CN105999254A - 含2型和12f血清型的15价肺炎球菌结合物组合疫苗 - Google Patents

含2型和12f血清型的15价肺炎球菌结合物组合疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种15价肺炎球菌结合物组合疫苗，组合中特别含有2型和12F血清型，具有较广的免疫覆盖率，用于预防肺炎链球菌引起的感染性疾病。本发明所述组合疫苗中还包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型血清型。

Description

含2型和12F血清型的15价肺炎球菌结合物组合疫苗
技术领域：
本发明涉及一种15价肺炎球菌结合物组合疫苗，组合中特别含有2型和12F血清型，具有较广的免疫覆盖率，用于预防肺炎链球菌引起的感染性疾病。
背景技术：
肺炎链球菌是导致发展中国家和发达国家各年龄组人群社区获得性肺炎(community acquire pneumonia,CAP)最重要的病原菌，同时也是引起中耳炎、肺炎、脑膜炎和菌血症的主要病原菌。在世界范围内，每年由于肺炎链球菌感染引起的死亡占总死亡人数的9％，每年由肺炎链球菌引起的脑膜炎3万多例，菌血症63万多例，中耳炎1400万例，肺炎2000万例。
预防肺炎球菌感染的免疫制剂分为多糖疫苗和结合疫苗两种，目前上市使用的多糖疫苗为“23价肺炎球菌多糖疫苗”，上市使用的结合疫苗为“10价肺炎球菌结合疫苗”和“13价肺炎球菌结合疫苗”。肺炎球菌多糖疫苗可使用于2岁以上人群，主要用于65岁以上老年人对疾病的免疫预防。肺炎球菌结合疫苗具有优于多糖疫苗的众多优势，基本适用于全年龄人群，是目前肺炎球菌疫苗的一个研究方向。“10价肺炎球菌结合疫苗”含有肺炎血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F，“13价肺炎球菌结合疫苗”含有肺炎血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。已知的肺炎血清型已达到90种以上，一些侵袭力强、多引起侵袭性疾病的型别也未包含在已上市的产品中，随着“10价肺炎球菌结合疫苗”和“13价肺炎球菌结合疫苗”在全球的使用，一些未包含在已有疫苗血清型中的高致病力的肺炎球菌血清型增长明显，需要考虑增加到原有的肺炎球菌结合物组合中。
肺炎球菌2型和12F具有很强的致病性，健康携带少见，多从肺炎球菌侵袭性疾病中分离出，是肺炎球菌引起细菌性脑膜炎的最主要血清型。我国在上世纪八十年代曾组织18个省市自治区开展了肺炎链球菌血清型监测工作，共临床分离出712株肺炎链球菌，其中2型45株，12型17株，占6.3％和2.4％，位于分离株排名的第5位和第11位，值得注意的是在712分离株中，有251株是侵袭性菌株，其中180株分离自脑脊液，在180株脑脊液分离株中，2型35株，12型8株，分别占19.4％和4.4％，位于排名的第1位和第8位(丁绍卿等.肺炎球菌血清学分型的研究《生物制品学杂志》1988,1(1):18-22.)。现今，2型和12F血清型在国内也很常见，如河南漯河2012年在患儿中分离到134株肺炎球菌，12F有14株，占10.4％(窦会娟等.儿科患者感染肺炎链球菌的耐药性及血清分型研究《中国消毒学杂志》2015,32(1):76-77)，四川自贡于2010年的一个肺炎球菌血清型研究中，也分离到2型和12F各2株(章成等.四川省自贡市儿童与成人分离肺炎链球菌株的血清型分布及抗生素敏感性比较《实用医院临床杂志》2012,9(1):82-85.)。国际上，2型和12F也是危害最严重的肺炎球菌血清型。在孟加拉国，2型位居肺炎球菌引起儿童脑膜炎的第一位，而且基本都分离自脑膜炎(98％)，是新近发现的儿童肺炎球菌脑膜炎的最大威胁(Saha SK,et al.Streptococcus pneumoniaeserotype-2childhood meningitis in Bangladesh:a newly recognized pneumococcalinfection threat.PLoS One.2012；7(3):e32134)。在危地马拉，2型是儿童侵袭性肺炎球菌病中致死率最高的，可引起大多数的脑膜炎，发生年龄小(平均3.5月龄)，但现有肺炎结合疫苗并未包含(Gaensbauer JT,et al.Pediatric Invasive Pneumococcal Disease inGuatemala City:Importance of Serotype 2.Pediatr Infect Dis J.2016May；35(5):e139-43.)。