KR20230043157A - 다가 백신 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하여 ExPEC와 관련된 질환에 대한 면역 보호를 제공하는 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 특히, 침습성 ExPEC 질환의 예방을 위해 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 다당류 항원 O75의 접합체를 사용하기 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다.

Description

다가 백신 조성물 및 이의 용도
장외 병원성 대장균(extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)은 일반적으로 공생 대장균 균주와 함께 인간 장의 무해한 서식 생물이다. 그러나 ExPEC 균주는 다양하고 심각한 침습성 질환을 초래하여 매년 상당한 이환율, 사망률 및 비용을 발생시키는 위장관 외부 부위의 집락화 및 감염에 대한 독성 인자를 보유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., J Lab Clin Med. 2002;139(3):155-162; Kohler et al., Int J Med Microbiol. 2011;301(8):642-647; Foxman, Am J Med. 2002;113 Suppl 1A:5S-13S; 및 Russo et al., Microbes Infect. 2003;5(5):449-456] 참조). ExPEC 균주는 요로 감염(UTI)의 가장 흔한 원인이다. 이들은 또한 복부 및 골반 감염 및 병원내 폐렴과 관련된 수술 부위 감염 및 신생아 수막염의 기여자이며(Johnson et al., 2002; 및 Russo et al., 2003), 때때로 다른 장외 감염, 예를 들어, 골수염, 연조직염 및 상처 감염과 관련된다. 이러한 모든 일차 감염 부위는 ExPEC 세균혈증을 초래할 수 있다(Russo et al., 2003). 신생아, 노인 및 면역 저하 환자는 침습성 ExPEC 질환(IED)을 포함한 ExPEC 감염에 특히 취약하다.
항생제에 대한 박테리아 내성은 박테리아 감염에 대한 저항에서 주요 관심사이며, 다중 약물 내성(MDR) 대장균 균주가 점차 우세해지고 있다(예를 들어, 문헌[Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; 및 Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10):1165-1176] 참조). ExPEC 서열 유형 131(ST131)의 출현 및 신속한 전세계적 전파는 다중 약물 내성을 포함한 증가된 약물 내성의 주요 동인으로 간주된다(Johnson et al., Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54(1):546-550; Rogers et al., J Antimicrob Chemother. 2011; 66(1):1-14). 이 클론은 모든 ExPEC 임상 분리주의 12.5% 내지 30%에서 발견되며, 대부분 혈청형 O25b:H4를 나타내고, 플루오로퀴놀론에 대한 높은 수준의 내성을 보여주며, 이는 종종 트리메토프림/설파메톡사졸 내성, 및 세팔로스포린에 대한 내성을 부여하는 광범위 베타-락타마제를 동반한다(Rogers et al, 2011, and Banerjee et al., Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58(9):4997-5004).
O 항원 혈청형은 그람 음성 박테리아에서 지질다당류(LPS)의 외막 부분인 O 다당류 항원의 화학 구조를 기초로 한다. 180개가 넘는 대장균 O 항원이 보고되었으나(Stenutz et al., FEMS Microbial Rev. 2006; 30: 382-403), ExPEC 분리주 대부분은 20개 미만의 O 항원 혈청형으로 분류된다. 전장 대장균 O 항원은 전형적으로 고도로 보존된 LPS 코어 구조에 부착된 약 10 내지 25개의 반복 당 단위를 포함하며, 각각의 구성요소는 각각 rfb 및 rfa 유전자 클러스터에서 주로 암호화되는 효소에 의해 개별적으로 합성되었다. O 항원의 중합 후, O 항원 다당류 백본은 전형적으로 아세틸 또는 글루코스 잔기의 첨가를 통해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 공통 다당류 백본을 공유하지만 측 분지가 상이한, 항원적으로 구별되는 혈청형을 생성함으로써, 혈청형 다양성을 효과적으로 증가시킨다. O 항원 변형 효소를 암호화하는 유전자는 전형적으로 염색체의 rfb 클러스터 외부에 있으며, 어떤 경우에는 이러한 유전자는 용원성 박테리오파지 내에서 발견된다.
ExPEC 감염은 임의의 혈청형에 의해 발생할 수 있다. ExPEC 감염에서 특정 혈청형의 과잉표현이 존재하나, 그럼에도 ExPEC 분리주로부터의 표면 다당류는 상당한 항원 다양성을 나타내며, 이는 표면 다당류를 기초로 한 ExPEC 백신의 개발을 매우 어렵게 만든다(Russo et al., Vaccine. 2007; 25: 3859-3870). 또한, 특정 O 항원은 면역원성이 불충분할 수 있다. 또한, 폐렴구균 접합체 백신으로부터의 연구를 기초로 하여, 다수의 혈청형이 질환을 초래할 수 있는 경우, 백신에 포함시키기 위한 혈청형의 선택 및 포함되는 혈청형의 투여량 수준과 같은 백신 조성이 중요할 수 있는데, 이는 특정 혈청형에 대한 백신의 사용이 백신에 포함되지 않은 혈청형, 또는 심지어 백신에 포함되나 혈청형에 대한 면역화에서 오로지 약하게 효과가 있는 혈청형의 운반 및 이러한 혈청형으로부터의 질환을 잠재적으로 증가시킬 수 있기 때문이다(Lipsitch, Emerging Infectious Diseases; 1999, 5:336-345). 이상적으로, 백신은 비백신 혈청형의 증가된 운반으로부터의 추가 질환의 위험을 최소화하면서 백신에 포함된 혈청형에 의해 야기되는 질환의 예방에 있어서 이로운 효과를 극대화시켜야 한다.
ExPEC 감염을 예방하기 위한 백신 개발을 위한 노력은 O 항원 다당류 접합체에 집중되었다. 12가 O 항원 접합체 백신은 O 항원 다당류의 추출과 정제 및 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A에 대한 화학적 접합을 통해 합성되고, 1상 임상 연구에서 안전성 및 면역원성에 대해 테스트되었다(Cross et al., J. Infect. Dis. (1994) v.170, pp.834-40). 이 후보 백신은 임상 용도로 허가되지 않았다. 대장균의 생체접합 시스템은 최근에 개발되었는데, 다당류 항원과 담체 단백질이 모두 생체 내에서 합성된 후 대장균에서 발현되는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 효소인 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB의 활성을 통해 생체 내에서 접합된다(Wacker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2006) v. 103, pp. 7088-93). 이 N 결합된 단백질 글리코실화 시스템은 담체 단백질에 다양한 다당류를 전달할 수 있어, 접합체를 정제하는 간단한 방법을 가능하게 한다.
생체접합은 대장균 4가 O 항원 후보 백신을 위한 접합체 다당류를 생산하는 데 성공적으로 사용되었다(Poolman and Wacker, J. Infect. Dis. (2016) v.213(1), pp. 6-13). 그러나 성공적인 ExPEC 백신의 개발은 우세한 혈청형의 보급을 필요로 하며, ExPEC 분리주의 서브세트에서 추가 O 항원 변형의 존재는 비변형 및 변형 LPS를 나타내는 분리주를 커버하는 데 있어서 추가 과제를 제시한다. 더욱이, 다중 혈청형으로부터의 O 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 면역 반응은 혈청형 간에 상이할 수 있다. 따라서, ExPEC에 대한 백신의 지속적인 필요성이 당업계에 존재한다. 특히, ExPEC O75 혈청형 및 ExPEC 중에서 일반적인 다른 혈청형에 대한 효과적인 면역 보호를 제공하는 데 사용될 수 있는 표면 다당류를 기초로 한 ExPEC 백신의 필요성이 존재한다.
놀랍게도 임상 시험에서 동일한 농도의 다른 O 항원과의 조성물에서 담체 단백질에 각각 공유 결합된 O 항원의 접합체로서 테스트할 경우 대장균 O75 항원은 다른 대장균 O 항원(예를 들어, O1, O2 및 O6)보다 면역원성이 낮은 것으로 보인다. 대장균 O75 항원의 접합체 및 하나 이상의 추가 대장균 O 항원의 접합체를 적절한 용량 및 비율로 포함하는 조성물을 사용한 백신접종은 ExPEC O75 혈청형 및 하나 이상의 추가 ExPEC O 혈청형에 대한 개선된 면역 반응을 제공한다.
따라서, 제1 일반 양태에서 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 및 O25 항원 다당류 각각의 농도는 O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각의 농도에 비해 독립적으로 증가된다.
특정 구현예에서, O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 대해 독립적으로 O75 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 2.5:1이다.
특정 구현예에서, O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 대해 독립적으로 O75 항원 다당류 농도의 중량비는 약 2:1이다.
제2 일반 양태에서, 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 항원 다당류 대 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 4:1이다. 바람직하게는 O75 항원 다당류 대 O1, O2 및/또는 O6의 농도의 중량비는 약 2:1이다.
특정 구현예에서, O75 항원 다당류 대 O4, O15, O16 및/또는 O18 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 4:1이다. 바람직하게는 O75 항원 다당류 대 O4, O15, O16 및/또는 O18 항원 다당류 농도의 중량비는 약 2:1이다.
제3의 일반 양태에서, 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 및 O25 항원 다당류 각각의 농도는 O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각의 농도에 비해 독립적으로 증가되며, O75 항원 다당류 대 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 4:1이다. 바람직하게는, O75 항원 다당류 대 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류 농도의 중량비는 약 2:1이다.
제1, 제2 및 제3의 일반 양태의 특정 구현예가 이제 설명된다.
특정 구현예에서, 조성물 중 O75 항원 다당류 대 O25 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1:1이다.
특정 구현예에서, 대장균 항원 다당류 O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 농도의 중량비는 1:1:1:1:1:1:1:2:2이다.
특정 구현예에서, O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이고, 여기서:
(i) 대장균 O1 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O1A)의 구조를 포함하고,
(ii) 대장균 O2 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O2)의 구조를 포함하고,
(iii) 대장균 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고,
(iv) 대장균 O6 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O6A)의 구조를 포함하고,
(v) 대장균 O15 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O15)의 구조를 포함하고,
(vi) 대장균 O16 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O16)의 구조를 포함하고,
(vii) 대장균 O18 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O18A)의 구조를 포함하고,
(viii) 대장균 O25 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O25B)의 구조를 포함하고,
(ix) 대장균 O75 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O75)의 구조를 포함하고,
여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, O75 항원 다당류의 농도는 약 8 내지 약 64 μg/mL, 바람직하게는 약 8 내지 약 50 μg/mL, 바람직하게는 약 12 내지 약 40 μg/mL, 바람직하게는 약 16 내지 약 32 μg/mL, 바람직하게는 약 28 내지 약 36 μg/mL, 바람직하게는 약 32 μg/mL이다.
특정 구현예에서, 조성물에 존재하는 대장균 O 항원 다당류는 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6으로 구성된다.
특정 구현예에서, 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 적어도 하나의 추가 대장균 항원 다당류를 추가로 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 추가 대장균 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O8)을 갖는 O8 항원 다당류를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, 담체 단백질은 슈도모나스 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA) 또는 CRM197, 바람직하게는 EPA이다. 바람직하게는 담체 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 1 내지 20개, 예컨대 1 내지 10개 또는 2 내지 4개의 글리코실화 공통 서열, 예컨대 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 공통 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는 담체 단백질은 4개의 글리코실화 공통 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA이다.
특정 구현예에서, 대장균 항원 다당류는 생체접합 또는 화학적 접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합되며, 바람직하게는 대장균 항원 다당류는 생체접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합되며, 바람직하게는 다당류는 담체 단백질의 글리코실화 부위의 Asn 잔기에 공유 결합된다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
추가 양태에서 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류 각각의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 및 O25 항원 다당류 각각의 유효량은 O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 비해 독립적으로 증가된다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 유효량의 O75 항원 다당류는 O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 대해 독립적으로 약 1.5:1 내지 약 2.5:1, 바람직하게는 약 2:1의 중량비로 투여된다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 유효량의 O75 항원 다당류는 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류에 대해 독립적으로 약 1.5:1 내지 약 4:1, 바람직하게는 약 2:1의 중량비로 투여되고, 바람직하게는 추가로 유효량의 O75 항원 다당류는 O25 항원 다당류에 대해 약 1:1의 중량비로 투여된다.
또 다른 양태에서 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류 각각의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 유효량의 O75 항원 다당류는 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류에 대해 독립적으로 약 1.5:1 내지 약 4:1의 중량비로 투여된다. 유효량의 O75 항원 다당류는 바람직하게는 O25 항원 다당류에 대해 약 1:1의 중량비로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 유효량의 O75 항원 다당류는 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류에 대해 독립적으로 약 2:1의 중량비로 투여된다.
본 발명의 임의의 방법 양태의 구현예가 아래에 제공된다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 면역 반응은 대상체에서 침습성 ExPEC 질환의 중증도를 제한하거나 이를 예방하며, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환은 패혈증 및/또는 균혈증을 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다. 바람직하게는 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 대상체에게 투여되는 대장균 O 항원 다당류는 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6으로 구성된다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 대상체에게 투여되는 대장균 O 항원 다당류는 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 O 항원 다당류를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 대상체는 대장균(바람직하게는 ExPEC) 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환이 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 인간이다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 8~16 μg, 바람직하게는 약 16 μg의 O75 항원 다당류가 투여당 투여된다.
본 발명의 방법에 따른 특정 구현예에서, 유효량의 O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 투여되는 대장균 항원 다당류는 1:1:1:1:1:1:1:2:2의 중량비로 투여된다.
전술한 요약과, 다음의 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 구현예로 한정되지 않음이 이해될 것이다.
도 1은 뉴질랜드 백색 토끼에서 ExPEC10V 백신에 의해 유도된 항체 반응을 나타낸다. 동물은 2주 간격으로 투여된 ExPEC10V 또는 식염수로 3회의 근육내 면역화를 받았다. ExPEC10V 백신은 3가지의 상이한 농도로 투여되었고(군 1: 고용량, 군 2: 중간 용량 및 군 3: 저용량, 표 11), 대조군은 식염수(군 4, 0.9% (w/v) 염화나트륨 용액)만 받았다. 항체 수준은 0일(백신접종 전) 및 14일, 27일 및 42일(백신접종 후)에 ELISA에 의해 측정되었다. 개별 역가(EC50 역가) 및 기하 평균 역가(GMT) ± 95% CI가 제시되어 있다. 다중 비교를 위한 Bonferroni 보정을 사용한 Wilcoxon 순위 합계 검정. ExPEC10V 백신접종된 동물(군 1, 2 및 3) 대 식염수 대조군(군 4)의 비교. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001. LOD: 검출 한계.
도 2는 ExPEC10V에 의해 유도된 항체 반응을 나타낸다. 뉴질랜드 백색 토끼는 ExPEC10V(총 다당류 105.6 μg) 또는 0.9% w/v 염화나트륨 용액(대조군)으로 3회의 근육내 면역화를 받았다. IgG 역가는 1일(면역화 전, n = 20/군), 31일(면역화 후, n = 20/군) 및 50일(면역화 후, n = 10/군)에 ELISA에 의해 결정되었다. 플롯은 각 군에 대한 개별 역가 및 기하 평균 ± 95% 신뢰 구간을 보여준다. ExPEC10V와 대조군 사이의 IgG 역가의 차이는 우도비 검정이 있는 Tobit 모델을 사용하여 분석되었다. P-값 ≤ 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *P ≤ 0.05, ****P ≤ 0.0001.
도 3a 내지 도 3b는 인간에서 ExPEC10V 백신을 사용한 1/2a상 임상 시험을 위한 전체 연구 설계를 보여준다. 도 3a는 코호트 1에 대한 전체 연구 설계를 나타내고, 도 3b는 코호트 2에 대한 전체 연구 설계를 나타낸다. 상세 내용은 실시예 7 참조.
도 4는 BAC1001 임상 시험에서 기준선(1일)으로부터 측정한, 백신접종 후 15일의 혈청 O 항원 특이적 항체 역가가 적어도 2배 증가한 참가자의 백분율을 보여준다(상세 내용은 실시예 7 참조). O 항원 특이적 혈청 항체 역가는 ECL 기반 면역분석법으로 측정했다.
도 5는 BAC1001 임상 시험에서 기준선(1일)으로부터 측정한, 백신접종 후 15일의 혈청 옵소닌 식세포 항체 역가가 적어도 2배 증가한 참가자의 백분율을 보여준다(상세 내용은 실시예 7 참조). 혈청 옵소닌 식세포 항체의 수준은 MOPA로 측정했다.
도 6은 뉴질랜드 백색 토끼에서 ExPEC 백신의 상이한 조성에 의해 유도된 혈청 항체 수준(총 IgG)을 나타낸다. 상세 내용은 실시예 8 참조. 그래프는 개별 역가(EC50 역가) 및 기하 평균 역가(GMT) ± 95% 신뢰 구간을 보여준다. 백신군 대 식염수 대조군 사이의 비교는 우도비 검정이 있는 Tobit 모델을 사용하여 통계적으로 평가되었고 다중 비교를 위한 Bonferroni 보정이 사용되었다. p 값 ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. ****p ≤ 0.0001.
다양한 간행물, 논문 및 특허가 [배경기술] 및 명세서 전체에 걸쳐 인용되거나 기술되며; 각각의 이러한 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 물질, 장치, 물품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 사항 전부 또는 그 중 임의의 것이, 개시되거나 청구되는 임의의 발명에 대해 선행 기술의 일부를 형성한다고 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다른 경우, 본원에서 인용되는 특정 용어는 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 그 시리즈 내의 모든 요소를 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
숫자와 함께 사용될 때 “약”이라는 용어는 언급된 숫자의 ±10%, 예를 들어, ±5% 또는 ±1% 내의 임의의 숫자를 지칭한다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 이후의 청구범위에 걸쳐서, 맥락상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "포함하고 있는"으로 치환될 수 있거나 또는 때때로, 본 명세서에서 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "구성되는"은 청구범위 요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용될 때 "본질적으로 구성되는"은 청구범위의 기본적이고 새로운 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 전술한 용어 “포함하는”, “함유하는”, “포함하고 있는” 및 “갖는” 중 임의의 것은, 본 발명의 양태 또는 구현예의 맥락에서 본 명세서에서 사용될 때마다, 용어 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"으로 대체되어 본 발명의 범주를 변경할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다수의 열거된 요소 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 및 조합 옵션 둘 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"에 의해 결합될 경우, 첫 번째 옵션은 제2 요소없이 제1 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 두 번째 옵션은 제1 요소 없이 제2 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은 제1 및 제2 요소 둘 다의 적용 가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 것이든 그 의미 내에 속하며 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족하는 것으로 이해된다. 옵션 중 하나 초과의 동시 적용 가능성도 그 의미 내에 속하며 따라서 용어 "및/또는"의 요건을 충족하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “O 다당류”, “O 항원”, “O 항원”, “O 항원 다당류”, “O 다당류 항원” 및 약어 “OPS”는 전부 그람 음성균의 O 항원을 지칭하는데, 이는 지질다당류(LPS)의 구성요소이고 그람 음성균의 각각의 혈청형 또는 혈청(아)형에 특이적이다. 대개, O 항원은 2개 내지 7개의 당 잔기의 반복 단위(RU)를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, RU는 생물학적 반복 단위(BRU)와 같게 설정된다. BRU는 생체 내에서 합성되는 O 항원의 RU를 설명한다. 대장균의 서로 다른 혈청형은 서로 다른 O 항원을 발현한다. 대장균에서 O 항원 생물발생에 관여하는 유전자 산물은 rfb 유전자 클러스터에 의해 암호화된다. 본원에서 O 항원 다당류를 언급할 때마다, 각각의 대장균 혈청형의 O 항원 다당류 및 이의 임의의 기존 하위 혈청형은, 달리 지시되지 않는 한, 예를 들어, O1 항원 다당류를 지칭할 때, 이것이 대장균 하위 혈청형 O1A, O1A1, O1B, 또는 O1C의 O 항원 다당류일 수 있고, 한편, O25 항원 다당류는 O25A 또는 O25B 항원 다당류 등을 의미할 수 있음을 의미한다. 많은 대장균 혈청형과 하위 혈청형 및 이의 O 항원 다당류의 RU(모이어티 구조 또는 O 단위)의 상응하는 구조는 본원에 참고로 포함된 WO 2020/039359의 표 1에 제공되어 있다.
본원에서 사용되는 "rfb 클러스터" 및 "rfb 유전자 클러스터"는 O 항원 백본 구조를 합성할 수 있는 효소 기구를 암호화하는 유전자 클러스터를 의미한다. 용어 rfb 클러스터는 임의의 O 항원 생합성 클러스터에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 에스케리키아 속, 특히 대장균으로부터의 유전자 클러스터를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "O1A"는 대장균의 O1A 항원(대장균 혈청형 O1의 하위 혈청형)을 의미한다. 용어 "O2"는 대장균의 O2 항원(대장균 혈청형 O2)을 의미한다. 용어 "O4"는 대장균의 O4 항원(대장균 혈청형 O4)을 의미한다. 용어 "O6A"는 대장균의 O6A 항원(대장균 혈청형 O6의 하위 혈청형)을 의미한다. 용어 "O8"는 대장균의 O8 항원(대장균 혈청형 O8)을 의미한다. 용어 "O15"는 대장균의 O15 항원(대장균 혈청형 O15)을 의미한다. 용어 "O16"는 대장균의 O16 항원(대장균 혈청형 O16)을 의미한다. 용어 "O18A"는 대장균의 O18A 항원(대장균 혈청형 O18의 하위 혈청형)을 의미한다. 용어 "O25B"는 대장균으로부터의 O25B 항원(대장균 혈청형 O25의 하위 혈청형)을 의미한다. 용어 "O75"는 대장균의 O75 항원(대장균 혈청형 O75)을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "글루코실화된 O4", "글루코스 분지형 O4", "O4 Glc+" 및 "Glc+ O4" O 항원은 글루코스 측 분지를 갖는 대장균의 O4 O 항원(대장균 혈청형 O4)을 의미하고, "비글루코실화된 O4", "O4 Glc-" 및 "Glc- O4"는 글루코스 측 분지가 없는 O4 항원을 지칭한다.
본 출원 전반에 걸쳐 언급된 몇몇 대장균 O 항원 다당류의 구조는 하기 표 1에 제시되어 있다. 각 대장균 O 항원 다당류에 대한 단일 반복 단위가 제시되어 있다.
표 1: 대장균 O 항원 다당류의 구조
Figure pct00001
Figure pct00002
1 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 예컨대 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20 및 1 내지 10, 3 내지 50, 3 내지 40, 5 내지 30, 예를 들어, 적어도 5, 예컨대, 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 30, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이지만, 일부 경우 1 또는 2일 수 있다.
본원에 기재된 모든 단당류는 당업계에 공지된 일반적인 의미를 갖는다. 단당류는 D 또는 L 구성을 가질 수 있다. D 또는 L이 지정되지 않은 경우 당류는 D 구성을 갖는 것으로 이해된다. 단당류는 전형적으로 당업계에서 일반적으로 알려지고 사용되는 약어로 지칭된다. 예를 들어, Glc는 글루코스를 지칭하고, D-Glc는 D-글루코스를 지칭하고, L-Glc는 L-글루코스를 지칭한다. 단당류에 대한 다른 일반적인 약어는 다음을 포함한다: Rha, 람노스; GlcNAc, N-아세틸글루코사민; GalNAc, N-아세틸갈락토사민; Fuc, 푸코스; Man, 만노스; Man3Me, 3-O-메틸-만노스; Gal, 갈락토스; FucNAc, N-아세틸푸코사민; 및 Rib, 리보스. 접미사 "f"는 푸라노스를 나타내고, 접미사 "p"는 피라노스를 나타낸다.
O 항원과 관련하여 사용된 용어 "RU", "반복 단위" 및 "반복하는 단위"는 생체 내에서 세포 기구(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제)에 의해 합성되는 것으로서 O 항원의 생물학적 반복 단위(BRU)를 나타낸다. O 항원의 RU의 수는 혈청형에 따라 다를 수 있으며, 본 발명의 구현예에서, 일반적으로 약 1 내지 100 RU, 바람직하게는 약 1 내지 50 RU, 예컨대 1 내지 50 RU, 1 내지 40 RU, 1 내지 30 RU, 1 내지 20 RU 및 1 내지 10 RU, 및 더욱 바람직하게는 적어도 3 RU, 적어도 4 RU, 적어도 5 RU, 예컨대 3 내지 50 RU, 바람직하게는 5 내지 40 RU, 예를 들어 7 내지 25 RU, 예를 들어 10 내지 20 RU로 다양하다. 그러나 어떤 경우에는 O 항원의 RU 수는 1 또는 2일 수 있다. 본원에 구체적으로 기재된 각 O 항원의 구조는 RU의 수를 지정하는 변수 "n"을 갖는 하나의 RU를 함유하는 것으로 나타난다. 본 발명의 생체접합체의 각각의 O 항원 다당류에서, n은 독립적으로 1 내지 100의 정수, 예컨대 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 바람직하게는 적어도 3, 더욱 바람직하게는 적어도 5, 예컨대 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 40의 정수(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40), 더욱 바람직하게는 5 내지 30의 정수이지만, 일부 경우 1 또는 2일 수 있다. 일부 구현예에서, n은 독립적으로 약 7 내지 25, 예를 들어 약 10 내지 20의 정수이다. 값은 조성물 중 개별 O 항원 다당류 간에 다를 수 있으며, 본원에서 평균값으로서 제공된다. 즉, 생체접합체가 독립적으로 5 내지 40의 정수인 n을 갖는 것으로 본원에 기재된 경우, 조성물은 5 내지 40개의 반복 단위를 갖는 O 항원 다당류를 대부분 함유하나, 또한 5개 미만의 반복 단위 또는 40개 초과의 반복 단위를 갖는 일부 O 항원 다당류를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "접합체" 및 "당접합체"는 단백질, 펩티드, 지질 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 또 다른 화학 종에 연결된 당 또는 당류 항원(예를 들어, 올리고당 및 다당류)-단백질 접합체를 지칭한다. 당접합체는 예를 들어 단백질과 당 또는 당류 항원의 화학적 (합성) 연결에 의해 화학적으로 제조될 수 있다. 당접합체라는 용어는 또한 생체접합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 본 발명의 구현예에 따른 방법에서 대상체에게 O 항원을 투여하는 것과 관련하여 대상체에서 원하는 면역 효과 또는 면역 반응을 유도하기에 충분한 O 항원의 양을 의미한다. 특정 구현예에서, "유효량"은 대상체에서 다음의 효과 중 하나 이상을 달성하기 위해 대상체에서 면역을 생성하기에 충분한 O 항원의 양을 지칭한다: (i) ExPEC 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환, 또는 이와 관련된 증상의 발달 또는 발생을 예방하고/하거나; (ii) ExPEC 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환, 또는 이와 관련된 증상의 재발을 예방하고/하거나; (iii) ExPEC 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환, 또는 이와 관련된 증상의 중증도를 예방, 감소 또는 개선하고/하거나; (iv) ExPEC 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환, 또는 이와 관련된 증상의 기간을 감소시키고/시키거나; (v) ExPEC 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환, 또는 이와 관련된 증상의 진행을 예방하고/하거나; (vi) ExPEC 감염 또는 이와 관련된 증상의 퇴행을 초래하고/하거나; (vii) ExPEC 감염과 관련된 장기 부전을 예방하거나 감소시키고/시키거나; (viii) ExPEC 감염이 있는 대상체의 입원 가능성 또는 빈도를 감소시키고/시키거나; (ix) ExPEC 감염이 있는 대상체의 입원 기간을 감소시키고/시키거나; (x) ExPEC 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환에 걸린 대상체의 생존을 증가시키고/시키거나; (xi) ExPEC 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환을 제거하고/하거나; (xii) ExPEC 복제를 억제 또는 감소시키고/시키거나; (xiii) 또 다른 요법의 예방 또는 치료 효과(들)를 증진시키거나 개선한다.
"유효량"은 다양한 요인, 예를 들어, 대상체의 신체 조건, 연령, 체중, 건강 등; 투여 경로, 예를 들어, 경구 또는 비경구; 투여되는 조성물, 예를 들어, 표적 O 항원, 다른 공동 투여되는 O 항원, 아쥬반트 등; 및 면역이 요망되는 특정 질환에 따라 달라질 수 있다. O 항원이 단백질 담체에 공유 결합되는 경우, O 항원에 대한 유효량은 접합체 내의 O 항원 다당류 모이어티만을 기초로 하여 계산된다. 본원에 기재된 바와 같은 생체접합체를 포함하는 접합체의 모든 농도, 양 및 비율은 또한 달리 명시되지 않는 한, 임의의 접합된 담체 단백질의 농도, 양 또는 비율과 관계 없이 접합체 내의 O 항원 다당류 모이어티의 중량만을 기초로 하여 계산된다. 예를 들어, 16 μg의 특정 생체접합체를 투여한다는 것은 투여되는 생체접합체가 16 μg의 특정 O 항원 다당류를 포함한다는 것을 의미하며, 접합된 담체 단백질의 양은 이 수치에 포함되지 않는다. 또 다른 예를 들어, 조성물이 혈청형 A 및 B로부터의 O 항원 다당류의 접합체를 2:1의 비율로 포함한다고 하면, 이는 조성물에서 접합된 담체 단백질의 중량은 무시하고, 접합된 O 항원 다당류의 중량을 기준으로 하여, 접합된 O 항원 다당류 B의 농도 또는 양의 2배의 접합된 O 항원 다당류 A의 농도 또는 양이 있음을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "침습성 장외 병원성 대장균(ExPEC) 질환(IED)"은 전신 박테리아 감염과 일치하는 급성 질환으로, 이는 혈액 또는 기타 정상적으로 멸균된 신체 부위로부터의 대장균의 분리 및 식별에 의해, 또는 침습성 질환(전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증 또는 패혈성 쇼크)의 징후 및 증상이 있고 식별 가능한 다른 감염원이 없는 환자의 소변으로부터의 대장균의 분리 및 식별에 의해 미생물학적으로 확인된다. 특정 구현예에서, IED는 전신 박테리아 감염과 일치하는 급성 질환이며, 이는 (i) 혈액 또는 기타 정상적으로 멸균된 신체 부위로부터의 대장균의 분리 및 식별에 의해, 또는 (ii) 요로 및/또는 남성 생식기에서 발생하는 감염에 대한 조절되지 않은 숙주 반응으로 인해 생명을 위협하는 기관 기능 장애가 있고 식별 가능한 다른 감염원이 없는 환자의 소변으로부터의 대장균의 분리 및 식별에 의해 미생물학적으로 확인된다.
IED는 요로 감염(UTI), 수술 부위 감염, 복부 또는 골반 감염, 폐렴, 골수염, 연조직염, 패혈증, 균혈증, 상처 감염, 신우신염, 전립선 생검 관련 감염(예를 들어, 경직장 초음파 유도 전립선 바늘 생검[TRUS-PNB] 관련 감염), 요로 패혈증, 수막염, 복막염, 담관염, 연조직 감염, 화농성 근염, 패혈성 관절염, 안내염, 화농성 갑상선염, 부비동염, 심내막염, 호중구 감소성 열 및 전립선염(급성 세균성 전립선염[ABP]을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되지는 않는다.
특정 바람직한 구현예에서, IED는 패혈증을 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, IED는 균혈증을 포함한다. 특정 구현예에서 본 발명은 대장균에 의해 유발된 패혈증을 예방하기 위한 본 발명에 따른 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서 본 발명은 대장균에 의해 유발된 균혈증을 예방하기 위한 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.
"패혈증에 대한 기준을 충족하는 IED 사건"이라는 용어는 감염에 대한 숙주 반응 조절 장애로 인해 생명을 위협하는 기관 기능 장애의 증거를 포함하는 IED 사례를 나타낸다. 순차적 장기 부전 평가(Sequential Organ Failure Assessment, SOFA) 총 점수가 기준선으로부터 2점 이상 급격하게 변화하고 IED에 이차적인 것으로 간주되는 경우 IED 사례는 패혈증 기준을 충족한다. 특정 구현예에서 본 발명은 패혈증에 대한 기준을 충족하는 IED를 예방하기 위한 본 발명에 따른 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 "요로성 패혈증"이라는 용어는 비뇨생식관 및/또는 남성 생식기에서 기원하는 감염에 의해 발생하는 패혈증이다.
"세균성 IED"라는 용어는 혈액에서 대장균을 분리 및 식별하는 것을 포함하는 IED 사례이다. 특정 구현예에서 본 발명은 균혈증 IED를 예방하기 위한 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항원 또는 조성물에 대한 “면역학적 반응” 또는 “면역 반응”은 대상체에서 해당 항원 또는 조성물에 존재하는 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 초과의 대장균 항원 다당류를 포함하는 "조성물"은 동일한 제약 조성물에 하나 초과의 대장균 항원 다당류를 포함하는 단일 제약 조성물, 또는 개별 제약 조성물에 하나 초과의 대장균 항원 다당류를 포함하는 하나 초과의 제약 조성물의 조합일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 단일 제약 조성물이다. 대장균에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서, 하나 초과의 대장균 항원 다당류를 포함하는 "조성물"은 하나 초과의 대장균 항원 다당류를 포함하는 단일 제약 조성물과 함께 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있거나, 또는 개별 제약 조성물로 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단일 제약 조성물이 대상체에게 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2개 이상의 O 항원 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 맥락에서 "조합하여" 또는 "~의 조합"이라는 용어는 O 항원 또는 조성물이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 제1 조성물은 대상체로의 제2 조성물의 투여 전(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 전), 투여와 동시에, 또는 투여 후(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 후)에 투여될 수 있다. 바람직하게는 2개 이상의 O 항원은 본질적으로 동시에, 예를 들어, 서로 5분 이내에, 대상체에게 투여되고, 더욱 바람직하게는 2개 이상의 O 항원은 동시에 적어도 2개의 조성물의 투여를 통해, 가장 바람직하게는 2개 이상의 O 항원을 포함하는 단일 조성물의 투여를 통해, 동시에 투여된다.
