EA037500B1 - Способы и композиции для иммунной защиты против внекишечной патогенной e. coli - Google Patents

Способы и композиции для иммунной защиты против внекишечной патогенной e. coli Download PDF

Info

Publication number
EA037500B1
EA037500B1 EA201890400A EA201890400A EA037500B1 EA 037500 B1 EA037500 B1 EA 037500B1 EA 201890400 A EA201890400 A EA 201890400A EA 201890400 A EA201890400 A EA 201890400A EA 037500 B1 EA037500 B1 EA 037500B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
coli
antigenic
antigen
polysaccharide
expec
Prior art date
Application number
EA201890400A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201890400A1 (ru
Inventor
Ян Тёнис Пулман
Берт Жакмин
Даррен Роберт Эббэнэт
Патрисия Ибарра Ён
Петер Вилхелмус Мария Германс
Михель Томас Коварик
Михель Лукас Веттер
Стэфан Йохан Кеммлер
Миха Андрес Хауптле
Вероника Гамбиллара
Мануэла Малли
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Янссен Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А., Янссен Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA201890400A1 publication Critical patent/EA201890400A1/ru
Publication of EA037500B1 publication Critical patent/EA037500B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Описаны композиции и способы для индукции иммунного ответа против внекишечной патогенной Escherichia coli (ExPEC), за счет этого обеспечивая иммунную защиту против заболеваний, ассоциированных с ExPEC. В частности, описаны композиции и способы применения конъюгатов антигенов полисахаридов E. coli O25B, O1A, O2 и O6A, ковалентно связанных с белком-носителем, обезвреженным экзотоксином A Pseudomonas aeruginosa (EPA), в качестве вакцин для предупреждения инвазивного заболевания ExPEC, вызванного ExPEC серотипов O1A, O2, O6A и O25B.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США 62/209091, поданной 24 августа 2015 г., и предварительной заявке на патент США 62/210655, поданной 27 августа, 2015 г., описание которых включено во всей полноте посредством ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям и способам для индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной Escherichia coli (ЕхРЕС) для обеспечения за счет этого иммунной защиты против заболеваний, ассоциированных с ЕхРЕС. В частности, воплощения настоящего изобретения относятся к мультивалентным вакцинам, содержащим конъюгаты полисахаридных антигенов Е. coli 025b, 01а, O2 и О6А, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa, и применениям указанных вакцин для обеспечения эффективной иммунной защиты против инфекции ЕхРЕС.
Предшествующий уровень техники
Внекишечная патогенная Е. coli (ЕхРЕС) обычно является безвредным организмом, заселяющим пищеварительный тракт человека. Однако штаммы ЕхРЕС могут обладать факторами вирулентности для колонизации и инфицирования сайтов за пределами желудочно-кишечного тракта, что вызывает различные тяжелые инвазивные заболевания, следствием которых являются ежегодная значительная заболеваемость, смертность и расходы (см., например, Johnson et al., J. Lab. Clin. Med. 2002; 139(3):155-162; Kohler et al., Int. J. Med. Microbiol. 2011; 301(8):642-647; Foxman, Am. J. Med. 2002; 113 Suppl. 1A:5S-13S; and Russo et al., Microbes Infect. 2003; 5(5):449-456). Штаммы ЕхРЕС являются наиболее частой причиной инфекций мочевыводящего тракта (ИМП). Они также являются причиной инфекций области операционного вмешательства и неонатального менингита (Johnson et al., 2002; and Russo et al., 2003), связаны с инфекциями брюшной полости и таза и нозокомиальной пневмонией, порой сопровождают другие внекишечные инфекции, такие как остеомиелит, панникулит и раневые инфекции. Все эти первичные очаги инфекции могут привести к бактериемии ExPEC (Russo et al., 2003). Устойчивость бактерий к антибиотикам является основной проблемой в борьбе с бактериальной инфекцией, и штаммы Е. coli с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) становятся все более и более широко распространенными (см., например, Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; и Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10): 1165-1176). Появление и быстрое массовое распространение ExPEC с типом последовательности 131 (ST131) считается основным фактором, вызывающим повышенную лекарственную устойчивость, включая множественную лекарственную устойчивость (Johnson et al., Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54(1):546-550; Rogers et al., J. Antimicrob Chemother. 2011; 66(1): 1-14). Этот клон обнаруживается у 12,5-30% от всех клинических изолятов ЕхРЕС, в основном имеет серотип О25В:Н4 и демонстрирует выраженную резистентность к фторхинолону, которая часто сопровождается устойчивостью к триметоприму/сульфаметоксазолу (Rogers et al., 2011, и Banerjee et al., Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58(9):4997-5004). Серотип О-антигена определяется химической структурой Ополисахаридного антигена, липополисахарида (LPS), являющегося составной частью внешней мембраны грамотрицательной бактерии. Описано более 180 О-антигенов Е. coli (Stenutz et al., FEMS Microbial Rev. 2006; 30: 382-403). Инфекция ExPEC может быть вызвана любым серотипом. Хотя при инфекции ЕхРЕС некоторые серотипы являются превалирующими, тем не менее поверхностные полисахариды изолятов ЕхРЕС демонстрируют существенное антигенное разнообразие, что чрезвычайно осложняет разработку вакцин против ЕхРЕС на основе поверхностных полисахаридов (Russo et al., Vaccine. 2007; 25: 38593870). Кроме того, некоторые О-антигены могут быть слабоиммуногенными. Как показали исследования вакцин на основе конъюгатов пневмококков, когда ряд серотипов могут вызывать заболевание, исключительно важное значение может иметь состав вакцины, как, например, выбор серотипов для включения в вакцину и дозировки включенных серотипов, поскольку применение вакцины против некоторых серотипов потенциально может увеличить носительство серотипов и заболевания, вызванные серотипами, не включенными в вакцину, или даже включенными в вакцину, но лишь слабо эффективными для иммунизации против серотипа (Lipsitch, Emerging Infectious Diseases; 1999, 5:336-345). В идеальном случае вакцина должна обеспечивать максимальную пользу в предупреждении заболеваний, вызванных серотипами, включенными в эту вакцину, при этом сводя к минимуму риск дополнительных заболеваний вследствие увеличения носительства серотипов, не входящих в состав вакцины.
Таким образом, в области техники существует потребность в вакцинах против ЕхРЕС. В частности, существует потребность в вакцинах против ЕхРЕС на основе поверхностных полисахаридов, которые могут применяться для обеспечения эффективной иммунной защиты против ЕхРЕС серотипа 025В и других серотипов, широко распространенных среди ЕхРЕС.
Краткое изложение сущности изоретения
При тестировании конъюгатов О-антигенов, каждый из которых ковалентно связан с белкомносителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин А Р. aeruginosa (ЕРА), неожиданно обнаружили, что антиген 025В Е. coli является несколько менее иммуногенным по сравнению с другими Оантигенами Е. coli (например, О1А, O2 и О6А), и что вакцинация композицией, содержащей конъюгаты ЕРА антигена Е. coli O25B и конъюгаты ЕРА одного или более дополнительных О-антигенов Е. coli в
- 1 037500 соответствующей дозе и соотношении обеспечивает улучшенный иммунный ответ против ЕхРЕС серотипа 025В и одного или более дополнительных О-серотипов ЕхРЕС. Соответственно, в одном общем аспекте изобретение относится к композиции, содержащей антиген Е. coli O25B в первой концентрации от 8 до 48 мкг/мл и по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli во второй концентрации, которая составляет от 10 до 100% от первой концентрации, где каждый из антигена Е. coli O25B и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli независимо ковалентно связан с белкомносителем ЕРА, и композиция эффективна в индуцировании иммунного ответа против антигена Е. coli O25B и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli у субъекта, нуждающегося в этом. В предпочтительном воплощении по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli присутствует во второй концентрации по меньшей мере 5 мкг/мл, более предпочтительно во второй концентрации по меньшей мере 8 мкг/мл.
В одном воплощении изобретение относится к композиции, содержащей антиген Е. coli O25B в первой концентрации от 10 до 36 мкг/мл, и по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli, выбранный из группы, состоящей из антигена Е. coli О1А, антигена Е. coli O2 и антигена Е. coli 06 а, где каждый из дополнительных О-антигенов Е. coli имеет концентрацию, которая независимо составляет от 50 до 100% от первой концентрации антигена Е. coli O25B в композиции, и каждый из антигенов Е. coli 025b, O1A, O2 и O6A независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА.
В одном предпочтительном воплощении изобретение относится к композиции, содержащей антиген Е. coli O25B в первой концентрации от 10 до 36 мкг/мл, и каждый из антигена Е. coli O1A, антигена Е. coli 02 и антигена Е. coli 06А во второй концентрации, где каждый из антигенов Е. coli 025B, 01А, 02 и 06А независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА и соотношение первой концентрации ко второй концентрации составляет от 1:1 до 2:1. Предпочтительно композиция содержит антигенные полисахариды Е. coli O25B, O1A, O2 и O6A в соотношении доз 1:1:1:1 или 2:1:1:1. Более предпочтительно композиция содержит 16 или 32 мкг/мл антигена 025В. В другом общем аспекте изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной Е. coli (ExPEC) у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту антигена Е. coli 025B в первом эффективном количестве от 4 до 24 мкг на введение и по меньшей мере одного дополнительного Оантигена Е. coli во втором эффективном количестве, которое составляет от 10 до 100% от первого эффективного количества, где каждый из антигена Е. coli 025B и по меньшей мере одного дополнительного Оантигена Е. coli независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА, и введение эффективно для индуцирования у субъекта иммунного ответа против антигена Е. coli 025B и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli. В предпочтительном воплощении по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli вводят во втором эффективном количестве по меньшей мере 3 мкг на введение, более предпочтительно во втором эффективном количестве по меньшей мере 4 мкг на введение. Антиген Е. coli 025B и по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli можно вводить в одной композиции или вводить в комбинации нескольких композиций.
В одном воплощении изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту антигена Е. coli 025B в первом эффективном количестве от 5 до 18 мкг на введение, более предпочтительно от 8 до 16 мкг на введение и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli , выбранного из группы, состоящей из антигена Е. coli 01А, антигена Е. coli 02 и антигена Е. coli 06А, где каждый из дополнительных Оантигенов Е. coli вводят в эффективном количестве, которое независимо составляет от 50 до 100% от первого эффективного количества антигена Е. coli 025B, и каждый из антигенов Е. coli 025B, 01А, 02 и 06А независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. В одном предпочтительном воплощении изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту антигена Е. coli 025B в первом эффективном количестве от 5 до 18 мкг на введение, более предпочтительно от 8 до 16 мкг на введение, и каждого из антигена Е. coli 01А, антигена Е. coli 02 и антигена Е. coli 06А во втором эффективном количестве, где каждый из антигенов Е. coli 025B, 01А, 02 и 06А независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА и соотношение первого эффективного количества ко второму эффективному количеству составляет от 1:1 до 2:1. Предпочтительно антигены Е. coli O25B, O1A, O2 и O6A вводят в дозовом соотношении 1:1:1:1 или 2:1:1:1 и антиген Е. coli 025B вводят в количестве 5 мкг, 8 мкг или 16 мкг на введение. В предпочтительном воплощении антигены Е. coli 025В, 01А, 02 и 06А вводят субъекту в одной композиции, более предпочтительно в композициях, содержащих антигены E. coli 025B, 01А, 02 и 06А, каждый из которых независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА, где концентрации указанных О-антигенов в композициях выбраны, соответственно, из 16:8:8:8 мкг/мл (т.е. 16 мкг/мл антигена O25B, 8 мкг/мл антигена O1A, 8 мкг/мл антигена O2 и 8 мкг/мл антигена O6A), 16:16:16:16 мкг/мл, 32:16:16:16 мкг/мл и 32:32:32:32 мкг/мл. Предпочтительно 0,5 мл такой композиции вводят субъекту для достижения дозы антигенов Е. coli O25B, O1A, O2 и O6A на введение, соответственно, 8:4:4:4 мкг (т.е. 8 мкг антигена O25B, 4 мкг антигена O1A, 4 мкг антигена O2 и 4 мкг антигена O6A), 8:8:8:8 мкг, 16:8:8:8 мкг или 16:16:16:16 мкг. Согласно предпочтительному воплощению иммунный ответ, индуцируемый способом по данному изобретению у субъекта, нуждающегося в этом, предупреждает инвазивное заболевание Ех
- 2 037500
РЕС, вызванное ЕхРЕС серотипов О1А, O2, О6А и 025В. Заболевания, связанные с заболеваниями ЕхРЕС, или заболевания ЕхРЕС включают без ограничения инфекции мочевыводящих путей, инфекции области операционного вмешательства, бактериемию, инфекции брюшной полости или таза, пневмонию, нозокомиальную пневмонию, остеомиелит, панникулит, пиелонефрит, раневые инфекции, менингит, неонатальный менингит, перитонит, холангит, инфекции мягких тканей, пиомиозит, септический артрит и сепсис. Предпочтительно субъект-человек является субъектом-человеком, подверженным риску, который имеет инвазивное заболевание ЕхРЕС, или подвержен риску его возникновения, таким как человек пожилого возраста, госпитализированный пациент, ребенок, человек с ослабленным иммунитетом, беременная женщина, люди с диабетом или раневыми повреждениями, люди, у которых недавно было проведено или планируется проведение хирургического вмешательства и т.д.
Согласно воплощению изобретения каждый из О-антигенов ковалентно связан с белком-носителем ЕРА по остатку Asn последовательности гликозилирования, содержащей Asp (Glu)-X-Asn-Z-Ser (Thr) (SEQ ID NO: 3), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты естественного происхождения, за исключением Pro. В предпочтительном воплощении белок-носитель ЕРА содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В другом воплощении О-антиген ковалентно связан с белкомносителем ЕРА при массовом соотношении полисахарид-белок от 1:7 до 1:2, предпочтительно от 1:5 до 1:2. Например, в конъюгате О-антиген/ЕРА согласно воплощению изобретения масса О-антигена может составлять от 15 до 50% или от 20 до 40% от массы ЕРА.
Другой аспект изобретения относится к способу получения композиции в соответствии с воплощением изобретения, включающий объединение в составе одной композиции антигенов Е. coli O25B, О1А, O2 и 06 а, каждый из которых независимо связан с белком-носителем ЕРА.
Следующий аспект изобретения относится к применению композиции в соответствии с воплощением изобретения для изготовления вакцины или лекарственного средства для индуцирования иммунного ответа против ЕхРЕС или для предупреждения или лечения заболевания, связанного с ЕхРЕС, у субъекта, нуждающегося в этом.
Краткое описание графических материалов
Приведенное ниже краткое описание, а также подробное описание изобретения будет более понятным при прочтении в привязке к графическим материалам. Следует понимать, что изобретение не ограничено конкретными воплощениями, приведенными в графических материалах. В графических материалах фиг. 1 является приведенным в качестве примера представлением платформы для получения гликоконъюгатной вакцины: цитоплазма (показана серым) клетки-хозяина содержит все ДНК конструкции, необходимые для рекомбинантной продукции конъюгата О-антиген/ЕРА в периплазме (показана белым) клетки-хозяина;
фиг. 2 является детальным представлением процесса гликозилирования белка, представленным в виде схемы;
на фиг. 3А-3В представлены показатели индекса опсонизации (IO), полученные с сывороткой, полученной у крыс до иммунизации (незакрашенные круги) и через 42 суток после иммунизации (закрашенные круги) одной примирующей дозой и двумя бустерными дозами моновалентной вакцины в указанных дозах; фиг. 3А: иммунизация 02-Ера; фиг. 3Б: иммунизация О6А-ЕРА; фиг. 3В: иммунизация О25В-ЕРА;
на фиг. 4 показаны титры ELISA (иммуноферментный анализ), полученные с сывороткой людей, вакцинированных плацебо или четырехвалентной вакциной, содержащей антигены Е. coli 01А, 02, 06А и 025b в количестве 4 мкг полисахарида на серотип; существенное увеличение титров ELISA после инъекции (30 суток после инъекции) по сравнению с титрами до инъекции (1 сутки) наблюдалось только в вакцинированных группах (* означает статистическую значимость, где несколько * означают увеличение уровня значимости; НД означает отсутствие достоверных различий); и на фиг. 5А-5Г изображены IO, полученные с сывороткой людей, вакцинированных четырехвалентной вакциной, содержащей антигены Е. coli O1A, O2, О6А и O25B в количестве 4 мкг полисахарида на серотип; иммунный ответ представлен I0 для плацебо в сравнении с компонентами четырехвалентной вакцины; фиг. 5А: О1А-ЕРА; фиг. 5Б: 02-ЕРА; фиг. 5В: О6А-ЕРА и фиг. 5Г: О25В-ЕРА; до инъекции (1 сутки) и после инъекции (30 суток после инъекции), где значимое увеличение IO после инъекции по сравнению со значениями до инъекции (обозначены *, несколько * означают увеличение уровня значимости; НД означает отсутствие достоверных различий) наблюдалось только в вакцинированных группах; НД означает отсутствие достоверных различий.
Подробное описание изобретения
Каждая из публикаций, статей и патентов, которые процитированы или описаны в разделе Предшествующий уровень техники или в других разделах описания, включены во всей полноте посредством ссылки. Обсуждение документов, действий, материалов, устройств, изделий и т.п., которые включены в настоящее описание, служит для раскрытия контекста изобретения. Такое обсуждение не является допущением, что какой-либо из указанных объектов или все из них являются частью уровня техники по отношению к любому из изложенных или заявленных изобретений.
- 3 037500
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют обычное значение, известное специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. В противоположном случае, некоторые упомянутые термины имеют значение, указанное в описании. Все патенты, опубликованные заявки на патент и публикации, процитированные в настоящем описании, включены посредством ссылки во всей полноте. Следует отметить, что в описании и формуле изобретения все термины в единственном числе охватывают указанные объекты во множественном числе, за исключением случаев, когда из контекста явным образом не следует противоположное.
В настоящем описании термины О-полисахарид, О-антиген, О-антиген, О-антигенный полисахарид, О-полисахаридный антиген и аббревиатура OPS относятся к О-антигену грамотрицательных бактерий, который является компонентом липополисахарида (LPS) и является специфичным для каждого серотипа или серо(под)типа грамотрицательных бактерий. О-антиген обычно содержит повторяющиеся единицы (RU), включающие от 2 до 7 сахарных остатков. В настоящем описании RU приравнивается к биологическим повторяющимся единицам (BRU). BRU описывает RU О-антигена, когда он синтезируется in vivo.
