CN108430500B - 用于针对肠外致病性大肠杆菌的免疫保护的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

描述了用于诱导针对肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）的免疫应答的组合物和方法，从而提供针对与ExPEC相关的疾病的免疫保护。特别地，描述了关于使用与铜绿假单胞菌（EPA）载体蛋白的解毒外毒素A共价结合的大肠杆菌多糖抗原O25B、O1A、O2和O6A的缀合物作为疫苗的组合物和方法，用于预防由ExPEC血清型O1A、O2、O6A和O25B引起的侵袭性ExPEC疾病。

Description

用于针对肠外致病性大肠杆菌的免疫保护的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119（e）要求于2015年8月24日提交的美国临时专利申请号62/209,091、以及于2015年8月27日提交的美国临时专利申请号62/210,655的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容以引用的方式全文并入本文。

发明领域

本发明涉及用于诱导针对肠外致病性大肠杆菌（Escherichia coli）（ExPEC）的免疫应答的组合物和方法，从而提供针对与ExPEC相关的疾病的免疫保护。特别地，本发明的实施方案涉及多价疫苗以及该疫苗提供针对ExPEC感染的有效免疫保护的用途，所述多价疫苗含有各自与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）载体蛋白的解毒外毒素A共价结合的大肠杆菌多糖抗原O25B、O1A、O2和O6A的缀合物。

发明背景

肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是人肠道的通常无害的居住者。然而，ExPEC菌株可以具有毒力因子用于定居和感染胃肠道外的部位，以引起不同的严重侵袭性疾病，每年导致显著的发病率、死亡率和成本（参见例如Johnson等人，J Lab Clin Med. 2002；139（3）:155-162；Kohler等人，Int J Med Microbiol. 2011；301（8）:642-647；Foxman，Am J Med.2002；113 Suppl 1A:5S-13S；和Russo等人，Microbes Infect. 2003；5（5）:449-456）。ExPEC菌株是泌尿道感染（UTI）最常见的原因。它们也是手术部位感染和新生儿脑膜炎的促成因素（Johnson等人，2002；和Russo等人，2003），与腹部和盆腔感染以及医院性肺炎有关，并且偶尔涉及其他肠外感染如骨髓炎、蜂窝织炎和伤口感染。所有这些主要感染部位都可以导致ExPEC菌血症（Russo等人，2003）。

对抗生素的细菌抗性是针对细菌感染的战斗中的主要问题，并且多药抗性（MDR）大肠杆菌菌株变得越来越普遍（参见例如Schito等人，2009，Int. J. Antimicrob. Agents34（5）:407-413；和Pitout等人，2012，Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10（10）:1165-1176）。ExPEC序列131型的出现和快速全球传播被视为增加的药物抗性包括多药抗性的主要驱动因素（Johnson等人，Antimicrob Agents Chemother. 2010；54（1）:546-550；Rogers等人，J Antimicrob Chemother. 2011；66（1）:1-14）。该克隆在所有ExPEC临床分离株的12.5%至30%中发现，主要显示出血清型O25B:H4，并且显示高水平的氟喹诺酮抗性，其通常伴随有甲氧苄啶/磺胺甲噁唑抗性（Rogers等人，2011和Banerjee等人，Antimicrob AgentsChemother. 2014；58（9）:4997-5004）。

O-抗原血清型基于O多糖抗原的化学结构，所述O多糖抗原是革兰氏阴性菌中的脂多糖（LPS）的外膜部分。已报道了超过180种大肠杆菌O-抗原（Stenutz等人，FEMSMicrobial Rev. 2006；30: 382-403）。ExPEC感染可以由任何血清型引起。尽管在ExPEC感染中存在某些血清型的过度呈现，但来自ExPEC分离株的表面多糖仍显示出相当大的抗原性多样性，这使得基于表面多糖的ExPEC疫苗的开发极具挑战性（Russo等人，Vaccine.2007；25: 3859-3870）。另外，某些O-抗原可能具有弱免疫原性。此外，基于来自肺炎球菌缀合物疫苗的研究，当许多血清型可以引起疾病时，疫苗组合物如用于包括在疫苗中的血清型的选择以及所包括的血清型的剂量水平可能是关键的，因为使用针对某些血清型的疫苗可能潜在地增加来自未包括在疫苗中的血清型的携带和疾病，或甚至包括在疫苗中但仅在针对血清型的免疫中微弱地有效（Lipsitch，Emerging Infectious Diseases；1999，5:336-345）。理想地，疫苗应该最大化其在由疫苗中包括的血清型引起的疾病预防中的有益效应，同时最小化来自增加的非疫苗血清型携带的额外疾病的风险。

相应地，本领域存在针对ExPEC的疫苗的需要。具体地，存在基于表面多糖的ExPEC疫苗的需要，所述ExPEC疫苗可以用于提供针对ExPEC O25B血清型和ExPEC中普遍存在的其他血清型的有效免疫保护。

发明概述

已惊讶地发现，当作为各自与铜绿假单胞菌（EPA）载体蛋白的解毒外毒素A共价结合的O-抗原缀合物进行共价测试时，大肠杆菌O25B抗原看起来比其他大肠杆菌O-抗原（例如O1A、O2和O6A）具有略微较低的免疫原性，并且具有含有大肠杆菌O25B抗原的EPA缀合物和一种或多种另外的大肠杆菌O-抗原的EPA缀合物的组合物以适当剂量和比率的疫苗接种，提供了针对ExPEC O25B血清型和一种或多种另外的ExPEC O-血清型的改善的免疫应答。

相应地，在一个一般方面，本发明涉及组合物，其包含以8至48 μg/ml的第一浓度的大肠杆菌O25B抗原和以第二浓度的至少一种另外的大肠杆菌O抗原，所述第二浓度为第一浓度的10%至100%，其中大肠杆菌O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合，并且所述组合物在有此需要的个体中有效诱导针对大肠杆菌O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O抗原的免疫应答。在一个优选实施方案中，至少一种另外的大肠杆菌O-抗原以至少5 μg/ml的第二浓度，更优选以至少8 μg/ml的第二浓度存在。

在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含以10至36 μg/ml的第一浓度的大肠杆菌O25B抗原和选自以下的至少一种另外的大肠杆菌O抗原：大肠杆菌O1A抗原、大肠杆菌O2抗原和大肠杆菌O6A抗原，其中另外的大肠杆菌O抗原各自具有的浓度独立地为组合物中的大肠杆菌O25B抗原的第一浓度的50%至100%，并且大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。

在一个优选实施方案中，本发明涉及组合物，其包含以10至36 μg/ml的第一浓度的大肠杆菌O25B抗原。以及第二浓度的各大肠杆菌O1A抗原、E.大肠杆菌O6抗原和大肠杆菌O6A抗原，其中大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合，并且第一浓度与第二浓度的比率为1:1至2:1。

优选地，组合物包含重量比为1:1:1:1或2:1:1:1的大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖。更优选地，组合物包含16或32 μg/ml的O25B抗原。

在另一个一般方面，本发明涉及在有此需要的个体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）的免疫应答的方法。该方法包括向个体施用以4至24 μg/施用的第一有效量的大肠杆菌O25B抗原，以及以第二有效量的至少一种另外的大肠杆菌O-抗原，所述第二有效量为第一有效量的10%至100%，其中大肠杆菌O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合，并且所述施用在个体中有效诱导针对大肠杆菌O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O-抗原的免疫应答。在一个优选实施方案中，至少一种另外的大肠杆菌O-抗原以至少3 μg/施用的第二有效量，更优选以至少4 μg/施用的第二有效量施用。大肠杆菌O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O-抗原可以在一种组合物中施用或由多重组合物以组合施用。

在一个实施方案中，本发明涉及在有此需要的个体中诱导针对ExPEC的免疫应答的方法，其包括向个体施用以5至18 μg/施用，更优选8至16 μg/施用的第一有效量的大肠杆菌O25B抗原，以及选自大肠杆菌O1A抗原、大肠杆菌O2抗原和大肠杆菌O6A抗原的至少一种另外的大肠杆菌O抗原，其中另外的大肠杆菌O-抗原各自以有效量施用，所述有效量独立地为大肠杆菌O25B抗原的第一有效量的50%至100%，并且大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。

在一个优选实施方案中，本发明涉及在有此需要的个体中诱导对ExPEC的免疫应答的方法，其包括向个体施用以5至18 μg/施用，更优选8至16 μg/施用的第一有效量的大肠杆菌O25B抗原，以及第二有效量的各大肠杆菌O1A抗原、大肠杆菌O2抗原和大肠杆菌O6A抗原，其中大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合，并且第一有效量与第二有效量的比率为1:1至2:1。优选地，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原以1:1:1:1或2:1:1:1的剂量比施用，并且大肠杆菌O25B抗原以5 μg、8 μg或16 μg/施用进行施用。在一个优选实施方案中，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原在一种组合物中，更优选地，在包含大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原（所述抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合）的组合物中施用，其中所述组合物中这些O-抗原的浓度分别选自16:8:8:8 μg/ml（即，16 μg/mlO25B抗原、8 μg/ml O1A抗原、8 μg/ml O2抗原和8 μg/ml O6A抗原）、16:16:16:16 μg/ml、32:16:16:16 μg/ml和32:32:32:32 μg/ml。优选地，将0.5 ml这样的组合物施用于个体，以实现分别以8:4:4:4 μg（即，8 μg O25B抗原、4 µg O1A抗原、4 µg O2抗原和4 µg O6A抗原）、8:8:8:8 µg、16:8:8:8 µg或16:16:16:16 µg大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原/施用的剂量。

根据一个优选实施方案，由本发明的方法诱导的免疫应答预防在有此需要的人个体中由ExPEC血清型O1A、O2、O6A和O25B引起的侵袭性ExPEC疾病。与ExPEC或ExPEC疾病相关的疾病包括但不限于尿道感染、手术部位感染、菌血症、腹部或盆腔感染、肺炎、医院性肺炎、骨髓炎、蜂窝织炎、肾盂肾炎、伤口感染、脑膜炎、新生儿脑膜炎、腹膜炎、胆管炎、软组织感染、化脓性肌炎、脓毒性关节炎和脓毒症。优选地，人个体是患有或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中的高危人个体，例如老年人、住院患者、人儿童、免疫受损的人、孕妇、患有糖尿病或伤口创伤的人、最近有过手术或预定具有手术的人等。

根据本发明的一个实施方案，O-抗原各自在糖基化序列的Asn残基处与EPA载体蛋白共价结合，所述糖基化序列包含Asp（Glu）-X-Asn-Z-Ser（Thr）（SEQ ID NO：3），其中X和Z独立地选自除了Pro以外的任何天然氨基酸。在一个优选实施方案中，EPA载体蛋白包含SEQID NO：1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，O-抗原以1:7至1:2，优选1:5至1:2的多糖/蛋白重量比与EPA载体蛋白共价结合。例如，在根据本发明的一个实施方案的O-抗原/EPA缀合物中，O-抗原的重量可以是EPA重量的15%至50%、或20%至40%。

本发明的另一个方面涉及制备根据本发明实施方案的组合物的方法，所述方法包括将大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原在一种组合物组合，所述抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。

本发明的又一个方面涉及根据本发明实施方案的组合物用于制备疫苗或药剂的用途，所述疫苗或药剂用于在有此需要的个体中诱导针对ExPEC的免疫应答或者用于预防或治疗与ExPEC相关的疾病。

附图简述

当结合附图阅读时，前述概述以及本发明的下述详细描述将得到更好地理解。应该理解，本发明并不限于附图中所示的确切实施方案。

在附图中：

图1是糖缀合物疫苗生产平台的示例性表示：宿主细胞的细胞质（以灰色标记）含有在宿主细胞的周质（以白色标记）中重组生产O-抗原/EPA缀合物所必需的所有DNA构建体；

图2是蛋白质糖基化过程的详细图示；

图3A-3C描绘了与免疫后42天（实心方块）相比，用衍生自预先免疫接种的大鼠的血清（空心圆圈）获得的调理指数（OI），所述预先免疫接种具有所示剂量的单价疫苗的一个引发剂量和两个加强剂量；图3A：O2-EPA免疫接种；图3B：O6A-EPA免疫接种；和图3C：O25B-EPA免疫接种；

图4显示了用来自由安慰剂或四价疫苗接种疫苗的人个体的血清获得的ELISA滴度，所述四价疫苗包含以4 μg多糖/血清型的大肠杆菌抗原O1A、O2、O6A和O25B；仅在接种疫苗的组中观察到在注射后（注射后30天）和注射前（第1天）之间的ELISA滴度中的显著增加（配对t检验；*表示统计学显著性，其中多个*表示增加程度的显著性(****P < 0.0001)；ns，无显著性差异；箱式图中值，5%和95%百分位数）。