본원에서 사용되는 "대상체"는 본 발명의 구현예에 따른 방법 또는 조성물에 의해 백신접종될 또는 백신접종된 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "포유류"는 임의의 포유류를 포괄한다. 포유류의 예에는 비제한적으로 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간 등을 포함하고, 가장 바람직하게는 인간이다. “대상체” 및 “환자”라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 “서열 동일성 퍼센트(%)” 또는 “동일성 %”는 전장의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 수와 비교하여 둘 이상의 정렬된 아미노산 서열 중 동일한 아미노산의 매치(“히트(hit)”)의 수를 설명한다. 다른 말로 하면, 정렬을 이용하면, 둘 이상의 서열에 있어서, 서열들을 본 기술 분야에 공지된 바와 같은 서열 비교 알고리즘을 이용하여 측정할 경우 최대 상응도를 위하여 비교 및 정렬할 때, 또는 수동으로 정렬하고 시각적으로 점검할 때, 동일한 아미노산 잔기의 백분율(예를 들어 90%, 95%, 97% 또는 98%의 동일성)이 결정될 수 있다. 따라서 서열 동일성을 결정하기 위하여 비교되는 서열들은 아미노산의 치환(들), 부가(들) 또는 결실(들)에 의해 다를 수 있다. 단백질 서열 정렬에 적합한 프로그램은 당업자에게 공지되어 있다. 단백질 서열의 서열 동일성 백분율은 예를 들어 CLUSTALW, Clustal Omega, FASTA 또는 BLAST와 같은 프로그램을 이용하여, 예를 들어 NCBI BLAST 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다(Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).
예를 들어, 아미노산 서열의 경우, 서열 동일성 및/또는 유사성은 비제한적으로 문헌[Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 서열 동일성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443]의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]의 유사성 방법에 대한 조사, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 미국 위스콘신 주 매디슨, 사이언스 드라이브 575), 문헌[Devereux et al, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395]에 기재된 Best Fit 서열 프로그램을 포함하는 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여, 바람직하게는 기본 설정을 사용하여, 또는 검사에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 퍼센트 동일성은 다음 파라미터에 기초하여 FastDB에 의해 계산된다: 1의 미스매치 패널티; 1의 갭 패널티; 0.33의 갭 크기 패널티; 및 30의 합류 패널티("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.).
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 하기 문헌에 기재된 BLAST 알고리즘이다: 문헌[Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; 및 Karin et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787]. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌[Altschul et al, 1996, Methods in Enzymology 266:460-480]에서 얻은 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 대부분 기본값으로 설정되는 여러 검색 파라미터를 사용한다.
추가의 유용한 알고리즘은 문헌[Altschul et al,1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]에 의해 보고된 바와 같은 갭핑된 BLAST이다.
대장균 O 항원
본 발명에서는 놀랍게도 담체 단백질에 접합된 대장균 O75 항원이 다가 백신 조성물의 동일한 다당류 농도의 담체 단백질에 접합된 다른 대장균 O 항원(예를 들어, O1A, O2, O4, O6A, O15, O16 및 O18A)보다 덜 면역원성인 것으로 나타난다는 점이 발견되었다. 이 발견은 대장균 O75 항원의 투여량과 다가 백신 내의 다양한 대장균 O 항원의 투여 비율에 대한 추가 조사로 이어졌으며, 이에 따라 ExPEC의 O75 혈청형 및 기타 혈청형에 대한 개선된 면역 반응을 위한 대장균 O 항원을 기반으로 한 다가 백신 및 면역화 방법이 개발되었다.
본 발명의 구현예는 대장균 O75 항원 다당류 및 하나 이상의 추가 대장균 O 항원 다당류에 관한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 추가 O 항원은 대장균의 임상 분리주 중에 널리 퍼져 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 이러한 대장균 항원의 예는 대장균 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O18 및 O25 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 필요에 따라, 조성물은 대장균 O75 혈청형 외에 다수의 대장균 혈청형에 대한 면역 보호를 제공하기 위해 하나 초과의 추가 대장균 O 항원, 예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 추가 대장균 O 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 대장균 O 항원은 대장균 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18 및 O25 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 추가 대장균 O 항원은 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A 및 O25B로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 조성물은 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A 및 O25B 대장균 O 항원을 모두 포함한다. 특정 구현예에서, 대장균 O 항원은 표 1에 제시된 바와 같은 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대장균 O75 및 O6 항원 다당류를 포함하며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 농도비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어 약 1:5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1 또는 2.5:1이다. 일부 구현예에서, 조성물은 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다.
본 발명에 유용한 대장균 O 항원은 본 개시내용을 고려하여 당업계에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이들은 세포, 바람직하게는 O 항원의 생합성에 최적화된 재조합 세포로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/119987, WO 2009/104074, 국제 특허 출원 제PCT/EP2015/053739호, 문헌[Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61](이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에서 대장균 O 항원 생합성을 위한 핵산, 단백질, 숙주 세포, 생산 방법 등에 대한 관련 개시내용 참조.
담체 단백질
본 발명의 구현예에 따르면, 각각의 대장균 O 항원은 바람직하게는 글리코시드 결합에 의해, 담체 단백질에 공유 결합된다. 본 개시를 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 담체 단백질이 사용될 수 있다. 적합한 담체 단백질은 비제한적으로, 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), CRM197, 대장균 플라겔린(FliC), 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, S. 아우레우스의 탈독소화된 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 대장균 열 민감 장독소의 탈독소화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 탈독소화된 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D를 포함한다. 요구되는 공통 글리코실화 서열을 함유하는 다양한 상이한 담체 단백질과의 생체접합이 설명되었으며, 이는 이 기술을 사용하여 광범위한 단백질이 글리코실화될 수 있음을 보여준다(예를 들어, WO 06/119987, WO 2015/124769, WO 2015/158403, WO 2015/82571, WO 2017/216286 및 WO 2017/67964 참조, 이들은 함께 생체접합에 성공적으로 사용된 광범위한 담체 단백질을 보여준다).
특정 구현예에서 담체 단백질은 변형된다. 예를 들어 단백질이 덜 독성이고/거나 글리코실화에 더 민감한 방식으로 변형된다. 특정 구현예에서, 본원에 사용된 담체 단백질은 더 낮은 농도의 단백질이 예를 들어, 면역원성 조성물 중에서 특히, 이의 생체접합체 형태로 투여되도록 하는 방식으로 담체 단백질의 글리코실화 부위의 수가 최대화되도록 변형된다.
따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 (예를 들어, 담체 단백질이 이의 천연/자연, 즉, "야생형" 상태에서 관련된 글리코실화 부위의 수와 비교하여) 일반적으로 담체 단백질과 관련된 것보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 글리코실화 부위를 포함하도록 변형된다. 담체 단백질 내로의 글리코실화 부위의 도입은, 예를 들어 글리코실화 부위가 완전히 또는 부분적으로 추가되도록 단백질의 일차 구조에 새로운 아미노산을 추가하여, 단백질의 일차 구조 임의의 곳에서 글리코실화 공통 서열을 삽입함으로써, 또는 글리코실화 부위를 생성하기 위해 단백질 내의 기존 아미노산을 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 접근법, 예를 들어 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 변형을 포함하는 재조합 접근법을 이용하여 단백질의 아미노산 서열이 용이하게 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 특정 구현예에서, 글리코실화 공통 서열은 담체 단백질의 특정 영역, 예를 들어 단백질의 표면 구조 내에 단백질의 N 또는 C 말단에 및/또는 단백질 염기의 이황화 가교에 의해 안정화되는 루프에 도입된다. 일부 구현예에서, 글리코실화 공통 서열은 더욱 효율적인 글리코실화를 위해 리신 잔기의 첨가에 의해 연장될 수 있다.
담체 단백질에 삽입되거나 생성될 수 있는 글리코실화 공통 서열의 예시적인 예는 Asn-X-Ser(Thr)(여기서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)(서열번호 1); 및 바람직하게는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(여기서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨)(서열번호 2)를 포함한다.
일부 구현예에서,대장균 O 항원 다당류는 담체 단백질 내의 아스파라긴(Asn) 잔기에 공유 결합되며(예를 들어, N-연결됨), 여기서 Asn 잔기는 서열번호 1, 더욱 바람직하게는 서열번호 2를 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 글리코실화 부위에 존재한다. 전형적으로, 담체 단백질은 1 내지 10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위, 예컨대 1 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함하며, 각각은 서열번호 1의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 담체 단백질은 P. 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A이다. EPA의 경우, 다양한 탈독소화된 단백질 변이체가 문헌에 설명되어 있으며 담체 단백질로 사용될 수 있었다. 예를 들어, 탈독소화는 문헌[Lukac et al., 1988, Infect Immun, 56: 3095-3098 및 Ho et al., 2006, Hum Vaccin, 289-98]에 따라 촉매적으로 필수적인 잔기 L552V 및 ΔE553을 돌연변이시키고 결실시킴으로써 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "EPA"는 P. 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A를 나타낸다. 담체 단백질이 EPA인 이러한 구현예에서, 대장균 항원 다당류는 서열번호 1을 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 글리코실화 부위의 Asn 잔기에 공유 결합될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2를 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 글리코실화 부위의 Asn 잔기에 공유 결합될 수 있다. 바람직하게는,EPA 담체 단백질은 1 내지 10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위, 예컨대 1 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함하며, 각각은 서열번호 1의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, EPA 담체 단백질은 각각 글리코실화 공통 서열을 포함하는 4개의 글리코실화 부위, 예를 들어 서열번호 2를 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 글리코실화 부위를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "EPA-4 담체 단백질" 및 "EPA-4"는 각각 서열번호 2를 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 4개의 글리코실화 부위를 포함하는 P. 애루기노사 담체 단백질의 탈독소화된 외독소 A를 지칭한다. EPA-4 담체 단백질의 예시적인 바람직한 예는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA 담체 단백질이다.
특정 구현예에서, EPA 담체 단백질은, 담체 단백질을 발현하는 숙주 세포의 주변 세포질 공간으로 담체 단백질을 표적화하는 신호 서열(예컨대, 대장균 DsbA, 대장균 외막 포린 A(OmpA), 대장균 말토스 결합 단백질(MalE) 등에 대한 신호 펩티드)과 함께 생성될 수 있다. EPA 담체 단백질은 또한 "태그", 즉 담체 단백질의 분리 및/또는 식별을 가능하게 하는 아미노산 서열로 변형될 수 있다.
본 발명에 유용한 EPA 담체 단백질은 본 개시내용을 고려하여 당업계에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61] 및 WO 2006/119987, WO 2009/104074 및 WO 2015/124769(이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 관련 개시내용 참조.
다른 구현예에서, 담체 단백질은 CRM197이다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 비독성 형태이지만, 면역학적으로 디프테리아 독소와 구별할 수 없다. CRM197은 독소 생성 코리네파지 베타의 니트로소구아니딘 돌연변이 생성에 의해 생성된 비독소 생성 파지 β197tox-에 의해 감염된 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae)에 의해 생성된다(Uchida et al. (1971) Nature New Biology 233:8-11). CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 분자량은 같지만 구조 유전자의 단일 염기 변화(구아닌에서 아데닌으로)에 의해 상이하다. 이 단일 염기 변화는 성숙한 단백질에서 아미노산 치환(글리신 대신 글루탐산)을 일으키고 디프테리아 독소의 독성 특성을 제거한다. CRM197 단백질은 당류에 대한 안전하고 효과적인 T 세포 의존성 담체이다. CRM197 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시되어 있다. CRM197 및 이의 생성에 대한 추가 상세 내용은 예를 들어, 미국 특허 제5,614,382호에서 찾을 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 O 항원 다당류는 CRM197 단백질 또는 CRM197의 A 사슬에 접합된다(CN103495161 참조). 일 구현예에서, 본 발명의 O 항원 다당류는 유전자 재조합 대장균에 의한 발현을 통해 얻은 CRM197의 A 사슬에 접합된다(CN103495161 참조). 일 구현예에서, 본 발명의 O 항원 다당류는 각각 독립적으로 CRM197에 접합된다. 일 구현예에서, 본 발명의 O 항원 다당류는 각각 독립적으로 CRM197의 A 사슬에 접합된다.
접합체
용어 "생체접합체"는 숙주 세포 배경, 바람직하게는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 숙주 세포에서 제조된 단백질(예를 들어, 담체 단백질)과 당 또는 당류 항원(예를 들어, 올리고당 및 다당류) 사이의 접합체를 지칭하며, 여기서 숙주 세포 기구는 항원을 단백질에 연결한다(예를 들어, N-연결). 바람직하게는, 용어 "생체접합체"는 숙주 세포 배경에서 제조된 단백질(예를 들어, 담체 단백질)과 O 항원, 바람직하게는 대장균 O 항원(예를 들어, O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, O75 등) 사이의 접합체를 지칭하며, 여기서 숙주 세포 기구는 항원을 단백질에 연결한다(예를 들어, N-연결). 생체접합체는 숙주 세포 기구에 의해 숙주 세포에서 제조되기 때문에, 항원과 단백질은 생체접합체에서 글리코시드 연결 또는 결합을 통해 공유 결합된다. 생체접합체는 O 항원을 합성하고/하거나 O 항원을 표적 단백질에 연결하는 데 필요한 세포 기구를 발현하도록 조작된 재조합 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 생체접합체는 글리칸이 박테리아 세포벽으로부터 정제되고 이어서 담체 단백질에 화학적으로 결합되는 화학적으로 제조된 당접합체에 비해 유리한 특성을 갖는다. 예를 들어, 생체접합체는 제조 시 더 적은 화학물질을 필요로 하고 생성된 최종 생성물의 관점에서 더 일관성이 있고, 유리(즉, 담체 단백질에 결합되지 않은) 글리칸을 더 적게 포함하거나 전혀 포함하지 않는다. 지질 A가 없는 O 항원의 정제 및 후속적인 담체 단백질에 대한 화학적 접합은 길고 힘든 과정이다. 또한, 정제, 지질 A 탈독소화 및 화학적 접합 과정은 접합된 다당류의 에피토프 손실, 항원 이질성 및 감소된 면역원성을 초래할 수 있다. 생체접합에 의한 당접합체의 합성은 고전적인 정제 및 화학적 접합의 이러한 한계를 극복할 수 있다. 따라서, 전형적인 구현예에서, 화학적으로 생성된 당접합체보다 생체접합체가 바람직하다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 대장균 O 항원 및 EPA 담체 단백질을 생산할 수 있고, O 항원을 EPA 담체 단백질에 공유 결합시켜 본 발명에 유용한 생체접합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61] 및 WO 2006/119987, WO 2009/104074 및 WO 2015/124769(이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함됨)의 관련 개시내용 참조.
특정 구현예에서, 담체 단백질은 본 발명에 유용한 대장균 O 항원에 N-연결된다. 예를 들어, 대장균 O 항원은 담체 단백질의 글리코실화 서열, 예컨대, Asn-X-Ser(Thr)(여기서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)(서열번호 2), 바람직하게는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(여기서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨)(서열번호 3)의 Asn 잔기에 연결된다.
대안적으로, 당접합체는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 즉, 숙주 세포 외부에서(시험관 내) 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 대장균 O 항원, 예를 들어 O75 항원은 다당류/올리고당에서 활성화 반응성 기 및 단백질 담체를 사용하는 것을 포함하여 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 담체 단백질에 접합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885; 및 Robbins et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978](이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨) 참조. 이러한 접근법은 숙주 세포로부터 항원성 다당류/올리고당의 추출, 다당류/올리고당의 정제, 다당류/올리고당의 화학적 활성화 및 다당류/올리고당의 담체 단백질로의 접합을 포함한다. 담체 단백질에 대한 화학적 접합을 사용하여 담체 단백질에 접합된 대장균 O 항원의 당접합체를 제조하는 방법 및 이러한 당접합체를 포함하는 조성물은 또한 WO 2020/039359에 기재되어 있다.
예를 들어 접합체는 CDAP 화학을 사용하여 제조할 수 있다. 이들 구현예에서, 다당류는 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 활성화되어 시아네이트 에스테르를 형성한다. 그런 다음 활성화된 다당류는 직접 또는 스페이서(링커) 기를 통해 담체 단백질(예를 들어, EPA 또는 CRM197)의 아미노 기에 커플링된다. 예를 들어, 스페이서는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있어 말레이미드-활성화된 담체 단백질(예를 들어 N-[γ-말레이미도부티릴록시]숙신이미드 에스테르(GMBS)를 사용) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질(예를 들어 요오도아세트이미드, N-숙신이미딜 브로모아세테이트(SBA; SIB), N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-SIAB), N-숙신이미딜 요오도아세테이트(SIA) 또는 숙신이미딜 3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트(SBAP)를 사용)와의 반응 후에 수득된 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있는 티올화된 다당류를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 시아네이트 에스테르(선택적으로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드(ADH)와 커플링되고, 아미노 유도체화된 당류는 단백질 담체 상의 카르복실 기를 통한 카르보디이미드(예를 들어, EDAC 또는 EDC) 화학을 이용하여 담체 단백질(예를 들어, EPA 또는 CRM197)에 접합된다. 이러한 접합체는 예를 들어 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/129094에 기재되어 있다.
접합을 위한 다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-하이드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 다수가 WO 98/42721에 기재되어 있다. 접합은 카르보닐 링커를 수반할 수 있으며, 이는 당류의 유리 하이드록실 기와 CDI의 반응에 의해 형성될 수 있고(문헌[Bethell et al. (1979) 1. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518] 참조), 이어서 단백질과 반응하여 카바메이트 연결을 형성할 수 있다. 이는 아노머 말단의 1차 하이드록실 기로의 환원, 1차 하이드록실 기의 선택적 보호/탈보호, 1차 하이드록실 기와 CDI의 반응에 의한 CDI 카바메이트 중간체 형성 및 CDI 카바메이트 중간체의 단백질 상의 아미노 기와의 커플링을 수반할 수 있다.
다른 구현예에서, 접합체는 환원적 아민화를 사용하여 제조된다. 환원적 아민화는 두 단계, 즉 (1) 다당류의 산화, (2) 활성화된 다당류 및 담체 단백질의 환원에 의한 접합체 형성을 포함한다. 산화 전에 다당류는 선택적으로 가수분해된다. 기계적 또는 화학적 가수분해가 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행할 수 있다.
산화 단계는 과요오드산염과의 반응을 수반할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "과요오드산염"이라는 용어는 과요오드산염 및 과요오드산을 포함하고; 이 용어는 또한 메타과요오드산염(IO4 -)과 오르토과요오드산염(IO6 5-)을 포함하고 과요오드산염의 다양한 염(예를 들어, 과요오드산 나트륨 및 과요오드산 칼륨)을 포함한다. 일 구현예에서, 협막 다당류는 메타과요오드산염의 존재 하에, 바람직하게는 과요오드산 나트륨(NaIO4)의 존재 하에 산화된다. 또 다른 구현예에서 협막 다당류는 오르토과요오드산염의 존재 하에, 바람직하게는 과요오드산의 존재 하에 산화된다.
일 구현예에서, 산화제는 (WO 2014/097099에 기재된 바와 같이) 1차 하이드록실을 선택적으로 산화시키는 산화제의 존재 하에 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물과 같은 안정한 니트록실 또는 니트록사이드 라디칼 화합물이다. 상기 반응에서, 실제 산화제는 촉매 순환에서 N-옥소암모늄 염이다. 일 양태에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록사이드 라디칼 화합물은 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물이다. 일 양태에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록사이드 라디칼 화합물은 TEMPO(2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시) 또는 PROXYL(2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시) 모이어티를 보유한다. 일 양태에서, 상기 안정한 니트록실 라디칼 화합물은 TEMPO 또는 이의 유도체이다. 일 양태에서, 상기 산화제는 N-할로 모이어티를 갖는 분자이다. 일 양태에서, 상기 산화제는 N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, N-요오도숙신이미드, 디클로로이소시아누르산, 1,3,5-트리클로로-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온, 디브로모이소시아누르산, 1,3,5-트리브로모-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온, 디요오도이소시아누르산 및 1,3,5-트리요오도-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 산화제는 N-클로로숙신이미드이다.
선택적으로 산화 반응은 ??칭제의 첨가에 의해 ??칭된다. ??칭제는 인접한 디올, 1,2-아미노알코올, 아미노산, 글루타티온, 설파이트, 바이설페이트, 다이티오나이트, 메타바이설파이트, 티오설페이트, 포스파이트, 하이포포스파이트 또는 아인산(예를 들어, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로판-1,2-디올, 부탄-1,2-디올 또는 부탄-2,3-디올, 아스코르브산)으로부터 선택된다.
다당류의 산화 단계 후, 다당류는 활성화된다고 하며 이하에서 "활성화된 다당류"라고 한다. 활성화된 다당류 및 담체 단백질은 독립적으로(분리된 동결건조) 또는 함께(공동 동결건조) 동결건조(냉동 건조)될 수 있다. 일 구현예에서 활성화된 다당류 및 담체 단백질은 공동 동결건조된다. 또 다른 구현예에서 활성화된 다당류 및 담체 단백질은 독립적으로 동결건조된다.
일 구현예에서 동결건조는 비환원당의 존재 하에 발생하며, 가능한 비환원당은 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨 및 팔라티니트를 포함한다.
접합 과정의 두 번째 단계는 환원제를 사용하여 활성화된 다당류와 담체 단백질의 환원을 통한 접합체 형성(소위 환원적 아민화)이다. 적합한 환원제는 시아노보로하이드라이드(예를 들어, 브뢴스테드 또는 루이스 산의 존재 하에 나트륨 시아노보로하이드라이드, 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 또는 나트륨 또는 아연 보로하이드라이드), 아민 보란, 예컨대 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-디보란-메탄올, 디메틸아민-보란, t-BuMeiPrN-BH3, 벤질아민-BH3 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란(PEMB) 또는 보로하이드라이드 교환 수지를 포함한다. 일 구현예에서 환원제는 나트륨 시아노보로하이드라이드이다.
일 구현예에서, 환원 반응은 수성 용매(예를 들어, PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicine 또는 HEPB로부터 선택됨, pH 6.0 내지 8.5, 7.0 내지 8.0, 또는 7.0 내지 7.5)에서 수행되고, 또 다른 구현예에서 반응은 비양성자성 용매에서 수행된다. 일 구현예에서, 환원 반응은 DMSO(디메틸설폭사이드) 또는 DMF(디메틸포름아미드) 용매에서 수행된다. DMSO 또는 DMF 용매는 동결건조된 활성화된 다당류 및 담체 단백질을 재구성하기 위해 사용될 수 있다.
환원 반응의 종료 시, 접합체에 미반응 알데히드 기가 남아 있을 수 있으며, 이들은 적절한 캡핑제를 사용하여 캡핑될 수 있다. 일 구현예에서 이 캡핑제는 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)이다.
다른 구현예에서, 접합체는 WO 2014/027302에 기재된 바와 같이 eTEC 접합을 사용하여 제조된다. 상기 당접합체는 하나 이상의 eTEC 스페이서를 통해 담체 단백질에 공유 접합된 당류를 포함하고, 여기서 당류는 카바메이트 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유 접합되고, 담체 단백질은 아미드 연결을 통해 eTEC 스페이서에 공유 접합된다. 본 발명의 eTEC 연결된 당접합체는 일반식 I로 표시될 수 있다:
[일반식 I]
Figure pct00003
여기서 eTEC 스페이서를 포함하는 원자는 중심 상자에 포함된다.
eTEC 스페이서는 7개의 선형 원자(즉, -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)를 포함하고 당류와 담체 단백질 사이에 안정한 티오에테르 및 아미드 결합을 제공한다. eTEC 연결된 당접합체의 합성은 당류의 활성화된 하이드록실 기와 티오알킬아민 시약, 예를 들어 시스타민 또는 시스테인아민 또는 이의 염의 아미노 기의 반응을 수반하여, 당류에 대한 카바메이트 연결을 형성하여 티올화된 당류를 제공한다. 하나 이상의 유리 설프하이드릴 기의 생성은 환원제와의 반응에 의해 달성되어 활성화된 티올화 당류를 제공한다. 아민 함유 잔기 상에 하나 이상의 α-할로아세트아미드 기를 갖는 활성화된 담체 단백질과 활성화된 티올화 당류의 유리 설프하이드릴 기와의 반응은 티오에테르 결합을 생성하여 접합체를 형성하며, 여기서 담체 단백질은 아미드 결합을 통해 eTEC 스페이서에 부착된다.
본원에 기재된 접합체는 단백질의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 음이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18)] 참조; 또한, WO 2009/104074에 기재된 방법 참조. 특정 접합체를 정제하는 데 사용되는 실제 조건은 부분적으로 합성 전략(예를 들어, 합성 생산 대 재조합 생산) 및 생체접합체의 순 전하, 소수성 및/또는 친수성과 같은 요인에 따라 달라질 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
숙주 세포
대장균 O 항원 및 이러한 대장균 O 항원을 포함하는 생체접합체를 생산할 수 있는 숙주 세포, 예를 들어 원핵 숙주 세포가 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 숙주 세포는 바람직하게는 대장균 O 항원 다당류 및/또는 이의 생체접합체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포 기구(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제)를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하도록 (예를 들어, 유전 공학을 통해) 변형된다.
고세균, 원핵 숙주 세포 및 진핵 숙주 세포를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 숙주 세포를 사용하여 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류(예를 들어, 대장균 O75 다당류) 및 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 생체접합체(예를 들어, 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체)를 생산할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이다. 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류 및 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 생체접합체의 생산에 사용하기 위한 예시적인 원핵 숙주 세포는 비제한적으로, 에스케리키아 종, 쉬겔라(Shigella) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 잔토모나스(Xhantomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 락토코커스(Lactococcus) 종, 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 바실러스(Bacillus) 종 및 클로스트리듐(Clostridium) 종을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류 및 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 생체접합체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이고, 바람직하게는 대장균이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류 및 생체접합체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 이종 핵산, 예를 들어 원하는 O 항원 혈청형의 rfb 유전자 클러스터를 포함하는 이종 핵산, 하나 이상의 담체 단백질 및/또는 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산을 포함하도록 조작된다. 특정 구현예에서, 이종 rfb 유전자 및/또는 글리코실화 경로(예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물 글리코실화 경로)에 관여하는 단백질을 암호화하는 이종 핵산은 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 핵산은 올리고사카릴 트랜스퍼라제 및/또는 글리코실트랜스퍼라제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단백질을 암호화할 수 있다.
예를 들어 대장균 O 항원 다당류 및 이의 생체접합체를 제조하는데 사용될 수 있는 재조합 숙주 세포를 만드는 데 유용한 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 다양한 유전자 및 유전자 클러스터의 서열이 본원에 기재되어 있다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 특정 아미노산 서열을 갖는 단백질이 다수의 상이한 핵산에 의해 암호화될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 당업자는 핵산에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서, 본원에서 제공되는 핵산의 서열이 본원에서 제공되는 서열과 상이한 방식으로 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
대장균 O75 항원 다당류, O1A 항원 다당류, O2 항원 다당류, 글루코실화 또는 비글루코실화 O4 항원 다당류, O6A 항원 다당류, O8 항원 다당류, O15 항원 다당류, O16 항원 다당류, O18A 항원 다당류, 또는 O25B 항원 다당류의 생체접합체를 생산하기 위한 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)가 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 숙주 세포는 대장균 O 항원 다당류를 생산할 수 있는 효소(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제)를 암호화하는 핵산을 포함한다. 본원에 기재된 숙주 세포는 관심 O 항원을 생성할 수 있는 핵산을 자연적으로 발현할 수 있거나, 숙주 세포는 이러한 핵산을 발현하도록 제조될 수 있다. 특정 구현예에서 핵산은 숙주 세포에 대해 이종이며 당업계에 공지된 유전적 접근법을 사용하여 숙주 세포에 도입된다. 예를 들어, 핵산은 유전자 조작에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다(예를 들어, 유전자 클러스터는 플라스미드 또는 플라스미드들에서 발현되거나 숙주 세포 게놈으로 통합된다(예를 들어, WO 2014/037585, WO 2014/057109, WO 2015/052344 참조).
또한, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A, O2, 글루코실화 또는 비글루코실화 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, 또는 O75 항원 다당류의 생체접합체를 생산할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)가 본원에 기재되어 있다. 이러한 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 O 항원 다당류에 특이적인 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. rfb 유전자 클러스터는 야생형 대장균 균주로부터 분리될 수 있고, 하나의 숙주 세포 내에서 올리고사카릴 트랜스퍼라제(예를 들어, PglB) 및 담체 단백질(예를 들어, EPA)을 암호화하는 핵산과 조합되어 관심 대장균 O 항원 또는 이의 생체접합체를 생산하는 재조합 숙주 세포를 얻을 수 있다. 예를 들어, 이러한 숙주 세포는 WO 2015/124769, WO 2014/037585, WO 2009/104074 및 WO 2009/089396에 기재된 것과 같은 생체접합 기술을 이용한 rfb 유전자 클러스터, 올리고사카릴 트랜스퍼라제(예를 들어, PglB) 및 담체 단백질(예를 들어, EPA)을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하는 재조합 접근법을 사용하여 조작될 수 있다. 바람직하게는 숙주 세포는 이들의 게놈에 통합된 rfb 유전자 클러스터를 포함한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제, 담체 단백질 및 적용 가능한 경우 gtrS 유전자를 암호화하는 핵산은 특정 구현예에서 또한 숙주 세포의 게놈으로 통합된다. 이종 또는 상동 gtrA 및 gtrB 유전자는 특정 구현예에서 또한 숙주 세포의 게놈으로 통합된다.
O1A, O2, O6A 및 O25B 항원에 대한 생체접합체의 제조는 WO 2015/124769 및 WO 2017/035181에 상세히 기재되어 있다. 각각의 대장균 O 항원(rfb 유전자좌)에 대한 예시적인 유전자 클러스터는 문헌[Iguchi A, et al, DNA Research, 2014, 1-7] 및 문헌[DebRoy C, et al, PLoS One. 2016, 11(1):e0147434; correction in: Plos One. 2016, 11(4):e0154551)]에 기재되어 있다. rfb 클러스터에 대한 핵산 서열 및 그 안에 암호화된 단백질에 대한 아미노산 서열은 또한 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 본원에 개시된 혈청형의 다당류 항원과의 생체접합체용 생산 균주에 사용될 수 있는 rfb 클러스터의 예시적인 서열은 또한 서열번호 9 및 11 내지 19에 제공된다. 따라서, 상기 언급된 각각의 원하는 생체접합체에 대해, 각각의 rfb 클러스터를 숙주 세포에 도입하여 원하는 O 항원에 대한 특정 rfb 클러스터를 가질 뿐만 아니라 올리고사카릴 트랜스퍼라제 및 담체 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를 얻을 수 있다. 전술한 이유로, 바람직하게는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이고, 바람직하게는 상대적으로 잘 알려진 특징을 갖는 균주, 예를 들어 대장균 실험실 또는 생산 균주, 예를 들어 대장균 K12 또는 대장균 BL21 등으로부터 유래된다. 바람직하게는, rfb 클러스터는 숙주 세포에 대해 이종성이며, 예를 들어 숙주 세포의 전구체 세포로 도입되고, 바람직하게는 이의 게놈으로 통합된다. 바람직하게는 원래의 rfb 유전자 클러스터가 전구체 세포에 존재하는 경우, 이는 숙주 세포에서 관심 O 항원에 대한 rfb 유전자 클러스터로 대체되어 관심 O 항원의 생체접합체의 생산을 가능하게 하였다. 바람직하게는 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 숙주 세포에 대해 이종성이며, 특정 구현예에서 이러한 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합된다.
본원에 기재된 임의의 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 원핵 숙주 세포)는 단백질의 N-글리코실화에서 활성인 추가 효소를 암호화하는 핵산을 포함하며, 예를 들어 본원에 기재된 숙주 세포는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 또는 다른 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 숙주 세포는 전형적으로 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 포함한다. 이러한 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 N-글리코실화 공통 모티프를 포함하는 초기 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기로 지질 연결된 올리고당을 전달한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산은 숙주 세포 고유의 것일 수 있거나 유전적 접근법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 숙주 세포에 대해 이종이다. 대장균은 자연적으로 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 포함하지 않으므로, 대장균이 생체접합체 생산을 위한 숙주 세포로 사용되는 경우, 이종 올리고사카릴 트랜스퍼라제가 예를 들어, 유전자 조작에 의해 도입 시, 이러한 숙주 세포에 포함된다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 본 개시내용을 고려하여 당업계에 공지된 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다.
