KR102574882B1 - 대장균 o-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트의 생성 방법, 이의 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

대장균 o-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트의 생성 방법, 이의 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

재조합 숙주 세포를 사용하여 담체 단백질에 공유 결합된 O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성하는 방법이 제공된다. 본원에 기술된 방법에 사용되는 재조합 숙주 세포는 생성하고자 하는 O-항원 다당류 바이오컨쥬게이트에 따라 특정 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소를 인코딩한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소는 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 또는 이의 변이체일 수 있다. 또한, 바이오컨쥬게이트를 함유하는 조성물, 및 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대하여 대상체를 백신화시키기 위해 본원에 기술된 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

대장균 O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트의 생성 방법, 이의 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 3월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/819,762에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록 참조
본 출원은 생성 날짜가 2020년 3월 11일이며, 199 KB의 크기를 갖는 파일명 "004852_11612 Sequence_Listing"을 갖는 ASCII 형식의 서열 목록으로서 EFS-Web를 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 갖는다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 사양의 일부이며, 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
발명의 배경
장외 병원성 대장균(ExPEC) 균주는 일반적으로 공생 대장균 균주와 함께 인간의 위장관에 무해한 점유균이다. O-항원, 캡슐 및 편모 항원 혈청형(O:K:H로 약칭됨, 예를 들어 O25:K1:H4)에 의해 정의된 바와 같이 ExPEC가 많은 클론 계통에서 우세하지만, ExPEC 분리주는 혈청형으로 공생 분리주와 쉽게 구별할 수 없다. 공생 대장균과 달리, ExPEC 균주는 광범위한 독성 인자를 발현하여, 이들이 위장관을 점령하게 할 뿐만 아니라, 광범위한 장외 감염을 유발하며, 이는 입원 및 사망으로 인한 상당한 의료 비용 부담과 관련이 있다. 신생아, 노인 및 면역 저하 환자는 침습성 ExPEC 질병(IED)을 포함하는 ExPEC 감염에 특히 취약하다.
ExPEC 균주는 요로 감염(UTI)의 가장 흔한 원인이며, 수술 부위 감염 및 신생아 수막염의 중요한 원인이다. 균주는 또한 복부 및 골반 감염 및 병원내 폐렴과 관련이 있으며, 골수염, 연조직염 및 상처 감염과 같은 다른 장외 감염과 종종 관련된다. 이러한 모든 주요 감염 부위는 ExPEC 균혈증을 유발할 수 있다. ExPEC는 지역사회 발병 균혈증의 가장 흔한 원인이자 병원 균혈증의 주요 원인 병원체이며, 임상적으로 유의한 혈액 분리물의 약 17% 내지 37%에서 발견된다. ExPEC-양성 혈액 배양물을 갖는 환자는 일반적으로 패혈증 증후군, 중증 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 겪는다. 세팔로스포린, 플루오로퀴놀론 및 트리메토프림/설파메톡사졸을 포함한 1차 항생제에 대한 ExPEC의 내성 증가가 관찰되었다. ExPEC 서열 유형 131(ST131)의 출현 및 급속한 글로벌 전파는 다중 약물 내성을 포함하는 약물 내성 증가의 주요 동인으로 간주된다. 이 클론은 모든 ExPEC 임상 분리주의 12.5% 내지 30%에서 발견되며, 대부분 혈청형 O25b:H4를 나타내며, 플루오로퀴놀론에 대한 높은 수준의 내성을 보여주며, 이는 종종 트리메토프림/설파메톡사졸 내성, 및 세팔로스포린에 대한 내성을 부여하는 광범위 베타-락타마제를 동반한다.
O-항원은 대장균을 포함하는 그람-음성 박테리아에서 세포벽 지질다당류(LPS)의 면역우세 구성요소를 포함한다. 현재 180개가 넘는 혈청학적으로 고유한 대장균 O-항원이 확인되었으며, 대부분의 ExPEC 분리주는 20개 미만의 O-항원 혈청형 내에 분류되었다. 전장 대장균 O-항원은 전형적으로 고도로 보존된 LPS 코어 구조에 부착된 약 10 내지 25개의 반복 당 단위를 포함하며, 각각의 구성요소는 각각 rfb 및 rfa 유전자 클러스터에서 주로 인코딩되는 효소에 의해 별도로 합성되었다. O-항원의 중합 후, O-항원 다당류 백본은 전형적으로 아세틸 또는 글루코스 잔기의 첨가를 통해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 공통 다당류 백본을 공유하지만 측 분지가 상이한 항원적으로 구별되는 혈청형을 생성함으로써 혈청형 다양성을 효과적으로 증가시킨다. O-항원 변형 효소를 인코딩하는 유전자는 전형적으로 염색체의 rfb 클러스터 외부에 있으며, 어떤 경우에는 이러한 유전자는 용원성 박테리오파지 내에서 발견된다.
O4 혈청군에 속하는 ExPEC 분리주는 미국 및 EU 혈액 분리주의 현대 감시 연구에서 일반적으로 확인되었다. O4 다당류의 구조는 대장균 O4:K52 균주로부터 -->2) α-L-Rha (1->6) α-D-Glc (1->3) α-L-FucNAc (1->3) β-D-GlcNAc (1->로서 결정되었다(Jann et al., Carbohydr. Res. (1993) v. 248, pp.241-250). 구별되는 형태의 O4 다당류 구조는 O4:K3, O4:K6 및 O4:K12 균주에 대해 결정되었으며, 여기서 위의 구조는 다당류의 람노스 잔기에 연결된 α-D-Glc(1->3)의 첨가에 의해 변형되며(Jann et al., 1993, 상기 참조), 이러한 형태의 다당류는 이하에서 '글루코실화된 O4'로 지칭된다. 대장균 O4 균주 내의 O-항원 변형을 담당하는 효소는 확인되지 않았다.
ExPEC 감염을 예방하기 위한 백신 개발을 위한 노력은 O-항원 다당류 컨쥬게이트에 집중되었다. 12가 O-항원 컨쥬게이트 백신은 O-항원 다당류의 추출과 정제 및 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A에 대한 화학적 컨쥬게이션을 통해 합성되고, 1상 임상 연구에서 안전성 및 면역원성에 대해 테스트되었다(Cross et al., J. Infect Dis.(1994) v.170, pp.834-40). 이 후보 백신은 임상 용도로 허가된 적이 없다. 대장균의 바이오컨쥬게이션 시스템은 최근에 개발되었는데, 다당류 항원과 담체 단백질이 모두 생체 내에서 합성된 후 대장균에서 발현되는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 효소인 올리고사카릴 전이효소 PglB의 활성을 통해 생체 내에서 컨쥬게이션된다 (Wacker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2006) v. 103, pp. 7088-93). 이 N-결합된 단백질 글리코실화 시스템은 담체 단백질에 다양한 다당류를 전달할 수 있어, 컨쥬게이트를 정제하는 간단한 방법을 허용한다.
바이오컨쥬게이션은 대장균 4가 O-항원 후보 백신을 위한 컨쥬게이트 다당류를 생산하는데 성공적으로 사용되었다(Poolman and Wacker, J. Infect. Dis. (2016) v.213(1), pp. 6-13). 그러나, 성공적인 ExPEC 백신의 개발은 우세한 혈청형의 보급을 필요로 하며, ExPEC 분리주의 서브세트에서 추가 O-항원 변형의 존재는 비변형 및 변형 LPS를 나타내는 분리주를 커버하는 데 있어서 추가 과제를 제시한다. 더욱이, 다중 혈청형을 커버하는 보다 복잡한 백신 조성물을 위한 다중 구성요소의 생산 효율이 점점 더 중요해지고 있으며, 따라서 특정 O-항원의 개별 바이오컨쥬게이트 생산의 개선이 여전히 필요하다.
발명의 개요
ExPEC 분리주 중 항생제 내성 증가 및 우세한 O-혈청형 중 추가 O-항원 변형의 존재의 관점에서, 이러한 감염에 대한 개선된 예방학적 및 치료학적 치료가 필요하다. 본 발명은 O-항원 변형 효소를 인코딩하는 유전자를 확인하여, 선택된 O-항원 변형을 포함하는 바이오컨쥬게이트를 비롯한 O-항원의 바이오컨쥬게이트를 합성할 수 있는 재조합 숙주 세포의 조작을 허용하는 것을 포함하는, 현대 임상 분리주의 유전자 조성물을 규정함으로써 이러한 요구를 충족시킨다. 또한, 본 발명의 한 양태에서, 올리고사카릴트랜스퍼라제(OST)의 변이체를 사용함으로써 특정 O-항원의 바이오컨쥬게이트의 개선된 생산을 위한 숙주 세포 및 방법이 예측할 수 없는 혈청형 의존적 방식으로 특정 대장균 O-항원의 바이오컨쥬게이트의 특정 OST 변이체의 사용 이점에 근거하여 제공된다. 이러한 OST 변이체의 사용은 또한 특정 경우에, 예를 들어 OST의 야생형 또는 다른 변이체를 사용하여 생성된 바이오컨쥬게이트와 비교하여 담체 단백질에 결합된 글리칸의 상대적 수를 증가시킴으로써 바이오컨쥬게이트의 글리코실화 패턴에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 이러한 방법에 의해 생성된 신규한 바이오컨쥬게이트는 또한 본 발명의 한 양태로서 제공된다.
일 양태에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
(i) a. Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
b. SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
c. 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(ii) 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 조건하에서 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
여기에서,
Ox-항원이 O1A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglBy는 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하고, 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기에서 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
Ox-항원이 O6A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 O8 항원 다당류인 경우, PglBy는 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며;
Ox-항원이 O15 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 O16 항원 다당류인 경우, PglBy는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 O18A 항원 다당류인 경우, PglBy는 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며;
Ox-항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며,
여기에서 각각의 경우에 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이며,
여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
한 구체예에서, Ox-항원은 O1A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, Ox-항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V를 포함한다. 한 구체예에서, Ox-항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함한다. Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 바람직하게는, SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 GtrA 및 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, Ox-항원은 O6A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, Ox-항원은 O8 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
한 구체예에서, Ox-항원은 O15 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, Ox-항원은 O16 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, Ox-항원은 O18A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, Ox-항원은 O75 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특정 양태에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
(i) a. Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
b. SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
c. 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(ii) 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 조건하에서 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
여기에서 PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V를 포함하고,
여기에서, Ox-항원은 O1A 항원 다당류, 글루코실화된 O4 항원 다당류, O6A 항원 다당류, O15 항원 다당류, O16 항원 다당류 또는 O75 항원 다당류이고, Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16 및 O75 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 각각 화학식 (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
특정 구체예에서, 방법은 재조합 숙주 세포로부터 바이오컨쥬게이트를 분리하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 담체 단백질은 탈독소화된 P. 애루기노사(P. aeruginosa)의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스(S. aureus)의 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 담체 단백질은 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA)이다. 바람직하게는, EPA 담체 단백질은 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 각각의 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, EPA 담체 단백질은 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
특정 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 대장균 세포, 예를 들어 대장균 K-12 균주, 예컨대 균주 W3110이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 담체 단백질에 공유 결합된 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법에 의해 생성된 바이오컨쥬게이트가 제공된다.
또 다른 양태에서, 이러한 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 더욱 바람직하게는 적어도 5개, 더욱 더 바람직하게는 적어도 7개의 이러한 바이오컨쥬게이트를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 담체 단백질에 공유 결힙된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하며, 여기서 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 담체 단백질에 공유 결힙된 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 추가로 포함하며, 여기서 O25B 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O25B)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 담체 단백질에 공유 결힙된 대장균 O2 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 추가로 포함하며, 여기에서 O2 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O2)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 (i) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (ii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (iii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (iv) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (v) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O8 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (vi) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (vii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (viii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트 및 (ix) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하며, 여기서 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O25B) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 특정 구체예에서, 이러한 조성물은 (x) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 추가로 포함하며, 여기에서 O18A 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O18A)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역원성 조성물이다.
다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오컨쥬게이트 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대해 대상체를 백신화하는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 백신화에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 그러한 바이오컨쥬게이트 또는 조성물이 제공된다.
다른 양태에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위한 재조합 숙주 세포가 제공되며, 상기 재조합 숙주 세포는
(a) Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
(b) SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(c) 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기에서,
Ox-항원이 O1A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglBy는 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하고, 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기에서 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
Ox-항원이 O6A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 O6A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 O15 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 O16 항원 다당류인 경우, PglBy는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
Ox-항원이 O18A 항원 다당류인 경우, PglBy는 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며;
Ox-항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고,
여기에서 각각의 경우에 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이며,
여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 O1A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하는 이러한 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V를 포함하는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, Ox-항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다. Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 특정 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 GtrA 및 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 O6A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 O8 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 O15 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 O16 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 O18A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, Ox-항원은 O75 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V를 포함하는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, 담체 단백질이 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 선택되는 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
특정 구체예에서, 담체 단백질이 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA)인 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다. 이의 특정 구체예에서, EPA 담체 단백질은 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 각각의 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, EPA 담체 단백질은 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
특정 구체예에서, 재조합 숙주 세포가 대장균 세포, 예를 들어 대장균 K-12 균주, 예를 들어 균주 W3110인 본 발명의 재조합 숙주 세포가 제공된다.
본 발명에 따른 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위한 숙주 세포 및 방법에 대한 특정 구체예에서, 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터는 대장균 O4 항원 다당류(표 1의 화학식 (O4-Glc-))를 생성하는 효소를 인코딩하며, SEQ ID NO: 9와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, rfb 유전자 클러스터는 SEQ ID NO: 9를 포함한다.
본 발명에 따른 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위한 숙주 세포 및 방법에 대한 특정 구체예에서, 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성시킬 수 있는 글루코실 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 4에 대한 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95%, 바람직하게는, 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 갖는다. 특정 구체예에서, 글루코실 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 4를 포함한다.
본 발명에 따른 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위한 숙주 세포 및 방법에 대한 특정 구체예에서, 트랜스로카제는 박토프레놀-연결된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구체예에서, 트랜스로카제는 SEQ ID NO: 7을 포함한다.
본 발명에 따른 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위한 숙주 세포 및 방법에 대한 특정 구체예에서, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며, SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구체예에서, 글리코실트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 8을 포함한다.
본 발명의 다음의 상세한 설명뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명이 도면에 도시된 정확한 구체예로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
도면에서:
도 1은 실시예 4에 기재된 바와 같이 Glc-변형된 O4 다당류 바이오컨쥬게이트로 면역화된 2마리의 토끼의 혈청에서 비변형된(GLC-) 또는 글루코스-변형된(GLC+) O4 LPS에 대한 ELISA IgG 역가를 보여주며; ELISA 역가는 4회 반복으로 결정되었다.
도 2는 실시예 4에 기술된 바와 같이 특성화된 gtrS 상태가 특성 규명된 대장균 O4 분리주에 대해 Glc-변형된 O4 바이오컨쥬게이트로 면역화된 토끼의 풀링된 혈청을 사용한 전체 세포 ELISA에서 IgG 역가를 보여준다; 다음 분리주는 gtrS-음성이었다: A2625, stGVXN4988, OC24784, OC24787 및 OC24788; 다음 분리주는 gtrS-양성이었다: Y1382, E551, OC24334, stGVXN4983, stGVXN4994 및 OC24794; 음성 대조군 균주 OC9487(ATCC 35383; 혈청형 O75)도 포함되었다.
도 3은 변형된 O4 다당류로 면역된 토끼의 풀링된 혈청으로 조사된 gtrS-양성 및 -음성 O4 분리주에서 추출한 LPS의 웨스턴 블롯을 보여준다.
도 4a 및 4b는 글루코실화된 O4(O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체 반응을 보여준다; 도 4a는 면역화 후 0, 14 및 42일째에 ELISA에 의해 측정된 혈청 항체 수준을 보여주고; 개별 역가(log10 EC50 역가) 및 GMT ± 95% CI를 보여주고; 회색 점선은 임계값을 나타내며, 이를 넘는 샘플의 희석 곡선은 4PL 피팅을 갖는다. 도 4b는 글루코실화된 O4(O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트(4.0 μg)로 면역화 후 42일째에 수득된 혈청 샘플에서 항체의 기능성을 결정하기 위한 옵소닌식세포(OPK) 검정의 결과를 보여준다; Wilcoxon 순위 합 테스트 및 Bonferroni 보정; *P≤0.05, ***P≤0.0001.
도 5는 실시예 4에 기술된 바와 같은 3개의 다른 용량으로 면역화된 Sprague Dawley 래트에서 글루코실화된 O4(O4 Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트의 부스트 효과를 보여준다; 혈청 항체 수준은 면역화 후 0, 14 및 42일째에 ELISA에 의해 측정되었다; 개별 역가(log10 EC50 역가)는 각 동물에 대해 제시된다; 데이터 포인트 사이의 선은 시간에 따라 각 동물에 대한 IgG 역가를 연결한다; 회색 점선은 임계값을 나타내며, 이를 넘는 샘플의 희석 곡선은 4PL 피팅을 갖는다; 다중 비교를 위한 Wilcoxon 부호 순위 테스트 및 Bonferroni 보정으로 통계 분석을 수행하였다 (14일 vs 0일, 4.0 μg/용량의 경우 P = 0.012; 42일 vs 0일, 모든 용량에 있어서 P = 0.006; 42일 vs 14일, 모든 용량에 있어서 P = 0.006);
도 6은 O4-Glc+-EPA 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체의 기능성을 보여준다; Sprague Dawley 래트를 4.00 μg/용량의 제형 완충액 또는 O4(Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트로 근육내 3회 면역화시켰다; 항체의 기능성은 O4(Glc+) 및 O4(Glc-) 대장균 균주를 사용하여 옵소닌식세포 치사 검정(OPKA)에 의해 결정되었다; 개별 옵소닉 역가(OI) 및 GMT ± 95% CI가 제시된다.
도 7은 주변세포질 분획에서 O4-Glc+ 바이오컨쥬게이트를 검출하기 위해 모노클로날 항체를 사용하는, 블롯-유사 이미지로 각 시험된 균주에 대한 O4-Glc+ 바이오컨쥬게이트 생성을 가시화하는 PglB 스크린의 모세관 전기영동 판독을 보여준다. 모노-글리코실화된 생성물 약 180 kDa, 디-글리코실화된 생성물 약 320 kDa 및 트리-글리코실화된 생성물 약 450 kDa. A) 1차 스크리닝 라운드. 레인 3의 Wt PglB, 레인 2 및 4의 N311V-PglB, 레인 1의 빈 대조군 균주 및 레인 5 및 6의 기타 PglB 변이체. B) 2차 스크리닝 라운드. 레인 3의 N311V PglB, 레인 9의 N311V+Y77H PglB, 레인 1 및 2의 빈 대조군 균주, 나머지 레인의 기타 PglB 변이체.
도 8은 뉴질랜드 백색 토끼에서 ExPEC10V 백신에 의해 유도된 항체 반응을 보여준다. 동물은 2주 간격으로 투여된 ExPEC10V 또는 식염수로 3회 근육내 면역화 처리되었다. ExPEC10V 백신은 3개의 상이한 농도(군 1: 고용량, 군 2: 중간 용량 및 군 3: 저용량, 표 11)로 투여되었고, 대조군에는 식염수만 제공되었다(군 4, 0.9% (w/v) 염화나트륨 용액). 항체 수준은 0일(백신화 전) 및 14, 27 및 42일째(백신화 후)에 ELISA에 의해 측정되었다. 개별 역가(EC50 역가) 및 기하 평균 역가(GMT) ± 95% CI이 제시된다. 다중 비교를 위한 Bonferroni 보정과 Wilcoxon 순위 합계 테스트. ExPEC10V 백신화된 동물(군 1, 2 및 3) 대 식염수 대조군(군 4) 비교. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001. LOD: 검출 한계.
도 9는 ExPEC10V에 의해 유도된 항체 반응을 보여준다. 뉴질랜드 백색 토끼는 ExPEC10V(105.6 μg 총 다당류) 또는 0.9% w/v 염화나트륨 용액(대조군)으로 3회 근육내 면역화 처리되었다. IgG 역가는 1일(면역화 전, n = 20/군), 31일(면역화 후, n = 20/군) 및 50일(면역화 후, n = 10/군)에 ELISA에 의해 결정되었다. 플롯은 각 군에 대한 개별 역가와 기하 평균 ± 95% 신뢰 구간을 보여준다. ExPEC10V와 대조군 사이의 IgG 역가의 차이는 우도비 테스트를 이용한 Tobit 모델을 사용하여 분석되었다. P-값 ≤ 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *P ≤0.05, ****P ≤ 0.0001.
도 10은 인간에서 ExPEC10V 백신을 사용한 1/2a 상 임상 시험에 대한 전체 연구 설계를 보여준다. 도 10a는 코호트 1에 대한 전체 연구 설계를 보여주며, 도 10b는 코호트 2에 대한 전체 연구 설계를 보여준다. 자세한 내용은 실시예 11을 참조한다.
발명의 상세한 설명
다양한 간행물, 기사 및 특허가 배경 및 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 설명된다; 이들 참고 문헌 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명의 내용을 제공하기 위한 것이다. 이러한 논의는 이러한 내용 중 일부 또는 전부가 개시된 또는 청구된 임의의 발명과 관련하여 종래 기술의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본원에 사용된 특정 용어는 명세서에 제시된 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 점에 유의해야한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 오는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
당업자는 단지 관례적인 실험을 사용하여 본원에 설명된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 이어지는 청구 범위 전반에서, 용어 "포함하다" 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수의 군의 포함하나, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우, 용어 "포함하는(comprising)"은 용어 "함유하는" 또는 "포함하는"이라는 용어로 대체될 수 있거나, 때때로 본 명세서에서 사용될 때 "갖는"이라는 용어로 대체될 수 있다.
본원에 사용되는 경우, "구성되는"은 청구항 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에 사용되는 경우, "필수적 요소로 하여 구성되는"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 양태 또는 구체예의 맥락에서 본원에 사용될 때마다 "포함하는", "함유하는", "포함하는" 및 "갖는"의 전술된 임의의 용어는 용어 "로 구성된" 또는 "필수적 요소로 하여 구성되는"으로 대체되어 개시내용의 범위를 변경시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 다수의 인용된 요소들 사이의 접속어 "및/또는"은 개별 및 조합된 옵션 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 연결되는 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소 없이 첫 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소가 없는 두 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소의 함께 적용할 수 있는 가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 하나는 그 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본 원에 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 하나 초과의 옵션의 동시 적용 가능성도 그 의미에 속하는 것으로 이해되므로, 용어 "및/또는"의 요건을 충족한다.
대장균 O4 혈청형(Jann et al., 1993) 내에서 O-항원 구조적 변형, 즉 글루코스 분지의 확인은 이 혈청형 내에서 박테이라 분리주를 표적으로 하는 글리코컨쥬게이트 백신의 발견 및 개발에 대한 도전을 제시한다. O4 O-항원의 변형되지 않은(글루코스 측-분지를 갖지 않음) 형태와 변형된(글루코스 측-분지를 가짐) 형태를 발현하는 임상적 현대 O4 분리주의 비율은 알려져 있지 않다. 이 특성에 대한 정보를 얻는 것은 관련 항원 구조를 선택하는 데 중요하다. 또한, 한 형태의 O4 다당류에 대해 유도된 항체를 유발하는 백신이 다른 형태와 교차 반응하는 정도는 결정되지 않았다. 지질 A가 없는 O-항원의 정제 및 담체 단백질에 대한 후속 화학적 컨쥬게이션은 길고 힘든 공정이다. 추가로, 정제, 지질 A 탈독소화 및 화학적 컨쥬게이션 공정은 에피토프의 손실, 항원 이질성 및 컨쥬게이션된 다당류의 감소된 면역원성을 발생시킬 수 있다. 바이오컨쥬게이션에 의한 글리코컨쥬게이트의 합성은 이러한 고전적 정제 및 화학적 컨쥬게이션의 한계를 극복할 수 있지만, 글루코스-분지된 O4 O-항원의 생체내 합성은 rfb 유전자 클러스터의 외부에 있는 다당류 분지 효소의 활성을 필요로 한다. 현재까지 O4 대장균 균주에서 글루코스-분지를 담당하는 O-항원 변형 효소는 확인되지 않았다. PglB를 발현하는 바이오컨쥬게이션 대장균 균주 내로의 O4 rfb 유전자 클러스터 클로닝은 글루코스-분지된 O4 글리코컨쥬게이트를 합성하는데 충분하지 않을 것이며, 그보다는 단지 비-글루코스-분지된 O4 바이오컨쥬게이트(이의 글리칸의 구조는 표 1의 화학식 (O4)에 제시됨)를 생성할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "글루코실화된 O4", "글루코스-분지된 O4", "O4 Glc+" 및 "Glc+ O4" O-항원은 글루코스 측-분지를 갖는 O4 O-항원을 나타내며, 이의 구조는 표 1의 화학식 (O4-Glc+)에 제시된다.
대장균 O4 항원 다당류의 글루코스 분지를 담당하는 O-항원 변형 효소를 인코딩하는 유전자가 본원에 개시된다. 또한, 생체내 담체 단백질에 공유 결합된 글루코실화된 O4 항원 다당류를 포함하는 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 효소를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 재조합으로 조작된 숙주 세포가 본원에 개시된다. 이러한 숙주 세포는 담체 단백질에 연결된 글루코실화된 O4 항원을 포함하는 바이오컨쥬게이트를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 치료학적 및/또는 예방학적 조성물(예를 들어, 백신)의 제형에 사용될 수 있다. 다른 대장균 항원(예를 들어, O1, O2, O6, O8, O15, O16, O18, O25, 및/또는 O75 항원 다당류 및 이의 하위혈청형)과 조합된 또는 단독의 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 본원에 추가로 제공된다. 조성물은 예방학적 및/또는 치료학적 방법, 예를 들어 대장균으로의 감염에 대한 숙주의 백신화에 사용될 수 있으며, 항체의 발생에 유용하며, 이는 예를 들어, 치료학적 방법, 예컨대 대상체의 면역화에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "O-항원", "O-항원 다당류", "O-항원 당류" 및 "OPS"는 그램-음성 박테리아의 O-항원을 나타낸다. 전형적으로, O-항원은 면역원성 반복 다당류 단위의 폴리머이다. 특정 구체예에서, 용어 "O-항원", "O-항원 다당류" 및 "OPS"는 대장균의 O-항원을 나타낸다. 대장균의 다른 혈청형은 다른 O-항원을 발현한다. 대장균에서, O-항원 생물발생과 관련된 유전자 생성물은 rfb 유전자 클러스터에 의해 인코딩된다.