图5A-5D描绘了用衍生自由四价疫苗接种疫苗的人个体的血清获得的OI，所述四价疫苗包含以4 μg多糖/血清型的大肠杆菌抗原O1A、O2、O6A和O25B；免疫应答如通过针对安慰剂和四价疫苗的组分的OI指示；图5A：O1A-EPA；图5B：O2-EPA；图5C：O6A-EPA；和图5D：O25B-EPA；仅在接种疫苗的组中观察到在注射后和注射前之间的OI中的显著增加（对数转化值的配对t检验；显著性通过*指示，多个*表示增加程度的显著性(****P < 0.0001)）；ns，无显著性差异；箱式图中值，5%和95%百分位数。

发明详述

在背景和说明书自始至终引用或描述了各种出版物、论文和专利；这些参考文献各自通过引用整体并入本文。已包括在本说明书中的文件、动作、材料、装置、论文等等的讨论用于提供本发明的背景的目的。此类讨论并非任何或所有这些事项构成关于所公开或请求保护的任何发明的现有技术的部分的承认。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。否则，本文引用的某些术语具有如在说明书中设定的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请和出版物通过引用并入，如同它在本文完全阐述一样。必须注意，除非上下文另有明确说明，否则如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。

如本文使用的，术语“O多糖”、“O-抗原”、“O抗原”、“O-抗原多糖”、“O-多糖抗原”和缩写“OPS”都是指革兰氏阴性菌的O抗原，其是脂多糖（LPS）的组分，并且对于革兰氏阴性菌的每种血清型或血清（亚）型都是特异性的。O抗原通常含有2至7个糖残基的重复单位（RU）。如本文使用的，RU设定为等于生物重复单位（BRU）。BRU描述了在体内合成的O-抗原的RU。

如本文使用的，术语“缀合物”和“糖缀合物”都是指含有与载体蛋白共价结合的大肠杆菌O抗原的缀合产物。缀合物可以是生物缀合物，其是在宿主细胞中制备的缀合产物，其中宿主细胞机制产生O抗原和载体蛋白，并且例如经由N-连接将O抗原与载体蛋白连接。缀合物也可以通过其他方式，例如通过蛋白质和糖抗原的化学连接进行制备。

如本文使用的，在根据本发明的实施方案的方法中将O抗原施用于个体的上下文中的术语“有效量”是指足以在个体中诱导所需免疫效应或免疫应答的O抗原的量。在某些实施方案中，“有效量”是指足以在个体中产生免疫的O抗原的量，以在个体中实现下述效应中的一种或多种：（i）预防ExPEC感染，优选侵袭性ExPEC疾病或与其相关的症状的发展或发作；（ii）预防ExPEC感染，优选侵袭性ExPEC疾病或与其相关的症状的复发；（iii）预防、减轻或改善ExPEC感染，优选侵袭性ExPEC疾病或与其相关的症状的严重性；（iv）减少ExPEC感染，优选侵袭性ExPEC疾病或与其相关的症状的持续时间；（v）预防ExPEC感染，优选侵袭性ExPEC疾病或与之相关的症状的进展；（vi）引起ExPEC感染或与之相关的症状的消退；（vii）预防或减少与ExPEC感染相关的器官衰竭；（viii）减少患有ExPEC感染的个体的住院机会或频率；（ix）减少患有ExPEC感染的个体的住院时间；（x）增加具有ExPEC感染，优选侵袭性ExPEC疾病的个体的存活；（xi）消除ExPEC感染，优选侵袭性ExPEC疾病；（xii）抑制或减少ExPEC复制；和/或（xiii）增强或改善另一种疗法的预防或治疗效应。

“有效量”可以取决于各种因素而变化，所述因素例如个体的身体状况、年龄、重量、健康等；施用途径，如经口或肠胃外；施用的组合物，如靶O抗原、其他共施用的O抗原，佐剂等；和对于其需要免疫的特定疾病。当O抗原与蛋白质载体共价结合时，O抗原的有效量仅基于缀合物中的O抗原多糖部分进行计算。

如本文使用的，在向个体施用两种或更多种O抗原或组合物的上下文中，术语“组合”不限制其中O抗原或组合物施用于个体的次序。例如，第一种组合物可以在第二种组合物施用于个体之前（例如前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周）、伴随或之后（例如后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周）施用。

如本文使用的，“个体”意指对其将要或已通过根据本发明的实施方案的方法或组合物接种疫苗的任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文使用的，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，最优选人。在一些实施方案中，个体是人婴儿。在另一个实施方案中，个体是人儿童。在另一个实施方案中，个体是人成年人。在具体实施方案中，个体是处于风险中的人成年人。在另一个实施方案中，个体是老年人。在另一个实施方案中，个体是人婴儿，包括早产的人婴儿和足月出生的人婴儿。在另一个实施方案中，个体是人幼儿。术语“个体”和“患者”在本文中可以互换使用。

如本文使用的，术语“早产的人婴儿”是指在小于37周胎龄出生的人婴儿。

如本文使用的，术语“人婴儿”是指新生儿至1岁的人。

如本文使用的，术语“人幼儿”是指1岁至3岁的人。

如本文使用的，术语“人儿童”是指1岁至18岁的人。

如本文使用的，术语“人成年人”是指18岁或更年长的人。

如本文使用的，术语“高危人成年人”是指比平均人成年人群体更易于感染ExPEC的18岁或更年长的人。“高危的人成年人”的实例包括但不限于老年人、免疫受损的人、孕妇、患有糖尿病或伤口创伤的人、最近有过手术或预定具有手术的人等。

如本文使用的，术语“老年人”是指55，优选60，更优选65岁或更年长的人。

如本文使用的，“侵袭性ExPEC疾病”定义为来自存在与细菌感染一致的急病的个体中的正常无菌身体部位的ExPEC分离和鉴定。

如本文使用的，对抗原或组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是指个体中对抗原或存在于组合物中的抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。

已惊讶地发现，在本发明中，与EPA载体蛋白缀合的大肠杆菌O25B抗原看起来比与EPA载体蛋白缀合的其他大肠杆菌O-抗原（例如，O1A、O2和O6A）更少免疫原性。这一发现导致进一步研究大肠杆菌O25B抗原的剂量和多价疫苗内各种大肠杆菌O抗原的剂量比，因此开发基于大肠杆菌O抗原的多价疫苗和免疫接种方法用于改善针对O25B血清型和ExPEC其他血清型的免疫应答。

流行病学

对引起ExPEC疾病的大肠杆菌的血清型分布的研究指示，10种占优势的O血清型可以覆盖估计的60-80%的ExPEC感染，假设覆盖不可分型菌株的子部分。参见例如下表1A-1C。在UTI和菌血症靶向群体中，血清型O1、O2、O6和O25被鉴定为四种最普遍的大肠杆菌血清型，其中血清型O25是菌血症中最普遍的大肠杆菌血清型。还发现，对于由不同、但结构和抗原上相关的亚型组成的O抗原血清型，一种亚型在临床分离株中可能比其他亚型更普遍。例如，O1A、O6A和O25B抗原被确定为分别对于O1、O6和O25血清型分析的更近期的临床株或分离株中更频繁的亚型。参见国际专利申请号PCT/EP2015/053739中关于流行病学研究的相关公开内容，所述国际专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。

表1A：来自2012年在瑞士收集的1841份尿样品的集合中最常见的UTI相关大肠杆菌血清型的分布。显示了来自671个个体的相关亚群的样品的血清型分布，以及来自所有**样品的分布。

表1B：来自范围为1987- 2011年的所选文献和来自2000-2011年（ECRC）的回顾性分析的美国数据的最常见UTI相关血清型的流行率。

表1C：在2011-2013年期间在美国和EU收集的860个血液分离物的集合中最常见的菌血症相关的大肠杆菌O-血清型的分布。指示的是样品的相对O-血清型分布。

新型O25凝集克隆近期已在从医院环境中分离的大肠杆菌中出现，并且这被命名为O25B。对于O-血清型O25，使用通过PCR的亚型分型分析发现绝大多数实际上是O25B亚型（在具有O25凝集阳性表型的24个测试的临床分离株的研究中，20个被分配到O25B亚型，而剩余的4个被分配到O25A亚型，并且随后在研究的菌血症群体中，57个研究的O25血清型分离株中的56个可分型为O25B）。已证实，自体抗血清比非自体抗原更好地识别自体抗原，并且因此将O25B抗原包含在疫苗中可以提供针对O25群的占优势O25B临床株比包括O25A抗原的更好保护（参见例如国际专利申请号PCT/EP2015/053739）。结果显示O25B疫苗可以产生与O25A抗原交叉反应的血清，因此也提供针对O25A血清型的免疫应答（同上）。根据本发明实施方案的组合物包含与EPA载体蛋白缀合的大肠杆菌O25B抗原和与EPA载体蛋白缀合的其他大肠杆菌O-抗原。

包含大肠杆菌O抗原缀合物的组合物

在一个一般方面，本发明涉及含有主要在大肠杆菌临床分离株中发现的O-抗原血清型的多价疫苗，其可以用于提供主动免疫用于预防由具有疫苗中含有的O-抗原血清型的ExPEC引起的疾病。在一个实施方案中，本发明涉及包含以8至48 μg/ml的第一浓度的大肠杆菌O25B抗原和以第二浓度的至少一种另外的大肠杆菌O抗原，所述第二浓度为第一浓度的10%至100%，其中大肠杆菌O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。

优选地，在根据本发明的实施方案的组合物中使用的至少一种另外的大肠杆菌O抗原在大肠杆菌临床分离株中普遍存在。此类另外的O抗原的实例包括但不限于大肠杆菌O1、O2、O4、O6、O7、O8、O15、O16、O18、O21、O73、O75和O153抗原。根据需要，组合物可以包括超过一种另外的大肠杆菌O抗原，例如2、3、4、5、6、7、8或9种另外的大肠杆菌O抗原，以提供针对除大肠杆菌O25B血清型之外的多重大肠杆菌血清型的免疫保护。在一个优选实施方案中，另外的大肠杆菌O-抗原选自大肠杆菌O1、O2和O6抗原。更优选地，另外的大肠杆菌O-抗原选自大肠杆菌O1A、O2和O6A抗原。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含以10至36 μg/ml的第一浓度的大肠杆菌O25B抗原以及大肠杆菌O1A、O2和O6A抗原，其各自的浓度独立地为第一浓度的10%至100%，其中大肠杆菌O25B抗原和另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。在一个优选实施方案中，大肠杆菌O1A、O2和O6A抗原各自独立地以至少5 μg/ml的浓度，更优选以至少8 μg/ml的浓度存在。

根据本发明实施方案的组合物含有大肠杆菌O25B抗原，其浓度等于或高于组合物中任何另外的O抗原的浓度。例如，组合物可以具有以例如10、16、24、32或36 μg/ml的第一浓度的大肠杆菌O25B抗原以及一种或多种另外的大肠杆菌O-抗原，其各自的浓度为第一浓度的例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。当组合物含有超过一种另外的O抗原时，所有另外的O抗原都可以具有与组合物中大肠杆菌O25B抗原浓度的10至100%相同的浓度。可替代地，另外的O抗原也可以具有不同的浓度，其各自独立地为大肠杆菌O25B抗原浓度的10-100%。优选地，组合物包含32 μg/ml大肠杆菌O25B抗原和独立地16-32 μg/ml一种或多种另外的O抗原，其中大肠杆菌O25B抗原和另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。在另一个优选实施方案中，组合物包含16 μg/ml大肠杆菌O25B抗原，和独立地8 μg/ml至16 μg/ml的一种或多种另外的O抗原，其中大肠杆菌O25B抗原和另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。

在一个优选实施方案中，本发明涉及组合物，其包含以10至36 μg/ml的第一浓度的大肠杆菌O25B抗原。以及第二浓度的各大肠杆菌O1A抗原、E.大肠杆菌O6抗原和大肠杆菌O6A抗原，其中大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合，并且第一浓度与第二浓度的比率为1:1至2:1。

优选地，组合物包含重量比为1:1:1:1或2:1:1:1的大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原，并且组合物包含32 μg/ml大肠杆菌O25B抗原，其中O-抗原各自与EPA载体蛋白共价结合。在另一个优选实施方案中，组合物包含重量比为1:1:1:1或2:1:1:1的大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原，并且组合物包含16 μg/ml大肠杆菌O25B抗原，其中O-抗原各自与EPA载体蛋白共价结合。更优选地，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原各自独立地与具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的EPA载体蛋白共价结合，并且各种O-抗原和EPA载体蛋白缀合物在细胞中制备，即是生物缀合物。最优选地，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原分别包含下文描述的式O25B’、式O1A’、式O2’和式O6A’的结构。