특정 구현예에서, O-글리코실트랜스퍼라제와 같은 N-글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 올리고사카릴 트랜스퍼라제에 대한 대안, 예를 들어 비제한적 예로서 PglL은 예를 들어 WO 2016/82597 및 WO 2020/120569에 기재된 바와 같이 담체 단백질에서 자체의 상이한 글리코실화 공통 서열과 함께 사용될 수 있다. 따라서, O-글리코실트랜스퍼라제와 같은 다른 글리코실트랜스퍼라제도 본 발명에 따른 올리고사카릴 트랜스퍼라제로서 사용될 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터 제주니로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제(즉, pglB)이다(예를 들어, 문헌[Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793] 참조; 또한, 예를 들어, NCBI Gene ID: 3231775, UniProt Accession No. O86154 참조). 또 다른 구현예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터 라리(Campylobacter lari)로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다(예를 들어, NCBI Gene ID: 7410986 참조).
특정 구현예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 천연(야생형) 단백질 또는 이의 임의의 변이체, 예컨대 WO 2016/107818 및 WO 2016/107819에 기재된 것을 포함하는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다. PglB는 공통 서열인 서열번호 1 및 서열번호 2의 아스파라긴 잔기로 지질 연결된 올리고당을 전달할 수 있다. 특정 구현예에서, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 야생형 PglB에서 하나 이상의 내인성 글리코실화 공통 서열은 돌연변이되어 PglB 자가글리코실화를 회피하였다. 예를 들어, 돌연변이 N534Q를 포함하는 서열번호 6. 본원에서 제공되는 재조합 숙주 세포에 사용하기에 적합한 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제의 예는 N311V, K482R, D483H, A669V, Y77H, S80R, Q287P 및 K289R로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 서열번호 6의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 포함한다. 일 특정 구현예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 N311V를 포함하는 서열번호 6을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는 서열번호 6을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 N311V, K482R, D483H 및 A669V를 포함하는 서열번호 6을 갖는다. 또 다른 특정 구현예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V를 포함하는 서열번호 6을 갖는다. 2020년 3월 18일에 출원된 PCT/US20/23415에서 특정 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 변이체가 특정 혈청형의 대장균 O 항원 생체접합체의 생산에서 놀라울 정도로 개선된 수율을 제공한다는 것이 밝혀지고 기재되었다. 주어진 대장균 O 항원에 대한 개선된 또는 최적의 PglB 변이체는 예측할 수 없었다. 따라서 특정 양태에서 본 발명은 또한 올리고사카릴 트랜스퍼라제로서 특정 PglB 변이체를 사용하여 특정 대장균 O 항원의 생체접합체를 생산하는 방법을 개시한다. 서열번호 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하며, 여전히 올리고사카릴 트랜스퍼라제 활성을 가지며, 바람직하게는 본원에 조합하여 개시된 지시된 위치에 하나 이상의 특정 아미노산을 갖는 PglB의 추가 변이체(예를 들어, 77Y, 80S, 287Q, 289K, 311N, 482K, 483D, 669A; 또는 311V; 또는 311V, 482R, 483H, 669V; 또는 77H, 80R, 287P, 289R, 311V; 또는 77H, 311V; 등)도 생체접합체의 생산에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체를 생산할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 바람직하게는 돌연변이 N311V를 포함하는 서열번호 6을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A, O6A 또는 O15 항원 다당류의 생체접합체를 생산할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 바람직하게는 돌연변이 N311V, K482R, D483H 및 A669V를 포함하는 서열번호 6을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화 O4 항원 다당류의 생체접합체를 생산할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 바람직하게는 돌연변이 N311V를 포함하는 서열번호 6, 또는 더욱 바람직하게는 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는 서열번호 6을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화 O4 항원 다당류의 생체접합체 생산을 위한 재조합 숙주 세포는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 암호화하는 서열(또는 서열번호 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 이의 변이체)로서, 글루코스 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형하여 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 서열, 및 각각 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(또는 각각 서열번호 7 및 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 이의 변이체)을 추가로 포함하고, 여기서 트랜스로카제는 박토프레놀 연결된 글루코스를 전위시킬 수 있고 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화할 수 있다. 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 비글루코실화 O4 항원 다당류의 생체접합체 생산을 위해 세포는 GtrS, GtrA 및 GtrB 단백질을 암호화하는 이러한 서열을 필요로 하지 않는다. 대장균 O4 항원 다당류의 글루코실화에 특이적인 신규한 GtrS를 사용하여 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화 O4 항원 다당류의 생체접합체의 생산은 본원에 전체가 참조로 포함된, 2020년 3월 18일 출원된 PCT/US20/23404에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 생체접합체를 생산할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 바람직하게는 돌연변이 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V를 포함하는 서열번호 6을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O8, O18A, O25B 또는 O2 항원 다당류의 생체접합체를 생산할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게는 여기서 서열번호 6은 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 숙주 세포는 담체 단백질, 예를 들어 숙주 세포 글리코실화 기구에 의해 생성된 O 항원 다당류(들)가 부착되어 생체접합체를 형성할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 숙주 세포는 비제한적으로, 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, S. 아우레우스의 탈독소화된 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 대장균 열 민감 장독소의 탈독소화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 탈독소화된 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D를 포함하나 이에 한정되지 않는 본 개시를 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 담체 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 P. 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA)를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 바람직하게는,EPA 담체 단백질은 1 내지 10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위, 예컨대 1 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함하며, 각각은 서열번호 1의 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 서열번호 3을 포함하는 EPA-4 담체 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 숙주 세포에 의한 생체접합체의 생성에 사용되는 담체 단백질은 "태그", 즉 담체 단백질의 분리 및/또는 식별을 가능하게 하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 담체 단백질에 태그를 추가하는 것은 해당 단백질의 정제에 유용할 수 있으며, 따라서 태그가 부착된 담체 단백질을 포함하는 접합체 백신의 정제에 유용할 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 예시적인 태그는 히스티딘(HIS) 태그(예를 들어, 헥사-히스티딘-태그 또는 6XHis-Tag), FLAG-TAG 및 HA 태그를 제한 없이 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 사용된 태그는 제거 가능하며, 예를 들어 일단 태그가 더 이상 필요하지 않으면, 예를 들어 단백질이 정제된 후에 화학 작용제 또는 효소적 수단에 의해 제거할 수 있다. 다른 구현예에서, 담체 단백질은 태그를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 담체 단백질을 발현하는 숙주 세포의 주변 세포질 공간으로 담체 단백질을 표적화하는 신호 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 신호 서열은 대장균 DsbA, 대장균 외막 포린 A(OmpA), 대장균 말토스 결합 단백질(MalE), 에르위니아 카로토보란스 펙테이트 리아제(Erwinia carotovorans pectate lyase)(PelB), FlgI, NikA, 또는 바실러스 종 엔독실라나제(XynA), 열 민감 대장균 장독소 LTIIB, 바실러스 엔독실라나제 XynA 또는 대장균 플라겔린(FlgI)으로부터 비롯된다. 일 구현예에서, 신호 서열은 서열번호 10을 포함한다. 신호 서열은 단백질이 주변 세포질로 전위된 후에 절단될 수 있고 따라서 생체접합체의 최종 담체 단백질에 더 이상 존재하지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 숙주 세포에 (예를 들어, 재조합 기술을 사용하여) 추가 변형이 도입될 수 있다. 예를 들어, 아마도 경쟁하거나 간섭하는 글리코실화 경로(예를 들어, 숙주 세포 내로 재조합으로 도입되는 글리코실화에 관련된 하나 이상의 이종 유전자와 경쟁하거나 이를 간섭함)의 일부를 형성하는 단백질을 암호화하는 숙주 세포 핵산(예를 들어, 유전자)은 이들을 불활성/기능 이상으로 만드는 방식으로(즉, 결실/변형되는 숙주 세포 핵산은 기능성 단백질을 암호화하지 않음) 숙주 세포 배경(게놈)에서 결실되거나 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 숙주 세포의 게놈으로부터 핵산이 결실될 때, 핵산은 바람직한 서열, 예를 들어 O 항원 다당류 또는 이의 생체접합체의 생산에 유용한 서열로 대체된다.
숙주 세포에서 결실될 수 있는 (일부 경우에, 다른 요망되는 핵산 서열로 대체될 수 있는) 예시적인 유전자 또는 유전자 클러스터는 waaL과 같은 당지질 생합성에 관여하는 숙주 세포의 유전자 또는 유전자 클러스터(예를 들어, 문헌 [Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021] 참조), 지질 A 코어 생합성 클러스터(waa), 갈락토스 클러스터(gal), 아라비노스 클러스터(ara), 콜론산 클러스터(wc), 협막 다당류 클러스터, 운데카프레놀-p 생합성 유전자(예를 들어, uppS, uppP), und-P 재순환 유전자, 뉴클레오티드 활성화된 당 생합성에 관여하는 대사 효소, 장내 세균 공통 항원 클러스터(eca) 및 프로파지 O 항원 변형 클러스터, 예를 들어, gtrABS 클러스터 또는 이의 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 숙주 세포는 원하는 O 항원 다당류, 예를 들어 글루코실화 O4 항원 다당류 이외의 임의의 O 항원 다당류를 생산하지 않도록 변형된다.
특정 구현예에서, waaL 유전자는 본원에 제공된 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다. 용어 "waaL" 및 "waaL 유전자"는 주변 세포질에 위치한 활성 부위를 갖는 막 결합 효소를 암호화하는 O 항원 리가제 유전자를 지칭한다. 암호화된 효소는 운데카프레닐포스페이트(UPP)에 결합된 O 항원을 지질 A 코어로 전달하여 지질다당류를 형성한다. 내인성 waaL 유전자의 결실 또는 파괴(예를 들어, ΔwaaL 균주)는 O 항원의 지질 A로의 전달을 방해하고, 대신 O 항원의 다른 생체분자, 예컨대 담체 단백질로의 전달을 증진시킬 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, waaL 유전자, gtrA 유전자, gtrB 유전자, gtrS 유전자 및 rfb 유전자 클러스터 중 하나 이상이 본원에 제공된 원핵 숙주 세포의 원래 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다.
일 구현예에서, 본원에서 사용되는 숙주 세포는 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체를 생산하는 대장균이고, 여기서 waaL 유전자는 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화되고, 대장균 O4 항원 다당류에 특이적인 gtrS 유전자가 삽입된다. 글루코실화된 O4 O 항원의 생체접합체를 위한 생산 균주에 대한 특정 구현예에서, 서열번호 4에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 gtrS 유전자가 모 균주의 gtrS 유전자를 O4 항원의 글루코실화를 담당하는 유전자로 대체하도록 해당 모 균주의 gtrS 유전자 대신에 삽입된다. 이러한 모 균주의 예는 대장균 K-12 균주 W3110이다. gtrA 및 gtrB 유전자는 모 균주에 대해 상동성일 수 있거나, 대안적으로 이들 유전자 중 하나 또는 둘 모두는 모 균주에 대해 이종성일 수 있다. 전형적으로 gtrS 유전자와 달리, 이러한 gtrA 및 gtrB 유전자는 O 항원 구조에 특이적이지 않다.
또한, 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 재조합 숙주 세포는 대장균 O 항원의 생체접합체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 세포 내로 도입하여 재조합 숙주 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 재조합 핵산 분자는 이종성이다. 본 개시내용을 고려하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합 핵산 분자를 숙주 세포에 도입할 수 있다. 재조합 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 전기천공, 화학적 형질전환, 열 충격, 자연 형질전환, 파지 형질도입 및 접합을 사용하여 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 핵산은 플라스미드를 사용하여 본원에 기재된 숙주 세포에 도입된다. 예를 들어, 이종 핵산은 플라스미드(예를 들어, 발현 벡터)에 의해 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 이종 핵산은 예를 들어 WO 2014/037585, WO 2014/057109, 또는 WO 2015/052344에 기재된 바와 같은 게놈으로의 삽입 방법을 사용하여 본원에 기재된 숙주 세포로 도입된다.
도구 및 모델 유기체로서 분자 생물학에서 일상적으로 사용되는 대장균 균주는 예를 들어 특정 구현예에서 숙주 세포에 대한 부모로서 사용될 수 있다. 비제한적 예는 대장균 K12 균주(예를 들어, W1485, W2637, W3110, MG1655, DH1, DH5α, DH10 등), B 균주(예를 들어, BL-21, REL606 등), C 균주, 또는 W 균주를 포함한다. 일 특정 구현예에서, 숙주 계통은 모 계통 W3110으로부터 유래된다. 이 균주는 예를 들어 예일의 E. coli Genetic Stock Center에서 얻을 수 있다. 대장균에 대한 자세한 내용은 예를 들어, Ecoliwiki.net 참조.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 숙주 세포는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 생체접합체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포를 사용하여 이러한 생체접합체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO 2003/074687 및 WO 2006/119987 참조. 이러한 방법은 생체접합체의 생산을 위한 조건 하에서 본원에 기재된 임의의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 생체접합체는 본 개시내용을 고려하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합 숙주 세포로부터 단리, 분리 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 생체접합체는 단백질의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 음이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, WO 2009/104074에 기재된 방법 참조. 또한, 생체접합체는 정제를 용이하게 하기 위해 이종 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다. 특정 생체접합체를 정제하는 데 사용되는 실제 조건은 부분적으로 생체접합체의 순 전하, 소수성 및/또는 친수성과 같은 요인에 따라 달라질 것이며, 당업자에게 명백할 것이다. O1A, O2, O6A 및 O25B에 대한 생체접합체 및 이들을 포함하는 백신 조성물의 제조는 예를 들어 WO 2015/124769 및 WO 2017/035181에 기재되어 있다.
또한, 본원에 기재된 방법, 즉 본원에 기재된 재조합 숙주 세포를 사용하여 생산된 생체접합체가 제공된다.
일부 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원 다당류의 생체접합체를 제조하는 방법은 다음을 포함한다: (i) (a) O 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 1, 바람직하게는 서열번호 2를 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하고, 더욱 바람직하게는 각각 서열번호 2를 갖는 글리코실화 공통 서열을 포함하는 4개의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질, 바람직하게는 EPA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 올리고사카릴 트랜스퍼라제, 예를 들어 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계.
특정 구현예에서, 대장균 O 항원 다당류는 특정 다당류 대 단백질 중량비(w/w)로 담체 단백질에 공유 결합된다. 담체 단백질에 공유 결합된 중량 기준의 O 항원 다당류의 양의 비율은 "글리칸/단백질 비율" 또는 "다당류/단백질 비율" 또는 "PS/단백질 비율"로 지칭된다. 일부 구현예에서, O 항원 다당류는 약 1:20 내지 20:1, 바람직하게는 1:10 내지 10:1, 더욱 바람직하게는 1:3 내지 3:1의 다당류 대 단백질(w/w) 비로 담체 단백질에 공유 결합된다. 본원에 기재된 생체접합체에 대한 특정 비제한적 구현예에서, 글리칸/단백질 비율은 약 0.1 내지 0.5, 예컨대 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45 또는 0.5이다. 이러한 구현예에서, O 항원 다당류:단백질의 중량비는 특정 O 항원 혈청형에 따라 약 1:10 내지 1:2, 예컨대 1:10: 1:9: 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 또는 1:2이다. 특정 구현예에서 글리칸/단백질 비율은 약 0.15 내지 약 0.45이다. 일반적으로, O 항원 다당류 대 담체 단백질의 더 높은 글리칸/단백질 비율이 바람직한데, 많은 양의 담체 단백질이 일부 경우에 면역학적 간섭을 유발할 수 있기 때문이다. 또한, 더 높은 글리칸/단백질 비율은 생체접합체 형태로 투여된 충분한 O 항원 다당류를 얻는 데 도움이 될 것이며, 담체 단백질의 양은 상대적으로 낮게 유지되며, 이는 다중 혈청형이 조성물, 예를 들어, 적어도 4개의 상이한 O 항원, 적어도 5개의 상이한 O 항원, 적어도 6개의 상이한 O 항원, 적어도 7개의 상이한 O 항원, 적어도 8개의 상이한 O 항원, 적어도 9개의 상이한 O 항원, 적어도 10개의 상이한 O 항원 등으로부터의 생체접합체를 포함하는 조성물에 의해 커버되어야 하는 다가 조성물에 특히 유리하다.
본 발명에 따른 접합체의 글리칸/단백질 비율은 단백질 양 및 글리칸 양을 결정함으로써 결정될 수 있다. 단백질 양은 280 nm에서의 UV 흡광도(A280)를 측정하여 결정할 수 있다. 글리칸 양은 (예를 들어, 표 1의 O8에 대한 Man, 및 표 1의 다른 글리칸에 대한 GlcNAc의) 반복 단위에서 당의 펄스 전류계 검출(IC-PAD)과 이온 크로마토그래피를 기반으로 결정될 수 있으며, 그 후 반복 단위의 구조 정보는 총 글리칸 양을 계산하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, O1A의 반복 단위는 845 Da의 몰 질량을 가지며, 이러한 반복 단위 1몰은 1몰의 GlcNAc를 함유하며, 이는 GlcNAc의 양이 IC-PAD에 의해 결정될 때 총 글리칸 양의 계산을 가능하게 한다).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 생체접합체는 L-Rh 당의 위치 2에서 특정 정도의 아세틸화를 갖는다. (생체)접합체에서 O25B 항원 다당류의 O-아세틸화 정도는 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 예컨대 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다.
유사하게, (생체)접합체에서 대장균 O16 항원 다당류의 O-아세틸화 정도는 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 예컨대 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다.
특정 구현예에서, O 항원 다당류의 생체접합체를 제조하는 방법은 생산되는 O 항원 다당류 생체접합체에 따라 특정 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소, 특히 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 특정 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소 변이체는 숙주 세포에 의해 생산된 생체접합체의 수율에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 수율이 특정 생체접합체를 생산하는 비용에 영향을 미치기 때문에 더 높은 수율이 바람직하며, 이는 여러 상이한 생체접합체를 포함하는 다가 조성물에 특히 중요하다.
일 특정 구현예에서, O 항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 돌연변이는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구현예에서, O 항원이 O1A, O6A, 또는 O15 항원 다당류일 때, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 N311V, K482R, D483H, 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 돌연변이는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구현예에서, O 항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 아미노산 돌연변이 N311V, 또는 Y77H 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 돌연변이는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구현예에서, O 항원이 O16 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 돌연변이는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구현예에서, O 항원이 O8, O18A, O25B, 또는 O2 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열번호 6은 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다. 이의 특정 구현예에서, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 지시된 O 항원/PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 쌍당 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 O 항원 다당류의 생체접합체는 바람직하게는 본원에 기재된 하나 이상의 바람직한 속성, 예를 들어 글리칸/단백질 비율 및/또는 다중-글리코실화된 담체 단백질의 백분율을 갖는다.
조성물 및 조합물
대장균 O75 및 O6 항원 다당류(여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된다)를 포함하고, 선택적으로 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 전부(여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된다)를 추가로 포함하는 조성물 및 조합물이 본원에 제공된다. O 항원 다당류 또는 접합체, 예를 들어 생체접합체의 조합물은 다수의 조성물을 포함할 수 있지만, O 항원 다당류 또는 접합체, 예를 들어 생체접합체의 조합물이 동일한 조성물에 존재하는 경우 이것이 바람직하다.
본원에 기재된 조성물 및 조합물은 대장균에 의한 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 감염의 치료 및 예방, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환의 예방에 유용하다. 일부 구현예에서, 조성물은 면역원성 조성물이다. 본원에서 사용되는 "면역원성 조성물"은 조성물이 투여되는 숙주 또는 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물을 의미한다. 조성물 및 면역원성 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “제약상 허용가능한”이라는 용어는 동물에서의, 더 구체적으로 인간에서의 사용용으로 미국 약전 또는 다른 일반적 공인 약전에 열거되거나 미국 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 것을 의미한다. 제약상 허용가능한 담체의 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같은 “담체”라는 용어는 희석제, 아쥬반트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클(이와 함께 제약 조성물이 투여됨)을 지칭한다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도, 특히 주사제 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌[“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E.W. Martin]에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Tris-완충 식염수(TBS) pH 7.4(예를 들어 각각 25 mM, 137 mM 및 2.7 mM의 Tris, NaCl 및 KCl을 함유함)에 본원에 기재된 바와 같은 (생체)접합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 7.0 pH의 약 10 mM KH2PO4/Na2HPO4 완충액, 약 5% (w/v) 소르비톨, 약 10 mM 메티오닌 및 약 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 80에 본원에 기재된 바와 같은 생체접합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 7.0 pH의 약 10 mM KH2PO4/Na2HPO4 완충액, 약 8% (w/v) 수크로스, 약 1 mM EDTA, 및 약 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 80(예를 들어, EPA 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원의 생체접합체에 적합한 완충액에 대해서는 WO 2018/077853 참조)에 본원에 기재된 바와 같은 생체접합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 5 mM 숙시네이트/0.9% NaCl, pH 6.0에 본원에 기재된 바와 같은 (생체)접합체를 포함한다.
다가 조성물, 예를 들어 2가, 3가, 4가 등의 조성물인 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)이 본원에 제공된다. 예를 들어, 다가 조성물은 대장균 O 항원, 당접합체, 또는 이의 생체접합체와 같은 하나 초과의 항원을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 다가 조성물은 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체 및 대장균 O6A 항원 다당류의 생체접합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 다가 조성물은 적어도 하나의 추가 항원 또는 생체접합체를 포함한다.
전형적으로 본 발명의 조성물은 먼저 이들 O 항원 다당류를 담체 단백질에 독립적으로 공유 결합함으로써, 예를 들어, 화학적 접합 또는 생체접합에 의해, 본원에 기재된 각각의 대장균 O 항원 다당류에 대한 개별 당접합체를 수득하고, 후속적으로 본 발명에 따른 조성물을 얻기 위해 본원에 기재된 양 및 비율로 개별 당접합체를 혼합함으로써 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)은 본원에 기재된 바와 같은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류 및 적어도 하나의 추가 항원을 포함하는 다가 조성물이다.
일부 구현예에서, 추가 항원은 항원 당류 또는 다당류, 더욱 바람직하게는 대장균 O 항원 다당류, 예를 들어 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O18 및 O25 혈청형 및 이의 하위 혈청형 중 하나 이상의 대장균 O 항원이고, 바람직하게는 각각 개별적으로 담체 단백질에 접합된 것이고, 여기서 각 혈청형에 대한 담체 단백질은 동일하거나, 또는 일부 또는 모든 혈청형 간에 상이할 수 있다. 바람직하게는, 대장균 O75 다당류의 (생체)접합체를 포함하는 다가 조성물은 각각의 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18 및 O25 혈청형 또는 이의 하위 혈청형의 대장균 O 항원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 추가 대장균 O 항원 다당류는 당접합체이며, 이는 대장균 O 항원 다당류가 또 다른 화학종, 예를 들어 단백질, 펩티드, 지질 등, 가장 바람직하게는 화학적 또는 효소적 방법과 같은 담체 단백질에 공유 결합됨을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 각각의 추가 대장균 O 항원 다당류는 O 항원 다당류가 숙주 세포 기구에 의해 효소적으로 글리코시드 결합을 통해, 예를 들어, 담체 단백질에 공유 결합된 생체접합체이다. 특정 구현예에서, 다가 조성물은 O8 혈청형의 대장균 O 항원을, 바람직하게는 당접합체, 바람직하게는 생체접합체 형태로 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 본원에 제공된 조성물은 1 내지 20개의 추가 당접합체, 더욱 바람직하게는 대장균 O 항원 다당류의 생체접합체, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 추가 당접합체 또는 바람직하게는 대장균 O 항원 다당류의 생체접합체를 포함할 수 있다. 펩티드, 단백질 또는 지질 항원 등과 같은 다른 항원이 본원에 제공된 조성물에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)은 대장균 O75 항원 다당류의 (생체)접합체 및 대장균 O6 항원 다당류의 (생체)접합체, 및 대장균 O1 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 글루코실화 O4 항원 다당류, 대장균 O8 항원 다당류, 대장균 O15 항원 다당류, 대장균 O16 항원 다당류, 대장균 O18 항원 다당류 및 대장균 O25 항원 다당류로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 항원 다당류, 바람직하게는 적어도 대장균 O1 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류 및 대장균 O25 항원 다당류, 더욱 바람직하게는 적어도 대장균 O1 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O25 항원 다당류, 대장균 O4 항원 다당류, 대장균 O15 항원 다당류, 대장균 O16 항원 다당류 및 대장균 O18 항원 다당류를 포함한다. 바람직하게는 O1 항원 다당류는 O1A 항원 다당류이고, O6 항원 다당류는 O6A 항원 다당류이고, O4 항원 다당류는 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, O18 항원 다당류는 O18A 항원 다당류이고, O25 항원 다당류는 O25B 항원 다당류이다. 바람직하게는, 각각의 추가 O 항원 다당류는 담체 단백질에 공유 결합되고, 더욱 바람직하게는 생체접합체이다.
일부 구현예에서, 조성물은 대장균 O75 및 대장균 O1, O2 또는 O6 항원 다당류 중 적어도 하나, 바람직하게는 대장균 O1 또는 O6 항원 다당류 중 적어도 하나를 포함하며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 항원 다당류 대 O1, O2, 및/또는 O6 항원 다당류의 농도비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1 또는 2.5:1이다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25 항원 다당류, 바람직하게는 대장균 O25B 항원 다당류를 추가로 포함하고, O25 항원 다당류 대 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류 농도비는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 바람직하게는 약 2:1이다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는 O25 항원 다당류 대 O75 항원 다당류의 농도비는 약 2:1 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 1.5:1, 더욱 바람직하게는 약 1:1이다. 이의 특정 구현예에서, O25 항원 다당류 대 O2 항원 다당류의 농도비는 약 4:1 내지 약 2:1이다. 특정 구현예에서, 조성물은 대장균 O75, O1, O2, O6 및 O25 항원 다당류를 포함하고, 바람직하게는 O1, O6 및 O25 항원 다당류는 각각 O1A, O6A 및 O25B 다당류이고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 항원 다당류 O75:O1:O2:O6:O25의 농도비는 약 2:1:1:1:2이다. 특정 구현예에서, O 항원은 생체접합에 의해, 예를 들어, 담체 단백질의 Asn-잔기에 대한 N-연결을 통해, 담체 단백질에 공유 결합된다. 특정 구현예에서, 조성물 중 O75 항원 다당류의 농도는 약 8 내지 64 μg/mL, 바람직하게는 약 16 내지 32 μg/mL, 바람직하게는 약 28 내지 36 μg/mL, 예를 들어, 약 32 μg/mL이다. 특정 구현예에서, 조성물은 대장균 O4, O15, O16, O18 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 바람직하게는 O4는 글루코실화되고, O18 항원은 O18A이다. 특정 구현예에서, 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O8 항원 다당류를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 이들 각각이 조성물에 존재하는 한 항원 다당류 O75:O4:O15:O16:O18:O8의 농도비는 약 2:1:1:1:1:1이다. 추가 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 추가 대장균 O 항원 다당류를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된다.
일 구현예에서, O1 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O1 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O1 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O1 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O2 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O2 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O2)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O2 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O2 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O4 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O4 항원 다당류는 글루코실화 O4 항원 다당류이고, 특정 구현예에서 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O4 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O4 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O6 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O6 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O6A)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O6 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O6 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O8 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O8 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O8)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O8 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O8 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O15 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O15 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O15)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O15 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O15 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O16 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O16 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O16)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O16 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O16 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O18 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O18 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O18A)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O18 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O18 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1.2:1 내지 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1, 예를 들어, 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1이다.
일 구현예에서, O25 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서)는 본원에서 제공되는 조성물에 사용된다(예를 들어, O75 항원 다당류 또는 이의 생체접합체와 조합하여). 특정 구현예에서, O25 항원 다당류는 O25B 항원 다당류를 포함하고, 특정 구현예에서 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O25B)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O25 항원 다당류는 생체접합체의 일부이고 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된다. 특정 구현예에서 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O25 항원 다당류 사이의 중량비는 약 1:4 내지 1:0.5, 바람직하게는 약 1:2 내지 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1:1, 예를 들어, 약 1:1.5, 1:1.4, 1:1.3, 1:1.2, 1:1.1, 1:1.0, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 또는 1:0.5이다.
또 다른 구현예에서, 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)은 적어도 담체 단백질에 접합된 대장균 O75, O1, O2, O4, O6 및 O25 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어, EPA 또는 CRM197에 공유 결합된 O75, O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A 및 O25B 항원 다당류의 생체접합체를 포함한다(즉, 적어도 6가 조성물). 일 구현예에서, 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O1:O2:O4:O6:O25 항원 다당류 사이의 중량비는 약 2:1:1:1:1:2이다.
바람직한 구현예에서, 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)은 적어도 담체 단백질에 접합된 대장균 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18, O25 및 O75 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함한다(즉, 적어도 9가 조성물). 일 구현예에서, 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25 항원 다당류 사이의 중량비는 약 2:1:1:1:1:1:1:1:2이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)은 적어도 담체 단백질에 접합된 대장균 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O18, O25 및 O75 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함한다(즉, 적어도 10가 조성물). 일 구현예에서, 조성물에서 및/또는 대상체에게 투여되는 O75:O1:O2:O4:O6:O8:O15:O16:O18:O25 항원 다당류 사이의 중량비는 약 2:1:1:1:1:1:1:1:1:2이다.
또한, 선택적으로 다른 대장균 혈청형으로부터의 추가 O 항원을 (예를 들어, 단리된 형태로, 또는 당접합체 또는 생체접합체의 일부로서) 추가로 포함하는 조성물이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)은 상기 기재된 바와 같은 적어도 6가, 9가 또는 10가 조성물을 포함하고, 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된 항원 다당류의 (생체)접합체, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 적어도 6가, 9가 또는 10가 조성물은 추가 대장균 항원 다당류 또는 이의 접합체를 포함하지 않는다. 즉, 이러한 조성물은 각각, 바람직하게는 접합체, 바람직하게는 생체접합체의 형태로, 6, 9 또는 10개의 대장균 항원 다당류를 포함하나, 이를 초과하여 포함하지 않는다. 따라서, 일 구현예는 9개의 접합체, 특히 담체 단백질에 접합된 대장균 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18, O25 및 O75 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하고(즉, 9가 조성물), 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원 다당류의 추가 접합체를 포함하지 않는 조성물을 제공하는 것이다. 따라서, 또 다른 구현예는 10개의 접합체, 특히 담체 단백질에 접합된 대장균 O1, O2, O4, O6, O8, O15, O16, O18, O25 및 O75 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어 EPA 또는 CRM197에 공유 결합된 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하고(즉, 10가 조성물), 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원 다당류의 추가 접합체를 포함하지 않는 조성물을 제공하는 것이다.
일부 바람직한 구현예에서, 추가 대장균 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18 및/또는 O25 항원 다당류 각각은 담체 단백질에 공유 결합된다. O 항원 다당류는 화학적 또는 다른 합성 방법에 의해 담체 단백질에 연결될 수 있거나, O 항원 다당류는 생체접합체의 일부일 수 있으며, 바람직하게는 생체접합체의 일부이다. 바람직하게는 조성물에 의해 커버되는 혈청형당 O 항원은 각각 개별적으로 담체 단백질에 커플링된다. 즉, 특정 혈청형을 커버하는 각각의 당접합체 또는 생체접합체는 본 발명에 따른 조성물에서 혼합되기 전에 개별적으로 생산될 수 있다. 담체 단백질은 바람직하게는 조성물 내의 각각의 당접합체 또는 생체접합체에 대해 동일할 수 있거나, 대안적으로 대장균 O 항원의 일부 또는 전부에 대해 상이할 수 있다. 예를 들어, 상이한 혈청형의 O 항원은 또한 상이한 담체 단백질에 접합될 수 있다. 본 개시를 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 담체 단백질이 사용될 수 있다. 적합한 담체 단백질은 비제한적으로, 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, S. 아우레우스의 탈독소화된 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 대장균 열 민감 장독소의 탈독소화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 탈독소화된 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D를 포함한다. 바람직하게는 담체 단백질은 EPA 또는 CRM197이다.
일부 구현예에서, 추가의 대장균 O1(A), O2, (글루코실화된) O4, O6(A), O15, O16, O18(A), 및/또는 O25(B) 항원 다당류 각각은, 특히 생체접합체의 일부인 경우, 담체 단백질의 아스파라긴(Asn) 잔기에 공유 결합되며, 여기서 Asn 잔기는 글리코실화 공통 서열 Asn-X-Ser(Thr)(여기서, X는 Pro을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)(서열번호 1)을 포함하는 글리코실화 부위에 존재하고, 바람직하게는 Asn 잔기는 글리코실화 공통 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(여기서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨)(서열번호 2)을 포함하는 글리코실화 부위에 존재한다. 담체 단백질은 1 내지 10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함할 수 있으며, 각각은 글리코실화 공통 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 담체 단백질은 EPA-4 담체 단백질, 예를 들어 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA-4 담체 단백질이다.
