～約５年後に患者に投与され、あるいは、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けてから１ヶ月～１年、１ヶ月～２年、１ヶ月～３年、１ヶ月～４年、１ヶ月～６ヶ月、２ヶ月～６ヶ月、２ヶ月～１年、１年～５年、６ヶ月～５年、６ヶ月～４年、６ヶ月～３年、６ヶ月～２年、６ヶ月～１年、１年～４年、１年～３年、または１年～２年後に患者に投与される。他の実施形態においては、多価免疫原性組成物は、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けてから約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１．２５年、約１．５年、約１．７５年、約２年、約２．２５年、約２．５年、約２．７５年、約３年、約３．２５年、約３．５年、約３．７５年、約４年、約４．２５年、約４．５年、約４．７５年または約５年後に患者に投与される。
他の実施形態においては、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与することと、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与することとを、任意の順序で含む、（１）ヒト患者において免疫応答を誘導する、（２）ヒト患者において防御免疫応答を誘導する、（３）ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染に対してヒト患者にワクチン接種する、または（４）ヒト患者においてストレプトコッカス・ニューモニエ感染の可能性を低減するための方法を提供する。例えば、最初に多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与し、ついで本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与する。あるいは、最初に本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与し、ついで多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与する。多価肺炎球菌ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型により引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる任意のワクチンでありうる。
前記方法の特定の実施形態においては、患者は、本発明の多価免疫原性組成物と、
ｉ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｉｉ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆおよび１９Ａ；
ｉｉｉ．１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｉｖ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ；
ｖ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０；ならびに
ｖｉ．４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆおよび１５Ｂ
からなる群から選択される血清型の群の１以上のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型により引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる多価肺炎球菌ワクチンとで治療される。
前記方法の特定の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａの莢膜多糖を含む。
前記方法の特定の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは複数の多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む。他の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲート化されていない複数のストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖を含む。
前記方法の追加的な実施形態においては、患者は、本発明の多価免疫原性組成物での治療、およびＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３［肺炎球菌１３価コンジュゲートワクチン（ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質），Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ］での治療を、任意の順序で受ける。１つの実施形態においては、最初にＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３を患者に投与し、ついで本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与し、ついでＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３を患者に投与する。
前記方法の他の実施形態においては、患者は、本発明の多価免疫原性組成物での治療、およびＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３［肺炎球菌ワクチン多価（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｏｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ），Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ］での治療を、任意の順序で受ける。１つの実施形態においては、最初にＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３を患者に投与し、ついで本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与し、ついでＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３を患者に投与する。
前記方法の更にもう１つの実施形態においては、患者は、本発明の多価免疫原性組成物での治療、およびＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）［肺炎球菌多糖コンジュゲートワクチン（吸着），ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｓ．ａ．，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ］での治療を、任意の順序で受ける。１つの実施形態においては、最初にＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）を患者に投与し、ついで本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与し、ついでＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）を患者に投与する。
前記方法の幾つかの実施形態においては、多価免疫原性組成物および多価肺炎球菌ワクチンを共投与する。本明細書中で用いる「共投与」は２つの組成物の同時投与には限定されず、任意の順序で次々に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、多価免疫原性組成物および多価肺炎球菌ワクチンを筋肉内または皮下投与により、別々の解剖学的部位、例えば２つの異なる腕に投与する。
前記方法の幾つかの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の投与と多価肺炎球菌ワクチンの投与との間の時間の長さは約４週～約１年である。代替的実施形態においては、期間は約１ヶ月～約５年である。
１つの実施形態においては、最初に多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与し、ついで本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与し、ついで多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与する。
また、
（１）本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与すること、
（２）所定時間が経過するのを待つこと、および
（３）多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与すること
を含む、患者においてストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫応答を誘導する、またはワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法も提供する。この方法においては、多価免疫原性組成物は、本明細書に記載されているストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの任意の組合せを含むことが可能であり、多価肺炎球菌ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型により引き起こされる疾患の予防に適応となる任意のワクチンでありうる。
また、本発明は、
（１）多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与すること、
（２）所定時間が経過するのを待つこと、および
（３）本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与すること
を含む、患者においてストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫応答を誘導する、またはワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法を提供する。
この方法においては、多価免疫原性組成物は、本明細書に記載されているストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの任意の組合せを含むことが可能であり、多価肺炎球菌ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型により引き起こされる疾患の予防に適応となる任意のワクチンでありうる。
前記方法の幾つかの実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含む。代替的実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲート化されていないストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖を含む。
本発明の方法の任意の実施形態（すなわち、本明細書に記載されている方法のいずれか）においては、該方法は、本発明の多価免疫原性組成物の、１以上の追加用量を患者に投与することを更に含みうる。そのような方法においては、患者は、前記の本発明の多価免疫原性組成物の初回用量の投与を受ける前に多価肺炎球菌ワクチンの投与を既に受けていることが可能であり、あるいは、本発明の多価免疫原性組成物の投与を受ける前に、ストレプトコッカス・ニューモニエに対してワクチン接種されていないことが可能である。したがって、１つの実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエにより引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けた患者に本発明の多価免疫原性組成物の２以上の用量を投与する。代替的実施形態においては、肺炎球菌疾患の予防に適応となるいずれのワクチンによっても以前に治療されていない患者に本発明の多価免疫原性組成物の２以上の用量を投与する。
前記方法の実施形態においては、２以上の用量は本発明の同じ多価免疫原性組成物のものである。代替的実施形態においては、２以上の用量は本発明の異なる多価免疫原性組成物のものである。
これらの方法のいずれかの特定の実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の２、３または４用量を患者に投与する。特定の実施形態においては、患者は（例えば、幹細胞移植後の免疫抑制レジメンにより）免疫無防備状態である。
幾つかの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の各用量の投与の間の時間の長さは約４週～約１年である。代替的実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の各用量の投与の間の時間の長さは約１ヶ月～約５年である。
本発明の方法のいずれかの実施形態においては、本発明の組成物で治療される患者はヒトである。特定の実施形態においては、ヒト患者は乳児（約６週～１２ヶ月）である。特定の実施形態においては、ヒト患者は幼児（約１２～２４ヶ月）または小児（約２～５歳）である。本発明の組成物は、より年長の子供、青年および成人（例えば、１８～４５歳、１８～５０歳、１８～５５歳、１８～６０歳または１８～６５歳）における使用にも適している。本発明の方法のいずれかの他の実施形態においては、患者は約２歳～約１８歳である。本発明の方法のいずれかの他の実施形態においては、患者は１８歳以上である。
本発明の方法の他の実施形態においては、患者は乳児であり、本発明の多価免疫原性組成物の１、２または３用量を乳児に投与する。各用量の投与の間の時間の長さは変動可能であるが、投薬スケジュールの例は、２月齢で用量を投与し、ついで４月齢で用量を更に投与し、最後に６月齢で用量を最終投与することを含む。乳児における投与スケジュールのもう１つの例は、２月齢で用量を投与し、ついで３月齢で用量を更に投与する。乳児における投与スケジュールのもう１つの例は、２月齢で用量を投与し、ついで３月齢で用量を更に投与し、最後に６月齢で用量を最終投与する。他の実施形態においては、乳児患者は、乳児が幼児になった際に本発明の多価免疫原性組成物の追加的な「ブースター」用量の投与を受けうる。例えば、乳児に２月齢で投与し、ついで４月齢で用量を更に投与し、最後に６月齢で用量を最終投与し、ついで、乳児が幼児の年齢に達した際に、本発明の多価免疫原性組成物の追加的な「ブースター」用量を１１～１５月齢で投与する。
１つの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の２用量を乳児に投与する。
１つの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の３用量を乳児に投与する。
１つの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の３用量を患者に投与し、ここで、第１用量および第２用量を２～１０月齢で投与し、第３用量を１１～１５月齢で投与する。
１つの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物の４用量を患者に投与し、ここで、第１用量を２月齢で投与し、第２用量を４月齢で投与し、第３用量を６月齢で投与し、第４用量を１１～１５月齢で投与する。
本発明の方法の他の実施形態においては、ヒト患者は高齢者である。本発明の方法のいずれかの幾つかの実施形態においては、患者は５０歳以上である。本発明の方法のいずれかの幾つかの実施形態においては、患者は５５歳以上である。本発明の方法のいずれかの幾つかの実施形態においては、患者は６０歳以上である。本発明の方法のいずれかの更に他の実施形態においては、患者は６５歳以上である。本発明の方法のいずれかの追加的な実施形態においては、患者は７０歳以上である。
本発明の方法のいずれかの幾つかの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物で治療される患者は免疫無防備状態である。
本発明の方法のいずれかの幾つかの実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物はインフルエンザに対するワクチンと共に投与される。特定の実施形態においては、インフルエンザワクチンは「シニアインフルエンザワクチン」、すなわち、高齢者、例えば６５歳以上の者に適応となる高用量インフルエンザワクチンである。