본원에 사용된 바와 같은, "rfb 클러스터" 및 "rfb 유전자 클러스터"는 O-항원 백본 구조를 합성할 수 있는 효소 기구를 인코딩하는 유전자 클러스터를 나타낸다. 용어 rfb 클러스터는 임의의 O-항원 생합성 클러스터에 적용할 수 있으며, 바람직하게는 에스체리치아 속, 특히 대장균으로부터의 유전자 클러스터를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "O1A"는 대장균의 O1A 항원(대장균 혈청형 O1의 하위혈청형)을 나타낸다. 용어 "O2"는 대장균의 O2 항원을 나타낸다(대장균 혈청형 O2). 용어 "O6A"는 대장균의 O6A 항원을 나타낸다(대장균 혈청형 O6의 하위혈청형). 용어 "O8"은 대장균의 O8 항원을 나타낸다(대장균 혈청형 O8). 용어 "O15"는 대장균의 O15 항원을 나타낸다(대장균 혈청형 O15). 용어 "O16"은 대장균의 O16 항원을 나타낸다(대장균 혈청형 O16). 용어 "O18A"는 대장균의 O18A 항원을 나타낸다(대장균 혈청형 O18의 하위혈청형). 용어 "O25B"는 대장균의 O25B 항원(대장균 혈청형 O25의 하위혈청형)을 나타낸다. 용어 "O75"는 대장균의 O75 항원을 나타낸다(대장균 혈청형 O75).
본 출원 전반에 걸쳐 언급된 대장균 O-항원 다당류의 구조는 하기 표 1에 제시되어 있다. 각 대장균 O-항원 다당류에 대한 단일 반복 단위가 제시된다.
표 1: 대장균 O-항원 다당류의 구조
1 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 예컨대 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 및 1-10, 3-50, 3-40, 예컨대 적어도 5, 예컨대 5-40, 예를 들어 7-30, 예를 들어 7-25, 예를 들어 10-20의 정수이지만, 일부 경우에는 1 내지 2일 수 있다.
본원에 기재된 모든 단당류는 당업계에 공지된 이들의 공통의 의미를 갖는다. 단당류는 D 또는 L 배열을 가질 수 있다. D 또는 L이 지정되지 않은 경우, 당은 D 배열을 갖는 것으로 이해된다. 전형적으로 단당류는 당업계에 일반적으로 알려져 있고 사용되는 약어로 언급된다. 예를 들어, Glc는 글루코스를 나타내며; D-Glc는 D-글루코스를 나타내며; L-Glc는 L-글루코스를 나타낸다. 단당류에 대한 다른 일반적인 약어는 다음을 포함한다: Rha, 람노스; GlcNAc, N-아세틸글루코사민; GalNAc, N-아세틸갈락토사민; Fuc, 푸코스; Man, 만노스; Man3Me, 3-O-메틸-만노스; Gal, 갈락토스; FucNAc, N-아세틸푸코사민; 및 Rib, 리보스. 접미사 "f"는 푸라노스를 나타내고, 접미사 "p"는 피라노스를 나타낸다.
O-항원과 관련하여 사용된 용어 "RU", "반복 단위" 및 "반복하는 단위"는 생체내에서 세포 기구(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제)에 의해 합성되는 것으로서 O-항원의 생물학적 반복 단위(BRU)를 나타낸다. O-항원의 RU의 수는 혈청형에 따라 다를 수 있으며, 본 발명의 구체예에서, 일반적으로 약 1-100 RU, 바람직하게는 약 1 내지 50 RU, 예컨대 1-50 RU, 1-40 RU, 1-30 RU, 1-20 RU 및 1-10 RU, 및 더욱 바람직하게는 적어도 3 RU, 적어도 4 RU, 적어도 5 RU, 예컨대 3-50 RU, 바람직하게는 5-40 RU, 예를 들어 7-25 RU , 예를 들어 10-20 RU로 다양하다. 그러나, 어떤 경우에는 O-항원의 RU 수는 1-2일 수 있다. 본원에 구체적으로 기술된 각 O-항원의 구조는 RU의 수를 지정하는 변수 "n"을 갖는 하나의 RU를 함유하는 것으로 나타난다. 본 발명의 바이오컨쥬게이트의 각각의 O-항원 다당류에서, n은 독립적으로 1-100의 정수, 예컨대 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 바람직하게는 적어도 3, 더욱 바람직하게는 적어도 5, 예컨대 3-50, 바람직하게는 5-40(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40)이며, 어떤 경우에는 1-2일 수 있다. 일부 구체예에서, n은 독립적으로 약 7-25, 예를 들어 약 10-20의 정수이다. 값은 조성물 중 개별 O-항원 다당류 마다 다를 수 있으며, 평균값으로서 제공되며, 즉, 바이오컨쥬게이트가 독립적으로 5-40의 정수인 n을 갖는 것으로 본원에 기재된 경우, 조성물은 5-40개 반복 단위를 갖는 O-항원 다당류를 대부분 함유하나, 또한 5개 미만의 반복 단위 또는 40개 초과의 반복 단위를 갖는 일부 O-항원 다당류를 함유할 수 있다.
용어 "글리코컨쥬게이트"는 단백질, 펩티드, 지질 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 화학종에 연결된 당 또는 당류 항원(예를 들어, 올리고당류 및 다당류)-단백질 컨쥬게이트를 나타낸다. 글리코컨쥬게이트는 화학적으로, 예를 들어 단백질과 당 또는 당류 항원의 화학적(합성) 결합에 의해 제조될 수 있다. 용어 글리코컨쥬게이트는 또한 바이오컨쥬게이트를 포함한다.
용어 "바이오컨쥬게이트"는 숙주 세포 배경, 바람직하게는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 대장균 숙주 세포에서 제조된 단백질(예를 들어, 담체 단백질) 및 당 또는 당류 항원(예를 들어, 올리고당류 및 다당류) 사이의 컨쥬게이트를 나타내며, 여기서 숙주 세포 기구는 항원을 단백질(예를 들어, N-결합)에 연결한다. 바람직하게는, 용어 "바이오컨쥬게이트"는 숙주 세포 배경에서 제조된 단백질(예를 들어, 담체 단백질)과 O-항원, 바람직하게는 대장균 O-항원(예를 들어, O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, O75 등) 사이의 컨쥬게이트를 나타내며, 여기에서 숙주 세포 기구는 항원을 단백질(예를 들어, N-결합)에 연결한다. 바이오컨쥬게이트는 숙주 세포 기구에 의해 숙주 세포에서 제조되기 때문에, 항원과 단백질은 바이오컨쥬게이트에서 글리코시드 연결 또는 결합을 통해 공유 결합된다. 바이오컨쥬게이트는 O-항원을 합성하고/하거나 O-항원을 표적 단백질에 연결하는 데 필요한 세포 기구를 발현하도록 조작된 재조합 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 바이오컨쥬게이트는 글리칸이 박테리아 세포벽으로부터 정제된 후 담체 단백질에 화학적으로 커플링되는, 화학적으로 제조된 글리코컨쥬게이트와 비교해 유리한 특성을 갖는데, 예를 들어, 바이오컨쥬게이트는 제조시 더 적은 화학물질을 필요로 하며, 생성된 최종 생성물에 있어서 더욱 일관되며, 자유(즉, 담체 단백질에 결합되지 않은) 글리칸을 덜 함유하거나 함유하지 않는다. 따라서, 전형적인 구체예에서, 바이오컨쥬게이트는 화학적으로 생성된 글리코컨쥬게이트보다 선호된다.
용어 "약"은 숫자와 함께 사용되는 경우 언급된 숫자의 ±1, ±5 또는 ±10% 이내의 임의의 수를 나타낸다.
용어 "퍼센트(%) 서열 동일성" 또는 "% 동일성"은 아미노선 서열의 전체 길이를 구성하는 아미노산 잔기의 수와 비교할때 2개 이상의 정렬된 아미노산 서열의 동일한 아미노산의 일치("히트")의 수를 설명한다. 다시 말해서, 2개 이상의 서열에 있어서, 당업계에 공지된 바와 같은 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정할 때 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬될 경우 또는 수동으로 정렬되거나 시각적으로 검사할 경우, 정렬을 사용하여 동일한 (예를 들어, 90%, 95%, 97% 또는 98% 동일성) 아미노산 잔기의 백분율이 결정될 수 있다. 따라서, 서열 동일성을 결정하기 위해 비교되는 서열은 아미노산의 치환(들), 부가(들) 또는 결실(들)에 의해 상이할 수 있다. 단백질 서열을 정렬하는데 적절한 프로그램은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 단백질 서열의 서열 동일성 백분율은 예를 들어, NCBI BLAST 알고리즘을 사용하는 CLUSTALW, Clustal Omega, FASTA 또는 BLAST와 같은 프로그램으로 결정될 수 있다(Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).
예를 들어, 아미노산 서열에 있어서, 서열 동일성 및/또는 유사성은 비제한적으로 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 서열 동일성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443]의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]의 유사성 방법에 대한 조사, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), 문헌 [Devereux et al, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395]에 기술된 Best Fit 서열 프로그램을 포함하는 당업계 공지된 표준 기술을 이용하여, 바람직하게는 디폴트 세팅을 사용하여 또는 검사에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 퍼센트 동일성은 다음 파라미터에 기초하여 FastDB에 의해 계산된다: 1의 불일치 페널티; 1의 갭 페널티; 0.33의 갭 크기 패널티; 및 30의 합류 페널티("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149(1988), Alan R. Liss, Inc.).
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 하기 문헌에 기술된 BLAST 알고리즘이다: [Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; and Karin et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787]. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌 [Altschul et al, 1996, Methods in Enzymology 266:460-480]에서 얻은 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 대부분 기본값으로 설정되는 여러 검색 파라미터를 사용한다.
추가적인 유용한 알고리즘은 문헌[Altschul et al,1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]에 의해 보고된 바와 같은 갭핑된 BLAST이다.
용어 "침습성 장외 병원성 대장균(ExPEC) 질환(IED)"은 본원에서 전신 박테리아 감염과 일치하는 급성 질환으로 정의되며, 이는 혈액 또는 기타 정상적으로 멸균된 신체 부위로부터의 대장균의 분리 및 식별에 의해, 또는 침습성 질환(전신염증반응증후군(SIRS), 패혈증 또는 패혈성 쇼크)의 징후 및 증상이 있고 식별 가능한 다른 감염원이 없는 환자의 소변으로부터의 대장균의 분리 및 식별에 의해 미생물학적으로 확인된다.
대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트
일 양태에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트가 본원에 제공된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "O4"는 대장균으로부터의 O4 항원(대장균 혈청형 O4)을 지칭한다. O-항원 구조적 변형은 대장균 O4 혈청형 내에 존재하는 것으로 알려져 있다. 특히, 일부 O4 혈청형은 분지된 글루코스 단위를 갖는 변형된 O-항원을 발현한다. 본원에 사용된 "글루코실화된 O4 항원", "글루코실화된 O4 항원 다당류", "O4-Glc+ 항원 다당류" 및 "O4-Glc+ 항원"은 글루코스 분지를 갖는 O4 항원(예를 들어, 대장균 O4 항원)을 나타내며, 여기서 D-글루코스는 반복 단위 L-Rha→D-Glc→L-FucNAc→D-GlcNAc에서 L-람노스에 연결된다. 특정 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 100의 정수이다. 바람직한 구체예에서, n은 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
글루코스 분지 상태와 무관하게 대장균 O4 균주는 O4 항원 다당류의 생성을 담당하는 유전자를 인코딩하는 실질적으로 동일한 rfb 유전자 클러스터를 수반한다. 그러나, 글루코스 분지를 갖는 변형된 O4 항원의 생체내 합성은 rfb 유전자 클러스터의 외부에 있는 다당류 분지 효소의 활성을 필요로 한다. 본 발명자들이 아는 한, O4 항원의 글루코스 변형을 담당하는 다당류 분지 효소의 정체는 현재까지 알려지지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 본 발명자들은 O4 항원의 글루코스 변형을 담당하는 다당류 분지 효소의 서열을 발견하였다. 이 효소의 확인은 글루코스 분지를 갖는 변형된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트의 생성을 가능하게 한다. O4 항원 다당류의 글루코스 변형된 형태는 우세한 혈청형에 존재하며, 따라서 예를 들어 예방학적 또는 치료학적 용도를 위해 개선된 면역 반응을 제공하는 데 사용될 수 있다.
특히, O4 항원을 글루코실화하는 대장균 혈청형 O4에 특이적인 글루코실트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 gtrS 유전자의 서열이 본원에서 제공된다. 일반적으로, gtrA, gtrB 및 gtrS 유전자는 O-항원 글루코실화를 담당하는 효소를 인코딩한다. 상이한 혈청형의 gtrA 및 gtrB 유전자는 고도로 상동성이고 상호교환가능하지만, gtrS 유전자는 혈청형 특이적 O-항원 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩한다. 대장균 혈청형 O4의 gtrS 유전자는 글루코스 분지를 도입함으로써 O4 항원을 변형하는 GtrS 효소를 인코딩한다. O4 혈청형의 현대 임상 대장균 분리주의 특성 규명으로 테스트된 시험된 분리주의 78%에서 gtrS의 존재가 드러났으며, 이는 글루코스 잔기의 추가로 변형된 대장균 O4 항원 다당류가 현재 감염 분리주에서 우세함을 나타낸다.
한 구체예에서, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 GtrS 글루코실트랜스퍼라제를 인코딩하는 대장균 혈청형 O4로부터의 gtrS 유전자의 핵산이 본원에 제공된다. 또 다른 구체예에서, gtrS 핵산은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 98%, 99% 또는 100% 동일한 대장균 혈청형 O4로부터의 GtrS 단백질을 인코딩한다. SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 GtrS 단백질은 대장균 O4 항원 다당류를 특정적으로 글루코실화하여 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 갖는 글루코실화된 O4 항원을 얻을 수 있다. 당업자는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO: 4의 GtrS 단백질의 변이된 형태를 만들고, 이러한 서열을 본 개시 내용에 비추어 볼 때 대장균 O4 항원의 글루코실화 활성에 대해 테스트할 수 있을 것이다. 대장균 혈청형 O4의 글루코실 트랜스퍼라제 gtrS 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포, 및 글루코스 변형된 O4 항원 다당류 및 이의 바이오컨쥬게이트의 생성에서 상기 재조합 숙주 세포의 사용은 하기 더욱 상세히 기재되어 있다.
각각 박토프레놀-연결된 글루코스 트랜스로카제(GtrA, 내부 막 위의 박토프레놀-연결된 글루코스를 주변 세포질로 뒤집음) 및 박토프레놀 글루코실 트랜스퍼라제(GtrB, 글루코스를 박토프레놀에 연결)로 기능하는 gtrA 및 gtrB 인코딩된 단백질에 대한 서열은 각각 SEQ ID NO: 7 및 8과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, SEQ ID NO: 7 및 8과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 각각 GtrA 및 GtrB 단백질을 인코딩하며, 각각 박토프레놀-연결된 글루코스 트랜스로카제 및 박토프레놀 글루코실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 핵산 서열이 또한 본 발명의 숙주 세포에 존재하며, 이는 추가로 O4-특이적 rfb 유전자좌, 상기 기술된 O4-특이적 GtrS 인코딩 서열, 본원에 기술된 바와 같은 올리고사카릴 트랜스퍼라제 및 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 글리코실화 컨센서스 서열을 갖는 담체 단백질을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하여 대장균 글루코실화된 O4 혈청형(표 1의 화학식 (O4-Glc+)의 글리칸 구조를 포함)의 바이오컨쥬게이트를 생성한다.
본원에 제공된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트는 바람직하게는, 글리코시드 연결에 의해 담체 단백질에 공유 결합된다. 본 개시 내용의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 담체 단백질이 사용될 수 있다. 적합한 담체 단백질은 비제한적으로, 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D를 포함한다. 요구되는 컨센서스 글리코실화 서열을 함유하는 다양한 상이한 담체 단백질과의 바이오컨쥬게이션이 기술되었으며, 이는 이 기술을 사용하여 광범위한 단백질이 글리코실화될 수 있음을 보여준다(예를 들어, WO 06/119987, WO 2015/124769, WO 2015/158403, WO 2015/82571, WO 2017/216286 및 WO 2017/67964 참조, 바이오컨쥬게이션에 성공적으로 사용된 광범위한 담체 단백질을 함께 보여줌).
특정 구체예에서, 담체 단백질이 변형되는데, 예를 들어 단백질이 덜 독성이고/거나 글리코실화에 더 민감하게 되는 방식으로 변형된다. 특정 구체예에서, 본원에 사용된 담체 단백질은, 더 낮은 농도의 단백질이 예를 들어, 면역원성 조성물 중에서 특히, 이의 바이오컨쥬게이트 형태로 투여되는 방식으로 담체 단백질의 글리코실화 부위의 수가 최대화되도록 변형된다.
따라서, 특정 구체예에서, 본원에 기술된 담체 단백질은 (예를 들어, 담체 단백질이 이의 천연/자연 즉, "야생형" 상태에서 관련된 글리코실화 부위의 수와 비교하여) 담체 단백질과 일반적으로 관련되는 것보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 글리코실화 부위를 포함하도록 변형된다. 담체 단백질 내로의 글리코실화 부위의 도입은, 예를 들어 글리코실화 부위가 완전히 또는 부분적으로 추가되도록 단백질의 일차 구조에 새로운 아미노산을 추가하여, 단백질의 일차 구조 임의의 곳에서 글리코실화 컨센서스 서열을 삽입함으로써 또는 글리코실화 부위를 생성하기 위해 단백질에 존재하는 아미노산을 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 접근법, 예를 들어 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 변형을 포함하는 재조합 접근법을 이용하여 단백질의 아미노산 서열이 용이하게 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 특정 구체예에서, 글리코실화 컨센서스 서열은 담체 단백질의 특정 영역, 예를 들어 단백질의 표면 구조 내에 단백질의 N 또는 C 말단에서 및/또는 단백질 염기의 이황화 브릿지에 의해 안정화되는 루프에 도입된다. 일부 구체예에서, 글리코실화 컨센서스 서열은 더욱 효율적인 글리코실화를 위해 리신 잔기의 첨가에 의해 연장될 수 있다.
특정 단백질에 삽입되거나 생성될 수 있는 글리코실화 컨센서스 서열의 예시적인 예는 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)(SEQ ID NO: 1) 및 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(여기에서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨)(SEQ ID NO: 2)를 포함한다.
일부 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 담체 단백질의 아스파라긴(Asn) 잔기에 공유 결합되며(예를 들어, N-결합됨), 여기에서 Asn 잔기는 SEQ ID NO: 1, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 글리코실화 부위에 존재한다. 전형적으로, 담체 단백질은 1-10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위, 예컨대 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 및 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함하며, 각각은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열, 및 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 담체 단백질은 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A이다. EPA에 있어서, 다양한 탈독소화된 단백질 변이체가 문헌에 기술되어 있으며, 담체 단백질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 탈독소화는 문헌 [Lukac et al., 1988, Infect Immun, 56: 3095-3098 and Ho et al., 2006, Hum Vaccin, 2:89 -98]에 따라 촉매적으로 필수적인 잔기 L552V 및 ΔE553을 돌연변이시키고 결실시킴으로써 달성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "EPA"는 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A를 나타낸다. 담체 단백질이 EPA인 이들 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 SEQ ID NO: 1을 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 글리코실화 부위에서 Asn 잔기에 공유 결합될 수 있으며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 글리코실화 부위에서 Asn 잔기에 공유 결합될 수 있다. 바람직하게는, EPA 담체 단백질은 1-10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위, 예컨대 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 및 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함하며, 각각은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열, 및 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, EPA 담체 단백질은 각각 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 4개의 글리코실화 부위, 예를 들어 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 글리코실화 부위를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "EPA-4 담체 단백질" 및 "EPA-4"는 각각 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 4개의 글리코실화 부위를 포함하는 탈독소화된 P. 애루기노사 외독소 A 담체 단백질을 나타낸다. EPA-4 담체 단백질의 예시적인 바람직한 예는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA 담체 단백질이다.
조성물
또 다른 양태에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 조성물은 본원에 기재된 담체 단백질(예를 들어, EPA)에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 임의의 바이오컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 면역원성 조성물이다. 본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 조성물"은 조성물이 투여되는 숙주 또는 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물을 나타낸다. 면역원성 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물이다. 본원에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용되는 담체"는 조성물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형제 또는 비히클을 나타내며, 이는 무독성이며, 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 예를 들어, 식염수 용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액은 특히 주사용 용액의 경우 액체 담체로 또한 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체의 다른 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.]에 기재되어 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Tris-완충 염수(TBS) pH 7.4(예를 들어, 각각 25 mM, 137 mM 및 2.7 mM으로 Tris, NaCl 및 KCl 함유) 중 본 발명의 바이오컨쥬게이트를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 약 7.0 pH의 약 10 mM KH2PO4/Na2HPO4 완충액, 약 5% (w/v) 소르비톨, 약 10 mM 메티오닌 및 약 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 80 중의 본 발명의 바이오컨쥬게이트를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 약 7.0 pH의 약 10 mM KH2PO4/Na2HPO4 완충액, 약 8%(w/v) 수크로스, 약 1mM EDTA, 및 약 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 80(예를 들어, EPA 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O-항원의 바이오컨쥬게이트에 적합한 완충액에 대해서는 WO 2018/077853 참조) 중의 본 발명의 바이오컨쥬게이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 일가 제형이고, 예를 들어 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트, 예컨대 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 일부로서 하나의 대장균 O-항원 다당류를 함유한다. 다가 조성물, 예를 들어, 2가, 3가, 4가 등의 조성물인 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 다가 조성물은 하나 초과의 항원, 예컨대 대장균 O-항원, 이의 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에서 제공되는 다가 조성물은 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트 및 적어도 하나의 추가 항원을 포함한다.
한 구체예에서, 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 본원에 기재된 바와 같은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 일가 조성물이다.
또 다른 구체예에서, 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 본원에 기재된 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류, 및 적어도 하나의 추가 항원을 포함하는 다가 조성물이다.
일부 구체예에서, 추가 항원은 항원 당류 또는 다당류, 더욱 바람직하게는 대장균 O-항원 다당류, 예컨대 O1, O2, O6, O8, O15, O16, O18, O25 및 O75 혈청형 및 이의 하위혈청 중 하나 이상의 대장균 O-항원이다. 일부 구체예에서, 추가의 대장균 O-항원 다당류 각각은 글리코컨쥬게이트이며, 이는 대장균 O-항원 다당류가 다른 화학종, 예를 들어 단백질, 펩티드, 지질 등, 가장 바람직하게는 담체 단백질에 예컨대, 화학적 또는 효소적 방법에 의해 공유적으로 결합됨을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 추가의 대장균 O-항원 다당류 각각은 O-항원 다당류가 숙주 세포 기구에 의해 효소적으로 글리코시드 결합을 통해 예를 들어, 담체 단백질에 공유 결합되는 바이오컨쥬게이트이다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 1-20개 추가의 글리코컨쥬게이트, 더욱 바람직하게는 대장균 O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 추가의 글리코컨쥬게이트 또는 바람직하게는, 대장균 O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 다른 항원, 예컨대 펩티드, 단백질 또는 지질 항원 등이 본원에 제공된 조성물에 포함될 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, 및 대장균 O1A 항원 다당류, 대장균 O2 항원 다당류, 대장균 O6A 항원 다당류, 대장균 O8 항원 다당류, 대장균 O15 항원 다당류, 대장균 O16 항원 다당류, 대장균 O18A 항원 다당류, 대장균 O25B 항원 다당류 및 대장균 O75 항원 다당류로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 항원 다당류를 포함한다. 바람직하게는, 추가의 O-항원 다당류 각각은 담체 단백질에 공유 결합되고, 더욱 바람직하게는 바이오컨쥬게이트이다.
한 구체예에서, O1A 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O1A 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O1A)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O1A 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O2 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O2 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O2)의 구조를 포함하며, 여기에서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O2 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O6A 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O6A 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O6A)의 구조를 포함하며, 여기에서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O6A 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O8 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O8 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O8)의 구조를 포함하며, 여기에서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O8 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O15 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O15 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O15)의 구조를 포함하며, 여기에서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O15 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O16 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O16 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O16)의 구조를 포함하며, 여기에서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O16 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O18A 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O18A 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O18A)의 구조를 포함하며, 여기에서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O18A 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O25B 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O25B 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O25B)의 구조를 포함하며, 여기에서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O25B 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
한 구체예에서, O75 항원 다당류(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)는 (예를 들어, 글루코실화된 O4 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트와 조합되어) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O75 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O75)의 구조를 포함하며, 여기서 n은 1-100, 바람직하게는 3-50, 예를 들어 5-40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, O75 항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부이고, 담체 단백질, 예를 들어 EPA에 공유적으로 결합된다.
또 다른 구체예에서, 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 적어도 대장균 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A 및 O25B 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어, EPA(즉, 5가 조성물)에 공유 결합된 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A 및 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 적어도 대장균 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O25B 및 O75 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어, EPA(즉, 9가 조성물)에 공유 결합된 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O25B 및 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 적어도 대장균 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류, 바람직하게는 담체 단백질, 예를 들어 EPA(즉, 10가 조성물)에 공유 결합된 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함한다.
다른 대장균 혈청형으로부터의 추가 O-항원(예를 들어, 단리된 형태로 또는 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트의 일부로서)을 임의적으로 추가로 포함하는 조성물이 또한 본원에서 고려된다.
일부 구체예에서, 추가의 대장균 O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, 및/또는 O75 항원 다당류 각각은 담체 단백질에 공유적으로 결합된다. O-항원 다당류는 화학적 또는 다른 합성 방법에 의해 담체 단백질에 연결될 수 있거나, O-항원 다당류는 바이오컨쥬게이트의 일부일 수 있고, 바람직하게는 바이오컨쥬게이트의 일부이다. 본 개시의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 담체 단백질이 사용될 수 있다. 적합한 담체 단백질은 비제한적으로, 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D를 포함한다. 바람직하게는, 담체 단백질은 EPA이다.