특정 구현예에서, 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)이 본원에 제공되며, 조성물은 (i) 서열번호 3을 포함하는 P.애루기노사의 탈독소화된 외독소 A 담체 단백질(EPA-4 담체 단백질)에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O75 항원 다당류는 화학식 (O75)의 구조를 포함한다); (ii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O1A 항원 다당류는 화학식 (O1A)의 구조를 포함한다); (iii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O2 항원 다당류는 화학식 (O2)의 구조를 포함한다); (iv) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O6A 항원 다당류는 화학식 (O6A)의 구조를 포함한다); (v) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O15 항원 다당류는 화학식 (O15)의 구조를 포함한다); (vi) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O16 항원 다당류는 화학식 (O16)의 구조를 포함한다); (vii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O18A 항원 다당류는 화학식 (O18A)의 구조를 포함한다); (viii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O25B 항원 다당류는 화학식 (O25B)의 구조를 포함한다); 및 (ix) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함한다)를 포함하고, 여기서 각 화학식은 표 1에 제공되어 있고, 각 화합물에 대해 독립적으로 n은 1 내지 100, 예를 들어 1 내지 50, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어, 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, 상기 조성물(예를 들어, 제약 및/또는 면역원성 조성물)은 추가로 (x) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O8 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O8 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O8)의 구조를 포함한다)를 포함하고, 여기서 이 구조에 대해 n은 1 내지 100, 예를 들어 1 내지 50, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어, 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 대장균 O75 항원 다당류의 접합체, 및 적어도 대장균 O6 항원 다당류, 바람직하게는 O6A 항원 다당류의 접합체를 포함하며, 여기서 대장균 O75 항원 다당류의 접합체는 조성물에 존재하는 O6 항원 다당류의 농도보다 약 1.2 내지 8배, 예를 들어 약 2 내지 4배, 예컨대, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8배 높다(모든 농도는 O 항원 다당류의 중량을 기준으로 함). 바람직하게는 조성물 중 대장균 O75 항원 다당류는 조성물 중 O6 항원 다당류 농도의 약 1.5배 내지 2.5배, 예컨대 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 또는 2.5배의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서, 조성물은 대장균 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18, O25B 및 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하며, 여기서 O1A:O2:글루코실화된 O4:O6A:O15:O16:O18:O25B:O75의 생체접합체는 (O 항원 다당류 중량 기준) 1:1:1:1:1:1:1:2:2, 1:1:1:1:1:1:1:2:1.5, 2:1:1:2:1:1:1:4:3, 2:1:1:2:1:1:1:4:4, 2:1:2:2:2:2:2:4:4, 바람직하게는 약 1:1:1:1:1:1:1:2:2의 비로 존재한다.
특정 구현예에서, 조성물은 대장균 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하며, 여기서 O1A:O2:글루코실화된 O4:O6A:O8:O15:O16:O18A:O25B:O75의 생체접합체는 (O 항원 다당류 중량 기준) 1:1:1:1:1:1:1:1:2:2, 2:1:2:2:2:2:2:2:4:4, 2:1:1:2:1:1:1:1:4:3, 또는 2:1:1:2:1:1:1:1:4:4, 바람직하게는 약 1:1:1:1:1:1:1:1:2:2의 비로 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체 및 적어도 대장균 O6 항원 다당류의 생체접합체를 포함하며, 여기서 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체는 조성물에 약 8 내지 약 50 μg/mL, 바람직하게는 약 12 내지 약 40 μg/mL, 더욱 바람직하게는 약 16 내지 약 32 μg/mL, 예컨대 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32 μg/mL, 바람직하게는 약 32 μg/mL의 농도로 존재한다. 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체의 농도는 바람직하게는 조성물에 존재하는 O6 생체접합체의 농도보다 약 1.2 내지 약 8배, 예를 들어 약 2 내지 4배, 예를 들어 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8배 높다.
일 특정 구현예에서, 제약 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은
(i) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 생체접합체;
(ii) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 생체접합체;
(iii) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O4 항원 다당류의 생체접합체;
(iv) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 생체접합체;
(v) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 생체접합체;
(vi) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 생체접합체;
(vii) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 생체접합체;
(viii) 약 28 내지 36, 바람직하게는 약 32 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 생체접합체; 및
(ix) 약 28 내지 36, 바람직하게는 약 32 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하고,
여기서 EPA-4 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고,
O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 더욱 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, 이러한 조성물은 추가로
(x) 약 12 내지 20, 바람직하게는 약 16 μg/mL의 다당류 농도의, EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하고,
O8 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O8)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 더욱 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다.
일 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 O75 항원 다당류는 적어도 약 32 μg/mL의 농도이다.
일 구현예에서, 조성물이 제공되며, 조성물은
(i) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O1A 항원 다당류는 화학식 (O1A)의 구조를 포함한다);
(ii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O2 항원 다당류는 화학식 (O2)의 구조를 포함한다);
(iii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함한다);
(iv) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O6A 항원 다당류는 화학식 (O6A)의 구조를 포함한다);
(v) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O15 항원 다당류는 화학식 (O15)의 구조를 포함한다);
(vi) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O16 항원 다당류는 화학식 (O16)의 구조를 포함한다);
(vii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O18A 항원 다당류는 화학식 (O18A)의 구조를 포함한다);
(viii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O25B 항원 다당류는 화학식 (O25B)의 구조를 포함한다); 및
(ix) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O75 항원 다당류는 화학식 (O75)의 구조를 포함한다)를 포함하고,
화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조 각각은 표 1에 제시되어 있고, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 더욱 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고,
조성물에 존재하는 대장균 항원 다당류는 O1A, O2, O4-Glc+, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75으로 구성된다. 바람직하게는, 담체 단백질은 P. 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA-4)이고, 더욱 바람직하게는 EPA-4는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, O75 항원 다당류 대 O1A, O2 및/또는 O6A 항원 다당류의 농도비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다. 바람직하게는 조성물에 존재하는 대장균 항원 다당류는 1:1:1:1:1:1:1:2:2의 비의 O1A, O2, O4-Glc+, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75로 구성된다.
하나의 일반 양태에서, 대장균 O75 및 O6 항원 다당류를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 농도비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 2.5:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
특정 구현예에서, 조성물은 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고,
바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다.
특정 구현예에서,
대장균 O1 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O1A)의 구조를 포함하고,
대장균 O2 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O2)의 구조를 포함하고,
대장균 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고,
대장균 O6 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O6A)의 구조를 포함하고,
대장균 O15 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O15)의 구조를 포함하고,
대장균 O16 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O16)의 구조를 포함하고,
대장균 O18 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O18A)의 구조를 포함하고,
대장균 O25 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O25B)의 구조를 포함하고,
대장균 O75 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O75)의 구조를 포함하고,
여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 대장균 항원 다당류의 중량비는 1:1:1:1:1:1:1:2:2이다.
특정 구현예에서, O75 항원 다당류의 농도는 약 8 내지 50 μg/mL, 바람직하게는 12 내지 40 μg/mL, 예를 들어, 16 내지 32 μg/mL, 바람직하게는 약 32 μg/mL이다.
특정 구현예에서, 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 적어도 하나의 추가 대장균 항원 다당류를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가 대장균 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O8)을 갖는 O8 항원 다당류를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, 각각의 담체 단백질은 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, S. 아우레우스의 탈독소화된 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 대장균 열 민감 장독소의 탈독소화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 탈독소화된 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 담체 단백질은 슈도모나스 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA) 또는 CRM197이다.
특정 구현예에서, 담체 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 1 내지 20개, 예컨대 1 내지 10개 또는 2 내지 4개의 글리코실화 공통 서열, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 공통 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 담체 단백질은 4개의 글리코실화 공통 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA이다.
특정 구현예에서, 대장균 항원 다당류는 생체접합에 의해 또는 화학적 접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합된다. 화학적 접합은 예를 들어 환원적 아민화 화학(RAC), 단일 말단 접합, (2-((2-옥소에틸)티오)에틸) 카바메이트(eTEC) 스페이서와의 접합, ADH 스페이서를 이용한 또는 ADH 스페이서 없는 시아닐화 화학(CNBr, CDAP), 티오에테르 화학(말레이미드/브로모아세틸 링커 기반), 또는 EDC-N-하이드록시 숙신이미드 제로 링커 화학을 포함한다.
특정 구현예에서, 대장균 항원 다당류는 생체접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합되며, 바람직하게는 다당류는 담체 단백질의 글리코실화 부위의 Asn 잔기에 공유 결합된다.
또 다른 양태에서, 조성물이 본원에 제공되며, 조성물은 P.애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA-4) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O1A 항원 다당류는 화학식 (O1A)의 구조를 포함한다);
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O2 항원 다당류는 화학식 (O2)의 구조를 포함한다);
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함한다);
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O6A 항원 다당류는 화학식 (O6A)의 구조를 포함한다);
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O15 항원 다당류는 화학식 (O15)의 구조를 포함한다);
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O16 항원 다당류는 화학식 (O16)의 구조를 포함한다);
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O18A 항원 다당류는 화학식 (O18A)의 구조를 포함한다);
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O25B 항원 다당류는 화학식 (O25B)의 구조를 포함한다); 및
EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O75 항원 다당류는 화학식 (O75)의 구조를 포함한다)를 포함하고,
여기서 EPA-4는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고,
화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조 각각은 표 1에 제시되어 있고, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 더욱 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고,
O75 항원 다당류 대 O6A 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
특정 구현예에서, 조성물은 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체를 포함하며, 여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체는 다음을 포함하는 대장균 세포에서 생산되었다:
(i) 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
(ii) 서열번호 4와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 글루코실 트랜스퍼라제는 대장균 O4 항원을 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생산할 수 있다);
(iii) 서열번호 7 및 8과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 및 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 트랜스로카제는 박토프레놀 연결된 글루코스를 전위시킬 수 있고 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화할 수 있다);
(iv) 담체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
(v) 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 담체 단백질에 공유 결합시킬 수 있는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(바람직하게는 올리고사카릴 트랜스퍼라제가 캄필로박터 제주니로부터의 PglB이다).
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 수은 유도체 티메로살과 같은 보존제를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 0.001% 내지 0.01%의 티메로살을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)은 아쥬반트를 포함하거나, 아쥬반트와 조합하여 투여된다. 본원에 기재된 조성물과 조합하여 투여하기 위한 아쥬반트는 상기 조성물의 투여 전에(예를 들어, 72시간, 48시간, 24시간, 12시간, 6시간, 2시간, 1시간, 10분 이내), 동시에 또는 이후에(예를 들어, 72시간, 48시간, 24시간, 12시간, 6시간, 2시간, 1시간, 10분 이내) 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, “아쥬반트”라는 용어는 본원에 기재된 조성물과 함께 또는 이의 일부로 투여되는 경우 생체접합체에 대한 면역 반응을 증강, 증진시키고/시키거나 촉진하지만, 아쥬반트 화합물이 단독으로 투여되는 경우에는 생체접합체에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아쥬반트는 생체접합체 펩티드에 대해 면역 반응을 일으키고 알레르기 또는 다른 부작용을 일으키지 않는다. 아쥬반트는 예를 들어 림프구 모집, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 포함하는 몇몇 메커니즘에 의해 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 생체접합체 이외의 아쥬반트를 포함하지 않고/않거나, 생체접합체 이외의 아쥬반트와 함께 투여되지 않는다(생체접합체가 일부 고유 아쥬반트 특성을 포함하는 경우, 이들은 무시되고 외인성 아쥬반트가 이러한 구현예에서 첨가될 것이다).
적합한 아쥬반트의 예에는 비제한적으로 알루미늄 염(알룸)(예컨대 알룸 또는 나노알룸 제형을 포함하는 나노입자를 포함하는, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트, 및 알루미늄 옥사이드), 칼슘 포스페이트, 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(예를 들어, GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919 참조), AS01, AS02, AS03 및 AS04(모두 GlaxoSmithKline; 예를 들어 AS04에 대해 EP1126876, US7357936, AS02에 대해 EP0671948, EP0761231, US5750110 참조), MF59(Novartis), 이미다조피리딘 화합물(WO2007/109812 참조), 이미다조퀴녹살린 화합물(WOWO2007/109813 참조), 델타-이눌린, STING-활성화 합성 사이클릭-디-뉴클레오타이드(예를 들어 US20150056224), 레시틴과 카보머 동종중합체의 조합(예를 들어 US6676958), 및 사포닌, 예컨대 QuilA 및 QS21(예를 들어, 문헌[Zhu D and W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113] 참조), 선택적으로 QS7과 조합한 Matrix M, Iscoms, Iscomatrix 등(문헌[Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)]; 미국 특허 제5,057,540호 참조)을 포함한다. 일부 구현예에서, 아쥬반트는 프로인드 아쥬반트(완전 또는 불완전)이다. 다른 아쥬반트로는 수중유 에멀젼(예컨대 스쿠알렌 또는 땅콩유)(선택적으로 면역 자극제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A와 조합됨)이 있다(문헌[Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)] 참조). 또 다른 아쥬반트는 CpG이다. 아쥬반트의 추가 예는 면역 자극제, 예컨대 AS01E 및 AS01B에서와 같이 MPL 및 QS21을 함유하는 리포좀이다(예를 들어 US 2011/0206758). 아쥬반트의 다른 예는 이미다조퀴놀린(예컨대, 이미퀴모드 및 R848)이다. 예를 들어, 문헌[Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608] 참조. 특정 구현예에서, 아쥬반트는 톨(toll)-유사 수용체 4(TLR4) 효능제를 함유한다. TLR4 효능제는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807] 참조. 특정 구현예에서, 아쥬반트는 지질 A를 포함하는 TLR4 효능제, 또는 이의 유사체 또는 유도체, 예컨대 MPL, 3D-MPL, RC529(예를 들어, EP1385541), PET-지질 A, GLA(글리코피라노실 지질 아쥬번트, 합성 이당류 당지질; 예를 들어, US20100310602, US8722064), SLA(예를 들어, 문헌[Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: e108 (doi: 10.1038/cti.2016.63)]으로서, 이는 인간 백신을 위한 TLR4 리간드를 최적화시키기 위한 구조-기능 접근법을 기술함), PHAD(포스포릴화된 헥사아실 이당류), 3D-PHAD(이의 구조는 GLA의 구조와 동일함), 3D-(6-아실)-PHAD (3D(6A)-PHAD) (PHAD, 3D-PHAD 및 3D(6A)PHAD는 합성 지질 A 변이체이며, 예를 들어, 이들 분자의 구조를 또한 제공하는 avantilipids.com/divisions/adjuvants 참조), E6020(CAS 번호 287180-63-6), ONO4007, OM-174 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 아쥬반트를 포함하지 않으며, 아쥬반트와 조합하여 투여되지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 대상체로의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 피하, 비경구, 경구, 피내, 경피, 결장직장, 복강내 및 직장 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 제약 조성물은 정맥내, 경구, 복강내, 비강내, 기관내, 피하, 근육내, 국소, 피내, 경피 또는 폐 투여를 위해 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 근육내 주사에 의해 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 하나 이상의 완충액, 예를 들어, Tris-완충 식염수, 인산염 완충액, 또는 수크로스 포스페이트 글루타메이트 완충액을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 하나 이상의 염, 예를 들어, 트리스-하이드로클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 포스페이트, 모노나트륨 글루타메이트, 또는 알루미늄 염(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 칼륨 알루미늄 설페이트, 또는 이러한 알루미늄 염의 혼합물)을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 사용 전에 보관될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 냉동 보관되거나(예를 들어, 약 -20℃ 또는 약 -70℃에서); 냉장 조건에서 보관되거나(예를 들어, 약 4℃에서); 실온에서 보관될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이는 필요한 O 항원 접합체 각각을 제공하고(예를 들어, 이들을, 예를 들어, 원료 의약품의 형태로 얻거나 제조함으로써), 본 발명의 조성물(예를 들어, 다가 대장균, 특히 ExPEC, 백신 조성물, 때때로 완제 의약품으로 지칭됨)을 얻기 위해 원하는 비율 및/또는 양으로 혼합하는 단계를 포함한다.
면역학적 반응의 유도 방법
본원에 제공된 생체접합체 및 조성물은 대상체에서 대장균 O 항원에 대한 항체를 유도하거나 대장균에 대해 대상체를 백신접종하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법은 O 항원이 조성물(들)에 존재하는 ExPEC 균주에 의한 감염에 대해 대상체를 백신접종하는 결과를 낳는다. O 항원 서브타입이 사용되는 경우, 본 발명의 방법은 또한 유사한 항원성을 갖는 또 다른 O 항원 서브타입에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 예는 하위 혈청형 사이의 교차 반응성이다. 예를 들어, O25B 항원으로의 면역화는 O25B 및 O25A 혈청형의 O-LPS를 인식하는 항체를 유도하고, 글루코실화된 O4로의 면역화는 글루코실화된 O4 및 비글루코실화된 O4 혈청형의 O-LPS를 인식하는 항체를 유도하며, 또 다른 예에서는 서로 다른 O 항원을 갖지만 여전히 항원 구조에서 약간의 유사성을 공유하는 다른 혈청형에 대한 교차 면역화가 존재할 수도 있다(예를 들어, 일부 혈청은 혈청형 연구에서 교차 반응하는 것으로 나타남).
일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 ExPEC 감염 또는 침습성 ExPEC 질환이 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 인간이다.
일부 구현예에서, 침습성 ExPEC 질환은 패혈증을 포함한다. 일부 구현예에서, 침습성 ExPEC 질환은 균혈증을 포함한다. 일부 구현예에서, 침습성 ExPEC 질환은 요로 감염, 수술 부위 감염, 복부 또는 골반 감염, 폐렴, 골수염, 연조직염, 패혈증, 균혈증, 상처 감염, 신우신염, 수막염, 복막염, 담관염, 연조직 감염, 화농성 근염, 패혈성 관절염, 안내염, 화농성 갑상선염, 부비동염, 심내막염 및 전립선염 중 하나 이상을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물의 투여 후 대상체에서 유도된 면역 반응은 대상체에서 침습성 ExPEC 질환의 중증도를 제한하거나 침습성 ExPEC 질환을 예방한다. 일 구현예에서, 대상체는 투여 시점에 대장균(예를 들어, ExPEC) 감염이 있다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 투여 시점에 대장균(예를 들어, ExPEC) 감염이 없다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물의 투여 후 대상체에서 유도된 면역 반응은 조성물이 투여된 대상체의 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%에서 ExPEC 감염으로 인한 증상을 예방 또는 감소시키는 데 효과적이다. ExPEC 감염의 증상은 감염의 특성에 따라 달라질 수 있고, 배뇨장애, 증가된 소변 빈도 또는 절박, 고름뇨, 혈뇨, 요통, 골반통, 소변 동안의 통증, 열, 오한, 및/또는 구역(예를 들어, ExPEC에 의해 야기된 요로 감염을 갖는 대상체에서); 고열, 두통, 목 경직, 구역, 구토, 발작, 졸림, 및/또는 빛 민감성(예를 들어, ExPEC에 의해 야기된 수막염이 있는 대상체에서); 열, 증가된 심박수, 증가된 호흡률, 감소된 소변 배출량, 감소된 혈소판 수, 복통, 호흡 곤란, 및/또는 비정상적인 심장 기능(예를 들어, ExPEC에 의해 야기된 패혈증이 있는 대상체)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물의 투여 후 대상체에서 유도된 면역 반응은 ExPEC 감염을 앓고 있는 대상체의 입원 가능성을 감소시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물의 투여 후 대상체에서 유도된 면역 반응은 ExPEC 감염을 앓고 있는 대상체의 입원 기간을 감소시키는 데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물을 사용한 백신접종은 침습성 ExPEC 질환(IED), 예를 들어 요로패혈증, 균혈증, 패혈증 등을 예방하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 백신접종은 요로 감염의 발생 또는 중증도를 예방하거나 감소시키기 위한 것이다. 특정 구현예에서, IED는 병원에서 획득할 수 있다. 예를 들어, 비뇨 생식기 및/또는 복부 시술 또는 수술을 받는 환자에서 획득할 수 있다. 특정 구현예에서, IED는 예를 들어 중심선, 카테터 등을 통해 다른 병태로 건강 관리를 받는 환자에서, 예를 들어, 병원, 외래 수술 센터, 말기 신장 질환 시설, 장기 요양 시설 등에서, 의료 관련된 것일 수 있다. 특정 구현예에서, IED는 예를 들어, 최근에 의료 위험에 노출되지 않은 환자에서, 지역사회에서 획득할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 본원에 기재된 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 대상체에게 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제2 유효량의 대장균 O6 항원 다당류를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 예를 들어 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다. 일부 바람직한 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O6 항원 다당류는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 대안적인 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O6 항원 다당류는 개별 조성물의 조합물로서 투여된다.
일부 구현예에서, 대상체에서 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된다. 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4 항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다. 바람직하게는 O1-, O2-, O4-, O6-, O15-, O16-, O18-, O25- 및 O75-항원은 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 가지며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 본 발명에 따르면, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다. 일부 구현예에서, 방법은 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 이러한 추가 대장균 항원은 바람직하게는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O8)의 구조를 갖는 O8 항원 다당류를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, 담체 단백질에 공유 결합된 각각의 대장균 항원 다당류는 생체접합체이다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 2개 이상의 개별 조성물의 조합물로서 투여된다. 개별 투여 횟수를 제한하는 것이 바람직하므로 대부분 또는 모든 항원을 포함하는 단일 조성물을 사용하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을 투여하는 방법으로서, 여기서 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체를 포함하고, 투여되는 O75 항원 다당류의 농도는 용량당 적어도 16 μg이다.
일부 구현예에서, 대상체에서 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 대상체에게 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제2 유효량의 대장균 O1 항원 다당류를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 예를 들어 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다. 일부 바람직한 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O1 항원 다당류는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 대안적인 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O1 항원 다당류는 조성물의 조합물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 대장균 O2, O4, O6, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된다. 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4 항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다. 바람직하게는 O1-, O2-, O4-, O6-, O15-, O16-, O18-, O25- 및 O75-항원은 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 가지며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 본 발명에 따르면, O75 항원 다당류 대 O1 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다. 일부 구현예에서, 방법은 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 이러한 추가 대장균 항원은 바람직하게는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O8)의 구조를 갖는 O8 항원 다당류를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, 담체 단백질에 공유 결합된 각각의 대장균 항원 다당류는 생체접합체이다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 2개 이상의 개별 조성물의 조합물로서 투여된다. 개별 투여 횟수를 제한하는 것이 바람직하므로 대부분 또는 모든 항원을 포함하는 단일 조성물을 사용하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 대상체에서 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 대상체에게 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제2 유효량의 대장균 O2 항원 다당류를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 예를 들어 약 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다. 일부 바람직한 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O2 항원 다당류는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 대안적인 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O2 항원 다당류는 조성물의 조합물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 대장균 O1, O4, O6, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된다. 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4 항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다. 바람직하게는 O1-, O2-, O4-, O6-, O15-, O16-, O18-, O25- 및 O75-항원은 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 가지며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 본 발명에 따르면, O75 항원 다당류 대 O2 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다. 일부 구현예에서, 방법은 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질에 공유 결합된 각각의 대장균 항원 다당류는 생체접합체이다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 2개 이상의 개별 조성물의 조합물로서 투여된다. 개별 투여 횟수를 제한하는 것이 바람직하므로 대부분 또는 모든 항원을 포함하는 단일 조성물을 사용하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 대상체에서 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 대상체에게 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제1 유효량의 대장균 O25 항원 다당류를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1:4 및 1:0.5이고, 바람직하게는 약 1:2 내지 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1:1, 예를 들어, 약 1:1.5, 1:1.4, 1:1.3, 1:1.2, 1:1.1, 1:1.0, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 또는 1:0.5이다. 일부 바람직한 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O25 항원 다당류는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 대안적인 구현예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 O75 항원 다당류 및 담체 단백질에 공유 결합된 O25 항원 다당류는 조성물의 조합물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 대장균 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된다. 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4 항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다. 바람직하게는 O1-, O2-, O4-, O6-, O15-, O16-, O18-, O25- 및 O75-항원은 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 가지며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 본 발명에 따르면, O75 항원 다당류 대 O25 항원 다당류의 비는 약 1:4 내지 약 1:0.5, 바람직하게는 약 1:2 내지 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1:1이다. 일부 구현예에서, 방법은 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 이러한 추가 대장균 항원은 바람직하게는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O8)의 구조를 갖는 O8 항원 다당류를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, 담체 단백질에 공유 결합된 각각의 대장균 항원 다당류는 생체접합체이다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 하나의 조성물로서 투여된다. 일부 구현예에서, 생체접합체는 2개 이상의 개별 조성물의 조합물로서 투여된다. 개별 투여 횟수를 제한하는 것이 바람직하므로 대부분 또는 모든 항원을 포함하는 단일 조성물을 사용하는 것이 바람직하다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물, 조합물 및 생체접합체는 항체, 바람직하게는 옵소닌 식세포 활성을 갖는 항체의 생성을 포함하는 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 기술(예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피, 원심분리, 침전 등)을 사용하여 단리될 수 있다.
대상체에서 면역 반응을 생성하는 본원에 기재된 생체접합체 및 조성물의 능력은 당업자에게 공지되거나 본원에 기재된 임의의 접근법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 생체접합체의 능력은 본원에 기재된 생체접합체로 대상체(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이) 또는 일련의 대상체를 면역화하고 대조군(예컨대, PBS)으로 추가 대상체(예컨대, 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이) 또는 일련의 대상체를 면역화함으로써 평가될 수 있다. 대상체 또는 일련의 대상체는 후속적으로 ExPEC으로 챌린지될 수 있고 대상체 또는 일련의 대상체에서 질환(예컨대, UTI, 균혈증 또는 기타 질환)을 유발하는 ExPEC의 능력이 결정될 수 있다. 당업자는 대조군으로 면역화된 대상체 또는 일련의 대상체가 ExPEC으로 챌린지 후 질환에 걸리지만, 본원에 기재된 생체접합체(들) 또는 이의 조성물로 면역화된 대상체 또는 일련의 대상체는 질환을 덜 앓거나 앓지 않는 경우, 생체접합체가 대상체에서 면역 반응을 생성할 수 있음을 인식할 것이다. ExPEC으로부터의 O 항원과 교차 반응하는 항혈청을 유도하는 본원에 기재된 생체접합체(들) 또는 이의 조성물의 능력은 예를 들어, 면역분석법, 예컨대 ELISA(예를 들어, 문헌[Van den Dobbelsteen et al, 2016, Vaccine 34: 4152-4160] 참조) 또는 ECL 기반 면역분석법에 의해 테스트될 수 있다.
예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 본원에 기재된 생체접합체의 능력은 혈청 살균 분석(SBA) 또는 옵소닌 식세포 살상 분석(OPK 분석, 또는 OPKA)을 사용하여 평가될 수 있으며, 이는 당접합체 기반 백신의 승인을 얻는 데 사용된, 확립된 허용되는 방법을 대표한다. 이러한 분석법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 간략하게는 대상체(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이)에게 이러한 항체를 유발하는 화합물을 투여함으로써 관심 표적(예를 들어, O 항원 다당류, 예를 들어 대장균 O75 항원 다당류)에 대한 항체를 생성하고 단리하는 단계를 포함한다. 이어서, 항체의 살균 능력은 예를 들어, 항체 및 보체 및 - 분석법에 따라 - 호중구 세포의 존재 하에 문제의 박테리아(예를 들어, 관련 혈청형의 대장균)를 배양하고, 예를 들어, 표준 미생물학적 접근법을 사용하여 박테리아의 살상 및/또는 중화를 매개하는 항체의 능력을 분석함으로써 평가될 수 있다. 대장균 생체접합체 백신에 대한 OPK 분석법의 예는, 예를 들어, 문헌[Abbanat et al, 2017, Clin. Vaccine Immunol. 24: e00123-17] 참조. OPK 분석법은 모노플렉스 또는 멀티플렉스 형식으로 수행될 수 있으며, 이 중 멀티플렉스 형식(예를 들어, 동시에 다중 혈청형 테스트)이 전형적으로 선호된다. 멀티플렉스 OPK 분석법은 때때로 본원에서 "MOPA"로 지칭된다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 조성물은 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체 및 적어도 대장균 O6A 항원 다당류의 생체접합체를 포함하며, 대장균 O75 항원 다당류의 유효량은 조성물에 존재하는 임의의 다른 생체접합체의 농도보다 약 1.2 내지 8배, 예를 들어, 약 2 내지 4배, 예컨대 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8배 높다. 이러한 구현예에서, 대장균 O75 항원 다당류의 유효량은 예를 들어 투여당 약 5 내지 18 μg, 예컨대 투여당 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 μg이다. 바람직하게는, 약 8 내지 16 μg의 O75 항원 다당류가 투여당 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 하나 이상의 다른 치료법(예를 들어, 항균 또는 면역조절 요법)과 조합하여 대상체에게 투여된다. 하나 이상의 다른 치료법은 ExPEC 감염의 치료 또는 예방에 유익할 수 있거나, 또는 ExPEC 감염과 관련된 증상 또는 병태를 개선할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다른 치료법은 진통제 또는 해열제이다. 특정 구현예에서, 치료법은 5분 미만 내지 1주 미만의 간격으로 투여된다. 당업자에게 공지된 임의의 항균제(예를 들어, 항생제)가 본원에 기재된 조성물과 조합하여 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 생체접합체 또는 조성물은 대상체에게 1회 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 생체접합체 또는 조성물은 대상체에게 1회 초과하여, 예를 들어 프라임-부스트 요법으로 투여된다. 특정 구현예에서, 2회 투여 사이의 시간은 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년 또는 적어도 15년이다. 인간에서, 원하는 면역 반응은 전형적으로 본 발명에 따른 생체접합체 또는 조성물의 단일 투여에 의해 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어 10년 후 반복 투여가 제공된다.
본원에 제공된 조성물은 대상체에서 대장균 O 항원에 대한 항체를 유도하고 대장균, 특히 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대해 대상체를 백신접종하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "대상체"는 본원에 제공된 생체접합체 또는 조성물을 투여받게 될 또는 투여받은 임의의 동물, 바람직하게는 포유류를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "포유류"는 임의의 포유류를 포괄한다. 포유류의 예로는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이 또는 유인원과 같은 비인간 영장류(NHP), 인간 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 인간 대상체는 임의의 연령일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 약 2개월 내지 약 18세, 예를 들어 1세 내지 18세의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 적어도 18세의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 15세 내지 50세, 예를 들어, 18세 내지 45세, 예를 들어, 20세 내지 40세의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 남성이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 여성이다. 특정 구현예에서, 대상체는 면역저하자이다. 특정 구현예에서, 대상체는 적어도 50세, 적어도 55세, 적어도 60세, 적어도 65세의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 100세 이하, 95세 이하, 90세 이하, 85세 이하, 80세 이하 또는 75세 이하의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 60세 이상 85세 이하의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 안정적인 건강 상태의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 안정적인 건강 상태의 60세 이상 85세 이하의 인간 성인이다. 특정 구현예에서, 대상체는 요로 감염(UTI, 즉 요도, 방광, 요관 및/또는 신장에서의 박테리아 감염; 일부 구현예에서 이는 신우신염을 포함함)의 병력이 있는, 즉, 자신의 삶에서 적어도 1회의 UTI 에피소드가 있었던 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 지난 20년, 15년, 12년, 10년, 9년, 8년, 7년, 6년, 5년, 4년, 3년, 2년 또는 1년 동안 UTI의 병력이 있는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 재발성 UTI의 병력이 있는, 즉 6개월 동안 적어도 2회의 UTI 또는 1년 동안 적어도 3회의 UTI가 있었던 인간 대상체이다. 특정 구현예에서, 대상체는 지난 2년 동안 재발성 UTI의 병력이 있는 인간 대상체이다. 특정 구현예에서, 대상체는 안정적인 건강 상태의 60세 이상의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 60세 이상의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 60세 이상 75세 미만의 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 75세 이상의 인간 대상체이다. 특정 구현예에서, 대상체는 선택적 비뇨생식기 및/또는 복부 시술 또는 수술, 예를 들어 경직장 초음파 유도 전립선 바늘 생검(TRUS-PNB)을 받도록 예정된 환자이다. 특정 구현예에서, 대상체는 급성 세균성 전립선염(ABP)을 포함하는 전립선염, 즉 전립선의 세균 감염의 병력이 있는, 즉, 자신의 삶에서, 예를 들어, 지난 10년, 9년, 8년, 7년, 6년, 5년, 4년, 3년, 2년 또는 1년 동안 적어도 1회의 전립선염 에피소드가 있었던 인간이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 면역 반응을 유도하는 조성물 또는 방법에 의해 유도된 면역 반응은 옵소닌 식세포 활성을 갖는 항체를 포함한다. 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원 다당류(즉, 대장균 O 항원의 당접합체)를 포함하는 조성물이 인간에서 이러한 유형의 기능적 항체를 유도할 수 있는 것으로 나타났으며, 이러한 항체는 생체 내에서 세균성 살상을 매개하고 이 메커니즘을 통해 대장균 감염으로부터 보호할 수 있는 것으로 나타났다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대해 대상체를 백신접종하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 대장균, 바람직하게는 ExPEC에 대한 항체를 유도하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 대장균, 바람직하게는 ExPEC에 대한 백신접종에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 대상체에서 대장균, 바람직하게는 ExPEC에 대한 항체를 유도하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 용도가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 대장균, 바람직하게는 ExPEC에 대해 대상체를 백신접종하기 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 용도가 본원에 제공된다.
특정 양태에서, 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 대상체에게 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제2 유효량의 대장균 O6 항원 다당류를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
특정 구현예에서, 면역 반응은 대상체에서 침습성 ExPEC 질환의 중증도를 제한하거나 침습성 ExPEC 질환을 예방한다.