本発明は、本明細書に記載されている多価免疫原性肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲート組成物のいずれかの免疫学的有効量を患者に投与する工程を含む、肺炎球菌感染に対して患者において防御免疫応答を誘導するための方法を提供する。特定のワクチン（例えば、本発明の多価免疫原性組成物）のための成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究により確認されうる。例えば、もう１つの実施形態においては、ヒトワクチン接種の投与量は動物研究からヒトデータへの外挿により決定される。もう１つの実施形態においては、投与量は経験的に決定される。
本発明の方法は、侵襲性感染症（髄膜炎、肺炎および細菌血症）および非侵襲性感染症（急性中耳炎および副鼻腔炎）の両方を含む、微生物、例えばストレプトコッカス・ニューモニエにより引き起こされる主要臨床症候群の予防および／または軽減のために使用されうる。
本発明の組成物の投与は筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射；または経口／消化管、呼吸器もしくは泌尿生殖器への粘膜投与による投与の１以上を含みうる。１つの実施形態においては、肺炎または中耳炎の治療には鼻腔内投与が用いられる（なぜなら、肺炎球菌の鼻咽頭保菌がより有効に予防可能であり、したがって、その初期段階で感染を減弱させることが可能だからである）。特定の実施形態においては、本発明の組成物は筋肉内または皮下投与により患者に投与される。
本明細書中に挙げられている全ての刊行物を、本発明に関して用いられうる方法および材料を記載し開示する目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。
添付の図面を参照して本発明の種々の実施形態が本明細書に記載されているが、本発明はそれらの厳密な実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲に定められている本発明の範囲または精神から逸脱することなく種々の変更および修飾がそれらにおいて当業者により行われうると理解されるべきである。
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖の製造
肺炎球菌の培養方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：５２を参照されたい。肺炎球菌莢膜多糖の製造方法も当技術分野で周知である。例えば、欧州特許番号ＥＰ ０ ４９７ ５２４Ｂ１を参照されたい。後記プロセスは、一般に、欧州特許番号ＥＰ ０ ４９７ ５２４ Ｂ１に記載されている方法に従い、全ての肺炎球菌血清型に一般に適用可能である。
血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂの肺炎球菌株の分離株はメルク・カルチャー・コレクション（Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。血清型２３Ｂの株は米国疾病予防管理センター（Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）およびアラバマ大学バーミンガム校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）から入手した。血清型２４Ｆの株はメルク・カルチャー・コレクション（Ｍｅｒｃｋ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）およびアラバマ大学バーミンガム校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）から入手した。必要な場合には、特異的抗血清を使用するクェルング（Ｑｕｅｌｌｕｎｇ）反応に基づいて亜型を区別した。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。得られた分離株を、ダイズペプトン、酵母エキスおよびグルコース（ヘミン非含有）を含有する動物成分非含有培地からなる寒天プレート上で２段階で連続的にプレーティングすることにより更にクローン的に単離した。血清型７Ｆの場合には、使用した寒天プレートはヘミンも含有していた。各血清型のクローン分離株を、ダイズペプトン、酵母エキス、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、グルコースおよびグリセロールを含有する動物成分非含有培地を使用して液体培養内で更に増殖させて、プレマスター細胞バンクを調製した。
肺炎球菌多糖の各血清型の製造は、細胞増殖およびバッチ生産発酵、ならびにそれに続く、下流精製前の化学的不活性化（化学的不活化）からなるものであった。各血清型からの解凍された細胞バンクバイアルを、ダイズペプトンまたはダイズペプトン限外濾過液、酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過液、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびグルコースを含有する予め滅菌された動物成分非含有増殖培地を含有する振とうフラスコまたは培養ボトルを使用して、増殖に付した。温度および攪拌を制御しながらガス交換が最小限となるように、密封振とうフラスコまたはボトル内で該細胞増殖培養物を増殖に付した。これらの血清型の細胞増殖中に、温度、ｐＨ、圧力および攪拌を制御した。スパージング（ｓｐａｒｇｉｎｇ）を用いなかったため、気流オーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）をも制御した。６００ｎｍでの光学密度による測定で、特定された培養密度が得られた後、該細胞増殖培養物の一部を、ダイズペプトンまたはダイズペプトン限外濾過液、酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過液、塩化ナトリウム、リン酸カリウムおよびグルコースを含有する予め滅菌された動物成分非含有増殖培地を含有する生産発酵槽に移した。温度、ｐＨ、圧力および攪拌を制御した。スパージングを用いなかったため、気流オーバーレイをも制御した。
グルコースがほぼ消費されたら、化学不活性化剤であるフェノールの添加によりバッチ発酵を終了させた。純粋フェノールを０．８～１．２％の最終濃度まで添加して、細胞を不活性化し、細胞壁から莢膜多糖を遊離させた。発酵槽内で、特定された時間にわたって一次不活性化を行い、この場合、温度および攪拌を制御し続ける。一次不活性化後、バッチをもう１つの容器に移し、それを、制御された温度および攪拌で、追加的な特定された時間にわたって維持して、完全な不活性化を行った。これは、微生物プレーティング技術またはフェノール濃度および特定された時間の検証のいずれかにより確認された。ついで不活性化ブロスを精製した。
実施例２
肺炎球菌多糖の精製
肺炎球菌多糖の精製プロセスは幾つかの遠心分離、デプス濾過、濃縮／ダイアフィルトレーション操作および沈殿工程からなるものであった。特に示されていない限り、全ての手順は室温で行った。
ストレプトコッカス・ニューモニエの発酵槽培養物からの不活性化ブロスをカチオン性ポリマー［例えば、ＢＰＡ－１０００、ＴＲＥＴＯＬＩＴＥ（登録商標）（Ｂａｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ８１６０、ポリ（エチレンイミン）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐＤＡＤＭＡＣ］で凝集させた。カチオン性ポリマーは不純物タンパク質、核酸、細胞破片に結合した。凝集工程および熟成期間の後、凝集固体を遠心分離および複数のデプス濾過工程により除去した。清澄化ブロスを濃縮し、１００ｋＤａ～５００ｋＤａ ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）フィルターを使用してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２バッファーおよびリン酸ナトリウムバッファーを使用して行った。ダイアフィルトレーションは残留核酸およびタンパク質を除去した。
更なる不純物の除去は、酢酸ナトリウムおよびフェノール中の多糖を変性アルコールおよび／またはイソプロパノールで再沈殿させることにより達成された。フェノール沈殿工程中に、リン酸ナトリウム生理食塩バッファー中の酢酸ナトリウムおよびフェノール（液化フェノールまたは固体フェノール）を、ダイアフィルトレーションされた保持液に充填した。ついで多糖のアルコール分画を２段階で行った。最初の段階においては、低比率のアルコールを調製物に添加して、細胞破片および他の不要な不純物を沈殿させ、一方、粗製多糖は溶液中に残存させた。不純物を遠心分離およびそれに続くデプス濾過工程により除去した。ついで、追加的なイソプロパノールまたは変性アルコールをバッチに加えることにより、多糖を溶液から回収した。沈殿した多糖ペレットを遠心分離により回収し、粉砕（トリチュレート）し、粉末として乾燥させ、－７０℃で凍結保存した。
実施例３
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型１コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、標的分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化（ホモジナイズ）して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２５０ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で１５時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）における発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を１０％ ｗ／ｖ スクロース濃度で２．５ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。１．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ透析カセットを使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０に対して約４℃で３日間、バッチを透析した。
最終濾過および生成物貯蔵
バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２５０ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で１５時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を緩衝化多糖溶液と０．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ６．９ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を１２０時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。ポリソルベート２０を０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度まで保持液バッチに加え、バッチを０．２ミクロンで濾過した。
０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ ７．０）中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例５
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究のための血清型１コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２５０ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で１５時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を緩衝化多糖溶液と０．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ６．９ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を１２０時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。ポリソルベート２０を０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度まで保持液バッチに加え、バッチを０．２ミクロンで濾過した。
０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ ７．０）中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例６
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型３コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を８１０ｂａｒ／６回通過、ついで９００ｂａｒ／３回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で１２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を１０％ ｗ／ｖ スクロース濃度で２．５ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．２５ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．３５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例７
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型３コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を３８０ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で１２時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と０．６の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ４．１ｇ／Ｌおよび１５０ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を１０℃で１２０時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。バッチを０．２ミクロンで濾過した。
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）バッファー中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例８
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型４コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を３００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで５０℃およびｐＨ４．１に調整して、多糖を部分的に脱ケタール化した。ついで多糖溶液を活性化前に２２℃に冷却した。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で４時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。５．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および２．０の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ透析カセットを使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０に対して約４℃で３日間、バッチを透析した。
最終濾過および生成物貯蔵
バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例９
ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）および水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型４コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を３００ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで５０℃およびｐＨ４．１に調整して、多糖を部分的に脱ケタール化した。ついで多糖溶液を活性化前に２２℃に冷却した。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で４時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロン濾過し、緩衝多糖溶液と０．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ８．３ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を１２０時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。ついでバッチを０．２ミクロンで濾過した。
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）バッファー中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１０
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型５コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を６００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで４℃およびｐＨ４．１に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は４℃で４時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．１）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウムを２０ｍＭの濃度まで添加（スパイク）した。２．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
希釈および中和
約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ透析カセットを使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０に対して約４℃で３日間、バッチを透析した。
最終濾過および生成物貯蔵
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１１
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型５コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を６００ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで４℃およびｐＨ４．１に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は４℃で４時間進行させた。
１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、活性化生成物を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．１）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を緩衝化多糖溶液と０．４の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ３．８ｇ／Ｌおよび１５０ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を９６時間進行させた。
精製および中和
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、３００ｍＭ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．３）に対してバッチを２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）で中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。ポリソルベート２０を０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度まで保持液バッチに加え、バッチを０．２ミクロンで濾過した。
０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１２
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）およびＰＣＶ２２多価研究用の血清型６Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２００ｂａｒ／５回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションした。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。１．５ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．４の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウムでバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１３
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ／Ａｑ）多価研究用の血清型６Ｂコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。１．８５ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．３５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１４
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究のための血清型６Ｂコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２００ｂａｒ／５回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。１．７５ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．３５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１５
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型７Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を１５０ｂａｒ／７回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで４℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は４℃で４時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．６ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１６
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究のための血清型７Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を１５０ｂａｒ／７回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで４℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は４℃で４時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．０４ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１７
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型８コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を６００ｂａｒ／６回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で４時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。４．５ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。混合後、コンジュゲート化反応を２２℃で進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例１８
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型９Ｖコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２３０ｂａｒ／５．５回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で６時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．３の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、６０℃以下で凍結した。
実施例１９
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型９Ｖコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を１００ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で６時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と０．７の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ１０．０ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を１２０時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。ポリソルベート２０を０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度まで保持液バッチに加え、バッチを０．２ミクロンで濾過した。
０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２０
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型９Ｖコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を１００ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で６時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と０．７の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ１０．０ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を１２０時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。ポリソルベート２０を０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度まで保持液バッチに加え、バッチを０．２ミクロンで濾過した。
０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２１
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３多価研究用の血清型１０Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を６１５ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．５ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．６の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２２
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１０Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を６００ｂａｒ／５回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．４ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．６の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２３
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型１０Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を６００ｂａｒ／５回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．８ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．７５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例Ｘ
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２４多価研究用の血清型１１Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を８００ｂａｒ／８回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａｌ）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．３ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウムでバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２４
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１２Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を２００ｍＭまで加え、８０℃で１５５分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム（ｐＨ７）バッファーを４００ｍＭまで加えて中和することにより行った。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．７ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．８の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２５
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１２Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を２００ｍＭまで加え、９０℃で６０分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム（ｐＨ７）バッファーを４００ｍＭまで加えて中和することにより行った。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２６