В настоящем описании термины конъюгат и гликоконъюгат относятся к конъюгированному продукту, содержащему О-антиген Е. coli, ковалентно связанный с белком-носителем. Конъюгат может представлять собой биоконъюгат, который является продуктом конъюгирования, полученным в клеткехозяине, где аппарат клетки-хозяина продуцирует О-антиген и белок-носитель и присоединяет О-антиген к белку-носителю, например, посредством N-связей. Конъюгат также может быть получен другими способами, например химическим соединением белка и углеводного антигена. В настоящем описании термин эффективное количество применительно к введению субъекту О-антигена способами согласно воплощениям изобретения относится к количеству О-антигена, достаточному для индуцирования у субъекта желаемого иммунного эффекта или иммунного ответа. В некоторых воплощениях эффективное количество относится к количеству О-антигена, которое достаточно, чтобы обеспечить иммунитет у субъекта для достижения у субъекта одного или более из следующих эффектов: (i) предотвратить развитие или начало инфекции ЕхРЕС, предпочтительно инвазивного заболевания ЕхРЕС или связанных с ним симптомов; (ii) предотвратить рецидив инфекции ЕхРЕС, предпочтительно инвазивного заболевания ЕхРЕС или связанных с ним симптомов; (iii) предупредить, сократить или уменьшить тяжесть инфекции ЕхРЕС, предпочтительно инвазивного заболевания ЕхРЕС или связанных с ним симптомов; (iv) сократить продолжительность инфекции ЕхРЕС, предпочтительно инвазивного заболевания ЕхРЕС или связанных с ним симптомов; (v) предотвратить прогрессирование инфекции ЕхРЕС, предпочтительно инвазивного заболевания ЕхРЕС или связанных с ним симптомов; (vi) вызвать регрессию инфекции ЕхРЕС или связанных с ней симптомов; (vii) предупредить или уменьшить органную недостаточность, связанную с инфекцией ExPEC; (viii) снизить вероятность или частоту госпитализаций субъекта, имеющего инфекцию ExPEC; (ix) уменьшить продолжительность госпитализации у субъекта, имеющего инфекцию ЕхРЕС; (х) повысить выживаемость субъекта с инфекцией ЕхРЕС, предпочтительно с инвазивным заболеванием ЕхРЕС; (xi) устранить инфекцию ЕхРЕС, предпочтительно инвазивного заболевания ЕхРЕС; (xii) подавить или снизить репликацию ЕхРЕС; и/или (xiii) усилить или улучшить профилактические или терапевтические эффекты другой терапии.
Эффективное количество может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как физическое состояние субъекта, возраст, масса, состояние здоровья и т.д.; способ введения, такой как пероральный или парентеральный; вводимая композиция, такая как целевой О-антиген, другие вводимые совместно О-антигены, адъювант и т.д.; и конкретное заболевание, против которого необходим иммунитет. Когда О-антиген ковалентно связан с белком-носителем, эффективное количество О-антигена рассчитывают только по О-антигенной полисахаридной группировке, входящей в состав конъюгата.
В настоящем описании термин в комбинации применительно к введению субъекту двух или более О-антигенов или композиций не ограничивает порядка, в котором субъекту вводят О-антигены или композиции. Например, первую композицию можно вводить до (например, за 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 16 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно или после (например, через 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 16 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения субъекту второй композиции.
В настоящем описании субъект означает любое животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека, которое будет или было вакцинировано способом согласно воплощению изобретения. Термин млекопитающее, используемый в настоящем описании, охватывает любое млекопитающее. Примеры млекопитающих включают без ограничения коров, лошадей, овец, свиней, кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, обезьян, человека и т.д., наиболее предпочтительно человека. В некоторых воплощениях человеком является ребенок грудного возраста. В другом воплощении человеком является ребенок. В другом воплощении человеком является взрослый человек. В конкретном воплощении субъектом является взрослый человек, подверженный риску. В другом воплощении человеком является человек пожилого возраста. В другом воплощении человеком является ребенок грудного возраста, включая недоношенного ребенка грудного возраста и ребенка грудного возраста, рожденного в
- 4 037500 срок. В другом воплощении человеком является ребенок ясельного возраста. Термины субъект и пациент в настоящем описании могут использоваться взаимозаменяемо.
В настоящем описании термин недоношенный ребенок грудного возраста относится к ребенку грудного возраста, появившемуся на свет менее чем на 37 неделе гестации.
В настоящем описании термин ребенок грудного возраста охватывает детей от новорожденного до годовалого возраста.
В настоящем описании термин ребенок ясельного возраста относится к людям в возрасте от 1 до 3 лет.
В настоящем описании термин ребенок относится к людям в возрасте от 1 до 18 лет.
В настоящем описании термин взрослый относится к людям в возрасте 18 лет или старше.
В настоящем описании термин взрослый, подверженный риску относится к людям в возрасте 18 лет или старше, которые более предрасположены к инфекции ЕхРЕС, по сравнению с популяцией взрослых людей в среднем. Примеры взрослых, подверженных риску включают без ограничения людей пожилого возраста, людей с ослабленным иммунитетом, беременных женщин, людей с диабетом или раневыми повреждениями, людей, у которых недавно было проведено или планируется проведение хирургического вмешательства и т.д.
В настоящем описании термин человек пожилого возраста относится к людям в возрасте 55, предпочтительно 60, более предпочтительно 65 лет или старше.
В настоящем описании инвазивное заболевание ЕхРЕС определяют, как выделение ЕхРЕС из участков организма, в норме являющихся стерильными, и их обнаружение у человека, имеющего острое заболевание, указывающее на бактериальную инфекцию.
В настоящем описании иммунологический ответ или иммунный ответ на антиген или композицию относится к развитию у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа против антигена или против антигена, присутствующего в композиции.
Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что антиген Е. coli O25B, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, является менее иммуногенным по сравнению с другими О-антигенами Е. coli (например, О1А, O2 и 06а), конъюгированными с белком-носителем ЕРА. Данное открытие привело к дальнейшим исследованиям дозировок антигена Е. coli O25B и соотношениям дозировок различных Оантигенов Е. coli в составе мультивалентной вакцины и, таким образом, к разработке мультивалентных вакцин и способов иммунизации на основе О-антигенов Е. coli для улучшения иммунных ответов против серотипа 025В и других серотипов ЕхРЕС.
Эпидемиология.
Исследования распределения серотипов Е. coli, вызывающих заболевание ЕхРЕС, указывают, что согласно оценкам IO преобладающих О-серотипов могут охватывать 60-80% инфекций ЕхРЕС с учетом охвата части нетипируемых штаммов. См., например, табл. 1А-1В ниже. В целевых популяциях с ИМП и бактериемией серотипы O1, O2, O6 и O25 идентифицированы как четыре наиболее широкораспространенных серотипа Е. coli, среди которых серотип O25 был самым широкораспространенным серотипом Е. coli при бактериемии. Также обнаружили, что в случае серотипа О-антигена, который включает различные, но при этом структурно и антигенно родственные подтипы, один подтип может быть более широкораспространенным среди клинических изолятов по сравнению с другими. Например, установили, что антигены О1А, О6А и 025В являются наиболее распространенными подтипами среди проанализированных клинических штаммов или изолятов для серотипов O1, O6 и O25 соответственно. См. соответствующее описание эпидемиологических исследований в заявке на международный патент РСТ/ЕР 2015/053739, содержание которой включено во всей полноте посредством ссылки.
- 5 037500
Таблица 1А
Распределение наиболее часто встречающихся ассоциированных с ИМП серотипов Е. coli из коллекции, включающей 1841 образец мочи, собранных в Швейцарии в 2012 Показано распределение серотипов в образцах соответствующей субпопуляции, включающей 671 субъект, и распределение во всех * * образцах
Наиболее распространенные серотипы Е, coli, ассоциированные с ИМП
О-серотип Внебольничные ИМП у 18-70 летних* (п-671) О-серотип Внебольничные и внутрибольничные ИМП у всех возрастов ** (п=1871)
6 10,75% 2 8,75%
2 9,55% 6 8,47%
25 6,87% 25 8,37%
1 5,52% 75 4,56%
4 5,37% 1 4,29%
75 4,78% 8 3,86%
8 3,43% 18 3,53%
18 3,28% 4 3,26%
15 3,28% 15 2,39%
73 2,24% 73 2,17%
16 2,24% 16 1,85%
7 1,94% 7 1,68%
Таблица 1Б
Распространенность наиболее часто встречающихся серотипов, ассоциированных с ИМП, по данным публикаций за период 1987-2011 гг. и по данным ретроспективных исследований, проведенных в США за период 2000-2011 гг. (ECRC)
УСЛОВИЕ Все ИМП ЦИСТИТ ПИЕЛОНЕФРИТ США 2000- 2010
Данные, имеющиеся для 1860 изолятов Данные, имеющиеся для 1089 изолятов Данные, имеющиеся для 373 изолятов 315 (все образцы ИМП за исключением фекальных, М+Ж всех возрастов)*
Серотип
01 4,8% 4,1% 5,4% 7,0%
02 7,1% 4,9% 15,3% 14,0%
04 7,8% 6,0% 3,2% 3,2%
Об 16,9% 16,3% 7,8% 18,7%
07 3,3% 2,4% 2,4% 1,9%
08 1,7% 3,2% 0,8% 3,5%
015 0,6% 1,5% 0,8% 1,3%
- 6 037500
016 4,3% 3,2% 7,2% 1,9%
018 7,0% 7,1% 6,7% 7,0%
021 НД НД НД 1,3%
022 0,6% 0,6% 0,5% 0,0%
025 3,0% 4,8% 0,5% 8,6%
075 7,5% 6,0% 8,6% 3,8%
083 1,9% 0,7% 0,5% 1,3%
020 1,6%
077 2,2%
082 1,9%
другие и нетипируемые/ нет данных 33,3% 39,2% 40,2%
другие 0-типы (нетипируемые -нет данных) 21,0%
*Число нетипируемых - нет данных
Таблица 1В Распределение наиболее часто встречающихся О-серотипов Е. coli, ассоциированных с бактериемией, из коллекции 860 изолятов из образцов крови, собранных в США и ЕС за период 2011-2013 гг.
Приведено относительное распределение О-серотипов в образцах
О-серотип Бактериемия у субъектов > 60 лет США/ЕС 2011-2013 (п=860)
25 19,2
2 8,8
6 8,3
1 7,8
75 з,з
4 2,8
16 2,7
18 2,7
15 2,3
8 2,0
153 1,6
73 1,6
Новый агглютинирующий клон O25, недавно появившийся среди изолятов Е. coli, выделенных в нозокомиальной среде, обозначен 025b. Субтипирование О-серотипа O25 посредством ПЦР позволило установить, что в подавляющем большинстве случаев это был подтип 025В (при исследовании 24 клинических изолятов с фенотипом O25, дающих положительную реакцию агглютинации, 20 были отнесены к подтипу 025В, тогда как оставшиеся 4 были отнесены к подтипу О25А, а в популяции с бактериемией, исследованной позднее, 56 из 57 исследованных изолятов серотипа O25 были типированы как 025В). Подтвердили, что аутологичная антисыворотка распознает аутологичный антиген лучше, чем неаутологичный антиген, и таким образом, включение антигена 025В в вакцину может обеспечить лучшую защиту против преобладающих клинических штаммов 025В группы O25, чем включение антигена О25А (см., например, заявку на международный патент РСТ/ЕР 2015/053739). Результаты показали, что вакцина 025В может привести к получению сыворотки, перекрестно реагирующей с антигеном О25А, таким образом одновременно обеспечивая иммунный ответ против серотипа О25А (Id.). Композиции согласно воплощениям изобретения содержат антиген Е. coli O25B, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, и другие О-антигены Е. coli, конъюгированные с белком-носителем ЕРА.
Композиции, содержащие конъюгаты О-антигена Е. coli.
В одном общем аспекте изобретение относится к мультивалентной вакцине, содержащей О-антиген серотипов, преимущественно встречающихся среди клинических изолятов Е. coli, которую можно применять для обеспечения активной иммунизации для предупреждения заболевания, вызываемого ЕхРЕС,
- 7 037500 имеющей О-антигены серотипов, содержащихся в вакцине. В одном воплощении изобретение относится к композиции, содержащей антиген Е. coli O25B в первой концентрации от 8 до 48 мкг/мл и по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli во второй концентрации, которая составляет от 10 до 100% от первой концентрации, где каждый из антигена Е. coli O25B и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА.
Предпочтительно по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli, который применяют в композициях согласно воплощениям изобретения, является широкораспространенным среди клинических изолятов Е. coli. Примеры таких дополнительных О-антигенов включают антигены Е. coli O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O73, O75 и O153, но не ограничиваются ими. В зависимости от необходимости композиция может включать более чем один дополнительный О-антиген Е. coli, например два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять дополнительных О-антигенов Е. coli для обеспечения иммунной защиты против множества серотипов Е. coli помимо серотипа Е. coli O25B. В предпочтительном воплощении дополнительный О-антиген Е. coli выбран из группы, состоящей из антигенов Е. coli O1, O2 и O6. Более предпочтительно дополнительный О-антиген Е. coli выбран из группы, состоящей из антигенов Е. coli О1А, O2 и 06 а.
В одном воплощении композиция по изобретению содержит антиген Е. coli 025В в первой концентрации от 10 до 36 мкг/мл и антигены Е. coli О1А, O2 и О6А, концентрация каждого из которых независимо составляет от 10 до 100% от первой концентрации, где каждый из антигена Е. coli O25B и дополнительных О-антигенов Е. coli независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. В предпочтительном воплощении каждый из антигенов Е. coli О1А, O2 и О6А независимо присутствует в концентрации по меньшей мере 5 мкг/мл, более предпочтительно в концентрации по меньшей мере 8 мкг/мл.
Композиция согласно воплощению изобретения содержит антиген Е. coli O25B в концентрации, которая является такой же или более высокой, чем концентрация любого из дополнительных О-антигенов в составе композиции. Например, композиция может иметь антиген Е. coli O25B в первой концентрации, например, 10, 16, 24, 32 или 36 мкг/мл и один или более дополнительных О-антигенов Е. coli, концентрация каждого из которых составляет, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% от первой концентрации. Когда композиция содержит более одного дополнительного О-антигена, все дополнительные О-антигены могут иметь одинаковую концентрацию, которая составляет от 10 до 100% от концентрации антигена Е. coli O25B в композиции. Альтернативно, дополнительные О-антигены также могут иметь различные концентрации, каждая из которых независимо составляет 10-100% от концентрации антигена Е. coli 025В. Предпочтительно композиция содержит 32 мкг/мл антигена Е. coli O25B и независимо от 16 до 32 мкг/мл каждого из одного или более дополнительных О-антигенов, где каждый из антигена Е. coli O25B и дополнительных О-антигенов Е. coli независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. В другом предпочтительном воплощении композиция содержит 16 мкг/мл антигена Е. coli O25B и независимо от 8 до 16 мкг/мл каждого из одного или более дополнительных О-антигенов, где каждый из антигена Е. coli 025В и дополнительных О-антигенов Е. coli независимо ковалентно связан с белкомносителем ЕРА.
В одном предпочтительном воплощении изобретение относится к композиции, содержащей антиген Е. coli O25B в первой концентрации от 10 до 36 мкг/мл, и каждый из антигена Е. coli О1А, антигена Е. coli O2 и антигена Е. coli О6А во второй концентрации, где каждый из антигенов Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА, и соотношение первой концентрации ко второй концентрации составляет от 1:1 до 2:1.
Предпочтительно композиция содержит антигены Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А в соотношении доз 1:1:1:1 или 2:1:1:1 и композиция содержит 32 мкг/мл антигена Е. coli 025В, где каждый из О-антигенов ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. В другом предпочтительном воплощении композиция содержит антигены Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А в соотношении доз 1:1:1:1 или 2:1:1:1 и композиция содержит 16 мкг/ил антигена-Е. coli O25B, где каждый из О-антигенов ковалентно связан с белкомносителем ЕРА. Более предпочтительно каждый из антигенов Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белком-носителем, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и каждый конъюгат О-антигена и белка-носителя ЕРА получен в клетке, т.е. является биоконъюгатом. Более предпочтительно антигены Е. coli 025В, О1А, O2 и О6А содержат, соответственно, структуры формулы 025В', формулы О1А', формулы O2' и формулы О6А', раскрытые ниже.
Раскрытые в настоящем описании композиции могут найти применение в лечении и предупреждении у субъектов (например, у людей) инфекции ЕхРЕС. В некоторых воплощениях раскрытая в настоящем описании композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, помимо того, что она содержит О-антигены Е. coli, ковалентно связанные с белком-носителем ЕРА. В настоящем описании термин фармацевтически приемлемый означает одобренный федеральными или региональными органами регулирования или включенный в фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею для применения у животных, и, в частности, у людей. Термин носитель, используемый в настоящем описании применительно к фармацевтически приемлемому носителю, обозначает разбавитель, адъювант, эксципиент или несущую среду, с которыми вводят фармацевтическую композицию. В качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов могут применяться солевые растворы, водные рас
- 8 037500 творы декстрозы и глицерина. Подходящие эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в издании Remington's Pharmaceutical Sciences под ред. E.W. Martin.
В конкретном воплощении предложена композиция, содержащая антиген Е. coli 025b, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и один или более дополнительных О-антигенов Е. coli, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. В другом конкретном воплощении предложена композиция, которая содержит: (i) биоконъюгат, содержащий антиген Е. coli O25B, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и (ii) биоконъюгат, содержащий антиген Е. coli О1А, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА.
В другом конкретном воплощении предложена композиция, которая содержит: (i) биоконъюгат, содержащий антиген Е. coli O25B, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и (ii) биоконъюгат, содержащий антиген Е. coli O2, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА.
В другом конкретном воплощении предложена композиция, которая содержит: (i) биоконъюгат, содержащий антиген Е. coli O25B, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и (ii) биоконъюгат, содержащий антиген Е. coli O6A, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА.
В другом конкретном воплощении предложена композиция, которая содержит биоконъюгат, содержащий антиген Е. coli O25B, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и два или более биоконъюгатов, выбранных из группы, состоящей из (i) биоконъюгата, содержащего антиген Е. coli О1А, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА; (ii) биоконъюгата, содержащего антиген Е. coli O2, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и (iii) биоконъюгата, содержащего антиген Е. coli O6A, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА.
В другом конкретном воплощении предложена композиция, которая содержит: (i) биоконъюгат Е. coli O25B, содержащий антиген Е. coli O25B, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА; (ii) биоконъюгат Е. coli О1А, содержащий антиген Е. coli О1А, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА; (iii) биоконъюгат Е. coli O2, содержащий антиген Е. coli O2, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и (iv) биоконъюгат Е. coli O6A, содержащий антиген Е. coli O6A, ковалентно связанный с белкомносителем ЕРА, где (i), (ii), (iii), и (iv) составлены в виде единой композиции.