특정 구현예에서, 침습성 ExPEC 질환은 패혈증 및/또는 균혈증을 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고,
바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이고,
더욱 바람직하게는 각각의 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고,
O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
특정 구현예에서, 방법은 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 대상체는 대장균(바람직하게는 ExPEC) 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환이 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 인간이다.
특정 구현예에서, 약 8~16 μg, 바람직하게는 약 16 μg의 O75 항원 다당류가 투여당 투여된다.
특정 구현예에서, O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 투여되는 대장균 항원 다당류의 중량비는 1:1:1:1:1:1:1:2:2이다.
특정 구현예에서, 글루코실화된 O4는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체이고, 여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체는 다음을 포함하는 대장균 세포에서 생산되었다:
(i) 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
(ii) 서열번호 4와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 글루코실 트랜스퍼라제는 대장균 O4 항원을 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생산할 수 있다);
(iii) 서열번호 7 및 8과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 및 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 트랜스로카제는 박토프레놀 연결된 글루코스를 전위시킬 수 있고 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화할 수 있다);
(iv) 담체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
(v) 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 담체 단백질에 공유 결합시킬 수 있는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(바람직하게는 올리고사카릴 트랜스퍼라제가 캄필로박터 제주니로부터의 PglB이다).
일 양태에서, 본 발명은 또한 대장균 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18, O25 및 O75 항원 다당류(각각의 항원에 대해 각각 상기 표시된 바와 같은 구조를 가짐)를 포함하는 조성물을 제공하며, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되며, 이 조성물은 담체 단백질에 공유 결합된 다른 대장균 O 항원 다당류를 포함하지 않는다(즉, 9가 조성물). 이 양태의 특정 구현예에서, 담체 단백질은 EPA이다. 이 양태의 다른 구현예에서, 담체 단백질은 CRM197이다. 이 양태의 특정 구현예에서, 공유 결합은 화학적 접합의 결과이다. 다른 구현예에서, 공유 결합은 생체접합의 결과이다. 이 양태의 특정 구현예에서, 담체 단백질은 CRM197이고 공유 결합은 화학적 접합의 결과이다. 이 양태의 다른 구현예에서, 담체 단백질은 EPA이고 공유 결합은 생체접합의 결과이다. 이 양태의 바람직한 구현예에서, 조성물은 O1, O2 또는 O6 항원 다당류와 비교하여, 바람직하게는 O1, O2 및 O6 항원 다당류의 각각의 하나와 비교하여, 증가된 양의 대장균 O75 항원 다당류, 바람직하게는 약 1.5 내지 4배 증가된, 바람직하게는 약 2배 증가된 양을 포함한다.
구현예
구현예 1은 대장균 O75 항원 다당류 및, O1, O2, O4, O6, O15, O16 및 O18로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 조성물로서, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 항원 다당류 대 추가의 O 항원 다당류의 농도비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 2.5:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 1a는 구현예 1의 조성물로서, 적어도 하나의 추가 O 항원 다당류는 O1, 바람직하게는 O1A이다.
구현예 1a1은 구현예 1a의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O1 항원 다당류의 농도비는 2:1이다.
구현예 1b는 구현예 1의 조성물로서, 적어도 하나의 추가 O 항원 다당류는 O2이다.
구현예 1b1은 구현예 1b의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O1 항원 다당류의 농도비는 2:1이다.
구현예 1c는 구현예 1의 조성물로서, 적어도 하나의 추가 O 항원 다당류는 O4, 바람직하게는 글루코실화된 O4이다.
구현예 1c1은 구현예 1c의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O4 항원 다당류의 농도비는 2:1이다.
구현예 1d는 구현예 1의 조성물로서, 적어도 하나의 추가 O 항원 다당류는 O6, 바람직하게는 O6A이다.
구현예 1d1은 구현예 1d의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 농도비는 2:1이다.
구현예 1e는 구현예 1의 조성물로서, 적어도 하나의 추가 O 항원 다당류는 O15이다.
구현예 1e1은 구현예 1e의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O15 항원 다당류의 농도비는 2:1이다.
구현예 1f는 구현예 1의 조성물로서, 적어도 하나의 추가 O 항원 다당류는 O16이다.
구현예 1f1은 구현예 1f의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O16 항원 다당류의 농도비는 2:1이다.
구현예 1g는 구현예 1의 조성물로서, 적어도 하나의 추가 O 항원 다당류는 O18, 바람직하게는 O18A이다.
구현예 1g1은 구현예 1g의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O18 항원 다당류의 농도비는 2:1이다.
구현예 1h는 구현예 1의 조성물로서, 담체 단백질에 독립적으로 공유 결합된 O25 항원 다당류를 추가로 포함하고, 바람직하게는 O25 항원은 O25B이다.
구현예 1h1은 구현예 1h의 조성물로서, O75 항원 다당류 대 O25 항원 다당류의 농도비는 1:1이다.
구현예 2는 구현예 1의 조성물로서, 조성물은 대장균 O75 항원 다당류 및, 대장균 O1, O2, O4, O6, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 2개 이상, 바람직하게는 모두를 포함하며, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이다.
구현예 3은 구현예 2의 조성물로서,
(i) 대장균 O1 항원 다당류는 화학식 (O1A)의 구조를 포함하고
[화학식 (O1A)]
Figure pct00004
,
(ii) 대장균 O2 항원 다당류는 화학식 (O2)의 구조를 포함하고
[화학식 (O2)]
Figure pct00005
,
(iii) 대장균 O4 항원 다당류는 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고
[화학식 (O4-Glc+)]
Figure pct00006
,
(iv) 대장균 O6 항원 다당류는 화학식 (O6A)의 구조를 포함하고
[화학식 (O6A)]
Figure pct00007
,
(v) 대장균 O15 항원 다당류는 화학식 (O15)의 구조를 포함하고
[화학식 (O15)]
Figure pct00008
,
(vi) 대장균 O16 항원 다당류는 화학식 (O16)의 구조를 포함하고
[화학식 (O16)]
Figure pct00009
,
(vii) 대장균 O18 항원 다당류는 화학식 (O18A)의 구조를 포함하고
[화학식 (O18A)]
Figure pct00010
,
(viii) 대장균 O25 항원 다당류는 화학식 (O25B)의 구조를 포함하고
[화학식 (O25B)]
Figure pct00011
, 및
(ix) 대장균 O75 항원 다당류는 화학식 (O75)의 구조를 포함하고
[화학식 (O75)]
Figure pct00012
,
여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구현예 4는 구현예 2 또는 3의 조성물로서, O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 대장균 항원 다당류의 중량비는 1:1:1:1:1:1:1:2:2이다.
구현예 5는 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 조성물로서, O75 항원 다당류의 농도는 약 8 내지 약 50 μg/mL, 바람직하게는 12 내지 40 μg/mL, 예를 들어, 16 내지 32 μg/mL, 바람직하게는 약 26 내지 38 μg/mL, 바람직하게는 약 32 μg/mL이다.
구현예 6은 구현예 1 내지 5 중 어느 하나의 조성물로서, 담체 단백질에 공유 결합된 적어도 하나의 다른 추가 대장균 항원 다당류를 추가로 포함한다.
구현예 7은 구현예 6의 조성물로서, 하나의 다른 추가 대장균 항원 다당류는 화학식 (O8)을 갖는 O8 항원 다당류를 포함하고
[화학식 (O8)]
Figure pct00013
,
여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구현예 8은 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 조성물로서, 각각의 담체 단백질은 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, S. 아우레우스의 탈독소화된 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 대장균 열 민감 장독소의 탈독소화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 탈독소화된 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
구현예 9는 구현예 8의 조성물로서, 담체 단백질은 슈도모나스 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA) 또는 CRM197이다.
구현예 10은 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 조성물로서, 담체 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 1 내지 20개, 예컨대 1 내지 10개 또는 2 내지 4개의 글리코실화 공통 서열, 예컨대 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 공통 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 담체 단백질은 4개의 글리코실화 공통 서열을 포함한다.
구현예 11은 구현예 1 내지 10 중 어느 하나의 조성물로서, 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA이다.
구현예 12는 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물로서, 대장균 항원 다당류는 생체접합 또는 화학적 접합, 예를 들어 환원적 아민화 화학(RAC), 단일 말단 접합, 또는 (2-((2-옥소에틸)티오)에틸) 카바메이트(eTEC) 스페이서와의 접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합된다.
구현예 13은 구현예 12의 조성물로서, 대장균 항원 다당류는 생체접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합되며, 바람직하게는 다당류는 담체 단백질의 글리코실화 부위의 Asn 잔기에 공유 결합된다.
구현예 14는 조성물로서,
(i) P.애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA-4) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O1A 항원 다당류는 화학식 (O1A)의 구조를 포함한다);
(ii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O2 항원 다당류는 화학식 (O2)의 구조를 포함한다);
(iii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함한다);
(iv) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O6A 항원 다당류는 화학식 (O6A)의 구조를 포함한다);
(v) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O15 항원 다당류는 화학식 (O15)의 구조를 포함한다);
(vi) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O16 항원 다당류는 화학식 (O16)의 구조를 포함한다);
(vii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O18A 항원 다당류는 화학식 (O18A)의 구조를 포함한다);
(viii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O25B 항원 다당류는 화학식 (O25B)의 구조를 포함한다); 및
(ix) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 생체접합체(여기서 대장균 O75 항원 다당류는 화학식 (O75)의 구조를 포함한다)를 포함하고,
여기서 EPA-4는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고,
화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조 각각은 표 1에 제시되어 있고, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 더욱 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고,
O75 항원 다당류 대 O6A 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 15는 구현예 14의 조성물로서, 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 추가로 포함한다.
구현예 16은 구현예 2 내지 15 중 어느 하나의 조성물로서, 글루코실화된 O4는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체이고, 여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체는 다음을 포함하는 대장균 세포에서 생산되었다:
(i) 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
(ii) 서열번호 4와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 글루코실 트랜스퍼라제는 대장균 O4 항원을 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생산할 수 있다);
(iii) 서열번호 7 및 8과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 및 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 트랜스로카제는 박토프레놀 연결된 글루코스를 전위시킬 수 있고 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화할 수 있다);
(iv) 담체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
(v) 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 담체 단백질에 공유 결합시킬 수 있는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(바람직하게는 올리고사카릴 트랜스퍼라제가 캄필로박터 제주니로부터의 PglB이다).
구현예 17은 대상체에게 구현예 1 내지 16 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 대장균(바람직하게는 장외 병원성 대장균, ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이다.
구현예 17a는 구현예 17의 방법으로서, 대상체는 상기 면역 반응을 필요로 한다.
구현예 18은 대상체에서 대장균(바람직하게는 장외 병원성 대장균, ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로, 대상체에게 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제2 유효량의 대장균 O6 항원 다당류를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 18a는 구현예 18의 방법으로서, 대상체는 상기 면역 반응을 필요로 한다.
구현예 19는 구현예 17 내지 18a 중 어느 하나의 방법으로서, 면역 반응은 대상체에서 침습성 ExPEC 질환의 중증도를 제한하거나 침습성 ExPEC 질환을 예방한다.
구현예 20은 구현예 19의 방법으로서, 침습성 ExPEC 질환은 패혈증 및/또는 균혈증을 포함한다.
구현예 20a는 구현예 20의 방법으로서, 침습성 ExPEC 질환은 패혈증을 포함한다.
구현예 20b는 구현예 20의 조성물로서, 침습성 ExPEC 질환은 균혈증을 포함한다.
구현예 21은 구현예 18 내지 20 중 어느 하나의 방법으로서, 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고,
바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이고,
더욱 바람직하게는 각각의 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 22는 구현예 18 내지 21 중 어느 하나의 방법으로서, 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예 23은 구현예 18 내지 22 중 어느 하나의 방법으로서, 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 24는 구현예 17 내지 23 중 어느 하나의 방법으로서, 대상체는 대장균(바람직하게는 ExPEC) 감염 또는 침습성 ExPEC 질환이 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 인간이다.
구현예 25는 구현예 17 내지 24 중 어느 하나의 방법으로서, 약 8~16 μg, 바람직하게는 약 16 μg의 O75 항원 다당류가 투여당 투여된다.
구현예 26은 구현예 21 내지 25 중 어느 하나의 방법으로서, O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 투여되는 대장균 항원 다당류의 중량비는 1:1:1:1:1:1:1:2:2이다.
구현예 27은 구현예 21 내지 26 중 어느 하나의 방법으로서, 글루코실화된 O4는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체이고, 여기서 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 생체접합체는 다음을 포함하는 대장균 세포에서 생산되었다:
(i) 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
(ii) 서열번호 4와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 글루코실 트랜스퍼라제는 대장균 O4 항원을 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생산할 수 있다);
(iii) 서열번호 7 및 8과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 및 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(여기서 트랜스로카제는 박토프레놀 연결된 글루코스를 전위시킬 수 있고 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화할 수 있다);
(iv) 담체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
(v) 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 담체 단백질에 공유 결합시킬 수 있는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(바람직하게는 올리고사카릴 트랜스퍼라제가 캄필로박터 제주니로부터의 PglB이다).
구현예 27은 대상체에서 대장균(바람직하게는 장외 병원성 대장균, ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 구현예 1 내지 16 중 어느 하나의 조성물이다.
구현예 28은 대상체에서 대장균(바람직하게는 장외 병원성 대장균, ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서 구현예 1 내지 16 중 어느 한 구현예의 조성물의 용도이다.
구현예 29는 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제2 유효량의 대장균 O6 항원 다당류의 조합물로서, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 29a는 구현예 29의 조합물로서, 제1 유효량 및 제2 유효량은 동일한 조성물에 존재한다.
구현예 29b는 구현예 29의 조합물로서, 제1 유효량 및 제2 유효량은 개별 조성물에 존재한다.
구현예 29c는 구현예 29 내지 29b 중 어느 하나의 조합물로서, 대상체는 상기 면역 반응을 필요로 한다.
구현예 30은 구현예 29 내지 29c 중 어느 하나의 조합물로서, 면역 반응은 대상체에서 침습성 ExPEC 질환의 중증도를 제한하거나 침습성 ExPEC 질환을 예방한다.
구현예 31은 구현예 30의 조합물로서, 침습성 ExPEC 질환은 패혈증 및/또는 균혈증을 포함한다.
구현예 32는 구현예 29 내지 31 중 어느 하나의 조합물로서, 유효량의 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 추가로 포함하고, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이고, 바람직하게는 각각의 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 33은 구현예 29 내지 32 중 어느 하나의 조합물로서, 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류의 유효량을 추가로 포함한다.
구현예 34는 구현예 29 내지 33 중 어느 하나의 조합물로서, 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 35는 구현예 29 내지 34 중 어느 하나의 조합물로서, 대상체는 대장균(바람직하게는 ExPEC) 감염 또는 침습성 ExPEC 질환이 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 인간이다.
구현예 36은 구현예 29 내지 35 중 어느 하나의 조합물로서, 유효량의 O75 항원 다당류는 약 8 내지 16 μg, 바람직하게는 약 16 μg이다.
구현예 37은 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서 제1 유효량의 대장균 O75 항원 다당류 및 제2 유효량의 대장균 O6 항원 다당류의 조합물로서, 여기서 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 제1 유효량 대 제2 유효량의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 37a는 구현예 37의 조합물로서, 대상체는 상기 면역 반응을 필요로 한다.
구현예 38은 구현예 37 또는 37a의 조합물로서, 면역 반응은 대상체에서 침습성 ExPEC 질환의 중증도를 제한하거나 침습성 ExPEC 질환을 예방한다.
구현예 39는 구현예 38의 조합물로서, 침습성 ExPEC 질환은 패혈증 및/또는 균혈증을 포함한다.
구현예 40은 구현예 37 내지 39 중 어느 하나의 조합물로서, 약제의 제조에서 유효량의 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25 항원 다당류 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 추가로 포함하고, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, 바람직하게는 O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이고, 바람직하게는 각각의 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고, O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 비는 약 1.2:1 내지 약 8:1, 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1이다.
구현예 41은 구현예 37 내지 40 중 어느 하나의 조합물로서, 약제의 제조에서 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 항원 다당류의 유효량을 추가로 포함한다.
구현예 42는 구현예 37 내지 41 중 어느 하나의 조합물로서, 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 43은 구현예 37 내지 42 중 어느 하나의 조합물로서, 대상체는 대장균(바람직하게는 ExPEC) 감염 또는 침습성 ExPEC 질환이 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 인간이다.
구현예 44는 구현예 37 내지 43 중 어느 하나의 조합물로서, 대상체에게 투여하기 위한 하나의 용량에서 유효량의 O75 항원 다당류는 약 8 내지 16 μg, 바람직하게는 약 16 μg이다.
실시예
실시예 1: 대장균 감염의 역학 데이터
균혈증 초래 대장균의 O 혈청형 분포를 결정하기 위해, 글로벌 감시 연구를 수행하였다. 2011년과 2017년 사이에 북미, 유럽, 아시아 태평양 지역 및 남미 국가에서 입원한 60세 이상의 환자로부터 3200개가 넘는 대장균 혈류 분리주를 수집하였다. 각 균주는 고전적 응집 기술 및 서열 기반 O 유전자형을 이용하여 O 항원 혈청형에 대해 분석되었다. 아래 표 2 참조.
분리된 인간 혈액 샘플을 분석하여 그 안의 병원체의 정체와 이들의 항생제 내성 패턴을 결정하였다. 대장균 분리주를 분석 후 샘플로부터 수득하였다. 대장균 정체를 MALDI-TOF MS에 의해 확인하였다. 대장균 분리주에 대한 추가 분석은 O 항원 혈청형을 결정하기 위해 항혈청 기반 응집 분석법을 사용하여 수행하였다(DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185). 응집 방법으로 유형화할 수 없는 분리주를 전체-게놈 시퀀싱에 이어서 O 혈청형 특이적 wzy 및 wzx 유전자 서열을 기반으로 하는 O 유전형 분석에 의해 추가로 분석하였다.
표 2.
응집에 의한 O 유전형 분석과 응집에 의해 유형화할 수 없는 분리주의 O 유전형 분석을 기반으로 한, 2011년에서 2017년 사이에 전 세계적으로 수집된 3217개 혈액 분리주의 컬렉션으로부터 가장 일반적인 균혈증 관련 대장균 O 혈청형의 분포 대상체는 다음 국가의 입원 대상체였다: 미국, 캐나다, 아르헨티나, 브라질, 영국, 독일, 스페인, 이탈리아, 네덜란드, 프랑스, 일본, 태국, 한국 및 호주.
Figure pct00014
전 세계의 균혈증 관련 대장균 세트에서 지리적 위치에 대한 계층화는 위치와 무관한 상위 10개 O 혈청형의 유병률을 보여주었으며, 이는 이들이 균혈증을 초래하는 대장균과 전 세계적으로 관련된 우세한 O 혈청형임을 시사한다.
전 세계의 균혈증 관련 다중 약물 내성 대장균 분리주(n=345), 즉 임상적으로 관련된 항미생물제의 적어도 3가지 부류에 내성이 있는 이러한 균주 세트에서, 상위 10개의 O 혈청형의 유병률은 75.4%이다.
역학 분석의 모든 정보를 종합하면, 유형화할 수 없는 균주의 하위부분을 내포한다고 가정할 경우 10개의 우세한 O 혈청형이 대장균 관련 균혈증 감염의 추정되는 60 내지 80%를 커버할 수 있다.
균혈증 초래 대장균 혈청형의 상당 부분을 커버하는 다가 백신은 매우 유용할 것이다. 따라서, 표 2의 O 혈청형은 O 항원 기반 다가 백신에 대한 좋은 후보가 될 것이다. 이러한 백신은 화학적 접합 또는 생체접합 기술을 사용하여 유리하게 제조될 수 있다.
실시예 2: 대장균 O 항원 생체접합체의 생산 및 생성된 생체접합체 제품.
대장균 O1A-EPA 생체접합체, O2-EPA 생체접합체, O4-Glc+-EPA 생체접합체(이하, 즉, 아래 실시예에서, O4-EPA라고도 함, O4 항원 다당류의 생체접합체는 O4가 글루코실화된 변이체로, 표 1에 제시된 글리칸 구조 (O4-Glc+)를 가짐; 대장균 글루코실화된 O4 항원을 생성하기 위한 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 특이적으로 변형할 수 있는 신규하고 지금까지 보고되지 않았으며 알려지지 않은 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 사용하여 이 변이체를 제조하는 것에 대한 설명은 본원에 참조로 포함된, 2020년 3월 18일 출원된 PCT/US20/23404에 자세히 제공되었다), O6A-EPA 생체접합체, O8-EPA 생체접합체, O15-EPA 생체접합체, O16-EPA 생체접합체, O18A-EPA 생체접합체, O25B-EPA 생체접합체 및 O75-EPA 생체접합체를 포함하는 10종의 생체접합체를 생산하였다. 이러한 접합체의 글리칸 구조는 표 1의 각각의 화학식에서 볼 수 있다. 10종의 생체접합체를 포함하는 조성물은 본원에서 'ExPEC10V'로 지칭된다. O1A-EPA, O2-EPA, O6A-EPA 및 O25B-EPA 생체접합체를 포함하는 조성물은 'ExPEC4V'로 지칭된다(이전에 예를 들어, WO 2015/124769 및 WO 2017/035181에 기재됨). 이들 10종의 생체접합체의 생산 및 이들 생체접합체에 대한 예시적인 생산 균주는 2020년 3월 18일에 출원된 PCT/US20/23404에 상세히 기술되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다.
대장균 W3110 모 균주
비병원성 대장균 K12 균주 W3110을 모든 10종의 생산 균주의 구축을 위한 모 균주로서 사용하였다. 대장균 K12 균주 W3110은 Coli Genetic Stock Center(예일대학교, 미국 (코네티컷 주) 뉴헤이븐, 제품 번호 CGSC#4474)에서 입수하였다. 이의 관련 유전자형은 이전에 설명되었으며(대장균 W3110, F-, 람다-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1), 및 이의 게놈 서열은 이전에 공개되었다(Hayashi K, et al., 2006, Mol. Syst. Biol. 2006.0007 (doi:10.1038/msb4100049). 대장균 W3110 균주는 대장균 O 항원 생체접합체 각각의 생산을 가능하게 하도록 유전자 변형되었다(표 3).
생체접합체 생산 균주
"ExPEC4V" 및 "ExPEC10V" 조성물은 둘 다 동일한 생산 균주로부터의 O2-EPA 및 O25B-EPA 생체접합체를 포함한다. "ExPEC4V" 조성물은 stGVXN4411 또는 stLMTB10217 생산 균주로부터의 O1A-EPA 생체접합체를 포함하는 반면, "ExPEC10V" 조성물은 stLMTB10217 생산 균주로부터의 O1A-EPA 생체접합체를 포함한다. "ExPEC4V" 조성물은 stGVXN4112 생산 균주로부터의 O6A-EPA 생체접합체를 포함하는 반면, "ExPEC10V" 조성물은 stLMTB10923 생산 균주로부터의 O6A-EPA 생체접합체를 포함한다. 또한, "ExPEC10V" 조성물은 "ExPEC4V"에 사용되지 않는 생산 균주로부터의 O4-EPA(즉, (O4-Glc+)-EPA), O8-EPA, O15-EPA, O16-EPA, O18A-EPA 및 O75-EPA 생체접합체를 포함한다. 다양한 생산 균주는 아래에 지시된 바와 같이 EPA 담체 단백질 및/또는 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB의 발현을 위한 플라스미드에서 다를 수 있다. 여러 예시적인 생산 균주의 개요가 아래 표 3에 제공되어 있다.
표 3. ExPEC4V 및 ExPEC10V 백신 조성물을 위한 O 항원 생체접합체에 대한 대장균 생산 균주의 유전자 공학 개요
Figure pct00015
예를 들어 개선된 수율 및/또는 생체접합체의 특정 특성의 변화를 가진 클론을 찾기 위해, 대체 생산 균주도 준비하여, 일부 생체접합체에 사용하였다.
O 항원 생합성( rfb ) 유전자 클러스터
모든 대장균 O 항원 생산 균주에서, 자연 발생 대장균 W3110 게놈 O16::IS5 -항원 생합성(rfb) 유전자 클러스터는 선택된 혈청형의 대장균 균주로부터 선택된 O 항원 특이적 생합성 클러스터에 의해 대체되었으며, 이는 혈청형-특이적 O 항원 구조를 암호화한다(이러한 O 항원 구조에 대해서는 표 1 참조). 10개의 공여체 rfb 클러스터는 대장균 혈액 분리주의 전체-게놈 분석 후 선택하고 확인하였다. O 항원 생합성에 결함이 있는 W3110 O16::IS5 rfb 유전자 클러스터의 대체는 단일 상동 재조합 사건으로 달성되었다. O16 및 O18A rfb 유전자 클러스터의 경우, 공여체 DNA는 측접하는 gnd 및 rmlCA 유전자를 통해 재조합되는 반면, 다른 균주의 rfb 유전자 클러스터는 측접하는 gnd 및 galF 유전자를 통해 재조합되었다. 생산 균주에서 rfb 클러스터의 서열은 서열번호 9 및 11 내지 19로 제공된다.
O 항원 리가제( waaL ) 유전자
모든 대장균 O 항원 생산 균주는 waaL 유전자에 의해 암호화된 대장균 W3110 게놈 O 항원 리가제의 인공적으로 도입된 결실을 보유한다. ΔwaaL 균주에서 지질 A로의 O 항원의 전달이 방해되고, 이는 대신에 O 항원의 담체 단백질로의 직접 전달을 유도하여 생성물 수율을 증가시킨다.
O 항원 글루코실화( gtrABS ) 유전자
대장균 O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 생산 균주에서, O16 O 항원 글루코실화를 담당하는 대장균 W3110 게놈 gtrABS 유전자가 결실되었다. 상이한 혈청형의 gtrA 및 gtrB 유전자는 고도로 상동성이고 상호교환가능하지만, gtrS 유전자는 혈청형-특이적 O 항원 글리코실 트랜스퍼라제를 암호화한다. 대장균 W3110에서 GtrS는 대장균 O16 O 항원의 α-L-Rha-(1→3)-D-GlcNAc 모티프에 있는 GlcNAc 당에 글루코스(Glc) 잔기를 전달할 수 있다. 대장균 O1A, O2 및 O6A 생산 균주에서는 gtrABS 유전자의 결실 또는 대체가 발생하지 않았다. 이러한 O 항원은 대장균 O16 gtrS의 천연 기질인 α-L-Rha-(1→3)-D-GlcNAc 모티프를 놓치게 된다. 대장균 O4 생산 균주에서, W3110 gtrS 유전자는 대장균 O4 gtrS 유전자로 대체되어 대장균 O4 O 항원의 적절한 글루코실화를 수용하였다(대장균 O4 gtrS 유전자의 암호화 서열은 본원에 서열번호 5로 제공되고, 대장균 O4 GtrS 단백질의 아미노산 서열은 본원에 서열번호 4로 제공된다; 예를 들어, 2020년 3월 18일 출원된 PCT/US20/23404도 참조).
올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB
모든 대장균 O 항원 생산 균주는 C. 제주니 글리코실 트랜스퍼라제 PglB의 변이체를 발현하였으며, 이는 N-글리코실화에 의해 담체 단백질 상의 아미노산 공통 서열 상으로 O 항원을 전달할 수 있다. PglB는 광범위한 기질 인식을 가졌으나, 낮은 생성물 수율로 인해, 변형된 기질 특이성을 갖는 PglB 변이체를 발현하는 여러 생산 균주를 제조하였으며, 이는 개선된 생성물 수율을 초래하였다(예를 들어, WO 2016/107818, WO 2016/107819 참조). pgIB 유전자는 플라스미드 상의 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 유도성 프로모터 뒤에 배치되었다. 아래 표 4는 상기 기재된 ExPEC4V 및 ExPEC10V 조성물을 위한 생체접합체에 대한 대장균 O 항원 생산 균주의 생산에 사용되는 플라스미드에 의해 암호화된 PglB 변이체를 나열한다. 벡터 백본, 항생제 내성 마커 및/또는 대안적 PglB 변이체에 변이가 있는 추가 플라스미드도 또한 생체접합체 생산에 대해 성공적으로 테스트되었다.
표 4. 대장균 O 항원 생산 균주에 사용되는 PglB 및 EPA 플라스미드
Figure pct00016
1 SpR, 스펙티노마이신 내성; AmpR, 암피실린 내성; KanR, 카나마이신 내성
ExPEC10V에서 10개의 대장균 O 항원의 각각의 생체접합체에 대한 최적의 PglB 변이체는 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함된 2020년 3월 18일 출원된 PCT/US20/23415에 더욱 상세히 기재된 바와 같이 결정되었다.
담체 단백질 (EPA)
모든 대장균 O 항원 생산 균주는 O 항원에 대한 담체 단백질로서 유전적으로 탈독소화된 P. 애루기노사 AD-리보실트랜스퍼라제 톡소이드(EPA)를 발현하였다. EPA 톡소이드는 2개 잔기에서 야생형 EPA 독소와 상이하다: Leu552는 Val로 변경되었으며, (촉매 도메인에서) Glu553이 결실되었다. Glu553 결실은 독성을 현저하게 감소시키는 것으로 보고되었다. 탈독소화 돌연변이 외에도, 4개(EPA-4) 공통 N-글리코실화 부위 모티프를 도입하였다. epa 유전자는 플라스미드 상의 l-아라비노스(Ara) 유도성 프로모터 뒤에 위치하였다(표 4). 표 4는 상기 기재된 "ExPEC4V" 및 "ExPEC10V" 조성물에 사용된 생체접합체에 대한 생산 균주에 사용되는 플라스미드로 제한된다. 벡터 백본, 항생제 내성 마커 및/또는 EPA 변이체에서 변이를 갖는, 예를 들어 공통 N-글리코실화 부위 모티프의 수(예를 들어, 2개의 이러한 모티프를 가짐, EPA-2)가 변화하는 플라스미드도 생체접합체 생산에 대해 성공적으로 테스트되었다.
실시예 3: 대장균 O 항원의 생체접합체의 생성을 위한 올리고사카릴트랜스퍼라제 최적화
생체접합체 생산을 위한 수율 최적화는 C. 제주니 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB의 변형에 의해 달성될 수 있으며, 이는 EPA 담체 단백질에 대한 관심 O 항원의 더욱 효율적인 또는 더 높은 정도의 N-글리코실화로 이어질 수 있다. 글루코실화된 O4(O4-Glc+) O 항원 다당류를 갖는 생체접합체의 생산을 위한 대장균 균주에서, 이러한 최적화 전략을 적용하였으며, 생체접합체 생성물 수율을 개선하는 (O4-Glc+) 특이적 최적화된 PglB 변이체를 발생시켰다.
이러한 접근법에서, EPA-발현 플라스미드를 함유하는 O4-Glc+ O 항원 다당류 생산 균주는 다양한 상이한 PglB 발현 플라스미드로 형질전환되었으며, 이들 각각은 PglB 단백질에 상이한 아미노산 치환을 함유하여 기질 특이성을 변경시켰다. 각 균주의 생체접합체 생산 수준 및 프로파일은 삼투압 충격 실험에서 진탕 플라스크 수준으로 평가하였으며, 판독은 O4-Glc+ 특이적 단클론 항체를 사용하여 주변 세포질 추출물에 대한 모세관 전기영동 면역분석법에 의해 수행하였다.
N311V 아미노산 치환을 함유하는 테스트한 PglB 변이체 중 하나는 글루코실화된 O4 생체접합체의 생성물 수율을 현저하게 개선하는 것으로 밝혀졌다(전체가 본원에 참조로 포함된 2020년 3월 18일 출원된 PCT/US20/23415 참조).
N311V PglB-변이체가 추가로 변형된 추가 개선에서, Y77H 아미노산 치환은 N311V PglB-변이체와 비교하여 O4-Glc+ 특이적 생성물 수율을 추가로 증진시켰으며, 증가된 정도의 디- 및 트리-글리코실화 생성물을 나타내었으며, 여기서 다른 변형은 중립적이거나 생성물 수율에 부정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(전체가 본원에 참조로 포함된 2020년 3월 18일 출원된 PCT/US20/23415 참조). 플라스미드 pLMTB4008(SpR)은 돌연변이 Y77H 및 N311V가 있는, 대장균 코돈 사용 빈도 최적화되고 (O4-Glc+) 기질 최적화된 PglB 변이체를 암호화한다.
야생형 (wt) C. 제주니 글리코실 트랜스퍼라제 PglB와 비교해 N311V 및 Y77H 아미노산 치환을 함유하는 O4-Glc+ O 항원 다당류에 대한 최적화된 기질 특이성을 갖는 PglB 변이체는 1차 라운드 최적화된 PglB-N311V 변이체와 비교하여 생체접합체 수율이 두 배인 것으로 밝혀졌다.
유사하게 스크린을 사용하여, ExPEC10V 조성물 중 다른 9개 혈청형의 대장균 O 항원 생체접합체 생산에 대해 가장 최적의 수율을 갖는 PglB 변이체를 또한 결정하였다. 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함된 2020년 3월 18일 출원된 PCT/US20/23415 참조.