일부 구체예에서, 추가의 대장균 O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, 및/또는 O75 항원 다당류 각각은, 특히 바이오컨쥬게이트의 일부인 경우, 담체 단백질의 아스파라긴(Asn) 잔기에 공유적으로 결합되며, 여기에서 Asn 잔기는 글리코실화 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는 글리코실화 부위에 존재하고, 여기에서 X는 Pro을 제외한 임의의 아미노산이며(SEQ ID NO: 1)이며, 바람직하게는 Asn 잔기는 글리코실화 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)을 포함하는 글리코실화 부위에 존재하며, 여기에서 X 및 Z는 Pro을 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택된다(SEQ ID NO: 2). 담체 단백질은 1-10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함할 수 있으며, 각각은 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 EPA-4 담체 단백질, 예를 들어 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 EPA-4 담체 단백질이다.
특정 구체예에서, 하기를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)이 본원에 제공된다: (i) SEQ ID NO: 3을 포함하는 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A 담체 단백질(EPA-4 담체 단백질)에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류는 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; (ii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O1A 항원 다당류는 화학식 (O1A)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; (iii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O2 항원 다당류는 화학식 (O2)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; (iv) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O6A 항원 다당류는 화학식 (O6A)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; (v) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O8 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O8 항원 다당류는 화학식 (O8)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; (vi) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O15 항원 다당류는 화학식 (O15)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; (vii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O16 항원 다당류는 화학식 (O16)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; (viii) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O25B 항원 다당류는 화학식 (O25B)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트; 및 (ix) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O75 항원 다당류는 화학식 (O75)의 구조를 포함하는 바이오컨쥬게이트(여기에서 각각의 화학식은 표 1에 제공되며, 각각의 화학식에 있어서, 독립적으로 n은 1 내지 100, 예를 들어 1 내지 50, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40의 정수이다).
특정 구체예에서, 상기 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 하기를 추가로 포함한다: (x) EPA-4 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트로서, 대장균 O18A 항원 다당류는 표 1에 나타낸 바와 같은 화학식 (O18A)의 구조를 포함하며, 여기에서 이 구조에 있어서 n은 1 내지 100, 예를 들어 1 내지 50, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40의 정수이다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, 및 적어도 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하고, 여기에서 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트는 조성물에 존재하는 임의의 다른 바이오컨쥬게이트의 농도보다 약 1.5 내지 6배, 예를 들어 약 2 내지 4배 더 높은 농도, 예컨대 1.5, 2, 3, 4, 5 또는 6배 더 높은 농도로 조성물에 존재한다.
특정 구체예에서, 조성물은 대장균 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O25B 및 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하고, 여기에서 O1A:O2:글루코실화된 O4:O6A:O8:O15:O16:O25B:O75의 바이오컨쥬게이트가 1:1:1:1:1:1:1:2:1 또는 2:1:1:2:1:1:1:4:1의 비율(O-항원 다당류의 중량 기준)로 존재한다.
특정 구체예에서, 조성물은 대장균 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하고, 여기에서 O1A:O2:글루코실화된 O4:O6A:O8:O15:O16:O18A:O25B:O75의 바이오컨쥬게이트가 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1 또는 2:1:1:2:1:1:1:1:4:1의 비율(O-항원 다당류의 중량 기준)로 존재한다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, 및 적어도 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하며, 여기에서 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트는 2 내지 50 μg/mL, 바람직하게는 8내지 40 μg/mL, 더욱 바람직하게는 16 내지 32 μg/mL, 예컨대 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 또는 32 μg/mL의 농도로 조성물에 존재한다. 이러한 구체예에서, 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트 농도는 조성물 중에 존재하는 임의의 다른 바이오컨쥬게이트의 농도보다 바람직하게는, 약 1.5 내지 6배, 예를 들어, 약 2 내지 4배 더 높고, 예를 들어 1.5, 2, 3, 4, 5, 또는 6배 더 높다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성 조성물)은 애쥬번트를 포함하거나 이와 조합되어 투여된다. 본원에 기재된 조성물과 조합하여 투여하기 위한 애쥬번트는 상기 조성물의 투여 전(예를 들어, 72시간, 48시간, 24시간, 12시간, 6시간, 2시간, 1시간, 10분 이내), 동시에 또는 후에(예를 들어, 72시간, 48시간, 24시간, 12시간, 6시간, 2시간, 1시간, 10분 이내) 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "애쥬번트"는 본원에 기술된 조성물과 함께 또는 이의 일부로서 투여되는 경우, 바이오컨쥬게이트의 대장균 O-항원 다당류에 대한 면역 반응을 증대, 강화 및/또는 부스팅하며, 애쥬번트 화합물이 단독으로 투여되는 경우, 바이오컨쥬게이트 중의 대장균 O-항원 다당류에 대한 면역 반응을 발생시키지 않는 화합물을 나타낸다. 일부 구체예에서, 애쥬번트는 이의 바이오컨쥬게이트의 대장균 O-항원 다당류에 대한 면역 반응을 향상시키고, 알레르기 또는 다른 부작용을 일으키지 않는다. 애쥬번트는 예를 들어, 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 포함하는 여러 기전에 의해 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
적합한 애쥬번트의 예는 임의적으로 QS7과 조합되는, 비제한적으로, 알루미늄 염(명반)(예컨대, 명반 또는 나노명반 제형을 포함하는 나노입자를 포함하는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 산화알루미늄), 인산칼슘, 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(예를 들어, 영국 특허 GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919 참조), AS01, AS02, AS03 및 AS04(모두 GlaxoSmithKline; 예를 들어, AS04에 있어서 EP1126876, US7357936, AS02에 있어서 EP0671948, EP0761231, US5750110), MF59(Novartis), 이미다조피리딘 화합물(WO2007/109812 참조), 이미다조퀴녹살린 화합물(WO2007/109813 참조), 델타-이눌린, STING-활성화 합성 사이클릭-디-뉴클레오티드(예를 들어, US20150056224), 레시틴과 카르보머 호모폴리머의 조합물(예를 들어, US6676958), 및 사포닌, 예컨대 QuilA 및 QS21(예를 들어, 문헌 [Zhu D and W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113] 참조), Matrix M, Iscoms, Iscomatrix 등을 포함한다(문헌 [Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)]; 미국 특허 번호 5,057,540 참조). 일부 구체예에서, 애쥬번트는 프로운트 애쥬번트(완전 또는 불완전)이다. 다른 애쥬번트는 선택적으로 모노포스포릴 지질 A와 같은 면역 자극제와 조합된 수중유 에멀젼(예컨대, 스쿠알렌 또는 땅콩 오일)이다(문헌 [Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91(1997)] 참조). 또 다른 애쥬번트는 CpG이다(Bioworld Today, Nov. 15, 1998). 애주번트의 추가 예는 AS01E 및 AS01B에서와 같이 MPL 및 QS21과 같은 면역 자극제를 함유하는 리포솜이다(예를 들어, US 2011/0206758). 애쥬번트의 다른 예는 CpG(Bioworld Today, Nov. 15, 1998) 및 이미다조퀴놀린(예컨대, 이미퀴모드 및 R848)이다. 예를 들어, 문헌 [Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608] 참조. 특정 구체예에서, 애쥬번트는 톨-유사 수용체 4(TLR4) 효능제를 함유한다. TLR4 효능제는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Ireton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807] 참조). 특정 구체예에서, 애쥬번트는 지질 A를 포함하는 TLR4 효능제, 또는 이의 유사체 또는 유도체, 예컨대 MPL, 3D-MPL, RC529(예를 들어, EP1385541), PET-지질 A, GLA(글리코피라노실 지질 애쥬번트, 합성 이당류 당지질; 예를 들어, US20100310602, US8722064), SLA(예를 들어, 문헌 [Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: e108 (doi: 10.1038/cti.2016.63)]으로서, 이는 인간 백신을 위한 TLR4 리간드를 최적화시키기 위한 구조-기능 접근법을 기술함), PHAD(포스포릴화된 헥사아실 이당류), 3D-PHAD (이의 구조는 GLA의 구조와 동일함), 3D-(6-아실)-PHAD (3D(6A)-PHAD) (PHAD, 3D-PHAD 및 3D(6A)PHAD는 합성 지질 A 변이체이며, 예를 들어, 이들 분자의 구조를 또한 제공하는 avantilipids.com/divisions/adjuvants 참조), E6020(CAS 번호 287180-63-6), ONO4007, OM-174 등을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 애쥬번트를 포함하지 않으며, 애쥬번트와 조합되어 투여되지 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 대상체에 대한 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성)은 피하, 비경구, 경구, 설하, 협측, 피내, 경피, 결장직장, 복강내, 직장 투여, 정맥내, 비강내, 기관내, 근육내, 국소용, 경피 또는 피내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물(예를 들어, 약학적 및/또는 면역원성)은 근육내 주사용으로 제형화된다.
사용 방법
본원에 제공된 바이오컨쥬게이트 및 조성물은 대상체에서 대장균 글루코실화된 O4 항원에 대한 항체를 유도하고, 대장균, 특히 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대하여 대상체를 백신화시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 본원에 제공된 바이오컨쥬게이트 또는 조성물이 투여되거나 투여될 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예에는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 원숭이 또는 유인원과 같은 비인간 영장류(NHP), 인간 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다. 인간 대상체는 모든 연령이 될 수 있다. 특정 구체예에서, 대상체는 약 2개월 내지 약 18세, 예를 들어 1세 내지 18세의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 적어도 18세의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 15 내지 50세, 예를 들어 18 내지 45세, 예를 들어 20 내지 40세의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간 남성이다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간 여성이다. 특정 구체예에서, 대상체는 면역저하된 대상체이다. 특정 구체예에서, 대상체는 적어도 50세, 적어도 55세, 적어도 60세, 적어도 65세의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 100세 이하, 95세 이하, 90세 이하, 85세 이하, 80세 이하, 또는 75세 이하인 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 적어도 60세, 및 85세 이하의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 안정적인 건강 상태의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 안정적인 건강 상태의 적어도 60세 및 85세 이하의 인간 성인이다. 특정 구체예에서, 대상체는 요로 감염(UTI, 즉 요도, 방광, 요관 및/또는 신장의 박테리아 감염)의 병력이 있는, 즉 그의 또는 그녀의 인생에 적어도 1회의 UTI 에피소드를 갖는 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 지난 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1년 동안 UTI의 병력이 있는 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 재발성 UTI의 병력, 즉 6개월 동안 적어도 2회의 UTI 또는 1년 동안 적어도 3회의 UTI를 갖는 인간 대상체이다. 특정 구체예에서, 대상체는 지난 2년 동안 재발성 UTI의 병력이 있는 인간 대상체이다. 특정 구체예에서, 대상체는 안정적인 건강 상태의 60세 이상의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 60세 이상의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 적어도 60세 및 75세 미만의 인간이다. 특정 구체예에서, 대상체는 지난 2년 동안 UTI의 병력이 있는 75세 이상의 인간 대상체이다. 특정 구체예에서, 대상체는 선택적 비뇨생식기 및/또는 복부 시술 또는 수술, 예를 들어 경직장 초음파-유도 전립선 바늘 생검(TRUS-PNB)을 받도록 예정된 환자이다.
일 양태에서, 대상체에서 대장균 글루코실화된 O4 항원에 대한 항체를 유도하는 방법으로서, 본원에 기재된 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 임의의 바이오컨쥬게이트, 또는 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트를 단독으로 또는 다른 대장균 O-항원 다당류 또는 이의 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트와 추가로 조합하여 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원에 대해 유도되거나, 유발되거나 확인된 항체는 옵소닌식세포 활성을 갖는다. 특정 구체예, 유도되거나, 유발되거나 확인된 항체는 대장균 글루코실화된 및 글루코실화되지 않은 O4 균주 둘 모두의 옵소닌식세포 치사를 매개할 수 있는 교차-반응성 항체이다.
특정 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원에 대해 유도되거나, 유발되거나 또는 확인된 항체는 비변형된 및 글루코스 변형된 O4 항원 다당류를 특이적으로 인식한다. 특정 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원에 대해 유도되거나, 유발되거나 확인된 항체는 O4 혈청형의 대장균을 특이적으로 인식한다. 특정 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체는 비-글루코실화된 O4 항원과 비교하여 글루코실화된 O4 항원에 우선적으로 결합한다.
본원에 기재된 바이오컨쥬게이트 및 조성물에 의해 유도된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 대장균 O-항원 다당류, 예를 들어 글루코실화된 O4 항원 다당류에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 바이오컨쥬게이트 또는 조성물을 사용하여 유도되거나, 유발되거나 확인된 항체를 사용하여 요법 및/또는 질환 진행의 효능을 모니터링할 수 있다. 방사면역검정, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), 전기화학발광(ECL)-기반 면역검정, "샌드위치" 면역검정, 프레시피틴 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 면역방사 검정, 형광 면역검정, 단백질 A 면역검정 및 면역전기영도 검정과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비경쟁적 검정 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 면역검정 시스템이 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 이러함 검정 중 여러개는 예를 들어, ECL-기반 면역검정은 다중 형식으로 수행되 수 있으며, 전형적으로 다중 검정 형식이 선호된다.
대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 사용하여 유도되거나, 유발되거나 확인된 항체는 예를 들어, 복수의 대장균 균주로부터 대장균 O4 균주, 특히 글루코실화된 O4 균주를 검출하고/거나 대장균 O4 또는 글루코실화된 O4 균주에 의한 감염을 진단하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 대장균(예를 들어, 장외 병원성 대장균, ExPEC)에 대해 대상체를 백신화시키는 방법으로서, 본원에 기재된 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트, 또는 단독의 또는 다른 대장균 O-항원 또는 이의 글리코컨주에이트 또는 바이오컨쥬게이트와 추가로 조합되는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물 중 임의의 것을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 당업자는 대장균 균주의 O 항원 또는 이의 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트가 투여되는 조성물에 존재하는 대장균 균주에 대해 대상체가 백신화될 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A 및 O25B 항원 다당류를 포함하는 조성물의 투여는 대장균 혈청형 O1A, O2, O4, O6A 및 O25B에 대해 대상체를 백신화하는데 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 백신화는 침습성 ExPEC 질환(IED), 예를 들어, 요로감염, 균혈증, 패혈증 등을 예방하기 위한 것이다. 특정 구체예에서, 백신화는 요로 감염의 발생 또는 중증을 예방하거나 감소시키기 위한 것이다. 특정 구체예에서, IED는 예를 들어, 비뇨생식기 및/또는 복부 시술 또는 수술을 받는 환자에서 병원 획득될 수 있다. 특정 구체예에서, IED는 예를 들어, 병원, 외래 수술 센터 말기 신장 질환 시설, 장기 요양 시설 등에서 예를 들어, 일부 경우에, 중앙 라인, 카테터 등을 통해 또 다른 상태에 대해 건강 관리를 받고 있는 환자에서 건강 관리와 관련될 수 있다. 특정 구체예에서, IED는 예를 들어, 최근에 의료 위험에 노출되지 않은 환자에서 지역사회 획득될 수 있다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 대장균(예를 들어, ExPEC)에 대해 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 본원에 기재된 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트, 또는 단독의 또는 다른 대장균 O-항원 또는 이의 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트와 추가로 조합되는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 한 구체예에서, 대상체는 투여 시점에 대장균(예를 들어, ExPEC) 감염을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 투여 시점에 대장균(예를 들어, ExPEC) 감염을 갖지 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물 및 바이오컨쥬게이트는 항체, 바람직하게는 옵소닌식세포 활성을 갖는 항체의 생성을 포함하는 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 기술(예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피, 원심분리, 침전 등)을 사용하여 단리될 수 있다.
대상체에서 면역 반응을 생성하는 본원에 기재된 바이오컨쥬게이트 및 조성물의 능력은 당업자에게 공지되거나 본원에 기재된 임의의 접근법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 바이오컨쥬게이트의 능력은 대상체(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이) 또는 대상체 세트를 본원에 기재된 바이오컨쥬게이트로 면역화하고 추가의 대상체(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이) 또는 대상체 세트를 대조군(PBS)으로 면역화시킴으로써 평가될 수 있다. 대상체 또는 대상체 세트는 이후에 ExPEC로 자극될 수 있으며, 대상체 또는 대상체 세트에서 질병(예를 들어, UTI, 균혈증, 또는 기타 질병)을 초래하는 ExPEC의 능력이 결정될 수 있다. 당업자는, 대조군으로 면역화된 대상체 또는 대상체 세트가 ExPEC로 자극 후 질병을 앓지만 본원에 기재된 바이오컨쥬게이트(들) 또는 이의 조성물로 면역화된 대상체 또는 대상체 세트는 질병을 덜 앓거나 질병에 걸리지 않은 경우, 바이오컨쥬게이트는 대상체에서 면역 반응을 발생시킬 수 있음을 인식할 것이다. ExPEC로부터의 O 항원과 교차 반응하는 항혈청을 유도하는 본원에 기재된 바이오컨쥬게이트(들) 또는 이의 조성물의 능력은 예를 들어, 면역검정, 예컨대 ELISA(예를 들어, [Van den Dobbelsteen et al, 2016, Vaccine 34: 4152-4160] 참조) 또는 ECL-기반 면역검정에 의해 테스트될 수 있다.
예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 생성하는 본원에 기재된 바이오컨쥬게이트의 능력은 혈청 살균 검정(SBA) 또는 옵소닌식세포 치사 검정(OPK 검정, 또는 OPKA)을 사용하여 검출될 수 있으며, 이는 글리코컨쥬게이트-기반 백신의 승인을 얻는데 사용된 확립되고 허용되는 방법을 대표한다. 이러한 검정은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 간략하게는 대상체(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이)에게 항체를 유발하는 화합물을 투여함으로써 관심 표적(예를 들어, O 항원 다당류, 예를 들어 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류)에 대한 항체를 발생시키고 분리하는 단계를 포함한다. 그 후, 항체의 멸균 능력은 예를 들어, 항체 및 보체 및 - 검정에 따라 - 호중구 세포의 존재 하에 문제의 박테리아(예를 들어, 관련 혈청형의 대장균)를 배양하고, 예를 들어, 표준 미생물학적 접근법을 사용하여 박테리아의 치사 및/또는 중화를 매개하는 항체의 능력을 검정함으로써 평가될 수 있다. 대장균 바이오컨쥬게이트 백신에 대한 OPK 검정의 예에 있어서, 예를 들어, 문헌 [Abbanat et al, 2017, Clin. Vaccine Immunol. 24: e00123-17] 참조. OPK 검정은 모노플렉스 또는 멀티플렉스 형식으로 수행될 수 있으며, 이중 멀티플렉스 형식(예를 들어, 동시에 다중 혈청형 테스트)이 전형적으로 선호된다. 멀티플렉스 OPK 검정은 종종 'MOPA'로서 본원에 지칭된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트, 또는 다른 대장균 O-항원 또는 이의 글리코컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트와 추가로 조합된 또는 단독의 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, "유효량"은 대장균(예를 들어, ExPEC)에 대해 대상체를 백신화시키는 양이다. 또 다른 구체예에서, "유효량"은 대장균(예를 들어, ExPEC)에 대한 면역 반응, 예컨대 항체, 바람직하게는 옵소닌식세포 활성을 갖는 항체의 생성을 포함하는 면역 반응을 대상체에서 유도하는 양이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, 및 적어도 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하고, 대장균 O25B 항원 다당류의 유효량은 조성물에 존재하는 임의의 다른 바이오컨쥬게이트의 농도보다 약 1.5 내지 6배, 예를 들어 약 2 내지 4배 더 높으며, 예컨대 1.5, 2, 3, 4, 5 또는 6배 더 높다. 이러한 구체예에서, 대장균 O25B 항원 다당류의 유효량은 예를 들어, 투여 당 약 5 내지 18 μg, 예컨대 투여 당 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 μg이다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따른 바이오컨쥬게이트 또는 조성물은 대상체에게 1회 투여된다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 바이오컨쥬게이트 또는 조성물은 예를 들어, 프라임-부스트 요법으로 대상체에게 1회 넘게 투여된다. 특정 구체예에서, 두 투여 사이의 시간은 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년 또는 적어도 15년이다. 인간에서 원하는 면역 반응은 전형적으로 본 발명에 따른 바이오컨쥬게이트 또는 조성물의 단일 투여에 의해 발생할 수 있다. 특정 구체예에서, 예를 들어 10년 후에 반복 투여가 제공된다.
숙주 세포
대장균 O 항원 및 이러한 대장균 O 항원을 포함하는 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포, 예를 들어 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 숙주 세포는 바람직하게는, 대장균 O-항원 다당류 및/또는 이의 바이오컨쥬게이트를 생성하는데 사용되는 숙주 세포 기구(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제)를 인코딩하는 핵산을 (예를 들어, 유전자 조작을 통해) 하나 이상 포함하도록 변형된다.
당업자에게 공지된 임의의 숙주 세포는 고세균, 원핵 숙주 세포 및 진핵 숙주 세포를 포함하는 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류(예를 들어, 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류) 및 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 바이오컨쥬게이트(예를 들어, 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트)를 생성하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이다. 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류 및 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 바이오컨쥬게이트의 생성에 사용하기 위한 예시적인 원핵 숙주 세포는 비제한적으로, 에스체리치아(Escherichia) 종, 쉬겔라(Shigella) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 잔토모나스(Xhantomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 락토코커스(Lactococcus) 종, 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 바실러스(Bacillus) 종 및 클로스트리듐(Clostridium) 종을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류 및 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 바이오컨쥬게이트를 생성하는데 사용된 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이며, 바람직하게는 대장균이다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류 및 바이오컨쥬게이트를 생성하는데 사용된 숙주 세포는 이종성 핵산, 예를 들어 요망되는 O 항원 혈청형의 rfb 유전자 클러스터를 포함하는 이종성 핵산, 하나 이상의 담체 단백질 및/또는 글리코실트랜스퍼라제를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하도록 조작된다. 특정 구체예에서, 이종성 rfb 유전자, 및/또는 글리코실화 경로(예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물 글리코실화 경로)에 관여하는 단백질을 인코딩하는 이종성 핵산은 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 핵산은 비제한적으로 올리고사카릴 트랜스퍼라제 및/또는 글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 단백질을 인코딩할 수 있다.
예를 들어, 대장균 O 항원 다당류 및 이의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 데 사용될 수 있는 재조합 숙주 세포를 제조하는 데 유용한 글리코실트랜스퍼라제를 인코딩하는 다양한 유전자 및 유전자 클러스터의 서열이 본원에 기재된다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 특정 아미노산 서열을 갖는 단백질이 다수의 상이한 핵산에 의해 인코딩될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 당업자는 본원에 제공된 핵산이 핵산에 의해 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 이의 서열이 본원에 제공된 서열과 상이한 방식으로 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류, O1A 항원 다당류, O2 항원 다당류, O6A 항원 다당류, O8 항원 다당류, O15 항원 다당류, O16 항원 다당류, O18A 항원 다당류, O25B 항원 다당류 또는 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성하기 위한 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)가 본원에 제공된다. 본원에 제공되는 숙주 세포는 대장균 O 항원 다당류를 생성할 수 있는 효소(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에 제공된 숙주 세포는 관심 O 항원을 생성할 수 있는 핵산을 자연적으로 발현할 수 있거나, 숙주 세포는 이러한 핵산을 발현하도록 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산은 숙주 세포에 이종성이며, 당업계에 공지된 유전자 접근법을 사용하여 숙주 세포 내에 도입된다. 예를 들어, 핵산은 유전자 조작에 의해 숙주 세포 내에 도입될 수 있다(예를 들어, 유전자 클러스터는 플라스미드 또는 플라스미드 상에 발현되거나 숙주 세포 게놈 내로 통합된다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2014/037585, WO 2014/057109, WO 2015/052344 참조).
한 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)가 본원에 제공된다. 이러한 숙주 세포는 바람직하게는, 전구체 세포를 조작함으로써 gtrS 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는데, 이는 본 발명자들이 아는 한 글루코스를 대장균 O4 항원 및 특히, α-1,3-글리코시드 결합을 통해 L-Rha에 전달할 수 있는 다당류 분지 효소(즉, 대장군 O4 항원 다당류에 특이적인 글루코실트랜스퍼라제)를 인코딩하는 것으로서 본원에서 처음으로 확인되었다. 이러한 분지 효소의 아미노산 서열의 예는 SEQ ID NO: 4에 제공된다. 다른 예는 이에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 대장균 O4 항원 다당류에 특이적인 gtrS 유전자를 인코딩하는 핵산 서열의 예시적인 예는 비제한적으로 SEQ ID NO: 5, 또는 SEQ ID NO: 4를 인코딩하는 이에 대한 퇴화 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 기능성 O4-특이적 GtrS 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 SEQ ID NO: 4에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 유전자 코드의 중복성의 관점에서, 당업자는 요망되는 경우, 예를 들어, 코돈 최적화된 서열을 사용하여 글루코실 트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산의 변이체를 만들 수 있다.
특정 구체예에서, SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제(GtrS)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 박토프레놀-연결된 글루코스 트랜스로카제(GtrA)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 박토프레놀 글루코실 트랜스퍼라제(GtrB)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 핵산 서열은 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 GtrA 및 GtrB 단백질을 인코딩하며, 각각 박토프레놀-연결된 글루코스 트랜스로카제(SEQ ID NO: 7) 및 박토프레놀 글루코실 트랜스퍼라제(SEQ ID NO: 8)를 갖는다. 유전자 코드의 중복성의 관점에서, 당업자는 요망되는 경우, 예를 들어, 코돈 최적화된 서열을 사용하여 박토프레놀-연결된 글루코스 트랜스로카제 및 박토프레놀 글루코실 트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산의 변이체를 만들 수 있다.