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型１４コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２００ｂａｒ／６回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で４時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。１．８ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。３００ｋＤａ ＭＷＣＯ透析カセットを使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ ポリソルベート２０に対して、バッチを約４℃で２２．５時間透析した。
最終濾過および生成物貯蔵
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２７
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１４コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２００ｂａｒ／６回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で４時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と１．０の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ３．８ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を７２時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。ついでバッチを０．２ミクロンで濾過した。
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）バッファー中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンでバッチを１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２８
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１５Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２１０ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２０時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を、３４℃に予熱された等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウムを２５ｍＭの濃度まで添加した。５．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および２．０の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、３４℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、３４℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例２９
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型１５Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を２００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２０時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を、３４℃に予熱された等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウムを２５ｍＭの濃度まで添加した。５．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および２．０の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、３４℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３０
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１５Ｃコンジュゲートの製造
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、Ｏ－アセチル基を遊離させるために穏やかな塩基加水分解に付し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小、塩基加水分解および酸化
精製された血清型１５Ｂ肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を３００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖溶液を６０℃に加熱し、重炭酸ナトリウム（ｐＨ９）バッファーを５０ｍＭの最終濃度まで加えた。バッチを、混合しながら、６０℃で１３時間インキュベートして、Ｏ－アセチル基を遊離させた。リン酸カリウム（ｐＨ６）バッファーを１３６ｍＭの最終濃度まで加えてｐＨを中和し、溶液を周囲温度に冷却した。ついで溶液を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．７５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３１
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型１５Ｃコンジュゲートの製造
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、Ｏ－アセチル基を遊離させるために穏やかな塩基加水分解に付し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小、塩基加水分解および酸化
精製された血清型１５Ｂ肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を３００ｂａｒ／５回通過に制御し、サイズ縮小多糖溶液を６０℃に加熱し、重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）バッファーを５０ｍＭの最終濃度まで加えた。バッチを、混合しながら、６０℃で１２時間インキュベートして、Ｏ－アセチル基を遊離させた。リン酸カリウム（ｐＨ６）バッファーを１５０ｍＭの最終濃度まで加えてｐＨを中和し、溶液を周囲温度に冷却した。ついで溶液を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．２ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．７５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３２
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１８Ｃコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を２００ｍＭまで加え、９０℃で１６０分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム（ｐＨ７）バッファーを４００ｍＭまで加えて中和することにより行った。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．４９ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３３
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型１８Ｃコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を２００ｍＭまで加え、９０℃で１６０分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム（ｐＨ７）バッファーを４００ｍＭまで加えて中和することにより行った。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．４９ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３４
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型１９Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．２２ミクロンで濾過した。多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２０時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．８ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．３３の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３５
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型１９Ａコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．２２ミクロンで濾過した。多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２０時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。３．８ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．３３の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３６
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）およびＰＣＶ２２多価研究用の血清型１９Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を１５０ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで４℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は４℃で４時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．２の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで２２℃で４．５日間インキュベートした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）、４℃で１０ｍＭ ヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３７
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型２２Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を８１０ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．３ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．５ミクロンプレフィルターで０．２ミクロン濾過し、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３８
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型２２Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を３５０ｂａｒ／５回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と０．６の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ７．５ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を１２０時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。
バッチを０．２ミクロンで濾過し、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）バッファー中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例３９
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）およびＰＣＶ２２多価研究用の血清型２３Ｂコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を４００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。５．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４０
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型２３Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を４００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で５時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．１ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．２５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４１
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型２３Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を４００ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で４時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．１ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．２５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で３時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロンで濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４２
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型２４Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を２００ｍＭまで加え、８０℃で１５０分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム（ｐＨ７）バッファーを４００ｍＭまで加えて中和することにより行った。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を１０％ ｗ／ｖ スクロース濃度で２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度まで添加した。１．４ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４３