在黎巴嫩，2型位于分离肺炎球菌的首位，常具有大环内脂类抗生素抗性，又不再现有肺炎球菌结合疫苗涵盖范围内，造成社区传播的风险(Taha N,et al.Genotypesand serotype distribution of macrolide resistant invasive and non-invasiveStreptococcus pneumoniae isolates from Lebanon.Ann Clin MicrobiolAntimicrob.2012Jan 16；11:2.)。12F是肺炎球菌中最具侵袭力的一种(Sleeman KL,etal.Capsular serotype-specific attack rates and duration of carriage ofStreptococcus pneumoniae in a population of children.J Infect Dis.2006Sep 1；194(5):682-8)，在美国、澳大利亚、加拿大都有过爆发(Rakov AV,et al.Populationstructure of hyperinvasive serotype 12F,clonal complex 218Streptococcuspneumoniae revealed by multilocus boxB sequence typing.Infect GenetEvol.2011Dec；11(8):1929-39.)，随着肺炎结合疫苗在全球的使用，12F的病例大幅增长，已成为侵袭性肺炎球菌病(IPD)最主要血清型。表1列举了肺炎球菌结合疫苗使用后，12F在一些国家的分离位置。
表1.肺炎球菌结合疫苗使用后12F在IPD非疫苗血清型的情况
2型和12F侵袭力强，常引起细菌性脑膜炎等侵袭性疾病，是危害最严重的肺炎球菌血清型之一，在全球各大洲都常见，表2列举了2型和12F在全球各洲的分离排名(Pneumococcal Regional Serotype Distribution for Pneumococcal AMCTPP.Codebook to assess whether a pneumococcal vaccine meets the PneumococcalAMC Target Product Profile for regional vaccine serotype coverage)，本发明包含的1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F血清型是亚洲地区排列前15位的血清型，特别适合于亚洲地区。在近百个肺炎球菌血清型中，2型和12F不仅侵袭力超强，而且高比例存在于各大洲，是本发明认为肺炎球菌结合疫苗组合中必须含有的两个血清型。
表2.肺炎球菌2型和12型在全球各洲的分布排名
发明内容：
本发明提供了一种含有2型和12F型血清型的15价肺炎球菌结合物组合疫苗，用于预防肺炎球菌2型，12F型以及其他型肺炎球菌的侵袭。
所述组合疫苗中还包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型血清型。
为此，本发明提供一种15价肺炎球菌结合物组合疫苗，包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F血清型，用于预防婴幼儿、青少年和成人的相应血清型肺炎球菌感染。
本发明所述的组合疫苗，是由上述15种肺炎球菌结合物组合制备而成。
所述15种肺炎球菌结合物是相应肺炎球菌血清型荚膜多糖与生理上可接受的载体蛋白质制备的多糖蛋白结合物。
其中，所述肺炎球菌荚膜多糖为：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F血清型。
其中，所述生理上可接受的载体蛋白质选自：白喉类毒素(DT)及其交叉反应物质(CRM)，CRM是一类与白喉抗毒素形成反应的物质，含有如CRM197、CRM9、CRM173、CRM228和CRM45；包括破伤风类毒素(TT)、百日咳类毒素(PT)、霍乱毒素B亚单位、不耐热大肠杆菌肠毒素(LT)、耐热大肠杆菌肠毒素(ST)、绿脓杆菌外毒素A(EPA)；包括外膜蛋白复合物(OMPC)、肺炎球菌溶血素(PLY)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白A(PsaA)、流感嗜血杆菌蛋白D。载体蛋白质优选DT、TT和CRM197，最优选DT。
本发明15种肺炎球菌结合物的制备方法可以采用本行业专业人员都熟知常规方法，如可利用荚膜多糖上的醛基、羧基或氨基等与载体蛋白质直接相连，也可通过桥联剂与载体蛋白质相连接，所述桥联剂包括但不限定为丁二酰二肼(SDH)、己二酰二肼(ADH)、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)等。
本发明15种肺炎球菌结合物的重量比例为1：1-1：2之间，其中所述重量以荚膜多糖的重量计算。例如，在本发明的15价肺炎球菌结合物组合疫苗中，单位剂量中，各型荚膜多糖的含量可以为0.1-10μg；优选含量为0.5-5μg；最优选含量为1-4μg。本发明最优选多糖含量组合为1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F各2μg，6B是4μg。