본원에 제공된 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 대장균 O4 항원 다당류의 생성에 유용한 rfb 유전자 클러스터의 예는 본원에서 SEQ ID NO: 9로서 제공된다. 또 다른 예는 GenBank, 유전자좌 AY568960에서 찾을 수 있다. 이 서열에 의해 인코딩된 것과 동일한 효소를 인코딩하는 퇴화 핵산 서열, 또는 적어도 80% 동일한, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 효소를 인코딩하는 서열이 또한 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성하는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 원핵 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 대장균 숙주 세포)가 본원에 제공되며, 여기에서 숙주 세포는 gtrS, 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터, 및 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 숙주 세포는 gtrS 유전자, rfb 유전자 클러스터, 및/또는 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하거나, gtrS, rfb 클러스터 및/또는 숙주 세포 게놈 내로 통합된 담체 단백질을 인코딩하는 핵산과 같은 관련 유전자 일부 또는 모두를 포함하도록 재조합 접근법을 이용하여 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 유전자 또는 유전자 클러스터는 상동 재조합을 사용하여 숙주 세포의 게놈 내로 통합되었다. 숙주 세포의 게놈 내로의 유전자를 통합하는 장점은 항생제 선택의 부재 하의 안정성이다.
또 다른 특정 구체예에서, 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성하는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 원핵 숙주 세포)가 본원에 제공되며, 숙주 세포는 GtrS(글루코실트랜스퍼라제)는 물론 O4 rfb 클러스터에 의해 인코딩된 효소를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 언급된 효소의 일부 또는 전부는 숙주 세포에 대해 이종성이다.
다른 특정 구체예에서, 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류, 바람직하게는 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성하는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 원핵 숙주 세포)가 본원에 제공되며, 숙주 세포는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 한 특정 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 숙주 세포에 대해 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 담체 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, O4 클러스터의 rfb 유전자는 숙주 세포에 이종성이다. 바람직하게는, O4 항원에 분지된 글루코스 측쇄를 도입할 수 있는 효소를 인코딩하는 서열, 즉 gtrS 유전자(SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩함)는 숙주 세포에 대해 이종성이다. 핵산은 동일한 서열이 상기 숙주 세포에 자연적으로 존재하지 않는 경우 숙주 세포에 대해 이종성이다. 예를 들어, 이종성 핵산은 유전자 조작에 의해, 예를 들어 형질전환(예를 들어, 화학적 형질전환 또는 전기천공) 및/또는 재조합에 의해 어미 세포에 도입될 수 있다. 특정 구체예에서, 이종성 핵산, 예컨대 요망되는 rfb 유전자좌, gtrS 코딩 서열, 담체 단백질 인코딩 서열 및/또는 글리코실트랜스퍼라제 인코딩 서열은 숙주 세포, 바람직하게는 박테리아 숙주 세포, 바람직하게는 대장균 숙주 세포의 게놈 내에 도입된다. 바람직한 구체예에서, 내인성 rfb 유전자좌 및 적용 가능한 경우 gtrS 코딩 서열은 불활성화되고, 바람직하게는 이의 선행자와 비교하여 재조합 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되고, 바람직하게는 이들은 각각 원하는 이종성 rfb 유전자좌 및 적용 가능한 경우 원하는 gtrS 코딩 서열에 의해 대체된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 대장균의 K-12(비제한적인 예로서, 대장균 균주 W3110은 K-12 균주임), 또는 대장균의 B 균주(비제한적인 예로서, 대장균 균주 BL21은 B 균주임), 또는 일차 야생형 분리주와 대조적으로 대장균의 다른 잘 정의된 균주, 예를 들어 실험실 균주 또는 생산 균주이다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 gtrS 유전자 및 O4 rfb 유전자좌를, O4 항원 또는 글루코실화된 O4 항원을 발현하지 않는 대장균 내에 도입시킴으써 이러한 대장균으로부터 유래한다. 숙주 세포의 전구체로서 대장균 K-12 또는 대장균 B와 같은 잘 특성 규명된 균주를 사용하는 이점은 생산 균주의 특성이 잘 규정되어 있기 때문에 다양한 O-항원 바이오컨쥬게이트에 대해 유사한 생산 공정을 사용할 수 있는 가능성이다. 다양한 O-항원의 바이오컨쥬게이트가 상이하게 행동할 것이고, 발현 과정이 생산 균주마다 최적화될 수 있지만, 적어도 O-항원 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 기본 과정은 야생형 분리주와 같은 알려지지 않은 균주가 숙주 균주의 생성을 위한 전구체로서 사용되는 경우보다 더 잘 규정된 전구체 균주를 사용하여 더욱 예측가능할 것이다. 이러한 방식으로, 예를 들어, WO 2015/124769 및 WO 2017/035181에 기술된 바와 같은 O1A, O2, O6A 및 O25B 바이오컨쥬게이트와 같은 이전에 기술된 대장균 O-항원 바이오컨쥬게이트의 생산에 대한 경험은 다른 대장균 O-항원 바이오컨쥬게이트의 생산을 설계하기 위한 기초로 사용될 수 있다. gtrS와 달리, gtrA 및 gtrB 유전자는 혈청형 특이적이지 않으며, 특정 구체예에서, 숙주 세포에 대해 상동성이다(예를 들어, 대장균 K12 균주 W3110은 내인성 gtrS 유전자를 대체하는 SEQ ID NO: 4의 글루코실 트랜스퍼라제 또는 이와 적어도 80% 동일한 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 O4-혈청형 특이적 재조합 도입된 gtrS 유전자와 함께 기능할 수 있는 gtrA 및 gtrB 유전자를 포함한다). 다른 구체예에서, gtrA 및 gtrB 유전자(각각 SEQ ID NO: 7 및 8과 적어도 약 80% 동일한 GtrA 및 GtrB를 인코딩하며, 각각 박토프레놀-연결된 글루코스 트랜스로카제 및 박토프레놀 글루코실 트랜스퍼라제 활성을 가짐) 중 하나 또는 둘 모두는 또한 예를 들어, 숙주 세포가 내인성 gtrA 및/또는 gtrB 유전자를 갖지 않는 경우 숙주 세포에 재조합적으로 도입된다.
또한, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 또는 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)가 본원에 제공된다. 이러한 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 O-항원 다당류에 특이적인 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. rfb 유전자 클러스터는 야생형 대장균 균주로부터 분리되고, 하나의 숙주 세포 내부에서 올리고사카릴 트랜스퍼라제(예를 들어, PgIB) 및 담체 단백질(예를 들어, EPA)을 인코딩하는 핵산과 조합될 수 있어 관심 대장균 O-항원 또는 이의 바이오컨쥬게이트를 생성하는 재조합 숙주 세포를 수득할 수 있다. 예를 들어, 이러한 숙주 세포는 WO 2014/037585, WO 2009/104074, 및 WO 2009/089396에 기술된 것과 같은 바이오컨쥬게이션 기술을 사용하여 rfb 유전자 클러스터, 올리고사카릴 트랜스퍼라제(예를 들어, PglB) 및 담체 단백질(예를 들어, EPA)을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하도록 재조합 접근법을 사용하여 조작될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 이들의 게놈 내로 통합된 rfb 유전자 클러스터를 포함한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제, 담체 단백질 및 적용 가능한 경우 gtrS 유전자를 인코딩하는 핵산은 특정 구체예에서, 또한 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 이종성 또는 상동성 gtrA 및 gtrB 유전자는 특정 구체예에서, 또한 숙주 세포의 게놈 내에 통합된다.
O1A, O2, O6A 및 O25B 항원에 대한 바이오컨쥬게이트의 제조는 WO 2015/124769 및 WO 2017/035181에 상세히 설명되어 있다. 각 대장균 O 항원(rfb 유전자좌)에 대한 예시적인 유전자 클러스터는 문헌 [Iguchi A, et al, DNA Research, 2014, 1-7 (doi: 10.1093/dnares/dsu043), and in DebRoy C, et al, PLoS One. 2016, 11(1):e0147434 (doi: 10.1371/journal.pone.0147434; correction in: Plos One. 2016, 11(4):e0154551, doi: 10.1371/journal.pone.0154551)]에 설명되어 있다. rfb 클러스터에 대한 핵산 서열 및 여기에 인코딩된 단백질에 대한 아미노산 서열 또한 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 본원에 기재된 혈청형의 다당류 항원과의 바이오컨쥬게이트에 대한 생산 균주에 사용될 수 있는 rfb 클러스터에 대한 예시적인 서열은 또한 SEQ ID NO: 9 및 11-19에 제공된다. 따라서, 상기 언급된 요망되는 바이오컨쥬게이트 각각에 있어서, 각 rfb 클러스터는 숙주 세포 내로 도입되어 요망되는 O-항원에 대한 특이적 rfb 클러스터를 가질뿐만 아니라 올리고사카릴트랜스퍼라제 및 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를 수득할 수 있다. 상기 언급된 이유로, 바람직하게는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이며, 바람직하게는 비교적 잘 공지된 특징을 갖는 균주, 예컨대 대장균 실험실 또는 생성 균주, 예를 들어, 대장균 K12 또는 대장균 BL21 등으로부터 유래된다. 바람직하게는, rfb 클러스터는 숙주 세포에 이종성이며, 예를 들어, 숙주 세포의 전구체 세포에 도입되며, 바람직하게는 이의 게놈 내에 통합된다. 바람직하게는, 원래 rfb 유전자 클러스터가 전구체 세포에 존재하는 경우, 이는 숙주 세포에서 관심 O-항원에 대한 rfb 유전자 클러스터에 의해 대체되어 관심 O-항원의 바이오컨쥬게이트의 생성을 가능하게 하였다. 바람직하게는, 올리고사카릴트랜스퍼라제는 숙주 세포에 대해 이종성이며, 특정 구체예에서, 이러한 올리고사카릴트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다.
본원에 제공된 임의의 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 원핵 숙주 세포)는 단백질의 N-글리코실화에서 활성인 추가적인 효소를 인코딩하는 핵산을 포함하며, 예를 들어, 본원에 제공된 숙주 세포는 다른 글리코실트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산 또는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 제공된 숙주 세포는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 N-글리코실화 컨센서스 모티프를 포함하는 초기 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기로 지질-연결된 다당류를 전달한다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포에 대해 고유할 수 있거나, 유전자 접근법을 사용하여 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 숙주 세포에 대해 이종성이다. 대장균은 자연적으로 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 포함하지 않으며, 따라서 대장균이 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 숙주 세포로서 사용되는 경우, 이종성 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 예를 들어, 유전자 조작에 의해 도입시 이러한 숙주 세포에 포함된다. 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 본 개시내용의 관점에서 당업계에 공지된 임의의 공급원으로부터 비롯될 수 있다.
특정 구체예에서, 예를 들어, 비제한적인 예로서 PglL로서 O-글리코실트랜스퍼라제와 같은 N-글리코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 올리고사카릴 트랜스퍼라제에 대한 대안은 예를 들어, WO 2016/82597에 기술된 바와 같이 담체 단백질에서 이들 자신의 상이한 글리코실화 컨센서스 서열과 함께 사용될 수 있다. 따라서, O-글리코실트랜스퍼라제와 같은 다른 글리코실트랜스퍼라제는 본 발명에 따른 올리고사카릴트랜스퍼라제로서 사용될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다. 예를 들어, 한 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄포르박터 제주니로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다(즉, pglB; 예를 들어, 문헌 [Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793; see also, e.g., NCBI Gene ID: 3231775, UniProt Accession No. O86154] 참조). 또 다른 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 캄필로박터 라리로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다(예를 들어, NCBI Gene ID: 7410986 참조).
특정 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 천연(야생형) 단백질 또는 이의 임의의 변이체, 예컨대 국제 특허 출원 공개 WO 2016/107818 및 WO 2016/107819에 기술된 것들을 포함하는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제이다. PglB는 지질-연결된 다당류를 컨센서스 서열 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 아스파라긴 잔기로 전달할 수 있다. 특정 구체예에서, PglB 다당류 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 6 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 야생형 PglB에서 하나 이상의 내인성 글리코실화 컨센서스 서열은 변이되어 PglB 자가글리코실화를 회피하였으며, 예를 들어, SEQ ID NO: 6은 돌연변이 N534Q를 포함한다. 본원에 제공된 재조합 숙주 세포에 사용하기에 적합한 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제의 예는 N311V, K482R, D483H, A669V, Y77H, S80R, Q287P 및 K289R로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 6의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 포함한다. 한 특정 구체예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6을 갖는다. 또 다른 특정 구체예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6을 갖는다. 또 다른 특정 구체예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 N311V, K482R, D483H 및 A669V를 포함하는 SEQ ID NO: 6을 갖는다. 또 다른 특정 구체예에서, 변이체 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6을 갖는다. 특정 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 변이체가 특정 혈청형의 대장균 O-항원 바이오컨쥬게이트의 생성에서 현저하게 개선된 수율을 제공한다는 것이 본원에서 발견되고 설명되었다. 주어진 대장균 O-항원에 대한 개선되거나 최적의 PglB 변이체는 예측할 수 없었다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 또한 올리고사카릴 트랜스퍼라제로서 특정 PglB 변이체를 사용하여 특정 대장균 O-항원의 바이오컨쥬게이트를 생성하는 방법을 제공한다. SEQ ID NO: 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하며, 여전히 올리고사카릴 트랜스퍼라제 활성을 가져, 바람직하게는 본원에서 조합되어 개시된 지정된 위치에서 특정 아미노산 중 하나 이상을 갖는 PglB의 추가의 변이체 (예를 들어, 77Y, 80S, 287Q, 289K, 311N, 482K, 483D, 669A; 또는 311V; 또는 311V, 482R, 483H, 669V; 또는 77H, 80R, 287P, 289R, 311V; 또는 77H, 311V; 등)가 또한 바이오컨쥬게이트의 생성에 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 SEQ ID NO: 6, 또는 바람직하게는 돌연변이 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6, 또는 더욱 바람직하게는 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A, O6A, 또는 O15 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 SEQ ID NO: 6 또는 바람직하게는, 돌연변이 N311V, K482R, D483H 및 A669V를 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 SEQ ID NO: 6, 또는 바람직하게는 돌연변이 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 SEQ ID NO: 6, 또는 바람직하게는 돌연변이 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O8, O18A, O25B, 또는 O2 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 캄필로박터 제주니로부터의 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 6은 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483, 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 임의의 숙주 세포는 담체 단백질, 예를 들어 숙주 세포 글리코실화 기구에 의해 생성된 O-항원 다당류(들)가 부착되어 바이오컨쥬게이트를 형성할 수 있는 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 숙주 세포는, 비제한적으로, 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D를 포함하는 본 개시의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 바람직하게는, EPA 담체 단백질은 1-10개의 글리코실화 부위, 바람직하게는 2 내지 4개의 글리코실화 부위, 가장 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위, 예컨대 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 및 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함하며, 각각은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 가지며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 EPA-4 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포에 의해 바이오컨쥬게이트의 생성에 사용되는 담체 단백질은 "tag", 즉 담체 단백질의 분리 및/또는 확인을 허용하는 아미노산의 서열을 포함한다. 예를 들어, tag를 담체 단백질에 추가하는 것은 그 단백질의 정제에 유용할 수 있으며, 따라서 컨쥬게이트 백신의 정제는 태깅된 담체 단백질을 포함한다. 본원에 사용될 수 있는 예시적인 tag는 비제한적으로, 히스티딘(HIS) tag(예를 들어, 헥사-히스티딘-tag, 또는 6XHis-Tag), FLAG-TAG 및 HA tag를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 사용된 tag는 제거가능하며, 예를 들어, 일단 이들이 더 이상 필요하지 않으면, 예를 들어, 단백질이 정제된 후에 예를 들어, 화학적 제제 또는 효소적 수단에 의해 제거된다. 다른 구체예에서, 담체 단백질은 tag를 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 담체 단백질을 발현하는 숙주 세포의 주변세포질 공간으로 담체 단백질을 표적화하는 신호 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 신호 서열은 대장균 DsbA, 대장균 외막 포린 A(OmpA), 대장균 말토스 결합 단백질(MalE), 에르위니아 카로토보란스 펙테이트 리아제(Erwinia carotovorans pectate lyase)(PelB), FlgI, NikA, 또는 바실러스 종 엔독실라나제(XynA), 열 민감 대장균 장독소 LTIIB, 바실러스 엔독실라나제 XynA 또는 대장균 플래겔린(FlgI)으로부터 비롯된다. 한 구체예에서, 신호 서열은 SEQ ID NO: 10을 포함한다. 신호 서열은 단백질의 주변 세포질로의 전위 후에 절단될 수 있고, 따라서 바이오컨쥬게이트의 최종 담체 단백질에 더 이상 존재하지 않을 수 있다.
특정 구체예에서, 추가적인 변형이 (예를 들어, 재조합 기술을 사용하여) 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 아마도 경쟁하거나 간섭하는 글리코실화 경로(예를 들어, 숙주 세포 내로 재조합으로 도입되는 글리코실화에 관련된 하나 이상의 이종성 유전자와 경쟁하거나 이를 간섭함)의 일부를 형성하는 단백질을 인코딩하는 숙주 세포 핵산(예를 들어, 유전자)은 이들을 불활성/기능이상으로 만드는 방식으로 숙주 세포 배경(게놈)에서 결실되거나 변형될 수 있다(즉, 결실/변형되는 숙주 세포 핵산은 기능성 단백질을 인코딩하지 않음). 특정 구체예에서, 핵산이 본원에 제공된 숙주 세포의 게놈으로부터 결실될 때, 이들은 바람직한 서열, 예를 들어 O 항원 다당류 또는 이의 바이오컨쥬게이트의 생성에 유용한 서열로 대체된다.
숙주 세포에서 결실될 수 있는 (일부 경우에, 다른 요망되는 핵산 서열로 대체될 수 있는) 예시적인 유전자 또는 유전자 클러스터는 waaL과 같은 당지질 생합성에 관여하는 숙주 세포의 유전자 또는 유전자 클러스터(예를 들어, 문헌 [Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021] 참조), 지질 A 코어 생합성 클러스터(waa), 갈락토스 클러스터(gal), 아라비노스 클러스터(ara), 콜론산 클러스터(wc), 캡슐 다당류 클러스터, 운데카프레놀-p 생합성 유전자(예를 들어, uppS, uppP), und-P 재순환 유전자, 뉴클레오티드 활성화된 당 생합성에 관여하는 대사 효소, 엔테로박터 공통 항원 클러스터(eca) 및 프로파지 O 항원 변형 클러스터, 예컨대 gtrABS 클러스터 또는 이의 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포는 이들이 요망되는 O 항원 다당류, 예를 들어 글루코실화된 O4 항원 다당류 이외의 임의의 O 항원 다당류를 생성하지 않도록 변형된다.
특정 구체예에서, waaL 유전자는 본원에 제공된 숙주 세포(예를 들어, 재조합 숙주 세포)의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다. 용어 "waaL" 및 "waaL 유전자"는 주변 세포질에 위치한 활성 부위를 갖는 막 결합 효소를 인코딩하는 O-항원 리가제 유전자를 지칭한다. 인코딩된 효소는 운데카프레닐포스페이트(UPP)-결합된 O 항원을 지질 A 코어에 전달하여 지질다당류를 형성한다. 내인성 waaL 유전자(예를 들어, ΔwaaL 균주)의 결실 또는 방해하는 O-항원의 지질 A로의 전달을 방해하고, 대신 O-항원을 또 다른 생체분자, 예컨대 담체 단백질로의 전달을 향상시킬 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, waaL 유전자, gtrA 유전자, gtrB 유전자, gtrS 유전자 및 rfb 유전자 클러스터 중 하나 이상은 본원에 제공된 원핵 숙주 세포의 원래의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다.
한 구체예에서, 본원에 사용된 숙주 세포는 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성하는 대장균이고, 여기서 waaL 유전자는 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화되고, 대장균 O4 항원 다당류에 특이적인 gtrS 유전자가 삽입된다. 글루코실화된 O4 O-항원의 바이오컨쥬게이트를 위한 생산 균주에 대한 특정 구체예에서, SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 gtrS 유전자는 모 균주의 gtrS 유전자를 O4 항원의 글루코실화를 담당하는 것으로 대체하도록 모 균주의 gtrS 유전자 대신 삽입된다. 이러한 모 균주의 예는 대장균 K-12 균주 W3110이다. gtrA 및 gtrB 유전자는 모 균주에 대해 상동일 수 있거나, 대안적으로 이들 유전자 중 하나 또는 둘 모두는 모 균주에 대해 이종성일 수 있다. 전형적으로, gtrS 유전자와 달리 이러한 gtrA 및 gtrB 유전자는 O-항원 구조에 특이적이지 않다.
또한 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합 숙주 세포는 대장균 O 항원의 바이오컨쥬게이트를 생성하는데 사용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 세포 내로 도입하여 재조합 숙주 세포를 생성하는 것을 포함한다. 전형적으로, 재조합 핵산 분자는 이종성이다. 본 개시내용의 관점에서 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합 핵산 분자를 숙주 세포에 도입할 수 있다. 재조합 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 전기천공, 화학적 형질전환, 열 충격, 자연 형질전환, 파지 형질도입 및 컨쥬게이션을 사용하여 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 구체예에서, 재조합 핵산은 플라스미드를 사용하여 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 이종성 핵산은 플라스미드(예를 들어, 발현 벡터)에 의해 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 이종성 핵산은 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2014/037585, WO 2014/057109, 또는 WO 2015/052344에 기재된 바와 같은 게놈 내로의 삽입 방법을 사용하여 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입된다.
한 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 생성하기 위한 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법은 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 세포, 바람직하게는 대장균 세포에 도입하여 재조합 숙주 세포를 생성하는 것을 포함한다. 이러한 구체예에서, 세포 내로 도입된 재조합 핵산 분자는 (i) 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열; (ii) SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 글루코실 트랜스퍼라제는 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성하기 위해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시킬 수 있는, 뉴클레오티드 서열; (iii) 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (iv) 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 담체 단백질에 공유 결합시켜 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는 올리고사카릴 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 글루코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 gtrS 유전자를 대체한다. 내인성 gtrS를 삭제하면 글루코실화된 O4 항원 다당류 구조의 생성을 방해하지 않을 것이라는 이점이 있다. 특정 구체예에서, 대장균 O4 항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열은 재조합 숙주 세포를 제조하는 데 사용되는 모 균주의 내인성 rfb 유전자 클러스터를 대체한다. 세포가 아직 gtrA 및/또는 gtrB 유전자를 인코딩하지 않는 경우, 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 트랜스로카제(gtrA) 및 글리코실트랜스퍼라제(gtrB)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 세포에 도입될 수 있다. 세포가 이미 gtrA 및 gtrB 유전자를 인코딩하는 경우(예를 들어, 대장균 K-12 균주 W3110의 경우), 이러한 유전자를 도입하거나 변경할 필요가 없다.
특정 구체예에서, 글루코실 트랜스퍼라제(O4 항원에 글루코스 분지를 부가하는데 특이적인 gtrS)는 SEQ ID NO: 4를 갖는다.
특정 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 C. 제주니로부터의 PglB이다. 이러한 한 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 이러한 구체예에서, 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 담체 단백질은 SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 담체 단백질은 EPA, 바람직하게는 EPA-4, 예컨대 SEQ ID NO: 3을 포함하는 EPA-4이다.
도구 및 모델 유기체 둘 모두로서 분자 생물학에서 관례적으로 사용되는 대장균 균주는 예를 들어, 본 발명에 따른 특정 구체예에서 숙주 세포에 대한 모체로서 사용될 수 있다. 비제한적 예는 대장균 K12 균주(예를 들어, 예컨대 W1485, W2637, W3110, MG1655, DH1, DH5α, DH10 등), B 균주(예를 들어, BL-21, REL606 등), C 균주 또는 W 균주를 포함한다. 한 특정 구체예에서, 숙주 균주는 모 균주 W3110으로부터 유래된다. 이 균주는 예를 들어, 예일의 E. coli Genetic Stock Center에서 얻을 수 있다. 대장균에 대한 자세한 내용에 있어서는, 예를 들어, Ecoliwiki.net. 참조.
컨쥬게이트 및 바이오컨쥬게이트를 생성하는 방법
또한, 본원에 기재된 대장균 O 항원 다당류의 글리코컨쥬게이트를 생성하는 방법이 제공된다. 바이오컨쥬게이트를 포함하는 글리코컨쥬게이트는 예를 들어, 생산을 위해 본원에 기재된 재조합 숙주 세포를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 제조될 수 있다.
일부 구체예에서, 글리코컨쥬게이트는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 즉 숙주 세포 외부에서 (시험관내) 제조될 수 있다. 예를 들어, 대장균 O 항원 다당류는 담체 단백질 뿐만 아니라 다당류/올리고당류에서 활성화 반응기를 사용하는 것을 포함하는, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 담체 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 그 개시내용이 본원에 참조로 통합되는 문헌 [Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885; and Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978)] 참조. 이러한 접근법은 숙주 세포로부터 항원성 다당류/올리고당을 추출하고, 다당류/올리고당을 정제하고, 다당류/올리고당을 화학적으로 활성화하고, 다당류/올리고당을 담체 단백질에 컨쥬게이션시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포를 사용하여 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O 항원 다당류를 포함하는 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 숙주 세포를 사용하여 이러한 바이오컨쥬게이트를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO 2003/074687 및 WO 2006/119987을 참조한다. 이러한 방법은 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 조건 하에 본원에 기재된 임의의 재조합 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 바이오컨쥬게이트는 본 개시내용의 관점에서 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합 숙주 세포로부터 단리, 분리 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 바이오컨쥬게이트는 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 음이온 교환, 친화도 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 단백질의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, WO 2009/104074에 기술된 방법을 참조한다. 추가로, 바이오컨쥬게이트는 정제를 용이하게 하기 위해 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다. 특정 바이오컨쥬게이트를 정제하는데 사용되는 실제 조건은 부분적으로 바이오컨쥬게이트의 순 전하, 소수성 및/또는 친수성과 같은 인자에 의존적일 것이며, 당업자에게 명백할 것이다. O1A, O2, O6A 및 O25B에 대한 바이오컨쥬게이트의 제조 뿐만 아니라 이들을 포함하는 백신 조성물은 예를 들어, WO 2015/124769및 WO 2017/035181에 기재되어 있다.
또한, 본원에 기재된 방법에 의해, 즉, 본원에 기재된 재조합 숙주 세포를 사용하여 생성된 바이오컨쥬게이트가 제공된다.