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型２４Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を２００ｍＭまで加え、８０℃で１５０分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム（ｐＨ７）バッファーを４００ｍＭまで加えて中和することにより行った。
サイズ縮小多糖を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を１０％ ｗ／ｖ スクロース濃度で２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加した。１．４ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４４
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）多価研究用の血清型３３Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して、Ｐｓの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を５１０ｂａｒ／５回通過に制御した。
サイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。２．５ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および１．７５の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加え、２２℃でコンジュゲート化を進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、２２℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４５
水性コンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型３３Ｆコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。ついで精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖のサイズ縮小および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧力およびホモジナイザー通過回数を３５０ｂａｒ／４回通過に制御した。ついでサイズ縮小多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
酸化された多糖溶液を水および１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と混合した。選択されたバッファーｐＨは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と０．７の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で一緒にした。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ６．５ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を０．２ミクロンで濾過した。１００ｍＭ 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を９６時間進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロンで濾過した。１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、バッチを１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して２～８℃でダイアフィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約２．０ｇ多糖／Ｌに希釈し、１．２Ｍ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を加えた。ついで１．５Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）を加えた。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して４℃で透析した。バッチを０．２ミクロンで濾過し、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）バッファー中の追加的な１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４６
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）およびＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）多価研究用の血清型３５Ｂコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウムを２０ｍＭの最終濃度まで添加した。６．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および３．０の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。コンジュゲート化を３４℃で進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、３４℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例４７
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２２多価研究用の血清型３５Ｂコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。
多糖の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンで濾過した。溶解した多糖を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
ついで多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで２２℃およびｐＨ５に調整して、活性化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を１００ｍＭ メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は２２℃で２時間進行させた。
活性化生成物を１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、ついで、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖コンジュゲート化
既に記載されているとおりに（ＷＯ ２０１２／１７３８７６ Ａ１）シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２ｍＭ ホスファート（ｐＨ７．２）バッファーに対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンで濾過した。
活性化多糖を５％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を１％ ｗ／ｖ スクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７物質を等体積のＤＭＳＯ中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウムを２０ｍＭの最終濃度まで添加した。６．０ｇ Ｐｓ／Ｌの多糖濃度および３．０の多糖対ＣＲＭ１９７質量比が得られるように、多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比が制御されるように、質量比を選択した。コンジュゲート化を３４℃で進行させた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を加え、３４℃で１時間インキュベートした。約０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム中にバッチを約４℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７）に対して約４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
ついでバッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭ ヒスチジンに対して４℃でダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを（０．５ミクロンプレフィルターで）０．２ミクロン濾過し、ついで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含有する１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の追加的な１０ｍＭ ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
実施例Ｙ
ＤＭＳＯコンジュゲート化を用いたＰＣＶ２４多価研究用の血清型の製造
前記実施例に記載されたものと同様の方法を用いて、ＰＣＶ２４研究用のコンジュゲートを製造した。各血清型に関して、多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖および精製ＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とＣＲＭ１９７溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の０．２ミクロン濾過に付した。
所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばｐＨ、温度、濃度および時間を制御した。前記実施例との差異には、均質化圧力および通過回数、酸化時間、凍結乾燥のための多糖およびスクロースの濃度、コンジュゲート化中の多糖濃度、多糖対ＣＲＭ１９７質量比、ならびにコンジュゲート化反応における塩濃度が含まれうる。
実施例４８
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化
前記実施例に記載されている種々の化学的方法を用いて製造された個々の肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートを８、１５、２２、２３および２４価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化に使用した。
ＰＣＶ８／ＡＰＡワクチン医薬品は、非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型（－８、－１０Ａ、－１２Ｆ、－１５Ａ、－１５Ｃ、－２３Ｂ、－２４Ｆおよび－３５Ｂ）に個別にコンジュゲート化させることにより製造され、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．１％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）および２５０μｇ ［Ａｌ］／ｍＬ（アジュバントとしてリン酸アルミニウムアジュバントの形態）中で各血清型４μｇ／ｍＬ（３２μｇ／ｍＬの総多糖濃度）で製剤化される。
ＰＣＶ１５／ＡＰＡワクチン医薬品は、非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型（－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－９Ｖ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２３Ｆ）に個別にコンジュゲート化させ、あるいは、型－１、－３、－４、－５、－１４、－２２Ｆおよび－３３Ｆの場合には、プロトン性溶媒（水性化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型に個別にコンジュゲート化させることにより製造され、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．２％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）および２５０μｇ ［Ａｌ］／ｍＬ（アジュバントとしてリン酸アルミニウムアジュバントの形態）中で各血清型４μｇ／ｍＬ（ただし、６Ｂは８μｇ／ｍＬ）（６４μｇ／ｍＬの総多糖濃度）で製剤化される。
マウスおよびウサギを免疫化するのに使用されるＰＣＶ２２ワクチン医薬品を、プロトン性溶液および非プロトン性溶液（ＤＭＳＯ／水性「Ａｑ」）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型（－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－９Ｖ、－１０Ａ、－１２Ｆ、－１４、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆ、－３３Ｆおよび－３５Ｂ）に個別にコンジュゲート化させることにより製造し、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）および１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）中で各血清型０．８μｇ／ｍＬ（ただし、６Ｂは１．６μｇ／ｍＬ）（１８．４μｇ／ｍＬの総多糖濃度）で製剤化した（ＰＣＶ２２非アジュバント化またはｕｎａｄｊと称される）。もう１つの特定の実施形態においては、製剤は、アジュバントとしてのリン酸アルミニウムの形態の５０μｇ ［Ａｌ］／ｍＬを使用して製造され、ＰＣＶ２２／ＡＰＡと称される。
ＰＣＶ２３ワクチン医薬品は、非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型（－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－８、－９Ｖ、－１０Ａ、－１２Ｆ、－１４、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆ、－３３Ｆおよび－３５Ｂ）に個別にコンジュゲート化させることにより製造され、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）および１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）中で各血清型４μｇ／ｍＬ（９２μｇ／ｍＬの総多糖濃度）で製剤化され、ＰＣＶ２３ ｕｎａｄｊｕｖと称される。もう１つの特定の実施形態においては、製剤は、アジュバントとしてのリン酸アルミニウムの形態の２５０μｇ ［Ａｌ］／ｍＬを使用して製造され、ＰＣＶ２３／ＡＰＡと称される。もう１つの実施形態においては、ＰＣＶ２３ワクチン医薬品は、プロトン性溶媒（水性化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型（－１、３、－４、－５、－９Ｖ、－１４、－２２Ｆおよび－３３Ｆ）に個別にコンジュゲート化させ、および非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型（－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－８、－１０Ａ、－１２Ｆ、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆおよび－３５Ｂ）に個別にコンジュゲート化させることにより製造される。該ワクチン医薬品は、０．０１％ カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の存在下の２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）および１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）中で各血清型４μｇ／ｍＬ（ただし、６Ｂは８μｇ／ｍＬ）（９６μｇ／ｍＬの総多糖濃度）で製剤化され、およびアジュバントとしてのリン酸アルミニウムの形態の２５０μｇ ［Ａｌ］／ｍＬを使用して製造され、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡと称される。