本文所述的组合物可用于治疗和预防用个体（例如人个体）由ExPEC的感染。在某些实施方案中，除包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O-抗原之外，本文所述的组合物还包含药学上可接受的载体。如本文使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的，或者在美国药典或其他一般公认的药典中列出的用于动物并且更特别地用于人中。如本文在药学上可接受的载体的上下文中使用的，术语“载体”是指药物组合物与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及水性葡萄糖溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。合适的药物载体的实例在通过E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述。

在一个具体实施方案中，本文提供了组合物，其包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原，以及各自与EPA载体蛋白共价结合的一种或多种另外的大肠杆菌O抗原。

在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物，其包含（i）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原的生物缀合物，和（ii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原的生物缀合物。

在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物，其包含（i）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原的生物缀合物，和（ii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原的生物缀合物。

在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物，其包含（i）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原的生物缀合物，和（ii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O6A抗原的生物缀合物。

在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物，其包含含有与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原的大肠杆菌O25B生物缀合物，以及选自下述的两种或更多种生物缀合物：（i）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原的大肠杆菌O1A生物缀合物；（ii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原的大肠杆菌O2生物缀合物；和（iii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O6A抗原的大肠杆菌O6A生物缀合物。

在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含：（i）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原的大肠杆菌O25B生物缀合物；（ii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原的大肠杆菌O1A生物缀合物；（iii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原的大肠杆菌O2生物缀合物；和（iv）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O6A抗原的大肠杆菌O6A生物缀合物，其中（i）、（ii）、（iii）和（iv）在单一制剂中配制。

在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含：（i）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原的大肠杆菌O25B生物缀合物；（ii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原的大肠杆菌O1A生物缀合物；（iii）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原的大肠杆菌O2生物缀合物；和（iv）包含与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O6A抗原的大肠杆菌O6A生物缀合物，其中（i）、（ii）、（iii）和（iv）在各个组合物中配制，所述各个组合物根据本发明实施方案的方法组合施用。

在某些实施方案中，前述组合物任选地包含共价连接至除了大肠杆菌O1A、O2、O6A和O25B以外的大肠杆菌O抗原的EPA载体蛋白。其他大肠杆菌O抗原包括但不限于上表1A-1C中列出的另外的O抗原。

本文提供的组合物可以用于引发组合物施用于其的宿主中的免疫应答，即是免疫原性的。因此，本文所述的组合物可以用作针对ExPEC感染的疫苗，并且可以包含适用于疫苗中的任何另外组分。在一个具体实施方案中，本文所述的组合物是多价制剂，例如包含O25B、O1A、O6A和O2血清型/血清亚型的大肠杆菌O-抗原的生物缀合物的至少四价制剂。

在某些实施方案中，本文所述的组合物另外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一个具体实施方案中，本文所述的药物组合物包含0.001%至0.01%硫柳汞。在其他实施方案中，本文所述的药物组合物不包含防腐剂。

在某些实施方案中，本文所述的组合物（例如免疫原性组合物）包含佐剂或与佐剂组合施用。用于与本文所述的组合物组合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，术语“佐剂”是指这样的化合物，当与本文所述组合物结合或作为本文所述组合物的部分施用时，其增大、增强和/或加强对于生物缀合物的免疫应答，但当单独施用时，佐剂化合物不生成对于生物缀合物的免疫应答。在一些实施方案中，佐剂生成对于多聚生物缀合物肽的免疫应答，并且不产生过敏反应或其他不利反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，所述机制包括例如淋巴细胞募集、B和/或T细胞的刺激以及巨噬细胞的刺激。在某些优选实施方案中，本文所述的组合物不包含除生物缀合物之外的佐剂，和/或不与除生物缀合物之外的佐剂组合施用（在生物缀合物将包含一些固有的佐剂性质的情况下，这些将被忽视，并且在这些实施方案中将不添加外部佐剂）。

佐剂的具体实例包括但不限于铝盐（明矾）（例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝）、3脱-O-酰化的单磷酰脂质A（MPL）（参见英国专利GB2220211）、MF59（Novartis）、AS03（GlaxoSmithKline）、AS04（GlaxoSmithKline）、聚山梨醇酯80（Tween 80；ICL Americas，Inc.）、咪唑并吡啶化合物（参见国际申请号PCT/US2007/064857，作为国际公开号WO2007/109812公开）、咪唑并喹喔啉化合物（参见国际申请号PCT/US2007/064858，作为国际公开号WO2007/109813公开）和皂苷例如QS21（参见Kensil等人，Vaccine Design: The Subunitand Adjuvant Approach（编辑Powell & Newman，Plenum Press，NY，1995）；美国专利号5,057,540）。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂（完全或不完全）。其他佐剂是水包油乳剂（例如角鲨烯或花生油），任选地与免疫刺激剂例如单磷酰脂质A组合（参见Stoute等人，1997，N. Engl. J. Med. 336，86-91）。另一种佐剂是CpG（Bioworld Today，1998年11月15日）。

在某些实施方案中，本文所述的组合物配制为适合于对个体的预期施用途径。例如，本文所述的组合物可以配制为适合于皮下、肠胃外、经口、皮内、透皮、结肠直肠、腹膜内和直肠施用。在一个具体实施方案中，药物组合物可以配制用于静脉内、经口、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、透皮或肺部施用。在某些实施方案中，本文所述的组合物通过肌内注射施用。

在某些实施方案中，本文所述的组合物另外包含一种或多种缓冲剂，例如Tris-缓冲盐水、磷酸盐缓冲液和蔗糖磷酸盐谷氨酸盐缓冲液。

在某些实施方案中，本文所述的组合物另外包含一种或多种盐，例如Tris-盐酸盐、氯化钠、氯化钙、氯化钾、磷酸钠、谷氨酸一钠和铝盐（例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾（硫酸铝钾）或这些铝盐的混合物）。在一个实施方案中，本发明的组合物包含在Tris缓冲盐水（TBS）pH 7.4（例如分别含有Tris、NaCl和KCl，例如分别以25 mM、137 mM和2.7 mM）的本文所述的生物缀合物。

本文所述的组合物可以连同用于施用的说明书一起包括在容器、包装或分配器中。

本文所述的组合物可以在使用前贮存，例如组合物可以冷冻贮存（例如在约-20℃或约-70℃下）；贮存在冷藏条件下（例如在约4℃下）；或贮存在室温下。

方法/用途

在另一个一般方面，本发明涉及在有此需要的个体中诱导针对ExPEC的免疫应答的方法。优选地，免疫应答有效预防或治疗有此需要的个体中与ExPEC相关的疾病。该方法包括向个体施用以4至24 μg/施用的第一有效量的大肠杆菌O25B抗原，以及以第二有效量的至少一种另外的大肠杆菌O抗原，所述第二有效量为所述第一有效量的10%至100%，其中所述大肠杆菌O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合，并且所述组合物有效诱导针对大肠杆菌的免疫应答O25B抗原和至少一种另外的大肠杆菌O-抗原的免疫应答。

优选地，本发明的方法和用途中使用的至少一种另外的大肠杆菌O抗原在大肠杆菌临床分离株中普遍存在。此类另外的O抗原的实例包括但不限于大肠杆菌O1、O2、O4、O6、O7、O8、O15、O16、O18、O21、O73、O75和O153抗原。根据需要，可以施用超过一种另外的大肠杆菌O抗原，例如2、3、4、5、6、7、8或9种另外的大肠杆菌O抗原，以提供针对除大肠杆菌O25B血清型之外的多重大肠杆菌血清型的免疫保护。

在一个优选实施方案中，本发明的方法在有此需要的个体中诱导针对ExPEC血清型O25的免疫应答，以及选自大肠杆菌O1、O2和O6抗原的一种或多种另外的大肠杆菌O-抗原。优选地，本发明的方法在有此需要的个体中诱导针对ExPEC血清型O25B以及选自大肠杆菌O1A、O2和O6A抗原的一种或多种另外的大肠杆菌O-抗原的免疫应答。该方法包括向有此需要的个体施用以5至18 μg/施用的第一有效量的大肠杆菌O25B抗原，以及大肠杆菌O1A、O2和O6A抗原，各自以独立地为第一有效量的10%至100%的有效量，其中大肠杆菌O25B抗原和另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。在一个优选实施方案中，大肠杆菌O1A、O2和O6A抗原各自以至少3 μg/施用的有效量，更优选以至少4 μg/施用的有效量独立施用。

在根据本发明的一个实施方案的方法中，施用的大肠杆菌O25B抗原的有效量等于或高于施用的任何另外的O抗原的有效量。例如，大肠杆菌O25B抗原可以以4至24 μg/施用的第一有效量施用，并且至少一种另外的大肠杆菌O-抗原可以以第二有效量施用，所述第二有效量为第一有效量的例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。当组合施用超过一种另外的O抗原时，所有另外的O抗原都可以以与大肠杆菌O25B抗原的第一有效量的10-100%相同的有效量施用。另外的O抗原还可以以不同的有效量施用，所述有效量各自独立地为大肠杆菌O25B抗原的第一有效量的10-100%。优选地，大肠杆菌O25B抗原以5 μg至18 μg的第一有效量施用，并且至少一种另外的O抗原以独立地为第一有效量的50%至100%的第二有效量施用。

在根据本发明的一个实施方案中，在有此需要的个体中诱导针对ExPEC的免疫应答的方法包括向个体施用以例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16 µg/施用的第一有效量的大肠杆菌O25B抗原，以及大肠杆菌O1A、O2和O6A抗原，其各自的有效量独立地为第一有效量的例如10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，其中大肠杆菌O25B抗原和另外的大肠杆菌O-抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合。

在一个优选实施方案中，本发明涉及在有此需要的个体中诱导针对ExPEC的免疫应答的方法，其包括向个体施用以5至18 μg/施用的第一有效量的大肠杆菌O25B抗原，以及第二有效量的各大肠杆菌O1A抗原、大肠杆菌O2抗原和大肠杆菌O6A抗原，其中大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原各自独立地与EPA载体蛋白共价结合质，并且第一有效量与第二有效量的比率为1:1至2:1。优选地，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原以1:1:1:1或2:1:1:1的剂量比施用于个体，并且大肠杆菌O25B抗原5 μg、8 μg或16 μg/施用进行施用。还优选地，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原在一种组合物中施用于个体。

本文提供了本发明组合物用于在有此需要的个体中诱导针对ExPEC的免疫应答的方法和用途，其包括向个体施用与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原，以及与EPA载体蛋白共价结合的至少一种另外的大肠杆菌O抗原。在一个具体实施方案中，本文所述的组合物用于给人个体接种疫苗，以诱导针对人个体的ExPEC感染的保护性免疫。

本文进一步提供了在有此需要的个体中诱导针对ExPEC的调理吞噬性抗体产生的方法，其包括向个体施用与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原，以及与EPA载体蛋白共价结合的至少一种另外的大肠杆菌O抗原。

在一个实施方案中，所述个体在施用时具有ExPEC感染。在另一个实施方案中，所述个体在施用时不具有ExPEC感染。由ExPEC引起的感染的实例包括但不限于尿道感染、手术部位感染、菌血症、腹部或盆腔感染、肺炎、医院性肺炎、骨髓炎、蜂窝织炎、伤口感染、脑膜炎、新生儿脑膜炎、腹膜炎、胆管炎、软组织感染、化脓性肌炎、脓毒性关节炎和脓毒症。优选地，由ExPEC引起的感染是由其抗原包括在根据本发明实施方案的组合物或方法中的ExPEC血清型引起的侵袭性ExPEC疾病。

本文所述的在个体中诱导免疫应答的方法导致个体针对由其O-抗原存在于组合物中的ExPEC菌株的感染的疫苗接种。当使用O-抗原亚型时，本发明的方法还可以诱导针对具有相似抗原性的另一种O-抗原亚型的免疫应答。

在一个具体实施方案中，由本文所述的方法或组合物诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由O25血清型的大肠杆菌引起的感染。在一个具体实施方案中，所述O25血清型是O25B。在另一个具体实施方案中，所述O25血清型是O25A。

在一个具体实施方案中，由本文所述的方法或组合物诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由O25血清型例如O25B血清型和O1血清型例如O1A血清型的大肠杆菌引起的感染。

在一个具体实施方案中，由本文所述的方法或组合物诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由O25血清型例如O25B血清型和O2血清型的大肠杆菌引起的感染。

在一个具体实施方案中，由本文所述的方法或组合物诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由O25血清型例如O25B血清型和O6血清型例如O6A血清型的大肠杆菌引起的感染。

在一个具体实施方案中，由本文所述的方法或组合物诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由O25血清型（例如O25B和/或O25A）以及下述大肠杆菌血清型中的两种或更多种的大肠杆菌引起的感染：O1（例如O1A、O1B和/或O1C）、O2和/或O6（例如O6A和/或O6GlcNAc）。

在一个具体实施方案中，由本文所述的方法或组合物诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由下述大肠杆菌血清型各自引起的感染：O25（例如O25B和/或O25A）、O1（例如O1A、O1B和/或O1C）、O2和O6（例如O6A和/或O6GlcNAc）。