O1A, O6A 또는 O15 항원 다당류를 갖는 생체접합체의 경우, 아미노산 돌연변이 N311V, K482R, D483H 및 A669V를 갖는 PglB가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
O2, O8, O18A 또는 O25B 항원 다당류를 갖는 생체접합체의 경우, 야생형 PglB(즉, 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이가 없음)가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
O16 항원 다당류를 갖는 생체접합체의 경우, 아미노산 돌연변이 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V를 갖는 PglB가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
O75 항원 다당류를 갖는 생체접합체의 경우, 아미노산 돌연변이 N311V를 갖는 PglB가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
이러한 결과는 최적의 PglB 변이체가 다양한 O 항원에 대해 상이하고, 주어진 O 항원 다당류를 갖는 생체접합체를 생성하기 위한 최적의 PglB 변이체는 예측할 수 없음을 보여주었다.
실시예 4: 10개의 대장균 혈청형으로부터의 O 항원의 생체접합체의 품질 속성.
표적 O 항원의 O-글리칸 잔기는 구조적으로 다양하고, 가변적인 반복 단위를 갖는다. 글리코실 트랜스퍼라제 PglB의 특이성 및 친화성은 글리칸 구조와 연결되어 있다. 따라서, 요망되는 품질 속성, 예를 들어 순도, 글리칸/단백질 비 등을 갖는 생체접합체를 만드는 것은 어렵고 간단하지 않은 작업이다. PglB와 EPA 담체 단백질의 올바른 조합은 수율을 결정하고, 글리코실화 효율에 영향을 미칠 수 있다. PglB 및 담체 단백질을 최적화함으로써, 요망되는 품질 속성을 갖는 생체접합체를 생성하였다. 매우 많은 양의 담체 단백질은 면역학적 간섭으로 이어질 수 있기 때문에, 특히 하나 이상의 O 항원 생체접합체가 함께 조합되어 단일 조성물 또는 백신으로 투여되는 경우, 총 담체 단백질의 더 낮은 역치 값을 유지하는 것이 또한 중요할 수 있다. 이러한 현상을 피하기 위해서 더 높은 글리칸/단백질 비율을 갖는 접합체가 바람직하다. 따라서, ExPEC10V 백신의 경우, (임상 시험으로 처리된 이전에 기재된 ExPEC4V 백신과) 적어도 유사한 글리코실화 비율을 갖는 생체접합체를 개발하였다.
생체접합체는 이전에 기재된 방법에 따라 생물반응기(10 L 및/또는 200 L 부피)에서 각 숙주 세포(실시예 2, 표 3)를 배양하고 생체접합체의 발현에 의해 각각 생성하였다. 각 원료 의약품은 박테리아 유가식 발효에 의해 배치식으로 제조되어 상응하는 다당류 혈청형의 발현된 생체접합체를 함유하는 바이오매스를 생성하였다. 세포를 배양하고, IPTG 및 아라비노스로 유도하였다. 삼투압 충격에 이어서 크로마토그래피 정제에 의해 생물반응기 배양물에서 세포의 주변세포질로부터 생체접합체를 분리하였다. 이러한 공정을 10개 생체접합체 각각에 대해 수행하였다.
ExPEC10V 및 ExPEC4V에 대한 원료 의약품(DS)인 이렇게 제조된 대장균 O 항원 생체접합체는 유사한 중요한 품질 속성을 나타내었다: (1) 공정-관련 순도(RH-HPLC에 의해 측정)는 95% 보다 높았음, (2) 약 0.1~0.5, 대부분 0.15 내지 0.45 범위의 다당류/단백질 비율, (3) 박테리아 내독소(Ph. Eur. 2.2.3)는 0.5 EU/μg 다당류 미만이었음. 개별 다당류 사슬의 평균 길이는 전형적으로 약 10~20 반복 단위였다(고해상도 SDS-PAGE를 사용하여 측정함).
다당류 반복 단위의 구조는 상기 기재된 ExPEC10V 조성물에 있어서 DS인 모든 10개의 생체접합체의 경우, 표 1에서 상응하는 혈청형에 대해 화학식으로 제시된 것으로 (온전한 또는 트립신-분해된 접합체의 NMR 및 MS/MS에 의해) 확인되었다.
ExPEC10V 완제 의약품(DP)은 상기 기재된 10개의 1가 DS의 혼합물을 포함한다.
실시예 5: ExPEC10V 백신의 독성학.
ExPEC10V를 사용한 단일-용량 파일럿 독성 및 국소 내성 연구(비-GLP)를 암컷 NZW 토끼에서 수행하였다. 하나의 군(n=2)은 대조군(식염수)의 근육내(IM) 주사(0일)를 받았고, 두 번째 군(n=4)은 0.6 mL의 투여 부피를 사용하여 105.6 μg의 총 다당류(PS)/용량(176 μg PS/mL)(각각 O 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 있어서 용량당 (9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 19.2: 9.6 μg PS)으로 ExPEC10V의 IM 주입을 받았다. 부검은 2일에 수행하였다.
사망은 관찰되지 않았다. 또한, 임상 관찰(Draize 스코어링을 사용한 주사 부위 효과 포함), 체중, 먹이 섭취 및 체온에 대해 언급된 백신 관련 효과는 없었다. 조직병리학적으로 투여 부위 또는 배액(장골) 림프절에서 백신과 관련된 변화는 관찰되지 않았다. 비장의 배 중심 형성의 최소 증가가 처리된 동물 4마리 중 한 마리에서 관찰되었으며(2일), 주사된 백신에 대한 정상적인 면역학적 반응으로 간주되었다. 전반적으로, 암컷 토끼에 대한 ExPEC10V의 단일 IM 용량의 투여는 내약성이 우수하였다.
실시예 6: 토끼에서 ExPEC10V 블렌딩된 제형의 면역원성.
ExPEC4V 백신(대장균 O1A, O2, O6A 및 O25B 혈청형의 생체접합체 포함)은 이전에 래트, 토끼 및 인간에서 이들 4가지 혈청형에 대해 면역원성인 것으로 나타났다(예를 들어, WO 2015/124769; WO 2017/035181; 문헌[Huttner et al, 2017, Lancet Infect Dis, http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30108-1; RW Frenck Jr, et al, 2019, Lancet Infect Dis 19(6): 631-640, http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(18)30803-X] 참조). 대장균 혈청형 O4-Glu+, O8, O15, O16, O18A 및 O75의 생체접합체(모두 담체 단백질로서 EPA-2를 가짐)의 면역원성은 래트에게 개별적으로(1가) 투여될 경우 이들 생체접합체 각각이 또한 면역원성이라는 것을 확인시켜 주었는데, 이는 ELISA 데이터가 이들 생체접합체 각각이 높은 수준의 대장균 O 항원 특이적 항체를 유발시킬 수 있음(미제시됨)을 나타내었기 때문이다.
상기 기재된 바와 같은 10개의 생체접합체의 혼합물을 함유하는 10가 백신의 면역원성을 또한 테스트하였다. 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼(암컷, 12~16주령)는 2주 간격으로 투여된 ExPEC10V 또는 식염수로 3회의 근육내 면역화를 받았다(표 5; 0, 14 및 27일에 투여). 이러한 실험에 사용된 ExPEC10V의 일부인 10개의 다당류를 4개의 글리코실화 부위를 함유하는 EPA(EPA-4) 담체 단백질에 접합시켰다. 백신은 3개의 상이한 용량으로 제형화시켰다: 군 1 ('고용량'): 8 μg/용량의 O1A, O2, O6A, O4, O8, O15, O16, O18 및 O75 및 16 μg/용량의 O25B; 군 2 ('중간 용량'): 4 μg/용량의 O2, O4, O8, O15, O16, O18 및 O75, 8 ug/용량의 O1A 및 O6A 및 16 μg/용량의 O25B; 군 3 ('저용량'): 0.4 μg/용량의 O2, O4, O8, O15, O16, O18 및 O75, 0.8 μg/용량의 O1A 및 O6A 및 1.6 μg/용량의 O25B. 대조군(군 4)의 동물은 식염수(0.9% (w/v) 염화나트륨 용액)만 받았다(표 5).
항체 반응은 0일(면역화 전) 및 면역화 후 14, 27 및 42일에 평가하였다. 백신 및 담체 단백질 EPA에 포함된 각각의 생체접합체에 의해 유도된 혈청 항체 수준을 코팅 물질로서 유형 특이적 LPS를 사용하여 ELISA(총 IgG)에 의해 측정하였다. 항체 역가는 4-파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델에 플롯팅된 12-단계 적정 곡선의 중복을 기반으로 하는 최대 유효 농도 절반에 해당하는 EC50 값으로서 보고하였다. 기능적 활성은 OPK에 의해 결정되었다.
표 5. 실험군의 설명.
Figure pct00017
결과는 도 1에 제시되어 있고, 표 6에 요약되어 있다.
표 6. NZW 토끼에서 ExPEC10V에 의해 유도된 대장균 O 항원 특이적 항체 반응의 요약.
Figure pct00018
p 값이 통계적으로 유의한 혈청형 특이적 항체 반응은 별표로 표시된다. p 값이 통계적으로 유의하지 않은 혈청형 특이적 항체 반응은 ns로 표시된다. 다중 비교를 위한 Bonferroni 보정을 사용한 Wilcoxon 순위 합계 검정. ExPEC10V 백신접종된 동물(군 1, 2 및 3) 대 식염수 대조군(군 4)의 비교. *p≤0.05, **p≤0.01. # P 값은 대조군에서 이상치 동물을 제외한 후 통계적으로 유의하였다(민감도 분석).
고용량의 ExPEC10V(군 1)은 O1A, O2, O4, O6A, O16, O18A 및 O25B에 대한 식염수 대조군과 비교할 경우 조사된 모든 시점(면역화 후 14, 27 및 42일)에서 유의하게 더 높은 IgG 항체 수준을 유도하였다(도 2, 표 6). 식염수 대조군과 비교할 경우 O8 및 O75 접합체에 의해 유도된 유의하게 더 높은 항체 역가가 면역화 후 27일 및 42일에 관찰되었다(도 1, 표 6).
중간 용량의 ExPEC10V(군 2) 및 저용량(군 3)은 O1A, O2, O4, O6A, O16 및 O25B에 대한 식염수 대조군과 비교할 경우 조사된 모든 시점(면역화 후 14, 27 및 42일)에서 유의하게 더 높은 항체 수준을 유도하였다(도 1, 표 6). 식염수 대조군과 비교할 경우 O8, O18A 및 O75 접합체에 의해 유도된 유의하게 더 높은 항체 역가가 면역화 후 27일 및 42일에 관찰되었으며, 이는 토끼에서의 부스트 용량이 이들 O 혈청형에 대한 반응을 증가시킴을 시사한다(도 1, 표 6).
O15 접합체의 경우, 대조군에서 이상치 동물을 생략한 민감도 분석은 ExPEC10V 백신의 3개 용량 모두가 면역화 후 14, 27 및 42일에 식염수 대조군과 비교하여 항체 반응의 유의한 증가를 유도함을 보여주었다(도 1, 표 6).
담체 단백질 EPA에 의해 유도된 항체는 조사된 모든 시점(14일, 27일 및 42일)에서 테스트된 3가지 용량의 ExPEC10V(고, 중간 및 저)에 대해 식염수 처리군(대조군)에서 EPA 항체 역가보다 유의하게 더 높았다(도 1).
용량간 비교(미제시됨)는 백신접종 후 14일에 고용량의 ExPEC10V가 테스트된 대부분의 접합체(O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A 및 O25B) 저용량과 비교할 때 유의하게 더 높은 항체 반응을 유도하였음을 보여주었다. 중간 용량의 ExPEC10V는 또한 O1A, O2, O4, O18A, O25B 및 O75에 대한 저용량과 비교하여 유의하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다. O8 접합체의 경우, ExPEC10V의 세 가지 제형 모두는 백신접종 후 14일에 유사한 수준의 항체를 유도하였다.
저용량의 ExPEC10V는 O1A, O2, O4, O16, O25B 및 O75 접합체에 대한 고용량 및 중간 용량의 ExPEC10V과 비교할 경우 백신접종 후(프라임 및 2회 부스트 용량 후) 42일에 항체 반응의 유의한 증가를 유도하였다. 이러한 발견은 예를 들어, 폐렴구균 접합체 백신으로 백신접종된 유아에서 용량과 일차 백신접종에 대한 항체 반응의 규모 사이의 명확한 관계가 관찰되지 않았다는 접합체 백신으로의 다른 경험과 일치한다(Poolman JT, et al. Expert Rev Vaccines. 2013, 12(12):1379-94).
O6A, O8 및 O15 접합체에 대해 백신접종 후 42일에 테스트한 3가지 용량의 ExPEC10V 간에는 유의한 차이가 없었다. O18A 접합체의 경우, 백신접종 후 42일에 중간 용량과 비교하여 고용량의 ExPEC10V가 유의하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다.
담체 단백질(EPA)에 있어서, 고용량 및 중간 용량의 ExPEC10V는 백신접종후 14일에 저용량과 비교하여 유의하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다. 고용량의 백신은 또한 백신접종후 42일에 저용량과 비교하여 유의하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다.
결론적으로, 0, 14, 27일에 근육내 주입을 통해 투여된 3가지 제형의 ExPEC10V(고, 중간 및 저)는 토끼에서 면역원성이다.
지금까지, 토끼에서 이 백신에 의해 유도된 대장균 균주를 살상할 수 있는 기능적 항체는 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16 및 O25B에 대해 나타났다.
추가 실험에서, ExPEC10V 백신의 GMP 배치(생산에 대해서는 상기 실시예 4 참조)를 제조하고, 독성학 연구의 일부로서 NZW 토끼에 주사하였다(표 7). 이 연구에서 NZW 토끼(수컷 및 암컷)는 ExPEC10V 백신(1일, 15일 및 29일)을 근육내 주사(0.6 mL)로 3회 받았고, 대조군은 0.9% (w/v) 염화나트륨 용액(식염수)를 받았다. 각 용량의 백신은 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A 및 O75에 대한 9.6 μg의 다당류(PS) 및 혈청형 O25B에 대한 19.2 μg의 PS를 함유하였으며, 이는 105.6 μg의 총 PS(176 μg 총 PS/mL) 및 382.8 μg의 총 EPA(638 μg EPA/mL)에 상응한다. O 항원 및 담체 단백질(EPA)에 대한 IgG 역가는 전처리 기간(1일) 및 면역화 후 31일 및 50일에 수집된 샘플로부터 결정하였다.
모든 O 항원 및 담체 단백질 EPA에 대한 항체 반응에서 유의한 증가는 단지 식염수만 받은 대조군과 비교할 경우 ExPEC10V를 받은 군에서 백신접종 후 31일 및 50일에 관찰되었다(도 2, 표 8). O1A 혈청형의 경우, 백신접종된 동물을 대조군과 비교할 때 유의하게 더 높은 항체 반응이 또한 1일(기준선)에 관찰되었다. 이러한 결과는 일부 동물이 대장균에 사전 노출되었거나, O1A-LPS와 교차 반응하는 항체를 가지고 있음을 시사한다.
표 7. NZW 토끼에 사용된 실험군 및 ExPEC10V 용량.
Figure pct00019
*각 용량(0.6 mL 투여 부피)은 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, O75 각각에 대해 9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:19.2:9.6 μg의 다당류(PS)를 함유한다(176 μg 총 PS/mL). 각 용량은 382.8 μg의 EPA 단백질을 함유한다(638 μg EPA/mL).
표 8. 독성학 연구의 일부로서 NZW 토끼에서의 ExPEC10V의 면역원성.
Figure pct00020
ExPEC10V에 의해 유도된 항체 반응. 대조군과 비교하여 백신군에서 항체 반응의 유의한 증가가 관찰된 혈청형은 별표로 표시된다. 우도비 검정이 있는 Tobit 모델. ****P ≤ 0.0001.
실시예 7: 인간에서 ExPEC10V 백신을 사용한 1/2a상 시험.
현재 IED를 예방하기 위해 이용 가능한 백신은 없다. ST131을 포함한 항균제 내성 IED를 유발하는 대부분의 ExPEC 분리주를 또한 대표하는 임상적으로 관련된 대다수의 ExPEC 균주로 인한 침습성 질환을 해결하기 위해 ExPEC10V 백신을 포함하는 혈청형(O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75)을 선택하였다. 선택된 혈청형은 노령 집단에서 혈류 감염을 일으키는 10종의 널리 퍼진 ExPEC O 혈청형을 대표하며, ExPEC으로 인한 혈류 감염의 약 70%를 차지한다.
침습성 질환 예방에 있어서 접합체 백신의 작용 메커니즘은 항생제 내성 메커니즘의 영향을 받지 않을 것으로 예상되기 때문에, ExPEC10V 백신은 약물 내성 및 약물 감수성 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 혈청형에 의해 유발된 IED에 대한 보호를 제공하는 것으로 여겨진다.
ExPEC10V에서도 발견되는 4가지 대장균 O 항원 접합체(O1A, O2, O6A 및 O25B)의 서브세트를 포함하는 초기 백신 후보인 ExPEC4V에 대한 선행 임상 경험이 있다. 4건의 완료된 임상 연구(2건의 1상 연구, 2건의 2상 연구)의 결과에 기초하여, ExPEC4V는 연구 참가자들에 있어서 내약성이 우수하였으며, 혈청형(O1A, O2, O6A 및 O25B)당 최대 16 μg의 다당류(PS) 용량에서 백신 관련 안전성 신호가 관찰되지 않았다. 대부분의 유해 사건(AE)은 1등급 및 2등급이었고, 3등급 AE는 거의 보고되지 않았다. 후기 발병된 명시된 국소 AE(백신접종 후 5일 이후에 시작되는 AE)는 주로 더 높은 용량의 ExPEC4V로 관찰되었다. 각 연구에서, ExPEC4V 백신은 면역원성인 것으로 나타났으며, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정된 바와 같이 용량 의존적 백신 면역 반응과 O 항원 특이적 면역글로불린 G(IgG) 역가 증가를 입증한다. 항체의 기능적 활성은 ExPEC4V-최적화된 옵소닌 식세포 살상 분석법(OPKA)으로 입증되었다. ELISA 및 OPKA 테스트 결과의 공동 분석은 분석법 반응 사이의 상관관계를 보여주었으며(2상 임상 시험[연구 4V-BAC2001]에서 각각 30일 및 360일에 대한 피어슨 상관 계수 ≥0.61 및 ≥0.48), 이는 ELISA를 ExPEC4V 항체 역가의 일차 척도로 사용하고, 기능적 항체 활성을 예측하는 데 사용함을 입증한다. 면역원성 데이터의 분석은 ExPEC4V로의 백신접종 후 3년에 걸쳐 면역 반응의 지속성을 입증하였다. 이제 ExPEC4V로 백신접종되고, 혈청형 특이적 옵소닌 식세포 항체의 역가가 높은 인간의 혈청은 이후에 O25B 또는 O2 혈청형의 대장균 균주로 복강내 챌린지한 마우스에 수동적으로 전달될 경우 혈액, 비장 및 간에서 대장균 콜로니 수(CFU)의 유의한 감소에 의해 입증된 생체 내 보호를 매개할 수 있었음이 또한 관찰되었다(데이터 미제시). 따라서, ExPEC4V 특이적 옵소닌 식세포 인간 항체는 생체 내에서 박테리아 살상을 매개하며, 이는 제안된 보호 메커니즘이 박테리아 살상을 매개하는 옵소닌 식세포 항체의 유도에 의한 것인 다른 접합체 백신과 일치한다.
ExPEC10V는 총 10개의 혈청형을 포함하며, 60세 이상 성인에서 ExPEC로 인한 혈류 감염의 약 50%(ExPEC4V) 내지 약 70%로 적용 범위를 늘린다. ExPEC4V에 대한 임상 경험과 상기 실시예에서 논의된 ExPEC10V에 대한 전임상 데이터를 기반으로 하여, ExPEC10V의 투여가 또한 인간에서 대장균 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 대한 면역 반응을 유도할 것으로 예상되었다. 각각의 O 항원 다당류(PS)는 슈도모나스 애루기노사에서 유래된 외독소 A(EPA)의 유전적으로 탈독소화된 형태인 담체 단백질에 개별적으로 생체접합되며, 이의 생산은 위에서 설명되었다. O4 PS는 표 1의 화학식 (O4-Glc+) 구조를 갖는 글루코실화된 형태이다.
ExPEC10V 백신의 3가지 다른 용량의 안전성, 반응원성 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 관찰자 맹검, 인간 최초의 1/2a상 연구를 안정적인 건강 상태의 60세 내지 85세의 인간에서 수행한다(연구 10V- BAC1001). 연구 설계는 2개의 코호트를 포함한다: 코호트 1에서 안정적인 건강 상태의 60세 이상 85세 이하의 404명의 참가자(참가자 100명/ExPEC10V 용량) 및 코호트 2에서 지난 5년 내에 UTI 병력이 있는 안정적인 건강 상태의 60세 이상의 약 420명의 참가자(ExPEC10V군 280명, 위약군 140명)(원래 코호트 2에 600명의 참가자를 포함할 계획이었지만, 이 숫자는 프로토콜에 대한 일부 조정을 통해 연구 중에 약 420명으로 줄었다)의 총 824명의 참가자가 연구에 등록된다.
목적 및 종점
코호트 1 - 1/2a상 관찰자-맹검 기간과 공개 라벨의 장기 추적 기간(N=404):
Figure pct00021
Figure pct00022
코호트 2 - 이중 맹검 기간과 이중 맹검 장기 추적 기간(N = 420):
Figure pct00023
Figure pct00024
전반적인 설계
이는 2개의 코호트를 포함하는 무작위 배정, 다기관, 중재 연구이다.
코호트 1의 경우, 이 연구는 관찰자-맹검, 활성 대조 설계를 가지고 있으며, UTI 병력이 있거나 없는 안정적인 건강 상태의 60세 이상 85세 이하의 총 404명의 성인 참가자가 포함된다. 코호트 1에 대한 연구 설계는 3개의 기간을 포함한다: 최대 28일의 스크리닝 기간, 1일차에서의 백신접종을 통한 관찰자-맹검 181일의 추적 기간 및 백신접종 후 182일차부터 3년(1096일)까지 지속되는 공개 라벨의 LTFU 기간(도 3a). 단지 ExPEC10V 선택된 용량군으로부터의 참가자(약 100명의 참가자) 및 Prevnar 13군의 참가자만이 LTFU 기간으로 진행된다. 코호트 1의 종료는 마지막 참가자의 3년차 방문(1096일)이다.
코호트 2의 경우, 연구는 이중 맹검, 위약 대조 설계를 가지며, 지난 5년 동안 UTI 병력이 있는 안정적인 건강 상태의 60세 이상의 총 대략 420명의 성인 참가자가 포함되었다. 등록은 코호트 1로부터 1/2a상 1차 분석 및 ExPEC10V 용량 선택 완료 후 시작되었다. 코호트 2에 대한 연구 설계는 3개의 기간을 포함한다: 최대 28일의 스크리닝 기간, 1일차에서의 백신접종을 통한 이중 맹검 181일의 추적 기간 및 백신접종 후 182일차부터 3년(1096일)까지 지속되는 이중 맹검 LTFU 기간(도 3b). 코호트 2에서 모든 참가자는 LTFU 기간으로 진행된다. 연구 종료는 코호트 2에서 마지막 참가자의 3년차 방문(1096일)이다.
코호트 1: 1상
코호트 1의 1상에서, 총 84명의 참가자는 한 단계에서 다음 단계로 진행하기 전에 정위에서의 안전성 평가가 있는 단계적 용량 증량 절차에 따라 시차 접근 방식으로 등록되었다. 내부데이터검토위원회(DRC)는 이들 84명의 1상 참가자의 신체 검사 데이터(기준선 및 표적화), 기준선 인구 통계 데이터 및 백신접종 후 14일 안전성 데이터(명시된 국소 및 전신 AE, 명시되지 않은 AE, SAE, 임상 실험실 데이터 및 활력 징후 포함)를 검토하기 위해 이 연구를 위해 위임되었다. 연구의 이 상에서, 참가자가 등록되고 6 단계로 무작위 배정되었다:
단계 1: 4명의 센티널 참가자가 등록되고 무작위 배정되었다; 2명의 참가자는 ExPEC10V 저용량군(표 11), 참가자 1명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13군이었다.
단계 2: 24명의 참가자가 등록되고 무작위 배정되었다; 18명의 참가자는 ExPEC10V 저용량군(표 11), 참가자 3명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13군이었다.
단계 3: 4명의 센티널 참가자가 등록되고 무작위 배정되었다; 2명의 참가자는 ExPEC10V 중간 용량군(표 11), 참가자 1명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13군이었다.
단계 4: 24명의 참가자가 등록되고 무작위 배정되었다; 18명의 참가자는 ExPEC10V 중간 용량군(표 11), 참가자 3명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13군이었다.
단계 5: 4명의 센티널 참가자가 등록되고 무작위 배정되었다; 2명의 참가자는 ExPEC10V 고용량군(표 11), 참가자 1명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13군이었다.
단계 6: 24명의 참가자가 등록되고 무작위 배정되었다; 18명의 참가자는 ExPEC10V 고용량군(표 11), 참가자 3명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13군이었다.
모든 참가자는 배정된 연구 백신접종군에 따라 1일에 ExPEC10V(3개 용량 중 1), ExPEC4V 또는 Prevnar 13을 단일 근육내(IM) 주사로 투여받았다. 단계 1, 3 및 5 각각에서 4명의 센티널 참가자는 백신접종 후 24시간째에 전화로 연락하여 안전성 정보를 수집하였다. 4명의 센티널 참가자의 각 군에서 백신접종 후 24시간째의 맹검 안전성 데이터를 수석 연구원(PI), 연구 담당 의사(SRP) 및 후원 의료 책임자(SML)가 검토하였다. 다음 단계를 위한 추가 참가자의 무작위 배정은 이러한 2일의 센티널 안전성 평가가 완료될 때까지 중단되었다.
임의의 임상적으로 유의한 결과가 없는 경우, 추가로 24명의 참가자(단계 2, 4 및 6의 경우)를 등록시키고, 3개 연구 백신접종군(표 11) 중 하나로 무작위 배정하여 ExPEC10V(3개 용량 중 1), ExPEC4V 또는 Prevnar 13을 1일에 단일 IM 주사로 투여받게 하였다.
각 용량 수준(단계 2의 저용량, 단계 4의 중간 용량 및 단계 6의 고용량)에서 추가 24명의 참가자의 백신접종 후, 각 용량 수준에서 모든 28명(4+24) 참가자의 백신접종 후 14일의 안전성 데이터를 다음 용량 수준 또는 2a상으로 진행하기 전에 DRC에서 검토하였다.
코호트 1: 2a상
초기 84명의 참가자에 대한 백신접종 후 14일 안전성 데이터 검토 후 DRC에 의해 결정된 허용가능한 안전성 및 반응원성을 기반으로 하여(임의의 안전성 문제 또는 특정 연구 일시 중지 규칙을 충족하는 임의의 사건이 없는 경우), 코호트 1로부터의 나머지 320명의 참가자를 무작위 배정하고 연구의 2a상에서 투여하였다. 이들 추가의 320명의 참가자를 등록시키고 5개의 연구 백신접종군 중 하나로 2:2:2:1:1의 비로 병렬로 무작위 배정하여 1일에 ExPEC10V(3개 용량 중 1), ExPEC4V 또는 Prevnar 13의 단일 IM 주사를 투여받게 하였다(표 11). 초기 84명의 참가자에 대한 14일 안전성 검토를 수행하는 것 외에, DRC는 또한 연구 과정 동안 코호트 1의 안전성 데이터를 평가하며, 특정 연구 백신접종 일시 중지 규칙을 충족하는 임의의 사건 또는 발생할 수 있는 임의의 기타 안전성 문제를 검토한다.
코호트 1의 경우, 모든 참가자가 30일 방문(방문 4)을 완료하였거나 더 일찍 중단한 경우 1차 분석이 발생하였다. 모든 참가자가 181일 방문을 완료하였거나 더 일찍 중단한 경우 최종 분석이 발생한다. 공개 라벨의 장기 추적(LTFU) 기간으로 진행되는 참가자의 경우(ExPEC10V 선택된 용량군 및 Prevnar 13군), 연간 추적 분석은 백신접종 후 1년(366일), 2년(731일) 및 3년(1096일)차의 방문 시점까지 수집된 안전성 및 면역원성 데이터(멀티플렉스 ECL 기반 면역분석법 및 MOPA)를 포함한다.
코호트 2
코호트 2에서는 지난 5년 동안 UTI 병력이 있는 안정적인 건강 상태의 60세 이상의 참자가를 대상으로 선택된 용량의 ExPEC10V(코호트 1의 1차 분석 결과를 기반으로 하여 고용량이 선택되었다)의 안전성, 반응원성 및 면역원성을 평가한다. 코호트 2의 경우, 연구는 이중 맹검, 위약 대조 설계를 가지며, 총 약 420명의 참가자가 등록되었고, 2:1 비율(ExPEC10V군 약 280명 참가자 및 위약군 약 140명)로 병렬로 무작위 배정되었다.
모든 참가자는 배정된 연구 백신접종군에 따라 1일에 선택된 용량의 ExPEC10V 또는 위약의 단일 IM 주사를 투여받았다(표 12).
코호트 2의 경우, 1차 분석은 안전성 및 면역원성 데이터를 포함하며, 모든 참가자가 30일 방문(방문 4)을 완료했거나 더 일찍 중단하였을 경우 발생한다. 모든 참가자가 181일 방문을 완료하였거나 더 일찍 중단한 경우 최종 분석이 발생한다. 모든 참가자에 있어서, 연간 추적 분석은 백신접종 후 1년(366일), 2년(731일)(MOPA에 적용되지 않음) 및 3년(1096일)차의 방문 시점까지 수집된 안전성 및 면역원성 데이터(멀티플렉스 ECL 기반 면역분석법 및 MOPA)를 포함한다.
대변 샘플 분석은 균유전체학을 이용하여 장내 세균총의 병원체(예를 들어, 클로스트리듐 디피실리균)의 유병률 및 ExPec10v 혈청형에 미치는 ExPEC10V의 영향을 평가하기 위해 선택된 서브세트의 참가자에서 수행된다.
참가자 수
총 약 824명의 참가자가 연구에 등록되었다; 404명의 참가자가 코호트 1에, 약 420명의 참가자가 코호트 2에 등록되었다.
중재 군: 중재 설명
ExPEC10V: EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O 항원 PS를 함유하는 인산염 완충 용액 중 대장균 생체접합체 백신. 1일에 ExPEC10V의 3가지 용량 중 하나의 단일 0.5 mL의 IM(삼각근) 주사.
ExPEC4V: EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O6A, O25B(4:4:4:8 μg PS/ExPEC 혈청형)의 O 항원 PS를 함유하는 식염수 완충액 중 대장균 생체접합체 백신. 1일에 ExPEC4V의 단일 0.5 mL의 IM(삼각근) 주사.
Prevnar 13: 무독성 디프테리아 CRM197 단백질에 개별적으로 연결된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F의 캡슐 항원의 당류의 멸균 현탁액. 1일에 단일 0.5 mL의 IM(삼각근) 주사, 단일 용량의 사전 충전형 주사기로 제공됨.
위약: 생리식염수. 1일에 위약의 단일 0.5 mL의 IM(삼각근) 주사.
ExPEC 연구 중재 자료는 표 9에 설명되어 있다.
표 9. BAC1001MV ExPEC 연구 백신
Figure pct00025
EPA = 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A; PS=다당류
ExPEC4V는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O6A 및 O25B의 O 항원 다당류(PS)로 구성된다.
ExPEC10V는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O 항원 다당류(PS)로 구성된다.
용량은 PS만을 기준으로 한다. EPA(μg)는 측정값이다.
ExPEC10V는 10개의 1가 원료 의약품(DS)으로 구성된다. 이 임상 연구를 위해 2개의 상이한 농도(중간 및 고)의 완제 의약품(DP)을 생성한다(표 10). 세 번째(저) 농도는 제형 완충액과 동일한 희석 완충액으로 고농도를 1:1로 희석하여 클리닉에서 얻는다. 각 DP는 pH 7.0(0.02% [w/w] 폴리소르베이트 80, 5% [w/w] 소르비톨, 10 mM 메티오닌)의 인산나트륨/인산칼륨 완충액에서 제형화된다.
표 10: 1/2a 상 임상 연구를 위한 ExPEC10V 백신의 조성
Figure pct00026
Figure pct00027
EPA = 담체 단백질로 사용되는 유전적으로 탈독소화된 P. 애루기노사 외독소 A
a 활성 성분은 PS 항원 및 담체 단백질(EPA)로 구성된 생물학적으로 합성된 접합체이다; 용량은 PS 모이어티에 대해서만 계산된다.
b "저농도"는 "고농도"를 희석 완충액으로 1:1로 희석하여 클리닉에서 얻는다.
안전성 평가
주요 안전성 평가에는 명시된 국소 및 전신 AE, 명시되지 않은 AE, SAE, 신체 검사, 활력 징후 측정 및 임상 실험실 테스트가 포함된다.