В другом конкретном воплощении предложена композиция, которая содержит: (i) биоконъюгат Е. coli O25B, содержащий антиген Е. coli O25B, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА; (ii) биоконъюгат Е. coli О1А, содержащий антиген Е. coli О1А, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА; (iii) биоконъюгат Е. coli O2, содержащий антиген Е. coli O2, ковалентно связанный с белком-носителем ЕРА, и (iv) биоконъюгат Е. coli О6А, содержащий антиген Е. coli O6A, ковалентно связанный с белкомносителем ЕРА, где (i), (ii), (iii), и (iv) составлены в виде отдельных композиций, которые вводят в комбинации в соответствии со способом согласно воплощению изобретения. В некоторых воплощениях раскрытые ниже композиции возможно содержат белок-носитель ЕРА, ковалентно связанный с Оантигеном Е. coli, отличным от Е. coli О1А, O2, О6А и 025В. Другие О-антигены Е. coli О включают, но не ограничиваются ими, дополнительные О-антигены, представленные в табл. 1А-1В выше. Предложенные композиции могут использоваться для индуцирования иммунного ответа у хозяина, которому вводят композицию, т.е. являются иммуногенными. Таким образом, раскрытые здесь композиции могут применяться в качестве вакцин против инфекции ЕхРЕС и могут содержать любые дополнительные компоненты, подходящие для применения в вакцине. В конкретном воплощении композиции, раскрытые в настоящем описании, являются мультивалентными композициями, например по меньшей мере четырехвалентными композициями, содержащими биоконъюгаты О-антигенов Е. coli серотипов/подсеротипов 025В, О1А, О6А и O2.
В некоторых воплощениях раскрытые композиции дополнительно содержат консервант, такой как производное ртути, представляющее собой тимеросал. В конкретном воплощении фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем описании, содержат от 0,001 до 0,01% тимеросала. В других воплощениях фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем описании, не содержат консервант.
В некоторых воплощениях композиции, раскрытые в настоящем описании (например, иммуногенные композиции), содержат адъювант или вводятся в комбинации с адъювантом. Адъювант для введения в комбинации с композицией, раскрытой в настоящем описании, может вводиться до, одновременно или после введения указанной композиции. В некоторых воплощениях термин адъювант относится к соединению, которое при введении в сочетании или в составе композиции, раскрытой в настоящем описании, усиливает и/или повышает иммунный ответ на биоконъюгат, однако когда вводят только соединение адъювант, иммунный ответ на биоконъюгат не вырабатывается. В некоторых воплощениях адъювант вызывает иммунный ответ на поливалентный биоконъюгат пептида и не вызывает аллергии или иной нежелательной реакции. Усиление иммунного ответа адъювантами может быть опосредовано несколькими механизмами, включая, например, рекрутинг лимфоцитов, стимулирование В и/или Т клеток или стимулирование макрофагов. В некоторых предпочтительных воплощениях композиции, раскрытые в настоящем описании, не содержат адъювант помимо биоконъюгатов и/или не вводятся в комбинации с
- 9 037500 адъювантами помимо биоконъюгатов (в случае, если биоконъюгаты будут обладать некоторыми присущими им адъювантными свойствами, их не будут учитывать и в этих воплощениях внешний адъювант добавлять не будут). Конкретные примеры адъювантов включают соли алюминия (такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия и сульфат алюминия), 3-де-О-ацетилированный монофосфорил липид A (MPL) (см. патент Великобритании GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), полисорбат 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), имидазопиридиновые соединения (см. международную заявку PCT/US 2007/064857, опубликованную как международная публикация WO 2007/109812), имидазохиноксалиновые соединения (см. международную заявку PCT/US 2007/064858, опубликованную как международная публикация WO 2007/109813) и сапонины, такие как QS21 (см. Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); патент US 5057540), но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях адъювант представляет собой адъювант Фрейнда (полный или неполный). Другие адъюванты представляют собой эмульсии масло-в-воде (такие как сквален или арахисовое масло), возможно в комбинации с иммуностимуляторами, такими как монофосфорил липид А (см. Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91). Другим адъювантом является CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998).
В некоторых воплощениях композиции, раскрытые в настоящем описании, составлены так, чтобы быть подходящими для предполагаемого способа введения субъекту. Например, композиции, раскрытые в настоящем описании, могут быть составлены, чтобы подходить для подкожного, парентерального, перорального, внутрикожного, чрескожного, колоректального, внутрибрюшинного и ректального введения. В конкретном воплощении фармацевтическая композиция может быть составлена для внутривенного, перорального, внутрибрюшинного, интраназального, интратрахеального, подкожного, внутримышечного, поверхностного, внутрикожного, чрескожного или легочного введения. В некоторых воплощениях композиции, раскрытые в настоящем описании, вводят посредством внутримышечной инъекции. В некоторых воплощениях раскрытые композиции дополнительно содержат один или более буферов, например Трис-буфер, фосфатный буфер и сахарозо-фосфатно-глутаматный буфер.
В некоторых воплощениях композиции, раскрытые в настоящем описании, дополнительно содержат одну или более солей, например Трис-гидрохлорид, хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид калия, фосфат натрия, глутамат натрия и соли алюминия (например, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия-калия или смеси указанных солей алюминия). В одном воплощении композиция по изобретению содержит биоконъюгаты, раскрытые в настоящем описании в Трис-буферном солевом растворе (TBS) рН 7,4 (например, содержащие Трис, NaCl и KCl, например, 25 мМ, 137 мМ и 2,7 мМ соответственно).
Раскрытые в настоящем описании композиции могут находиться в контейнере, упаковке или диспенсере вместе с инструкциями по применению.
Композиции, раскрытые в настоящем описании, можно хранить перед применением, например композиции можно хранить в замороженном состоянии (например, при температуре приблизительно -20°С или приблизительно -70°С); хранить в прохладных условиях (например, приблизительно при 4°С) или хранить при комнатной температуре.
Способы/применения.
В другом общем аспекте изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом. Предпочтительно иммунный ответ является эффективным для предупреждения или лечения заболевания, связанного с ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту антигена Е. coli O25B в первом эффективном количестве от 4 до 24 мкг на введение и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli во втором эффективном количестве, которое составляет от 10 до 100% от первого эффективного количества, где каждый из антигена Е. coli O25B и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА, и композиция эффективна для индуцирования у субъекта, нуждающегося в этом, иммунного ответа против антигена Е. coli O25B и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli.
Предпочтительно по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli, который используют в способах и применениях по изобретению, является широко распространенным среди клинических изолятов Е. coli. Примеры таких дополнительных О-антигенов включают антигены Е. coli O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O73, O75 и O153, но не ограничиваются ими. В зависимости от необходимости для обеспечения иммунной защиты против множества серотипов Е. coli в дополнение к серотипу Е. coli O25B можно вводить более чем один дополнительный О-антиген Е. coli, например два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять дополнительных О-антигенов Е. coli.
В предпочтительном воплощении способ по изобретению индуцирует иммунный ответ у субъекта, нуждающегося в этом, против ЕхРЕС серотипа O25, а один или более дополнительных О-антигенов Е. coli выбраны из группы, состоящей из антигенов Е. coli O1, O2 и O6. Предпочтительно способ по изобретению индуцирует иммунный ответ у субъекта, нуждающегося в этом, против ЕхРЕС серотипа 025b, и один или более дополнительных О-антигенов Е. coli выбраны из группы, состоящей из антигенов Е. coli О1А, O2 и О6А. Способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антигена Е. coli O25B в
- 10 037500 первом эффективном количестве от 5 до 18 мкг на введение и антигены Е. coli О1А, O2 и О6А, концентрация каждого из которых независимо составляет от 10 до 100% от первого эффективного количества, где каждый из антигена Е. coli O25B и дополнительных О-антигенов Е. coli независимо ковалентно связаны с белком-носителем ЕРА. В предпочтительном воплощении каждый из антигенов Е. coli О1А, O2 и 06а независимо вводят во втором эффективном количестве по меньшей мере 3 мкг на введение, более предпочтительно во втором эффективном количестве по меньшей мере 4 мкг на введение.
В способе согласно воплощению изобретения вводимое эффективное количество антигена Е. coli O25B является таким же или более высоким, чем вводимое эффективное количество любого из дополнительных О-антигенов. Например, антиген Е. coli O25B можно вводить в первом эффективном количестве от 4 до 24 мкг на введение и по меньшей мере один дополнительный О-антиген Е. coli можно вводить во втором эффективном количестве, которое составляет, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% от первого эффективного количества. Когда в комбинации вводят более чем один дополнительный Оантиген, все дополнительные О-антигены можно вводить в одинаковом эффективном количестве, которое составляет от 10 до 100% от первого эффективного количества антигена Е. coli O25B. Дополнительные О-антигены также можно вводить в различных эффективных количествах, каждое из которых независимо составляет 10-100% от первого эффективного количества антигена Е. coli 025В. Предпочтительно антиген Е. coli O25B вводят в первом эффективном количестве от 5 до 18 мкг, и по меньшей мере один дополнительный О-антиген вводят во втором эффективном количестве, которое независимо составляет от 50 до 100% от первого эффективного количества.
В одном воплощении изобретения способ индуцирования иммунного ответа против ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом, включает введение субъекту антигена Е. coli O25B в первом эффективном количестве, составляющем, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 мкг на введение, и каждый из антигенов Е. coli О1А, O2 и О6А в эффективном количестве, которое независимо составляет, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% от первого эффективного количества, где каждый из антигена Е. coli 025В и дополнительных О-антигенов Е. coli независимо ковалентно связаны с белкомносителем ЕРА.
В одном предпочтительном воплощении изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту антигена Е. coli O25B в первом эффективном количестве от 5 до 18 мкг на введение, и каждого из антигена Е. coli О1А, антигена Е. coli O2 и антигена Е. coli O6A во втором эффективном количестве, где каждый из антигенов Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белком-носителем ЕРА и соотношение первого эффективного количества ко второму эффективному количеству составляет от 1:1 до 2:1. Предпочтительно антигены Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А вводят субъекту в дозовом соотношении 1:1:1:1 или 2:1:1:1 и антиген Е. coli O25B вводят в количестве 5 мкг, 8 мкг или 16 мкг на введение. Также предпочтительно антигены Е. coli 025В, О1А, O2 и О6А вводят субъекту в одной композиции.
Предложены способы и применения композиций по изобретению для индуцирования иммунного ответа против ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту антигена Е. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, и по меньшей мере одного или более дополнительных О-антигенов Е. coli, ковалентно связанных с белком-носителем ЕРА. В конкретном воплощении раскрытые в настоящем описании композиции также применяют для вакцинации людей для обеспечения защитного иммунитета против инфекции ЕхРЕС у людей. Также предложены способы, индуцирующие образование опсонофагоцитарных антител против ЕхРЕС у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту антигена Е. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, и по меньшей мере одного дополнительного О-антигена Е. coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА. В одном воплощении указанный субъект имеет инфекцию ЕхРЕС во время введения. В другом воплощении указанный субъект не имеет инфекцию ЕхРЕС во время введения. Примеры инфекций, вызванных ЕхРЕС, включают инфекции мочевыводящих путей, инфекции области операционного вмешательства, бактериемию, инфекции брюшной полости или таза, пневмонию, нозокомиальную пневмонию, остеомиелит, панникулит, раневые инфекции, менингит, неонатальный менингит, перитонит, холангит, инфекции мягких тканей, пиомиозит, септический артрит и сепсис, но не ограничиваются ими. Предпочтительно инфекции, вызванные ЕхРЕС, представляют собой инвазивное заболевание ЕхРЕС, вызванное ЕхРЕС серотипов, антигены которых включены в композиции или способы согласно воплощениям изобретения.
Результатом способов индуцирования иммунного ответа у субъекта, раскрытых в настоящем описании, является вакцинация субъекта против инфекции, вызванной штаммами ЕхРЕС, антигены которых присутствуют в композиции(ях). Когда используют подтип О-антигена, способ по изобретению также может индуцировать иммунный ответ против другого подтипа О-антигена, обладающего схожими антигенными свойствами. В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный способом или композицией, раскрытыми в настоящем описании, является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O25. В конкретном воплощении указанный серотип O25 представляет собой 025В. В другом конкретном воплощении указанный серотип O25 представляет собой О25А.
- 11 037500
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный способом или композицией, раскрытыми в настоящем описании, является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O25, например серотипа 025b, и серотипа O1, например серотипа О1А.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный способом или композицией, раскрытыми в настоящем описании, является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O25, например серотипа 025В, и серотипа O2.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный способом или композицией, раскрытыми в настоящем описании, является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O25, например серотипа 025В, и серотипа O6, например серотипа О6А.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный способом или композицией, раскрытыми в настоящем описании, является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O25 (например, 025В и/или О25А), и двумя или более следующими серотипами Е. coli: O1 (например, О1А, 01В и/или О1С), O2 и/или O6 (например, О6А и/или O6GlcNAc). В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный способом или композицией, раскрытыми в настоящем описании, является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной каждым из следующих серотипов Е. coli: O25 (например, 025В и/или О25А), O1 (например, О1А, 01В и/или О1С), O2 и O6 (например, О6А и/или O6GlcNAc).
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный способом или композицией, раскрытыми в настоящем описании, является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O25, например серотипа 025В, и серотипа Е. coli, отличного от O1, O2, O6 или O25, включая, без ограничений, дополнительные О-серотипы, приведенные в табл. 1А-1В. Для иммунизации субъекта против инфекции ЕхРЕС субъекту можно вводить единственную композицию, раскрытую в настоящем описании, где указанная композиция содержит антиген Е. coli O25B и один, два, три, четыре или более дополнительных О-антигенов Е. coli, раскрытых в настоящем описании, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. Альтернативно, для лечения субъекта, имеющего инфекцию ЕхРЕС, или для иммунизации субъекта против инфекции ЕхРЕС множество композиций, раскрытых в настоящем описании, можно вводить субъекту в комбинации. Например, субъекту можно вводить композицию, содержащую антиген Е. coli O25B, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, в комбинации с введением двух, трех, четырех или более композиций, содержащих дополнительные Оантигенные конъюгаты согласно воплощениям изобретения.
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный у субъекта после введения композиции, раскрытой в настоящем описании, эффективен для предупреждения или уменьшения симптомов, возникающих в результате инфекции ЕхРЕС, предпочтительно по меньшей мере у 30%, более предпочтительно по меньшей мере у 40%, например по меньшей мере у 50% субъектов, которым ввели композицию. Симптомы инфекции ЕхРЕС могут варьировать в зависимости от природы инфекции и могут включать, без ограничения, дизурию, учащенное мочеиспускание или ургентность, пиурию, гематурию, боль в спине, боль в области таза, боль при мочеиспускании, лихорадку, озноб и/или тошноту (например, у субъектов, имеющих инфекции мочевыводящих путей, вызванные ЕхРЕС); сильный жар, головную боль, ригидность затылочных мышц, тошноту, рвоту, судороги, сонливость и/или светобоязнь (например, у субъектов, имеющих менингит, вызванный ЕхРЕС); лихорадку, усиленное сердцебиение, учащенное дыхание, пониженный диурез, пониженное количество тромбоцитов, боли в области живота, затрудненное дыхание и/или аномалии сердечной деятельности (например, у субъектов, имеющих сепсис, вызванный ЕхРЕС).
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный у субъекта после введения композиции, раскрытой в настоящем описании, эффективен для снижения вероятности госпитализации субъекта, страдающего инфекцией ЕхРЕС. В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный у субъекта после введения композиции, раскрытой в настоящем описании, эффективен для снижения продолжительности госпитализации субъекта, страдающего инфекцией ЕхРЕС.
О-антигены Е. coli.
Воплощения изобретения относятся к композициям и способам, относящимся к антигену Е. coli O25B и одному или более дополнительным О-антигенам Е. coli. Предпочтительно дополнительный Оантиген является широкораспространенным среди клинических изолятов Е. coli. Примеры антигенов Е. coli, которые могут применяться в изобретении, включают антигены Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А, но не ограничиваются ими.
В настоящем описании антиген Е. coli O25B относится к О-антигену, специфическому для серотипа Е. coli O25B. В одном воплощении антиген Е. coli O25B содержит структуру формулы 025В
- 12 037500
D-GIc
D-GIc----► L-Rha2Ac----► D-GIcNAc
L-Rha предпочтительно антиген is. coli 025В содержит структуру формулы 025В' D-GIc β 6 a
D-GIc--1,3 3 a
L-Rha2Ac 3 ► D-GIcNAc
L-Rha где n в формуле 025b или формуле 025b' является целым числом от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении изобретения n в формуле O25B или в формуле O25B' является целым числом от 1 до 20. Предпочтительно популяцию антигенов Е. coli O25B, имеющих структуру формулы O25B, более предпочтительно формулы O25B', используют в композициях и способах согласно воплощениям изобретения, где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli O25B в популяции является целым числом от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении изобретения n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli O25B в популяции является целым числом от 10 до 20.
В настоящем описании антиген Е. coli O1 относится к О-антигену, специфическому для серотипа Е. coli O1. В одном воплощении антиген Е. coli O1 представляет собой антиген Е. coli О1А.
В настоящем описании антиген Е. coli 01А относится к О-антигену, специфическому для серотипа Е. coli 01А.
В одном воплощении антиген Е. coli 01А содержит структуру формулы 01А
L-Rha----► L-Rha----►L-Rha----► D-GIcNAc
D-ManNAc предпочтительно антиген Е. coli 01А содержит структуру формулы 01А'
α α β
L-Rha----► L-Rha „ „ ►L-Rha „ ► D-GIcNAc л 1,3 1,3 1,4 β 2
D-ManNAc где n в формуле 01А или формуле 01А' является целым числом от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении n в формуле 01А или формуле 01А' является целым числом от 7 до 15.
Предпочтительно популяцию антигенов Е. coli 01А, имеющих структуру формулы 01А, более предпочтительно формулы 01А' применяют в композициях и способах согласно воплощениям изобретения, где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli 01А в популяции имеет значения от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении изобретения n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli 01А в популяции является целым числом от 5 до 15. В настоящем описании антиген Е. coli 02 относится к О-антигену, специфическому для серотипа Е. coli 02. В одном воплощении антиген Е. coli 02 содержит структуру формулы 02
предпочтительно антиген is. coli 02 содержит структуру формулы 02'
- 13 037500
η α α β
---► L-Rha----► L-Rha----► D-GIcNAc 1,2 1,3 1,4
D-Fuc3NAc где n в формуле O2 или формуле O2' является целым числом от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении n в формуле O2 или формуле O2' является целым числом от 8 до 16.
Предпочтительно популяцию антигенов Е. coli O2, имеющих структуру формулы O2, более предпочтительно формулы O2' применяют в композициях и способах согласно воплощениям изобретения, где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli O2 в популяции имеет значения от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli O2 в популяции является целым числом от 5 до 20.
В настоящем описании антиген Е. coli О6 относится к О-антигену, специфическому для серотипа Е. coli О6. В одном воплощении антиген Е. coli О6 представляет собой антиген Е. coli O6A.