在一个具体实施方案中，由本文所述的方法或组合物诱导的免疫应答有效预防和/或治疗由O25血清型例如O25B血清型和除了O1、O2、O6或O25以外的大肠杆菌血清型（包括但不限于表1A-1C中列出的另外的O血清型）的大肠杆菌引起的感染。

为了针对ExPEC感染给个体免疫接种，可以给个体施用本文所述的单一组合物，其中所述组合物包含大肠杆菌O25B抗原，以及本文所述的一种、两种、三种、四种或更多种另外的大肠杆菌O抗原，其各自与EPA载体蛋白共价结合。可替代地，为了治疗具有ExPEC感染的个体或针对ExPEC感染给个体免疫接种，可以给个体组合施用本文所述的多重组合物。例如，可以给个体施用包含与EPA载体蛋白缀合的大肠杆菌O25B抗原的组合物，与根据本发明实施方案包含另外的O抗原缀合物的两种、三种、四种或更多种组合物的施用组合。

在某些实施方案中，在本文所述组合物的施用后在个体中诱导的免疫应答有效预防或减轻起因于ExPEC感染的症状，优选至少30%，更优选至少40%，例如至少50%的由组合物施用的个体。ExPEC感染的症状可能取决于感染的性质而变化，并且可以包括但不限于：排尿困难、尿频或尿急增加、脓尿、血尿、背痛、盆腔疼痛、排尿时疼痛、发烧、寒战和/或恶心（例如在具有由ExPEC引起的泌尿道感染的个体中）；高烧、头痛、颈部僵硬、恶心、呕吐、癫痫发作、嗜睡和/或光敏感性（例如在具有由ExPEC引起的脑膜炎的个体中）；发热、心率增加、呼吸频率增加、尿排出量减少、血小板计数减少、腹痛、呼吸困难和/或心脏功能异常（例如在具有由ExPEC引起脓毒症的个体中）。

在某些实施方案中，在本文所述的组合物施用后在个体中诱导的免疫应答有效降低患有ExPEC感染的个体住院的可能性。在一些实施方案中，在本文所述的组合物施用后在个体中诱导的免疫应答有效减少患有ExPEC感染的个体住院的时间。

大肠杆菌O-抗原

本发明的实施方案涉及与大肠杆菌O25B抗原和一种或多种另外的大肠杆菌O抗原有关的组合物和方法。优选地，另外的O抗原在大肠杆菌的临床分离株中普遍存在。可以用于本发明中的大肠杆菌抗原的实例包括但不限于大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原。

如本文使用的，“大肠杆菌O25B抗原”是指对大肠杆菌O25B血清型特异性的O抗原。在一个实施方案中，大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构：

优选地，大肠杆菌O25B抗原包含式O25B’的结构：

其中式O25B或式O25B’中的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整数。在本发明的一个实施方案中，式O25B或式O25B’中的n是10-20的整数。

优选地，具有式O25B结构，更优选式O25B’结构的大肠杆菌O25B抗原群体用于根据本发明实施方案的组合物和方法中，其中群体中至少80%的大肠杆菌O25B抗原的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整数。在本发明的一个实施方案中，群体中至少80%的大肠杆菌O25B抗原的n是10-20的整数。

如本文使用的，“大肠杆菌O1抗原”是指对大肠杆菌O1血清型特异性的O抗原。在一个实施方案中，大肠杆菌O1抗原是大肠杆菌O1A抗原。

如本文使用的，“大肠杆菌O1A抗原”是指对大肠杆菌O1A血清型特异性的O抗原。在一个实施方案中，大肠杆菌O1A抗原包含式O1A的结构：

优选地，大肠杆菌O1A抗原包含式O1A’的结构：

其中式O1A或式O1A’中的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整数。在一个实施方案中，式O1A或式O1A’中的n是7-15的整数。

优选地，具有式O1A结构，更优选式O1A’结构的大肠杆菌O1A抗原群体用于根据本发明实施方案的组合物和方法中，其中群体中至少80%的大肠杆菌O1A抗原的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20。在一个实施方案中，群体中至少80%的大肠杆菌O1A抗原的n是5-15的整数。

如本文使用的，“大肠杆菌O2抗原”是指对大肠杆菌O2血清型特异性的O抗原。在一个实施方案中，大肠杆菌O2抗原包含式O2的结构：

优选地，大肠杆菌O2抗原包含式O2’的结构：

其中式O2或式O2’中的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整数。在一个实施方案中，式O2或式O2’中的n是8-16的整数。

优选地，具有式O2结构，更优选式O2’结构的大肠杆菌O2抗原群体用于根据本发明实施方案的组合物和方法中，其中群体中至少80%的大肠杆菌O2抗原的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20。在一个实施方案中，群体中至少80%的大肠杆菌O2抗原的n是5-20的整数。

如本文使用的，“大肠杆菌O6抗原”是指对大肠杆菌O6血清型特异性的O抗原。在一个实施方案中，大肠杆菌O6抗原是大肠杆菌O6A。

如本文使用的，“大肠杆菌O6A抗原”，也称为“大肠杆菌O6K2抗原”或“大肠杆菌O6Glc抗原”是指对大肠杆菌O6A血清型特异性的O抗原。在一个实施方案中，大肠杆菌O6A抗原包含式O6A的结构：

优选地，大肠杆菌O6A抗原包含式O6A’的结构：

其中β1,2键也被命名为β2键，式O6A或式O6A’中的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20的整数。在一个实施方案中，式O6A或式O6A’中的n是8-18的整数。

优选地，具有式O6A结构，更优选式O6A’结构的大肠杆菌O6A抗原群体用于根据本发明实施方案的组合物和方法中，其中群体中至少80%的大肠杆菌O6A抗原的n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20、或15至20。在一个实施方案中，群体中至少80%的大肠杆菌O6A抗原的n是5-20的整数。

在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含具有式O25B’结构的大肠杆菌O25B抗原，其中群体中至少80%的大肠杆菌O25B抗原的n是10-20的整数；具有式O1A’结构的大肠杆菌O1A抗原，其中群中至少80%的大肠杆菌O1A抗原的n是5-15的整数；具有式O2’结构的大肠杆菌O2抗原，其中群体中至少80%的大肠杆菌O2抗原的n是5-20的整数；和具有式O6A’结构的大肠杆菌O6A抗原，其中群体中至少80%的大肠杆菌O6A抗原的n是5-20的整数，其中O-抗原各自与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的EPA载体蛋白共价结合。

鉴于本公开内容，可以通过本领域已知的方法产生可用于本发明中的大肠杆菌O抗原。例如，它们可以从细胞产生，所述细胞优选对于O抗原的生物合成而优化的重组细胞。参见例如WO2006/119987、WO2009/104074、国际专利申请号PCT/EP2015/053739、Ihssen等人，2010，Microbial Cell Factories 9，61中关于大肠杆菌O抗原生物合成的核酸、蛋白质、宿主细胞、生产方法等的相关公开内容，所述参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。

EPA载体蛋白

根据本发明的实施方案，每种大肠杆菌O抗原与EPA载体蛋白共价结合（参见例如Ihssen等人，2010，Microbial Cell Factories 9，61）。各种解毒的EPA变体已在文献中得到描述，并且可以用作本文所述缀合物中的EPA载体蛋白。

在某些实施方案中，用于本文所述缀合物中的EPA载体蛋白是以使得蛋白质较少毒性和/或对糖基化更敏感的方式修饰的EPA。例如，根据Lukac等人，Infect Immun，56:3095-3098，1988和Ho等人，Hum Vaccin，2:89-98，2006，可以通过突变且缺失催化必需残基如L552V和ΔE553来实现解毒。在一个具体实施方案中，用于生成本文所述缀合物的载体蛋白是经修饰的EPA，使得载体蛋白中糖基化位点的数目以允许较低浓度的蛋白质例如在免疫原性组合物中以其生物缀合形式施用的方式进行优化。

在某些实施方案中，EPA载体蛋白是经修饰以包括通常与载体蛋白相关的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个糖基化位点（例如相对于与以其天然/自然，例如“野生型”状态的载体蛋白相关的糖基化位点的数目）的EPA。在一个具体实施方案中，糖基化位点的引入通过在EPA蛋白质的一级结构中的任何地方插入糖基化共有序列（例如Asn-X-Ser（Thr），其中X可以是除了Pro以外的任何氨基酸（SEQ ID NO：2）；或优选Asp（Glu）-X-Asn-Z-Ser（Thr），其中X和Z独立地选自除了Pro以外的任何天然氨基酸（SEQ ID NO：3）（参见WO2006/119987））来完成。在一个具体实施方案中，EPA载体蛋白包含4个共有糖基化序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr（SEQ ID NO：3），并且具有如SEQ ID NO：1中提供的氨基酸序列。

在某些实施方案中，EPA载体蛋白可以连同信号序列（例如大肠杆菌DsbA的信号肽、大肠杆菌外膜孔蛋白A（OmpA）、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白（MalE）等）一起产生，所述信号序列将载体蛋白靶向表达载体蛋白的宿主细胞的周质空间。EPA载体蛋白也可以被修饰为“标签”，即允许分离和/或鉴定载体蛋白的氨基酸序列。

鉴于本公开内容，可以通过本领域已知的方法生产可用于本发明中的EPA载体蛋白。参见例如在Ihssen等人，2010，Microbial Cell Factories 9，61以及WO2006/119987、WO2009/104074和国际专利申请号PCT/EP2015/053739中的相关公开内容，所述参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。

缀合物

在某些实施方案中，宿主细胞可以产生大肠杆菌O抗原和EPA载体蛋白，并且将O抗原与EPA载体蛋白共价结合，以形成可用于本发明中的生物缀合物。参见例如在Ihssen等人，2010，Microbial Cell Factories 9，61以及WO2006/119987、WO2009/104074和国际专利申请号PCT/EP2015/053739中的相关公开内容，所述参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。

可替代地，糖缀合物可以通过化学合成制备，即在宿主细胞外（体外）制备。例如，可以使用本领域技术人员已知的方法，包括借助于使用多糖/寡糖中的活化反应基团以及蛋白质载体，将本文所述的大肠杆菌O抗原例如O25B抗原与载体蛋白缀合。参见例如Pawlowski等人，2000，Vaccine 18:1873-1885；和Robbins等人，2009，Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978，所述参考文献的公开内容通过引用并入本文。这些方法包括从宿主细胞中提取抗原性多糖/寡糖，纯化多糖/寡糖，化学活化多糖/寡糖，并且将多糖/寡糖与载体蛋白缀合。

生物缀合物具有超过体外制备的糖缀合物的有利性质，例如，生物缀合物在制造中需要较少的化学品，并且在所生成的最终产物方面更一致和同质。因此，生物缀合物优选超过化学生产的糖缀合物。

在一个具体实施方案中，EPA载体蛋白与可用于本发明中的大肠杆菌O-抗原N-连接。例如，大肠杆菌O抗原与载体蛋白的糖基化序列中的Asn残基连接，所述糖基化序列例如Asn-X-Ser（Thr），其中X可以是除了Pro以外的任何氨基酸（SEQ ID NO：2），优选Asp（Glu）-X-Asn-Z-Ser（Thr），其中X和Z独立地选自除了Pro以外的任何天然氨基酸（SEQ ID NO：3）。

本文所述的缀合物可以通过本领域已知的用于纯化蛋白质的任何方法进行纯化，例如通过层析（例如离子交换、阴离子交换、亲和力和尺寸排阻柱层析）、离心、差异溶解度、或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。参见例如，Saraswat等人，2013，Biomed. Res. Int. ID#312709（第1-18页）；也参见WO2009/104074中描述的方法。用于纯化特定缀合物的实际条件部分取决于合成策略（例如，合成生产相对于重组生产）以及因素例如生物缀合物的净电荷、疏水性和/或亲水性，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。

组合疗法

在某些实施方案中，本文所述的组合物与一种或多种其他疗法（例如抗细菌或免疫调节疗法）组合施用于个体。一种或多种其他疗法可以有益于治疗或预防ExPEC感染，或者可以改善与ExPEC感染相关的症状或状况。在一些实施方案中，一种或多种其他疗法是止痛药或退烧药。在某些实施方案中，所述疗法分开施用少于5分钟至少于1周。本领域技术人员已知的任何抗菌剂（例如抗生素）可以与本文所述的组合物组合使用。

患者群体

在某些实施方案中，将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于首次用于实验的个体，即不具有ExPEC感染或先前没有ExPEC感染的个体。在一个实施方案中，将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于处于获得ExPEC感染的风险中的首次用于实验的个体。

在某些实施方案中，将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于已诊断有或先前诊断有ExPEC感染的个体。在一些实施方案中，在症状体现或症状变得严重之前（例如，在患者需要住院之前），将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于感染有ExPEC的个体。