多価免疫原性組成物ＰＣＶ２４は、非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ化学とも称される）中で還元的アミノ化を用いて、ＣＲＭ１９７タンパク質をストレプトコッカス・ニューモニエ多糖（ＰｎＰ）型－１、－３、－４、－５、－６Ａ、－６Ｂ、－７Ｆ、－８、－９Ｖ、－１０Ａ、－１１Ａ、－１２Ｆ、－１４、－１５Ａ、－１５Ｃ、－１８Ｃ、－１９Ａ、－１９Ｆ、－２２Ｆ、－２３Ｂ、－２３Ｆ、－２４Ｆ、－３３Ｆおよび－３５Ｂに個別にコンジュゲート化させることにより製造され、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）中で各血清型４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬ（それぞれ９６μｇ／ｍＬまたは１９２μｇ／ｍＬの総多糖濃度）で製剤化され、「ＰＣＶ２４ ｕｎａｄｊ」と称される。もう１つの特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物ＰＣＶ２４は、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（ｐＨ５．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ ｗ／ｖ ポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）、そして更に２５０μｇ ［Ａｌ］／ｍＬ（アジュバントとしてリン酸アルミニウムアジュバントの形態）中で各血清型４μｇ／ｍＬ（９６μｇ／ｍＬの総多糖濃度）で製剤化される。これは「ＰＣＶ２４／ＡＰＡ」と称される。
個々の血清型の目標濃度を得るために必要なバルクコンジュゲートの必要体積を、個々のバルク多糖濃度のバッチ体積および濃度に基づいて計算した。個々のコンジュゲートをヒスチジン、塩化ナトリウムおよびポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）の溶液に加えて、２×～４×コンジュゲート混合物を得た。該コンジュゲート混合物を含有する製剤容器を、マグネチックスターラーを使用して混合し、別の容器内に滅菌濾過する。滅菌濾過した２×～４×混合物を、リン酸アルミニウムアジュバントを含有する別の容器に加え、または生理食塩水で希釈して、所望の目標総多糖、賦形剤およびＡＰＡアジュバント（必要な場合）濃度を得る。ついで製剤をガラスバイアルまたはシリンジ内に充填し、２～８℃で貯蔵する。
実施例４９
マウスにおけるＰＣＶ２２免疫原性および機能的抗体
若い雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（６～８週齢、ｎ＝１０／群）を第０日、第１４日および第２８日に０．１ｍＬの２２価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ２２／ＡＰＡまたは非アジュバント化ＰＣＶ２２）で免疫化した。ＰＣＶ２２を各肺炎球菌多糖０．０８μｇ（１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ）および０．１６μｇ（６Ｂ）（全てはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されていた）で非アジュバント化形態または５μｇのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）（免疫化ごと）の存在下で投与した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、マウスを観察した。ワクチン関連有害事象が認められなかったため、マウスにおけるワクチン製剤は安全かつ高忍容性であるとみなされた。第５２日に、マウスをストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２４Ｆで気管内チャレンジした。ストレプトコッカス・ニューモニエの指数増殖期培養物を遠心分離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳ中に懸濁させた。チャレンジ前に、マウスをイソフルランで麻酔した。０．１ｍＬのＰＢＳ中の１０５ ｃｆｕのストレプトコッカス・ニューモニエを、切歯でまっすぐに吊るしたマウスの喉内に配置した。舌を穏やかに外側に引っ張り、鼻孔を覆うことにより、該細菌の吸引を誘導した。マウスを毎日秤量し、体重減少が開始体重の２０％を超えた場合には安楽死させた。細菌血症を評価するために、２４時間、４８時間および７２時間の時点で採血した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、マウスを少なくとも１日２回観察した。全ての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の推奨事項を厳守して行った。マウス実験プロトコルはメルク（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）の動物管理・使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、マウス血清をＩｇＧ免疫原性に関して評価した。このアッセイは、Ｍａｒｃｈｅｓｅら［３］により記載されているヒトアッセイに基づいてマウス血清で使用するために開発されたものであり、電気化学的刺激時に発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤの一部門）により開発された技術を用いる。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗マウスＩｇＧを、マウス血清サンプルを試験するための二次抗体として使用した。ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕに既に記載されているプロトコル、ならびにアラバマ大学（ＵＡＢ）研究財団［Ａｌａｂａｍａ（ＵＡＢ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ］により所有されライセンスされているＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェアに基づく多重オプソニン食作用アッセイ（ＭＯＰＡ）により、機能的抗体を決定した［１，２］。
マウス血清を各群に関してプールし、多重電気化学発光アッセイにおいて試験して抗体価を決定した。ＰＣＶ２２は、該ワクチンでの１、２および３回の免疫化の後、全ての血清型に関して、マウスにおける抗体価を生成した（図１）。ＩｇＧ力価により実証されているとおり、ＰＣＶ２２は血清型１５Ｂに対する交差反応性を示した（図１）。ＡＰＡと共に製剤化されたＰＣＶ２２は、ＰＤ２（データ非表示）およびＰＤ３（図２）のマウスにおいて、非アジュバント化ＰＣＶ２２と比較して、より高い免疫原性をもたらす傾向にあった。
マウス血清を各群に関してプールし、多重オプソニン食作用アッセイ（ＭＯＰＡ）において試験して機能的抗体価を決定した。ＰＣＶ２２は、該ワクチンでの３回の免疫化の後、ワクチン型細菌血清型を殺滅する機能的抗体価をマウスにおいて生成した（図３）。ＡＰＡと共に製剤化されたＰＣＶ２２は、ＩｇＧ力価（図２）と同様に、ＰＤ２（データ非表示）およびＰＤ３（図４）において、非アジュバント化ＰＣＶ２２と比較して、より高い機能的抗体力価をもたらす傾向にあった。
ＰＣＶ２２免疫化マウスはストレプトコッカス・ニューモニエ２４Ｆでの気管内チャレンジから防御された（図５）。マンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘ）対数順位検定は、非アジュバント化ＰＣＶ２２（ＰＣＶ２２ ｕｎａｄｊ）群とＰＣＶ２２／ＡＰＡ群との両方が、ナイーブ群と比較して、チャレンジから有意に防御されることを示した（Ｐ＜０．０００１）。同様に、両方のＰＣＶ２２免疫化マウス群は細菌血症をほとんど又は全く示さず、これは、ナイーブ群と比較して有意に少なかった（データ非表示）。
実施例５０
ウサギにおけるＰＣＶ２２免疫原性および機能的抗体
成体Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ（ニュージーランド）白ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝５／群）を、第０日および第１４日（交互の側）に、０．１ｍＬの２２価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ２２／ＡＰＡまたは非アジュバント化ＰＣＶ２２）で筋肉内（ＩＭ）免疫化した。ＰＣＶ２２を各肺炎球菌多糖０．０８μｇ（１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ）および０．１６μｇ（６Ｂ）（全てはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されていた）で非アジュバント化形態または５μｇのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）（免疫化ごと）の存在下で投与した。研究開始前（免疫前）ならびに第１４日（ＰＤ１）および第２８日（ＰＤ２）に血清を収集した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。ワクチン関連有害事象が認められなかったため、ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は安全かつ高忍容性であるとみなされた。全ての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の推奨事項を厳守して行った。ＮＺＷＲ実験プロトコルはメルク（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）およびコバンス（Ｃｏｖａｎｃｅ）（Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）の両方の動物管理・使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、ウサギ血清をＩｇＧ免疫原性に関して評価した。このアッセイは、Ｍａｒｃｈｅｓｅら［３］により記載されているヒトアッセイに基づいてウサギ血清で使用するために開発されたものであり、電気化学的刺激時に発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤの一部門）により開発された技術を用いる。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ウサギＩｇＧを、ＮＺＷＲ血清サンプルを試験するための二次抗体として使用した。ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕに既に記載されているプロトコル、ならびにアラバマ大学（ＵＡＢ）研究財団［Ａｌａｂａｍａ（ＵＡＢ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ］により所有されライセンスされているＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェアに基づく多重オプソニン食作用アッセイ（ＭＯＰＡ）により、機能的抗体を決定した［１，２］。
抗体価を決定するために、多重電気化学発光アッセイにおいてウサギの血清を個別に試験した。ＰＣＶ２２は、該ワクチンでの免疫化の後、全ての血清型に対するウサギにおける抗体価を生成した（図６）。ＰＣＶ２２でのウサギの免疫化は、血清型１５Ｂ多糖に結合する抗体をも生成する（図６）。ウサギにおいては、ＰＣＶ２２と共にＡＰＡを配合する利点はなかった。なぜなら、ＰＤ２において、（血清型１）非アジュバント化ＰＣＶ２２と比較して、免疫原性が同等以下だったからである（図７）。
機能的抗体価を決定するために、多重オプソニン食作用アッセイ（ＭＯＰＡ）においてウサギ血清を個別に試験した。ＰＣＶ２２は、該ワクチンでの２回の免疫化の後、ワクチン型細菌血清型を殺滅する機能的抗体価をウサギにおいて生成した（図８）。非アジュバント化ＰＣＶ２２は、ＡＰＡと共に製剤化されたＰＣＶ２２と比較して、血清型４ではＰＤ１（データ非表示）において、そして血清型１、３および４ではＰＤ２において、より高い機能的抗体価を示した。ＡＰＡと共に製剤化されたＰＣＶ２２は、非アジュバント化ＰＣＶ２２と比較して、血清型のほとんどに関して、ＰＤ１（データ非表示）およびＰＤ２において、より高い機能的抗体価を示さなかった（図８）。
実施例５１
乳児アカゲザルにおけるＰＣＶ２３免疫原性
乳児アカゲザル（ＩＲＭ、２～３月齢、ｎ＝８～９／群）を、第０日、第２８日および第５６日に、０．１ｍＬの２３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ２３）で筋肉内免疫化した。ＰＣＶ２３を総肺炎球菌多糖９．６μｇ（０．４μｇの１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂならびに０．８μｇの６Ｂ；全てはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されている）で、非アジュバント化形態または免疫化ごとに２５μｇのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）と共に製剤化された形態で投与した。前記と同じスケジュールに従い、ＰＣＶ１５を総肺炎球菌多糖６．４μｇ（０．４μｇの１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに０．８μｇの６Ｂ；全てはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されており、免疫化ごとに２５μｇのＡＰＡが配合される）で１つの四頭筋に投与し、０．１ｍＬのＰＣＶ８（０．４μｇの８、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、２３Ｂ、２４Ｆおよび３５Ｂ；全てはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されており、免疫化ごとに２５μｇのＡＰＡが配合される）を別の四頭筋に投与した。研究開始前（免疫前、第０日）ならびに第１４日（ＰＤ１）、第２８日、第４２日（ＰＤ２）、第５６日および第７０日（ＰＤ３）に血清を収集した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、ＩＲＭを観察した。全ての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の推奨事項を厳守して行った。実験プロトコルはメルク（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）およびニューイベリア研究所（Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）の動物管理・使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、アカゲザル血清をＩｇＧ免疫原性に関して評価した。このアッセイは、ＭａｒｃｈｅｓｅらおよびＳｋｉｎｎｅｒら［３，４］により記載されているヒトアッセイに基づいてアカゲザル血清で使用するために開発されたものであり、電気化学的刺激時に発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤの一部門）により開発された技術を用いる。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ヒトＩｇＧを、アカゲザル血清サンプルを試験するための二次抗体として使用した。
ＰＣＶ２３でのＩＲＭ免疫化は、評価されたＰＣＶ２３ワクチン製剤の全てに関して、全ての血清型に関して抗体価を生成した（図９Ａ～９Ｄ）。多糖コンジュゲート１５Ａ－ＣＲＭ１９７および１５Ｃ－ＣＲＭ１９７を含有するＰＣＶ２３は、ＥＣＬにおいて実証されているとおり、１５Ｂに対する交差反応性をももたらすことにも注目すべきである（図９Ａ～９Ｄ）。ＰＣＶ２３は、ＩＲＭにおいて、１用量のワクチンで免疫原性であった（図９Ａ～９Ｄ）。
ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡ製剤は、ＰＤ１において、非アジュバント化ＰＣＶ２３より高い、血清型２２Ｆに関する免疫原性を示し、一方、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡは、ＰＤ１において、非アジュバント化ＰＣＶ２３より高い、血清型１および血清型１５Ｃに関する免疫原性を示した（図１０Ａ）。ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡ製剤は、ＰＤ２において、非アジュバント化ＰＣＶ２３より高い、血清型１８Ｃに関する免疫原性を示した（図１０Ｂ）。ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡは、ＰＤ２において、大多数の血清型（１、３、４、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ｆ、２２Ｆおよび２３Ｆ）に関して、非アジュバント化ＰＣＶ２３より高い免疫原性を示した（図１０Ｂ）。ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡは、ＰＤ３において、非アジュバント化ＰＣＶ２３より高い、血清型１、４および９Ｖに関する免疫原性を示した（図１０Ｃ）。
ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡでワクチン接種された、または別々の肢におけるＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡの共投与でワクチン接種されたＩＲＭは、ＰＤ１において、多数の免疫原性の差異を示さなかった。ただし、血清型１０Ａは、共投与群において、より高い免疫原性を示した（図１１Ａ）。しかし、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡでワクチン接種されたＩＲＭは、血清型１、３、４、５、７Ｆ、８、９Ｖ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂおよび２３Ｆの大多数に関して、ＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡの共投与より高いＰＤ２免疫原性を示した（図１１Ｂ）。ＰＤ３においては、それらの２つのワクチンの間で免疫原性の差異は認められなかった（図１１Ｃ）。
抗体増強効果を評価したところ、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭにおける血清型２３Ｂを除く全ての血清型に関して、ＰＣＶの全てが、免疫前血清と比較して、ＰＤ１における一次免疫応答を引き起こした（図１２Ａ）。評価された全てのＰＣＶは、全ての血清型に関して、免疫前血清と比較して、ＰＤ２およびＰＤ３における、有意に高い抗体価を生成した（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。ＰＣＶの第２用量は、非アジュバント化ＰＣＶ２３、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ）／ＡＰＡおよびＰＣＶ１５／ＡＰＡ＋ＰＣＶ８／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭにおける血清型３および血清型１を除く全ての血清型に関して、ＰＤ１と比較して、ＰＤ２からの抗体価の増加を引き起こす（図１２Ｄ）。ＰＣＶの第３用量は、大多数の血清型に関して、抗体価の増加をもたらすが、例外的に、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭにおいては、ＰＤ２と比較してＰＤ３における減少が認められ、このことは、ＰＣＶ２３（ＤＭＳＯ＋Ａｑ）／ＡＰＡで免疫化されたＩＲＭがＰＤ２において最大抗体応答に達したことを示唆している（図１２Ｅ）。
実施例Ｚ
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギおよび幼児アカゲザルにおけるＰＣＶ２４免疫原性
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝８／群）を、第０日および第１４日に、０．１ｍＬの２４価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ２４）で筋肉内免疫化した。ＰＣＶ２４を総肺炎球菌多糖９．６μｇ（０．４μｇの１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ｄｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；全てはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されている）を投与した。該ＰＣＶ２４は免疫化ごとにリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ、２５μｇ）と共に製剤化された。研究開始前（免疫前、第０日）ならびに第１４日（ＰＤ１）および第２８日（ＰＤ２）に、血清を収集した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。
乳児アカゲザル（ＩＲＭ、２～３月齢、ｎ＝５／群）を、第０日、第２８日、第５６日に、０．１ｍＬの２４価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ２４）で筋肉内免疫化した。ＰＣＶ２４を総肺炎球菌多糖９．６μｇ（０．４μｇの１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ｄｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；全てはＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されている）を投与した。該ＰＣＶ２４は免疫化ごとにリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ、２５μｇ）と共に製剤化された。研究開始前（免疫前、第０日）ならびに第１４日（ＰＤ１）、第２８日、第４２日（ＰＤ２）、第５６日および第７０日（ＰＤ３）に、血清を収集した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、ＩＲＭを観察した。全ての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の推奨事項を厳守して行った。実験プロトコルはメルク（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）およびニューイベリア研究所（Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）の動物管理・使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、アカゲザル血清をＩｇＧ免疫原性に関して評価した。このアッセイは、ＭａｒｃｈｅｓｅらおよびＳｋｉｎｎｅｒら［３，４］により記載されているヒトアッセイに基づいてアカゲザル血清で使用するために開発されたものであり、電気化学的刺激時に発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤの一部門）により開発された技術を用いる。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ヒトＩｇＧを、アカゲザル血清サンプルを試験するための二次抗体として使用し、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ウサギＩｇＧをＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギサンプルのために使用した。
機能的抗体を、ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕに既に記載されているプロトコル、ならびにアラバマ大学（ＵＡＢ）研究財団［Ａｌａｂａｍａ（ＵＡＢ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ］により所有されライセンスされているＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェアに基づく多重オプソニン食作用アッセイ（ＭＯＰＡ）により決定した［１，２］。
ＰＣＶ２４でのＮＺＷＲ免疫化は、ワクチンにおける全ての血清型に関して、抗体価を生成した（図１３Ａ）。多糖コンジュゲート１５Ａ－ＣＲＭ１９７、ｄｅＯＡｃ１５Ｂ－ＣＲＭ１９７、６Ａ－ＣＲＭ１９７、６Ｂ－ＣＲＭ１９７を含有するＰＣＶ２４は、ＥＣＬにおいて実証されているとおり、１５Ｂおよび６Ｃに対する交差反応性をももたらすことにも注目すべきである（図１３Ａ）。
機能的抗体価を決定するために、多重オプソニン食作用アッセイ（ＭＯＰＡ）において、ＮＺＷＲ血清を個別に試験した。ＰＣＶ２４は、全てのワクチン型細菌血清型を殺滅する機能的抗体価をＮＺＷＲにおいて生成した（図１３Ｂ）。
ＰＣＶ２４でのＩＲＭ免疫化は、ワクチンにおける全ての血清型に関して、抗体価を生成した（図１４Ａ）。多糖コンジュゲート１５Ａ－ＣＲＭ１９７、ｄｅＯＡｃ１５Ｂ－ＣＲＭ１９７、６Ａ－ＣＲＭ１９７、６Ｂ－ＣＲＭ１９７を含有するＰＣＶ２４は、ＥＣＬにおいて実証されているとおり、１５Ｂおよび６Ｃに対する交差反応性をももたらすことにも注目すべきである（図１４Ａ）。
機能的抗体価を決定するために、多重オプソニン食作用アッセイ（ＭＯＰＡ）において、ＩＲＭ血清を個別に試験した。ＰＣＶ２４は、ワクチン型細菌血清型を殺滅する機能的抗体価をＩＲＭにおいて生成した（図１４Ｂ）。ただし、３３Ｆは例外的に、ＥＣＬにおいて、より低いＰＤ３／Ｐｒｅ結合抗体価を示した。しかし、ＰＣＶ２４／ＡＰＡをＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギにおいて評価したところ、ＰＤ２ ３３Ｆ ＯＰＡ力価は免疫前力価より５８倍以上高かった（図１３Ｂ）。
参考文献
１．Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ Ｉ，Ｉｎｄｒａｗａｔｉ Ｌ，Ｋａｕｆｈｏｌｄ ＲＭ，Ｇａｕｎｔ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｎａｗｒｏｃｋｉ ＤＫら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ａ １５－ｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ（ＰＣＶ１５）ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｏｓｅ，ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｓｔｒａｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１７ Ｆｅｂ ０７；３５（６）：８６５－７２．
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３．Ｍａｒｃｈｅｓｅ ＲＤ，Ｐｕｃｈａｌｓｋｉ Ｄ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｐ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｏ Ｊ，Ｈａｍｍｏｎｄ Ｏ，Ｇｒｅｅｎ Ｔ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ＬＪ，Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ ＭＪ，Ｓｉｋｋｅｍａ Ｄ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｓｅｒｏｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ；１６（３）：３８７－９６．
４．Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ １５－ｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ（ＰＣＶ１５－ＣＲＭ１９７）ｉｎ ａｎ ｉｎｆａｎｔ－ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｅｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１１．２９（４８）：ｐ．８８７０－８８７６．
実施例５２
材料および方法
遊離多糖試験
コンジュゲートサンプルにおける遊離多糖（ＣＲＭ１９７にコンジュゲート化されていない多糖）を、まず、遊離タンパク質およびコンジュゲートをデオキシコラート（ＤＯＣ）および塩酸で沈殿させることにより測定する。ついで沈殿物を濾去し、濾液をＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩにより遊離多糖濃度に関して分析する。遊離多糖を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩにより測定された全多糖に対する百分率として計算する。
遊離タンパク質試験
コンジュゲートサンプル中の遊離多糖、多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートおよび遊離ＣＲＭ１９７をミセル界面動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）モードのキャピラリー電気泳動により分離する。簡潔に説明すると、サンプルを、２５ｍＭ ボラート、１００ｍＭ ＳＤＳ（ｐＨ９．３）を含有するＭＥＫＣランニングバッファーと混合し、前処理されたベアフューズド（ｂａｒｅ－ｆｕｓｅｄ）シリカキャピラリーで分離する。分離を２００ｎｍでモニターし、遊離ＣＲＭ１９７をＣＲＭ１９７標準曲線で定量する。遊離タンパク質の結果を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法により決定された総タンパク質含有量に対する百分率として表す。
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを用いたコンジュゲートの分子量および濃度分析
コンジュゲートサンプルを注入し、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により分離した。紫外線（ＵＶ）、多角度光散乱光散乱（ＭＡＬＳ）および屈折率（ＲＩ）検出器を直列で使用して、検出を行った。吸光係数を使用して、ＵＶ２８０からタンパク質濃度を計算した。ｍＬ／ｇで表された溶質濃度の変化に伴う溶液の屈折率の変化であるｄｎ／ｄｃ係数を使用して、ＲＩシグナル（タンパク質と多糖との両方が寄与）から多糖濃度をデコンボリューションした。測定濃度および光散乱情報（サンプルピーク全体にわたるもの）を用いて、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）により、サンプルの平均分子量を計算した。多分散分子の分子量の平均値には複数の形態が存在する。例えば、数平均分子量Ｍｎ、重量平均分子量Ｍｗおよびｚ平均分子量Ｍｚ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１５，２０，１０３１３－１０３４１）が挙げられる。特に示されていない限り、分子量は重量平均分子量である。
多糖と担体タンパク質との間の共有結合の数の尺度としてのコンジュゲート化タンパク質におけるリジン消費の決定
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ－Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて、コンジュゲートサンプルにおけるコンジュゲート化の度合を測定した。Ｅｌｄｅｘワークステーションにおいて気相酸加水分解を用いて、サンプルを加水分解して、担体タンパク質をそれらの成分アミノ酸に分解した。６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバマート（ＡＱＣ）を使用して、遊離アミノ酸を誘導体化した。ついで、Ｃ１８カラム上のＵＶ検出付きＵＰＬＣを使用して、誘導体化サンプルを分析した。リジン以外の代表的なアミノ酸を使用して、平均タンパク質濃度を得た。コンジュゲートにおけるリジンの平均測定量と出発タンパク質におけるリジンの予想量との差により、コンジュゲート化中のリジン消費（すなわち、リジン損失）を決定した。

Claims (34)

  1. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、該多糖タンパク質コンジュゲートが、