В настоящем описании антиген Е. coli О6А, также обозначаемый антиген Е. coli O6K2 или антиген Е. coli O6Glc относится к О-антигену, специфическому для серотипа Е. coli O6A. В одном воплощении антиген Е. coli O6A содержит структуру формулы О6А — D-GalNAc---► D-Man---► D-Man---► D-GIcNAc--►
D-GIc предпочтительно антиген Е. coli O6A содержит структуру формулы О6А' а
— ►D-GalNAc 1,4 а ---► D-Man 1,3 β β
---► D-Man----► D-GIcNAc
1,4 1,3
η β 1,2 D-GIc где связь β 1, 2 также обозначается связью β2, n в формуле О6А или формуле О6А' является целым числом от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении n в формуле О6А или формуле О6А' является целым числом от 8 до 18.
Предпочтительно популяцию антигенов Е. coli O6A, имеющих структуру формулы О6А, более предпочтительно формулы О6А', применяют в композициях и способах согласно воплощениям изобретения, где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli O6A в популяции имеет значения от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В одном воплощении n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli О6А в популяции является целым числом от 5 до 20. В предпочтительном воплощении композиция по изобретению содержит антигены Е. coli 025b, имеющие структуру формулы 025b', где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli O25B в популяции является целым числом от 10 до 20; антигены Е. coli О1А, имеющие структуру формулы О1А', где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli О1А в популяции является целым числом от 5 до 15; антигены Е. coli O2, имеющие структуру формулы O2', где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli O2 в популяции является целым числом от 5 до 20; и антигены Е. coli O6A, имеющие структуру формулы О6А', где n по меньшей мере у 80% антигенов Е. coli О6А в популяции является целым числом от 5 до 20, где каждый из О-антигенов ковалентно связан с белком-носителем ЕРА, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
О-антиген Е. coli, который может найти применение в изобретении, можно получать способами, известными в области техники с учетом настоящего описания. Например, они могут быть получены из клетки, предпочтительно рекомбинантной клетки, которая оптимизирована для биосинтеза О-антигена. См., например, соответствующие описания нуклеиновых кислот, белков, клеток-хозяев, способов получения и т.д. для биосинтеза О-антигена Е. coli, изложенные в WO 2006/119987, WO 2009/104074, заявке на международный патент РСТ/ЕР 2015/053739, Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61, содержание которых включено в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.
Белок-носитель ЕРА.
Согласно воплощениям изобретения каждый О-антиген Е. coli ковалентно связан с белкомносителем ЕРА (см., например, Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61). В литературе описаны различные обезвреженные варианты ЕРА, и они могут применяться в качестве белков носителей ЕРА в раскрытых здесь конъюгатах. В некоторых воплощениях белки-носители ЕРА, используемые в конъюга
- 14 037500 тах, раскрытых в настоящем описании, модифицированы таким образом, что белок является менее токсичным и/или более подверженным гликозилированию. Например, обезвреживание может достигаться за счет мутации и делеции важных для каталитической активности остатков, таких как L552V и АЕ553, согласно Lukac et al., Infect Immun, 56: 3095-3098, 1988 и Ho et al., Hum Vaccin, 2:89-98, 2006. В конкретном воплощении белки-носители, использованные для создания конъюгатов, раскрытых в настоящем описании, модифицированы таким образом, что ряд сайтов гликозилирования в белках носителях оптимизирован таким образом, что позволяет вводить белки в более низких концентрациях, например, в иммуногенной композиции, в форме его биоконъюгата.
В некоторых воплощениях белки-носители ЕРА представляют собой модифицированные ЕРА, включающие на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более сайтов гликозилирования, больше, чем обычно связано с белком-носителем (например, по сравнению с количеством сайтов гликозилирования, связанных с белком-носителем в его нативной/естественной форме, например, дикого типа). В конкретных воплощениях внедрение сайтов гликозилирования осуществляют путем встраивания консенсусных последовательностей гликозилирования (например, Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой, за исключением Pro (SEQ ID NO: 2); или предпочтительно Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты, за исключением Pro (SEQ ID NO: 3) (см. WO 2006/119987)) в любом участке первичной структуры белка ЕРА. В одном конкретном воплощении белок-носитель ЕРА содержит 4 консенсусных последовательности гликозилирования Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO: 3) и имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях белок-носитель ЕРА может быть получен вместе с сигнальной последовательностью (такой как сигнальный пептид Е. coli DsbA, порин А внешней мембраны Е. coli (OmpA), связывающий мальтозу белок Е. coli (MalE), и т.д.), направляющей белок-носитель в периплазматическое пространство клеткихозяина, экспрессирующей белок-носитель. Кроме того, белок-носитель ЕРА может быть модифицирован, чтобы нести метку, т.е. последовательность аминокислот, позволяющую выделять и/или детектировать белок-носитель.
Белок-носитель ЕРА, который может найти применение в изобретении, можно получать способами, известными в области техники с учетом настоящего описания. См., например, соответствующие документы, например Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61, а также WO 2006/119987, WO 2009/104074, заявку на международный патент РСТ/ЕР 2015/053739, содержание которых включено во всей полноте посредством ссылки.
Конъюгаты.
В некоторых воплощениях клетка-хозяин может продуцировать О-антиген Е. coli и белок-носитель ЕРА и ковалентно связывать О-антиген с белком-носителем ЕРА с образованием биоконъюгата, который может использоваться в изобретении. См., например, соответствующие документы, например Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61, а также WO 2006/119987, WO 2009/104074, заявку на международный патент РСТ/ЕР 2015/053739, содержание которых включено во всей полноте посредством ссылки.
Альтернативно, гликоконъюгаты могут быть получены путем химического синтеза, т.е. получены вне клеток-хозяев (in vitro). Например, О-антигены Е. coli , раскрытые в настоящем описании, например антиген 025b, может быть конъюгирован с белками-носителями, с использованием способов, известных специалистам в области техники, включая способы с использованием активации реакционноспособных групп полисахарида/олигосахарида, а также белка-носителя. См., например, Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885; и Robbins et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Такие подходы включают экстрагирование антигенных полисахаридов/олигосахаридов из клеток-хозяев, очистку полисахаридов/олигосахаридов, химическую активацию полисахаридов/олигосахаридов и конъюгирование полисахаридов/олигосахаридов с белком-носителем.
Биоконъюгаты обладают преимуществами по сравнению с гликоконъюгатами, полученными in vitro, например, при изготовлении биоконъюгатов требуются меньше химических агентов, а конечный продукт, получаемый из биоконъюгатов, является более устойчивым и гомогенным. Таким образом, биоконъюгаты являются предпочтительными по сравнению с гликоконъюгатами, полученными химическим путем. В конкретном воплощении белок-носитель ЕРА является N-связанным с О-антигеном Е. coli, который может использоваться в изобретении. Например, О-антиген Е. coli присоединен к остатку Asn в последовательности гликозилирования белка-носителя, такого как Asn-X-Ser(Thr), где X может представлять собой любую аминокислоту за исключением Pro (SEQ ID NO: 2), предпочтительно Asp(Glu)-XAsn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты естественного происхождения, за исключением Pro (SEQ ID NO: 3).
Раскрытые в настоящем описании конъюгаты могут быть очищены любым способом очистки белка, известным в области техники, например посредством хроматографии (например, ионообменной, анионообменной, аффинной и колоночной хроматографии с разделением по размерам), центрифугирования, по различиям в растворимости или любым другим стандартным способом очистки белков. См., например, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (с. 1-18); см. также способы, раскрытые в WO 2009/104074. Фактические условия, используемые для очистки конкретного конъюгата, будут в оп
- 15 037500 ределенной мере зависеть от стратегии синтеза (например, получения синтетическим путем или рекомбинантным способом) и от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность и/или гидрофильность биоконъюгата, и будут очевидны для специалиста в области техники.
Комбинированная терапия.
В некоторых воплощениях композицию, раскрытую в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с одним или более чем одним другим препаратом (например, антибактериальными или иммуномодулирующими препаратами). Один или более чем один другой препарат может быть эффективным в лечении или предупреждении инфекции ЕхРЕС или может улучшать симптомы или состояния, связанные с инфекцией ЕхРЕС. В некоторых воплощениях один или более чем один другой препарат является обезболивающим или жаропонижающим препаратом. В некоторых воплощениях препараты вводят с интервалом от менее чем 5 мин до менее чем 1 неделя. В комбинации с композицией, раскрытой в настоящем описании, могут применяться любые антибактериальные агенты, известные специалистам в области техники (например, антибиотики).
Популяции пациентов.
В некоторых воплощениях композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) наивному субъекту, т.е. субъекту, не имеющему инфекции ЕхРЕС или ранее не имевшему инфекции ЕхРЕС. В одном воплощении композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) наивному субъекту, который подвержен риску развития инфекции ЕхРЕС. В некоторых воплощениях композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) субъекту, у которого диагностирована или ранее была диагностирована инфекция ЕхРЕС. В некоторых воплощениях композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) субъекту, инфицированному ЕхРЕС, до проявления симптомов или до того, как симптомы станут тяжелыми (например, до того, как пациенту потребуется госпитализация).
В некоторых воплощениях композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) субъекту, у которого диагностирована или ранее была диагностирована уропатогенная инфекция Е. coli (UPEC). В некоторых воплощениях композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) субъекту, страдающему рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей. В некоторых воплощениях композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) субъекту, страдающему рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей, но являющемуся здоровым на момент лечения. В некоторых воплощениях композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, вводят (или применяют) субъекту, имеющему или подверженному риску развития бактериемии или сепсиса.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является животным. В некоторых воплощениях животное является собакой. В некоторых воплощениях животное является кошкой. В некоторых воплощениях животное является лошадью. В некоторых воплощениях животное является коровой. В некоторых воплощениях животное является млекопитающим, например лошадью, свиньей, кроликом, мышью или приматом. В предпочтительном воплощении субъект является человеком.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является человеком, предпочтительно человеком, подверженным риску возникновения инвазивного заболевания ЕхРЕС. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является человеком старше 50 лет. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является человеком старше 55 лет, старше 60 или старше 65 лет.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является ребенком. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является ребенком. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является ребенком грудного возраста, включая недоношенного ребенка грудного возраста. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является ребенком ясельного возраста. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, не является ребенком грудного возраста младше 6 месяцев.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является беременным индивидуумом. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является женщиной, у которой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель назад состоялись роды.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является индивидуумом с повышенным риском ЕхРЕС, например индивидуумом с ослабленным иммунитетом или иммунодефицитом, индивидуумом, у которого планируется проведение хирургического вмешательства или недавно было проведено хирургическое вмешательст
- 16 037500 во, индивидуумом, имеющим раневое повреждение, пациентом, находящимся в палате интенсивной терапии или реанимации и т.д. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является индивидуумом, находящимся в близком контакте с индивидуумом, имеющим или подверженным повышенному риску инфекции ЕхРЕС.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является медицинским работником. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, имеет ослабленный иммунитет (например, имеет ВИЧ-инфекцию) или подавленный иммунитет. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, имеет диабет. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, имеет рассеянный склероз.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, имеет состояние, требующее применения катетера, например мочевого катетера. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, имеет спинно-мозговую травму.
В некоторых воплощениях субъект является мужчиной, которому предстоит или недавно была проведена биопсия простаты.
В предпочтительном воплощении субъект, которому вводят (или применяют) композицию (или способ), раскрытые в настоящем описании, является подверженным риску взрослым человеком, которому необходима иммунизация для предупреждения инвазивного заболевания ЕхРЕС, вызванного ЕхРЕС серотипов О1А, O2, О6А и 025b. Примеры людей, подверженных риску, включают раскрытых выше, но не ограничиваются ими. Другие примеры людей, подверженных риску, включают, например, индивидуумов, проходящих трансректальное ультразвуковое исследование с пункционной биопсией простаты (TRUS-PNB) или страдающих рецидивирующим уросепсисом, находящихся в стационарах длительного пребывания (LTCF), проживающих в пансионатах с предоставлением ухода (LTAC), пациентов перед операцией (включая пациентов, которым планируется урогенитальное/полостное хирургическое вмешательство, но не ограничиваясь ими); пациентов перед диализом и т.д.
Дозы и частота введения.
Введение конъюгатов О-антигенов и белка-носителя ЕРА и/или их композиции можно осуществлять различными способами, известными клиницистам, например подкожным, парентеральным, внутривенным, внутримышечным, поверхностным, пероральным, внутрикожным, чрескожным, интраназальным и т.д. В одном воплощении введение осуществляют посредством внутримышечной инъекции.
Согласно воплощениям изобретения уровень доз антигена Е. coli 025В должен быть не ниже, предпочтительно выше уровня доз других О-антигенов Е. coli, используемых в композиции или способе по изобретению, где каждый из О-антигенов Е. coli ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. Конкретные дозы, используемые в композиции и способе, будут зависеть от способа введения и тяжести инфекции и должны определяться по усмотрению практикующего врача и в зависимости от ситуации у каждого пациента.
В некоторых воплощениях изобретения приведенные в качестве примера дозы антигена Е. coli 025В находятся в диапазоне от 4 до 24 мкг антигена 025В на введение и приведенные в качестве примера дозы каждого дополнительного О-антигена Е. coli, которые будут применяться в комбинации с антигеном Е. coli O25B, находятся в диапазоне от 10 до 100% от дозы антигена-Е. coli O25B, где каждый из дополнительных О-антигенов Е. coli ковалентно связан с белком-носителем ЕРА. В некоторых воплощениях приведенная в качестве примера доза гликоконъюгата Е. coli O25B составляет, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 мкг антигена 025В на введение и приведенная в качестве примера доза другого О-гликоконъюгата Е. coli для применения в комбинации с гликоконъюгатом Е. coli O25B составляет, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% от дозы гликоконъюгата Е. coli O25B, где доза рассчитана по количеству О-антигена в О-гликоконъюгате на введение.
В некоторых воплощениях изобретения субъекту, которому необходимо, вводят 0,5 мл композиции по изобретению.
В некоторых воплощениях приведенная в качестве примера доза на введение человеку соответствует 0,5 мл композиции, содержащей первую концентрацию приблизительно 8-48 мкг/мл, например приблизительно 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 или 48 мкг/мл антигена Е. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, и концентрацию от 10 до 100% от первой концентрации одного или более дополнительных О-антигенов Е. coli, ковалентно связанных с белком-носителем ЕРА. В некоторых воплощениях приведенная в качестве примера доза на введение человеку соответствует 0,5 мл композиции, содержащей концентрацию приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, приблизительно 8 мкг/мл антигена Е. coli О1А, ковалентно связанного с белкомносителем ЕРА, приблизительно 8 мкг/мл антигена Е. coli O2, ковалентно связанного с белкомносителем ЕРА, и приблизительно 8 мкг/мл антигена Е. coli O6A, ковалентно связанного с белкомносителем ЕРА.
В некоторых воплощениях приведенная в качестве примера доза на введение человеку соответству
- 17 037500 ет 0,5 мл композиции, содержащей концентрацию приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli О1А, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli O2, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, и приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli 06 а, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА.
В некоторых воплощениях приведенная в качестве примера доза на введение человеку соответствует 0,5 мл композиции, содержащей концентрацию приблизительно 32 мкг/мл антигена Е. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli О1А, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli O2, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, и приблизительно 16 мкг/мл антигена Е. coli О6А, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА.
В некоторых воплощениях приведенная в качестве примера доза на введение человеку соответствует 0,5 мл композиции, содержащей концентрацию приблизительно 32 мкг/мл антигена Е. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, приблизительно 32 мкг/мл антигена Е. coli О1А, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, приблизительно 32 мкг/мл антигена Е. coli O2, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА, и приблизительно 32 мкг/мл антигена Е. coli О6А, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА.
В некоторых воплощениях конъюгаты О-антигена Е. coli, предпочтительно биоконъюгаты, раскрытые в настоящем описании или композиции, раскрытые в настоящем описании, вводят субъекту однократно в виде однократной дозы. В некоторых воплощениях конъюгаты О-антигена Е. coli, предпочтительно биоконъюгаты, раскрытые в настоящем описании или композиции, раскрытые в настоящем описании, вводят субъекту в виде однократной дозы, после чего через 3-6 недель следует введение второй дозы. Согласно указанным воплощениям бустерные инокуляции можно осуществлять субъекту с интервалами от 6 до 24 месяцев после второй инокуляции. В некоторых воплощениях в бустерных инокуляциях можно применять другой О-антиген Е. coli, биоконъюгат или композицию. В некоторых воплощениях введение того же самого конъюгата О-антигена Е. coli или композиции можно повторять, и интервалы между введениями могут составлять по меньшей мере 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 7 суток, 10 суток, 15 суток, 30 суток, 45 суток, 2 месяца, 75 суток, 3 месяца или по меньшей мере 6 месяцев. В некоторых воплощениях конъюгат О-антигена Е. coli, раскрытый в настоящем описании, или композицию, раскрытую в настоящем описании, вводят субъекту в виде однократной дозы один раз в год. В некоторых воплощениях конъюгат О-антигена Е. coli, раскрытый в настоящем описании, или композицию, раскрытую в настоящем описании, вводят субъекту в виде однократной дозы один раз в n лет, где n составляет, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет.
В некоторых воплощениях конъюгат О-антигена Е. coli, раскрытый в настоящем описании, или композицию, раскрытую в настоящем описании, вводят субъекту в виде 2, 3, 4, 5 или более доз с интервалом 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель или 6 недель. В некоторых воплощениях субъекту вводят 2, 3, 4, 5 или более доз конъюгата О-антигена Е. coli, раскрытого в настоящем описании, или композиции, раскрытой в настоящем описании, с интервалом 2, 3, 4, 5 или 6 недель. В некоторых воплощениях вводимые конъюгат О-антигена Е. coli или композиция каждый раз являются одинаковыми. В некоторых воплощениях вводимые конъюгат О-антигена Е. coli или композиция каждый раз являются разными.
Исследования.
Способность конъюгатов/композиций, раскрытых в настоящем описании, вырабатывать иммунный ответ у субъекта можно оценивать с использованием любого подхода, известного специалистам в области техники с учетом настоящего описания. Исследования для оценки способности биоконъюгатов индуцировать иммунный ответ В некоторых воплощениях способность биоконъюгата вызывать иммунный ответ у субъекта можно оценивать посредством иммунизации субъекта (например, мыши) или ряда субъектов биоконъюгатом и иммунизации дополнительного субъекта (например, мыши) или ряда субъектов контролем (например, плацебо). Субъекта или ряд субъектов можно впоследствии инфицировать ЕхРЕС и определять способность ЕхРЕС взывать заболевание (например, ИМП) у субъекта или ряда субъектов. Специалистам в области техники понятно, что если субъект или ряд субъектов, иммунизированных контролем, страдают от заболевания после инфицирования ЕхРЕС, а субъект или ряд субъектов, иммунизированных биоконъюгатом(ами) или его композицией, раскрытыми в настоящем описании, страдают меньше или не страдают заболеванием, биоконъюгат способен вызывать у субъекта иммунный ответ. Способность биоконъюгата(ов) или его (их) композиции, раскрытых в настоящем описании, вызывать образование антисыворотки, перекрестно реагирующей с О-антигеном ЕхРЕС, можно исследовать, например, при помощи иммунологического анализа, такого как ELISA.