在某些实施方案中，将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于已诊断有尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染的个体。在一些实施方案中，将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于患有复发性尿道感染的个体。在一些实施方案中，将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于患有复发性尿道感染，但在治疗时健康的个体。在一些实施方案中，将本文所述的组合物（或方法）施用（或应用）于患有或者处于获得菌血症或脓毒症的风险中的个体。

在一些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是动物。在某些实施方案中，动物是犬科动物。在某些实施方案中，动物是猫科动物。在某些实施方案中，动物是马。在某些实施方案中，该动物是牛。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，例如马、猪、兔、小鼠或灵长类动物。在一个优选实施方案中，个体是人。

在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是人个体，优选处于具有侵袭性ExPEC疾病的风险中的人个体。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是超过50岁的人成年人。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是超过55、超过60或超过65岁的人成年人。

在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是人儿童。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是人儿童。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述的组合物（或方法）的个体是人婴儿，包括早产的人婴儿。在一些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是人幼儿。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体不是小于6个月大的婴儿。

在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是怀孕的个体。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是1、2、3、4、5、6、7或8周前已分娩的妇女。

在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是处于ExPEC风险增加中的个体，例如免疫受损或免疫缺陷个体、预定进行手术或近期经历手术的个体、具有伤口受伤的个体、重症监护室（ICU）或危症监护室（CCU）患者等。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是与具有ExPEC感染或处于增加的ExPEC感染风险中的个体密切接触的个体。

在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是卫生保健工作者。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是免疫受损（例如患有HIV感染）或免疫抑制的。

在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体患有糖尿病。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体患有多发性硬化。

在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体具有需要它们使用导管（例如导尿管）的状况。在某些实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体患有脊髓损伤。

在某些实施方案中，个体是将经历或近期已经历前列腺活组织检查的男性。

在一个优选实施方案中，待施用（或应用）本文所述组合物（或方法）的个体是需要免疫接种的高危人成年人，用于预防由ExPEC血清型O1A、O2、O6A和O25B引起的侵袭性ExPEC疾病。高危人的实例包括但不限于本文上文所述的那些。高危人的其他实例包括例如具有经直肠超声检查伴前列腺针刺活组织检查（TRUS-PNB）或复发性尿脓毒症的个体、长期护理设施（LTCF）的居民、长期护理（LTAC）- 辅助生活、手术前患者（包括但不限于预定进行生殖泌尿/腹部手术的患者）；透析前患者，透析前等。

施用的剂量和频率

O-抗原和EPA载体蛋白的缀合物和/或其组合物的施用可以经由临床医生已知的各种途径完成，所述途径例如皮下、肠胃外、静脉内、肌内、局部、经口、皮内、透皮、鼻内等。在一个实施方案中，施用经由肌内注用。

根据本发明的实施方案，大肠杆菌O25B抗原的剂量水平共价应该不低于，优选超过用于本发明组合物或方法中的其他大肠杆菌O抗原的剂量水平，其中大肠杆菌O抗原各自与EPA载体蛋白共价结合。制剂和方法中采用的确切剂量取决于施用途径和感染的严重性，并且应该根据从业者的判断和每个个体的情况来决定。

在本发明的某些实施方案中，关于大肠杆菌O25B抗原的示例性剂量范围为4至24μg O25B抗原/施用，并且关于待与大肠杆菌O25B抗原组合使用的另外的大肠杆菌O抗原各自的示例性剂量范围为大肠杆菌O25B抗原剂量的10%至100%，其中大肠杆菌O抗原各自与EPA载体蛋白共价结合。在某些实施方案中，关于大肠杆菌O25B糖缀合物的示例性剂量为例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24 μg O25B抗原/施用，并且关于待与大肠杆菌O25B糖缀合物组合使用的另一种大肠杆菌O糖缀合物的示例性剂量为例如大肠杆菌O25B糖缀合物剂量的10%、20%、30% %、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，其中所述剂量通过每次施用的O糖缀合物中O抗原的量进行计算。

在本发明的某些实施方案中，有此需要的个体用0.5 ml根据本发明的组合物进行施用。

在某些实施方案中，向人个体的每次施用的示例性剂量对应于0.5 ml组合物，所述组合物包含第一浓度为约8-48 μg/mL，例如约8、12、16、20、24、28、32、36、40、44或48 μg/mL的与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原，以及浓度为第一浓度的10%至100%的与EPA载体蛋白共价结合的一种或多种另外的大肠杆菌O抗原。

在某些实施方案中，对人个体每次施用的示例性剂量对应于0.5 ml组合物，所述组合物含有浓度为约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原、约8 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原、约8 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原、以及约8 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合大肠杆菌O6A抗原。

在某些实施方案中，对人个体每次施用的示例性剂量对应于0.5 ml组合物，所述组合物含有浓度为约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原、约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原、约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原、以及约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合大肠杆菌O6A抗原。

在某些实施方案中，对人个体每次施用的示例性剂量对应于0.5 ml组合物，所述组合物含有浓度为约32 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原、约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原、约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原、以及约16 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合大肠杆菌O6A抗原。

在某些实施方案中，对人个体每次施用的示例性剂量对应于0.5 ml组合物，所述组合物含有浓度为约32 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O25B抗原、约32 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O1A抗原、约32 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O2抗原、以及约32 μg/mL与EPA载体蛋白共价结合大肠杆菌O6A抗原。

在某些实施方案中，本文描述的大肠杆菌O-抗原缀合物，优选生物缀合物或本文所述的组合物作为单一剂量一次施用于个体。在某些实施方案中，本文所述的大肠杆菌O-抗原缀合物，优选生物缀合物或本文所述组合物作为单一剂量施用于个体，随后为在3至6周后的第二剂量。根据这些实施方案，可以在第二次接种后以6至24个月的间隔对个体施用加强接种。在某些实施方案中，加强接种可以利用不同的大肠杆菌O-抗原、生物缀合物或组合物。在一些实施方案中，可以重复施用相同的大肠杆菌O-抗原缀合物或组合物，并且施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、7天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在某些实施方案中，本文所述的大肠杆菌O-抗原缀合物或本文所述的组合物作为单一剂量每年一次施用于个体。在某些实施方案中，本文所述的大肠杆菌O-抗原缀合物或本文所述的组合物作为单一剂量每n年一次施用于个体，n为例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20年。

在某些实施方案中，本文所述的大肠杆菌O-抗原缀合物或本文所述的组合物作为相隔2周、3周、4周、5周或6周的2、3、4、5个或更多个剂量施用于个体。在一些实施方案中，本文所述的大肠杆菌O-抗原缀合物或本文所述的组合物的2、3、4、5个或更多个剂量相隔2、3、4、5或6周施用于个体。在某些实施方案中，施用的大肠杆菌O-抗原缀合物或组合物每次都是相同的。在某些实施方案中，施用的大肠杆菌O-抗原缀合物或组合物每次都是不同的。

测定

鉴于本公开内容，可以使用本领域技术人员已知的任何方法评价本文所述的缀合物/组合物在个体中生成免疫应答的能力。

用于评价生物缀合物诱导免疫应答的能力的测定

在一些实施方案中，生物缀合物在个体中生成免疫应答的能力可以通过下述进行评价：用生物缀合物免疫接种个体（例如小鼠）或个体集合，并且用对照（例如安慰剂）免疫接种另外的个体（例如小鼠）或个体集合。随后可以用ExPEC攻击个体或个体集合，并且可以确定ExPEC在个体或个体集合中引起疾病（例如UTI）的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫接种的个体或个体集合在用ExPEC攻击后患有疾病，但用本文所述的生物缀合物或其组合物免疫接种的个体或个体集合患有较少的疾病或不患有疾病，则生物缀合物能够在个体中生成免疫应答。本文描述的生物缀合物或其组合物诱导与来自ExPEC的O-抗原交叉反应的抗血清的能力可以通过例如免疫测定如ELISA来测试。

体外杀菌测定

可以使用血清杀菌测定（SBA）或调理吞噬性杀伤测定（OPK）（其代表已用于获得基于糖缀合物的疫苗的批准的建立和公认的方法），来评价本文所述的缀合物/组合物在个体中生成免疫应答的能力。这样的测定是本领域众所周知的，并且简言之，包括通过向个体（例如小鼠）施用引发这种抗体的化合物，生成且分离针对目的靶（例如大肠杆菌的O-抗原，例如O25B）的抗体的步骤。随后，抗体的杀菌能力可以通过例如在所述抗体和补体和 - 取决于测定 - 嗜中性粒细胞的存在下，培养所考虑的细菌（例如相关血清型的大肠杆菌），并且例如使用标准微生物学方法测定抗体杀伤和/或中和细菌的能力。

试剂盒

本文提供了包括一个或多个容器的包装或试剂盒，所述容器填充有本文所述组合物的一种或多种成分，例如一种或多种大肠杆菌O抗原和/或根据本发明实施方案的与EPA载体蛋白共价结合的大肠杆菌O抗原的缀合物。与这样的容器任选相关联的可以是以由政府机构规定的形式的通知或说明书，所述政府机构管理药物或生物产品的制造、使用或销售，所述通知反映了由制造、使用或销售机构批准用于人施用。本文涵盖的试剂盒可以用于上述个体治疗和免疫接种的方法中。

本发明的下述实施例是为了进一步示出本发明的性质。应该理解，下述实施例并不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求确定。

实施方案

实施方案1是组合物，其包含第一浓度的大肠杆菌O25B抗原多糖，以及第二浓度的各大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖和大肠杆菌O6A抗原多糖，其中第一浓度与第二浓度的比率为1:1至2:1，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与铜绿假单胞菌载体蛋白的解毒外毒素A（EPA）共价结合，并且第一浓度为10至36 μg/ml。

实施方案2是实施方案1的组合物，其包含重量比为1:1:1:1的大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖。

实施方案3是实施方案1的组合物，其包含重量比为2:1:1:1的O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖。

实施方案4是实施方案1至3中任一个的组合物，其包含16 μg/ml O25B抗原多糖。

实施方案5是实施方案1至3中任一个的组合物，其包含32 μg/ml O25B抗原多糖。

实施方案6是多价免疫组合物，其包含以5至18 μg的第一剂量的大肠杆菌O25B抗原多糖，以及大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖和大肠杆菌O6A抗原多糖，其各自的剂量独立地为第一剂量的50%至100%，其中大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与铜绿假单胞菌载体蛋白的解毒外毒素A（EPA）共价结合。

实施方案7是多价免疫组合物，其包含具有式O25B’结构的大肠杆菌O25B抗原多糖：

具有式O1A’结构的大肠杆菌O1A抗原多糖：

具有式O2’结构的大肠杆菌O2抗原多糖：

具有式O6A’结构的大肠杆菌O6A抗原多糖：

其中n独立地为5至25的整数，和

大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的载体蛋白共价结合；和

组合物中大肠杆菌O25B、O1A、O2、O6A抗原多糖的浓度分别为16:8:8:8 μg/ml、16:16:16:16 μg/ml、32:16:16:16 μg/ml或32:32:32:32 μg/ml。

实施方案8是在有此需要的个体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）的免疫应答的方法，其包括向个体施用实施方案1至7中任一个的组合物。

实施方案9是在有此需要的个体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）的免疫应答的方法，其包括向个体施用第一有效量的大肠杆菌O25B抗原多糖，以及第二有效量的各大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖和大肠杆菌O6A抗原多糖，其中第一有效量与第二有效量的比率为1:1至2:1，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与铜绿假单胞菌（EPA）载体蛋白的解毒外毒素A共价结合，并且第一有效量为5至18 μg/施用。

实施方案10是实施方案9的方法，其中所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖以1:1:1:1的剂量比施用。

实施方案11是实施方案9的方法，其中所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖以2:1:1:1的剂量比施用。

实施方案12是实施方案8至11中任一个的方法，其中施用8 μg O25B抗原多糖/施用。

实施方案13是实施方案8至11中任一个的方法，其中施用16 μg O25B抗原多糖/施用。

实施方案14是实施方案8至13中任一个的方法，其中所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖在一种组合物中一起施用。

实施方案15是在有此需要的个体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）的免疫应答的方法，其包括向个体施用具有式O25B’结构的大肠杆菌O25B抗原多糖：

具有式O1A’结构的大肠杆菌O1A抗原多糖：

具有式O2’结构的大肠杆菌O2抗原多糖：

具有式O6A’结构的大肠杆菌O6A抗原多糖：

其中n独立地为5至25的整数，

大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的载体蛋白共价结合，和

大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖以8:4:4:4 µg、8:8:8:8 µg、16:8:8:8 µg或16:16:16:16 µg/施用进行施用。

实施方案16是实施方案8至15中任一个的方法，其中所述免疫应答限制了在高危人个体中由ExPEC血清型O1A、O2和O6A和O25B引起的侵袭性ExPEC疾病的严重性或预防侵袭性ExPEC疾病。