일부 구체예에서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법은 (i) (a) O-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열; (b) SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하고, 더욱 바람직하게는 각각 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 4개의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질, 바람직하게는 EPA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 올리고당 트랜스퍼라제, 예를 들어 PglB 올리고당 트랜스퍼라제 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 재조합 숙주 세포를 사용하여 생성된 대장균 O-항원 다당류는 특정 다당류 대 단백질 중량비(w/w)로 담체 단백질에 공유 결합된다. 담체 단백질에 공유 결합된 O-항원 다당류의 양의 이러한 중량비는 "글리칸/단백질 비" 또는 "다당류/단백질 비" 또는 "PS/단백질 비"로 언급된다. 일부 구체예에서, O-항원 다당류는 약 1:20 내지 20:1, 바람직하게는 1:10 내지 10:1, 더욱 바람직하게는 1:3 내지 3:1의 다당류 대 단백질 (w/w) 비율로 담체 단백질에 공유 결합된다. 본원에 기재된 바이오컨쥬게이트에 대한 특정 비제한적인 구체예에서, 글리칸/단백질 비율은 약 0.1 내지 0.5, 예컨대 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 또는 0.5이다. 이러한 구체예에서, O-항원 다당류:단백질의 중량비는 특정 O-항원 혈청형에 따라 약 1:10 내지 1:2, 예컨대 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 또는 1:2이다. 특정 구체예에서, 글리칸/단백질 비는 약 0.15 내지 약 0.45이다. 일반적으로, O-항원 다당류 대 담체 단백질의 더 높은 글리칸/단백질 비율이 선호되는데, 그 이유는 다량의 담체 단백질이 일부 경우에 면역학적 간섭을 유발할 수 있기 때문이다. 또한, 더 높은 글리칸/단백질 비율은 바이오컨쥬게이트 형태로 투여된 충분한 O-항원 다당류를 얻는 데 도움이 될 것이며, 담체 단백질의 양은 상대적으로 낮게 유지되며, 이는 다중 혈청형이 조성물 예를 들어, 적어도 4개의 상이한 O-항원, 적어도 5개의 상이한 O-항원, 적어도 6개의 상이한 O-항원, 적어도 7개의 상이한 O-항원, 적어도 8개의 상이한 O-항원, 적어도 9개의 상이한 O-항원, 적어도 10개의 상이한 O-항원 등으로부터의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물에 의해 커버되어야 하는 다가 조성물에 특히 유리하다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트의 글리칸/단백질 비는 단백질 양 및 글리칸 양을 결정함으로써 결정될 수 있다. 단백질 양은 280 nm에서의 UV 흡광도(A280)를 측정하여 결정될 수 있다. 글리칸 양은 (예를 들어, 표 1의 O8에 대한 Man, 및 표 1의 다른 글리칸에 대한 GlcNAc의) 반복 단위에서 당의 펄스 전류계 검출(IC-PAD)과 이온 크로마토그래피를 기반으로 결정될 수 있으며, 그 후 반복 단위의 구조 정보는 총 글리칸 양을 계산하는데 사용될 수 있다(예를 들어, O1A의 반복 단위는 845 Da의 몰 질량을 가지며, 이러한 반복 단위 1몰은 1몰의 GlcNAc를 함유하며, 이는 GlcNAc의 양이 IC-PAD에 의해 결정될 때 총 글리칸 양의 계산을 가능하게 한다).
일부 구체예에서, 본원에 기재된 세포 및 방법에 따라 재조합 숙주 세포를 사용하여 생성된 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트는 L-Rh 당의 위치 2에서 특정 정도의 아세틸화를 갖는다. 바이오컨쥬게이트에서 O25B 항원 다당류의 O-아세틸화 정도는 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 예컨대 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다.
유사하게는, 바이오컨쥬게이트에서 대장균 O16 항원 다당류의 O-아세틸화 정도는 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 예컨대 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다.
특정 구체예에서, O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법은 생성되는 O-항원 다당류 바이오컨쥬게이트에 따라 특정 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소, 특히 PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 특정 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소 변이체는 숙주 세포에 의해 생성된 바이오컨쥬게이트의 수율에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 수율이 특정 바이오컨쥬게이트를 생산하는 비용에 영향을 미치기 때문에 더 높은 수율이 바람직하며, 이는 여러 상이한 바이오컨쥬게이트를 포함하는 다가 조성물에 특히 중요한다. 일부 구체예에서, 방법은 재조합 숙주 세포로부터 바이오컨쥬게이트를 분리하는 것을 추가로 포함한다.
한 특정 구체예에서, O-항원이 O1A, O6A, 또는 O15 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 N311V, K482R, D483H, 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기에서 아미노산 돌연변이는 SEQ DI NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, O-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 아미노산 돌연변이 N311V, 또는 Y77H 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기에서 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, O-항원인 O16 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, O-항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기에서 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, O-항원이 O8, O18A, O25B 또는 O2 항원 다당류인 경우, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 SEQ ID NO: 6은 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다. 이의 특정 구체예에서, PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 담체 단백질은 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 담체 단백질은 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA)이다. 바람직하게는, EPA 담체 단백질은 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 바람직하게는, 각각의 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 EPA-4 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
특정 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 대장균 세포, 예를 들어 대장균 K-12 균주, 예컨대 균주 W3110이다.
또한, 상기 나타낸 O-항원/PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 쌍에 따라 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 재조합 숙주 세포를 사용하여 생성된 O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트가 본원에 제공된다. 또한, 이러한 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 구체예에서, 조성물은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 더욱 바람직하게는 적어도 5개, 더욱 더 바람직하게는 적어도 7개의 이러한 바이오컨쥬게이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 나타낸 O-항원/PglB 올리고사카릴 트랜스퍼라제 쌍에 따라 올리고사카릴 트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 O-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트는 바람직하게는 본원에 기재된 바람직한 속성, 예를 들어 글리칸/단백질 비 및/또는 다중-글리코실화된 담체 단백질의 양 또는 중량 중 하나 이상을 갖는다.
구체예
구체예 1은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법이며, 상기 방법은
(i) a. Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
b. SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
c. 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(ii) 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 조건하에서 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
여기에서,
Ox-항원이 O1A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglBy는 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하고, 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
Ox-항원이 O6A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 O8 항원 다당류인 경우, PglBy는 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며;
Ox-항원이 O15 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 O16 항원 다당류인 경우, PglBy는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 O18A 항원 다당류인 경우, PglBy는 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며;
Ox-항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고,
여기에서 각각의 경우에 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이며,
여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A 및 O75 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 각각 화학식 (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구체예 2는 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 O1A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 3은 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함한다.
구체예 4는 구체예 3의 방법이며, 여기에서 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 GtrA 및 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
구체예 5는 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 O6A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 6은 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 O8 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
구체예 7은 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 O15 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 8은 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 O16 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 9는 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 O18A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
구체예 10은 구체예 1의 방법이며, 여기에서 Ox-항원은 O75 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 11은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법이며, 상기 방법은
(i) (a) Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
(b) SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(c) 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(ii) 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 조건하에서 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V를 포함하고,
여기에서 Ox-항원은 O1A 항원 다당류, 글루코실화된 O4 항원 다당류, O6A 항원 다당류, O15 항원 다당류, O16 항원 다당류 또는 O75 항원 다당류이고, Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16 및 O75 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같이 각각 화학식 (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O15), (O16) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구체예 12는 구체예 1 내지 11 중 어느 하나의 방법으로서, 재조합 숙주 세포로부터 바이오컨쥬게이트를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
구체예 13은 구체예 1 내지 12 중 어느 하나의 방법이며, 여기에서 담체 단백질은 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
구체예 14는 구체예 13의 방법이며, 여기에서 담체 단백질은 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA)이다.
구체예 15는 구체예 14의 방법이며, 여기에서 EPA 담체 단백질은 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다.
구체예 16은 구체예 15의 방법이며, 여기에서 각각의 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다.
구체예 17은 구체예 16의 방법이며, 여기에서 EPA 담체 단백질은 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
구체예 18은 구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 방법이며, 여기에서 재조합 숙주 세포는 대장균 세포, 예를 들어 대장균 K-12 균주, 예를 들어 균주 W3110이다.
구체예 19는 구체예 1-18 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 바이오컨쥬게이트이다.
구체예 20은 구체예 19의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물이다.
구체예 21은 구체예 19의 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 더욱 바람직하게는 적어도 5개, 더욱 더 바람직하게는 적어도 7개의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물이다.
구체예 22는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하는 구체예 20 또는 21의 조성물이며, 여기에서 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어, 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다.
구체예 23은 적어도 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 추가로 포함하는 구체예 20 내지 22 중 어느 하나의 조성물이며, 여기에서 O25B 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O25B)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구체예 24는 적어도 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 추가로 포함하는 구체예 20 내지 23 중 어느 하나의 조성물이며, 여기에서 O2 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O2)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구체예 25는 구체예 20 내지 24 중 어느 하나의 조성물이며, 이는 (i) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O1A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (ii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O2 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (iii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (iv) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O6A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (v) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O8 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (vi) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O15 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (vii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O16 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트, (viii) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O25B 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트 및 (ix) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O75 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하며, 여기서 O1A, O2, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 도시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O25B) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구체예 26은 구체예 25의 조성물이며, 이는 추가로 (x) 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 O18A 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 포함하며, 여기에서 O18A 항원 다당류는 표 1에 제시된 화학식 (O18A)의 구조를 가지며, n은 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구체예 27은 구체예 20 내지 26 중 어느 하나의 조성물이며, 여기에서 조성물은 면역원성 조성물이다.
구체예 28은 대장균, 특히 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대해 대상체를 백신화시키는 방법으로서, 대상체에 구체예 19의 바이오컨쥬게이트 또는 구체예 20 내지 27 중 어느 하나의 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
구체예 29는 장외 병원성 대장균(ExPEC)에 대한 백신화에 사용하기 위한 구체예 19의 바이오컨쥬게이트, 또는 구체예 20 내지 27 중 어느 하나의 조성물 또는 면역원성 조성물이다.
구체예 30은 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위한 재조합 숙주 세포이며, 재조합 숙주 세포는
(a) Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
(b) SEQ ID NO: 1, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(c) 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기에서,
Ox-항원이 O1A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglBy는 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하고, 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기에서 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
Ox-항원이 O6A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 O8 항원 다당류인 경우, PglBy는 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며;
Ox-항원이 O15 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 O16 항원 다당류인 경우, PglBy는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고;
Ox-항원이 O18A 항원 다당류인 경우, PglBy는 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않으며;
Ox-항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하고,
여기에서 각각의 경우에 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이며,
여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O8, O15, O16, O18A 및 O75 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같이 각각 화학식 (O1A), (O4-Glc+), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어 5 내지 40, 예를 들어 7 내지 25, 예를 들어 10 내지 20의 정수이다.
구체예 31은 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원은 O1A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 32는 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PdlB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함한다.
구체예 33은 구체예 32의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 재조합 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 GtrA 및 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
구체예 34는 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원은 O6A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 35는 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원은 O8 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
구체예 36은 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원은 O15 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 37은 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원은 O16 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 38은 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원은 O18A 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는다.
구체예 39는 구체예 30의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 Ox-항원은 O75 항원 다당류이고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
구체예 40은 구체예 30 내지 39 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 담체 단백질은 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
구현예 41은 구체예 30-40 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 담체 단백질은 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA)이다.
구체예 42는 구체예 41의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 EPA 담체 단백질은 1-10개, 바람직하게는 2-4개, 더욱 바람직하게는 4개의 글리코실화 부위를 포함한다.
구체예 43은 구체예 42의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 각 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 2를 갖는 글리코실화 컨센서스 서열을 포함한다.
구체예 44는 구체예 43의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 EPA 담체 단백질은 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
구체예 45는 구체예 30 내지 44 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포이며, 여기에서 재조합 숙주 세포는 대장균 세포, 예를 들어, 대장균 K-12 균주, 예컨대 균주 W3110이다.
구체예 46은 구체예 19에 따른 바이오컨쥬게이트이며, 여기에서 바이오컨쥬게이트는 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트이다.
구체예 47은 구체예 46에 따른 바이오컨쥬게이트이며, 여기에서 담체 단백질은 SEQ ID NO: 3을 포함하는 EPA 담체 단백질이다.
구체예 48은 구체예 46 또는 47에 따른 바이오컨쥬게이트이며, 여기에서 글루코실화된 O4 항원 다당류는 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 가지며, n은 5 내지 40의 정수이다.
구체예 49는 구체예 46-48 중 어느 하나에 따른 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물이다.
구체예 50은 구체예 49에 따른 조성물로서, 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 항원 다당류를 각각 포함하는 하나 이상의 컨쥬게이트를 추가로 포함하는 조성물이다.
구체예 51은 구체예 50에 따른 조성물이며, 여기에서 하나 이상의 컨쥬게이트는 대장균 혈청형 O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, 및 O75 중 하나 이상의 대장균 항원 다당류를 포함하며, 여기에서 O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O25B 및 O75 항원 다당류는 각각 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O1A), (O2), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A), (O25B) 및 (O75)의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100, 바람직하게는 3 내지 50, 예를 들어, 5 내지 40, 예를 들어, 7 내지 25, 예를 들어, 10 내지 20의 정수이다.
구체예 52는 구체예 51에 따른 조성물로서, 대장균 혈청형 O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이다.
구체예 53은 구체예 52에 따른 조성물이며, 여기에서 컨쥬게이트 각각은 바이오컨쥬게이트이다.
실시예
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 결정되어야 함을 이해해야 한다.
실시예 1: 대장균 감염의 역학 데이터
균혈증 초래 대장균의 O-혈청형 분포를 결정하기 위해, 글로벌 감시 연구를 수행하였다. 2011년과 2017년 사이에 북미, 유럽, 아시아 태평양 지역 및 남미 국가에서 입원한 60세 이상의 환자로부터 3200개가 넘는 대장균 혈류 분리주를 수집하였다. 각 균주는 고전적 응집 기술 및 서열-기반 O-유전자형을 이용하여 O 항원 혈청형에 대해 분석되었다. 표 2 참조.
분리된 인간 혈액 샘플을 분석하여 그 안의 병원체의 정체와 이들의 항생제 내성 패턴을 결정하였다. 대장균 분리주를 분석 후 샘플로부터 수득하였다. 대장균 정체를 MALDI-TOF MS에 의해 확인하였다. 대장균 분리주에 대한 추가의 분석은 O-항원 혈청형을 결정하기 위해 항혈청-기반 응집 검정을 사용하여 수행하였다(DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185). 응집 방법으로 유형화할 수 없는 분리주를 전체-게놈 시퀀싱에 이어서 O-혈청형 wzy 및 wzx 유전자 서열을 기반으로 하는 O-지노타이핑에 의해 추가로 분석하였다.
표 2: 응집에 의한 O-지노타이핑과 응집에 의한 유형화할 수 없는 분리주의 O-지노타이핑을 기반으로 한, 2011년에서 2017년 사이에 전 세계적으로 수집된 3217개 혈액 분리주의 컬렉션으로부터 가장 공통적인 균혈증-관련 대장균 O-혈청형의 분포 대상체는 다음 국가의 입원 대상체였다: USA, 캐나다, 아르헨티나, 브라질, 영국, 독일, 스페인, 이탈리아, 네덜란드, 프랑스, 일본, 태국, 한국 및 호주.
전 세계의 균혈증 관련 대장균 세트에서 지리적 위치에 대한 계층화는 위치와 무관한 상위 10개 O-혈청형의 유병률을 보여주었으며, 이는 이들이 균혈증을 초래하는 대장균과 전세계적으로 관련된 우세한 O-혈청형임을 시사한다.
전 세계의 균혈증-관련 다중-약물 내성 대장균 분리주(n=345), 즉 임상적으로 관련된 항미생물제의 적어도 3가지 부류에 내성이 있는 이러한 균주 세트에서, 상위 10개 O-혈청형의 유병률은 75.4%이다.
역학 분석의 모든 정보를 종합하면, 유형화할 수 없는 균주의 하위부분을 내포한다고 가정할 경우 10가지 우세한 O-혈청형이 대장균-관련 균혈증 감염의 추정되는 60-80%를 커버할 수 있다.
균혈증-초래 대장균 혈청형의 상당 부분을 커버하는 다가 백신은 매우 유용할 것이다. 따라서, 표 2의 O-혈청형은 O-항원 기반 다가 백신에 대한 좋은 후보가 될 것이다. 이러한 백신은 바이오컨쥬게이션 기술을 사용하여 유리하게 제조될 수 있다.
상위 10개 혈청형(표 2) 중 하나는 O4이다. 따라서, 담체 단백질에 결합된 대장균 혈청형 O4의 O-항원 다당류를 포함하는 바이오컨쥬게이트 백신을 제조하는 것이 유익할 것이다.
실시예 2 : O-항원 변형 효소를 인코딩하는 유전자에 대한 현대 O4 임상 분리주의 특성 규명
대장균 O4 항원 다당류의 2개 변이체가 기술되었는데(예를 들어, 문헌 [Jann B, et al., 1993, Carbohydr. Res. 248: 241-250] 참조), 하나는 비분지된 구조(표 1에서 (O4-Glc-)로서 제시된 구조)를 가지며, 또 다른 변이체는 추가의 글루코스 측분지(표 1에서 (O4-Glc+)로서 제시된 구조)로 치환된 것이다. 이들 두 변이체가 현대 임상 분리주 중에서 발견되는 비율은 알려져 있지 않았다. 두 변이체 모두는 O4 항혈청과 반응하지만, 이들 변이체 사이에 면역학적 차이가 존재하는지의 여부는 또한 알려지지 않았다. 또한, (O4-Glc+) 항원 다당류를 생성하기 위해 글루코스 측-분지를 부착시키는 역할을 하는 효소는 지금까지 확인되지 않았으며, 이의 추정 코딩 서열은 아마도 O4 rfb 유전자 클러스터 외부에 존재할 것이다.
미국과 유럽 연합의 대상체로부터 2011-2012년 기간 동안 원래 분리된 32개의 응집 확인된 대장균 O4 임상 분리주 세트를 전체 게놈 서열 분석으로 처리하였다. 32개의 시퀀싱된 O4 분리주로부터 추출된 rfb 유전자 클러스터 서열을 참조 균주의 서열과 정렬하고, 뉴클레오티드 수준에서 비교하였다. 일부 자연 발생 단일 뉴클레오티드 다형성을 제외하고, 특성 규명된 분리주 모두는 O4 참조 균주와 동일한 rfb 클러스터를 나타내었으며, 이는 대장균 O4 균주가 이들의 Glc-분지 상태와 무관하게 동일한 rfb 유전자 클러스터를 수반함을 나타낸다. 따라서, 대장균 O4-Glc+ 항원 다당류를 생성하기 위해, 대장균 O4-특이적 분지 효소를 인코딩하고, 대장균 O4 rfb 유전자 클러스터의 외부 어딘가에 있을 알려지지 않은 서열을 갖는 유전자가 필요할 가능성이 높다. 이러한 알려지지 않은 유전자의 서열은 확인되어야 하며, 대장균 O4-Glc-항원 다당류와의 바이오컨쥬게이트를 생성하기만 할 균주에서 대장균 O4-Glc+ 항원 다당류를 갖는 바이오컨쥬게이트를 생성하고자 하는 경우, 사용되어야 한다.
그 후, 전체-게놈 서열 데이터를 O-항원 변형 효소를 인코딩할 수 있는 rfb 유전자 클러스터 외부에 있는 유전자의 존재에 대해 분석하였다. 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 중의 gtrAB의 상동체를 먼저 대장균 O4에서 확인하였다. 그 후, 대장균에서 gtrAB 다운스트림의 오픈 리딩 프레임은 대장균 O4-특이적 유전자 gtrS로서 추정적으로 확인되었으며, 이는 대장균 O4 항원에의 글루코스 분지 첨가를 담당하는 추정적 대장균 O4 특이적 분지 효소 GtrS를 인코딩할 수 있다.
O4 특이적 GtrS 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로서 제공된다. 이러한 단백질을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5로서 제공된다.
특성 규명된 대장균 O4 분리주 중 약 80%가 여기에서 확인된 gtrS 유전자를 수반하는 것으로 밝혀졌다(32개 중 26개). 대장균 O4-특이적 gtrS 서열의 유병률은 또한 미국 및 유럽 연합에서 2014년-2016년 기간 동안 대상체로부터 분리된 20개의 응집-확인된 대장균 O4 임상 분리주의 독립된 세트에서 서열 특이적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 결정되었다. 이 분석은 20개의 분리주 중 17개가 O4 gtrS 염기서열을 수반하고 있음을 보여주었고, 이는 85%의 유병률에 해당한다.
실시예 3: O4 gtrS 의 대장균 W3110으로의 클로닝, Glc-변형된 O4 바이오컨쥬게이트의 생성 및 구조 확인
분지형 글루코스로 변형된 O4-항원 다당류를 포함하는 바이오컨쥬게이트가 제조될 수 있는지의 여부를 테스트하기 위해, 추정되는 분지 효소를 갖는 대장균 O4-항원 EPA 바이오컨쥬게이트 생산 균주를 작제하였다. 이를 위해 내인성 O16-gtrS 유전자를 추정되는 O4-gtrS 유전자(SEQ ID NO: 5, 실시예 2참조)로 치환하고, 상동성 재조합에 의해 대장균 균주 W3110 ΔwzzE-wecG ΔwaaL ΔwbbI-J-K에서 O16 rfb 클러스터를 O4 rfb 클러스터로 대체하였다. 대안적으로, 일부 균주에서, O4 rfb 클러스터를 플라스미드에 인코딩하였다.
후속하여, 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA) 담체 단백질(각각 'EPA-2' 및 'EPA-4'로 지칭되는 2 또는 4개의 컨센서스 글리코실화 부위를 갖는 변이체) 및 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB를 인코딩하는 플라스미드를 균주에 도입하였다. Glc로 변형된 O4-EPA 바이오컨쥬게이트는 생물반응기 배양에서 대장균 생산 균주를 성장시키고, 각각 IPTG 및 아라비노스에 의해 PglB 및 EPA 발현을 유도하여 생성하였다. O4-EPA 바이오컨쥬게이트는 바이오매스 주변세포질 추출물로부터 추출하였다.
상세한 다당류 조성 및 O4-EPA 바이오컨쥬게이트의 연결을 확인하기 위해, 다중 NMR 실험은 EPA-4 담체 단백질을 갖는 바이오컨쥬게이트에 대해 수행하였다(데이터는 미도시됨). 수득된 배치는 공개된 문헌과 일치하였다(Jansson, P.E., et al., 1984, Carbohydr. Res. 134(2): 283-291; Jann B, et al., 1993, Carbohydr. Res. 248: 241-250). 313K에서 기록된 1D 스펙트럼은 5개의 아노머, 2개의 NAc 및 2개의 H6 신호(Rha & FucNAc)가 있는 O4 오당류 RU에서 큰 HOD 신호와 작고 날카로운 신호를 보여주었다.
1D 양성자 배치는 2D 양성자-양성자 및 양성자-탄소 상관 NMR 실험을 사용하여 확인되었다. 먼저, 2D TOCSY(120 ms) 실험은 O4 오당류 RU에 대해 H1 및 H6(Rha 및 FucNAc의 경우)에서 예상되는 교차 피크와 말단 RU 및 EPA에서 작은 피크를 보여주었다. 메틸 영역에서, TOCSY는 O4 RU에 있어서 α-FucNAc에 대한 H6 내지 H5 및 α-Rha에 있어서 H6 내지 H1의 교차 피크를 보여주었다. 관찰된 다른 피크는 EPA 아미노산 및 말단 Rha (tRha)로부터 비롯된다. 두번째, 탄소 NMR 스펙트럼은 O4 RU에 대해 잘 분산되고 진단적인 단일 피크를 함유하였다. 탄소는 HSQC 실험을 사용하여 부착된 양성자를 통해 간접적으로 프로파일링하였다. HSQC-DEPT 실험은 CH2 기에 대한 역 피크를 제공하였다. HSQC는 O4 오당류 RU [5개의 아노머, 고리, 2개의 N-아세틸 및 2개의 메틸(Rha 및 FucNAc)] 기는 물론 특징적인 영역의 EPA 아미노산에 대한 교차 피크를 제공하였다. O4에 대한 각각의 양성자/탄소 쌍은 양성자 배치 및 문헌에 따라 배치될 수 있다.
따라서, 구조적 특성 규명 실험은 Glc-분지된 O4 바이오컨쥬게이트(표 1에서 화학식 (O4-Glc+)로 나타낸 바와 같이 다당류 항원 구조를 포함)가 실시예 2에서 확인된 추정 대장균 O4-gtrS 유전자를 사용하여 생성될 수 있음을 확인시켜 주었다.
실시예 4 : 토끼에서 Glc-분지된 O4 바이오컨쥬게이트의 면역원성
Glc-변형된 O4 바이오컨쥬게이트(즉, 표 1에 제시된 바와 같은 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 갖는 글리칸을 가짐)는 스피디-래빗 프로토콜(Eurogentec)을 적용함으로써 토끼 면역화에 사용하였다. 면역화된 토끼로부터의 혈청을 Glc-분지의 존재 (Glc+; 즉, 글루코실화된 O4 다당류를 함유) 또는 부재(Glc-; 즉, 비-글루코실화된 O4 다당류 함유) 하에 정제된 O4 지질다당류(LPS)에 대한 항-O4 IgG 역가에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 바이오컨쥬게이트로의 면역화는 두 토끼 모두에서 높은 IGg 역가를 발생시켰다(도 1). 두 경우 모두에서, Glc+ LPS에 대한 O4 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체 역가는 Glc- LPS와 비교하여 더 높았다.