本发明15价肺炎球菌结合物组合疫苗中，还可包括疫苗制剂所需要的必要辅料，如：可包含佐剂和/或缓冲液，所述的佐剂选自铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等。水包油或细菌细胞壁成份，如MF59、SAE、RAS等。或者皂角类佐剂，如Quil A、QS-21。或者细菌脂多糖或合成类脂A佐剂。细胞因子，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、共刺激分子B7-1、B7-2等。或者毒素亚单位类佐剂，如霍乱毒素及亚单位、百日咳毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)等。所述的缓冲液选自磷酸缓冲液或Tris缓冲液，也可以是生理氯化钠溶液。缓冲液浓度可以是0.01－0.05M，优选0.01－0.02M，最优选0.01M。
也可包含稳定剂和/或分散剂，稳定剂选自氨基酸，氨基酸可以是组氨酸，优选L-组氨酸，使用浓度1-100mM，优选2-50mM，更优选3-10mM，最优选5mM。组氨酸可以组氨酸缓冲液的形式出现。分散剂选自多聚山梨醇酯，优选Tween 80，使用浓度0.01-1％，更优选0.01-0.1％，最优选0.02-0.05％。
本发明的15价肺炎球菌结合物组合疫苗可以制成供临床用的各种制剂形式，所述的制剂选自液体剂型、冻干剂型，优选液体剂型。
本发明的15价肺炎球菌结合物组合疫苗，其接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射途径。
本发明的15价肺炎球菌结合物组合疫苗，在免疫小鼠和大鼠后，都能产生针对各血清型多糖的特异性IgG抗体，产生的15种血清型特异性抗体滴度较高，阳转率基本都能达到100％，而且具有协同增效作用，2型和12F与其他13个血清型也未出现免疫干扰情况。
以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：
15价肺炎球菌结合物组合小鼠免疫力实验
实验的15价肺炎球菌结合物组合有2种，一种含有磷酸铝佐剂，一种不含任何佐剂，每毫升组合中含1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F多糖各4μg，含6B多糖8μg。实验采用NIH小鼠，皮下免疫2针，间隔1月，剂量为0.1ml/次。免疫后14天采血，分离血清，测定15种特异性IgG抗体效价。以阴性对照平均值加2倍SD作为cutoff值判定血清抗体滴度，抗体滴度取对数后分析处理；以抗体4倍以上增长评定阳转率，结果见表3。分析比较了含佐剂和不含佐剂组合诱导抗体滴度间的情况，未发现明显差异。
表3.15价肺炎球菌结合物组合在小鼠中的免疫原性
15价肺炎球菌结合物组合大鼠免疫力实验
实验的15价肺炎球菌结合物组合含有磷酸铝佐剂，每毫升中含1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F多糖各4μg，含6B多糖8μg。采用SD大鼠，免疫程序为3针，每针间隔1月，0.125ml/次，采集免前和最后1针免后2周的血样，分离并测定特异性IgG血清抗体滴度，取对数后进行分析，结果见表4。
表4.15价肺炎球菌结合疫苗在大鼠中的免疫原性
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：15价肺炎球菌结合物组合处方
每0.5ml剂量含各型多糖共32μg(多糖总量)，其中6B型4μg，1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F、23F各2μg。各型多糖与白喉类毒素结合后吸附于磷酸铝佐剂(铝含量0.125mg)，溶剂为生理氯化钠溶液。
实施例2：15价肺炎球菌结合物组合不同针次免疫小鼠后的抗体情况
采用NIH小鼠，皮下免疫3针，每针间隔2周，剂量为0.1ml。每针免疫后14天采血，分离血清，测定特异性血清效价。以阴性对照平均值加2倍SD作为cutoff值判定血清抗体滴度，取对数后进行数据分析，以抗体4倍以上增长评定阳转率。结果可见，本发明结合物组合可在小鼠中诱导高滴度特异性抗体，1针免疫就可达到理想的抗体滴度和阳转率，对于已有很高抗体滴度的小鼠，再次免疫后的抗体滴度也不再升高。
表5.15价肺炎球菌结合物组合在小鼠免疫应答状况
实施例3：15价肺炎球菌结合物组合豚鼠主动过敏实验