实施方案17是实施方案16的方法，其中所述成年人个体患有或处于患有选自以下的侵袭性ExPEC疾病的风险中：尿道感染、手术部位感染、腹部或盆腔感染、肺炎、医院性肺炎、骨髓炎、蜂窝织炎、脓毒症、菌血症、伤口感染、肾盂肾炎、脑膜炎、新生儿脑膜炎、腹膜炎、胆管炎、软组织感染、化脓性肌炎和脓毒性关节炎。

实施方案18是制备实施方案1至7中任一个的组合物的方法，其包括将大肠杆菌O25B抗原多糖、大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖和大肠杆菌O6A抗原多糖组合，从而获得组合物。

实施例

O-抗原生物缀合物

在例如Ihssen等人，2010，Microbial Cell Factories 9，61以及WO2006/119987、WO2009/104074和国际专利申请号PCT/EP2015/053739（所述参考文献的公开内容通过引用整体并入本文）中所述的，可以产生、纯化且表征O1A-EPA、O2-EPA、O6A-EPA和O25B-EPA生物缀合物，其分别含有与EPA蛋白质载体的糖基化位点共价连接的大肠杆菌O1A、O2、O6A和O25B。生物缀合物使用重组大肠杆菌细胞合成，所述重组大肠杆菌细胞在寡糖基转移酶PgIB和蛋白质载体（EPA）的存在下，表达不同O型血清型的多糖合成酶。在该方法中，糖缀合物疫苗可以在大肠杆菌的周质中表达，提取并且通过在图1和图2示出的生化方法纯化。表2指示用于生产根据本发明的一个实施例的缀合物的宿主菌株。

表2：用于产生临床前、毒理学研究和临床分批的宿主菌株

。

例如，对于O25B-EPA生产，构建了具有基因组整合的O25B簇的菌株：W3110 ΔwaaLΔgtrABS ΔrfbO16::rfb（upec138），其用质粒pGVXN1076（其表达具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的EPA）和pGVXN970（其表达寡糖基转移酶PelB）（WO/2009/104074）进行转化。通过Datsenko和Wanner（2000，Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645）的方法，以及用于将大插入片段定点整合到细菌染色体内的同源重组技术（参见WO2014/057109），从菌株W3110开始构建该菌株。从对于O25B阳性的大肠杆菌菌株upec138中克隆与O25B抗原相关的rfb簇。重组宿主细胞在周质中产生O25B/EPA生物缀合物。所得到的O25B生物缀合物使用标准释放和表征测定进行表征。使用两个连续的阴离子交换和尺寸排阻层析步骤纯化生物缀合物，产生98.1%纯的O25B生物缀合物制剂。

类似地，构建了用于重组生产O1A-EPA、O2-EPA和O6A-EPA的宿主菌株（表2）。这些菌株包括分别与从大肠杆菌菌株upec032、upec116和CCUG11309克隆的O1A、O2和O6A相关的rfb簇。O1A-EPA、O2-EPA和O6A-EPA的生物缀合物从这些重组宿主细胞产生，并且根据本公开内容使用本领域已知的方法纯化。

SDS PAGE定量用于纯度分析。基于通过蒽酮测定（参见Laurentin和Edwards，2003，Anal Biochem 315，143-145）的糖定量和用于蛋白质浓度的BCA测定来计算糖与蛋白质的比率。分析尺寸排阻层析显示颗粒的单体状态与具有附着的聚糖链的EPA的预期流体力学半径一致。

通过具有多角度光散射的尺寸排阻层析（SEC-MALS）分析生物缀合物和未糖基化的EPA参考标准，以便定量各个生物缀合物的单糖基化和双糖基化程度，并且确定蛋白质载体和附着至其的O-PS的分子量（MW）。将样品在磷酸盐缓冲液（pH 7.0；50 mM NaCl，150 mM磷酸钠）中的TSKgel-G3000 SWxl柱上分开，并且通过UV（214和280 nm）、折射率（RI）和多角度光散射（MALS）进行监测。

疫苗组合物

本实施例示出了可用于本发明的疫苗组合物。

表3-1：疫苗组合物

表3-2：疫苗组合物

将上文示出的液体疫苗组合物各自包装在准备用于注射的小瓶中。疫苗产品应该贮存在+ 2℃至+ 8℃下。

疫苗组合物中的活性物质是糖基化蛋白质（由与大肠杆菌O抗原多糖共价连接的EPA蛋白质载体组成的生物缀合物），并且剂量仅基于多糖部分（O抗原）的含量计算。

EPA载体蛋白的剂量取决于多糖/蛋白质的比率。取决于O-抗原血清型，估计的多糖/蛋白质的比率为15%至50%，即缀合物中多糖的重量为缀合物中EPA蛋白质载体重量的约15%至50%。对于ExPEC4V中的每种血清型，定量多糖/蛋白质的比率，例如通过蒽酮测定（参见Laurentin和Edwards，2003，Anal Biochem 315，143-145）测量多糖（O-抗原）的量，并且二喹啉甲酸（BCA）测定用于测量蛋白质浓度。对于产物1-3中的每种血清型，表3-1和3-2中提供的EPA值是基于来自ExPEC4V的分析结果的预期值。

在经过3个月时期的过程中测试了四价疫苗组合物（O25B、O1A、O2和O6生物缀合物）的稳定性。这些研究包括加速和应激贮存条件，以鉴定降解途径。这些研究证实活性物质和四价疫苗组合物稳定至少三个月，并且因此就稳定性而言是合适的疫苗组合物。

在大鼠中的重复剂量毒性研究

在Sprague-Dawley大鼠中进行具有14天恢复期的良好实验室实践（GLP）毒性研究，以评价在第1天和第14天时的2次肌内（i.m.）注射（在股四头肌中）后，疫苗组合物的毒性和局部耐受性。在14天恢复期（即在第28天时）后，评价任何改变的可逆性、持久性和延迟发生。表4中概括了在大鼠中的阶段1-允许重复剂量毒性研究的设计。

表4：在大鼠中的重复剂量毒性研究的设计

EPA = 用作蛋白质载体的外蛋白A/绿脓假单胞菌外毒素A，解毒形式；

F = 雌性，

M =雄性

注：第1天 = 治疗开始

^a媒介物组施用制剂缓冲液（媒介物对照）

^b动物接受0.25 mL/给药场合的2次注射（左和右后腿）。动物在2个场合进行给药：第1天和第14天

^c主要动物在第17天时实施安乐死

^d恢复动物在第28天时，即在第二次治疗后14天，实施安乐死。

在该研究中测试了ExPEC4V的4 μg/O-抗原多糖（PS）的剂量（总PS剂量为16 μg）。该剂量等价于于下文描述的阶段1临床研究中评估的最大剂量。因此，在大鼠GLP毒理学研究中施用如阶段1中使用的完全人剂量。该研究用非临床分批执行，该分批代表了用于阶段1临床研究的分批。

在研究期间未观察到死亡率，也没有任何治疗相关的临床体征（包括体温）或眼科观察。此外，对体重、体重增加、食物消耗或血液学、临床化学、凝血和尿分析参数不存在毒理学有关的不利作用。在治疗结束时（第14天）和恢复期（第28天），不存在测试物品相关的肉眼发现或器官重量中的差异。

并未观察到不利的测试物品有关的显微镜观察结果。在媒介物和治疗组两者的治疗期结束时，在股四头肌中的注射部位处注意到非不利的最低限度至轻度显微镜检查发现（间质炎症、肌纤维变性/坏死和混合炎性细胞浸润）。这些发现因此被视为与测试物品的施用无关，而是施用程序（即，i.m.注射）的结果。在恢复期结束时，第1天注射部位肌肉已恢复，而在第14天注射部位处，在肌肉中可见残余的最低限度混合细胞炎症/浸润，提示在媒介物和治疗动物两者中的进行性恢复。总之，疫苗是良好耐受的，并且并未注意到不利的治疗相关效应。

疫苗的免疫原性已得到证实，与仅接受配制缓冲液的媒介物相比，在疫苗接种组中诱导针对4种O-抗原的更高的血清免疫球蛋白G（IgG）滴度。

在兔中的重复剂量毒性研究

在NZW兔（TOX11163，草案报告）中进行具有3周恢复期的GLP重复剂量毒性研究，以评价间隔2周给予的3次i.m.注射（第0、14和28天）后的ExPEC4V的毒性和局部耐受性。在第28天时的第3次注射后的3周无治疗期后，在第49天时评价任何变化的可逆性、持久性和延迟发生。在兔中的阶段2-允许重复剂量毒性研究的设计可在表5中找到。

表5：在兔中的重复剂量毒性研究的设计

ADM：施用部位；F = 雌性；M =雄性

注：第0天 = 治疗开始；组1接受生理盐水（对照组）

^a总O-抗原多糖（对于O1A、O2、O6A和O25B血清型分别为1:1:1:1比率）

^b 8 μg多糖/血清型 + 109 μg总EPA载体蛋白

^c 16 μg多糖/血清型 + 218 μg总EPA载体蛋白

^d ADM1：左 - 下部分m.股二头肌；ADM2：右 - 下部分m.股二头肌；ADM3：左 - 上部分m.股二头肌；ADM4：右- 上部分m.股二头肌；ADM5：左 - m.股四头肌；ADM6：右 - m.股四头肌

^e终末动物在第30天时实施安乐死，并且恢复动物在第49天时实施安乐死。

在该研究中测试了16 μg/O-抗原PS的ExPEC4V（总共64 μg PS剂量，连同218 μgEPA载体蛋白一起）的最大剂量。该剂量比先前在大鼠中的阶段1-允许GLP毒性研究中测试的最大剂量高4倍，并且等价于在下述阶段2临床研究中评估的最大PS（和EPA）剂量。因此，在该兔GLP毒理学研究中施用关于阶段2使用的完全（最大）人剂量。

该研究用在下述阶段1临床研究中使用的ExPEC4V（含有32 μg/mL总PS）执行。该分批被视为用于下述阶段2临床研究中的疫苗组合物（含有128 μg/mL总PS）的代表，因为相同的原料药用于两种疫苗组合物中。

在研究期间并未观察到死亡率。不存在对体温、体重、体重增加、食物消耗、眼科学、皮肤评估（Draize评分）、临床化学和C-反应蛋白的作用。

在治疗和恢复期结束时，接受64 μg ExPEC4V的雌性显示出非不利的最低限度降低的血红蛋白水平，具有在恢复期结束时总RBC计数和血细胞比容中的最低限度降低。纤维蛋白原在第1次注射后1周和在治疗期结束时在雌性中最低限度增加，但在无治疗（恢复）阶段结束时再也没有观察到变化。

在给药后不久，在ExPEC4V给药组的一些动物中注意到皮下组织的暗变色，其与在尸检（第30天）时在所有组（包括对照组）中在第28天时注射的位点处可见的变色的病灶/区域相关联。在恢复期结束时未注意到异常。主要在ExPEC4V给药动物中的第28天注射部位处可见混合炎性细胞浸润（最低限度至轻微）的组织病理学多病灶。在恢复期结束时（第49天），高剂量组中仅1个雌性在第28天的注射部位处显示出混合炎性细胞浸润，指示（进行中的）恢复。

在引流髂内侧淋巴结内，在治疗期结束时，在ExPEC4V给药的兔的副皮质和/或髓索内可见成淋巴细胞的产生（在生发中心）和隔离，导致总体细胞性增加。此外，淋巴结在两个性别中都较大，这与雌性中增加的体重相关联。这些发现在恢复期结束时不可见。在治疗和恢复期结束时，在经治疗的雄性和雌性脾脏中注意到生发中心的数量增加，并且在治疗期结束时伴随在两个性别中的脾脏重量增加。

这些发现被视为不利的并且与针对疫苗施用的免疫应答有关。

证实了疫苗的免疫原性，因为针对所有4个O-抗原血清型以及EPA的血清IgG水平在雄性和雌性中升高。

总之，用包含高达64 μg总PS的ExPEC4V剂量给兔接种疫苗（3次i.m.注射，间隔2周）是安全且良好耐受的。观察到的所有治疗相关效应被视为反映了由疫苗施用诱导的正常非不利应答。

在大鼠中通过疫苗诱导的抗体应答的功能性

为了评价O25B、O1A、O2和O6A生物缀合物的疫苗诱导的抗体应答的功能活性，来自用含有O25B、O1A、O2和O6A EPA生物缀合物的单价或四价疫苗各自单独或组合接种疫苗的大鼠的血清，使用调理吞噬性杀伤（OPK）测定进行分析，所述OPK测定测量细菌（例如大肠杆菌）的体外补体和抗体依赖性吞噬作用和杀伤。OPK测定测量血清促进不同大肠杆菌血清型的调理吞噬和杀伤的能力。在96孔板中，将样品血清的限定稀释度在每个孔中与来自四种疫苗特异性大肠杆菌血清型之一的细菌、确定量的HL60细胞和幼兔补体一起温育。在温育后，将一部分混合物点在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上，并且计数细菌菌落的数目。将抗体结合细菌细胞且激活补体沉积且介导通过HL60细胞的细菌摄取和杀伤的能力表示为调理素滴度。调理素滴度或调理指数（OI）对应于杀伤50%细菌细胞的血清稀释度。提供免疫前和免疫后血清的调理指数。从免疫前到免疫后OI的至少4倍增加被视为显著的。