Исследования бактерицидной активности in vitro.
Способность конъюгатов/композиций, раскрытых в настоящем описании, вызывать иммунный ответ у субъекта можно оценивать с использованием сывороточного бактерицидного теста (SBA) или опсонофагоцитарного теста (OPK-теста), который представляет собой общепринятый метод, используемый для получения разрешения на применение вакцин на основе гликоконъюгатов. Такие тесты хорошо известны в области техники и, вкратце, включают стадии выработки и выделения антител против мишени,
- 18 037500 представляющей интерес (например, О-антигена Е. coli, например 025В), посредством введения субъекту (например, мыши) соединения, вызывающего выработку таких антител. Впоследствии можно оценивать бактерицидную способность антител, например, посредством культивирования бактерий, о которых идет речь (например, Е. coli соответствующего серотипа) в присутствии указанных антител и комплемента и в зависимости от теста нейтрофилов и оценивать способность антител вызывать гибель и/или нейтрализацию бактерий, например, с помощью стандартных микробиологических подходов.
Наборы.
Предложен комплект или набор, содержащий один или более чем один контейнер, заполненный одним или более чем одним ингредиентом композиций, раскрытых в настоящем описании, таким как один или более О-антигенов Е. coli и/или конъюгатов О-антигенов Е. coli, ковалентно связанных с белком-носителем ЕРА согласно воплощениям изобретения. Возможно, к такому контейнеру может быть присоединен листок с информацией или инструкциями по форме, предписанной государственными органами, регулирующими изготовление, применение или продажу фармацевтической или биологической продукции, где отражено разрешение на изготовление, применение или продажу для введения человеку, выданное соответствующими органами. Наборы, предусмотренные данным изобретением, можно применять в указанных выше способах лечения и иммунизации субъектов.
Следующие примеры предназначены для дальнейшей иллюстрации сути изобретения. Следует понимать, что приведенные примеры не ограничивают объем изобретения и что объем изобретения определяется приведенной ниже формулой изобретения.
Воплощения изобретения
Воплощение 1 представляет собой композицию, содержащую антигенный полисахарид Е. coli 025b в первой концентрации и каждый из антигенного полисахарида Е. coli О1А, антигенного полисахарида Е. coli O2, антигенного полисахарида Е. coli 06а во второй концентрации, где соотношение первой концентрации к второй концентрации составляет от 1:1 до 2:1, каждый из антигенных полисахаридов Е. coli O25B, O1A, O2 и O6A независимо ковалентно связан с белком-носителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA), и первая концентрация составляет от 10 до 36 мкг/мл.
Воплощение 2 представляет собой композицию по воплощению 1, содержащую антигенные полисахариды Е. coli O25B, O1A, O2 и O6A в соотношении доз 1:1:1:1.
Воплощение 3 представляет собой композицию по воплощению 1, содержащую антигенные полисахариды Е. coli O25B, O1A, O2 и O6A в соотношении доз 2:1:1:1.
Воплощение 4 представляет собой композицию по любому из воплощений 1-3, содержащую 16 мкг/мл антигенного полисахарида 025В.
Воплощение 5 представляет собой композицию по любому из воплощений 1-3, содержащую 32 мкг/мл антигенного полисахарида 025В.
Воплощение 6 представляет собой мультивалентную иммунную композицию, содержащую антигенный полисахарид Е. coli O25B в первой дозе от 5 до 18 мкг и каждый из антигенного полисахарида Е. coli 01А, антигенного полисахарида Е. coli 02, антигенного полисахарида Е. coli 06А в дозе, которая независимо составляет от 50 до 100% от первой дозы, где каждый из антигенных полисахаридов Е. coli 025B, 01А, 02 и 06А независимо ковалентно связан с белком-носителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA).
Воплощение 7 представляет собой мультивалентную иммунную композицию, содержащую антигенный полисахарид Е. coli O25B, имеющий структуру формулы O25B'
D-GIc β|6 β α а'
--► D-GIc----► L-Rha2Ac л o »· D-GIcNAc -► 4 A 1,3 1-3 a 3
L-Rha антигенный полисахарид E. coli O1A, имеющий структуру формулы O1A' β α αβ — L-Rha---► L-Rha ——-► L-Rha ——► D-GIcNAc з[ A 1-3 1,31,4 β 2
D-ManNAc
антигенный полисахарид Е. coli 02, имеющий структуру формулы 02'
- 19 037500
и антигенный полисахарид Е. coli О6А, имеющий структуру формулы О6А'
где n независимо представляет собой целое число от 5 до 25 и каждый из антигенных полисахаридов Е. coli O25B, 01а, O2 и 06а независимо ковалентно связан с белком-носителем, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и концентрации антигенных полисахаридов Е. coli O25B, О1А, O2, О6А в композициях составляют, соответственно, 16:8:8:8 мкг/мл, 16:16:16:16 мкг/мл, 32:16:16:16 мкг/мл или 32:32:32:32 мкг/мл.
Воплощение 8 представляет собой способ индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной Е. coli (ExPEC) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту композиции по любому из воплощений 1-7.
Воплощение 9 представляет собой способ индуцирования иммунного ответа на внекишечную патогенную Е. coli (ExPEC) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту антигенного полисахарида Е. coli O25B в первом эффективном количестве и каждого из антигенного полисахарида Е. coli О1А, антигенного полисахарида Е. coli O2 и антигенного полисахарида Е. coli O6A во втором эффективном количестве, где отношение первого эффективного количества к второму эффективному количеству составляет от 1:1 до 2:1, каждый из антигенных полисахаридов Е. coli 025В, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белком-носителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA), и первое эффективное количество составляет от 5 до 18 мкг на введение.
Воплощение 10 представляет собой способ по воплощению 9, где антигенные полисахариды Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А вводят в соотношении доз 1:1:1:1.
Воплощение 11 представляет собой способ по воплощению 9, где антигенные полисахариды Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А вводят в соотношении доз 2:1:1:1.
Воплощение 12 представляет собой способ по любому из воплощений 8-11, где вводят 8 мкг антигенного полисахарида 025В на введение.
Воплощение 13 представляет собой способ по любому из воплощений 8-11, где вводят 16 мкг антигенного полисахарида 025В на введение.
Воплощение 14 представляет собой способ по любому из пп. 8-13, где антигенные полисахариды Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А вводят вместе в составе одной композиции.
Воплощение 15 представляет собой способ индуцирования иммунного ответа на внекишечную патогенную Е. coli (ExPEC) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту антигенного полисахарида Е. coli O25B, имеющего структуру формулы 025В'
D-GIc э|б
а «
D-GIc----► L-Rha2Ac , „ ► D-GIcNAc
А 1,3 1,3 аТ 3
L-Rha антигенного полисахарида Е. coli 01А, имеющего структуру формулы 01А' α β
-Rha----►L-Rha----► D-GIcNAc
1,3 1,4
D-ManNAc антигенного полисахарида Е. coli O2, имеющего структуру формулы O2'
- 20 037500 и антигенного полисахарида Е. coli О6А, имеющего структуру формулы О6А'
где n независимо представляет собой целое число от 5 до 25, каждый из антигенных полисахаридов Е. coli O25B, 01а, O2 и 06а независимо ковалентно связан с белком-носителем, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и антигенные полисахариды Е. coli 025В, О1А, O2 и О6А вводят в соотношении 8:4:4:4 мкг, 8:8:8:8 мкг, 16:8:8:8 мкг или 16:16:16:16 мкг на введение.
Воплощение 16 представляет собой способ по любому из воплощений 8-15, где иммунный ответ ограничивает тяжесть или предупреждает инвазивное заболевание ЕхРЕС, вызванное ЕхРЕС серотипов О1А, O2, О6А и 025В, у человека, подверженного риску.
Воплощение 17 представляет собой способ по воплощению 16, где взрослый человек имеет инвазивное заболевание ЕхРЕС, выбранное из группы, состоящей из инфекции мочевыводящих путей, инфекции области операционного вмешательства, инфекции брюшной полости или таза, пневмонии, нозокомиальной пневмонии, остеомиелита, панникулита, сепсиса, бактериемии, раневой инфекции, пиелонефрита, менингита, неонатального менингита, перитонита, холангита, инфекции мягких тканей, пио миозита и септического артрита, или подвержен риску его возникновения.
Воплощение 18 представляет собой способ получения композиции по любому из воплощений 1-7, включающий объединение антигенного полисахарида Е. coli O25B, антигенного полисахарида Е. coli О1А, антигенного полисахарида Е. coli O2 и антигенного полисахарида Е. coli O6A с получением таким образом композиции.
Примеры
Биоконъюгаты О-антигена.
Биоконъюгаты О1А-ЕРА, 02-ЕРА, О6А-ЕРА и О25В-ЕРА, содержащие, соответственно, Е. coli О1А, O2, О6А и 025В, ковалентно связанные с сайтами гликозилирования белка-носителя ЕРА, можно получать, очищать и характеризовать, как описано, например, в Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61, а также в WO 2006/119987, WO 2009/104074 и в заявке на международный патент РСТ/ЕР 2015/053739, содержание которых включено во всей полноте посредством ссылки. Биоконъюгаты синтезируют с использованием клеток рекомбинантных Е. coli, которые экспрессируют ферменты, синтезирующие полисахариды различных О-серотипов, в присутствии олигосахарилтрансферазы PglB и белка-носителя (ЕРА). В данном подходе вакцину на основе гликоконъюгата можно экспрессировать в периплазме Е. coli, выделять и очищать с использованием биохимического процесса, проиллюстрированного на фиг. 1 и 2. В табл. 2 указаны штаммы-хозяева, использованные при получении конъюгатов в соответствии с воплощением изобретения.
Таблица 2
Штаммы-хозяева для получения партий для доклинических, токсикологических и клинических исследований
Продукт Штамм Плазмида, экспрессирующая ЕРА Плазмида, экспрессирующая PglB
ЕРА-01 А W3110 krfb::rfb(upec032) kwaaL pGVXN1076 pGVXN970
ЕРА-02 W3110 №fb::rfb(upecll6) kwaaL pGVXN1076 pGVXN971
ЕРА-О6А W3110 ^fb::rfb(CCUGl1309) kwaaL pGVXN659 pGVXN114
ЕРА- 025В W3110 krft>::rfb(upecl38) kwaaL kgtrABS pGVXN1076 pGVXN970
Например, для получения О25В-ЕРА конструировали штамм с интегрированным в геном кластером 025В: W3110 ΔwaaL ΔgtrABS ΔrfbO16::rfb(upec138), который трансформировали плазмидами pGVXN1076 (экспрессирующей ЕРА с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1) и pGVXN970 (экспрессирующей олигосахарилтрансферазу PelB) (WO/2009/104074). Данный штамм конструировали на основе штамма W3110 способом, предложенным Datsenko and Wanner (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645), и методом гомологичной рекомбинации для сайт-направленной интеграции больших вставок в бактериальные хромосомы (см. WO 2014/057109). Кластер rfb, относящийся к антигену 025В, клонировали из штамма-Е. coli upec138, положительного по 025В. Рекомбинантные клетки-хозяева продуцировали биоконъюгаты О25В/ЕРА в периплазме. Полученные биоконъюгаты 025В характеризовали с использованием стандартных тестов, в которых определяли их высвобождение и присутствие. Биоконъюгаты очищали посредством двух последовательных стадий анионообменной и эксклюзионной хроматографии, получая препараты биоконъюгата 025В с чистотой 98,1%.
- 21 037500
Аналогично были сконструированы штаммы-хозяева для рекомбинантной продукции О1А-ЕРА, 02-ЕРА и О6А-ЕРА (табл. 2). Указанные штаммы содержали кластеры rfb, относящиеся к О1А, O2 и 06а, которые клонировали из Е. coli штаммов upec032, upec116 и CCUG11309 соответственно. Биоконъюгаты О1А-ЕРА, О2-ЕРА и О6А-ЕРА получали из указанных рекомбинантных клеток-хозяев и очищали способами, известными в области техники, с учетом настоящего описания.
Для анализа чистоты проводили количественное определение с помощью SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Отношение углеводов к белкам рассчитывали по результатам количественного определения углеводов антроновым методом (см. Laurentin and Edwards, 2003, Anal. Biochem. 315, 143-145) и определения концентрации белка методом с бицинхониновой кислотой. Аналитическая эксклюзионная хроматография показала, что частицы находились в мономерном состоянии, что согласовывалось с ожидаемым гидродинамическим радиусом ЕРА с присоединенными гликановыми цепями.
Для количественного определения степени моно- и дигликозилирования отдельных биоконъюгатов и для определения молекулярной массы (MW) белка-носителя и присоединенного к нему O-PS (Ополисахарида) биоконъюгаты и негликозилированный референтный стандарт ЕРА анализировали посредством эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния (SECMALS). Образцы разделяли на колонке TSKgel-G3000 SWxl в фосфатном буфере (рН 7,0; 50 мМ NaCl, 150 мМ фосфат натрия) и осуществляли детекцию по поглощению в УФ-области (214 и 280 нм), показателю преломления (RI) и многоугловому светорассеянию (MALS).
Композиции вакцин.
Данный пример иллюстрирует композиции вакцин, пригодные для настоящего изобретения.
Таблица 3-1 Композиции вакцин
Ингредиент Количество (мкг/мл)
Действующее вещество ЕхРЕС4У Композиция 3
O-antigen polysaccharide
Е. coli 01А 8 8
Е. coli 02 8 8
Е. coli О6А 8 8
Е. coli 025В 8 16
Белок-носитель ЕРА 109 Расчетное: 126
Эксципиенты
TBS буфер, содержащий pH 7,4
Трис 25 мМ
NaCl 137 мМ
КС1 2,7 мМ
- 22 037500
Таблица 3-2
Композиции вакцин
Ингредиент Количество (мкг/мл)
Действующее вещество Композиция 1 Композиция 2
O-antigen polysaccharide
Е. coli 01А 32 16
Е. coli 02 32 16
Е. coli О6А 32 16
Е. coli 025В 32 32
Белок-носитель
ЕРА Расчетное: 436 Расчетное: 251
Эксципиенты
TBS буфер, содержащий pH 7,4
Трис 25 мМ
NaCl 137 мМ
KCl 2,7 мМ
Каждая из раскрытых выше композиций вакцин упакована во флакон и готова для инъекции. Препараты вакцины следует хранить при температуре от +2 до +8°С. Действующие вещества в композиции вакцины представляют собой гликозилированные белки (биоконъюгаты, состоящие из белка-носителя ЕРА, ковалентно связанного с О-антигенным полисахаридом Е. coli), дозу рассчитывают только на основании содержания полисахаридной группировки (О-антигена).
Доза белка-носителя ЕРА зависит от соотношения полисахарид:белок. Расчетное соотношение полисахарид:белок составляло от 15 до 50% в зависимости от серотипа О-антигена, т.е. масса полисахарида в конъюгате составляла приблизительно от 15 до 50% от массы белка-носителя ЕРА в конъюгате. Для каждого серотипа в ExPEC4V проводили количественное определение отношения полисахарид :белок, например определяли количество полисахарида (О-антиген) антроновым методом (см. Laurentin and Edwards, 2003, Anal Biochem 315, 143-145), и для определения концентрации белка использовали метод с бицинхониновой кислотой. Для каждого серотипа в продуктах 1-3 значение ЕРА, которое приведено в табл. 3-1 и 3-2, представляет собой значение, рассчитанное на основании аналитических данных, полученных для ExPEC4V. Стабильность композиций четырехвалентной вакцины (биоконъюгаты 025b, 01а, O2 и О6) исследовали в течение 3-месячного периода. Для определения путей деградации проводили исследования стабильности в условиях ускоренного старения. Данные исследования показали, что действующие вещества и композиции четырехвалентной вакцины стабильны по меньшей мере в течение трех месяцев и, следовательно, в части стабильности являются подходящими композициями вакцины.
Исследование токсичности при многократном введении крысам.
Исследование токсичности проводили в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики (GLP) на крысах Sprague-Dawley для оценки токсичности и местной переносимости композиции вакцины после 2 внутримышечных (в/м) инъекций (в четырехглавую мышцу бедра) на 1 и 14 сутки с 14дневным восстановительным периодом. Обратимость, персистирование и отсроченное возникновение любых изменений оценивали после 14-дневного восстановительного периода (т.е. на 28 сутки). Схема исследования 1 фазы для оценки токсичности при многократном введении крысам представлена в табл. 4.
- 23 037500
Таблица 4
Схема исследования токсичности при многократном введении крысам
Г руппа Величина дозы Концентрация (мкг/мл) Объем дозы (мл)ь Животные основной группы (п)с Животные группы восстановле НИЯ ()
Плацебо3 - - 0,5 10М+ 10F 5M + 5F
ЕхРЕС4У 4 мкг полисахарида каждого О-антигена = суммарно 16 мкг полисахарида в одной дозе + 48 мкг белка-носителя ЕРА в одной дозе 8 мкг/мл полисахарида каждого Оантигена + белок-носитель ЕРА: 96 мкг/мл 0,5 10М+ 10F 5M + 5F
ЕРА = экзобелок А/экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa в обезвреженной форме, использованный в качестве белка-носителя;
F означает самка,
М означает самец.
Примечание: 1 сутки означает начало применения препарата, а группе плацебо вводили рецептурный буфер (контроль с несущей средой), b животные получали 2 инъекции по 0,25 мл на введение (в левую и правую заднюю конечность); введение животным осуществляли 2-кратно: на 1 сутки и 14 сутки, с животных в основной группе подвергали эвтаназии на 17 сутки, d животных, прошедших восстановительный период, подвергали эвтаназии на 28 сутки, т.е. через 14 суток после второго применения препарата.
В данном исследовании испытывали дозу 4 мкг на О-антиген полисахарида (PS) ExPEC4V (общая доза PS 16 мкг). Указанная доза эквивалентна максимальной дозе, которую испытывали в клиническом исследовании 1 фазы, описанном ниже. Таким образом, в исследовании токсичности на крысах, проводившемся в соответствиями с требованиями GLP, вводили полную дозу, которую применяли у людей в исследовании 1 фазы. Исследование проводили на партии препарата для доклинических исследований, которая была репрезентативной для партии препарата, использованной в клиническом исследовании 1 фазы.