分2ml、0.5ml两个免疫剂量组，健康白色豚鼠腹腔注射15价肺炎球菌结合组合，隔日一次，连续3次进行致敏；末次致敏后第12天，由静脉单次注射2倍致敏剂量的15价肺炎球菌结合物组合进行激发，2ml剂量组对豚鼠过敏反应为阳性(++3只、+++2只、++++1只)，主要症状为不安宁、竖毛、发抖、搔鼻、喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、流泪、呼吸困难、步态不稳、痉挛、死亡，反应在给药后约1分钟出现，死亡出现在给药后约5分钟，存活鼠反应在给药后半小时内消失，反应率为100％，死亡率为16.7％；另取2只未致敏健康豚鼠单次静脉注射给予相同激发剂量的15价肺炎球菌结合物组合，未见异常反应；0.5ml剂量组无过敏反应发生。两个剂量组豚鼠在致敏期间均未见明显异常反应，体重也均随试验时间延长而增长，其首次致敏、末次致敏和激发时的平均体重均与相应时间的0.9％NaCl注射液阴性对照组相似(P>0.05)。牛血清白蛋白阳性对照组豚鼠在致敏期间也未见异常反应，但激发后也均出现明显的过敏反应症状，主要表现为不安宁、竖毛、发抖、搔鼻、喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、流泪、呼吸困难、步态不稳、跳跃、痉挛、甚至死亡，死亡时间在给药后5分钟左右，有过敏反应的存活豚鼠在给药后30分钟内逐渐恢复正常，其反应出现率为100％，死亡率为66.7％，过敏反应为阳性(++2只、++++4只)。
实施例4：15价肺炎球菌结合物组合溶血实验
15价肺炎球菌结合物组合0.1～0.5ml各管在3小时内均未出现溶血和凝集，与0.9％NaCl注射液阴性对照管相同。蒸馏水阳性对照管各时间点观察均出现完全溶血。
实施例5：15价肺炎球菌结合物组合肌肉刺激实验
兔左右腿股四头肌单次注射15价肺炎球菌结合物组合1ml/点和铝佐剂对照1ml/点剂量，停药48小时大体观可见15价肺炎球菌结合物组合给药组1号兔双侧股四头肌可见0.5×1.0cm以上病灶，触摸较硬，色泽暗红、浑浊感；4号兔双侧股四头肌可见0.5×1.0cm以上病灶，触摸较硬，色泽发白或局部暗红、浑浊感；其所有股四头肌反应级之和为8，小于10。佐剂对照组2号兔双侧股四头肌注射局部可见范围在0.5×1.0cm以下病灶，触摸较硬，色泽发白、局部暗红；7号兔左侧股四头肌可见0.5×1.0cm以下病灶，触摸较硬，色泽发白、浑浊感，右侧股四头肌未见异常；其所有股四头肌反应级之和为3，小于10。组织学检查可见，停药48小时两组试验兔主要出现以注射局部间质受试物沉积和周围单核细胞为主的炎性浸润病变，肌纤维病变均不明显；给药组在病变范围和间质充血、出血、水肿病变程度较佐剂对照组严重，但二组试验兔股四头肌病变范围局限，均未出现明显大范围的变性、坏死和间质炎性浸润、充血、出血、水肿等严重刺激性病变；恢复期结束检查二组试验兔股四头肌注射局部小灶性病变，以受试物沉积、单核细胞为主的炎性浸润伴纤维结缔组织增生为主，同时可见嗜酸性粒细胞增生，病变范围局限，肌纤维病变不明显。二期检查的0.9％NaCl注射液对照组兔股四头肌均未见明显病理变化。
在本试验剂量条件下，根据肌肉刺激反应分级标准判断，15价肺炎球菌结合物组合对兔股四头肌刺激试验符合规定。15价肺炎球菌结合物组合单次肌肉注射后出现注射局部间质受试物沉积和周围单核细胞为主的炎性浸润病变，与佐剂对照反应相似，可能与佐剂不容易吸收有关。
实施例6：15价肺炎球菌结合物组合急性毒性实验
健康ICR小鼠单次肌肉注射给予15价肺炎球菌结合物组合1ml剂量，给药后整个试验观察期间小鼠未出现明显异常反应，也未引起动物死亡，给药后小鼠体重均随试验时间延长而增加。试验结束动物经剖检，大体观检查可见实验组和佐剂对照组所有小鼠给药局部出现触摸较硬的白色或土黄色结节，组织学检查发现小鼠给药局部肌纤维间质出现异物肉芽肿样结节，但对肌纤维实质并无明显影响；正常对照组小鼠给药局部未见类似现象。本试验所有小鼠经剖检，各脏器未见异常变化。小鼠单次肌肉注射给予15价肺炎球菌结合物组合1ml剂量，给药局部肌纤维间质出现与佐剂对照组相似的异物肉芽肿样结节，但对肌纤维实质无明显影响，小鼠未出现其他明显异常反应，也未引起动物死亡，急性中毒靶器官未明显显示。
实施例7：15价肺炎球菌结合物组合长期毒性实验
SD大鼠连续5次(每次间隔1月，以28天计)分别肌肉注射给予15价肺炎球菌结合物组合0.125ml、0.5ml/(鼠.次)剂量、铝佐剂对照0.5ml/(鼠.次)，在整个试验期间大鼠未出现明显的毒副反应，也未引起动物死亡。对雌雄大鼠的摄食和体重增长无明显影响，基本与正常对照组【0.9％NaCl注射液0.5ml/(鼠.次)】大鼠相似。给药中期(第3次给药后两周)、停药检查(第5次给药后两周)、恢复期结束(停药检查后四周)检查结果显示：对大鼠血液生化学、血液学指标和大鼠脏器重量及系数均无明显影响。大体观和组织病理学检查发现：给予15价肺炎球菌结合物组合0.125ml、0.5ml/(鼠.次)剂量和佐剂对照组所有大鼠给药部位均出现由供试品沉积引起的异物肉芽肿样结节和淋巴结反应性增生变化，其中0.5ml/(鼠.次)剂量组最为明显，0.125ml/(鼠.次)剂量组与佐剂对照组程度相似，同一试验组比较给药中期和停药检查给药部位变化相似，恢复期结束检查呈减轻趋势，但对给药部位肌纤维实质无明显影响；正常对照组大鼠给药部位未出现类似变化，对其他组织脏器未见明显因供试品引起的病理形态学和组织学改变。