면역원성 평가
수집된 혈청의 주요 면역원성 평가는, 멀티플렉스 ECL 기반 면역분석법에 의해 측정되는 백신에 의해 유발된 ExPEC10V 및 ExPEC4V 혈청형 특이적 총 IgG 항체 수준 및 멀티플렉스 포맷(MOPA)의 옵소닌 식세포 살상 분석법(OPKA)에 의해 측정되는 같은 ExPEC10V 및 ExPEC4V 혈청형 특이적 기능성 항체의 평가를 포함한다. Prevnar 13에 의해 유발된 폐렴구균 항체 역가의 면역원성 평가는 수행되지 않는다.
ExPEC10V에 의해 유도된 혈청 항체 수준은 멀티플렉스 전기화학발광(ECL) 기반 면역분석법에 의해 평가된다. 이 분석법은 상이한 대장균 O-LPS 항원 또는 담체 단백질 EPA로 코팅된 다중-스팟 96웰 포맷 마이크로플레이트에서 고결합 탄소 전극을 조합한다. 혈청 샘플에 존재하는 항원 특이적 항체의 수준은 SULFO-TAG로 표지된 2차 항체(항-인간 IgG)를 사용하여 검출된다. SULFO-TAG는 결합된 IgG 항체의 양에 비례하여 증가하는 강도로 전기 자극의 존재 하에 발광한다. 이 분석법은 ICH(International Conference on Harmonization) 권장 사항에 따라 검증되었다.
ExPEC10V에 의해 유도된 기능적 항체의 수준은 멀티플렉스 옵소닌 식세포 분석법(MOPA)으로 측정된다. 간단히 말해서, 열 불활성화된 혈청 샘플은 연속적으로 희석되고, 다양한 유형의 항생제에 특이적으로 내성이 있는 다른 대장균 균주와 함께 인큐베이션된다. 그 후, 인간 보체 및 식세포(HL60)를 반응물에 첨가하고, 두 번째 인큐베이션 기간 후, 반응 혼합물의 분취량을 선택적으로 특정 항생제에 내성인 균주의 성장을 허용하는 특정 항생제가 보충된 배지를 함유하는 다양한 PVDF 친수성 막 필터 플레이트에 옮긴다. 밤새 성장시킨 후, 생존 박테리아의 수를 결정하기 위해 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산한다. 이 분석법은 ICH 권장 사항에 따라 검증되었다.
멀티플렉스 ECL 기반 면역분석법 및 MOPA에 의해 측정된 ExPEC10V 혈청형 항체 및 멀티플렉스 ECL 기반 면역분석법만으로 측정된 EPA의 경우, 모든 면역원성 시점에 대해 연구 백신접종군에 의해 면역원성의 다음 척도가 평가되고 표로 작성된다:
- 1일로부터 혈청 항체 역가가 2배 이상 및 4배 이상 증가한 참가자의 비율(백신접종 전)
- 기하 평균 역가(GMT)
- GMR: 기준선 이후/기준선 값으로부터 계산된 기준선으로부터의 배수 변화.
LTFU 기간 동안 각 혈청형에 있어서 면역원성에 대한 기술적 요약이 제공된다.
나중 상을 위한 용량 선택은 코호트 1(30일 결과)의 1차 분석 시점에 이용 가능한 증거 전체를 고려한다.
표 11: 코호트 1: 백신접종 일정
Figure pct00028
*ExPEC10V는 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O 항원 다당류(PS)로 구성된다.
** ExPEC4V는 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래한 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O6A 및 O25B의 O 항원 다당류(PS)로 구성된다.
*** Prevnar 13, 폐렴구균 13가 접합체 백신(디프테리아 CRM197 단백질)은 무독성 디프테리아 CRM197 단백질에 개별적으로 연결된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F의 캡슐 항원의 당류의 멸균 현탁액이다.
표 12: 코호트 2: 백신접종 일정
Figure pct00029
a ExPEC10V는 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O 항원 다당류(PS)로 구성된다.
연구의 코호트 2에 등록된 참가자의 무작위 배정 비율은 2:1(ExPEC10V:위약)이다. 코호트 2에 사용된 ExPEC10V 용량은 코호트 1의 1차 분석(30일) 결과를 기반으로 하였고, 이는 코호트 1에 사용된 고용량이다.
상태
전술한 연구의 코호트 1의 등록 및 백신접종이 완료되었다. 주요 안전성 문제는 확인되지 않았으며, ExPEC10V 백신은 허용가능한 안전성 프로파일을 갖는다.
코호트 1 임상 샘플의 면역원성의 분석이 수행되었고, 결과는 아래에 기재되어 있다.
코호트 2 백신접종은 ExPEC10V에 대한 고용량을 사용하여 시작되었고, 연구의 이 부분이 진행 중이다.
코호트 1 안전성 및 면역원성 결과
본원에 제시된 이러한 결과는 BAC1001 임상 연구(코호트 1)를 참조한다. 전체 분석 세트에는 416명의 참가자가 있었다. 각 참가자는 ExPEC10V의 단일 근육내 투여 용량 3개 중 1개 또는 ExPEC4V 또는 Prevnar의 활성 대조군 용량 2개 중 1개로 무작위 배정되었다; 104명은 ExPEC10V 저용량, 102명은 ExPEC10V 중간 용량, 104명은 ExPEC10V 고용량, 52명은 ExPEC4V(4:4:4:8 μg O1A, O2, O6A 및 O25B 다당류/용량), 54명은 Prevnar로 백신접종되었다. 총 413명의 참가자가 30일 방문을 완료했다. 392명(94.2%)의 참가자가 프로토콜 면역원성 분석에 따라 15일에 포함되었다.
안전성
전반적으로, 모든 ExPEC10V 용량은 내약성이 우수했다. 고용량에서 반응원성이 증가하는 경향이 있었고, ExPEC10V 고용량 반응원성은 홍반, 부기 및 구역을 제외하고는 Prevnar보다 낮거나 비슷했다. Prevnar와 대조적으로, ExPEC10V군에서 더 늦게 발병하는 국소 반응원성이 관찰되었고, 주사 부위 홍반 및 부기가 이러한 국소 사건을 경험한 참가자의 >90%에서 후기 발병 사건으로 보고되었다. 그러나 ExPEC10V의 반응원성 프로파일은 노인 집단에서 사용되는 다른 허가된 백신과 비교할 때 허용 가능하다.
면역원성
혈청형 특이적 혈청 항체(총 면역글로불린 G[IgG])의 수준을 측정하는 멀티플렉스 전기화학발광(ECL) 기반 면역분석법과 항체 매개 세균 옵소닌 식세포 살상을 측정하는 멀티플렉스 옵소닌 식세포 살상 분석법(MOPA)을 사용하여 기준선(백신접종 전 1일차)과 백신 접종 후 15일차에 백신 유발 면역 반응을 평가하였다.
항원 특이적 혈청 항체 수준(ECL)
O 항원 특이적 혈청 항체(총 IgG)의 수준은 테스트한 모든 ExPEC10V 용량 및 모든 백신 관련 혈청형에 대해 백신접종 후 15일차에 유의하게 증가했다. 고용량의 ExPEC10V 백신을 받은 대상체의 적어도 80%가 O25B, O6A, O2, O1A, O4, O15, O16 및 O18A를 포함하는 10개 혈청형 중 8개에 대해 백신접종 후 15일차까지 O 항원 특이적 항체 역가의 2배 이상의 증가를 나타냈음이 관찰되었다. ExPEC10V 중간 용량군의 경우, 대상체의 적어도 80%가 O25B, O2, O1A, O4 및 O15를 포함하는 10개 혈청형 중 5개에 대해 백신접종 후 15일차까지 O 항원 특이적 항체 역가의 2배 이상의 증가를 보여주고; ExPEC10V 저용량군의 경우, O25B, O2, O15 및 O16를 포함하는 10개 혈청형 중 4개에 대해 그러했다(도 4, 표 13). Prevnar 또는 ExPEC4V(비ExPEC4V 혈청형의 경우)를 투여받은 대상체 군에서 1일부터 15일까지 GMT의 최소 변화가 관찰되었다(도 4, 표 13).
ECL 분석의 경우, 모든 대상체를 분석하고 모든 면역원성 서브세트에 포함했다. 프로토콜 제외 기준에 따라 중대한 위반이 있는 대상체는 프로토콜별 분석에서 제외되었다. 기하 평균 역가(GMT), GMT FI(기하 평균 역가 배수 증가) 및 ECL 기반 면역분석에서 기준선으로부터 적어도 2배 및 4배 증가가 있는 참가자의 백분율이 하기 표 13에 요약되어 있다.
표 13. ECL 데이터 BAC1001 코호트 1
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
코호트 1: 1차 분석을 위한 출력
1= 기준선(1일)으로부터의 FI의 GM
2= 기준선(1일)으로부터 배수 증가가 있는 참가자의 백분율
CI=신뢰 구간; GM=기하 평균, GMT=기하 평균 역가; FI=배수 증가
GMT 및 GM FI에 대한 95% CI는 t-분포를 기반으로 한다.
Clopper-Pearson 방법을 사용하여 2배 및 4배 증가가 있는 참가자 백분율에 대한 95% CI를 얻는다.
데이터(도 4)에서 O75 다당류 항원에 대한 총 IgG 반응이 같은 양으로 투여된 다른 항원에 비해 더 낮음을 알 수 있는데(예를 들어, 1일 대비 15일에 적어도 2배의 증가가 있는 대상체의 비율이 더 낮음), 이는 놀라운 결과였다. 데이터는 또한 조성물 중 O75 다당류 항원의 양의 증가(즉, 고용량 8 μg 대 저용량 및 중간 용량 4 μg의 투여)가 O75 다당류 항원에 대한 유도된 면역 반응을 증가시켰음을 보여준다.
혈청 항체 기능성(MOPA)
부분 데이터는 코호트 1 MOPA 분석에 포함되었다. 표 14는 15일에서의 MOPA GMT 분석에 포함된 참가자 수를 보여준다. ExPEC10V에 의해 유도된 항체 반응의 기능성을 평가하기 위해 부분 데이터를 사용했지만 전체 데이터 세트를 사용할 수 있을 경우 분석 결론은 바뀌지 않았다.
표 14. MOPA GMT 분석에 포함된 참가자 수
Figure pct00035
MOPA에 의해 측정된 옵소닌 식세포 항체의 수준은 일반적으로 ECL 기반 면역분석법에 의해 측정된 O 항원 특이적 항체(총 IgG)의 수준과 일치했다. 기능적 항체의 증가된 수준은 테스트한 모든 용량군에서 10개의 ExPEC10V 혈청형 중 9개에 대해 15일에 관찰되었다(도 5).
다른 ExPEC10V 혈청형과 달리, 혈청형 O8의 경우, 검증된 MOPA 분석은 1일에 ExPEC10V 백신접종 후 15일차에 기능적 항체의 백신 매개 증가를 보여줄 수 없었지만(도 5), 혈청형 O8 총 IgG 역가의 증가가 관찰되었다(도 4). 검증된 분석이 기능적 O8 항체를 검출할 수 없는지를 구별하기 위한 연구가 시작되었다. 수정된 MOPA 분석법과 1일차 및 15일차 혈청을 사용한 후속 실험에서 성공적으로 2배 이상의 15일의 기능적 항체 증가를 나타냈으며(데이터 미제시), ExPEC10V 백신이 혈청형 O8에 대해서도 기능적 항체를 실제로 유도했음을 입증했다. 임상 개발을 위해, 수정된 O8 MOPA는 상당한 시간이 소요되는 분석법의 재검증과 임상 샘플의 재검사를 요하여, 처음에는 O8 다당류 항원을 포함하지 않는 백신 조성물 개발을 진행하기로 했다. 그러나 10가 ExPEC 백신 조성물의 O8 생체접합체가 대장균 O8 혈청형에 대한 기능적 항체를 유도한다는 것이 후속 실험으로부터 명백하며, 따라서 이러한 생체접합체는 아래 실시예에서 기재된 9가 백신 조성물에 성공적으로 첨가될 가능성이 있다.
최고 수준의 옵소닌 식세포 항체가 혈청형 O2에서 관찰되었다; 고용량의 해당 백신으로 백신접종한 대상체의 95%는 백신접종 후 15일차에 항-O2 옵소닌 항체 역가의 2배 이상의 증가를 보여주었다. 위에서 논의된 바와 같이 제한된 수준의 기능적 항체가 관찰된 O8 혈청형을 제외하고, 최저 수준의 옵소닌 식세포 항체가 혈청형 O75에서 관찰되었다; 고용량의 백신으로 백신접종한 대상체의 36%가 백신접종 후 15일차에 항-O75 옵소닌 항체 역가의 2배 이상의 증가를 보여주었다. 따라서 O75 혈청형에 대한 MOPA 데이터는 위에 기재된 이 혈청형에 대한 ECL 데이터와 일치하며, 이는 동일한 농도의 조성물 내의 몇몇 다른 접합체, 예를 들어, 대장균 O6, O1 또는 O2 접합체의 면역원성과 비교하여, 대장균 O75 항원 다당류의 접합체의 상대적으로 낮은 면역원성을 뒷받침한다. 또한, Prevnar 또는 ExPEC4V(비ExPEC4V 혈청형의 경우)를 투여받은 대상체 군에서 1일부터 15일까지 GMT의 최소 변화가 관찰되었는데(도 5), 이는 각각의 백신 조성물에 존재하지 않는 혈청형에 대한 예상과 일치한다.
기하 평균 역가(GMT), 기하 평균 배수 증가(GMR FI) 및 MOPA에서 기준선으로부터 적어도 2배 및 4배의 증가가 있는 참가자의 백분율은 10개의 혈청형 각각에 대해 표 15에 요약되어 있다.
표 15. MOPA 데이터 BAC1001 코호트 1
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
코호트 1: 1차 분석을 위한 출력
1= 기준선(1일)으로부터의 FI의 GM
2= 기준선(1일)으로부터 배수 증가가 있는 참가자의 백분율
CI=신뢰 구간; GM=기하 평균, GMT=기하 평균 역가; FI=배수 증가
GMT 및 GM FI에 대한 95% CI는 t-분포를 기반으로 한다.
Clopper-Pearson 방법을 사용하여 2배 및 4배 증가가 있는 참가자 백분율에 대한 95% CI를 얻는다.
용량 선택
각 용량군의 기준선으로부터 15일까지의 log10배 증가의 평균에 기반한 면역원성 용량 선택 알고리즘은, 2개의 분석 세트(PPI 및 FAS)와 2종의 분석법(ECL 및 MOPA)을 고려하는 이 시험의 코호트 2에 대한 ExPEC10V 고용량을 확인하였다.
혈청형 O2, O4, O15, O16 및 O18A의 경우, 고용량군은 두 분석법 모두에서 다른 2개의 ExPEC10V 용량과 비교하여 15일에 더 높은 GMT, GMR 및 2배 및 4배의 증가가 있는 참가자의 백분율을 나타냈다. 혈청형 O25B의 경우, 중간 용량군은 일반적으로 3개의 ExPEC10V 용량군 중에서 더 높은 GMT, GMR 및 2배 및 4배의 증가가 있는 참가자의 백분율을 나타냈다; 이 혈청형의 경우, O 항원 용량은 중간 및 높은 ExPEC10V 용량군 모두에 대해 동일했다(16 μg). 혈청형 O1A와 O6A 둘 다의 경우, 결과는 고용량과 중간 용량 사이에서 혼합되었다. 혈청형 O75에서, ExPEC10V 용량에 대해 측정 가능한 기능적 항체 반응이 있었다. 측정 가능한 기능적 항체 반응은 위에서 논의한 바와 같이 혈청형 O8에 대한 검증된 분석에서 검출되지 않았다. 비ExPEC4V 혈청형에서, 2개의 활성 대조군에서 낮은 기능적 항체 반응이 관찰되었다; 항체 반응은 백신 유발 반응이 아닌 기존 항체에서 나왔다. 이러한 결과를 바탕으로 BAC1001 임상시험의 코호트 2를 위해 ExPEC10V의 고용량을 선택하였다.
결론
ExPEC10V 백신은 강력한 항체 반응을 유도했으며 기준선 역가(1일)와 비교할 때 백신접종 후 15일에 모든 백신 관련 혈청형에 대해 O 항원 특이적 혈청 항체의 증가가 관찰되었다. 대장균 옵소닌 식세포 살상을 매개하는 ExPEC10V 유도 기능적 항체는 혈청형 O8을 제외한 모든 백신 관련 혈청형에 대해 검증된 MOPA에서 검출되었다. 혈청형 O8의 경우, 수정된 MOPA를 사용한 후속 연구에서 기능적 항체 반응을 측정했다. 특히, O75 반응은 같은 용량의 다른 혈청형보다 4 μg 및 8 μg 용량에서 더 약했으며, 이는 이 연구에서 놀랍고도 예측할 수 없는 발견이었다. 다가 당접합체 조성물에 의해 생성된 대장균 O75 혈청형에 대한 면역 반응을 개선하기 위해, 일 양태에서 본 발명은 혈청형 O75 항원 다당류의 용량을 예를 들어 일부 다른 혈청형의 용량의 약 1.2~8배, 예를 들어, 약 1.5~4배, 예를 들어 약 1.5~2.5배, 예를 들어, 일부 다른 혈청형, 예컨대, O6 또는 O1의 용량의 약 2배, 예를 들어, 약 16 μg까지 증가시키는데, 이는 가장 관련성이 높고 널리 퍼진 세 가지 혈청형 O1A, O2 및 O6A보다 높고 혈청형 O25B 항원 다당류와 유사하다. 초기 실험에서(예를 들어, 본 실시예의 위 및 실시예 5 및 6 참조, 즉, 본원에 개시된 ExPEC10V 백신을 사용한 임상 데이터가 이용 가능하기 전 참조) O75 항원 다당류의 용량은 기껏해야 O1A, O2 및 O6A 항원 다당류의 용량만큼 높았거나, 또는 실제로 특정 테스트한 군에서 O1A 및 O6A 항원 다당류보다 2배 더 낮았고, O25B 항원 다당류보다 2~4배 더 낮았다. 대조적으로, 본 발명의 특정 양태에서 O75의 용량은 따라서 O1, O2 및/또는 O6의 용량에 비해 실제로는 증가된다.
코호트 2 안전성 및 면역원성 결과
이 연구의 코호트 2에서 지난 5년 동안 UTI 병력이 있는 안정적인 건강 상태의 60세 이상의 참가자 총 약 420명이 등록되었고 2:1 비로 병렬로 무작위 배정되었다(전체 결과 분석이 수행된 세트에는 ExPEC10V(고용량)군의 참가자 278명과 위약군의 참가자 138명이 포함되었다).
안전성
전반적으로 ExPEC10V 백신은 내약성이 우수했다. 반응원성 프로파일은 코호트 1에서 ExPEC10V의 중간 및 고용량에서 관찰된 것과 일반적으로 비슷했다. 가장 빈번한 명시된 국소 AE는 통증/압통이었고 가장 빈번하게 보고된 전신 AE는 근육통, 두통 및 피로였다. 주사 부위 홍반 및 부기가 가장 흔한 후발성 사건이었다(최초 발병까지의 시간 > 백신접종 후 5일). ExPEC10V의 반응원성 프로파일은 노인 집단에서 사용되는 다른 허가된 백신과 비교할 때 허용 가능하다.
면역원성
혈청형 특이적 혈청 항체(총 IgG)의 수준을 측정하는 멀티플렉스 ECL 기반 면역분석법을 사용하여 기준선(백신접종 전 1일)과 백신접종 후 15일차 및 30일차에 백신 유발 항체 반응을 평가했다.
항원 특이적 혈청 항체 수준(ECL, 1일, 15일 및 30일)
ExPEC10V 백신은 증가하는 값의 GMT, GMT FI 및 1일부터 15일까지 기준선으로부터 역가의 적어도 2배의 증가가 있는 참가자의 백분율을 기준으로 모든 혈청형에 대해 면역원성이었다. 15일부터 30일까지 세 가지 측정치 모두에서 최소한의 변화가 있었다.
혈청형 O2, O4, O15 및 O16에서 가장 높은 항체 반응이 관찰되었는데, ExPEC10V로 백신접종한 참가자 중 적어도 80%가 백신접종 후 15일 및 30일까지 항체 반응의 2배 이상의 증가를 보여주었다. 혈청형 O1A, O6A 및 O25B의 경우, 참가자의 적어도 70%가 항체 반응의 2배 이상의 증가를 보여주고, 혈청형 O8 및 O18A의 경우, 참가자의 적어도 60%가 항체 반응의 2배 이상의 증가를 보여준다. 혈청형 O75의 경우, 더 낮은 항체 반응이 관찰되었으나, 참가자의 적어도 50%에서 항원 특이적 항체 반응의 2배 이상의 증가가 관찰되었다. 1일부터 15일 및 30일까지 GMT의 최소 변화가 위약을 받은 대상체 군에서 관찰되었다(표 16).
기하 평균 역가(GMT), GMT FI(기하 평균 역가 배수 증가) 및 ECL 기반 면역분석에서 기준선으로부터 적어도 2배 및 4배 증가가 있는 참가자의 백분율이 하기 표 16에 요약되어 있다.
표 16. ECL 데이터 BAC1001 코호트 2(1일, 15일 및 30일)
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
코호트 2: 1차 분석을 위한 출력
1= 기준선(1일)으로부터의 FI의 GM
2= 기준선(1일)으로부터 배수 증가가 있는 참가자의 백분율
CI=신뢰 구간; GM=기하 평균, GMT=기하 평균 역가; FI=배수 증가
GMT 및 GM FI에 대한 95% CI는 t-분포를 기반으로 한다.
Clopper-Pearson 방법을 사용하여 2배 및 4배 증가가 있는 참가자 백분율에 대한 95% CI를 얻는다.
15일에서의 반응의 규모(GMT)는 모든 혈청형에 대해 코호트 1과 2 사이에서 유사했다.
실시예 8: 신규한 ExPEC 조성물 및 토끼에서의 면역원성
ExPEC 백신의 2개의 맞춤형 조성물(본원에서 맞춤형 제형이라고도 함)(ExPEC9V a 및 b, 표 17)을 포함하는 새로운 연구를 설계하였다. 이러한 맞춤형 제형은 혈청형 O8 다당류가 고갈되고 대장균 혈청형 O75에 대한 다당류 함량이 증가되었는데(ExPEC9V b), 이는 Ph1/2a 임상 시험에서 코호트 1을 분석하는 동안 이들 항원에 대해 낮은 면역원성이 관찰되었기 때문이다. 위에서 기재한 초기의 실험을 확인하기 위한 대조군으로서, ExPEC10V 조성물도 평가했다. 식염수 대조군(백신 미접종 군)도 포함되었다.
연구의 전반적인 목적은 상기 기재된 ExPEC10V와 비교하여 백신 조성의 변화(O8 다당류의 고갈 및 특히 O75 항원 다당류에 대한 용량 증가)가 백신 유발 면역 반응에 영향을 미치는지를 평가하는 것이었다. 특히, 다가 접합체 백신 조성물에서 예를 들어, 대장균 O6 항원 다당류의 접합체와 비교하여 대장균 O75 항원 다당류의 접합체의 양을 증가시키는 것이 실제로 혈청형 O75의 대장균에 대한 면역 반응을 선택적으로 개선하고, 따라서 구성 대장균 혈청형에 걸쳐 보다 균일하게 증가된 면역 반응을 초래하는지를 살펴보는 것이 목적이었다. 이를 위해, 다양한 제형의 ExPEC 백신에 의해 유도된 항체 반응을 뉴질랜드 백색 토끼(NZW)를 사용하여 확립된 면역원성의 전임상 모델에서 평가했다.
실험 설계
뉴질랜드 백색 토끼(NZW, 연구 시작 시 13주령)는 2주 간격으로 투여된 다양한 제형의 ExPEC 백신 또는 식염수로 3회의 근육내 면역화(500 μL/주사)를 받았다(표 17). 연구는 4개의 상이한 군을 포함하였다(표 18): 군 1(ExPEC10V)은 8 μg/용량의 O1A, O2, O6A, O4, O8, O15, O16, O18 및 O75 및 16 μg/용량의 O25B(즉, 각각 O1A, O2, O6A, O4-Glc+, O8, O15, O16, O18A 및 O75 항원 다당류 16 μg/mL 및 O25B 항원 다당류 32 μg/mL를 포함하는 조성물 0.5 mL, 각각의 항원 다당류는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합됨, 상기 실시예 참조)를 투여받았다; 군 2(ExPEC9V a)는 8 μg/용량의 O1A, O2, O6A, O4, O15, O16, O18A 및 O75 및 16 μg/용량의 O25B(즉, 각각 O1A, O2, O6A, O4-Glc+, O15, O16, O18A 및 O75 항원 다당류 16 μg/mL 및 O25B 항원 다당류 32 μg/mL를 포함하는 조성물 0.5 mL, 각각의 항원 다당류는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합됨, 상기 실시예 참조)를 투여받았다; 군 3(ExPEC9V b)은 8 μg/용량의 O1A, O2, O6A, O4, O15, O16 및 O18A 및 16 μg/용량의 O75 및 O25B(즉, 각각 O1A, O2, O6A, O4-Glc+, O15, O16 및 O18A 항원 다당류 16 μg/mL 및 O25B 및 O75 항원 다당류 32 μg/mL를 포함하는 조성물 0.5 mL, 각각의 항원 다당류는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합됨, 상기 실시예 참조)를 투여받았다.
배합에 사용된 완충액은 6.19 mM KH2PO4, 3.81 mM Na2HPO4, 5% 소르비톨(w/w), 10 mM 메티오닌, 0.02% PS80 (w/w), pH 7.0을 함유하였다. 대조군(군 4)의 동물은 식염수(0.9% (w/v) 염화나트륨 용액)를 받았다. 각 실험군에는 10마리의 동물이 포함되었다. ELISA로 측정한 혈청 항체 수준(총 IgG)을 면역화 전(0일) 및 면역화 후(14일, 28일 및 42일) 평가했다.
표 17. 상이한 다가 ExPEC 백신 조성물.
Figure pct00048
표 18. 실험군.
Figure pct00049
잠재적인 주사 부위 반응을 각 용량 전, 각 투약일에 용량 후 약 6시간, 주사 후 7일 동안 매일 Draize 채점 시스템을 사용하여 모니터링했다. 증례 주사 부위 영향이 관찰되면 점수가 0이 될 때까지 매일 관찰을 계속했다.
개별적으로 전처리 동안 1회, 각 용량 후 3일 동안 매일, 그 후 매주 1회 동물의 체중을 쟀다(그램 단위). 건강이 좋지 않거나 바람직하지 않은 임상 효과에 대해 동물을 적어도 하루에 한 번 관찰했다. 투약일에 동물을 투약 전과 치료 약 6시간 후(주사 부위 검사와 동시에) 치료에 대한 반응에 대해 조사했다. 용량 전, 각 용량 후 6시간 및 24시간 후에 직장 디지털 온도계를 사용하여 체온을 모니터링하고 기록했다. 체온이 38~40℃의 토끼의 정상 범위를 벗어나는 경우, 체온이 이 값 이내로 돌아올 때까지 매일 추가 측정을 수행했다.
동물은 2주 간격으로 투여된 ExPEC10V, ExPEC9V a, ExPEC9V b 또는 식염수로 3회의 근육내 면역화를 받았다. 항체 수준은 0일(백신접종 전) 및 14일, 28일 및 42일(백신접종 후)에 ELISA에 의해 측정되었다.
ExPEC 백신 조성물에 포함된 각 O 항원에 의해 유도된 혈청 항체 수준을 Gen 5 소프트웨어를 사용하여 ELISA로 분석했다. 450 nm에서의 OD를 4 파라미터(4PL) 비선형 회귀 모델에서 분석하였다. 이중 12단계 적정 곡선을 기반으로 각 개별 샘플에 대해 최대 유효 농도의 절반(EC50)을 계산했다. 샘플 결과는 EC50 역가로 표시된다.
NZW 토끼에서 항원 특이적 혈청 항체 반응의 평가는 테스트한 모든 ExPEC 백신 조성물(ExPEC10V, ExPEC9V a 및 ExPEC9V b)이 식염수 대조군과 비교하여 백신접종 후 14일, 28일 및 42일에 모든 백신 항원에 대한 항체 반응의 유의한 증가를 유도함을 보여주었다(도 6). 테스트한 모든 ExPEC 백신 조성물의 두 번째 용량은 백신접종 후 14일부터 28일까지 항원 특이적 항체 반응의 유의한 증가에 의해 입증된 바와 같이 항체 반응을 부스트했다. ExPEC 백신의 세 번째 용량의 추가 부스트 효과는 특정 항원 및 조성물에 대해 명백했다.
O75 항원의 기하 평균 항체 역가(GMT)는 O75 다당류의 농도가 증가함에 따라 증가했다(도 6). 증가된 농도의 다당류 O75(16 μg)를 함유하는 ExPEC9V b 조성물은 단지 8 μg의 O75 다당류를 함유하는 ExPEC9V a 및 ExPEC10V 조성물과 비교하여 백신접종 후 14일, 28일 및 42일에 더 높은 O75 GMT 및 GMT 배수 증가를 유도하였다(표 19).
표 19. 다양한 ExPEC 백신 조성물에서 O75 항체 반응의 평가.
Figure pct00050
n.a.: 해당 없음; GMT: 기하 평균 항체 역가; CI: 신뢰 구간; 0일(백신접종 전 기준선)과 비교하여 GMT 배수 증가.
체중, 체온 및 주사 부위 반응의 평가는 테스트한 모든 ExPEC 백신 조성물이 동물에서 내약성이 우수하였음을 보여준다(데이터 미제시).
결론적으로, 테스트한 모든 ExPEC 백신 조성물은 NZW 토끼에서 면역원성이었으며, 식염수 대조군과 비교할 때 백신접종 후 14일, 28일 및 42일에 항원 특이적 혈청 항체 반응의 유의한 증가가 관찰되었다. 테스트한 모든 ExPEC 백신 조성물은 다당류 특이적 항체 반응을 부스트할 수 있었다. 또한, 테스트한 모든 ExPEC 백신 조성물은 동물에서 내약성이 우수하였고, 백신 관련 유해 사건은 관찰되지 않았다. 중요하게도, 증가된 농도의 O75 다당류를 함유하는 ExPEC9V b 조성물은 더 낮은 농도의 O75 다당류를 함유하는 조성물(ExPEC9Va 및 ExPEC10V)과 비교할 때 더 높은 O75 항체 반응(GMT 및 GMT 배수 증가)을 유도하였다. 따라서, ExPEC9V b 조성물에서 O75의 증가된 용량은 O75 혈청형에 대한 면역 반응을 개선하고, 따라서 이러한 조성물은 ExPEC9V b 조성물에서 혈청형에 걸쳐 보다 균일하게 증가된 면역 반응을 유도한다.
실시예 9. 신규한 ExPEC9V 조성물을 이용한 인간 대상 3상 효능 시험.
증가된 농도의 O75 항원 다당류를 갖는 9가 ExPEC 백신 조성물을 사용하여 인간에서의 효능 연구를 수행하였다. 연구 제목은 "과거 2년 동안 요로 감염의 병력이 있는 60세 이상 성인의 침습성 장외 병원성 대장균 질환 예방에서 ExPEC9V 백신접종의 효능, 안전성 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 이중 맹검, 위약 대조, 다기관 3상 연구"이며, 본원에서는 'BAC3001' 연구로 지칭된다.
ExPEC9V는 60세 이상 성인의 침습성 장외 병원성 대장균(ExPEC) 질환(IED) 예방을 위해 개발 중인 9가 백신 후보이다. ExPEC9V는 이전 실시예에서 자세하게 기재된 바와 같이, 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 개별적으로 생체접합된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O 항원 다당류(PS)로 구성된다. ExPEC9V 백신은 모든 IED의 약 65%를 차지하는 ExPEC의 가장 널리 퍼진 O 혈청형 중에 있는 9개의 표시된 대장균 혈청형을 커버한다.
목적 및 종점
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
전반적인 설계
이는 지난 2년 동안 UTI 병력이 있는 60세 이상의 의학적으로 안정적인 성인 약 18,556명을 대상으로 실시되는 무작위, 이중 맹검, 위약 대조, 병렬군, 다기관, 중재적 3상 연구이다.
모든 참가자는 ExPEC9V 또는 위약에 대해 1:1 비로 병렬로 등록되고 무작위 배정되며 1일에 연구 백신(0.5 mL 근육내 주사(삼각근 내))을 받는다. 최초의 1차 종점(혈액, 기타 멸균 부위 또는 소변에서 미생물학적 확인 포함)에 대한 최종 분석은 연구에서 72건의 백신 혈청형 IED 사건이 관찰되었을 때 또는 늦어도 마지막 참가자가 백신접종 후 36개월 동안 추적 관찰되었을 때 발생한다. 두 번째 1차 종점(혈액 또는 기타 멸균 부위에서 미생물학적 확인 포함)은 최초의 1차 종점이 통계적 유의성을 보일 때 계층적 방식으로 테스트된다. 두 번째 1차 종점(혈액 또는 기타 멸균 부위에서 미생물학적 확인 포함)의 최종 분석의 경우, 두 번째 1차 종점에 따른 53건의 백신 혈청형 IED 사건을 관찰해야 한다. ExPEC9V 백신 조성물은 16 μg/mL의 각각의 O1A, O2, O6A, O4-Glc+, O15, O16 및 O18A 항원 다당류 및 32 μg/mL의 O25B 및 O75 항원 다당류를 포함하며, 각 항원 다당류는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 생체접합된다. 예를 들어, 위 참조(예를 들어, 이는 위의 실시예 8의 토끼 면역화의 군 3에서 사용된 동일한 조성물임; 부형제는 실시예 7의 BAC1001 연구에서 사용된 ExPEC10V 백신에 대해 기술된 것과 동일하다). 위약은 0.9% w/v의 염화나트륨이다.