혈청을 또한 풀링시키고, 특성 규명된 gtrS 상태를 갖는 대장균 O4 분리주의 테스트 세트를 사용하여 전체 세포 ELISA 연구에 사용하였다. 5개의 gtrS-음성(Glc-분지 없음) 및 6개의 gtrS-양성(Glc-분지) 대장균 O4 분리주 및 음성 대조군 균주를 테스트하였다. Glc-변형된 O4 바이오컨쥬게이트로 면역화된 토끼로부터의 풀링된 혈청은 시험된 O4 분리주를 특이적으로 인식하는 높은 역가의 IgG를 함유하였다(도 2). LPS ELISA에 따라, 모든 시험된 O4 분리주는 면역 혈청에 의해 인식되었다. gtrS-양성 분리주는 gtrS-음성 분리주보다 전반적으로 더 높은 결합을 나타내었다(도 2). 특히, 다음 분리주는 gtrS-양성이었으며: Y1382, E551, OC24334, stGVXN4983, stGVXN4994 및 OC24794; 다음 분리주는 gtrS-음성이었다: A2625, stGVXN4988, OC24784, OC24787, 및 OC24788. 면역 혈청은 비관련 O-혈청형의 음성 대조군 균주인 대장균 OC9487(ATCC 35383)에 결합하지 않았다.
은-염색된 폴리아크릴아미드 겔에서 gtrS-양성 및 -음성 분리주의 테스트 세트로부터 추출된 LPS의 프로파일은 O4 항원의 비변형된 형태 및 변형된 형태를 발현하는 분리주 사이의 현격한 차이를 드러내지 않았으며, 이는 관찰된 차이가 LPS 발현 수준에서 정량적 차이(데이타 미제시됨)로 설명되지 않음을 확인시켜준다.
풀링된 면역 혈청을 사용하여 추출된 LPS의 웨스턴 블롯을 수행하여 Glc-변형된 O4 바이오컨쥬게이트로의 면역화에 대한 반응으로 유발된 IgG에 의한 O4 O-항원의 인식을 평가하였다. 변형된 O4 면역화된 토끼로부터의 IgG에 의한 변형된 및 비변형된 O4 LPS 둘 모두의 결합이 관찰되었으며, 고분자량 LPS 밴드를 포함하는 광범위한 크기에 걸친 LPS 밴드의 특정 인식을 포함하였다(도 3).
하기 추가 실험에서, 'O4' 바이오컨쥬게이트 또는 생산 균주 또는 'EcoO4'가 언급될 경우, 달리 특정하게 나타내지 않는 한 Glc-분지된 O4(표 1의 글리칸 구조 (O4-Glc+)를 가짐)의 바이오컨쥬게이트 또는 생산 균주를 의미한다(따라서, 용어 'O4' 및 'O4-Glc+'은 이들 실험에서 바이오컨쥬게이트 또는 생산 균주에 대해 상호교환적으로 사용됨).
실시예 5 : 래트에서 Glc-분지된 O4 바이오컨쥬게이트의 면역원성
Sprague Dawley 래트를 3가지 상이한 용량(0.04 μg, 0.40 μg 또는 4.0 μg)의 제형 완충액 또는 (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트(즉, EPA 담체 단백질에 공유 결합된 글루코실화된 O4 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트; 담체 단백질은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 EPA-2임)로 근육내 3회 면역화시켰다. 면역화 후 0, 14 및 42일째에 혈청 항체 수준을 ELISA로 측정하였다.
0.04 μg, 0.40 μg 및 4.00 μg의 (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트로의 면역화는 제형 완충액과 비교하여 면역화 후 42일??에 IgG 항체 수준의 현저한 증가를 유도하였다(도 4a). (O4-Glc+)-컨쥬게이트에 의해 유도된 항체는 기능적이었고, 즉 (O4-Glc+) 대장균 균주의 치사를 매개할 수 있었다(도 4b).
0.04 μg, 0.40 μg 및 4.0 μg의 (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체 수준은 기준선에서 검출된 것과 비교하여 면역화 후 42일째(42일 vs 0일, 모든 용량에 있어서 P = 0.006) 및 면역화 후 14일째(42일 vs 14일, 모든 용량에 있어서 P = 0.006) 현저하게 증가되었다(도 5). 4.0 μg의 바이오컨쥬게이트가 투여된 군에서, 역가 또한 0일과 비교해 14일째에 현저하게 증가하였으며, 이는 단일 용량의 4.0 μg의 (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트가 IgG 역가의 현저한 증가를 유도함을 나타낸다(14일째 vs 0일, P=0.012). 시험한 모든 3개의 바이오컨쥬게이트 농도에 있어서 14일 내지 42일째에 관찰된 IgG 역가에서의 현저한 증가는 제3 용량의 (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트가 항체 반응을 증대시킬 수 있음을 보여주었다(도 5).
제형 완충액 또는 4.00 μg/용량의 바이오컨쥬게이트로 3회 근육내 면역화시킨 래트에서 O4-Glc+-EPA 컨쥬게이트에 의해 유도된 항체의 기능성은 O4(Glu+) 및 O4(Glu-) 대장균 균주를 사용하는 옵소닌식세포 치사 검정(OPKA)에 의해 결정하였다. (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체는 기능적이었고, 즉 (O4-Glc+) 대장균 균주의 치사를 매개할 수 있다(도 4b, 도 6). 특히, (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체는 (O4-Glc+) 및 (O4-Glc-, 즉 표 1에서 화학식 (O4-Glc-)의 구조를 갖는 글리칸을 가짐, 즉 Glc-분지가 없는 O4 다당류) 대장균 균주 둘 모두의 치사를 매개할 수 있었다(도 6).
결론적으로, O4-Glc+-EPA 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 항체는 교차-반응성이며, 글루코스 분지의 존재 및 부재하의 대장균 O4 균주의 치사를 매개할 수 있다.
실시예 6: 대장균 O-항원 바이오컨쥬게이트에 대한 생성 균주 및 생성된 바이오컨쥬게이트 생성물
상기 기술된 바와 같이 제조된 (O4-Glc+)-EPA 바이오컨쥬게이트 이외에, 9개의 다른 바이오컨쥬게이트를 생성하였다. 특히, 추가로 생성된 바이오컨쥬게이트는 대장균 O1A-EPA 바이오컨쥬게이트, O2-EPA 바이오컨쥬게이트, O6A-EPA 바이오컨쥬게이트, O8-EPA 바이오컨쥬게이트, O15-EPA 바이오컨쥬게이트, O16-EPA 바이오컨쥬게이트, O18A-EPA 바이오컨쥬게이트, O25B-EPA 바이오컨쥬게이트 및 O75-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함하였다. 이들 컨쥬게이트의 글리칸의 화학 구조는 표 1의 각 화학식에서 찾아볼 수 있다. 10개 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 'ExPEC10V'로 본원에서 지칭된다. O1A-EPA, O2-EPA, O6A-EPA 및 O25B-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 'ExPEC4V'로서 언급된다(예를 들어, WO 2015/124769 및 WO 2017/035181에 이전에 기술되었음).
대장균 W3110 모 균주
비병원성 대장균 K12 균주 W3110은 모든 10개 생산 균주의 작제물을 위한 모 균주로서 사용하였다. 대장균 K12 균주 W3110은 Coli Genetic Stock Center(Yale University, New Haven(CT), USA, 제품 번호 CGSC#4474)에서 입수하였다. 이의 관련 유전자형은 종래 기술되었으며(대장균 W3110, F-, 람다-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1), 및 이의 게놈 서열은 종래 기술되었다(Hayashi K, et al., 2006, Mol. Syst. Biol. 2006.0007 (doi:10.1038/msb4100049). 대장균 W3110 균주는 대장균 O-항원 바이오컨쥬게이트 각각의 생산을 가능하게 하도록 유전자 변형되었다(표 3).
바이오컨쥬게이트 생산 균주
"ExPEC4V" 및 "ExPEC10V" 조성물은 둘 다 동일한 생산 균주로부터의 O2-EPA 및 O25B-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함한다. "ExPEC4V" 조성물은 stGVXN4411 또는 stLMTB10217 생산 균주로부터의 O1A-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함하는 반면, "ExPEC10V" 조성물은 stLMTB10217 생산 균주로부터의 O1A-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함한다. "ExPEC4V" 조성물은 stGVXN4112 생산 균주로부터의 O6A-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함하는 반면, "ExPEC10V" 조성물은 stLMTB10923 생산 균주로부터의 O6A-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함한다. 또한, "ExPEC10V" 조성물은 "ExPEC4V"에 사용되지 않은 생산 균주로부터의 O4-EPA (즉, (O4-Glc+)-EPA), O8-EPA, O15-EPA, O16-EPA, O18A-EPA 및 O75-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함한다. 다양한 생산 균주는 하기 나타낸 바와 같이 EPA 담체 단백질 및/또는 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB의 발현을 위한 플라스미드에서 다를 수 있다. 여러 생산 균주의 개요가 아래 표 3에 나와 있다.
표 3: ExPEC4V 및 ExPEC10V 백신 조성물을 위한 O-항원 바이오컨쥬게이트에 대한 대장균 생산 균주의 유전자 공학 개요
O-항원 생합성( rfb ) 유전자 클러스터
모든 대장균 O-항원 생산 균주에서, 자연 발생 대장균 W3110 게놈 O16::IS5 -항원 생합성(rfb) 유전자 클러스터는 선택된 혈청형의 대장균 균주로부터 선택된 O-항원-특이적 생합성 클러스터에 의해 대체되었으며, 이는 혈청형-특이적 O-항원 구조를 인코딩한다(이러한 O-항원 구조에 대해서는 표 1 참조). 10개의 공여체 rfb 클러스터는 대장균 혈액 분리주의 전체-게놈 분석 후 선택하고 확인하였다. O-항원 생합성에 결함이 있는 W3110 O16::IS5 rfb 유전자 클러스터의 대체는 단일 상동 재조합 사건으로 달성되었다. O16 및 O18A rfb 유전자 클러스터의 경우, 공여체 DNA는 측접하는 gnd 및 rmlCA 유전자를 통해 재조합되는 반면, 다른 균주의 rfb 유전자 클러스터는 측접하는 gnd 및 galF 유전자를 통해 재조합되었다. 생산 균주에서 rfb 클러스터의 서열은 SEQ ID NO: 9 및 11-19로 제공된다.
O-항원 리가제( waaL ) 유전자
모든 대장균 O-항원 생산 균주는 waaL 유전자에 의해 인코딩된 대장균 W3110 게놈 O-항원 리가제의 결실을 인공적으로 도입하였다. ΔwaaL 균주에서 지질 A로의 O-항원의 전달이 중단되고, 이는 대신에 O-항원의 담체 단백질로의 직접 전달을 유도하여 생성물 수율을 증가시킨다.
O-항원 글루코실화( gtrABS ) 유전자
대장균 O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 생산 균주에서, O16 O-항원 글루코실화를 담당하는 대장균 W3110 게놈 gtrABS 유전자가 결실되었다. 상이한 혈청형의 gtrA 및 gtrB 유전자는 고도로 상동성이고 상호교환가능하지만, gtrS 유전자는 혈청형-특이적 O-항원 글리코실 트랜스퍼라제를 인코딩한다. 대장균 W3110에서 GtrS는 대장균 O16 O-항원의 α-L-Rha-(1→3)-d-GlcNAc 모티프에 있는 GlcNAc 당에 글루코스(Glc) 잔기를 전달할 수 있다. 대장균 O1A, O2 및 O6A 생산 균주에서는 gtrABS 유전자의 결실 또는 대체가 발생하지 않았다. 이러한 O-항원은 대장균 O16 gtrS의 천연 기질인 α-L-Rha-(1→3)-D-GlcNAc 모티프를 놓치게 된다. 대장균 O4 생산 균주에서, W3110 gtrS 유전자는 대장균 O4 gtrS 유전자로 대체되어 대장균 O4 O-항원의 적절한 글루코실화를 수용하였다.
올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB
모든 대장균 O-항원 생산 균주는 C. 제주니 글리코실 트랜스퍼라제 PglB의 변이체를 발현하였으며, 이는 N-글리코실화에 의해 담체 단백질 상의 아미노산 컨센서스 서열 상으로 O-항원을 전달할 수 있다. PglB는 광범위한 기질 인식을 가졌으나, 낮은 생성물 수율로 인해, 변형된 기질 특이성을 갖는 PglB 변이체를 발현하는 여러 생산 균주를 제조하였으며, 이는 향상된 생성물 수율을 발생시켰다(예를 들어, WO 2016/107818, WO 2016/107819 참조). pgIB 유전자는 플라스미드 상의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 유도성 프로모터 뒤에 배치되었다. 하기 표 4는 상기 기술된 ExPEC4V 및 ExPEC10V 조성물을 위한 바이오컨쥬게이트에 대한 대장균 O-항원 생산 균주의 생산에 사용되는 플라스미드에 의해 인코딩된 PglB 변이체를 나열한다. 벡터 백본, 항생제 내성 마커 및/또는 대안적 PglB 변이체에 변이가 있는 추가 플라스미드도 또한 바이오컨쥬게이트 생산에 대해 성공적으로 테스트되었다.
표 4: 대장균 O-항원 생산 균주에 사용되는 PglB 및 EPA 플라스미드
1 SpR, 스펙티노마이신 내성; AmpR, 암피실린 내성; KanR, 카나마이신 내성
담체 단백질 (EPA)
모든 대장균 O-항원 생산 균주는 O-항원에 대한 담체 단백질로서 유전학적으로 탈독소화된 P. 애루기노사 AD-리보실트랜스퍼라제 톡소이드(EPA)를 발현하였다. EPA 톡소이드는 2개 잔기에서 야생형 EPA 독소와 상이하다: Leu552는 Val로 변경되었으며, Glu553(촉매 도메인에서)이 결실되었다. Glue553 결실은 독성을 현저하게 감소시키는 것으로 보고되었다. 탈독소화 돌연변이 외에도, 4개(EPA-4) 컨센서스 N-글리코실화 부위 모티프를 도입하였다. epa 유전자는 플라스미드 상의 L-아라비노스(Ara) 유도성 프로모터 뒤에 위치하였다(표 4). 표 4는 상기 기재된 "ExPEC4V" 및 "ExPEC10V" 조성물에 사용된 바이오컨쥬게이트에 대한 생산 균주에 사용되는 플라스미드로 제한된다. 벡터 백본, 항생제 내성 마커 및/또는 EPA 변이체에서 변이를 갖는, 예를 들어 컨센서스 N-글리코실화 부위 모티프의 수(예를 들어, 2개의 이러한 모티프, EPA-2를 가짐)가 변화하는 플라스미드도 바이오컨쥬게이트 생산에 대해 성공적으로 테스트되었다.
실시예 7 : 글루코실화된 O4(O4-Glc+) 항원과의 바이컨쥬게이트의 생성을 위한 올리고사카릴트랜스퍼라제 최적화
바이오컨쥬게이트 생산을 위한 수율 최적화는 C. 제주니 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglB의 변형에 의해 달성될 수 있으며, 이는 EPA 담체 단백질에 대한 관심 O-항원의 더욱 효율적인 또는 더 높은 등급의 N-글리코실화로 이어질 수 있다. 글루코실화된 O4 (O4-Glc+) O-항원 다당류를 갖는 바이오컨쥬게이트의 생산을 위한 대장균 균주에서, 이러한 최적화 전략을 적용하였으며, 바이오컨쥬게이트 생성물 수율을 향상시키는 (O4-Glc+)-특이적 최적화된 PglB 변이체를 발생시켰다.
이러한 접근법에서, EPA-발현 플라스미드를 함유하는 O4-Glc+ O-항원 다당류 생산 균주는 다양한 상이한 PglB 발현 플라스미드로 형질전환되었으며, 이들 각각은 PglB 단백질에 상이한 아미노산 치환을 함유하여 기질 특이성을 변경시켰다. 각 균주의 바이오컨쥬게이트 생산 수준 및 프로파일은 삼투압 충격 실험에서 쉐이크-플라스크 수준으로 평가하였으며, 판독은 O4-Glc+ -특이적 모노클로날 항체를 사용하여 주변 세포질 추출물에 대한 모세관 전기영동 면역검정에 의해 수행하였다.
N311V 아미노산 치환을 함유하는 테스트한 PglB 변이체 중 하나는 글루코실화된 O4 바이오컨쥬게이트의 생성물 수율을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀졌다(도 7a).
N311V PglB-변이체가 추가로 변형된 추가 개선에서, Y77H 아미노산 치환은 N311V PglB-변이체와 비교하여 O4-Glc+-특이적 생성물 수율을 추가로 향상시켰으며, 증가된 정도의 디- 및 트리-글리코실화 생성물을 나타내었으며, 여기에서 다른 변형은 중립적이거나 생성물 수율에 부정적인 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(도 7b). 플라스미드 pLMTB4008(SpR)은 돌연변이 Y77H 및 N311V가 있는, 대장균 코돈 사용 최적화되고 (O4-Glc+)-기질 최적화된 PglB 변이체를 인코딩한다.
야생형 (wt) C. 제주니 글리코실 트랜스퍼라제 PglB와 비교해 N311V 및 Y77H 아미노산 치환을 함유하는 O4-Glc+ O-항원 다당류에 대한 최적화된 기질 특이성을 갖는 PglB 변이체는 1차 라운드 최적화된 PglB-N311V 변이체와 비교하여 바이오컨쥬게이트 수율이 두배인 것으로 밝혀졌다.
유사하게 스트린을 사용하여, ExPEC10V 조성물 중 다른 9개 혈청형의 대장균 O-항원 바이오컨쥬게이트 생성에 대해 가장 최적 수율을 갖는 PglB 변이체를 또한 결정하였다.
O1A, O6A 또는 O15 항원 다당류를 갖는 바이오컨쥬게이트에 있어서, 아미노산 돌연변이 N311V, K482R, D483H 및 A669V를 갖는 PglB가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
O2, O8, O18A 또는 O25B 항원 다당류를 갖는 바이오컨쥬게이트에 있어서, 야생형 PglB(즉, 위치 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 및 669에서 아미노산 돌연변이가 없음)가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
O16 항원 다당류를 갖는 바이오컨쥬게이트에 있어서, 아미노산 돌연변이 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V를 갖는 PglB가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
O75 항원 다당류를 갖는 바이오컨쥬게이트에 있어서, 아미노산 돌연변이 N311V를 갖는 PglB가 가장 높은 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
이들 결과로부터 최적의 PglB 변이체가 다양한 O-항원에 있어서 상이하고, 주어진 O-항원 다당류를 갖는 바이오컨쥬게이트를 생성하기 위한 최적의 PglB 변이체는 예측할 수 없음을 알 수 있다.
실시예 8: 10개 대장균 혈청형으로부터의 O-항원의 바이오컨쥬게이트 및 이들의 품질 속성
표적 O-항원의 O-글리칸 잔기는 구조적으로 다양하고, 가변적인 반복 단위를 갖는다. 글리코실 트랜스퍼라제 PglB의 특이성 및 친화성은 글리칸 구조와 연결되어 있다. 따라서, 요망되는 품질 속성, 예를 들어 순도, 글리칸/단백질 비율 등을 갖는 바이오컨쥬게이트를 만드는 것은 어렵고 간단하지 않은 작업이다. PglB와 EPA 담체 단백질의 올바른 조합은 수율을 결정하고, 글리코실화 효율에 영향을 미칠 수 있다. PglB 및 담체 단백질을 최적화시킴으로써, 요망되는 품질 속성을 갖는 바이오컨쥬게이트를 생성하였다. 매우 많은 양의 담체 단백질은 면역학적 간섭으로 이어질 수 있기 때문에, 특히 하나 이상의 O-항원 바이오컨쥬게이트가 함께 조합되어 단일 조성물 또는 백신으로 투여되는 경우, 총 담체 단백질의 더 낮은 역치 값을 유지하는 것이 또한 중요할 수 있다. 이러한 현상을 피하기 위해서 더 높은 글리칸/단백질 비율을 갖는 컨쥬게이트가 바람직하다. 따라서, ExPEC10V 백신에 있어서, (임상 시험으로 처리된 이전에 기술된 ExPEC4V 백신과) 적어도 유사한 글리코실화 비율을 갖는 바이오컨쥬게이트를 개발하였다.
바이오컨쥬게이트는 종래 기술된 방법에 따라 생물반응기(10 L 및/또는 200 L 부피)에서 각 숙주 세포(실시예 6, 표 3)를 배양하고 바이오컨쥬게이트의 발현에 의해 생성하였다. 각 약물 물질은 박테리아 유가식 발효에 의해 배치식으로 제조하여 상응하는 다당류 혈청형의 발현된 바이오컨쥬게이트를 함유하는 바이오매스를 생성하였다. 세포를 배양하고, IPTG 및 아라비노스로 유도하였다. 바이오컨쥬게이트는 삼투압 충격에 이어서 크로마토그래피 정제에 의해 생물반응기 배양물에서 세포의 주변세포질로부터 분리하였다. 이러한 공정은 10개 바이오컨쥬게이트 각각에 대해 수행하였다.
ExPEC10V 및 ExPEC4V에 대한 약물 물질(DS)인 이렇게 제조된 대장균 O-항원 바이오컨쥬게이트는 유사한 중요한 품질 속성을 나타내었다: (1) 공정-관련 순도(RH-HPLC에 의해 측정)는 95% 보다 높았음, (2) 약 0.1-0.5, 대부분 0.15 내지 0.45 범위의 다당류/단백질 비율, (3) 박테리아 내독소(Ph. Eur. 2.2.3)는 0.5 EU/μg 다당류 미만이었다. 개별 다당류 사슬의 평균 길이는 전형적으로 약 10-20 반복 단위였다(고해상도 SDS-PAGE를 사용하여 측정됨).
다당류 반복 단위의 구조는 상기 기술된 ExPEC10V 조성물에 있어서 DS인 모든 10개 바이오컨쥬게이트의 경우, 표 1에서 상응하는 혈청형에 대해 화학식으로 제시된 것으로 (온전한 또는 트립신-분해된 컨쥬게이트의 NMR 및 MS/MS에 의해) 확인되었다.
O18 혈청형은 ExPEC10V 조성물을 위해 만들어진 바이오컨쥬게이트의 10개 혈청형 중에서 바이오컨쥬게이트 생산 수율이 가장 낮았다.
ExPEC10V 의약품(DP)은 상기 기술된 10개 1가 DS의 혼합물을 포함한다.
실시예 9 : ExPEC10V 백신의 독성학
ExPEC10V를 사용한 단일-용량 파일럿 독성 및 국소 내성 연구(비-GLP)를 암컷 NZQ 토끼에서 수행하였다. 일 군(n=2)은 대조군(식염수)의 근육내(IM) 주사(0일째)로 처리되었으며, 두 번째 군(n=4)은 0.6 mL의 투여량(176 μg PS/mL)을 사용하여 105.6 μg 총 다당류 (PS)/용량 (각각 O-혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 있어서 용량 당 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 19.2: 9.6 μg PS)으로 ExPEC10V의 IM 주입으로 처리하였다. 부검은 2일째에 수행하였다.
사망 사례는 관찰되지 않았다. 또한, 임상 관찰(Draize 스코어링을 사용한 주사 부위 효과 포함), 체중, 음식 섭취 및 체온에 대해 언급된 백신 관련 효과는 없었다. 조직병리학적으로 투여 부위 또는 배액(장골) 림프절에서 백신과 관련된 변화는 관찰되지 않았다. 비장의 배 중심 형성의 최소 증가가 처리된 동물 4마리 중 한 마리에서 관찰되었으며(2일째), 주사된 백신에 대한 정상적인 면역학적 반응으로 간주되었다. 전반적으로, 암컷 토끼에 대한 ExPEC10V의 단일 IM 용량의 투여는 내약성이 우수하였다.
실시예 10 : 토끼에서 ExPEC10V 블렌딩된 제형의 면역원성
ExPEC4V 백신(대장균 O1A, O2, O6A 및 O25B 혈청형의 바이오컨쥬게이트 포함)은 이전에 래트, 토끼 및 인간에서 이들 4가지 혈청형에 대해 면역원성인 것으로 나타났다(예를 들어, WO 2015/124769; WO 2017/035181; [Huttner et al, 2017, Lancet Infect Dis, http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30108-1, RW Frenck Jr, et al, 초록 5587, ASM Microbe 2018] 참조). 대장균 글루코실화된 O4 혈청형을 갖는 본 발명의 신규한 바이오컨쥬게이트는 상기 실시예 4 및 5에서 면역원성인 것으로 나타났다. 래트에 개별적으로 투여될 경우(일가) 대장균 혈청형 O8, O15, O16, O18A 및 O75의 바이오컨쥬게이트(이 실험에서 모두 담체 단백질로서 EPA-2를 가짐)의 면역원성은, 이들 바이오컨쥬게이트 각각이 또한 면역원성이라는 것을 확인시켜주었는데, 이는 ELISA 데이터가 이들 바이오컨쥬게이트 각각이 높은 수준의 대장균 O-항원 특이적 항체를 유발시킬 수 있음(미제시됨)을 나타내었기 때문이다.
상기 기술된 바와 같은 10개 바이오컨쥬게이트의 혼합물을 함유하는 10가 백신의 면역원성을 또한 테스트하였다. 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼(암컷, 12-16주령)는 2주 간격으로 투여된 ExPEC10V 또는 식염수로 3회의 근육내 면역화로 처리하였다(표 5; 0, 14 및 27일째에 투여). 이들 실험에 사용된 ExPEC10V의 일부인 10개의 다당류를 4개의 글리코실화 부위를 함유하는 EPA(EPA-4) 담체 단백질에 컨쥬게이션시켰다. 백신은 3개의 상이한 용량으로 제형화시켰다: 군 1 ('고용량'): 8 ug/용량의 O1A, O2, O6A, O4, O8, O15, O16, O18 및 O75 및 16 ug/투여량의 O25B; 군 2 ('중간 용량'): 4 ug/용량의 O2, O4, O8, O15, O16, O18 및 O75, 8 ug/용량의 O1A 및 O6A 및 16 ug/용량의 O25B; 군 3 ('저용량'): 0.4 ug/용량의 O2, O4, O8, O15, O16, O18 및 O75, 0.8 ug/용량의 O1A 및 O6A 및 1.6 ug/용량의 O25B. 대조군(군 4)의 동물에게는 식염수(0.9% (w/v) 염화나트륨 용액)만 제공하였다(표 5).