给药前、给药中期、停药检查、恢复期结束对大鼠进行免疫原性检查，结果显示：大鼠给予15价肺炎球菌结合物组合0.125ml、0.5ml/(鼠.次)剂量，给药中期、停药检查、恢复期结束检查均可检测到不同水平的“1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F、23F型肺炎球菌”特异性抗体，两剂量组间的抗药物抗体滴度平均值基本无明显差异；两剂量组大鼠给药后的抗药特异性抗体滴度平均值均高于给药前和佐剂对照组、正常对照组(P<0.01或0.05)。在本试验剂量条件下，SD大鼠连续5次(每次间隔1月，以28天计)肌肉注射15价肺炎球菌结合物组合，大鼠给药后的抗药特异性抗体滴度有明显升高；大鼠给药部位出现对肌纤维实质无明显影响的异物肉芽肿样结节、淋巴结反应性增生变化，恢复期结束检查给药部位变化呈减轻趋势。中毒剂量和中毒靶器官未明显显示。

Claims (10)

1.一种含有2型和12F型血清型的15价肺炎球菌结合物组合疫苗，所述疫苗是由以下15种肺炎球菌结合物组合制备而成，所述15种肺炎球菌结合物为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F血清型肺炎球菌荚膜多糖与生理上可接受的载体蛋白质制备而成，15种肺炎球菌结合物的重量比例为1：1-1：2之间。
2.根据权利要求1所述的组合疫苗，其特征在于，其中，所述生理上可接受的载体蛋白质选自：白喉类毒素(DT)及其交叉反应物质(CRM)，破伤风类毒素(TT)、百日咳类毒素(PT)、霍乱毒素B亚单位、不耐热大肠杆菌肠毒素(LT)、耐热大肠杆菌肠毒素(ST)、绿脓杆菌外毒素A(EPA)；外膜蛋白复合物(OMPC)、肺炎球菌溶血素(PLY)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白A(PsaA)、流感嗜血杆菌蛋白D。
3.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中，单位剂量的组合疫苗中，各型荚膜多糖的含量为0.1-10μg。
4.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中，单位剂量的组合疫苗中，各型荚膜多糖的含量为0.5-5μg。
5.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中，单位剂量的组合疫苗中，各型荚膜多糖的含量为1-4μg。
6.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中，单位剂量的组合疫苗中，各型荚膜多糖含量组合为1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F各2μg，6B是4μg。
7.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中，还包括疫苗制剂所需要的必要辅料。
8.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中，还包括疫苗制剂所需要的必要辅料。选自佐剂，缓冲液，稳定剂，分散剂。
9.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中，所述的佐剂选自铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝，水包油或细菌细胞壁成份，如MF59、SAE、RAS，或者皂角类佐剂，如Quil A、QS-21，或者细菌脂多糖或合成类脂A佐剂，细胞因子，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、共刺激分子B7-1、B7-2，或者毒素亚单位类佐剂，如霍乱毒素及亚单位、百日咳毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)。
所述的缓冲液选自磷酸缓冲液，Tris缓冲液，生理氯化钠溶液。
所述稳定剂选自组氨酸，优选L-组氨酸，
所述分散剂选自多聚山梨醇酯，优选Tween80。
10.根据权利要求2所述的组合疫苗，其特征在于，其中结合物中1、2、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F和23F多糖含量2μg/ml，6B多糖含量4μg/ml，另含有100μg/ml的白喉类毒素，含有0.25mg/ml的铝离子，含有0.85％的氯化钠。
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