用来自接种疫苗的大鼠的血清稀释物预先调理大肠杆菌，与补体和吞噬细胞（分化的HL60细胞）一起温育，并且测定菌落形成单位（CFU）。随后，计算最大%杀伤和调理指数（OI：杀伤50%大肠杆菌的血清稀释度）。选择用于OPK测试的大肠杆菌是OC 24453（血清型O2）、OC 24781（血清型O6A）和OC 24176（血清型O25B）。

如图3A-3C所示的结果显示，含有O2-EPA、O6A-EPA和O25B-EPA的单价疫苗在大鼠中诱导强抗体应答，并且这样的抗体应答在杀伤来自这些血清型的大肠杆菌中起作用。

表6显示了来自用具有0.4或4 μg/O-抗原的四价疫苗免疫接种的大鼠的O-抗原O2、O6A和O25B的总OI滴度。滴度在两个分开的实验中确定。对于O2和O 6 A血清型，0.4 μg剂量在所有动物中诱导显著的OI。对于O25B，用0.4 μg剂量免疫接种后，3/8只动物显示OI中的显著增加。与0.4 μg剂量相比，4 μg剂量在所有动物中诱导对于O2较低的OI增加。当来自4 μg剂量组的血清对O25B大肠杆菌进行测试时，3/8只动物显示OI增加。

数据证实四价疫苗能够在动物中引发针对O2、O6A和O25B的O抗原特异性的调理性抗体，证实本文所述的疫苗组合物诱导针对大肠杆菌血清型的抗体应答，来自所述大肠杆菌血清型的O抗原被包括在疫苗中，并且这种抗体应答在杀伤来自这些血清型的大肠杆菌中起作用。

在人中的效应 – 阶段I研究

ExPEC4V已在首次人体阶段1研究中进行测试，该研究入选了总共194个个体。该阶段1研究是随机化、安慰剂对照、多中心研究。该研究以单盲方式进行，因为研究者和研究人员知道个体的随机化组，而个体被要求在任何时间都不知道其随机化组。

该首次人体研究的目的是评估候选疫苗在具有复发性尿道感染（rUTI）史的≥18岁至≤70岁健康女性中的安全性、免疫原性和功效。该研究的主要目的是比较在接受ExPEC4V的个体和接受安慰剂的个体之间的诱导和主动（solicited and unsolicited）不良事件（AE）和严重不良事件（SAE）。主要次要目的包括免疫原性参数、由大肠杆菌疫苗血清型引起的症状性UTI发作的次数、以及疫苗血清型特异性大肠杆菌UTI的发生率和临床症状。

合格的个体需要具有在过去的12个月中的至少3次独立的UTI发作或者在过去的6个月中的至少2次独立的UTI发作；至少1次独立的UTI发作必须是由于培养物确认的大肠杆菌感染。总共194个个体入选且随机化到单一i.m.剂量的0.5 mL ExPEC4V或安慰剂（参见表7）。在进行至下一个阶段之前，入选以交错的方式完成，以评价第14天的安全性数据：

1. 前8个个体被随机化（3:1）至1 μg每种PS或安慰剂的剂量

2. 后8个个体被随机化（3:1）至4 μg每种PS或安慰剂的剂量

3. 剩下的178个个体被随机化（1:1）至4 μg每种PS或安慰剂的剂量。

表7：入选阶段1研究的个体的人口统计学和基线特征。

^aExPEC4V剂量含有4种ExPEC血清型O1A、O2、O6A和O25B的O-抗原多糖 。

在第一次就诊时，筛选了已提供知情同意书的合格个体，并且确认了纳入/排除标准的符合性。抽取血液并且收集尿。在就诊2（第1天）时，每个个体接受在三角肌中0.5 ml溶液（ExPEC4V或安慰剂）的肌内注射。候选疫苗的减少剂量含有1 μg每种多糖（总共4 μg多糖）。候选疫苗的靶剂量含有4 μg每种多糖（总共16 μg多糖）。

基于从疫苗接种后第1天直到第7天在日记中收集的诱导性局部（在注射部位处的疼痛、红斑和肿胀）和全身（发热，即体温≥38℃）AE，以及直到第270天（研究就诊结束）时收集的AE和SAE来评估安全性。通过合格的酶联免疫吸附测定（ELISA）和调理吞噬性杀伤（OPK）测定来评估免疫原性，所述测定使用来自在第1天时疫苗接种前以及在第30天和第270天时疫苗接种后获取的血液样品的血清。

适用时，描述统计学（关于连续变量的n、平均值、标准差、中值和范围，以及关于分类变量的频率和百分比）通过治疗组和/或就诊提供。所有数据均按个体、治疗组和适用时的就诊列出。来自接受安慰剂的组B的所有个体都合并，以形成安慰剂治疗组。

安全性

迄今为止，下述中无一已从阶段1研究（其仍在进行中）中得到鉴定：不良药物反应、显著的临床实验室异常、心血管、肺、中枢神经系统、肾或其他显著不利效应、用药过量。不良事件和严重不良事件的发生率在安慰剂组和疫苗接种组之间是可比较的。

免疫原性 - 总抗体滴度

为了评价疫苗组分的免疫原性，获得来自参与临床研究的女性的血清，并且通过ELISA分析，以定量针对四价疫苗中包括的四种不同O-抗原（大肠杆菌O1、大肠杆菌O2、大肠杆菌O6和大肠杆菌O25B）的IgG。使用纯化的血清型特异性O-抗原作为主要测定抗原，通过对于每种血清型分离株优化的合格ELISA评价总第1天（疫苗接种前）和第30天血清IgG抗体滴度。使用4-参数逻辑曲线拟合来计算总IgG抗体滴度/血清型，以确定每个样品的半数最大有效浓度（EC₅₀）值。

ExPEC4V中的1 μg多糖/血清型（N = 6）

六个个体接受1 μg PS/血清型的ExPEC4V剂量（4 μg总PS）。到第30天时这些个体的血清型特异性免疫应答的分析显示，具有每种血清型的总抗体中的≥2倍增加的个体比例为50%（血清型O1A）、83%（血清型O2）、50%（血清型O6A）和67%（血清型O25B）。具有抗体滴度中的≥4倍增加的个体比例较低，即17%（血清型O6A）、33%（血清型1A）、33%（血清型2）和50%（血清型O25B）。

1 μg PS/血清型剂量组的应答分析跨4种血清型产生了类似的量值增加。对于血清型O1A、O2、O6A和O25B，比较第30天与第1天，抗体滴度的中值倍数增加分别为2.5、3.7、2.2和4.1。个体个体倍数增加对于血清型O1A和O2范围为1至6，对于血清型O6A范围为1至7，并且对于血清型O25B范围为1至11。在第30天时的几何平均滴度（GMT）值对于分别的4种血清型为4,053、13,768、1,236和227（表8），代表超过第1天GMT值的大约2.2 - 3.5倍增加。

表8：从第1天（疫苗接种前）到第30天 - 阶段1研究的ELISA确定的总抗体滴度中的GMT和95%置信区间。

4 μg多糖/血清型ExPEC4V（N = 93）

与含1 μg PS/血清型的剂量（4 μg总PS）相比，4 μg PS/血清型的ExPEC4V剂量（16μg总PS）的施用产生更强的免疫应答。到第30天时这些个体的分析显示，具有每种血清型的总抗体中的≥2倍增加的个体比例为81%（血清型O1A）、92%（血清型O2）、80%（血清型O6A）和82%（血清型O25B）。具有抗体滴度中的≥4倍增加的个体比例范围从57%（血清型O1A和O6A）到80%（血清型O2），其低于具有2倍增加的比例，但明显高于用含有1 μg PS/血清型的剂量观察到的。也参见图4，观察到对O1A、O2、O6A和O25B各自的强免疫反应，并且仅在接种疫苗的组（V_第30天相对于V_第1天），而不是安慰剂组（P_第30天相对于P_第1天）中，观察到在注射后（注射后30天）和注射前（第1天）之间的ELISA滴度中的显著增加。

4 μg PS/血清型组的应答分析产生的中值倍数增加大于1 μg PS/血清型剂量组的中值倍数增加。对于血清型O1A、O2、O6A和O25B，比较第30天与第1天，EC50中值倍数增加分别为4.6、9.4、4.9和5.9。倍数增加中的量值和变化性对于该剂量组较大，对于血清型O1A范围为1至96，对于血清型O2范围为1至165，对于血清型O6A范围为0至61，并且对于血清型O25B范围为1至579。在第30天时的GMT值对于分别的4种血清型为9,460、27,973、4,475和2,164（表8），代表超过第1天GMT值的大约4.9至9.8倍增加。

结论

这些期中结果显示在施用1 μg PS/血清型ExPEC4V剂量的健康个体中的疫苗特异性免疫应答，以及经过30天观察期，具有更高的4 μg PS/血清型ExPEC4V剂量的免疫应答中相对更大的增加。经过这个期间安慰剂组中的95个个体的抗体滴度中相关变化的缺乏，提示ExPEC4V接受者中的抗体应答是疫苗介导的，并且不是由于对ExPEC细菌的环境暴露。

这些数据指示与1 μg PS/血清型剂量相比，与更高的4 μg PS/血清型剂量相关的抗体滴度中的总体增加。尽管这些结果提示与更低剂量组相比，与更高剂量组的滴度相关的更大变化性，但1 μg/个体剂量中的个体的小数目限制了对任何观察到的差异的解释。在相对IgG滴度/血清型中在每个剂量组内也观察到差异，其中针对O25B抗原的抗体滴度最低（表8）。

功能性抗体应答

OPK测定用于评价参与临床研究的女性的功能性抗体应答。从研究参与者中收集血清。大肠杆菌用来自接种疫苗的妇女的血清稀释物进行预调理，与补体和吞噬细胞（分化的HL60细胞）一起温育，并且测定剩余的菌落形成单位（CFU）。随后，计算最大杀伤百分比和调理指数（OI：杀伤50%大肠杆菌的血清稀释度）。选择用于OPK测试的大肠杆菌是OC 24452（血清型O1A）、OC 24453（血清型O2）、OC 24454（血清型O6A）和OC 24176（血清型O25B）。

通过使用选择的血清型O1A、O2、O6A或O25B ExPEC菌株优化的OPK测定，伴随人补体和HL60吞噬细胞，评价第1天和第30天血清中的功能性抗体（作为调理指数[OI]测量，或产生大肠杆菌菌落形成单位中的50%降低的血清浓度）。基于滴度准确性和重复性的初步评价，在期中分析中包括关于血清型O25B的功能性抗体滴度。对于所有血清型，通过使用NICE程序（由美国国家标准和技术研究所（U.S. National Institute of Standards andTechnology）开发）和由Opsititer3程序（由University of Alabama开发且得到许可），从大肠杆菌调理吞噬介导的杀伤的测量来确定功能性抗体滴度。对于期中分析，对于测定了194个个体的OPK滴度，其中包括接受安慰剂的95个个体、接受ExPEC4V 1 μg PS（每种血清型）疫苗的6个个体、以及接受ExPEC4V 4 μg PS（每种血清型）疫苗的93个个体。

安慰剂接受者（N = 95）

如用ELISA测试观察到的，安慰剂接受者（95个个体）对于第1天和第30天血清相对于ExPEC4V血清型显示相似的OPK应答，对大多数分别根据个体的OPK滴度值具有很少变化或没有观察到的变化。这些结果指示经过这个时间段，对于大多数或全部安慰剂个体稳定的功能性抗体滴度。

1 μg多糖/血清型ExPEC4V（N = 6）

六个个体接受1 μg PS/血清型的ExPEC4V剂量（4 μg总PS）。到第30天时这些个体的血清型特异性免疫应答的分析显示，具有每种血清型的总抗体中的≥2倍增加的个体比例为33%（血清型O1A）、67%（血清型O2）和0%（血清型O6A和O25B）。对于血清型O1A和O2，具有抗体滴度中的≥4倍增加的个体比例分别降至17%和50%。

对于血清型O1A、O2、O6A和O25B，比较第30天与第1天，抗体滴度的中值倍数增加分别为1.0、4.8、0.9和1.0。个体个体倍数增加对于血清型O1范围为0.6至8.1，对于O2范围为0.3至9.5，对于血清型O6A范围为0.8至1.3，并且对于血清型O25B范围为0.5至1.5。在第30天时的几何平均滴度（GMT）值对于分别的4种血清型为429、1834、1136和51，代表超过第1天GMT值的大约1.0 - 2.8倍增加。