В ходе исследования не наблюдалось ни летальных исходов, ни связанных с использованием препарата клинических проявлений (включая температуру тела), ни офтальмологических изменений. Кроме того, токсикологически значимых побочных действий на массу тела, увеличение массы тела, потребление пищи или на гематологические, биохимические, коагуляционные показатели и показатели анализа мочи не наблюдалось. По окончании применения препарата (14 сутки) и по окончании восстановительного периода (28 сутки) макроскопические изменения или изменения массы органов, связанные с исследуемым препаратом, отсутствовали. Нежелательных изменений, связанных с исследуемым препаратом, не наблюдали. В местах инъекций в четырехглавую мышцу бедра в конце периода применения препарата как в группе, получавшей плацебо, так и в группе, получавшей исследуемый препарат, по результатам микроскопического исследования отмечали изменения от минимальных до умеренных (интерстициальное воспаление, дегенерация/некроз миофибрилл и полиморфно-клеточный воспалительный инфильтрат), которые не относили к нежелательным. Указанные изменения не связывали с введением исследуемого препарата, а считали следствием самой процедуры введения (т.е. в/м инъекции). В конце восстановительного периода место инъекции, произведенной в мышцу на 1 сутки, восстанавливалось, тогда как в месте инъекции, произведенной на 14 сутки, в мышце наблюдались остаточные минимальные полиморфно-клеточные воспалительные инфильтраты, что позволяло предположить текущее восстановление как у животных, получавших плацебо, так и у получавших исследуемый препарат. В целом, вакцина хорошо переносилась, и побочных действий, связанных с исследуемым препаратом, не отмечалось.
Была подтверждена иммуногенность вакцины, вызывавшей выработку сывороточного иммуноглобулина G (IgG) против 4 О-антигенов в вакцинированной группе в более высоком титре по сравнению с группой плацебо, получавшей только рецептурный буфер.
Исследование токсичности при многократном введении кроликам.
Исследование токсичности проводили в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики (GLP) на кроликах NZW (TOX11163, предварительный отчет) для оценки токсичности и местной переносимости ExPEC4V после 3 в/м инъекций (на 0, 14 и 28 сутки), выполнявшихся с интервалом 2
- 24 037500 недели, с 3-месячным восстановительным периодом. Обратимость, персистирование и отсроченное возникновение любых изменений оценивали на 49 сутки, после 3-недельного периода отсутствия применения препарата после 3 инъекции, выполнявшейся на 28 сутки. Схема исследования 2 фазы для оценки токсичности при многократном введении кроликам представлена в табл. 5.
Таблица 5
Схема исследования токсичности при многократном введении кроликам
Группа Величина дозыа (мкг/дозу) Концентрация (мкг/мл) Вводимый объем на дозу ADMd Дни введения Число животных
Терминальная группа6 Группа восстановления6
1 - 0 2x1 мл ADM 1,2 ADM 3,4 ADM 5, 6 0 сутки, 14 сутки, 28 сутки 5M + 5F 5M + 5F
2 32ь 32 1 мл ADM 1 ADM3 ADM 5 0 сутки, 14 сутки, 28 сутки 5M + 5F 5M + 5F
3 64е 32 2x1 мл ADM 1,2 ADM 3,4 ADM 5, 6 0 сутки, 14 сутки, 28 сутки 5M + 5F 5M + 5F
ADM: место введения;
F означает самка;
М означает самец.
Примечание: 0 сутки означает начало применения препарата; группа 1 получала физиологический раствор (контрольная группа), а общее количество О-антигенного полисахарида (соотношение 1:1:1:1 для серотипов О1А, O2, 06а и 025b соответственно), b 8 мкг полисахарида на серотип плюс суммарно 109 мкг белка-носителя ЕРА, с 16 мкг полисахарида на серотип плюс суммарно 218 мкг белка-носителя ЕРА, d ADM1: левая нижняя часть двуглавой мышцы бедра; ADM2: правая нижняя часть двуглавой мышцы бедра; ADM3: левая верхняя часть двуглавой мышцы бедра; ADM4: правая верхняя часть двуглавой мышцы бедра; ADM5: левая четырехглавая мышца бедра; ADM6: правая четырехглавая мышца бедра, e животных в терминальной группе подвергали эвтаназии на 30 сутки, а животных в группе восстановления на 49 сутки.
В данном исследовании испытывали ExPEC4V в максимальной дозе по 16 мкг каждого О-антигена PS (общая доза PS 64 мкг, наряду с 218 мкг белка-носителя ЕРА). Указанная доза в 4 раза превышает максимальную дозу, которую испытывали в предыдущем исследовании токсичности (1 фазы) на крысах, соответствующем требованиям GLP, и эквивалентна максимальной дозе PS (и ЕРА), которую оценивали в клиническом исследовании 2 фазы, описанном ниже. Таким образом, в данном исследовании токсичности на кроликах, соответствующем требованиями GLP, вводили полную (максимальную) дозу, предназначенную для применения у людей в исследовании 2 фазы.
Исследование проводили с использованием ExPEC4V (содержащей суммарно 32 мкг/мл PS), которую использовали в клиническом исследовании 1 фазы, описанном ниже. Данную партию препарата считали репрезентативной для композиции вакцины, которую использовали в клиническом исследовании 2 фазы, описанном ниже (содержащей суммарно 128 мкг/мл PS), поскольку в обеих композициях вакцины использовали одинаковые лекарственные субстанции.
В ходе исследования летальных случаев не наблюдалось. Влияние на температуру тела, массу тела, увеличение массы тела, потребление пищи, офтальмологические, кожные показатели (тест Дрейза), биохимические показатели и С-реактивный белок отсутствовало.
Самки, получавшие 64 мкг ExPEC4V, демонстрировали минимальное снижение уровней гемоглобина по окончании применения препарата и восстановительного периода с минимальным снижением общего числа эритроцитов и гематокрита в конце восстановительного периода, которое не считали нежелательным. Через 1 неделю после 1 инъекции и в конце периода применения препарата у самок отмечалось минимальное повышение фибриногена, однако в конце восстановительного периода, когда применение препарата отсутствовало, изменений уже не наблюдалось.
Вскоре после введения у некоторых животных в группах, получавших ExPEC4V, наблюдалась депигментация гиподермы, которая коррелировала с очагами/областями депигментации, обнаруженными при вскрытии (30 сутки) в местах инъекций, произведенных на 28 сутки, во всех группах (включая контрольную группу). По окончании восстановительного периода аномалий не отмечалось. Гистопатологи
- 25 037500 ческие изменения были представлены множественными очагами воспалительной полиморфно-клеточной инфильтрации (от минимальной до легкой степени), которые наблюдались преимущественно в местах инъекций, произведенных на 28 сутки, у животных, получавших ExPEC4V. По окончании восстановительного периода (49 сутки) только у 1 самки в группе, получавшей высокую дозу, наблюдалась воспалительная полиморфно-клеточная инфильтрация в месте инъекции, произведенной на 28 сутки, что свидетельствовало о (текущем) восстановлении.
В дренирующих медиальных подвздошных лимфатических узлах кроликов, получавших ExPEC4V, по окончании периода применения препарата наблюдалась продукция (в терминальных центрах) и секвестрация лимфобластов в паракортексе и/или медуллярных связках, что в результате приводило к увеличению общего клеточного содержимого. Кроме того, лимфоузлы были увеличены у обоих полов, что коррелировало с увеличением массы тела у самок. По окончании восстановительного периода этих результатов не наблюдалось. В селезенке самцов и самок, получавших исследуемый препарат, по окончании периода применения препарата и восстановительного периода отмечалось увеличение количества герминативных центров, сопровождавшееся увеличением массы селезенки у обоих полов по окончании периода применения препарата.
Эти изменения не считали нежелательными и связывали с иммунным ответом на введение вакцины.
Иммуногенность вакцины была подтверждена, поскольку уровни IgG к О-антигенам всех 4 серотипов, а также ЕРА были повышены у самцов и самок. В целом, вакцинация кроликов (3 в/м инъекции с интервалом 2 недели) ExPEC4V в дозах, содержащих суммарно до 64 мкг PS, была безопасной и хорошо переносимой. Все явления, наблюдавшиеся в связи с использованием препарата, расценивали как нормальный, не являющийся нежелательным ответ на введение вакцины.
Функциональность гуморальных ответов, индуцированных вакциной, у крыс.
Для оценки функциональной активности индуцированных вакциной гуморальных ответов на биоконъюгаты 025b, 01а, О2 и О6А сыворотку крыс, вакцинированных одновалентной или четырехвалентной вакцинами, содержащими биоконъюгаты 025В, О1А, O2 и О6А в отдельности или в комбинации, исследовали с помощью OPK-теста, в котором определяли комплемент- и антителозависимый фагоцитоз и уничтожение бактерий, например Е. coli, in vitro. OPK-тест характеризует способность сыворотки усиливать опсонизацию, фагоцитоз и уничтожение Е. coli различных серотипов. В каждой лунке 96луночных планшетов инкубировали определенные разведения образцов сыворотки с бактериями 1-4 серотипов Е. coli, соответствующих вакцине, определенное количество клеток HL60 и комплемент крольчонка. После инкубации часть смеси наносили на триптон-соевый агар (TSA) и подсчитывали число бактериальных колоний. Способность антител связываться с бактериальными клетками и активировать присоединение комплемента, а также опосредовать поглощение и уничтожение бактерий клетками HL60, выражали в виде опсонического титра. Опсонический титр или индекс опсонизации (IO) соответствует разведению сыворотки, вызывающему уничтожение 50% бактериальных клеток. Представлены индексы опсонизации сыворотки до и после иммунизации. Значимым считали по меньшей мере 4-кратное увеличение IO сыворотки после иммунизации по сравнению с показателем до иммунизации.
Производили предварительную опсонизацию Е. coli с использованием разведений сыворотки вакцинированных крыс, инкубировали с комплементом и фагоцитами (дифференцированные клетки HL60) и подсчитывали колониеобразующие единицы (CFU). Затем подсчитывали максимальный % уничтожения и индекс опсонизации (IO: разведение сыворотки, вызывающее уничтожение 50% Е. coli). Для OPKтеста выбирали Е. coli ОС 24453 (серотип O2), ОС 24781 (серотип О6А) и ОС 24176 (серотип 025В).
Как показывают результаты, представленные на фиг. 3А-3В, одновалентные вакцины, содержащие 02-ЕРА, О6А-ЕРА и О25В-ЕРА, индуцировали выраженные гуморальные ответы у крыс, и такие гуморальные ответы являлись функциональными, приводя к уничтожению Е. coli указанных серотипов.
В табл. 6 показаны общие титры IO для О-антигенов O2, О6А и 025В крыс, иммунизированных четырехвалентной вакциной, содержащей по 0,4 или 4 мкг каждого О-антигена. Титры определяли в двух отдельных экспериментах. При дозе 0,4 мкг у всех животных были получены значимые IO в отношении серотипов O2 и О6А. В случае 025В 3 из 8 животных демонстрировали значимое увеличение IO после иммунизации в дозе 0,4 мкг. У всех животных доза 4 мкг вызывала меньшее увеличение IO в отношении O2 по сравнению с дозой 0,4 мкг. В группе, получавшей дозу 4 мкг, 3 из 8 животных демонстрировали увеличение IO, когда сыворотку тестировали на Е. coli O25B.
Результаты подтвердили, что четырехвалентная вакцина способна вызывать выработку у животных опсонизирующих О-антиген-специфичных антител против O2, О6А и 025В, что свидетельствует о том, что композиции вакцины, раскрытые в настоящем описании, индуцируют гуморальный ответ против серотипов Е. coli, О-антигены которых входят в состав вакцины, и что указанный гуморальный ответ является функциональным, приводя к уничтожению Е. coli указанных серотипов.
- 26 037500
Таблица 6
IO против Е. coli O2, О6А и 025В
Для всех животных приведены IO для отдельных сывороток до вакцинации и после 3 вакцинаций, полученные в двух отдельных экспериментах
Индексы опсонизации (10) сыворотки крыс, иммунизированных четырехвалентной вакциной сЕРА
E.coli 02 E.coli Об E.coli 025
Доза 0,4 мкг Доза 4 мкг Доза 0,4 мкг Доза 4 мкг Доза 0,4 мкг Доза 4 мкг
Эксп. Эксп. Эксп. Эксп. Эксп. Эксп. Эксп. Эксп. Эксп.
Животное № Эксп. 1 Эксп. 2 Эксп. 1
1 2 2 1 2 1 2 1 2
1: до
6 7 5 0 17 6 6 16 2404 2082 0 0
вакцинации
после
>16384 1476 293 32 202 226 2045 2821 1847 1578 9 0
вакцинации
2: до
21 11 11 20 11 90 0 0 0 0 0 0
вакцинации
после
11148 >16384 150 120 436 475 10262 11460 0 0 4 0
вакцинации
3: до
6 6 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0
вакцинации
после
11073 >16384 46 19 98 37 7959 8597 6 0 355 197
вакцинации
4: до
5 5 5 6 23 17 0 0 0 0 0 0
вакцинации
после
>16384 63 57 45 108 116 2189 4488 0 0 70 26
вакцинации
5: до
7 0 0 4 30 8 8 7 0 0 0 0
вакцинации
после
10413 7050 105 108 >16384 12672 3107 7564 0 0 105 69
вакцинации
6: до
8 0 8 7 299 164 5 0 269 154 0 0
вакцинации
после 89 34 24 17 1725 1475 540 896 0 0 0 0
вакцинации
7: до
9 9 6 6 18 21 22 5 0 0 0 0
вакцинации
после
>16384 >16384 109 92 1249 1863 160 143 ИЗО 630 9 8
вакцинации
8: до
4 6 6 5 26 22 0 0 0 0 0 0
вакцинации
после
5058 4201 39 25 6590 3826 288 656 3336 1986 0 0
вакцинации
Сред, до
8 5 5 6 53 42 5 3 334 280 0 0
вакцинации
Сред, после
10867 7747 103 57 3349 2586 3319 4578 790 524 69 37
вакцинации
Влияние на человека. Исследование фазы I.
ExPEC4V испытывали в первом исследовании 1 фазы у человека, в которое всего вошли 194 субъекта. Указанное исследование 1 фазы представляло собой рандомизированное плацебо-контролируемое многоцентровое исследование. Исследование представляло собой простое слепое исследование, поскольку исследователю и персоналу, участвующему в исследовании, была известна группа рандомизации субъектов, тогда как субъекты в течение всего времени держались в неведении относительно группы их рандомизации.
- 27 037500
Задачей указанного первого исследования у человека была оценка безопасности, иммуногенности и эффективности экспериментальной вакцины у здоровых женщин в возрасте от больше или равно 18 до меньше или равно 70 лет, имеющих в анамнезе рецидивирующую инфекцию мочевыводящих путей (рИМП). Главной задачей исследования было сравнение нежелательных явлений, сообщаемых в процессе направленного опроса и спонтанно (АЕ), а также серьезных нежелательных явлений (SAE) у субъектов, получавших ExPEC4V, и субъектов, получавших плацебо. Дополнительные задачи включали показатели иммуногенности, число симптоматических эпизодов ИМП, вызванных серотипами Е. coli, входящими в состав вакцины, а также частоту возникновения и клинические симптомы ИМП, вызванные серотипами Е. coli, специфическими для вакцины.
Субъекты, подходящие для участия в исследовании, должны были иметь по меньшей мере 3 независимых эпизода ИМП за последние 12 месяцев или по меньшей мере 2 независимых эпизода ИМП за последние 6 месяцев; по меньшей мере 1 независимый эпизод ИМП должен был быть связан с инфекцией Е. coli, подтвержденной культуральными методами. Всего было включено 194 субъекта и их рандомизировали на группы для однократного в/м введения ExPEC4V в дозе 0,5 мл или плацебо (см. табл. 7). Включение в исследование осуществляли с разнесением по времени, чтобы оценить результаты по безопасности на 14 сутки до перехода к следующей фазе.
1. Первые 8 субъектов рандомизировали (3:1) для получения дозы 1 мкг каждого PS или плацебо.
2. Следующие 8 субъектов рандомизировали (3:1) для получения дозы 4 мкг каждого PS или плацебо.
3. Оставшиеся 178 субъектов рандомизировали (1:1) для получения дозы 4 мкг каждого PS или плацебо.
Таблица 7
Демографические и исходные характеристики субъектов, включенных в исследование 1 фазы
ExPEC4V
Плацебо 1 мкг полисахарида каждого серотипа3 N = 6 4 мкг полисахарида каждого серотипа3 N=93 Всего N = 19
Возраст (лет) N Среднее (ст. откл.) Медиана (размах) 95 42,1 (15,9) 42,6(18,71) 6 28,1 (9,6) 23,1 (20, 43) 93 42,0 (17,6) 38,5 (19, 72) 194 41,6 (16,7) 39,6(18, 72)
Раса N Европеоиды Другие 95 91 (96%) 4 (4%) 6 6 (100%) 0 93 87 (94%) 6 (6%) 194 184 (95%) 10 (5%)
Масса тела (кг) N Среднее (ст. откл.) Медиана (размах) 95 63,1 (11,0) 61 (46,2, 95,0) 6 59,7 (10,3) 56,5 (50, 79) 93 63,8(11,0) 63 (44, 105) 194 63,3 (10,9) 61 (44, 105)
Индекс массы тела (кг/м2) N Среднее (ст. откл.) Медиана (размах) 95 23,2(4,1) 22 (17,8, 33,7) 6 21,1 (4,3) 19,9 (17,5, 29,4) 93 23,3 (3,8) 22,7 (17,6, 34,3) 194 23,2 (3,9) 22,2 (17,5, 34,3)
Менопаузальный статус N Пременопауза 95 64 (67%) 6 6 (100%) 93 57 (61%) 194 127 (65%)
Способность к деторождению N да 64 55 (86%) 6 6 (100%) 57 54 (95%) 127 115 (91%)
a Доза ExPEC4V содержит О-антигенный полисахарид ЕхРЕС серотипов О1А, O2, 06 а и 025В.
- 28 037500
В ходе первого визита субъекты, подходящие для участия в исследовании, давшие информированное согласие, проходили скрининг и подтверждалось их соответствие критериям включения/исключения. Брали образцы крови и мочи. В ходе 2 визита (1 сутки) каждый субъект получал одну внутримышечную инъекцию 0,5 мл раствора (ExPEC4V или плацебо) в дельтовидную мышцу. Уменьшенная доза экспериментальной вакцины содержала 1 мкг каждого полисахарида (суммарно 4 мкг полисахаридов). Целевая доза экспериментальной вакцины содержала 4 мкг каждого полисахарида (суммарно 16 мкг полисахаридов).
Безопасность оценивали по местным (боль, покраснение и припухлость в месте инъекции) и системным (жар, т.е. температура тела >38°С) АЕ, зафиксированным в дневнике при ответе на соответствующий вопрос, начиная с 1 суток и до 7 суток после вакцинации, а также АЕ и SAE, зафиксированным до 270 суток (визит в конце исследования). Иммуногенность оценивали с помощью сертифицированного ELISA и OPK-теста с использованием сыворотки из образцов крови, взятых до вакцинации в 1 сутки и после вакцинации на 30 и 270 сутки.