항체 반응은 0일째(면역화전) 및 면역화 후 14, 27 및 42일째에 평가하였다. 백신 및 담체 단백질 EPA에 포함된 각각의 바이오컨쥬게이트에 의해 유도된 혈청 항체 수준은 코팅 물질로서 유형 특이적 LPS를 사용하여 ELISA(총 IgG)에 의해 측정하였다. 항체 역가는 4-파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델에 플롯팅된 12-단계 적정 곡선의 중복을 기반으로 하는 최대 유효 농도 절단에 해당하는 EC50 값으로서 보고하였다. 기능적 활성은 OPK에 의해 결정되었다.
표 5. 실험군의 설명
결과는 도 8에 도시하고, 표 6에 요약하였다.
표 6. NZW 토끼에서 ExPEC10V에 의해 유도된 대장균 O-항원 특이적 항체 반응의 요약.
암회색 사각형은 p 값이 통계적으로 유의한 혈청형-특이적 항체 반응을 보여준다. 연회색 사각형은 p 값이 통계적으로 유의하지 않은(ns) 혈청형-특이적 항체 반응을 보여준다. 다중 비교를 위한 Bonferroni 보정과 Wilcoxon 순위 합계 테스트. ExPEC10V 백신화된 동물(군 1, 2 및 3) 대 식염수 대조군(군 4)을 비교. *p≤0.05, **p≤0.01. # P 값은 대조군에서 이상치 동물을 제외한 후 통계적으로 유의하였다(민감도 분석).
고용량의 ExPEC10V(군 1)은 O1A, O2, O4, O6A, O16, O18A 및 O25B에 대한 식염수 대조군과 비교할 경우 조사된 모든 시점(면역화 후 14, 27 및 42일째)에서 현저하게 더 높은 IgG 항체 수준을 유도하였다(도 8, 표 6). 식염수 대조군과 비교할 경우 O8 및 O75 컨쥬게이트에 의해 유도된 현저하게 더 높은 항체 역가가 면역화 후 27일 및 42일째에 관찰되었다(도 8, 표 6).
중간 용량의 ExPEC10V(군 2) 및 저용량(군 3)은 O1A, O2, O4, O6A, O16 및 O25B에 대한 식염수 대조군과 비교할 경우 조사된 모든 시점(면역화 후 14, 27 및 42일째)에서 현저하게 더 높은 항체 수준을 유도하였다(도 8, 표 6). 식염수 대조군과 비교할 경우 O8, O18A 및 O75 컨쥬게이트에 의해 유도된 현저하게 더 높은 항체 역가가 면역화 후 27일 및 42일째에 관찰되었으며, 이는 토끼에서의 부스트 용량이 이들 O-혈청형에 대한 반응을 증가시킴을 시사한다(도 8, 표 6).
O15 컨쥬게이트에 있어서, 대조군에서 이상치 동물은 생략한 민감도 분석은 ExPEC10V 백신의 3개 용량 모두가 면역화 후 14, 27 및 42일째에 식염수 대조군과 비교하여 항체 반응의 현저한 증가를 유도함을 보여주었다(도 8, 표 6).
담체 단백질 EPA에 의해 유도된 항체는 조사된 모든 시점(14일, 27일 및 42일째)에서 테스트된 3가지 용량의 ExPEC10V(고, 중 및 저)에 대해 식염수-처리군(대조군)에서 EPA 항체 역가보다 현저하게 더 높았다(도 8).
용량간 비교(미제시됨)는 백신화 후 14일째에 고용량의 ExPEC10V가 테스트된 대부분의 컨쥬게이트(O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A 및 O25B) 저용량과 비교할 때 현저하게 더 높은 항체 반응을 유도하였음을 보여주었다. 중간 용량의 ExPEC10V는 또한 O1A, O2, O4, O18A, O25B 및 O75에 대한 저용량과 비교하여 현저하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다. O8 컨쥬게이트에 있어서, ExPEC10V의 세 가지 제형 모두는 백신 접종 후 14일째에 유사한 수준의 항체를 유도하였다.
저용량의 ExPEC10V는 O1A, O2, O4, O16, O25B 및 O75 컨쥬게이트에 대한 고용량 및 중간 용량의 ExPEC10V과 비교하여 백신화 후 (프라임 및 2회 부스트 용량 후) 42일째에 항체 반응의 현저한 증가를 유도하였다. 이러한 발견은 예를 들어, 폐렴구균 컨쥬게이트 백신으로 백신화된 유아에서 용량과 일차 백신화에 대한 항체 반응의 크기 사이의 명확한 관계가 관찰되지 않았다는 컨쥬게이트 백신으로의 다른 경험과 일치한다(Poolman JT, et al. Expert Rev Vaccines. 2013, 12(12):1379-94).
O6A, O8 및 O15 컨쥬게이트에 대해 백신화 후 42일째에 테스트한 3가지 용량의 ExPEC10V 간에는 유의한 차이가 없었다. O18A 컨쥬게이트의 경우, 백신화 후 42일째에 중간 용량과 비교하여 고용량의 ExPEC10V가 현저하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다.
담체 단백질(EPA)에 있어서, 고용량 및 중간 용량의 ExPEC10V는 백신화후 14일째에 저용량과 비교하여 현저하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다. 고용량의 백신은 또한 백신화후 42일째에 저용량과 비교하여 현저하게 더 높은 항체 반응을 유도하였다.
결론적으로, 0, 14, 27일째에 근육내 주입을 통해 투여된 3가지 제형의 ExPEC10V(고, 중 및 저)는 토끼에서 면역원성이다.
지금까지, 토끼에서 이 백신에 의해 유도된 대장균 균주를 치사시킬 수 있는 기능적 항체는 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O15, O16 및 O25B에 대해 나타났다.
추가 실험에서, ExPEC10V 백신의 GMP 배치(생산에 대해서는 상기 실시예 8 참조)를 제조하고, 독성 연구의 일부로서 NZW 토끼에 주사하였다(표 7). 이 연구에서 NZW 토끼(수컷 및 암컷)는 ExPEC10V 백신(1일, 15일 및 29일)을 근육내 주사(0.6 mL)로 3회 처리하고, 대조군은 0.9%(w/v) 염화나트륨 용액(식염수)으로 처리하였다. 각 용량의 백신은 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A 및 O75에 대한 9.6 μg 다당류(PS) 및 혈청형 O25B에 대한 19.2 μg PS를 함유하였으며, 이는 105.6 μg의 총 PS (176 μg 총 PS/mL) 및 382.8 μg의 총 EPA (638 μg EPA/mL)에 상응한다. O-항원 및 담체 단백질(EPA)에 대한 IgG 역가는 전처리 기간(1일) 및 면역화 후 31일 및 50일 동안 수집된 샘플로부터 결정되었다.
모든 O-항원 및 담체 단백질 EPA에 대한 항체 반응에서 현저한 증가는 단지 식염수로만 처리된 대조군과 비교할 경우 ExPEC10V로 처리한 군에서 백신화 후 31일째 및 50일째에 관찰되었다(도 9, 표 8). O1A 혈청형의 경우, 백신화된 동물을 대조군과 비교할 때 현저하게 더 높은 항체 반응이 또한 1일(기준선)째에 관찰되었다. 이들 결과는 일부 동물이 대장균에 사전 노출되었거나, O1A-LPS와의 교차 반응하는 항체를 가지고 있음을 시사한다.
표 7. NZW 토끼에 사용된 실험군 및 ExPEC10V 용량.
* 각 용량(0.6mL 부피 용량)은 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B, O75 각각에 대해 9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:19.2:9.6 μg 다당류(PS)를 함유한다(176 μg 총 PS/mL). 각 용량은 382.8 μg EPA 단백질을 함유한다(638 μg EPA/mL).
표 8. 독성 연구의 일환으로 NZW 토끼에서 ExPEC10V의 면역원성.
ExPEC10V에 의해 유도된 항체 반응. 연회색 사각형은 대조군과 비교하여 백신군에서 항체 반응의 유의한 증가가 관찰된 혈청형을 나타낸다. 우도비로의 토빗 모델. ****P ≤0.0001.
실시예 11 : 인간에서 ExPEC10V 백신을 사용한 단계 1/2a 시험
현재 IED를 예방하기 위해 이용가능한 백신은 없다. ExPEC10V 백신을 포함하는 혈청형(O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75)은 ST131을 포함한 항균제 내성 IED를 유발하는 대부분의 ExPEC 분리주를 또한 대표하는 임상적으로 관련된 대다수의 ExPEC 균주로 인한 침습성 질환을 해결하기 위해 선택되었다. 선택된 혈청형은 노년층에서 혈류 감염을 일으키는 10가지 널리 퍼진 ExPEC O-혈청형을 대표하며, ExPEC로 인한 혈류 감염의 약 70%를 차지한다.
침습성 질환 예방에 있어서 컨쥬게이트 백신의 작용 기전은 항생제 내성기전의 영향을 받지 않을 것으로 예상되기 때문에, ExPEC10V 백신은 약물-내성 및 약물-감수성 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75 혈청형에 의해 유발된 IED에 대한 보호를 제공하는 것으로 여겨진다.
ExPEC10V에서도 발견되는 4가지 대장균 O-항원 컨쥬게이트(O1A, O2, O6A 및 O25B)의 서브세트를 포함하는 초기 백신 후보인 ExPEC4V에 대한 선행 임상 경험이 있다. 4건의 임상 연구(2건의 완료된 1상 연구, 1건의 완료된 2상 연구 및 진행 중인 2상 연구)의 결과에 기초하여, ExPEC4V는 연구 참가자들에 있어서 내약성이 우수하였으며, 혈청형(O1A, O2, O6A 및 O25B) 당 최대 16 μg 다당류(PS) 용량에서 백신 관련 안전성 신호가 관찰되지 않았다. 대부분의 유해 사례(AE)는 1등급 및 2등급이었고, 3등급 AE는 거의 보고되지 않았다. 후기 발병 예측 국소 AE(백신화 후 5일 이후에 시작되는 AE)는 주로 더 높은 용량의 ExPEC4V로 관찰되었다. 각 연구에서 ExPEC4V 백신은 면역원성인 것으로 나타났으며, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 측정된 바와 같이 용량 의존적 백신 면역 반응과 O-항원 특이적 면역글로불린 G(IgG) 역가 증가를 입증한다. 항체의 기능적 활성은 ExPEC4V-최적화된 옵소닌식세포 치사 검정(OPKA)으로 입증되었다. ELISA 및 OPKA 테스트 결과의 공동-분석은 검정 반응 사이의 상관관계를 보여주었으며(2상 임상 시험[연구 4V-BAC2001]에서 각각 30일 및 360일에 대한 피어슨 상관 계수 ≥0.61 및 ≥0.48), 이는 ELISA를 ExPEC4V 항체 역가의 일차 척도로 사용하고, 기능적 항체 활성을 예측하는데 사용함을 입증한다. 면역원성 데이터 분석은 ExPEC4V로의 백신화 후 3년에 걸쳐 면역 반응의 지속성을 입증하였다. 이제 ExPEC4V로 백신화되고, 혈청형-특이적 옵소닌식세포 항체의 역가가 높은 인간의 혈청은 이후에 O25B 또는 O2 혈청형으로 복강내 자극된 마우스에 수동적으로 전달될 경우 생체내 보호를 매개할 수 있었음이 또한 관찰되었다(미제시). 따라서, ExPEC4V-특이적 옵소닌식세포 인간 항체는 생체 내에서 박테리아 치사를 매개하며, 이는 제안된 보호 메커니즘이 박테리아 치사를 매개하는 옵소닌식세포 항체의 유도에 의한 것인 다른 컨쥬게이트 백신과 일치한다.
ExPEC10V는 총 10개의 혈청형을 포함하며, 60세 이상 성인에서 ExPEC로 인한 혈류 감염의 약 50%(ExPEC4V) 내지 약 70%로 적용 범위를 늘린다. ExPEC4V에 대한 임상 경험과 상기 실시예에서 논의된 ExPEC10V에 대한 전임상 데이터를 기반으로 하여, ExPEC10V의 투여가 또한 인간에서 대장균 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75에 대한 면역 반응을 유도할 것으로 예상된다.
ExPEC10V 백신의 3가지 다른 용량의 안전성, 반응원성 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 관찰자 맹검, 인간 최초의 1/2a 상 연구를 안정적인 건강 상태의 60세 내지 85세 인간에서 수행하였다(연구 10V- BAC1001). 연구 설계는 2개의 코호트를 포함한다: 코호트 1에서 안정한 건강 상태의 60세 이상 내지 85세 이하의 404명의 참가자(참가자 100명/ExPEC10V 용량) 및 코호트 2에서 지난 5년 내에 UTI 병력이 있는 안정한 건강 상태의 60세 이상의 추가 600명 참가자로 총 1004명의 참가자가 연구에 등록되었다.
ExPEC10V는 60세 이상 성인의 침습성 장외 병원성 대장균(ExPEC) 질병(IED) 예방을 위해 개발 중인 10가 백신 후보이다. ExPEC10V는 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 개별적으로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O-항원 다당류(PS)로 구성되며, 이의 생성은 상기 기술되었다. O4 PS는 글루코실화된 형태이며, 표 1의 화학식 (O4-Glc+)의 구조를 갖는다.
목적 및 끝점
코호트 1 - 1/2a 상 관찰자-맹검 기간과 라벨 개방된 장기 추적 기간(N=404):
코호트 2 - 이중 맹검 기간과 이중 맹검 장기 추적 기간(N = 600):
전반적인 설계
이는 2개의 코호트를 포함하는 무작위의 다기관 중재 연구이다.
코호트 1의 경우, 이 연구는 관찰자-맹검 활성 대조된 설계를 가지고 있으며, UTI 병력이 있거나 없는 안정적인 건강 상태의 60세 이상 내지 85세 이하의 총 404명의 성인 참가자가 포함된다. 코호트 1에 대한 연구 설계는 3개의 기간을 포함한다: 최대 28일의 스크리닝 기간, 1일째 백신화를 통한 관찰자-맹검 181-일 추적 기간, 및 백신화 후 182일부터 3년까지(1096일) 지속되는 라벨 개방된 LTFU 기간(도 10a). 단지 ExPEC10V 선택된 용량 군으로부터의 참가자(약 100명 참가자) 및 Prevnar 13 군의 참가자만이 LTFU 기간으로 진행된다. 코호트 1의 끝은 마지막 참가자의 3년차 방문(1096일)이다.
코호트 2에 있어서, 연구는 이중 맹검 플라세보 제어된 설계를 가지며, 지난 5년 동안 UTI 병력을 갖는 안정한 건강 상태의 60세 이상의 총 600명의 성인 참가자가 포함된다. 등록은 코호트 1로부터 1/2a 상 일차 분석 및 ExPEC10V 용량 선택 완료 후 시작된다. 코호트 2에 대한 연구 설계는 3개의 기간을 포함한다: 최대 28일의 스크리닝 기간, 1일째 백신화를 통한 이중 맹검 181-일 추적 기간, 및 백신화 후 182일부터 3년까지(1096일) 지속되는 이중 맹검 LTFU 기간(도 10b). 코호트 2에서 모든 참가자는 LTFU 기간으로 진행된다. 연구 끝은 코호트 2에서 마지막 참가자의 3년차 방문(1096일)이다.
코호트 1: 1상
코호트 1의 1상에서, 총 84명의 참가자는 한 단계에서 다음 단계로 진행하기 전에 정위에서의 안전성 평가가 있는 단계적 용량-증량 절차에 따라 시차 접근 방식으로 등록된다. 내부 데이터 검토 위원회(DRC)는 이들 84명의 1상 참가자의 신체 검사 데이터(기준선 및 표적화됨), 기준선 인구 통계 데이터 및 백신화 후 14일째 안전성 데이터(예측 국소 및 전신 AE, 예측되지 않은 AE, SAE, 임상 실험실 데이터 및 활력 징후 포함)를 검토하기 위해 이 연구를 위해 위임되었다. 이러한 상의 연구에서, 참가자가 등록되고 6 단계로 무작위 배정하였다:
단계 1: 4명의 센티널 참가자가 등록되고 무작위 배정하였다; 2명의 참가자는 ExPEC10V 저용량 군(표 11)이며, 참가자 1명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13 군이었다.
단계 2: 24명의 참가자가 등록되고 무작위 배정하였다; 18명의 참가자는 ExPEC10V 저용량 군(표 11)이며, 참가자 3명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13 군이었다.
단계 3: 4명의 센티널 참가자가 등록되고 무작위 배정하였다; 2명의 참가자는 ExPEC10V 중간 용량 군(표 11)이며, 참가자 1명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13 군이었다.
단계 4: 24명의 참가자가 등록되고 무작위 배정하였다; 18명의 참가자는 ExPEC10V 중간 용량 군(표 11)이며, 참가자 3명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13 군이었다.
단계 5: 4명의 센티널 참가자가 등록되고 무작위 배정하였다; 2명의 참가자는 ExPEC10V 고용량 군(표 11)이며, 참가자 1명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13 군이었다.
단계 6: 24명의 참가자가 등록되고 무작위 배정하였다; 18명의 참가자는 ExPEC10V 고용량 군(표 11)이며, 참가자 3명씩은 각각 ExPEC4V 및 Prevnar 13 군이었다.
모든 참가자는 배정된 연구 백신화 군에 따라 1일째에 ExPEC10V(3개 용량 중 1), ExPEC4V 또는 Prevnar 13을 단일 근육내(IM) 주사로 투여받았다. 단계 1, 3 및 5 각각에서 4명의 센티널 참가자는 백신화 후 24시간째에 전화로 연락하여 안전 정보를 수집하였다. 4명의 센티널 참가자의 각 군에서 백신화 후 24시간째에 맹검 안전성 데이터는 수석 연구원(PI), 연구 담당 의사(SRP) 및 후원 의료 책임자(SML)에 의해 검토되었다. 다음 단계를 위한 추가 참가자의 무작위 배정은 이러한 2일차 센티널 안전성 평가가 완료될 때까지 중단되었다.
임의의 임상적으로 유의한 결과가 없는 경우, 추가로 24명의 참가자(단계 2, 4 및 6)를 등록시키고, 3개 연구 백신화 군(표 11) 중 하나로 무작위 배정하여 ExPEC10V(3개 용량 중 1), ExPEC4V 또는 Prevnar 13을 1일째에 단일 IM 주사로 투여하였다.
각 용량 수준(2 단계 저용량, 4 단계 중간 용량 및 6 단계 고용량)에서 추가 24명 참가자의 백신화 후, 각 용량 수준에서 모두 28명(4+24) 참가자의 백신화 후 14일째 안전성 데이터를 다음 용량 수준 또는 2a 상으로 진행하기 전에 DCR에 의해 검토하였다.
코호트 1: 2a 상
초기 84명의 참가자에 대한 백신화 후 14일째 안전성 데이터 검토 후 DRC에 의해 결정된 바와 같은 허용가능한 안전성 및 반응성(임의의 안전성 문제 또는 특정 연구 일시 중지 룰을 충족하는 임의의 이벤트가 없는 경우)을 기반으로 하여, 코호트 1로부터의 나머지 320명 참가자를 무작위 배정시키고 2a 상 연구에서 투여하였다. 이들 추가의 320명 참가자를 등록시키고 5개의 백신화 연구 군 중 하나로 2:2:2:1:1의 비율로 병렬로 무작위 배정하여 1일째에 ExPEC10V (3개 용량 중 1), ExPEC4V 또는 Prevnar 13의 단일 IM 주사로 투여하였다(표 11).
초기 84명 참가자에 대한 14일째 안전성 검토를 수행하는 것 외에, DRC는 또한 연구 과정 동안 코호트 1의 안전성 데이터를 평가하며, 특정 백신화 연구 일시 중지 룰을 충족하는 임의의 이벤트 또는 발생할 수 있는 기타 안전 문제를 검토한다.
코호트 1에 있어서, 모든 참가자가 30일째 방문(4차 방문)을 완료하였거나 더 일찍 중단한 경우 일차 분석이 발생한다. 모든 참가자가 181일째 방문을 완료하였거나 더 일찍 중단되었을 때 최종 분석이 발생한다. 라벨 공개된 장기 추적(LTFU) 기간으로 진행되는 참가자에 있어서(ExPEC10V 선택된 용량 군 및 Prevnar 13군), 연간 추적 분석은 백신화 후 1년(366일), 2년(731일) 및 3년(1096일)차의 방문 시점에서 수집된 안전성 및 면역원성 데이터(다중 ECL-기반 면역검정 및 MOPA)를 포함한다.
코호트 2
코호트 2에서는 지난 5년 동안 UTI 병력이 있는 안정적 건강 상태의 60세 이상의 참자가를 대상으로 (코호트 1의 일차 분석 결과를 기반으로 하여) ExPEC10V의 선택적 용량의 안전성, 반응성 및 면역원성을 평가하였다. 코호트 2에 있어서, 이 연구는 이중-맹검 플라세보 대조 설계를 가지며, 총 600명의 참가자가 등록되고, 2:1 비율(ExPEC10V 군 400명 참가자 및 200명 플라세보군)로 병렬로 무작위 배정하였다.
모든 참가자는 배정된 연구 백신화 군에 따라 1일째에 선택된 용량의 ExPEC10V 또는 플라세보의 단일 IM 주사로 투여받았다(표 12).
코호트 2에 있어서, 일차 분석은 안전성 및 면역원성 데이터를 포함하며, 모든 참가자가 30일째 방문(4차 방문)을 완료했거나 일찍 중단하였을 경우 발생한다. 모든 참가자가 181일째 방문을 완료하였거나 더 일찍 중단되었을 때 최종 분석이 발생한다. 모든 참가자에 있어서, 연간 추적 분석은 백신화 후 1년차(366일), 2년차(731일) 및 3년차(1096일) 방문 시점까지 수집된 안전성 및 면역원성 데이터(다중 ECL 기반 면역검정 및 MOPA)를 포함한다.
대변 샘플 분석은 메타게노믹스를 이용하여 장내 세균총에서 병원체(예를 들어, 클로스트리듐 디피실레)의 유병률 및 ExPec10v 혈청형에 대한 ExPEC10V의 효과를 평가하기 위해 선택된 서브세트의 참가자에서 수행된다.
참가자 수
총 1004명의 참가자기 연구에 등록된다; 코호트 1의 참가자 404명 및 코호트 2의 참가자 600명.
중재 군
개입 설명
ExPEC10V: EPA 담체 단백질에 개별적으로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O 항원 PS를 함유하는 인산염 완충 용액 중 대장균 바이오컨쥬게이트 백신. 1일째에 ExPEC10V의 3가지 용량 중 하나의 단일 0.5mL IM(삼각근) 주사.
ExPEC4V: EPA 담체 단백질에 개별적으로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O6A, O25B(4:4:4:8 μg PS/ExPEC 혈청형)의 O-항원 PS를 함유하는 식염수 완충액 중 대장균 바이오컨쥬게이트 백신. 1일째에 ExPEC4V의 단일 0.5 mL IM(삼각근) 주사.
Prevnar 13: 비독소 디프테리아 CRM197 단백질에 개별적으로 연결된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F의 캡슐 항원의 당류의 멸균 현탁액. 1일째 단일 0.5 mL(삼각근) 주사, 단일 용량으로 미리 충전된 주사기로 제공됨.
플라세보: 생리식염수. 1일째에서 플라세보의 단일 0.5 mL IM(삼각근) 주사.
ExPEC 연구 중재 자료는 표 9에 설명되어 있다.
표 9. BAC1001MV ExPEC 연구 백신.
EPA = 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A; PS=다당류
ExPEC4V는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O6A 및 O25B의 O-항원 다당류(PS)로 구성된다.
ExPEC10V는 EPA 담체 단백질에 개별적으로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O-항원 다당류(PS)로 구성된다.
용량은 PS만을 기준으로 한다. EPA(μg)는 측정값이다.
ExPEC10V는 10개의 1가 약물 물질(DS)로 구성된다. 이 임상 연구를 위해 2개의 상이한 농도(중간 및 고)의 의약품(DP)을 생성시킨다(표 10). 세 번째(저) 농도는 제형 완충액과 동일한 희석 완충액으로 고농도를 1:1로 희석하여 클리닉에서 얻는다. 각 DP는 pH 7.0(0.02% [w/w] 폴리소르베이트 80, 5% [w/w] 소르비톨, 10 mM 메티오닌)의 인산나트륨/인산칼륨 완충액에서 제형화된다.
표 10: 1/2a 상 임상 연구를 위한 ExPEC10V 백신의 조성
EPA = 담체 단백질로 사용되는 유전적으로 탈독소화된 P. 애루기노사 외독소 A
A 활성 성분은 PS 항원과 담체 단백질(EPA)로 구성된 생물학적으로 합성된 컨쥬게이트이다; 용량은 PS 모이어티에서만 계산된다.
b "저농도"는 "고농도"를 희석 완충액으로 1:1로 희석하여 클리닉에서 얻는다.
안전성 평가
주요 안전성 평가에는 예측된 국소 및 전신 AE, 예측되지 않은 AE, SAE, 신체 검사, 바이탈 사인 측정 및 임상 실험실 테스트가 포함된다.
면역원성 평가
수집된 혈청의 주요 면역원성 평가는, 다중 ECL-기반 면역검정에 의해 측정되는 백신에 의해 유발된 ExPEC10V 및 ExPEC4V 혈청형-특이적 총 IgG 항체 수준, 및 다중 포맷(MOPA)의 옵소닌식세포 치사 검정(OPKA)에 의해 측정되는 바와 같은 ExPEC10V 및 ExPEC4V 혈청형-특이적 기능성 항체의 평가를 포함한다. Prevnar 13에 의해 유발된 뉴모코컬 항체 역가의 면역원성 평가는 수행되지 않는다.
ExPEC10V에 의해 유도된 혈청 항체 수준은 다중 전기화학발광(ECL)-기반 면역검정에 의해 평가된다. 이 검정은 상이한 대장균 O-LPS 항원 또는 담체 단백질 EPA로 코팅된 다중-스팟 96웰 포맷 마이크로플레이트에서 고결합 탄소 전극을 조합한다. 혈청 샘플에 존재하는 항원 특이적 항체의 수준은 SULFO-TAG로 표지된 이차 항체(항-인간 IgG)를 사용하여 검출된다. SULFO-TAG는 결합된 IgG 항체의 양에 비례하여 증가하는 강도로 전기 자극이 있을 때 발광한다. 이 검정은 ICH(International Conference on Harmonization) 권장 사항에 따라 검증되었다.