안전성 평가
주요 안전성 평가에는 SAE, 신체 검사 및 활력 징후가 포함된다. 또한, 명시된 국소 및 전신 AE 및 명시되지 않은 AE는 "안전성 서브세트"의 참가자, 즉 추가 평가를 위해 무작위화하기 전에 정보에 입각한 동의를 제공한 선택된 연구 현장의 약 4,000명의 참가자에 대해 기록된다.
면역원성 평가
면역원성의 평가의 경우, 각각의 9가지 백신 O 혈청형 및 담체 단백질 EPA에 대한 백신에 의해 유도된 IgG 항체 수준을 멀티플렉스 ECL 기반 면역분석으로 측정하고, 혈청형 특이적 기능적 항체를 MOPA로 측정한다. 면역원성 분석은 "면역원성 서브세트"의 참가자, 즉 추가 면역원성 평가를 위해 무작위화하기 전에 정보에 입각한 동의를 제공한 선택된 연구 현장의 약 1,200명의 참가자, 그리고 확인된 IED 사건이 있는 모든 참가자, 그리고 UTI 또는 급성 세균성 전립선염(ABP) 사건이 있는 면역원성 서브세트의 참가자에 대해 수행된다.
효능 평가
1차 목적은 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 의해 유발된 최초의 IED 사건의 예방에서 위약과 비교하여 ExPEC9V의 효능을 입증하는 것이다. IED, UTI 또는 ABP로 정의된 사건은 전체 연구 기간(1,096일, 3년) 동안 모든 참가자에 대해 수집된다. 연구 추적관찰 동안 참가자는 UTI 또는 ABP의 임의의 징후 또는 증상을 경험하거나 전신 감염으로 인해 발생할 수 있는 증상의 임의의 새로운 발병 또는 악화를 경험하는 경우 가능한 한 빨리 연구 현장에 알릴 것이 기대된다. 또한, 모든 참가자는 과거의 입원 또는 UTI, ABP 또는 잠재적 IED였을 수 있고 현장에서 실시간으로 포착되지 않은 의료 사건에 대해 질문을 받게 될 것이다. IED(모든 참가자) 및 UTI 또는 ABP(면역원성 서브세트만)와 관련된 의료 접촉과 관련된 의료 자원 활용 데이터가 수집된다. 건강 관련 삶의 질을 측정하기 위해 SF-36 버전 2와 EQ-5D-5L의 두 가지 환자 보고 결과(PRO) 도구가 사용된다. 또한, 쇠약은 SPPB 및 쇠약 지수 점수를 사용하여 평가된다.
면역원성 평가
면역원성의 평가의 경우, 각각의 9가지 백신 O 혈청형 및 담체 단백질 EPA에 대한 백신에 의해 유도된 IgG 항체 수준을 멀티플렉스 ECL 기반 면역분석으로 측정하고, 혈청형 특이적 기능적 항체를 MOPA로 측정한다. 면역원성 분석은 "면역원성 서브세트"의 참가자, 즉 추가 면역원성 평가를 위해 무작위화하기 전에 정보에 입각한 동의를 제공한 선택된 연구 현장의 약 1,200명의 참가자, 그리고 확인된 IED가 있는 모든 참가자, 그리고 UTI 또는 ABP 사건이 있는 면역원성 서브세트의 참가자에 대해 수행된다. 1일 및 30일의 면역원성 혈액 샘플을 모든 참가자로부터 수집한다.
안전성 평가
주요 안전성 평가에는 SAE, 신체 검사 및 활력 징후가 포함된다. 또한, 명시된 국소 및 전신 AE 및 명시되지 않은 AE는 "안전성 서브세트"의 참가자, 즉 추가 평가를 위해 무작위화하기 전에 정보에 입각한 동의를 제공한 선택된 연구 현장의 약 4,000명의 참가자에 대해 기록된다.
효능 분석
첫 번째 1차 종점의 1차 분석은 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 의해 유발되고 프로토콜별 효능(PPE) 모집단에서 위약군과 비교한 활성 백신(ExPEC9V)군에서 백신접종 후 적어도 29일 후에 발병한 적어도 1건의 IED 사건이 있는 참가자의 수를 평가한다. 두 번째 1차 종점의 1차 분석은 PPE 모집단에서 위약군과 비교하여 활성 백신(ExPEC9V)군에서 백신접종 후 적어도 29일 후에(30일부터) 발병한 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 의해 유발된, 혈액 또는 기타 멸균 부위에서 미생물학적 확인을 통한 적어도 1회의 IED 사건이 있는 참가자 수를 평가한다. 추적관찰 시간도 고려된다. IED 사건이 있는 참가자의 경우, 추적관찰 시간은 백신접종과 최초의 사건 발생 사이의 시간으로 정의된다. IED 사건이 없는 참가자의 경우, 이는 백신접종과 마지막 방문(또는 연구를 중단한 참가자의 경우 마지막 접촉) 사이의 시간이다. VE ≤20%라는 귀무가설을 대립가설 VE >20%에 대해 검정한다.
단계적 계층적 테스트 전략이 다음의 종점에 적용된다:
일차:
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 혈액, 기타 멸균 부위 또는 소변의 미생물학적 확인을 통한 최초의 IED
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 혈액 또는 기타 멸균 부위의 미생물학적 확인을 통한 첫 번째 IED
이차:
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 모든 IED(참가자당 여러 IED 포함)
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 최초의 입원 IED 사건
- ExPEC O 혈청형에 의해 유발된 패혈증에 대한 기준을 충족하는 최초의 IED 사건
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 최초의 균혈증 IED 사건
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 최초의 신우신염 사건
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 최초의 UTI
- ExPEC9V O 혈청형에 의해 유발된 모든 UTI(참가자당 여러 UTI 포함)
- 임의의 ExPEC O 혈청형에 의해 유발된 최초의 IED 사건
- 임의의 ExPEC O 혈청형에 의해 유발된 최초의 신우신염 사건
- 임의의 ExPEC O 혈청형에 의해 유발된 최초의 UTI
이 테스트 전략에서, 두 번째 1차 종점은 첫 번째 1차 종점이 통계적 유의성을 보인 경우에만 테스트된다. 첫 번째 1차 종점이 72건의 사건으로 통계적 유의성을 보인 경우, 53건 미만의 사건이 해당 시점에 관찰되면 두 번째 1차 종점(혈액 또는 기타 멸균 부위에서 미생물학적 확인 포함)에 대한 중간 분석을 수행한다. 두 번째 1차 종점이 유의하지 않은 경우, 두 번째 1차 종점 정의에 따른 53건의 백신 혈청형 IED 사건이 관찰되었을 때 두 번째 1차 종점의 최종 분석이 수행된다. 또한 첫 번째 주요 2차 종점은 두 1차 종점이 모두 통계적 유의성을 보인 경우에만 테스트된다. 첫 번째 주요 2차 종점에는 추적관찰 기간이 끝날 때까지 백신접종 후 적어도 29일 후에 발병된 모든 ExPEC9V IED 사건(PPE)이 포함된다.
참가자는 아래 기준이 충족되고 독립적인 종점 심사 위원회(IEAC)에서 확인하는 경우 IED가 있는 것으로 간주된다.
IED 진단을 받은 성인 참가자는 다음이 있는 임의의 참가자이다:
* 다음 중 하나의 존재로 표시되는 전신 세균 감염의 징후 및 증상:
- 온도 <36.0℃(96.8℉) 또는 >38.0℃(100.4℉),
- 빈맥(HR) >90 bpm,
- 빈호흡(RR) >20회 호흡/분, 또는
- WBC 수 <4 또는 >12 x 109/L 또는 10% 미성숙 (밴드) 형태,
그리고
* 다음의 배양에 의한 미생물학적 확인:
- 혈액 또는 임의의 기타 멸균 부위(예를 들어, 뇌척수액[CSF], 흉막)의 대장균,
및/또는
- UTI 징후/증상이 있고 다른 식별 가능한 감염 부위가 없고 기준선으로부터 2점 이상의 순차적 장기 부전 평가(SOFA) 총 점수의 급성 변화가 있는 소변 내 대장균(콜로니 형성 단위/mL ≥105).
1차 및 2차 종점의 경우, 임의의 ExPEC9V O 혈청형(즉, O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 또는 O75)에 의해 유발된 IED와 함께, O 혈청형 분석이 가능해야 하며 IED는 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 또는 O75 양성으로 확인되어야 한다. 임의의 ExPEC O 혈청형과 관련된 2차 종점의 경우, O 혈청형 분석을 사용할 수 없어야 한다. IEAC 판단에 따라 전신 감염이 대장균에만 기인할 수 없는 경우 배양 결과에 여러 병원체가 있는 증례는 1차 또는 2차 종점으로 간주되지 않는다. 혼합 병원체 및 대장균의 존재가 있는 증례는 민감도 분석에 포함된다.
참가자가 UTI의 징후 및 증상으로 의사 및/또는 연구 현장에 연락한 경우, 아래 기준을 충족하고 신우신염의 경우에 대해 IEC에서 확인하는 경우 참가자가 증상이 있는 UTI가 있는 것으로 정의된다.
문서화된 농뇨(백혈구(WBC) 수 ≥10개 세포/mm3)와 징후 및 증상에 대한 다음 정의 중 하나를 가진 소변 내 대장균 배양에 의한 미생물학적 확인(콜로니 형성 단위 ≥105/mL)이 있는 성인:
· 단순 UTI의 경우, 다음 징후 또는 증상 중 적어도 2개:
- 배뇨 장애,
- 빈뇨,
- 요절박, 또는
- 치골상부 통증.
· 복합 UTI(cUTI)의 경우:
- 다음 징후 또는 증상 중 적어도 2개:
o 오한, 경직 또는 열과 관련된 온기(예를 들어, 체온 ≥38.0℃),
o 배뇨 장애, 빈뇨 또는 요절박,
o 하복부 통증 또는 골반통, 또는
o 구역 또는 구토,
그리고,
- 다음 합병 요소 중 적어도 1개:
o 요폐력(남성 참가자),
o 현재 내재하는 요도 카테터,
o 폐쇄성 요로병증, 또는
o 임의의 관련된 기능적 또는 해부학적 이상.
· 다음 증상 중 적어도 2개를 동반하는 신우신염의 경우(요로의 근본적인 이상 여부에 관계없이):
- 오한, 경직 또는 열과 관련된 온기(예를 들어, 체온 ≥38.0℃), 또는
- 신체 검사에서 갈비척추각의 옆구리 통증 또는 압통, 또는
- 구역 또는 구토.
· 재발성 UTI(rUTI)의 경우:
- 지난 6개월 동안 2회의 UTI 빈도로 단순 및/또는 복합 UTI의 재발, 또는
- 1년에 적어도 3회의 빈도로 단순 및/또는 복합 UTI의 재발.
2차 종점의 경우, 임의의 ExPEC9V O 혈청형(즉, O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 또는 O75)에 의해 유발된 UTI와 함께, O 혈청형 분석이 가능해야 하며 UTI는 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 또는 O75 양성으로 확인되어야 한다. 임의의 ExPEC O 혈청형과 관련된 2차 종점의 경우, O 혈청형 분석을 사용할 수 없어야 한다. 배양 결과에 여러 병원체가 있고 대장균의 존재가 있는 증례는 2차 종점에 대해 고려되지 않는다. 이러한 증례는 민감도 분석에 포함된다.
탐색적 종점으로서, IED(대장균의 미생물학적 확인 제외) 또는 UTI의 위의 정의를 충족하지만 P. 애루기노사에 대해 양성인 샘플(UTI의 경우 소변)이 있는 참가자는 각각 P. 애루기노사로 인한 침습성 질환 또는 P. 애루기노사 UTI가 있는 것으로 보고된다. P. 애루기노사에 대해서는 혈청형 분석을 수행하지 않는다. P. 애루기노사의 존재가 있는 혼합 병원체를 가진 샘플은 이 탐색적 종점에 대해 고려되지 않는다.
ABP에 대한 탐색적 효능 종점으로서, ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 의해 유발된 사건이 보고된다.
참가자가 ABP의 징후 및 증상으로 의사 및/또는 연구 현장에 연락하는 경우, 아래 기준을 충족하는 경우 참가자가 증상이 있는 ABP가 있는 것으로 정의된다.
문서화된 농뇨(WBC 수 ≥10개 세포/mm3)와 열 및 다음의 급성 발병을 수반한, 소변 내 대장균 배양에 의한 미생물학적 확인(콜로니 형성 단위 ≥105/mL)이 있는 성인:
· 자극성 배뇨 증상:
o 배뇨 장애,
o 빈뇨,
o 요절박, 또는
· 폐쇄성 배뇨 증상:
- 소변주저,
- 불완전 배뇨,
- 배뇨 힘주기,
- 약한 배뇨, 및
· 치골상부, 직장 또는 회음 통증.
당업자라면 광범위한 본 발명의 개념으로부터 벗어남이 없이, 상기에 기재된 구현예에 대한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 구현예에 한정되지 않고, 본 설명에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주 내에서의 변형을 포함하고자 함이 이해된다.
서열
서열번호 1 (글리코실화 공통 서열)
Asn-X-Ser(Thr), 여기서 X는 Pro을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음
서열번호 2 (최적화된 글리코실화 공통 서열)
Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), 여기서 X 및 Z는 Pro을 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨
서열번호 3 (4개의 글리코실화 공통 서열을 포함하는 EPA 담체 단백질(EPA-4))
G SGGG DQNAT G SGGGKLAEEA FDLWNECAKA CVLDLKDGVR SSRMSVDPAI ADTNGQGVLH YSMVLEGGND ALKLAIDNAL SITSDGLTIR LEGGVEPNKP VRYSYTRQAR GSWSLNWLVP IGHEKPSNIK VFIHELNAGN QLSHMSPIYT IEMGDELLAK LARDATFFVR AHESNEMQPT LAISHAGVSV VMAQAQPRRE KRWSEWASGK VLCLLDPLDG VYNYLAQQRC NLDDTWEGKI YRVLAGNPAK HDLDIKDNNN STPTVISHRL HFPEGGSLAA LTAHQACHLP LEAFTRHRQP RGWEQLEQCG YPVQRLVALY LAARLSWNQV DQVIRNALAS PGSGGDLGEA IREQPEQARL ALTLAAAESE RFVRQGTGND EAGAASADVV SLTCPVAKDQ NRTKGECAGP ADSGDALLER NYPTGAEFLG DGGDVSFSTR GTQNWTVERL LQAHRQLEER GYVFVGYHGT FLEAAQSIVF GGVRARSQDL DAIWRGFYIA GDPALAYGYA QDQEPDARGR IRNGALLRVY VPRWSLPGFY RTGLTLAAPE AAGEVERLIG HPLPLRLDAI TGPEEEGGRV TILGWPLAER TVVIPSAIPT DPRNVGGDLD PSSIPDKEQA ISALPDYASQ PGKPPREDLK LGSGGG DQNA T
서열번호 4 (O4 GtrS 아미노산 서열)
MNNLIMNNWCKLSIFIIAFILLWLRRPDILTNAQFWAEDSVFWYKDAYENGFLSSLTTPRNGYFQTVSTFIVGLTALLNPDYAPFVSNFFGIMIRSVIIWFLFTERFNFLTLTTRIFLSIYFLCMPGLDEVHANITNAHWYLSLYVSMILIARNPSSKSWRFHDIFFILLSGLSGPFIIFILAASCFKFINNCKDHISVRSFINFYLRQPYALMIVCALIQGTSIILTFNGTRSSAPLGFSFDVISSIISSNIFLFTFVPWDIAKAGWDNLLLSYFLSVSILSCAAFVFVKGTWRMKVFATLPLLIIIFSMAKPQLTDSAPQLPTLINGQGSRYFVNIHIAIFSLLCVYLLECVRGKVATLFSKIYLTILLFVMGCLNFVITPLPNMNWREGATLINNAKTGDVISIQVLPPGLTLELRKK
서열번호 5 (예시적 O4 gtrS 핵산 서열)
ATGAATAATTTAATTATGAATAACTGGTGTAAATTATCTATATTTATTATTGCATTTATTTTGCTATGGCTTAGAAGGCCGGATATACTCACAAACGCACAATTTTGGGCAGAAGATTCCGTTTTCTGGTATAAGGACGCCTATGAGAACGGATTCTTAAGTTCACTAACAACGCCTAGGAATGGGTATTTCCAGACTGTTTCTACATTTATAGTTGGTCTGACTGCTTTATTAAATCCAGATTATGCACCTTTTGTTTCTAATTTTTTTGGCATAATGATTCGCTCAGTAATTATATGGTTTTTATTTACAGAAAGATTCAACTTCCTCACATTGACTACTAGGATTTTCTTATCTATTTATTTTCTATGCATGCCTGGATTGGATGAAGTTCATGCAAATATAACAAATGCACATTGGTATTTGTCATTATATGTATCAATGATCCTGATAGCTCGCAATCCAAGTTCAAAATCATGGAGGTTTCATGATATATTCTTTATCTTGCTATCCGGGCTCAGTGGCCCATTTATAATTTTCATTTTAGCAGCTTCATGCTTTAAATTTATAAATAATTGTAAAGATCATATTAGTGTAAGATCTTTCATAAATTTCTACTTGCGTCAGCCATACGCATTAATGATTGTTTGCGCTTTAATTCAAGGAACTTCTATAATTCTAACTTTCAATGGCACACGTTCCTCAGCACCGCTAGGATTCAGTTTTGATGTGATTTCGTCTATTATATCATCGAATATTTTTTTATTTACATTTGTCCCATGGGATATTGCAAAGGCTGGGTGGGATAATTTACTGTTATCTTATTTTTTGTCTGTTTCGATTTTGTCGTGTGCGGCCTTTGTTTTTGTTAAAGGTACGTGGCGAATGAAAGTATTTGCAACTTTACCATTGCTAATTATAATATTTTCAATGGCAAAACCACAATTGACAGACTCGGCACCTCAATTGCCAACACTTATTAATGGGCAAGGTTCAAGATACTTCGTAAATATACATATTGCGATATTCTCTTTGCTATGTGTTTACTTACTTGAGTGCGTCAGGGGGAAAGTGGCAACTTTATTTTCCAAAATATACTTAACAATTTTGCTATTCGTGATGGGATGTTTGAATTTTGTTATCACCCCACTCCCAAACATGAACTGGAGGGAAGGTGCTACTTTGATTAATAATGCAAAAACTGGTGATGTCATTTCGATTCAAGTGCTACCACCTGGCCTAACACTTGAACTAAGGAAAAAATAA
서열번호 6 (예시적 PglB 서열('야생형'))
MLKKEYLKNPYLVLFAMIILAYVFSVFCRFYWVWWASEFNEYFFNNQLMIISNDGYAFAEGARDMIAGFHQPNDLSYYGSSLSALTYWLYKITPFSFESIILYMSTFLSSLVVIPTILLANEYKRPLMGFVAALLASIANSYYNRTMSGYYDTDMLVIVLPMFILFFMVRMILKKDFFSLIALPLFIGIYLWWYPSSYTLNVALIGLFLIYTLIFHRKEKIFYIAVILSSLTLSNIAWFYQSAIIVILFALFALEQKRLNFMIIGILGSATLIFLILSGGVDPILYQLKFYIFRSDESANLTQGFMYFNVNQTIQEVENVDLSEFMRRISGSEIVFLFSLFGFVWLLRKHKSMIMALPILVLGFLALKGGLRFTIYSVPVMALGFGFLLSEFKAIMVKKYSQLTSNVCIVFATILTLAPVFIHIYNYKAPTVFSQNEASLLNQLKNIANREDYVVTWWDYGYPVRYYSDVKTLVDGGKHLGKDNFFPSFALSKDEQAAANMARLSVEYTEKSFYAPQNDILKTDILQAMMKDYNQSNVDLFLASLSKPDFKIDTPKTRDIYLYMPARMSLIFSTVASFSFINLDTGVLDKPFTFSTAYPLDVKNGEIYLSNGVVLSDDFRSFKIGDNVVSVNSIVEINSIKQGEYKITPIDDKAQFYIFYLKDSAIPYAQFILMDKTMFNSAYVQMFFLGNYDKNLFDLVINSRDAKVFKLKI
서열번호 7 (예시적 gtrA 아미노산 서열; 대장균 W3110 yfdG, GenBank: BAA16209.1)
MLKLFAKYTSIGVLNTLIHWVVFGVCIYVAHTNQALANFAGFVVAVSFSFFANAKFTFKASTTTMRYMLYVGFMGTLSATVGWAADRCALPPMITLVTFSAISLVCGFVYSKFIVFRDAK
서열번호 8 (예시적 gtrB 아미노산 서열 - 대장균 W3110 yfdH, GenBank: BAA16210.1)
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서열번호 9 (예시적 O4 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O4-EPA 생산 균주 BVEC-L-00684f)
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서열번호 10 (EPA 담체 단백질에 대한 예시적 신호 서열)
MKKIWLALAG LVLAFSASA
서열번호 11 (예시적 O1A rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O1A-EPA 생산 균주 stGVXN4411 및 stLMTB10217)
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서열번호 12 (예시적 O2 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O2-EPA 생산 균주 stGVXN4906)
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서열번호 13 (예시적 O6A rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O6A-EPA 생산 균주 stGVXN4112 및 stLMTB10923)
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서열번호 14 (예시적 O8 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O8-EPA 생산 균주 stLMTB11734)
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서열번호 15 (예시적 O15 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O15-EPA 생산 균주 stLMTB11738)
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서열번호 16 (예시적 O16 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O16-EPA 생산 균주 stLMTB11739)
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서열번호 17 (예시적 O18A rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O18A-EPA 생산 균주 BVEC-L-00559)
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서열번호 18 (예시적 O25B rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O25B-EPA 생산 균주 stGVXN4459)
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서열번호 19 (예시적 O75 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O75-EPA 생산 균주 stLMTB11737)
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서열번호 20 (실시예 CRM197 서열)
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
본원에 기재된 구현예는 단지 예시적인 것으로 의도되며, 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 구체적인 절차에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 모든 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되며 다음 청구범위에 포함된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌(특허 출원, 특허 및 간행물 포함)은 마치 각 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위하여 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 전체가 참고로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceuticals, Inc. <120> Multivalent Vaccine Compositions and Uses Thereof <130> CRU6048WOPCT1 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycosylation consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Any amino acid residue except Pro <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Ser or Thr <400> 1 Asn Xaa Xaa 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized glycosylation consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Any amino acid residue except Pro <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Any amino acid residue except Pro <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Ser or Thr <400> 2 Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPA carrier protein comprising 4 glycosylation consensus sequences (EPA-4) <400> 3 Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser 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taatacagac tacctgcttg tatcaaagtt 12720 tctgacatta agttatgtga caatttttgg cagctatatg atggtatttc agatagtaac 12780 tgttttgatg tcaagttttg ttaatgctat tactgcagga atgggtaatt acttaattaa 12840 taaaagtaat ttagaaatta aggaaattac acgtcaattt tatgtgatat ttatcgcctt 12900 tgcaacattc atatcactaa atatgttttt tcttgttaat gattttatcg caaaatggat 12960 aggtgttaat tatacattaa gtaacaccct agttgcatta atgattgtta acgtattcat 13020 tagtgttgtc agggtacctt ctgatatatt aaaaaacgca agtggacatt ttggtgatat 13080 ttattatcca ttattagaag gtgtgctgaa tattacgata tccatcattt tggctatcat 13140 tattggatta cctggcatta ttatagggac aatagtatct aacttaatag taataatgct 13200 tgcgaaacca ttatatcttt actctaagtt atttaatctt agaaatccga cgagggttta 13260 ttttgaattt atttctcggc ctatgttata ttcattatgt gtgattgggg tgagctattt 13320 attgcgcgat gaaatatatt catttaaagt aagtacatgg ttggatttta ttaacaagct 13380 actcttagtc tctactccta gcatattggt aatatgtgct attttctcta cggatagtga 13440 ctttagatta tttttcagaa aaattatata tgtgattatg aagaaataaa aatttcgaaa 13500 atgtattaat cgaaattatg caacgagctt tatttttata aatgatatgt gatcttttcg 13560 cgaataggag taaggatccg tgtaggctgg agctgcttcg aagttcctat actttctaga 13620 gaataggaac ttcggaatag gaactaagga ggatattcat atggataaag ccgtaagcat 13680 ataagcatgg ataagctatt tatactttaa taagtacttt gtatacttat ttgcgaacat 13740 tccaggccgc gagcattcag cgcggtgatc acacctgaca ggagtatgta atgtccaagc 13800 aacagatcgg cgtagtcggt atggcagtga tgggacgcaa ccttgcgctc aacatcgaaa 13860 gccgtggtta taccgtctct attttcaacc gttcccgtga gaagacggaa gaagtgattg 13920 ccgaaaatcc aggcaagaaa ctggttcctt actatacggt gaaagagttt gtcgaatctc 13980 tggaaacgcc tcgtcgcatc ctgttaatgg tgaaagcagg tgcaggcacg gatgctgcta 14040 ttgattccct caaaccatat ctcgataaag gagacatcat cattgatggt ggtaacacct 14100 tcttccagga cactattcgt cgtaatcgtg agctttcagc agagggcttt aacttcatcg 14160 gtaccggtgt ttctggcggt gaagaggggg cgctgaaagg tccttctatt atgcctggtg 14220 gccagaaaga agcctatgaa ttggtagcac cgatcctgac caaaatcgcc gccgtagctg 14280 aagacggtga accatgcgtt acctatattg gtgccgatgg cgcaggtcac tatgtgaaga 14340 tggttcacaa cggtattgaa tacggcgata tgcagctgat tgctgaagcc tattctctgc 14400 ttaaaggtgg cctgaacctc accaacgaag aactggcgca gacctttacc gagtggaata 14460 acggtgaact gagcagttac ctgatcgaca tcaccaaaga tatcttcacc aaaaaagatg 14520 aagacggtaa ctacctggtt gatgtgatcc tggatgaagc ggctaacaaa ggtaccggta 14580 aatggaccag ccagagcgcg ctggatctcg gcgaaccgct gtcgctgatt accgagtctg 14640 tgtttgcacg ttatatctct tctctgaaag atcagcgtgt tgccgcatct aaagttctct 14700 ctggtccgca agcacagcca gcaggcgaca aggctgagtt catcgaaaaa gttcgtcgtg 14760 cgctgtatct gggcaaaatc gtttcttacg cccagggctt ctctcagctg cgtgctgcgt 14820 ctgaagagta caactgggat ctgaactacg gcgaaatcgc gaagattttc cgtgctggct 14880 gcatcatccg tgcgcagttc ctgcagaaaa tcaccgatgc ttatgccgaa aatccacaga 14940 tcgctaacct gttgctggct ccgtacttca agcaaattgc cgatgactac cagcaggcgc 15000 tgcgtgatgt cgttgcttat gcagtacaga acggtattcc ggttccgacc ttctccgcag 15060 cggttgccta ttacgacagc taccgtgctg ctgttctgcc tgcgaacctg atccaggcac 15120 agcgtgacta ttttggtgcg catacttata agcgtattga taaagaaggt gtgttccata 15180 ccgaatggct ggattaa 15197 <210> 20 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example CRM197 sequence <400> 20 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535

Claims (22)

  1. 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류를 포함하는 조성물로서, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 및 O25 항원 다당류 각각의 농도는 O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각의 농도에 비해 독립적으로 증가되는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 대해 독립적으로 O75 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 2.5:1인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 대해 독립적으로 O75 항원 다당류 농도의 중량비는 약 2:1인, 조성물.
  4. 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류를 포함하는 조성물로서, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 항원 다당류 대 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 바람직하게는 약 2:1인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, O75 항원 다당류 대 O4, O15, O16 및/또는 O18 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 바람직하게는 약 2:1인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 O75 항원 다당류 대 O25 항원 다당류 농도의 중량비는 약 1:1인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 항원 다당류 O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 농도의 중량비는 1:1:1:1:1:1:1:2:2인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이고,
    (i) 대장균 O1 항원 다당류는 화학식 (O1A)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O1A)]
    Figure pct00055
    ,
    (ii) 대장균 O2 항원 다당류는 화학식 (O2)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O2)]
    Figure pct00056
    ,
    (iii) 대장균 O4 항원 다당류는 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O4-Glc+)]
    Figure pct00057
    ,
    (iv) 대장균 O6 항원 다당류는 화학식 (O6A)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O6A)]
    Figure pct00058
    ,
    (v) 대장균 O15 항원 다당류는 화학식 (O15)의 구조를 포함하고,
    [화학식 (O15)]
    Figure pct00059
    ,
    (vi) 대장균 O16 항원 다당류는 화학식 (O16)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O16)]
    Figure pct00060
    ,
    (vii) 대장균 O18 항원 다당류는 화학식 (O18A)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O18A)]
    Figure pct00061
    ,
    (viii) 대장균 O25 항원 다당류는 화학식 (O25B)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O25B)]
    Figure pct00062
    , 및
    (ix) 대장균 O75 항원 다당류는 화학식 (O75)의 구조를 포함하고
    [화학식 (O75)]
    Figure pct00063
    ,
    여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, O75 항원 다당류의 농도는 약 8 내지 약 64 μg/mL, 바람직하게는 약 8 내지 약 50 μg/mL, 바람직하게는 약 12 내지 약 40 μg/mL, 바람직하게는 약 16 내지 약 32 μg/mL, 바람직하게는 약 28 내지 약 36 μg/mL, 바람직하게는 약 32 μg/mL인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 존재하는 대장균 O 항원 다당류는 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6으로 구성되는 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질에 공유 결합된 적어도 하나의 추가 대장균 항원 다당류를 추가로 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 추가 대장균 항원 다당류는 화학식 (O8)을 갖는 O8 항원 다당류를 포함하고
    [화학식 (O8)]
    Figure pct00064
    ,
    여기서 n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질은 슈도모나스 애루기노사의 탈독소화된 외독소 A(EPA) 또는 CRM197, 바람직하게는 EPA이고, 바람직하게는 담체 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 1 내지 20개, 예컨대 1 내지 10개 또는 2 내지 4개의 글리코실화 공통 서열, 예컨대 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 공통 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 담체 단백질은 4개의 글리코실화 공통 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 각각의 담체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 대장균 항원 다당류는 생체접합 또는 화학적 접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합되며, 바람직하게는 대장균 항원 다당류는 생체접합에 의해 담체 단백질에 공유 결합되며, 바람직하게는 다당류는 담체 단백질의 글리코실화 부위의 Asn 잔기에 공유 결합되는 것인, 조성물.
  14. 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  15. 대상체에서 대장균, 바람직하게는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 대장균 O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6 항원 다당류 각각의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 각각의 항원 다당류는 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합되고, O75 및 O25 항원 다당류 각각의 유효량은 O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 비해 독립적으로 증가되는 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    a) 유효량의 O75 항원 다당류는 O1, O2, O4, O15, O16, O18 및 O6 항원 다당류 각각에 대해 독립적으로 약 1.5:1 내지 약 2.5:1, 바람직하게는 약 2:1의 중량비로 투여되거나; 또는
    b) 유효량의 O75 항원 다당류는 O1, O2 및/또는 O6 항원 다당류에 대해 독립적으로 약 1.5:1 내지 약 4:1, 바람직하게는 약 2:1의 중량비로 투여되고, 추가로 유효량의 O75 항원 다당류는 O25 항원 다당류에 대해 1:1의 중량비로 투여되는 것인, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응은 대상체에서 침습성 ExPEC 질환의 중증도를 제한하거나 이를 예방하며, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환은 패혈증 및/또는 균혈증을 포함하는 것인, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, O1 항원은 O1A이고, O4는 글루코실화되고, O6 항원은 O6A이고, O18 항원은 O18A이고, O25 항원은 O25B이고,
    바람직하게는 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 바람직하게는 5 내지 30, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이고,
    O75 항원 다당류 대 O6 항원 다당류의 중량비는 약 1.5:1 내지 약 4:1, 더욱 바람직하게는 약 2:1인, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여되는 대장균 O 항원 다당류는
    a) O1, O2, O4, O15, O16, O18, O25, O75 및 O6으로 구성되거나; 또는
    b) 각각 독립적으로 담체 단백질에 공유 결합된 1 내지 15개의 추가 대장균 O 항원 다당류를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 대장균(바람직하게는 ExPEC) 감염, 바람직하게는 침습성 ExPEC 질환이 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 인간인, 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약 8~16 μg, 바람직하게는 약 16 μg의 O75 항원 다당류가 투여당 투여되는 것인, 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 O1:O2:O4:O6:O15:O16:O18:O25:O75의 투여되는 대장균 항원 다당류는 1:1:1:1:1:1:1:2:2의 중량비로 투여되는 것인, 방법.
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