4 μg多糖/血清型ExPEC4V（N = 93）

4 μg PS/血清型的ExPEC4V剂量（16 μg总PS）的施用对于所有ExPEC 4V血清型产生功能性免疫应答。到第30天时这些个体的分析显示，具有每种血清型的OI值中的≥2倍增加的个体比例为63%（血清型O1A）、90%（血清型O2）、33%（血清型O6A）和55%（血清型O25B）。具有OI值中的≥4倍增加的个体比例范围从20%（血清型O6A）到82%（血清型O2）；如预期的，这些比例始终低于对于≥2倍增加观察到的比例。

对于血清型O1A、O2、O6A和O25B，比较第30天与第1天，OI中值倍数OPK滴度增加分别为3.5、14.7、1.4和2.5。对于该剂量组每个个体倍数增加的量值对于O1A和O2血清型范围为0.5至> 292，对于血清型O6A范围为0.3至26.4，并且对于血清型O25B范围为0.1至272.8。如图5A-5D中所示，观察到对O1A、O2、O6A和O25B各自的强功能性免疫应答，并且仅在疫苗接种组，而不是安慰剂组中观察到注射后和注射前之间的OI中的显著增加。

在第30天时的GMT值对于分别的4种血清型分别为950.5、4132、1542和414.7（表9），代表超过第1天GMT值的大约2至14倍增加。这些数据指示，跨所有ExPEC 4V血清型，与4μg PS/血清型剂量相关的第30天功能性抗体滴度中的总体增加。

表9：从第1天（疫苗接种前）到第30天的OPK-测定的功能性抗体滴度中的GMT和95%置信区间 - 阶段1研究。

结论

这些期中结果显示经过30天观察期，在施用4 μg PS/血清型ExPEC4V剂量的健康个体中的疫苗特异性功能性免疫应答。经过这个期间安慰剂组中的95个个体的抗体滴度中显著变化的缺乏（图5A-5D和表9）与ELISA结果一致，并且支持了针对疫苗接种的抗体应答已跨4种ExPEC血清型得到证实的结论。

来自阶段1研究的期中免疫原性结果显示，对于总体（ELISA）和功能性（OPK）抗体滴度两者，在施用1 μg PS/血清型ExPEC4V剂量的健康个体中的疫苗特异性免疫应答，以及经过30天观察期，具有更高的4 μg PS/血清型ExPEC4V剂量的免疫应答中相对更大的增加。与用ELISA测试观察到的血清型特异性倍数增加相比，OPK测定显示血清型O1A和O2对于两种测定相似的应答水平，但对于血清型O6A和O25B的OPK %个体应答的略微更低的水平。对于血清型O6A和O25B一些个体的OPK应答中的选择性降低处于调查中。

值得注意的是，OPK-测定的对于O25B抗原的功能性抗体滴度的GMT值低于对于其他抗原（O1A、O2和O6A）的那些GMT值。OPK测定已公认为由针对肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的PS缀合物疫苗（Prevenar^®）诱导的免疫保护的更佳替代测定，因为ELISA可能无法区分非保护性低亲合力抗体与保护性高亲合力抗体（Kim等人，Clin Diagn Lab Immunol. 2003 10（4）:616-21）。

在人中的效应 – 阶段II研究

基于来自阶段I研究的期中结果，将进行阶段II研究。这项随机化、双盲、安慰剂对照的多中心研究计划为评估稳定健康的男性和女性中的5个不同剂量的安全性、耐受性和免疫原性，按年龄分层：≥18至<50岁（N = 275）和≥50岁（N = 560）。

在阶段II研究中将使用两种疫苗组合物，即表3-2中提供的产物1和2，其具有使用与ExPEC4V中使用的那些相同的活性物质的两个不同的多糖浓度。更具体而言，组合物1制剂分别含有32、32、32、32 μg/ml/O-抗原多糖（PS）的大肠杆菌血清型O1A、O2、O6A和O25B，不含佐剂。组合物2制剂分别含有16、16、16、32 μg/ml/O-抗原PS的大肠杆菌血清型O1A、O2、O6A和O25B，不含佐剂。

在阶段II研究中将测试活性物质的不同剂量和比率。更具体而言，入选的个体将随机化且分成六个臂：（i-v）五个不同剂量的候选疫苗和（vi）安慰剂。每个个体接受单一i.m.剂量的组合物1、组合物2或安慰剂。关于大肠杆菌O-抗原O1A：O2：O6A：O25B/注射的组合物1或2的靶剂量为：4:4:4:4 µg（即，与上文阶段I研究中使用的最高剂量相同）、4:4:4:8、8:8:8:8、8:8:8:16和16:16:16:16 μg。该研究的目的是评价5个不同剂量的四价大肠杆菌生物缀合物疫苗的安全性、免疫原性和功效。

本文描述的实施方案预期仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过例行实验来确定本文所述的具体程序的许多等价物。所有这些等价物都被视为在本发明的范围内，并且由下述权利要求覆盖。

本文引用的所有参考文献（包括专利申请、专利和出版物）通过引用整体并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个个别出版物或专利或专利申请被特别且个别地被指示通过引用整体并入用于所有目的。

参考文献

(1) Johnson等人，J Lab Clin Med. 2002；139（3）:155-162

(2) Kohler等人，Int J Med Microbiol. 2011；301（8）:642-647

(3)Foxman，Am J Med. 2002；113 Suppl 1A:5S-13S；

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(6) Pitout等人，2012，Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10（10）:1165-1176

(7) Johnson等人，Antimicrob Agents Chemother. 2010；54（1）:546-550

(8) Rogers等人，J Antimicrob Chemother. 2011；66（1）:1-14

(9) Banerjee等人，Antimicrob Agents Chemother. 2014；58（9）:4997-5004

(10) Stenutz等人，FEMS Microbial Rev. 2006；30: 382-403

(11) Russo等人，Vaccine. 2007；25: 3859-3870

(12) Lipsitch，Emerging Infectious Diseases；1999，5:336-345

(13) WO2006/119987

(14) WO2009/104074

(15) 国际专利申请号PCT/EP2015/053739（作为WO2015/124769公开）

(16) Ihssen等人，2010，Microbial Cell Factories 9，61

(17) Lukac等人，Infect Immun，56: 3095-3098，1988

(18) Ho等人，Hum Vaccin，2: 89-98, 2006

(19) Pawlowski等人，2000，Vaccine 18:1873-1885

(20) Robbins等人，2009，Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978

(21) Saraswat等人，2013，Biomed. Res. Int. ID#312709（p. 1-18）

(22) WO/2009/104074

(23) Datsenko和Wanner（2000）Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645

(24) WO2014/057109

(25) Laurentin和Edwards，2003，Anal Biochem 315，143-145

(26)Kim等人，Clin Diagn Lab Immunol. 2003 10（4）: 616-21。

Claims (33)

1.一种免疫组合物，其包含第一浓度的大肠杆菌O25B抗原多糖，以及第二浓度的大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖和大肠杆菌O6A抗原多糖中的每一种，其中所述第一浓度与所述第二浓度的比率为2:1，所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与铜绿假单胞菌解毒外毒素A(EPA)载体蛋白共价结合，并且所述第一浓度为10至36 μg/ml，其中所述大肠杆菌O25B抗原多糖具有式O25B'结构：

所述大肠杆菌O1A抗原多糖具有式O1A'结构：

所述大肠杆菌O2抗原多糖具有式O2'结构：

所述大肠杆菌O6A抗原多糖具有式O6A'结构：

其中n独立地为5至25的整数。

2.权利要求1的免疫组合物，其包含重量比为2:1:1:1的所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖，其中所述第一浓度为10、16、24、32或36 μg/ml。

3.权利要求1或2中任一项的免疫组合物，其包含16 μg/ml O25B抗原多糖。

4.权利要求1或2中任一项的免疫组合物，其包含32 μg/ml O25B抗原多糖。

5.一种多价免疫组合物，其包含5至18 μg的第一剂量的大肠杆菌O25B抗原多糖，以及大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖和大肠杆菌O6A抗原多糖，其各自的剂量独立地为所述第一剂量的50%，其中所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与铜绿假单胞菌解毒外毒素A(EPA)载体蛋白共价结合，其中所述大肠杆菌O25B抗原多糖具有式O25B'结构：

所述大肠杆菌O1A抗原多糖具有式O1A'结构：

所述大肠杆菌O2抗原多糖具有式O2'结构：

所述大肠杆菌O6A抗原多糖具有式O6A'结构：

其中n独立地为5至25的整数。

6.一种多价免疫组合物，其包含具有式O25B’结构的大肠杆菌O25B抗原多糖：

具有式O1A’结构的大肠杆菌O1A抗原多糖：

具有式O2’结构的大肠杆菌O2抗原多糖：

具有式O6A’结构的大肠杆菌O6A抗原多糖：

其中n独立地为5至25的整数，且

所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的载体蛋白共价结合；且

所述组合物中所述大肠杆菌O25B、O1A、O2、O6A抗原多糖的浓度分别为16:8:8:8 μg/ml或32:16:16:16 μg/ml。

7.权利要求1至6中任一项的组合物用于制备疫苗的用途，所述疫苗用于在有此需要的个体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的免疫应答，其包括向所述个体施用权利要求1至6中任一项的组合物。

8.第一有效量的大肠杆菌O25B抗原多糖以及第二有效量的大肠杆菌O1A抗原多糖、第二有效量的大肠杆菌O2抗原多糖和第二有效量的大肠杆菌O6A抗原多糖用于制备疫苗的用途，所述疫苗用于在需要所述疫苗的个体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的免疫应答，其包括向所述个体施用第一有效量的大肠杆菌O25B抗原多糖，以及第二有效量的大肠杆菌O1A抗原多糖、第二有效量的大肠杆菌O2抗原多糖和第二有效量的大肠杆菌O6A抗原多糖，其中所述第一有效量与所述第二有效量的比率为2:1，大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与铜绿假单胞菌解毒外毒素A(EPA)载体蛋白共价结合，并且所述第一有效量为5至18 μg，其中所述大肠杆菌O25B抗原多糖具有式O25B'结构：

所述大肠杆菌O1A抗原多糖具有式O1A'结构：

所述大肠杆菌O2抗原多糖具有式O2'结构：

所述大肠杆菌O6A抗原多糖具有式O6A'结构：

其中n独立地为5至25的整数。

9.权利要求8的用途，其中所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖以2:1:1:1的剂量比施用，其中所述第一有效量为6、8、10、12、14、16或18 μg/施用。

10.权利要求7至9中任一项的用途，其中施用8 μg大肠杆菌O25B抗原多糖/施用。

11.权利要求7至9中任一项的用途，其中施用16 μg大肠杆菌O25B抗原多糖/施用。

12.权利要求7至9中任一项的用途，其中所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖在一种组合物中一起施用。

13.具有式O25B’结构的大肠杆菌O25B抗原多糖：

具有式O1A’结构的大肠杆菌O1A抗原多糖：

具有式O2’结构的大肠杆菌O2抗原多糖：

具有式O6A’结构的大肠杆菌O6A抗原多糖：

用于制备疫苗的用途，所述疫苗用于在需要所述疫苗的个体中诱导针对肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的免疫应答，其包括向所述个体施用所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖，

其中n独立地为5至25的整数，

所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖各自独立地与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的载体蛋白共价结合，且

所述疫苗包含比率为8:4:4:4 µg或16:8:8:8 µg的所述大肠杆菌O25B、O1A、O2和O6A抗原多糖。

14.权利要求7至9和13中任一项的用途，其中所述免疫应答限制了在有风险人个体中由ExPEC血清型O1A、O2和O6A和O25B引起的侵袭性ExPEC疾病的严重性或预防了在有风险人个体中由ExPEC血清型O1A、O2和O6A和O25B引起的侵袭性ExPEC疾病。

15.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为尿道感染。

16.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为手术部位感染。

17.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为腹部或盆腔感染。

18.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为肺炎。

19.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为医院性肺炎。

20.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为骨髓炎。

21.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为蜂窝织炎。

22.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为脓毒症。

23.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为菌血症。

24.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为伤口感染。

25.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为肾盂肾炎。

26.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为脑膜炎。

27.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为新生儿脑膜炎。

28.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为腹膜炎。

29.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为胆管炎。

30.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为软组织感染。

31.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为化脓性肌炎。

32.权利要求14的用途，其中所述有风险人个体患有侵袭性ExPEC疾病或处于患有侵袭性ExPEC疾病的风险中，所述侵袭性ExPEC疾病为脓毒性关节炎。

33.一种制备权利要求1至6中任一项的组合物的方法，其包括将大肠杆菌O25B抗原多糖、大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖和大肠杆菌O6A抗原多糖组合，从而获得所述组合物。

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