Описательная статистика (n, среднее арифметическое, стандартное отклонение, медиана и размах для непрерывных переменных, частота и проценты для категориальных переменных) представлены по группам воздействия и/или по визитам, где это применимо. Все данные указаны для субъектов, группы воздействия и, где применимо, визитов. Всех субъектов из группы В, получавших плацебо, объединяли для формирования группы плацебо.
Безопасность.
К настоящему времени в исследовании 1 фазы (которая все еще продолжается) не зафиксировали нежелательных лекарственных реакций, существенных аномалий клинико-лабораторных показателей, побочных действий со стороны сердечно-сосудистой, дыхательной, центральной нервной системы, почек или других существенных побочных действий, передозировки. Возникновение нежелательных явлений и серьезных нежелательных явлений сравнивали между группами, получавшими плацебо и вакцинацию.
Иммуногенность - общий титр антител.
Для оценки иммуногенности компонентов вакцины получали сыворотку женщин, принимавших участие в клиническом исследовании, и исследовали при помощи ELISA для количественного определения IgG к четырем различным О-антигенам, входящим в четырехвалентную вакцину (Е. coli O1, Е. coli O2, Е. coli O6 и Е. coli O25B).
Суммарные титры IgG антител на 1 сутки (до вакцинации) и на 30 сутки оценивали при помощи сертифицированного ELISA, оптимизированного для изолята каждого серотипа, с использованием очищенного серотип-специфического О-антигена в качестве первичного анализируемого антигена. Суммарные титры IgG антител для каждого серотипа вычисляли с использованием 4-параметрической логистической регрессии для определения значений концентрации, вызывающей полумаксимальный эффект (ЕС50), для каждого образца.
мкг полисахарида каждого серотипа в составе ExPEC4V (N = 6).
Шесть субъектов получали ExPEC4V в дозе 1 мкг PS каждого серотипа (суммарно 4 мкг PS). Анализ серотип-специфических иммунных ответов указанных субъектов на 30 сутки показал, что доля субъектов с >2-кратным увеличением общего количества антител к каждому серотипу составляла 50% (серотип О1А), 83% (серотип O2), 50% (серотип О6А) и 67% (серотип 025b). Доля субъектов с >4-кратным увеличением титра антител была ниже, т.е. 17% (серотип О6А), 33% (серотип 1А), 33% (серотип О6А) и 50% (серотип 025В).
Анализ ответов в группе, получавшей дозу 1 мкг PS каждого серотипа, показал сопоставимую степень увеличения для всех 4 серотипов. Для серотипов О1А, O2, О6А и 025В медианные значения кратности увеличения титров антител при сравнении на 30 сутки и на 1 сутки составляли 2,5, 3,7, 2,2 и 4,1 соответственно. У отдельных субъектов кратность увеличения варьировала от 1 до 6 для серотипов О1А и O2, от 1 до 7 для серотипа О6А и от 1 до 11 для серотипа 025В. Средние геометрические значения титров (GMT) для соответствующих 4 серотипов на 30 сутки составляли 4053, 13768, 1236 и 227 (табл. 8), что соответствовало приблизительно 2,2-3,5-кратному увеличению по сравнению со значениями GMT на 1 сутки.
- 29 037500
Таблица 8
GMT и 95% доверительные интервалы общих титров антител с 1 суток (до вакцинации) до 30 суток при определении методом ELISA - исследование 1 фазы
ExPEC4V
Плацебо N=95 1 мкг полисахарида каждого серотипа3 N = 6 4 мкг полисахарида каждого серотипа3 N = 93
Антитело О1А GMT 95% ДИ 1 сутки 1895 1515-2369 30 сутки 1887 1517-2347 1 сутки 1720 633 -4672 30 сутки 4053 2160-7605 1 сутки 1807 1489-2191 30 сутки 9460 7511-11916
02 GMT 3529 3502 4266 13768 2855 27973
95% ДИ 2926 - 4257 2910-4214 1731 - 10511 6516-29091 2279 - 3576 22026 -
35526
О6А GMT 943 953 558 1236 920 4475
95% ДИ 777- 1145 789- 1151 292 - 1067 799- 1911 743 - 1138 3608-5549
025В GMT 285 282 64 227 261 2164
95% ДИ 211-384 209-381 16-254 53 - 976 188-363 1676 - 2794
a 4 мкг полисахарида каждого серотипа в составе ExPEC4V (N = 93).
Введение ExPEC4V в дозе 4 мкг PS каждого серотипа (суммарно 16 мкг PS) приводило к более выраженному иммунному ответу по сравнению с дозой, содержащей 1 мкг PS каждого серотипа (суммарно 4 мкг PS). Анализ указанных субъектов на 30 сутки показал, что доля субъектов с >2-кратным увеличением общего количества антител к каждому серотипу составляла 81% (серотип О1А), 92% (серотип O2), 80% (серотип О6А) и 82% (серотип 025b). Доля субъектов с >4-кратным увеличением титров антител варьировала от 57% (серотипы О1А и О6А) до 80% (серотип O2), что было ниже доли с 2-кратным увеличением, однако заметно выше по сравнению с тем, что наблюдалось, когда доза включала 1 мкг PS каждого серотипа. См. также фиг. 4, выраженный иммунный ответ на каждый из О1А, O2, О6А и 025В и существенное увеличение титров ELISA после инъекции (30 сутки после инъекции) по сравнению с титрами до инъекции (1 сутки) наблюдались только в вакцинированных группах (В_30 сутки по сравнению с В_1 сутки), но не в группах плацебо (П_30 сутки по сравнению с П_1 сутки). Анализ ответов показал, что медианные значения кратности увеличения в группе, получавшей по 4 мкг PS каждого серотипа, были выше, чем в дозовой группе, получавшей по 1 мкг PS каждого серотипа. Для серотипов О1А, O2, О6А и 025В медианные значения кратности увеличения ЕС50 при сравнении на 30 сутки и на 1 сутки составили 4,6, 9,4, 4,9 и 5,9 соответственно. Величина и разброс кратности увеличения были выше в указанной дозовой группе, варьируя от 1 до 96 для серотипа О1А, от 1 до 165 для серотипа O2, от 0 до 61 для серотипа О6А и от 1 до 579 для серотипа 025В. Значения GMT на 30 сутки составляли 9460, 27973, 4475 и 2164 для соответствующих 4 серотипов (табл. 8), что соответствовало приблизительно 4,9-9,8-кратному увеличению по сравнению со значениями GMT на 1 сутки.
Заключение.
Данные промежуточные результаты демонстрируют специфический иммунный ответ на вакцину у здоровых субъектов, которым вводили ExPEC4V в дозе 1 мкг PS каждого серотипа, и сравнительно более выраженное усиление иммунного ответа при введении ExPEC4V в дозе 4 мкг PS каждого серотипа в течение 30-дневного периода наблюдений. Отсутствие надлежащего изменения титров антител у 95 субъектов в группе плацебо в течение указанного периода свидетельствует о том, что гуморальный ответ у реципиентов ExPEC4V был опосредован вакциной и не был следствием внешнего воздействия бактерий ЕхРЕС.
Эти результаты указывают на общее увеличение титров антител, связанное с более высокой дозой 4 мкг PS каждого серотипа по сравнению с дозой 1 мкг PS каждого серотипа. Хотя приведенные результаты свидетельствуют о более высоком разбросе титров в группе, получавшей более высокую дозу, по сравнению с группой, получавшей более низкую дозу, малое количество субъектов в группе, получавшей дозу 1 мкг, не позволяет дать интерпретацию наблюдавшихся различий. Кроме того, в каждой дозовой группе наблюдались различия в относительных титрах IgG к каждому из серотипов, при этом титры антител к антигену 025В были наиболее низкими (табл. 8).
Функциональный гуморальный ответ.
OPK-тест использовали для оценки функционального гуморального ответа у женщин, принимающих участие в клиническом исследовании. У участников исследования брали сыворотку. Производили предварительную опсонизацию Е. coli с использованием разведений сыворотки вакцинированных женщин, инкубировали с комплементом и фагоцитами (дифференцированные клетки HL60) и подсчитывали оставшиеся колониеобразующие единицы (CFU). Затем рассчитывали максимальный % уничтожения и
- 30 037500 индекс опсонизации (IO: разведение сыворотки, приводящее к гибели 50% Е. coli). Для OPK-теста выбирали Е. coli ОС 24452 (серотип О1А), ОС 24453 (серотип O2), ОС 24454 (серотип О6А) и ОС 24176 (серотип 025b).
В сыворотке, полученной на 1 сутки и 30 сутки, определяли функциональные антитела (выражали как индекс опсонизации (IO), или концентрацию сыворотки, вызывающую 50% уменьшение числа колониеобразующих единиц Е. coli) с помощью оптимизированного OPK-теста с использованием выбранных штаммов ЕхРЕС с серотипами О1А, O2, О6А или 025В, человеческого комплемента и фагоцитирующих клеток HL60. Титры функциональных антител к серотипу 025В включали в промежуточный анализ, основанный на предварительных оценках точности и воспроизводимости титров. Для всех серотипов титры функциональных антител определяли по показателям уничтожения Е. coli в опсонофагоцитарном тесте с использованием программы NICE, разработанной Национальным институтом стандартов и технологии США, и программы Opsititer3, разработанной и лицензированной в университете Алабамы. Для промежуточного анализа опсонофагоцитарные титры определяли для 194 субъектов, включая 95 субъектов, получавших плацебо, 6 субъектов, получавших вакцину ExPEC4V 1 мкг PS (каждого серотипа), и 93 субъектов, получавших вакцину ExPEC4V 4 мкг PS (каждого серотипа).
Реципиенты плацебо (N = 95).
Как и в случае ELISA, опсонофагоцитарная реакция против серотипов ExPEC4V у реципиентов плацебо (95 субъектов) была сопоставима для сыворотки, взятой на 1 сутки и на 30 сутки, при этом у большинства субъектов разница в значениях опсонофагоцитарных титров была незначительной или отсутствовала. Эти результаты указывают на стабильность титров функциональных антител в течение указанного периода времени у большинства или у всех субъектов, получавших плацебо.
мкг полисахарида каждого серотипа ExPEC4V (N = 6).
Шесть субъектов получали ExPEC4V в дозе 1 мкг PS каждого серотипа (суммарно 4 мкг PS). Анализ серотип-специфических иммунных ответов указанных субъектов на 30 сутки показал, что доля субъектов с >2-кратным увеличением общего количества антител к каждому серотипу составляла 33% (серотип О1А), 67% (серотип O2) и 0% (серотипы О6А и 025В). Для серотипов О1А и O2 доля субъектов с >4-кратным увеличением титров антител снижалась до 17 и 50% соответственно.
Для серотипов О1А, O2, О6А и 025В медианные значения кратности увеличения титров антител при сравнении на 30 сутки и на 1 сутки составили 1,0, 4,8, 0,9 и 1,0, соответственно. У отдельных субъектов кратность увеличения варьировала от 0,6 до 8,1 для серотипа O1, от 0,3 до 9,5 для серотипа O2, от 0,8 до 1,3 для серотипа О6А и от 0,5 до 1,5 для серотипа 025В. Средние геометрические значения титров (GMT) на 30 сутки составляли 429, 1834, 1136 и 51 для соответствующих 4 серотипов, что соответствовало приблизительно 1,0-2,8-кратному увеличению по сравнению со значениями GMT на 1 сутки.
мкг полисахарида каждого серотипа ExPEC4V (N = 93).
Введение ExPEC4V в дозе 4 мкг PS каждого серотипа (суммарно 16 мкг PS) вызывало функциональный иммунный ответ на все серотипы ExPEC 4V. Анализ указанных субъектов на 30 сутки показал, что доля субъектов с >2-кратным увеличением значений IO для каждого серотипа составляла 63% (серотип О1А), 90% (серотип O2), 33% (серотип О6А) и 55% (серотип 025В). Доля субъектов с >4-кратным увеличением значений IO варьировала от 20% (серотип О6А) до 82% (серотип O2); как и ожидалось, указанные доли были стабильно ниже, чем доли субъектов, у которых наблюдалось >2-кратное увеличение.
Для серотипов О1А, O2, О6А и 025В медианные значения кратности увеличения IO в OPK-тесте при сравнении на 30 сутки и на 1 сутки составили 3,5, 14,7, 1,4 и 2,5 соответственно. Кратность увеличения у субъектов в данной дозовой группе варьировала от 0,5 до более 292 для серотипов О1А и O2, от 0,3 до 26,4 для серотипа О6А и от 0,1 до 272,8 для серотипа 025В. Как показано на фиг. 5А-5Г, выраженный функциональный иммунный ответ на каждый из О1А, O2, О6А и 025В и существенное увеличение IO после инъекции по сравнению с показателями до инъекции наблюдались только в вакцинированных группах, но не в группах плацебо.
Значения GMT на 30 сутки составляли 950,5, 4132, 1542 и 414,7 для соответствующих 4 серотипов (табл. 9), что соответствовало приблизительно 2-14-кратному увеличению по сравнению со значениями GMT на 1 сутки. Эти результаты указывают, что для всех серотипов ExPEC 4V наблюдалось общее увеличение титров функциональных антител на 30 сутки при дозе 4 мкг каждого серотипа PS.
- 31 037500
Таблица 9
GMT и 95% доверительные интервалы титров функциональных антител с 1 суток (до вакцинации) до 30 суток по результатам OPK-теста - исследование 1 фазы
Индекс опсонизации3
Плацебо N=95 ExPEC4V
1 мкг полисахарида каждого серотипа6 N=6 4 мкг полисахарида каждого серотипа6 N = 93
Антитело 1 сутки 30 сутки 1 сутки 30 сутки 1 сутки 30 сутки
О1А GMT 156 161 288 429 192,5 950,5
95% ДИ 126,4 - 131- 94-881 203 -910 158,9- 692,8 -
192,5 197,8 233,3 1304,1
02 GMT 341,9 341,6 652 1834 301,3 4132
95% ДИ 275,2 - 273,8- 214-1980 425-7913 237,6 - 3034,9-
424,8 426,4 382,2 5625
О6А GMT 692,6 715,1 1147 1136 790,6 1542
95% ДИ 598,4 - 614,5- 794 - 1657 749- 1721 676,7 - 1263,7-
813,8 832,2 923,7 1181
025В GMT 86,6 97,3 52 51 114 414,7
95% ДИ 58,4- 64,3- 27 - 103 28-92 74,6- 273,5-629
128,5 147,2 174,5
Заключение.
Данные промежуточные результаты демонстрируют специфический функциональный иммунный ответ на вакцину в течение 30-дневного периода наблюдений у здоровых субъектов, которым вводили ExPEC4V в дозе по 4 мкг PS каждого серотипа. Отсутствие существенных изменений в титрах антител в течение указанного периода у 95 субъектов в группе плацебо (фиг. 5А-5Г и табл. 9) согласуются с результатами ELISA и подтверждают вывод о том, что вакцинация вызывала гуморальный ответ на все 4 серотипа ЕхРЕС.
Промежуточные результаты по иммуногенности, полученные в исследовании 1 фазы в течение 30дневного периода наблюдений при определении общего титра антител (ELISA) и титра функциональных антител (OPK), демонстрируют специфический иммунный ответ на вакцину у здоровых субъектов, которым вводили ExPEC4V в дозе 1 мкг PS каждого серотипа, и сравнительно более выраженный иммунный ответ при введении ExPEC4V в дозе 4 мкг PS каждого серотипа. Сравнение кратности усиления специфического ответа на серотипы, наблюдавшегося в ELISA и в опсонофагоцитарном тесте, показало сопоставимый уровень ответов для серотипов О1А и O2 в обоих исследованиях, но несколько более низкие уровни опсонофагоцитарной реакции субъектов на серотипы 06а и 025b. Избирательное снижение опсонофагоцитарной реакции на серотипы О6А и 025В у некоторых субъектов изучается.
Следует отметить, что по результатам OPK-теста GMT значения титра функциональных антител к антигену 025В ниже, чем к другим антигенам (О1А, O2 и О6А). OPK-тест признан более предпочтительным суррогатным исследованием иммунной защиты, индуцированной вакциной на основе конъюгата PS против Streptococcus pneumoniae (Prevenar®), поскольку ELISA не позволяет дифференцировать низкоавидные антитела, не обладающие защитными свойствами, от высокоавидных защитных антител (Kim et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2003 10(4):616-21).
Влияние на человека. Исследование фазы II.
На основании промежуточных результатов, полученных в исследовании фазы I, будет проведено исследование фазы II. Это рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование планируется для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности 5 различных доз у мужчин и женщин в стабильном состоянии здоровья, стратифицированных по возрасту: в возрасте от более или равно 18 до менее 50 лет (N=275) и в возрасте более или равно 50 лет (N=560). В исследовании фазы II будут применяться две композиции вакцины, т.е. препараты 1 и 2, приведенные в табл. 3-2, имеющие две различные концентрации полисахаридов, используемые действующие вещества будут такими же, как и в ExPEC4V. Более конкретно, композиция 1 содержит в своем составе 32, 32, 32, 32 мкг/мл Оантигенного полисахарида (PS) Е. coli серотипов О1А, O2, О6А и 025В, соответственно, без адъюванта. Композиция 2 содержит в своем составе 16, 16, 16, 32 мкг/мл каждого О-антигена PS Е. coli серотипов О1А, O2, О6А и 025В, соответственно, без адъюванта. В исследовании фазы II будут исследованы различные дозы и соотношения действующих веществ. Более конкретно, включенные в исследование субъекты будут рандомизированы на 6 групп: группы (i-v) для пяти различных доз экспериментальной вак
- 32 037500 цины и группа (vi) плацебо. Каждый субъект будет получать однократную дозу композиции 1, композиции 2 или плацебо в/м. Целевая доза О-антигенов Е. coli О1А:О2:О6А:О25В на инъекцию композиции 1 или 2 составит 4:4:4:4 мкг (т.е. такая же, как наиболее высокая доза, использованная в исследовании фазы I, раскрытом выше), 4:4:4:8, 8:8:8:8, 8:8:8:16 и 16:16:16:16 мкг. Задачей исследования является оценка безопасности, иммуногенности и эффективности 5 различных доз четырехвалентной вакцины против Е. coli на основе биоконъюгата.
Последовательности
Описание Последовательность SEQ ID NO.
Обезвреженный белок ЕРА, содержащий 4 оптимизированных последовательности Nгликозилирования GSGGGDQNATGSGGGKLAEEAFDLWNECAKAC VLDLKDGVRS SRMS VDP AIADTNGQGVLH YSM VLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEP NKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIK VFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARD ATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQP RREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQR CNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKDNNNST PTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTR HRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWN 1
QVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLAL TLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCP VAKDQNRTKGECAGPADSGDALLERNYPTGAEF LGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERG YVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIW RGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALL RVYVPRWSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIG HPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTVVIP SAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQ PGKPPREDLKLGSGGGDQNAT
Консенсусная последовательность N- гликозилирования Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой, за исключением Pro 2
Консенсусная последовательность N- гликозилирования Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты естественного происхождения, за исключением Pro 3
Раскрытые в настоящем описании воплощения приведены исключительно в качестве примеров, и специалисты в области техники смогут представить и, проведя рутинные эксперименты, осуществить различные варианты конкретных процедур, раскрытых в настоящем описании. Все эти эквиваленты входят в объем настоящего изобретения и охвачены приведенной ниже формулой изобретения.