ExPEC10V에 의해 유도된 기능적 항체의 수준은 다중 옵소닌식세포 검정(MOPA)으로 측정된다. 간단히 말해서, 열-불활성화된 혈청 샘플은 연속적으로 희석되고, 다양한 유형의 항생제에 특이적으로 내성이 있는 다른 대장균 균주와 함께 배양된다. 그 후, 인간 보체 및 식세포(HL60)를 반응에 첨가하고, 두 번째 배양 기간 후, 반응 혼합물의 분취량을 선택적으로 특정 항생제에 내성인 균주의 성장을 허용하는 특정 항생제가 보충된 배지를 함유하는 다양한 PVDF 친수성 막 필터 플레이트에 옮긴다. 밤새 성장시킨 후, 생존 박테리아의 수를 결정하기 위해 집락 형성 단위(CFU)를 계산한다. 이 검정은 ICH 권장 사항에 따라 검증되었다.
다중 ECL-기반 면역검정 및 MOPA에 의해 측정된 바와 같은 ExPEC10V 혈청형 항체 및 다중 ECL-기반 면역검정만으로 측정된 EPA에 있어서, 모든 면역원성 시점에 대해 백신화 연구 군에 의해 면역원성의 다음 측정이 평가되고 표로 작성된다:
- 1일째로부터 혈청 항체 역가가 2배 이상 및 4배 이상 증가한 참가자의 비율(백신화 전)
- 기하 평균 역가 (GMT)
- GMR: 기준선 이후/기준선 값으로부터 계산된 기준선으로부터의 배수 변화.
LTFU 기간 동안 각 혈청형에 있어서 면역원성에 대한 설명 요약이 제공된다.
나중 단계에 대한 용량 선택은 코호트 1(30일째 결과)의 일차 분석 시점에 이용 가능한 증거 전체를 고려한다.
표 11: 코호트 1: 백신화 일정
*ExPEC10V는 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 개별적으로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O-항원 다당류(PS)로 구성된다.
** ExPEC4V는 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래한 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 별도로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O6A 및 O25B의 O-항원 다당류(PS)로 구성된다.
***Prevnar 13, 뉴모코컬 13-변이체 컨쥬게이트 백신(디프테리아 CRM197 단백질)은 비독소 디프테리아 CRM197 단백질에 개별적으로 연결된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F의 캡슐 항원의 당류의 멸균 현탁액이다.
표 12: 코호트 2: 백신화 일정
a ExPEC10V는 담체 단백질인 슈도모나스 애루기노사로부터 유래된 유전학적으로 탈독소화된 형태의 외독소 A(EPA)에 개별적으로 바이오컨쥬게이션된 ExPEC 혈청형 O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B 및 O75의 O-항원 다당류(PS)로 구성된다.
연구의 코호트 2에 등록된 참가자의 무작위 배정 비율은 2:1(ExPEC10V:플라세보)이다. 코호트 2에 사용된 ExPEC10V 용량은 코호트 1의 일차 분석(30일째) 결과를 기반으로 한다.
상태
상기에서 설명한 연구의 코호트 1의 등록 및 백신화가 완료되었다. 연구는 맹검 방식으로 진행된다. 안전성 데이터의 지속적 검토에 근거하여, 주요 안전성 문제는 확인되지 않았으며, ExPEC10V 백신은 허용가능한 안전성 프로파일을 갖는다.
코호트 1 임상 샘플의 면역원성의 분석은 맹검 방식으로 진행 중이다. ECL 데이터는 100% 허용 품질 한계(Acceptance Quality Limit)(AQL) 체크되었으며, 데이터 관리를 위해 업로드되었다. MOPA 샘플의 분석은 진행중이다. 데이터 비맹검 및 통계 분석은 임상 연구 기관(CRO)을 사용하여 수행된다.
코호트에 대한 ExPEC10V 용량이 코호트 1로부터의 30일째 결과의 최종 일차 분석을 기반으로 확인되면, 코호트 2 백신화가 시작된다.
당업자는 본 발명의 광범위한 본 발명의 개념을 벗어나지 않고 전술한 구체예에 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 구체예에 제한되지 않고, 본 설명에 의해 정의된 본 발명의 사상 및 범위 내에 변형이 포함되도록 의도된 것으로 이해된다.
서열
SEQ ID NO: 1 (글리코실화 컨센서스 서열)
Asn-X-Ser(Thr), 여기에서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음
SEQ ID NO: 2 (최적화된 글리코실화 컨센서스 서열)
Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), 여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨
SEQ ID NO: 3 (4 글리코실화 컨센서스 서열을 포함하는 EPA 담체 단백질 (EPA-4))
SEQ ID NO: 4 (O4 GtrS 아미노산 서열)
SEQ ID NO: 5 (예시적 O4 gtrS 핵산 서열)
SEQ ID NO: 6 (예시적 PglB 서열('야생형'))
SEQ ID NO: 7 (예시적 gtrA 아미노산 서열; 대장균 W3110 yfdG, GenBank: BAA16209.1)
SEQ ID NO: 8 (예시적 gtrB 아미노산 서열 - 대장균 W3110 yfdH, GenBank: BAA16210.1)
SEQ ID NO: 9 (예시적 O4 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O4-EPA 생성 균주 BVEC-L-00684f)
SEQ ID NO: 10 (EPA 담체 단백질에 대한 예시적 신호 서열)
SEQ ID NO: 11 (예시적 O1A rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O1A-EPA 생성 균주 stGVXN4411 및 stLMTB10217)
SEQ ID NO: 12 (예시적 O2 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O2-EPA 생성 균주 stGVXN4906)
SEQ ID NO: 13 (예시적 O6A rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O6A-EPA 생성 균주 stGVXN4112 및 stLMTB10923)
SEQ ID NO: 14 (예시적 O8 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O8-EPA 생성 균주 stLMTB11734)
SEQ ID NO: 15 (예시적 O15 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O15-EPA 생성 균주 stLMTB11738)
SEQ ID NO: 16 (예시적 O16 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O16-EPA 생성 균주 stLMTB11739)
SEQ ID NO: 17 (예시적 O18A rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O18A-EPA 생성 균주 BVEC-L-00559)
SEQ ID NO: 18 (예시적 O25B rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O25B-EPA 생성 균주 stGVXN4459)
SEQ ID NO: 19 (예시적 O75 rfb 유전자좌 뉴클레오티드 서열 - O75-EPA 생성 균주 stLMTB11737)
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceuticals, Inc. GlaxoSmithKline Biologicals S.A. <120> Methods of Producing Bioconjugates of E. coli O-Antigen Polysaccharides, Compositions Thereof, and Methods of Use Thereof <130> 004852.11612/128WO1 (CRU6009WOPCT1; VB66734P) <150> US62/819,762 <151> 2019-03-18 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glycosylation consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> any amino acid residue except Pro <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Ser orThr <400> 1 Asn Xaa Xaa 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized glycosylation consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> any amino acid residue except Pro <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> any amino acid residue except Pro <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Ser or Thr <400> 2 Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPA carrier protein comprising 4 glycosylation consensus sequences (EPA-4) <400> 3 Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15 Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 20 25 30 Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 35 40 45 Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met 50 55 60 Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 85 90 95 Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 100 105 110 Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 115 120 125 Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 130 135 140 His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 145 150 155 160 Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn 165 170 175 Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 180 185 190 Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg 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gtggcccatt tataattttc 540 attttagcag cttcatgctt taaatttata aataattgta aagatcatat tagtgtaaga 600 tctttcataa atttctactt gcgtcagcca tacgcattaa tgattgtttg cgctttaatt 660 caaggaactt ctataattct aactttcaat ggcacacgtt cctcagcacc gctaggattc 720 agttttgatg tgatttcgtc tattatatca tcgaatattt ttttatttac atttgtccca 780 tgggatattg caaaggctgg gtgggataat ttactgttat cttatttttt gtctgtttcg 840 attttgtcgt gtgcggcctt tgtttttgtt aaaggtacgt ggcgaatgaa agtatttgca 900 actttaccat tgctaattat aatattttca atggcaaaac cacaattgac agactcggca 960 cctcaattgc caacacttat taatgggcaa ggttcaagat acttcgtaaa tatacatatt 1020 gcgatattct ctttgctatg tgtttactta cttgagtgcg tcagggggaa agtggcaact 1080 ttattttcca aaatatactt aacaattttg ctattcgtga tgggatgttt gaattttgtt 1140 atcaccccac tcccaaacat gaactggagg gaaggtgcta ctttgattaa taatgcaaaa 1200 actggtgatg tcatttcgat tcaagtgcta ccacctggcc taacacttga actaaggaaa 1260 aaataa 1266 <210> 6 <211> 713 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example PglB sequence ('wild-type') <400> 6 Met Leu 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cgccgggcgt gaccattatg 300 aacgtgcgtc agggcgaacc tttaggttta ggccactcca ttttgtgtgc gcgacctgcc 360 attggtgaca acccatttgt cgtggtactg ccagacgttg tgatcgacga tgccagcgcc 420 gacccgctac gttacaacct tgctgccatg attgcacgtt tcaacgaaac gggccgcagc 480 caggtgctgg caaaacgtat gccgggtgac ctctctgaat actccgtcat ccagactaaa 540 gagccgctgg accgtgaggg taaagtcagc cgcattgttg aatttatcga aaaaccggat 600 cagccgcaga cgctggactc agacatcatg gccgtaggtc gctatgtgct ttctgccgat 660 atttggccgg aactggaacg tactcagcct ggtgcatggg gacgtattca gctgactgat 720 gctattgccg agctggcgaa aaaacaatcc gttgatgcaa tgctgatgac cggcgacagt 780 tacgactgcg gcaaaaaaat gggctatatg caggcgtttg tgaagtatgg cctacgcaac 840 ctgaaagaag gggcgaagtt ccgtaaaggt attgagaagc tgttaagcga ataatgaaaa 900 tctgaccgga tgtaacggtt gataagaaaa ttataacggc agtgaaaatt cgcagcaaaa 960 gtaatttgtt gcgaatcttc ctgccgttgt tttatataaa ccatcagaat aacaacgagt 1020 tagcagtagg gttttattca aagttttcca ggattttcct tgtttccaga gcggattggt 1080 aagacaatta gcgtttgaat ttttcgggtt tagcgcgagt gggtaacgct 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tgttgaagat 1980 catgcgcgtg cgttatatac cgtcgtaacc gaaggtaaag cgggtgaaac ttataacatt 2040 ggtgggcaca acgaaaagaa aaacatagat gtagtgctca ctatttgtga tttgctggat 2100 gagattgtac cgaaagagaa atcttatcgt gagcaaatca cttatgttgc cgatcgtccg 2160 ggacacgatc gccgttatgc gattgatgct gagaatattg gtcgcgaatt gggatggaaa 2220 ccacaggaaa cgtttgagag cgggattcgg aagacagtgg aatggtatct gtccaataca 2280 aaatgggttg ataatgtgaa aagtggtgcc tatcaatcgt ggattgaaga gaactatgag 2340 ggccgccagt aatgaatatc ctcctttttg gcaaaacagg gcaggtaggt tgggaactac 2400 agcgtgctct ggcacctctg ggtaacttga ttgctcttga tgttcattcc actgattatt 2460 gtggcgattt cagtaacccc gaaggtgtgg ctgaaaccgt caaaaaaatt cgcccagatg 2520 ttattgttaa tgctgctgct cataccgcgg tagataaggc tgagtcagaa ccagaatttg 2580 cacaattact caatgcgacc agcgttgaag caattgcaaa agcggctaat gaagttgggg 2640 cttgggtaat tcattactca actgactacg tcttccctgg aaatggcgac atgccatggc 2700 tcgagactga tgtaaccgct ccgctcaatg tttatggcaa aaccaaattg gctggagaaa 2760 gagcattaca agaacattgc gcaaagcatc ttattttccg taccagctgg gtatatgcag 2820 gtaaaggaaa taactttgcc aaaacaatgt tacgtctggc aaaagagcgc gaagaactgg 2880 ctgtgataaa cgatcagttt ggcgcaccaa caggtgctga attgctggct gattgcaccg 2940 ctcatgccat tcgcgtggca ttaaaaaaac cagaagttgc tggcttgtac catctggtag 3000 caaatggcac aacaacctgg cacgattacg ccgcgctagt attcgaagaa gcccgtaaag 3060 cagggattga ccttgcactt aacaaactca acgccgtacc aacaacggct tatcctactc 3120 cagcccgccg tcctcataat tctcgcctca ataccgaaaa gtttcagcag aactttgcgc 3180 ttgtcttgcc tgactggcag gtgggcgtga aacgtatgct caacgaatta tttacgacta 3240 cggcaattta acaaattttt gcatctcgct catgatgcca gagcgggatg aattaaaagg 3300 aatggtgaaa tgaaaacgcg taaaggtatt attctggctg gtggttccgg cactcgtctt 3360 tatcctgtga cgatggcagt gagtaaacaa ctgctgccga tttatgataa gccgatgatt 3420 tattatccgc tttcaacgct tatgttagcg ggtattcgcg atattcttat tatcagtacg 3480 ccacaggata caccgcgttt ccaacaattg ttgggggacg ggagtcagtg ggggcttaat 3540 ctacagtata aagtacaacc gagtccggat ggcctggcgc aagcgtttat tattggtgaa 3600 gactttattg gtggtgatga ttgtgcactc gtacttggcg ataatatctt ctatggacac 3660 gacttgccga aattaatgga agctgctgtt aacaaagaaa tcggtgcaac ggtatttgct 3720 tatcacgtca atgatcctga acgttatggt gtcgtggagt ttgataataa cggtactgca 3780 attagcctgg aagaaaaacc gctggaacca aaaagtaact atgcggttac tgggctttat 3840 ttctatgaca atgatgttgt agaaatggcg aaaaacctta agccttctgc ccgtggcgaa 3900 ctggaaatta ccgatattaa ccgtatttat atggagcagg gacgtttgtc tgtcgctatg 3960 atggggcgtg gttatgcctg gttggatact ggtacacatc aaagtcttat tgaagcaagt 4020 aacttcattg ccaccattga agagcgtcag ggattaaagg tatcttgccc ggaagagatt 4080 gcttaccgta aagggtttat tgatgctgag caggtgaaag tattagccga accgctgaag 4140 aaaaatgatt atggtcagta tctgctaaaa atgattaaag gttattaata aaatgaacgt 4200 aattaaaact gaaattcctg atgtgctgat ttttgaacca aaagtttttg gtgatgaacg 4260 tggcttcttt tttgagagtt ttaaccagaa agtatttgaa gaagctgtag gacggaaggt 4320 tgaatttgtt caggataacc attctaagtc taaaataaat gtattgcgtg ggatgcatta 4380 tcaaacacaa aatactcaag gaaaactggt tcgggtaatt tctggttcag tatatgatgt 4440 tgccgtagat ttaagagaaa aatcaaagac atttggcaaa tgggtgggtg 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Artificial Sequence <220> <223> example O18A rfb locus nucleotide sequence - O18A-EPA production strain BVEC-L-00559 <400> 17 atgacgaatt taaaagcagt tattcctgta gcgggtctcg ggatgcatat gttgcctgcc 60 actaaggcga tacccaaaga gatgctacca atcgtcgaca agccaatgat tcagtacatt 120 gttgacgaga ttgtggctgc agggatcaaa gaaatcctcc tggtaactca cgcgtccaag 180 aacgcggtcg aaaaccactt cgacacctct tatgagttag aatcactcct tgagcagcgc 240 gtgaagcgtc aactgctggc ggaagtacag tccatctgtc cgccgggcgt gaccattatg 300 aacgtgcgtc agggcgaacc tttaggttta ggccactcca ttttgtgtgc gcgacctgcc 360 attggtgaca acccatttgt cgtggtactg ccagacgttg tgatcgacga tgccagcgcc 420 gacccgctac gttacaacct tgctgccatg attgcacgtt tcaacgaaac gggccgcagc 480 caggtgctgg caaaacgtat gccgggtgac ctctctgaat actccgtcat ccagactaaa 540 gagccgctgg accgtgaggg taaagtcagc cgcattgttg aatttatcga aaaaccggat 600 cagccgcaga cgctggactc agacatcatg gccgtaggtc gctatgtgct ttctgccgat 660 atttggccgg aactggaacg tactcagcct ggtgcatggg gacgtattca gctgactgat 720 gctattgccg agctggcgaa aaaacaatcc 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aacggtgaac tgagcagtta cctgatcgac atcaccaaag atatcttcac 12540 caaaaaagat gaagacggta actacctggt tgatgtgatc ctggatgaag cggctaacaa 12600 aggtacgggt aaatggacca gccagagcgc gctggatctc ggcgaaccgc tgtcgctgat 12660 taccgagtct gtgtttgcac gttatatctc ttctctgaaa gatcagcgtg ttgccgcatc 12720 taaagttctc tctggtccgc aagcacagcc agcaggcgac aaggctgagt tcatcgaaaa 12780 agttcgtcgt gcgctgtatc tgggcaaaat cgtttcttac gcccagggct tctctcagct 12840 gcgtgctgcg tctgaagagt acaactggga tctgaactac ggcgaaatcg cgaagatttt 12900 ccgtgctggc tgcatcatcc gtgcgcagtt cctgcaaaaa atcaccgatg cttatgccga 12960 aaatccacag atcgctaacc tgttgctggc tccgtacttc aagcaaattg ccgatgacta 13020 ccagcaggcg ctgcgtgatg tcgttgctta tgcagtacag aacggtattc cggttccgac 13080 cttctccgca gcggttgcct attacgacag ctaccgtgct gctgttctgc ctgcgaacct 13140 gatccaggca cagcgtgact attttggtgc gcatacttat aagcgtattg ataaagaagg 13200 tgtgttccat accgaatggc tggattaa 13228 <210> 18 <211> 13554 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> example O25B rfb locus nucleotide sequence - O25B-EPA production strain stGVXN4459 <400> 18 atgacgaatt taaaagcagt tattcctgta gcgggtctcg ggatgcatat gttgcctgcc 60 actaaggcga tacccaaaga gatgctacca atcgtcgaca agccaatgat tcagtacatt 120 gttgacgaga ttgtggctgc agggatcaaa gaaatcctcc tggtaactca cgcgtccaag 180 aacgcggtcg aaaaccactt cgacacctct tatgagttag aatcactcct tgagcagcgc 240 gtgaagcgtc aactgctggc ggaagtacag tccatctgtc cgccgggcgt gaccattatg 300 aacgtgcgtc agggcgaacc tttaggttta ggccactcca ttttgtgtgc gcgacctgcc 360 attggtgaca acccatttgt cgtggtactg ccagacgttg tgatcgacga tgccagcgcc 420 gacccgctac gttacaacct tgctgccatg attgcacgtt tcaacgaaac gggccgcagc 480 caggtgctgg caaaacgtat gccgggtgac ctctctgaat actccgtcat ccagactaaa 540 gagccgctgg accgtgaggg taaagtcagc cgcattgttg aatttatcga aaaaccggat 600 cagccgcaga cgctggactc agacatcatg gccgtaggtc gctatgtgct ttctgccgat 660 atttggccgg aactggaacg tactcagcct ggtgcatggg gacgtattca gctgactgat 720 gctattgccg agctggcgaa aaaacaatcc gttgatgcaa tgctgatgac cggcgacagt 780 tacgactgcg gcaaaaaaat gggctatatg 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gggcaaaatc gtttcttacg cccagggctt ctctcagctg cgtgctgcgt 14820 ctgaagagta caactgggat ctgaactacg gcgaaatcgc gaagattttc cgtgctggct 14880 gcatcatccg tgcgcagttc ctgcagaaaa tcaccgatgc ttatgccgaa aatccacaga 14940 tcgctaacct gttgctggct ccgtacttca agcaaattgc cgatgactac cagcaggcgc 15000 tgcgtgatgt cgttgcttat gcagtacaga acggtattcc ggttccgacc ttctccgcag 15060 cggttgccta ttacgacagc taccgtgctg ctgttctgcc tgcgaacctg atccaggcac 15120 agcgtgacta ttttggtgcg catacttata agcgtattga taaagaaggt gtgttccata 15180 ccgaatggct ggattaa 15197

Claims (19)

  1. 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (i) a. Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
    b. 글리코실화 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임) (SEQ ID NO: 1), 또는 글리코실화 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    c. 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 원핵 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
    (ii) 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 조건하에서 재조합 원핵 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
    여기에서 Ox-항원은 O1A 항원 다당류, 글루코실화된 O4 항원 다당류, O6A 항원 다당류, O15 항원 다당류, O16 항원 다당류 또는 O75 항원 다당류이고,
    Ox-항원이 O1A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglBy는 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하고, 재조합 원핵 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기에서 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
    Ox-항원이 O6A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 O15 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 O16 항원 다당류인 경우, PglBy는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며,
    여기에서 각각의 경우에 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이며,
    여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16 및 O75 항원 다당류는 각각 화학식
    (O1A)
    ;
    (O4-Glc+)
    ;
    (O6A)
    ;
    (O15)
    ;
    (016)
    ; 및
    (O75)
    의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100의 정수인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 n은 독립적으로 7 내지 25의 정수인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류이며, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PdlB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 재조합 원핵 숙주 세포가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 GtrA 및 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  5. 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (i) a. Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
    b. 글리코실화 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임) (SEQ ID NO: 1), 또는 글리코실화 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    c. 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 원핵 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
    (ii) 바이오컨쥬게이트의 생성을 위한 조건하에서 재조합 원핵 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
    여기에서 PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V를 포함하며,
    여기에서 Ox-항원은 O1A 항원 다당류, 글루코실화된 O4 항원 다당류, O6A 항원 다당류, O15 항원 다당류, O16 항원 다당류 또는 O75 항원 다당류이며,
    Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, 재조합 원핵 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기에서 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며,
    여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16 및 O75 항원 다당류는 각각
    화학식
    (O1A)
    ;
    (O4-Glc+)
    ;
    (O6A)
    ;
    (O15)
    ;
    (O16)
    ; 및
    (O75)
    의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100의 정수인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 각각의 n은 독립적으로 7 내지 25의 정수인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 원핵 숙주 세포로부터 바이오컨쥬게이트를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 탈독소화된 P. 애루기노사(P. aeruginosa)의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스(S. aureus)의 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 담체 단백질은 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA)인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, EPA 담체 단백질은 SEQ ID NO: 3을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 원핵 숙주 세포가 대장균 세포, 대장균 K-12 균주, 또는 균주 W3110인, 방법.
  12. 담체 단백질에 공유 결합된 대장균 Ox 항원 다당류의 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위한 재조합 원핵 숙주 세포로서, 상기 재조합 원핵 숙주 세포가
    a. Ox-항원 다당류에 대한 rfb 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열;
    b. 글리코실화 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임) (SEQ ID NO: 1), 또는 글리코실화 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    c. 올리고사카릴 트랜스퍼라제 PglBy를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    여기에서 Ox-항원은 O1A 항원 다당류, 글루코실화된 O4 항원 다당류, O6A 항원 다당류, O15 항원 다당류, O16 항원 다당류 또는 O75 항원 다당류이고,
    Ox-항원이 O1A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류인 경우, PglBy는 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하고, 재조합 원핵 숙주 세포는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80% 동일성을 가지며, 글루코스의 첨가에 의해 대장균 O4 항원 다당류를 변형시켜 대장균 글루코실화된 O4 항원 다당류를 생성할 수 있는 글루코실트랜스퍼라제 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 트랜스로카제 GtrA 및 글리코실트랜스퍼라제 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기에서 트랜스로카제는 박토프레놀 결합된 글루코스를 전위시킬 수 있으며, 글리코실트랜스퍼라제는 박토프레놀을 글루코실화시킬 수 있으며;
    Ox-항원이 O6A 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 O15 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V, K482R, D483H 및 A669V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 O16 항원 다당류인 경우, PglBy는 Y77H, S80R, Q287P, K289R 및 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며;
    Ox-항원이 O75 항원 다당류인 경우, PglBy는 N311V의 아미노산 돌연변이를 포함하며,
    여기에서 각각의 경우에 아미노산 돌연변이는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PglB에 대한 것이며,
    여기에서 O1A, 글루코실화된 O4, O6A, O15, O16 및 O75 항원 다당류는 각각 화학식
    (O1A)
    ;
    (O4-Glc+)
    ;
    (O6A)
    ;
    (O15)
    ;
    (016)
    ; 및
    (O75)
    의 구조를 가지며, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 100의 정수인, 재조합 원핵 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 각각의 n은 독립적으로 7 내지 25의 정수인, 재조합 원핵 숙주 세포.
  14. 제12항에 있어서, Ox-항원이 글루코실화된 O4 항원 다당류고, PglBy는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 야생형 PdlB와 비교해 아미노산 돌연변이 N311V 또는 아미노산 돌연변이 Y77H 및 N311V를 포함하는, 재조합 원핵 숙주 세포.
  15. 제14항에 있어서, 재조합 원핵 숙주 세포가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 GtrS를 인코딩하는 서열, 및 각각 SEQ ID NO: 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 GtrA 및 GtrB를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 재조합 원핵 숙주 세포.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 탈독소화된 P. 애루기노사의 외독소 A(EPA), 대장균 플라겔린(FliC), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드, 탈독소화된 S. 아우레우스의 헤모리신 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, 대장균 열 민감 장독소, 탈독소화된 대장균 열 민감 장독소의 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 탈독소화된 콜레라 독소의 변이체, 대장균 Sat 단백질, 대장균 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴모리신, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), P. 애루기노사 PcrV, 네이세리아 메닌지티디스의 외막 단백질(OMPC) 및 비정형 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 원핵 숙주 세포.
  17. 제16항에 있어서, 담체 단백질은 탈독소화된 슈도모나스 애루기노사의 외독소 A(EPA)인, 재조합 원핵 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, EPA 담체 단백질은 SEQ ID NO: 3을 포함하는, 재조합 원핵 숙주 세포.
  19. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 원핵 숙주 세포가 대장균 세포, 대장균 K-12 균주, 또는 균주 W3110인, 재조합 원핵 숙주 세포.
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