    ａ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｂ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｃ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｄ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｅ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｆ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ＤｅＯＡｃ１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｇ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｈ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｊ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｋ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｌ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｍ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｎ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｏ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｐ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｑ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｒ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｓ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｔ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｕ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｖ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｗ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｘ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｙ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｚ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ａａ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ；
    ｂｂ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ｄｅＯ－１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｃｃ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｄｄ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ｄｅＯ－１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｅｅ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｆｆ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｇｇ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、ｄｅＯ－１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｈｈ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｉｉ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｊｊ）１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｋｋ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｌｌ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｍｍ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｎｎ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｏｏ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｐｐ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｑｑ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｒｒ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｓｓ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｔｔ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｕｕ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｖｖ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｗｗ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｘｘ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｙｙ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ｚｚ）１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；
    ａａａ）１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９；ならびに
    ｂｂｂ）１、３、４、５、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９
    からなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む、多価免疫原性組成物。
  2. 免疫原性組成物が、いずれの他のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型由来の多糖を有する多糖タンパク質コンジュゲートをも含まない、請求項１記載の多価免疫原性組成物。
  3. 多糖タンパク質コンジュゲートの少なくとも１つが、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成される、請求項１または２記載の多価免疫原性組成物。
  4. 多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれが、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成される、請求項１または２記載の多価免疫原性組成物。
  5. 非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項３または４記載の多価免疫原性組成物。
  6. 担体タンパク質が、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、プロテインＤおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物。
  7. 担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１～６のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物。
  8. 組成物がアジュバントを更に含む、請求項１～７のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物。
  9. 組成物がアジュバントを含まない、請求項１～７のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物。
  10. 請求項１～９のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物を患者に投与することを含む、ヒト患者において免疫応答を誘導するための方法。
  11. 請求項１～９のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物を患者に投与することを含む、ヒト患者において防御免疫応答を誘導するための方法。
  12. 請求項１～９のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物を患者に投与することを含む、ヒト患者においてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する防御免疫応答を誘導するための方法。
  13. 患者が多価肺炎球菌ワクチンで以前に治療されていた、請求項１０～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 患者が６週齢～１７歳である、請求項１０～１３のいずれか１項記載の方法。
  15. 請求項１記載の多価免疫原性組成物を６週齢～１７歳の患者に投与することを含む、６週齢～１７歳の患者における肺炎球菌肺炎および／または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法。
  16. ２３個の異なるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートが、それぞれ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ由来の多糖を含み、担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、多価免疫原性組成物。
  17. 免疫原性組成物が、いずれの他のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型由来の多糖を有する多糖タンパク質コンジュゲートをも含まない、請求項１６記載の多価免疫原性組成物。
  18. 多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれが、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成され、非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１６記載の多価免疫原性組成物。
  19. 組成物がアジュバントを含む、請求項１６記載の多価免疫原性組成物。
  20. ２４個の異なるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートが、それぞれ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ由来の多糖を含み、担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、多価免疫原性組成物。
  21. 免疫原性組成物が、いずれの他のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型由来の多糖を有する多糖タンパク質コンジュゲートをも含まない、請求項２０記載の多価免疫原性組成物。
  22. 多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれが、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成され、非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項２０記載の多価免疫原性組成物。
  23. 組成物がアジュバントを含む、請求項２０記載の多価免疫原性組成物。
  24. ２４個の異なるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートが、それぞれ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ由来の多糖を含み、担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、多価免疫原性組成物。
  25. 免疫原性組成物が、いずれの他のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型由来の多糖を有する多糖タンパク質コンジュゲートをも含まない、請求項２４記載の多価免疫原性組成物。
  26. 多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれが、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成され、非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項２４記載の多価免疫原性組成物。
  27. 組成物がアジュバントを含む、請求項２４記載の多価免疫原性組成物。
  28. ３０個までの異なるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、前記の３０個までの多糖タンパク質コンジュゲートが、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む、多価免疫原性組成物。
  29. ３０個までの多糖タンパク質コンジュゲートが、７Ｃ、９Ｎ、１６Ｆ、２３Ａ、３５Ｆおよび３８から選択される１、２、３、４、５または６個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を更に含む、請求項２８記載の多価免疫原性組成物。
  30. ３０個までの異なるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、前記の３０個までの多糖タンパク質コンジュゲートが、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む、多価免疫原性組成物。
  31. ３０個までの多糖タンパク質コンジュゲートが、７Ｃ、９Ｎ、１６Ｆ、２３Ａ、３５Ｆおよび３８から選択される１、２、３、４、５または６個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を更に含む、請求項３０記載の多価免疫原性組成物。
  32. 担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項２８～３１のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物。
  33. 多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれが、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲート化反応により形成され、非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項２８～３２のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物。
  34. 組成物がアジュバントを含む、請求項２８～３３のいずれか１項記載の多価免疫原性組成物。
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