Все цитируемые в настоящем описании источники (включая заявки на патенты, патенты и публикации) включены посредством ссылки во всей полноте, по всем назначениям и в том же объеме, как если бы для каждой отдельной публикации, патента или заявки на патент было непосредственно указано, что они включены посредством ссылки во всей полноте и по всем назначениям.
Список литературы (1) Johnson et al., J Lab Clin Med. 2002;139(3): 155-162 (2) Kohler et al., Int J Med Microbiol. 2011;301(8):642-647
- 33 037500 (3) Foxman, Am J Med. 2002;113 Suppl 1A:5S-13S;
(4) Russo et al., Microbes Infect. 2003;5(5):449-456 (5) Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413 (6) Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10):1165-1176 (7) Johnson et al., Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54(1):546-550 (8) Rogers et al., JAntimicrob Chemother. 2011; 66(1):1-14 (9) Banerjee et al., Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58(9):4997-5004 (10) Stenutz et al., FEMS Microbial Rev. 2006; 30: 382-403 (11) Russo et al., Vaccine. 2007; 25: 3859-3870 (12) Lipsitch, Emerging Infectious Diseases', 1999,5:336-345 (13) WO 2006/119987 (14) WO 2009/104074 (15) International Patent Application No. PCT/EP2015/053739 (published as WO 2015/124769) (16) Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61 (17) Lukac et al., Infect Immun, 56: 3095-3098, 1988 (18) Ho et al., Hum Vaccin, 2:89-98, 2006 (19) Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885 (20) Robbins et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978 (21) Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. Ш#312709 (p. 1-18) (22) WO/2009/104074 (23) Datsenko and Wanner (2000) Proc Natl Acad Sci USA97'. 6640-6645 (24) WO 2014/057109 (25) Laurentin and Edwards, 2003, AnalBiochem 315, 143-145 (26) Kim et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2003 10(4): 616-21

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция для индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной E.coli (ЕхРЕС), содержащая полисахаридный антиген Е. coli 025b в первой концентрации и каждый из антигенного полисахарида Е. coli О1А, антигенного полисахарида Е. coli O2 и антигенного полисахарида Е. coli O6A во второй концентрации, где отношение первой концентрации к второй концентрации составляет 2:1, каждый из антигенных полисахаридов Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белком-носителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA), и первая концентрация составляет от 10 до 36 мкг/мл.
  2. 2. Композиция по п.1, содержащая антигенные полисахариды Е. coli 025В, О1А, O2 и О6А в соотношении доз 2:1:1:1, где первая концентрация составляет 10, 16, 24, 32 или 36 мкг/мл.
  3. 3. Композиция по любому из пп.1 или 2, содержащая 16 мкг/мл антигенного полисахарида 025В.
  4. 4. Композиция по любому из пп.1 или 2, содержащая 32 мкг/мл антигенного полисахарида 025В.
  5. 5. Мультивалентная иммунная композиция для индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной Е. coli (ЕхРЕС), содержащая полисахаридный антиген Е. coli O25B в первой дозе от 5 до 18 мкг и каждый из антигенного полисахарида Е. coli О1А, антигенного полисахарида Е. coli O2 и антигенного полисахарида Е. coli O6A в дозе, которая независимо составляет 50% от первой дозы, где каждый из антигенных полисахаридов Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белком-носителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (ЕРА).
  6. 6. Мультивалентная иммунная композиция для индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной E.coli (ЕхРЕС), содержащая антигенный полисахарид Е. coli 025В, имеющий структуру формулы 025В'
    - 34 037500
    D-GIc
    α 3
    L-Rha2Ac “3 »· D-GIcNAc
    L-Rha антигенный полисахарид Е. coli О1А, имеющий структуру формулы О1А' β Г α α β — L-Rha----► L-Rha , „ »- L-Rha ——► D-GIcNAc з[ A 1,3 1,3 1,4 β 2
    D-ManNAc
    антигенный полисахарид Е. coli O2, имеющий структуру формулы O2'
    и антигенный полисахарид Е. coli 06а, имеющий структуру формулы 06а'
    где n независимо представляет собой целое число от 5 до 25 и каждый из антигенных полисахаридов Е. coli О25В, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белком-носителем, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и концентрации антигенных полисахаридов Е. coli О25В, О1А, O2, О6А в композициях составляют, соответственно, 16:8:8:8 мкг/мл или 32:16:16:16 мкг/мл.
  7. 7. Способ индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной Е. coli (ExPEC) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.1-6.
  8. 8. Способ индуцирования иммунного ответа на внекишечную патогенную Е. coli (ExPEC) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту антигенного полисахарида Е. coli O25B в первом эффективном количестве и каждого из антигенного полисахарида Е. coli О1А, антигенного полисахарида Е. coli O2 и антигенного полисахарида Е. coli O6A во втором эффективном количестве, где отношение первого эффективного количества к второму эффективному количеству составляет 2:1, каждый из антигенных полисахаридов Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А независимо ковалентно связан с белкомносителем, представляющим собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA), и первое эффективное количество составляет от 5 до 18 мкг на введение.
  9. 9. Способ по п.8, где антигенные полисахариды Е. coli О25В, О1А, O2 и О6А вводят в соотношении доз 2:1:1:1, где первое эффективное количество составляет 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18 мкг на введение.
  10. 10. Способ по любому из пп.7-9, где вводят 8 мкг антигенного полисахарида Е. coli О25В на введе ние.
  11. 11. Способ по любому из пп.7-9, где вводят 16 мкг антигенного полисахарида Е. coli O25B на вве дение.
  12. 12. Способ по любому из пп.7-11, где антигенные полисахариды Е. coli O25B, О1А, O2 и О6А вводят вместе в составе одной композиции.
  13. 13. Способ индуцирования иммунного ответа против внекишечной патогенной Е. coli (ExPEC) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту антигенного полисахарида Е. coli О25В, имеющего структуру формулы О25В'
    D-GIc β 6
    Rha2Ac “ »D-GIcNAc
    Ί
    L-Rha антигенного полисахарида Е. coli О1А, имеющего структуру формулы О1А'
    - 35 037500
    D-GIcNAc
    D-ManNAc антигенного полисахарида-Е. coli O2, имеющего структуру формулы O2' α α β
    L-Rha---► L-Rha——► L-Rha ——* D-GIcNAc
    A 1,2 1,3 1,4
    η
    D-Fuc3NAc и антигенного полисахарида Е. coli О6А, имеющего структуру формулы О6А'
    D-GalNAc —► D-Man 1.3 А β β
    ---► D-Man---► D-GIcNAc
    1,4 1,3
    η β 1,2
    D-GIc где n независимо представляет собой целое число от 5 до 25, каждый из антигенных полисахаридов Е. coli 025b, 01а, O2 и 06 а независимо ковалентно связан с белком-носителем, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и антигенные полисахариды Е. coli 025В, О1А, O2 и О6А вводят в соотношении 8:4:4:4 мкг или 16:8:8:8 мкг на введение.
  14. 14. Способ по любому из пп.7-13, где иммунный ответ ограничивает тяжесть или предупреждает вызванное ЕхРЕС серотипами О1А, O2, О6А и 025В инвазивное заболевание ЕхРЕС у человека, подверженного риску, например, где взрослый человек имеет инвазивное заболевания ЕхРЕС, выбранное из группы, состоящей из инфекции мочевыводящих путей, инфекции области хирургического вмешательства, инфекции брюшной полости или таза, пневмонии, нозокомиальной пневмонии, остеомиелита, панникулита, сепсиса, бактериемии, раневой инфекции, пиелонефрита, менингита, неонатального менингита, перитонита, холангита, инфекции мягких тканей, пиомиозита и септического артрита, или подвержен риску его возникновения.
  15. 15. Способ получения композиции по любому из пп.1-6, включающий объединение антигенного полисахарида Е. coli O25B, антигенного полисахарида Е. coli О1А, антигенного полисахарида Е. coli O2 и антигенного полисахарида Е. coli О6А с получением таким образом композиции.
EA201890400A 2015-08-24 2016-08-24 Способы и композиции для иммунной защиты против внекишечной патогенной e. coli EA037500B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562209091P 2015-08-24 2015-08-24
US201562210655P 2015-08-27 2015-08-27
PCT/US2016/048278 WO2017035181A1 (en) 2015-08-24 2016-08-24 Methods and compositions for immune protection against extra-intestinal pathogenic e. coli

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201890400A1 EA201890400A1 (ru) 2018-09-28
EA037500B1 true EA037500B1 (ru) 2021-04-05

Family

ID=56855827

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201890400A EA037500B1 (ru) 2015-08-24 2016-08-24 Способы и композиции для иммунной защиты против внекишечной патогенной e. coli

Country Status (19)

Country Link
US (3) US10583185B2 (ru)
EP (2) EP4245320A3 (ru)
JP (1) JP6872532B2 (ru)
KR (1) KR20180054629A (ru)
CN (1) CN108430500B (ru)
AU (1) AU2016312422B2 (ru)
BR (1) BR112018003469A2 (ru)
CA (1) CA2995873A1 (ru)
EA (1) EA037500B1 (ru)
ES (1) ES2951408T3 (ru)
HR (1) HRP20230947T1 (ru)
HU (1) HUE063961T2 (ru)
IL (1) IL257608B (ru)
MX (1) MX2018002340A (ru)
NZ (1) NZ739963A (ru)
PL (1) PL3341016T3 (ru)
RS (1) RS64449B1 (ru)
TW (1) TWI715617B (ru)
WO (1) WO2017035181A1 (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8329184B2 (en) * 2005-06-27 2012-12-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Process for manufacturing vaccines
MX365331B (es) 2013-01-17 2019-05-29 Arsanis Biosciences Gmbh Anticuerpo específico contra e. coli mdr.
LT3110441T (lt) 2014-02-24 2024-04-25 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Naujas polisacharidas ir jo panaudojimas
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
US20190275135A1 (en) 2018-03-12 2019-09-12 Janssen Pharmaceuticals, Inc Vaccines against intra-abdominal infections
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
MA55365B1 (fr) 2019-03-18 2023-09-27 Janssen Pharmaceuticals Inc Procedes de production de bioconjugues de polysaccharides o-antigenes d'e. coli, leurs compositions et leurs procedes d'utilisation
CN113924112A (zh) * 2019-03-18 2022-01-11 杨森制药公司 大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物、其生产方法及其使用方法
AU2021208493B2 (en) 2020-01-16 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. FimH mutant, compositions therewith and use thereof
CN115485550A (zh) 2020-04-28 2022-12-16 杨森制药公司 用于鉴定和定量复合糖缀合物组合物中的多糖的方法
CA3185639A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
KR20230043157A (ko) 2020-09-17 2023-03-30 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 다가 백신 조성물 및 이의 용도
CA3203450A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Analytical method for glycoconjugates using a capillary-based immunoassay system
CN116888140A (zh) 2021-01-12 2023-10-13 杨森制药公司 FimH突变体、其组合物及其用途
WO2022178020A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 Duke University Vaccine compositions and methods for the treatment and prevention of urinary tract infections
JP2024514074A (ja) 2021-04-01 2024-03-28 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド Ｅ．ｃｏｌｉ ｏ１８バイオコンジュゲートの産生
WO2022214620A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Process for bioconjugate production

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104074A2 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Glycovaxyn Ag Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
WO2014037585A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Glycovaxyn Ag Bioconjugates comprising modified antigens and uses thereof
WO2015124769A1 (en) * 2014-02-24 2015-08-27 Glycovaxyn Ag Novel polysaccharide and uses thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700612A (en) 1971-06-23 1972-10-24 Tenneco Chem Aqueous surface-coating compositions containing hydroxyalkyl ethers of galactomannan gums as thickeners
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5370872A (en) 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
PT1481057E (pt) 2002-03-07 2006-05-31 Eidgenoess Tech Hochschule Sistema e metodo para a producao de proteinas glicosiladas recombinantes num hospedeiro procariota
EP1747262B1 (en) * 2004-05-14 2012-09-26 National Research Council Of Canada Conserved inner core lipopolysaccharide epitopes as multi-species vaccine candidates
DE602006017207D1 (de) 2005-05-11 2010-11-11 Eth Zuerich Rekombinante n-glykosylierte proteine aus prokaryontischen zellen
CA2646891A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
EP2010537B1 (en) 2006-03-23 2011-12-28 Novartis AG Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
US20100286067A1 (en) 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
HUE038456T2 (hu) 2009-11-19 2018-10-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bioszintetikus rendszer, amely immunogén poliszaccharidokat termel prokarióta sejtekben
BR112013012626A2 (pt) 2010-12-10 2016-07-19 Merck Sharp & Dohme formulação, composição imunogênica, e, seringa pré-carregada
US20140336366A1 (en) 2011-09-06 2014-11-13 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
US9932598B2 (en) 2012-08-02 2018-04-03 The Regents Of The University Of California Metabolic engineering of microbial organisms
CN110423716A (zh) 2012-10-12 2019-11-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 宿主细胞修饰方法
US10287330B2 (en) 2012-12-27 2019-05-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods and compositions relating to CRM197
MX365331B (es) * 2013-01-17 2019-05-29 Arsanis Biosciences Gmbh Anticuerpo específico contra e. coli mdr.
EP3055416B1 (en) 2013-10-11 2020-01-22 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods of host cell modification
CN106536551B (zh) 2014-02-06 2021-04-16 X4制药(奥地利)有限责任公司 大肠杆菌特异性抗体序列
JP6850724B2 (ja) 2014-12-30 2021-03-31 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム タンパク質グリコシル化のための組成物および方法
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) * 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104074A2 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Glycovaxyn Ag Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
WO2014037585A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Glycovaxyn Ag Bioconjugates comprising modified antigens and uses thereof
WO2015124769A1 (en) * 2014-02-24 2015-08-27 Glycovaxyn Ag Novel polysaccharide and uses thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. CROSS, ARTENSTEIN A., QUE J., FREDEKING T., FURER E., SADOFF J. C., J. CRYZ JR . S.: "Safety And Immunogenicity Of A Polyvalent Escherichia Coli Vaccine In Human Volunteers", JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS, US, vol. 170, no. 4, 1 October 1994 (1994-10-01), US, pages 834 - 840, XP055311603, ISSN: 0022-1899, DOI: 10.1093/infdis/170.4.834 *
B. A. ROGERS, H. E. SIDJABAT, D. L. PATERSON: "Escherichia coli O25b-ST131: a pandemic, multiresistant, community-associated strain", JOURNAL OF ANTIMICROBIAL CHEMOTHERAPY, OXFORD UNIVERSITY PRESS, vol. 66, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 1 - 14, XP055056619, ISSN: 03057453, DOI: 10.1093/jac/dkq415 *
CRYZ, S.J. QUE, J.O. CROSS, A.S. FURER, E.: "Synthesis and characterization of a polyvalent Escherichia coli O-polysaccharide-toxin A conjugate vaccine", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 13, no. 5, 1 January 1995 (1995-01-01), AMSTERDAM, NL, pages 449 - 453, XP004057719, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/0264-410X(94)00009-C *
MARIO F. FELDMAN, MICHAEL WACKER, MARCELA HERNANDEZ, PAUL G. HITCHEN, CRISTINA L. MAROLDA, MICHAEL KOWARIK, HOWARD R. MORRIS, ANNE: "Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 102, no. 8, 22 February 2005 (2005-02-22), US, pages 3016 - 3021, XP009121034, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.0500044102 *
VAN DEN DOBBELSTEEN GERMIE P.J.M.; FAÉ KELLEN C.; SERROYEN JAN; VAN DEN NIEUWENHOF INGRID M.; BRAUN MARTIN; HAEUPTLE MICHA A.; SIR: "Immunogenicity and safety of a tetravalentE. coliO-antigen bioconjugate vaccine in animal models", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 34, no. 35, 6 July 2016 (2016-07-06), AMSTERDAM, NL, pages 4152 - 4160, XP029644969, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2016.06.067 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3341016A1 (en) 2018-07-04
EP3341016C0 (en) 2023-06-07
IL257608B (en) 2021-12-01
CN108430500A (zh) 2018-08-21
ES2951408T3 (es) 2023-10-20
JP2018525423A (ja) 2018-09-06
TW201714620A (zh) 2017-05-01
US11484582B2 (en) 2022-11-01
BR112018003469A2 (pt) 2018-09-25
CN108430500B (zh) 2021-12-24
TWI715617B (zh) 2021-01-11
AU2016312422B2 (en) 2019-09-26
IL257608A (en) 2018-04-30
US20180243393A1 (en) 2018-08-30
AU2016312422A1 (en) 2018-03-29
MX2018002340A (es) 2018-09-17
PL3341016T3 (pl) 2023-11-13
WO2017035181A1 (en) 2017-03-02
EP3341016B9 (en) 2023-09-27
EA201890400A1 (ru) 2018-09-28
EP3341016B1 (en) 2023-06-07
US10583185B2 (en) 2020-03-10
US20210046171A1 (en) 2021-02-18
RS64449B1 (sr) 2023-09-29
HUE063961T2 (hu) 2024-02-28
US20230062987A1 (en) 2023-03-02
EP4245320A3 (en) 2023-11-22
CA2995873A1 (en) 2017-03-02
NZ739963A (en) 2024-02-23
EP4245320A2 (en) 2023-09-20
HRP20230947T1 (hr) 2023-11-24
KR20180054629A (ko) 2018-05-24
JP6872532B2 (ja) 2021-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11484582B2 (en) Methods and compositions for immune protection against extra-intestinal pathogenic E. coli
TWI815860B (zh) 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物
KR101214766B1 (ko) 면역약화된 집단에 사용하기 위한 당결합체 백신
TWI826420B (zh) 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物
TW201946650A (zh) 針對腹內感染之疫苗
Waite et al. Capsular polysaccharide conjugate vaccines against contagious bovine pleuropneumonia: immune responses and protection in mice
Kaplonek et al. A semisynthetic glycoconjugate provides expanded cross-serotype protection against Streptococcus pneumoniae
RU2683027C2 (ru) Поливалентная иммунизирующая и/или терапевтическая композиция для применения при бактериальных инфекциях или пищевом отравлении, в частности сальмонеллёзе, способ получения этой композиции, её применение и вакцина, содержащая эту композицию
WO2023202607A1 (zh) 多价肺炎球菌多糖结合疫苗的成分及其应用
AU2002365253B2 (en) Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations
NZ531647A (en) Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations against Staphylococcal and Enterococcal infections
AU2002365253A1 (en) Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations