JP2023539943A - 多価ワクチン組成物及びその使用 - Google Patents

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Abstract

組成物及び方法は、腸管外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導して、それによりＥｘＰＥＣと関連する疾患に対する免疫防御をもたらすために記載される。特に、組成物及び方法は、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の予防のためにキャリアタンパク質に共有結合された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）多糖抗原Ｏ７５のコンジュゲートを使用するために記載される。

Description

腸管外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）は通常、共生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株と比較してヒト腸の有害な生息菌である。しかしながら、ＥｘＰＥＣ株は、胃腸管の外部のコロニー形成及び感染のための病原性因子を保有して、著しい罹患率、死亡率、及び年間の費用をもたらす多様で重篤な侵襲性疾患を引き起こす可能性がある（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．２００２；１３９（３）：１５５－１６２；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１；３０１（８）：６４２－６４７；Ｆｏｘｍａｎ，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ．２００２；１１３ Ｓｕｐｐｌ １Ａ：５Ｓ－１３Ｓ；及びＲｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２００３；５（５）：４４９－４５６を参照のこと）。ＥｘＰＥＣ株は、尿路感染症（ＵＴＩ）の最も一般的な原因である。それらはまた、手術部位感染及び新生児髄膜炎の寄与体でもあり（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；及びＲｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）、腹腔及び骨盤感染並びに院内肺炎と関連し、場合によっては骨髄炎、蜂巣炎、及び創傷感染などの他の腸管外感染に関与する。感染の全てのこれらの原発部位は、ＥｘＰＥＣ菌血症をもたらす可能性がある（Ｒｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。新生児、高齢者、及び免疫無防備状態の患者は特に、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患（ＩＥＤ）を含むＥｘＰＥＣ感染になりやすい。
抗生物質に対する細菌耐性は、細菌感染に対する戦いにおける主要な懸念であり、多剤耐性（ＭＤＲ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ますます蔓延している（例えば、Ｓｃｈｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ３４（５）：４０７－４１３；及びＰｉｔｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ａｎｔｉ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｔｈｅｒ．１０（１０）：１１６５－１１７６を参照のこと）。ＥｘＰＥＣ配列１３１型（ＳＴ１３１）の出現及び急速な世界的蔓延は、多剤耐性を含む薬剤耐性の増加の主要な促進要因とみなされている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１０；５４（１）：５４６－５５０；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１１；６６（１）：１－１４）。このクローンは、全てのＥｘＰＥＣ臨床分離株の１２．５％～３０％に見出され、大部分は血清型Ｏ２５Ｂ：Ｈ４を呈し、高レベルのフルオロキノロン耐性を示し、多くの場合、トリメトプリム／スルファメトキサゾール耐性及びセファロスポリンに対する耐性を与える広域スペクトルのベータ－ラクタマーゼを伴う（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２０１１、及びＢａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１４；５８（９）：４９９７－５００４）。
Ｏ抗原血清型は、グラム陰性細菌におけるリポ多糖（ＬＰＳ）の外膜部分であるＯ多糖抗原の化学構造に基づく。１８０種を超える血清学的に特有の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原が報告されているが（Ｓｔｅｎｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖ．２００６；３０：３８２－４０３）、大多数のＥｘＰＥＣ分離株は、２０種未満のＯ抗原血清型内に分類される。全長大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は通常、それぞれｒｆｂ及びｒｆａクラスターにおいて支配的にコードされる酵素によって別々に合成される各構成要素とともに高度に保存されたＬＰＳコア構造に結合される約１０～２５個の繰り返し糖単位で構成される。Ｏ抗原の多量体化の後、Ｏ抗原多糖骨格は、典型的にはアセチル又はグルコース残基の付加を介して修飾され得る。これらの修飾は、共通の多糖骨格を共有するが、側枝が異なる抗原性が異なる血清型を生成することによって血清型の多様性を効率的に増大させる。Ｏ抗原修飾酵素をコードする遺伝子は通常、染色体上のｒｆｂクラスターの外部に存在し、いくつかの場合、これらの遺伝子は、溶原性バクテリオファージ内に見出される。
ＥｘＰＥＣ感染は、任意の血清型によって引き起こされ得る。ＥｘＰＥＣ感染においてある特定の血清型の過剰提示があるが、それにもかかわらず、ＥｘＰＥＣ分離株由来の表面多糖は、多大な抗原性の多様性を呈し、このことが表面多糖に基づくＥｘＰＥＣワクチンの開発を非常に困難なものにしている（Ｒｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００７；２５：３８５９－３８７０）。また、ある特定のＯ抗原は、免疫原性に乏しい場合がある。さらに、肺炎球菌ワクチンからの研究に基づいて、いくつかの血清型が疾患を引き起こす可能性があるとき、ワクチンにおける封入のための血清型の選択及び含まれる血清型の投与量レベルなどのワクチン組成は、ある特定の血清型に対するワクチンの使用が、ワクチンに含まれない血清型、或いはワクチンに含まれるがその血清型に対して免疫化するのに弱い効果しかない血清型の保因及びそれ由来の疾患を潜在的に増加させるため、重大な意味を持ち得る（Ｌｉｐｓｉｔｃｈ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；１９９９，５：３３６－３４５）。理想的には、ワクチンは、ワクチンに含まれる血清型によって引き起こされる疾患の予防においてその有利な効果を最大化する一方で、非ワクチン血清型の保因の増加に起因して追加される疾患のリスクを最小化する必要がある。
ＥｘＰＥＣ感染を予防するためのワクチンの開発に対する試みは、Ｏ抗原多糖コンジュゲートに焦点が当てられている。十二価Ｏ抗原コンジュゲートワクチンは、Ｏ抗原多糖の抽出及び精製並びに解毒された緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａに対する化学的コンジュゲーションを介して合成され、第１相臨床試験において安全性及び免疫原性について試験された（Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９４）ｖ．１７０，ｐｐ．８３４－４０）。この候補ワクチンは、臨床使用について認可されなかった。近年、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるバイオコンジュゲーション系が開発されており、多糖抗原及びキャリアタンパク質の両方がインビボで合成され、続いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）酵素の活性を介してインビボでコンジュゲートされる（Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００６）ｖ．１０３，ｐｐ．７０８８－９３）。このＮ結合タンパク質グリコシル化系は、キャリアタンパク質への多様な多糖の移行が可能であり、コンジュゲートを精製する率直な方法を可能にしている。
バイオコンジュゲーションは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）四価Ｏ抗原候補ワクチンのためのコンジュゲート多糖を順調に生成するために使用されてきた（Ｐｏｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｗａｃｋｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１６）ｖ．２１３（１），ｐｐ．６－１３）。しかしながら、奏功するＥｘＰＥＣワクチンの開発は、支配的な血清型の包含を必要とし、ＥｘＰＥＣ分離株のサブセットにおけるさらなるＯ抗原修飾の存在は、未修飾及び修飾ＬＰＳを表示する分離株を包含する際にさらなる課題を提示する。さらに、複数の血清型に由来するＯ抗原を含むワクチン組成物に対する免疫応答は、血清型間で異なる場合がある。したがって、当該技術分野においてＥｘＰＥＣに対するワクチンのための必要性が存在し続けている。特に、ＥｘＰＥＣ Ｏ７５血清型及びＥｘＰＥＣ中で普及している他の血清型に対する有効な免疫防御をもたらすために使用され得る表面多糖に基づくＥｘＰＥＣワクチンのための必要性が存在している。
驚くべきことに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原は、臨床試験において同じ濃度で他のＯ抗原を有する組成物中のキャリアタンパク質にそれぞれ共有結合されるＯ抗原のコンジュゲートとして試験されるとき、他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原（例えば、Ｏ１、Ｏ２、及びＯ６）より免疫原性が低いように見えることが発見されている。適切な用量及び比で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原のコンジュゲート及び１つ以上の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のコンジュゲートを含有する組成物によるワクチン接種は、ＥｘＰＥＣ Ｏ７５血清型及び１つ以上の追加のＥｘＰＥＣ Ｏ血清型に対する免疫応答の向上をもたらす。
したがって、第１の一般的な態様において、本明細書では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物であって、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５及びＯ２５抗原多糖の各々の濃度が、独立して、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度と比較して高い組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、Ｏ７５抗原多糖の濃度と、独立してＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度との重量比は、約１．５：１～約２．５：１である。
ある特定の実施形態では、Ｏ７５抗原多糖の濃度と、独立してＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度との重量比は、約２：１である。
第２の一般的な態様において、本明細書では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物であって、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖の濃度の重量比が、約１：５：１～約４：１である組成物が提供される。好ましくは、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６の濃度との重量比は、約２：１である。
ある特定の実施形態では、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ４、Ｏ１５、Ｏ１６及び／又はＯ１８抗原多糖の濃度との重量比は、約１．５：１～約４：１である。好ましくは、Ｏ７５抗原多糖の濃度のＯ４、Ｏ１５、Ｏ１６及び／又はＯ１８抗原多糖の濃度との重量比は、約２：１である。
第３の一般的な態様において、本明細書では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物であって、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５及びＯ２５抗原多糖の各々の濃度が、独立して、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度と比較して高く、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖の濃度との重量比が、約１．５：１～約４：１である組成物が提供される。好ましくは、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖の濃度との重量比は、約２：１である。
第１、第２及び第３の一般的な態様のある特定の実施形態がここで記載される。
ある特定の実施形態では、組成物中のＯ７５抗原多糖の濃度とＯ２５抗原多糖の濃度との重量比は、約１：１である。
ある特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の濃度の重量比は、１：１：１：１：１：１：１：２：２である。
ある特定の実施形態では、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４はグルコシル化されており、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂであり、
（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１Ａ）の構造を含み、
（ｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ２）の構造を含み、
（ｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含み、
（ｉｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ６Ａ）の構造を含み、
（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１５）の構造を含み、
（ｖｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１６）の構造を含み、
（ｖｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１８Ａ）の構造を含み、
（ｖｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含み、及び
（ｉｘ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ７５）の構造を含み、
各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。
ある特定の実施形態では、Ｏ７５抗原多糖の濃度は、約８～約６４μｇ／ｍＬ、好ましくは、約８～約５０μｇ／ｍＬ、好ましくは、約１２～約４０μｇ／ｍＬ、好ましくは、約１６～約３２μｇ／ｍＬ、好ましくは、約２８～約３６μｇ／ｍＬ、好ましくは、約３２μｇ／ｍＬである。
ある特定の実施形態では、組成物中に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６からなる。
ある特定の実施形態では、組成物はさらに、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含み、好ましくは、少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ８）を有するＯ８抗原多糖を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。
ある特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）又はＣＲＭ１９７、好ましくは、ＥＰＡである。好ましくは、キャリアタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する１～１０個、又は２～４個などの１～２０個のグリコシル化コンセンサス配列、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列を含む。より好ましくは、キャリアタンパク質は、４個のグリコシル化コンセンサス配列を含む。最も好ましくは、各キャリアタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡである。
ある特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲーション又は化学的コンジュゲーションによってキャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲーションによってキャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、多糖は、キャリアタンパク質中のグリコシル化部位におけるＡｓｎ残基に共有結合的に連結されている。
別の態様では、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に本発明の組成物を投与することを含む方法が提供される。
さらなる態様では、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖の各々の有効量を投与することを含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５及びＯ２５抗原多糖の各々の有効量が、独立して、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々と比較して高い方法が提供される。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、Ｏ７５抗原多糖の有効量は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々に対して独立して約１．５：１～約２．５：１、好ましくは、約２：１の重量比で投与される。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、Ｏ７５抗原多糖の有効量は、Ｏ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖に対して独立して約１．５：１～約４：１、好ましくは、約２：１の重量比で投与され、好ましくはさらに、有効量のＯ７５抗原多糖は、Ｏ２５抗原多糖に対して約１：１の重量比で投与される。
別の態様では、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖の各々の有効量を投与することを含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖の有効量が、Ｏ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖に対して独立して約１．５：１～約４：１の重量比で投与される方法が提供される。Ｏ７５抗原多糖の有効量は、好ましくは、Ｏ２５抗原多糖に対して約１：１の重量比で投与され得る。好ましくは、Ｏ７５抗原多糖の有効量は、Ｏ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖に対して独立して約２：１の重量比で投与される。
本発明のいずれかの方法の態様の実施形態が下で提供される。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、免疫応答は、対象において侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防し、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患は、敗血症及び／又は菌血症を含む。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４はグルコシル化されており、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂである。好ましくは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖は、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造をそれぞれ含み、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の重量比は、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、対象に投与される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖は、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６からなる。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、対象に投与される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖はさらに、それぞれ独立してキャリアタンパク質に共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含む。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、対象は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくはＥｘＰＥＣ）感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクがあるヒトである。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、投与当たり８～１６μｇ、好ましくは、約１６μｇのＯ７５抗原多糖が投与される。
本発明の方法によるある特定の実施形態では、Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の投与された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の有効量は、１：１：１：１：１：１：１：２：２の重量比で投与される。
上述の概要及び下記の本発明の詳細な説明は、添付した図面と共に読む場合により十分に理解されるであろう。本発明が図面に示す明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
図１：ニュージーランドホワイトラビットにおけるＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンによって誘導される抗体応答を示す。動物は、２週間隔で投与されるＥｘＰＥＣ１０Ｖ又は生理食塩水により３回の筋肉内免疫化を受けた。ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンは、３種の異なる濃度で投与され（群１：高用量、群２：中用量及び群３：低用量、表１１）、対照群は、生理食塩水のみを受容した（群４、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液）。抗体レベルは、０日目（ワクチン接種前）並びに１４、２７及び４２日目（ワクチン接種後）にＥＬＩＳＡによって測定された。個々の力価（ＥＣ５０力価）及び幾何平均力価（ＧＭＴ）±９５％ ＣＩが示される。多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うウィルコクソン順位和検定。生理食塩水対照（群４）に対するＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチン接種された動物（群１、２及び３）の比較。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。ＬＯＤ：検出限界。 （上記の通り。） 図２：ＥｘＰＥＣ１０Ｖによって誘導される抗体応答を示す。ニュージーランドホワイトラビットは、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ（１０５．６μｇの総多糖）又は０．９％ ｗ／ｖ塩化ナトリウム（対照）による３回の筋肉内の免疫化を受けた。ＩｇＧ力価は、１日目（免疫化前、ｎ＝２０／群）、３１日目（免疫化後、ｎ＝２０／群）及び５０日目（免疫化後、ｎ＝１０／群）にＥＬＩＳＡによって決定された。プロットは、各群に関する個々の力価及び幾何平均±９５％信頼区間を示す。ＥｘＰＥＣ１０Ｖと対照群の間のＩｇＧ力価における差は、尤度比検定によるトービットモデルを使用して解析された。≦０．０５のＰ値が有意であるとみなされた。＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。 （上記の通り。） 図３：ヒトにおけるＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンによる第１／２ａ相臨床試験のための全体的な試験デザインを示す。図３Ａは、コホート１のための全体的な試験デザインを示し、図３Ｂは、コホート２のための全体的な試験デザインを示す。詳細については実施例７を参照されたい。 （上記の通り。） ＢＡＣ１００１臨床試験においてベースライン（１日目）から測定されるとおりのワクチン接種後１５日目の血清Ｏ抗原特異的抗体力価における少なくとも２倍の増加を有する参加者のパーセンテージを示す（詳細については実施例７を参照されたい）。Ｏ抗原特異的血清抗体力価は、ＥＣＬ系イムノアッセイによって測定された。 ＢＡＣ１００１臨床試験においてベースライン（１日目）から測定されるとおりのワクチン接種後１５日目の血清オプソニン作用抗体力価における少なくとも２倍の増加を有する参加者のパーセンテージを示す（詳細については実施例７を参照されたい）。血清オプソニン作用抗体のレベルは、ＭＯＰＡによって測定された。 図６：ニュージーランドホワイトラビットにおけるＥｘＰＥＣワクチンの異なる組成物によって誘導される血清抗体レベル（総ＩｇＧ）を示す。詳細については実施例８を参照されたい。グラフは、個々の力価（ＥＣ５０力価）及び幾何平均力価（ＧＭＴ）±９５％信頼区間を示す。生理食塩水対照に対するワクチン群間の比較は、尤度比検定によるトービットモデルを使用して統計的に評価され、多重比較のためのボンフェローニ補正が使用され、≦０．０５のｐ値が、統計的に有意であるとみなされた。＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。 （上記の通り。）
背景技術及び本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文、及び特許が引用又は説明されているが、これらの参照文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の文脈を提供することを目的とする。そのような考察は、これらの内容のいずれか又は全てが、開示されている、又は特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で引用される特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。本明細書で使用される場合及び添付した特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の各要素に関すると理解すべきである。
用語「約」は、数字とともに使用される場合、言及された数の±１０％、例えば、±５％、又は±１％内の任意の数を指す。
当業者は、通例の実験だけを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識することになるか、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明に包含されるものとする。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、「含む」という語句、並びに「含む」及び「含んでいる」などの変形形態は、規定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外するものではないことを意味することが理解されよう。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「含有する」若しくは「包含する」という用語に置き換えられ得るか、又は本明細書で使用される場合に「有する」という用語に置き換えられ得ることもある。
本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素において規定されていない任意の要素、工程又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲の基本的な特徴及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外するものではない。上記の「含む」、「含有する」、「包含する」及び「有する」という用語のいずれも、本発明の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用される場合には常に、「～からなる」又は「本質的に～からなる」という用語に置き換えられて、本開示の範囲を変更し得る。
本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間を接続する「及び／又は」という用語は、個々の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものと理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１選択肢は第２要素を伴わない第１要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を含まない第２の要素を適用することを指す。第３の選択肢は、第１の要素及び第２の要素を共に適用することを指す。これらの選択肢のいずれか１つは、本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語の意味の範囲内に含まれ、したがって「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。複数の選択肢を同時に適用することは、「及び／又は」という用語の意味の範囲内に含まれ、したがって「及び／又は」という用語の要件を満たすものとも理解される。
本明細書で使用する場合、「Ｏ多糖」、「Ｏ抗原」、「Ｏ抗原」、「Ｏ抗原多糖」、「Ｏ多糖抗原」及び略語「ＯＰＳ」という用語は全て、グラム陰性細菌のＯ抗原を指し、これは、リポ多糖（ＬＰＳ）の成分であり、グラム陰性細菌の各血清型又は血清（亜）型に特異的である。Ｏ抗原は通常、２～７個の糖残基の繰り返し単位（ＲＵ）を含有する。本明細書で使用する場合、ＲＵは、生物学的反復単位（ＢＲＵ）と一致する。ＢＲＵは、インビボで合成されるＯ抗原のＲＵを表す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の異なる血清型が、異なるＯ抗原を発現する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、Ｏ抗原新生に関与する遺伝子産物は、ｒｆｂ遺伝子クラスターによってコードされる。本明細書でＯ抗原多糖を参照する際は常に、別段の指示がない限り、それぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型及びその任意の既存の亜血清型のＯ抗原多糖が意味され、例えば、Ｏ１抗原多糖を参照するとき、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）亜血清型Ｏ１Ａ、Ｏ１Ａ１、Ｏ１Ｂ、又はＯ１ＣのＯ抗原多糖であり得る一方で、Ｏ２５抗原多糖は、Ｏ２５Ａ又はＯ２５Ｂ抗原多糖などを意味し得る。多くの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型及び亜血清型並びにそのＯ抗原多糖のＲＵ（部分構造、又はＯ単位）の対応する構造は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２０／０３９３５９号パンフレットの表１において提供される。
本明細書で使用する場合、「ｒｆｂクラスター」及び「ｒｆｂ遺伝子クラスター」は、Ｏ抗原骨格構造を合成することができる酵素機構をコードする遺伝子クラスターを指す。ｒｆｂクラスターという用語は、Ｏ抗原生合成クラスターに適用することができ、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の遺伝子クラスターを指す。
本明細書で使用する場合、用語「Ｏ１Ａ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ１Ａ抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１の亜血清型）を指す。用語「Ｏ２」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ２抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２）を指す。用語「Ｏ４」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ４抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ４）を指す。用語「Ｏ６Ａ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ６Ａ抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６の亜血清型）を指す。用語「Ｏ８」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ８抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８）を指す。用語「Ｏ１５」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ１５抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１５）を指す。用語「Ｏ１６」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ１６抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１６）を指す。用語「Ｏ１８Ａ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ１８Ａ抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１８の亜血清型）を指す。用語「Ｏ２５Ｂ」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ２５Ｂ抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５の亜血清型）を指す。用語「Ｏ７５」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ７５抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ７５）を指す。本明細書で使用する場合、用語「グルコシル化Ｏ４」、「グルコース－分岐状Ｏ４」、「Ｏ４ Ｇｌｃ＋」及び「Ｇｌｃ＋Ｏ４」Ｏ抗原は、グルコース側枝を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ４ Ｏ抗原（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ４）を指すが、「非グルコシル化Ｏ４」、「Ｏ４ Ｇｌｃ－」、及び「Ｇｌｃ－Ｏ４」は、グルコース側枝を有しないＯ４抗原を指す。
本明細書を通して参照されるいくつかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の構造は、表１において下で示される。各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖類の単一の繰り返し単位が示される。
本明細書に記載される全ての単糖は、当該技術分野で知られるそれらの共通の意味を有する。単糖は、Ｄ又はＬ配置を有し得る。Ｄ又はＬが指定されない場合、糖は、Ｄ配置を有することが理解される。単糖は通常、当該技術分野で一般的に知られ、使用される略称によって参照される。例えば、Ｇｌｃは、グルコースを指し；Ｄ－Ｇｌｃは、Ｄ－グルコースを指し；Ｌ－Ｇｌｃは、Ｌ－グルコースを指す。単糖のための他の一般的な略称としては、Ｒｈａ、ラムノース；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ－アセチルグルコサミン；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ－アセチルガラクトサミン；Ｆｕｃ、フコース；Ｍａｎ、マンノース；Ｍａｎ３Ｍｅ、３－Ｏ－メチル－マンノース；Ｇａｌ、ガラクトース；ＦｕｃＮＡｃ、Ｎ－アセチルフコサミン；及びＲｉｂ、リボースが挙げられる。接尾辞「ｆ」はフラノースを指し、接尾辞「ｐ」はピラノースを指す。
用語「ＲＵ」、「反復単位」、及び「繰り返し単位」は、Ｏ抗原に関して使用される場合、それが細胞機構（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）によってインビボで合成されるため、Ｏ抗原の生物学的反復単位（ＢＲＵ）を指す。Ｏ抗原のＲＵの数は、血清型毎に変動する場合があり、本発明の実施形態において、典型的には、約１～１００個のＲＵ、好ましくは、約１～５０個のＲＵ、例えば、１～５０個のＲＵ、１～４０個のＲＵ、１～３０個のＲＵ、１～２０個のＲＵ、及び１～１０個のＲＵ、より好ましくは、少なくとも３個のＲＵ、少なくとも４個のＲＵ、少なくとも５個のＲＵ、例えば、３～５０個のＲＵ、好ましくは、５～４０個のＲＵ、好ましくは、５～３０個のＲＵ、例えば、７～２５個のＲＵ、例えば、１０～２０個のＲＵで変動する。しかしながら、いくつかの例では、Ｏ抗原のＲＵの数は、１～２個であり得る。本明細書に具体的に記載される各Ｏ抗原の構造は、１個のＲＵを含有して示され、変数「ｎ」はＲＵの数を指定する。本発明のバイオコンジュゲートにおける各Ｏ抗原多糖において、ｎは、独立して、１～１００、例えば、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、好ましくは、少なくとも３、より好ましくは、少なくとも５、例えば、３～５０、好ましくは、５～４０（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０）、より好ましくは、５～３０の整数であるが、いくつかの例では、１～２であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは、独立して、約７～２５、例えば、１０～２０の整数である。値は、組成物中の個々のＯ抗原多糖間で変動してもよく、平均値として本明細書で提供され、すなわち、バイオコンジュゲートが独立して５～４０の整数であるｎを有するものとして本明細書で記載される場合、組成物は、５～４０個の反復単位を有するＯ抗原多糖の大部分を含有するが、５個未満の反復単位又は４０個より多い反復単位を有するいくつかのＯ抗原多糖も含有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「コンジュゲート」及び「グリココンジュゲート」は、タンパク質、ペプチド、脂質などを含むがこれらに限定されない別の化学種に連結された糖又は糖類抗原（例えば、オリゴ糖及び多糖）－タンパク質コンジュゲートを指す。グリココンジュゲートは、例えば、タンパク質及び糖又は糖類抗原の化学的（合成的）結合によって化学的に調製され得る。グリココンジュゲートという用語はバイオコンジュゲートも含む。
本明細書で使用する場合、本発明の実施形態による方法において対象にＯ抗原を投与する文脈における用語「有効量」は、対象において所望の免疫効果又は免疫応答を誘導するのに十分なＯ抗原の量を指す。ある特定の実施形態では、「有効量」は、対象において以下の効果の１つ以上を達成するために対象において免疫をもたらすのに十分なＯ抗原の量を指す：（ｉ）ＥｘＰＥＣ感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患、又はそれと関連する症状の発達又は発症を予防する；（ｉｉ）ＥｘＰＥＣ感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患、又はそれと関連する症状の再発を予防する；（ｉｉｉ）ＥｘＰＥＣ感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患、又はそれと関連する症状の重症度を予防するか、減少させるか又は寛解させる；（ｉｖ）ＥｘＰＥＣ感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患、又はそれと関連する症状の持続を減少させる；（ｖ）ＥｘＰＥＣ感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患、又はそれと関連する症状の進行を予防する；（ｖｉ）ＥｘＰＥＣ感染又はそれと関連する症状の退行を引き起こす；（ｖｉｉ）ＥｘＰＥＣ感染と関連する臓器不全を予防するか又は低減する；（ｖｉｉｉ）ＥｘＰＥＣ感染を有する対象の入院の機会又は頻度を減少させる；（ｉｘ）ＥｘＰＥＣ感染を有する対象の入院期間を減少させる；（ｘ）ＥｘＰＥＣ感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有する対象の生存時間を増加させる；（ｘｉ）ＥｘＰＥＣ感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を除去する；（ｘｉｉ）ＥｘＰＥＣ複製を阻害するか又は減少させる；及び／又は（ｘｉｉｉ）別の療法の予防又は治療効果を増強するか又は向上させる。
「有効量」は、対象の健康状態、年齢、体重、健康など；経口又は非経口などの投与経路；標的Ｏ抗原、他の同時投与されるＯ抗原、アジュバントなどの投与される組成物；及び免疫が望まれる特定の疾患などの様々な要因に応じて変動し得る。Ｏ抗原がタンパク質キャリアに共有結合されるとき、Ｏ抗原のための有効量は、コンジュゲートにおけるＯ抗原多糖部分のみに基づいて計算される。本明細書に記載されるとおりのバイオコンジュゲートを含むコンジュゲートの全ての濃度、量、及び比もまた、別段の指示がない限り、任意のコンジュゲートされたキャリアタンパク質の濃度、量、又は比にかかわらずコンジュゲート中のＯ抗原多糖部分の重量にのみ基づいて計算される。例えば、１６μｇの特定のバイオコンジュゲートの投与は、投与されるバイオコンジュゲートが、１６μｇの特定のＯ抗原多糖を含み、コンジュゲートされたキャリアタンパク質の量は、この数に含まれない。別の例では、組成物が、２：１の比で血清型Ａ及びＢ由来のＯ抗原多糖のコンジュゲートを含むと言われる場合、それは、コンジュゲートされたＯ抗原多糖の重量に基づくコンジュゲートされたＯ抗原多糖Ｂのものの２倍のコンジュゲートされたＯ抗原多糖の濃度又は量が存在することを示し、組成物中のコンジュゲートされたキャリアタンパク質の重量を無視する。
用語「侵襲性腸管外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）疾患（ＩＥＤ）」は、本明細書で使用する場合、全身性の細菌感染と一致する急性疾患であり、血液又は他の正常な無菌の身体部位からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の単離及び同定、又は侵襲性疾患（全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症又は敗血症性ショック）の徴候及び症状の存在を有し及び他の識別可能な感染源のない患者における尿からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の単離及び同定のいずれかによって微生物学的に確認される。ある特定の実施形態では、ＩＥＤは、全身性の細菌感染と一致する急性疾患であり、（ｉ）血液又は他の正常な無菌の身体部位からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の単離及び同定、又は（ｉｉ）尿路及び／又は男性の生殖器から生じる感染に応答した調節不全にされた宿主応答に起因する生命を脅かす臓器障害を有し及び他の識別可能な感染源のない患者における尿からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の単離及び同定のいずれかによって微生物学的に確認される。
ＩＥＤは、尿路感染症（ＵＴＩ）、手術部位感染、腹部感染又は骨盤内感染、肺炎、骨髄炎、蜂巣炎、敗血症、菌血症、創傷感染、腎盂腎炎、前立腺生検関連感染（経直腸的超音波ガイド前立腺針生検［ＴＲＵＳ－ＰＮＢ］関連感染など）、尿路性敗血症、髄膜炎、腹膜炎、胆管炎、軟部組織感染、化膿性筋炎、化膿性関節炎、眼内炎、化膿性甲状腺炎、副鼻腔炎、心内膜炎、好中球減少性発熱、及び前立腺炎（急性細菌前立腺炎［ＡＢＰ］を含むがこれに限定されない）を含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。
ある特定の好ましい実施形態では、ＩＥＤは、敗血症を含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＩＥＤは、菌血症を含む。本発明は、ある特定の実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって引き起こされる敗血症を予防するための本発明による組成物を提供する。本発明は、ある特定の実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって引き起こされる菌血症を予防するための本発明による組成物を提供する。
用語「敗血症のための判定基準を満たすＩＥＤ事象」は、感染に対して調節不全にされた宿主応答に起因する生命を脅かす臓器障害のエビデンスを含むＩＥＤ症例を示す。ＩＥＤの症例は、ベースラインから２点以上の全体の逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアにおける急性の変化が存在し、ＩＥＤが原因で生じたとみなされる場合に敗血症のための判定基準を満たしている。本発明は、ある特定の実施形態において、敗血症のための判定基準を満たすＩＥＤを予防するための本発明による組成物を提供する。用語「尿路性敗血症」は、本明細書で使用する場合、腎尿路生殖器路及び／又は男性の生殖器から生じる感染によって引き起こされる敗血症である。
用語「菌血症ＩＥＤ」は、血液からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の単離及び同定を含むＩＥＤ症例である。本発明は、ある特定の実施形態において、菌血症ＩＥＤを予防するための本発明による組成物を提供する。
本明細書で使用する場合、抗原又は組成物に対する「免疫学的反応」又は「免疫反応」は、対象中における、この抗原又はこの組成物中に存在する抗原に対する体液性の及び／又は細胞性の免疫反応の発生を指す。
本明細書で使用する場合、２種以上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含む「組成物」は、同じ医薬組成物において２種以上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含む単一の医薬組成物、又は別々の医薬組成物において２種以上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含む２種以上の医薬組成物の組み合わせであり得る。好ましい実施形態では、組成物は、単一の医薬組成物である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導する方法において、２種以上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含む「組成物」は、２種以上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含む単一の医薬組成物と合わせて必要とする対象に投与され得るか、又は別々の医薬組成物と組み合わせて対象に投与され得る。好ましい実施形態では、単一の医薬組成物が、対象に投与される。
本明細書で使用する場合、２種以上のＯ抗原又は組成物の対象への投与の文脈における用語「組み合わせて」又は「～の組み合わせ」は、Ｏ抗原又は組成物が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第１の組成物は、対象への第２の組成物の投与前（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、１６時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前、若しくは１２週間前）に、投与と同時に、又は投与に続いて（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、１６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、若しくは１２週間後に）投与され得る。好ましくは、２種以上のＯ抗原は、本質的に同時に、例えば、互いに５分位内に対象に投与され、より好ましくは、２種以上のＯ抗原は、同じ時点での少なくとも２つの組成物の投与を介して、最も好ましくは２種以上のＯ抗原を含む単一の組成物の投与を介して同時に投与される。
本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態による方法又は組成物によりワクチン接種されることになるか又はワクチン接種されているあらゆる動物を意味しており、好ましくは哺乳動物を意味しており、最も好ましくはヒトを意味している。「哺乳動物」という用語は、本明細書で使用される場合、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例として、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなどが挙げられるが、これらに限定されず、最も好ましくはヒトが挙げられる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
用語「配列同一性のパーセント（％）」又は「％同一性」は、アミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較して、２つ以上の整列させたアミノ酸配列の同一のアミノ酸の一致する（「ヒットする」）数を指す。言い換えると、配列が当該技術分野において既知である配列比較アルゴリズムを使用して測定される際に最大限の一致に対して比較され整列させる場合、又は手動で整列させ視覚的に検証される場合、アラインメントを使用して、２つ以上の配列について、同一のものである（例えば、９０％、９５％、９７％又は９８％の同一性）アミノ酸残基の百分率が決定されてもよい。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なってもよい。タンパク質配列を整列させるための好適なプログラムは、当業者に知られている。タンパク質配列の配列同一性のパーセンテージは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、又は例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴなどのプログラムにより決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。
例えば、アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当該術分野で知られる標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより、又は目視により決定され得る。ある特定の実施形態では、同一性パーセントは、以下のパラメーターに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から入手したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されるとおりのギャップ付きＢＬＡＳＴである。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原
驚くべきことに、キャリアタンパク質にコンジュゲートされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原は、多価ワクチン組成物において同じ多糖濃度でキャリアタンパク質にコンジュゲートされる他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６及びＯ１８Ａ）より少ない免疫原性になるように見えることが本発明において発見されている。この発見は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原の投与量及び多価ワクチン内の様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原の投与量比へのさらなる調査につながり、したがって、Ｏ７５血清型及びＥｘＰＥＣの他の血清型に対する向上した免疫応答のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に基づく多価ワクチンの開発及び免疫化方法につながった。
本発明の実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖及び１つ以上の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖に関する組成物及び方法に関する。好ましくは、１種以上の追加のＯ抗原が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の臨床分離株間で普及している。本発明において使用され得るそのような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２５抗原が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５血清型に加えて複数の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫防御をもたらすために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原などの２種以上の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含み得る。いくつかの実施形態では、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１８及びＯ２５抗原からなる群から選択される 好ましい実施形態では、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ２５Ｂからなる群から選択される。より好ましくは、組成物は、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ２５Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原の全てを含む特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は、表１に示されるとおりの構造を含み、ｎは、１～１００の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。
一実施形態では、本発明の組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の濃度の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～４：１、より好ましくは、約２：１、例えば、１：５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１又は２．５：１である。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４はグルコシル化されており、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂである。
本発明において有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は、本開示を鑑みて当該技術分野で知られる方法によって生成され得る。例えば、それらは、細胞、好ましくは、Ｏ抗原の生合成に最適化されている組換え細胞から生成され得る。例えば、開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／１１９９８７号パンフレット、国際公開第２００９／１０４０７４号パンフレット、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３７３９号、Ｉｈｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ９，６１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原生合成に関する核酸、タンパク質、宿主細胞、生成方法などに対する関連する開示を参照されたい。
キャリアタンパク質
本発明の実施形態によれば、各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は、キャリアタンパク質に、好ましくはグリコシド結合によって共有結合的に結合される。本開示の観点から、当業者に知られている任意のキャリアタンパク質を使用することができる。好適なキャリアタンパク質としては、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、ＣＲＭ１９７、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄが挙げられるが、これらに限定されない。必要となるコンセンサスグリコシル化配列を含有する様々な異なるキャリアタンパク質とのバイオコンジュゲーションが記載されており、広範なタンパク質がこの技術を使用してグリコシル化され得ることを示している（例えば、バイオコンジュゲーションにおいて首尾よく使用された多種多様のキャリアタンパク質をともに示す国際公開第０６／１１９９８７号パンフレット、国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレット、国際公開第２０１５／１５８４０３号パンフレット、国際公開第２０１５／８２５７１号パンフレット、国際公開第２０１７／２１６２８６号パンフレット、及び国際公開第２０１７／６７９６４号パンフレットを参照のこと）。
ある特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、修飾され、例えば、タンパク質が、毒性が少なく及び／又はグリコシル化しやすいように修飾される。特定の実施形態では、本明細書で使用されるキャリアタンパク質は、キャリアタンパク質におけるグリコシル化部位の数が、例えば、免疫原性組成物、特に、そのバイオコンジュゲート形態において投与されることになるタンパク質のより低い濃度を可能にする様式で最大化されるように修飾される。
したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるキャリアタンパク質は、通常キャリアタンパク質と結合されることになるものより（例えば、その天然の／自然な、すなわち、「野生型」状態においてキャリアタンパク質と結合されるグリコシル化部位の数と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上多いグリコシル化部位を含むように修飾される。キャリアタンパク質へのグリコシル化部位の導入は、例えば、グリコシル化部位が完全に又は部分的に付加されるようにタンパク質の一次構造に新規のアミノ酸を付加することによって、又はグリコシル化部位を生成するためにタンパク質において既存のアミノ酸を変異させることによって、タンパク質の一次構造における任意の場所へのグリコシル化コンセンサス配列の挿入によって達成され得る。当業者は、タンパク質のアミノ酸配列が、当該技術分野で知られる手法、例えば、タンパク質をコードする核酸配列の修飾を含む組換え手法を使用して容易に修飾され得る。特定の実施形態では、グリコシル化コンセンサス配列は、タンパク質のＮ若しくはＣ末端にあるキャリアタンパク質の特定の領域、例えば、タンパク質の表面構造、及び／又はタンパク質の基部にあるジスルフィド架橋によって安定化されるループにおいて導入される。いくつかの実施形態では、グリコシル化コンセンサス配列は、より効率的なグリコシル化のためにリジン残基の付加によって伸長され得る。
キャリアタンパク質に挿入され得るか又はキャリアタンパク質において生成され得るグリコシル化コンセンサス配列の例示的な例としては、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）（配列番号１）；及び好ましくは、Ａｓｐ（Ｇｌｕ）－Ｘ－Ａｓｎ－Ｚ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（Ｘ及びＺは、独立して、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸から選択される）（配列番号２）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖は、キャリアタンパク質におけるアスパラギン（Ａｓｎ）残基に共有結合的に連結され（例えば、Ｎ結合）、Ａｓｎ残基は、配列番号１を有する、より好ましくは配列番号２を有するグリコシル化コンセンサス配列を含むグリコシル化部位に存在する。通常、キャリアタンパク質は、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列、及びより好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有するグリコシル化コンセンサス配列を含む１～１０個のグリコシル化部位、好ましくは２～４個のグリコシル化部位、最も好ましくは４個のグリコシル化部位、例えば、１～１０個、好ましくは２～４個、及びより好ましくは４個のグリコシル化部位を含む。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａである。ＥＰＡについては、様々な無毒化タンパク質バリアントが文献に記載されており、キャリアタンパク質として使用することができる。例えば、無毒化は、Ｌｕｋａｃ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，５６：３０９５－３０９８、及びＨｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ，２：８９－９８に従って触媒的に重要な残基Ｌ５５２Ｖ及びΔＥ５５３を変異させ及び欠失させることによって達成され得る。本明細書で使用する場合、「ＥＰＡ」は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａを指す。キャリアタンパク質がＥＰＡであるそれらの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、配列番号１を有するグリコシル化コンセンサス配列を含むグリコシル化部位においてＡｓｎ残基に共有結合的に連結することができ、好ましくは、配列番号２を有するグリコシル化コンセンサス配列を含むグリコシル化部位においてＡｓｎ残基に共有結合的に連結することができる。好ましくは、ＥＰＡキャリアタンパク質は、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列、及びより好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有するグリコシル化コンセンサス配列を含む１～１０個のグリコシル化部位、好ましくは２～４個のグリコシル化部位、最も好ましくは４個のグリコシル化部位、例えば、１～１０個、好ましくは２～４個、及びより好ましくは４個のグリコシル化部位を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＰＡキャリアタンパク質は、それぞれグリコシル化コンセンサス配列、例えば、配列番号２を有するグリコシル化コンセンサス配列を含むグリコシル化部位を含む４個のグリコシル化部位を含む。本明細書で使用する場合、「ＥＰＡ－４キャリアタンパク質」及び「ＥＰＡ－４」は、それぞれ配列番号２を有するグリコシル化コンセンサス配列を含む４個のグリコシル化部位を含む緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）キャリアタンパク質の無毒化外毒素Ａを指す。ＥＰＡ－４キャリアタンパク質の例示的な好ましい例は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡキャリアタンパク質である。
ある特定の実施形態では、ＥＰＡキャリアタンパク質は、キャリアタンパク質を発現する宿主細胞の細胞膜周辺腔にキャリアタンパク質を標的化するシグナル配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｓｂＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）などのためのシグナルペプチドなど）とともに生成され得る。ＥＰＡキャリアタンパク質はまた、「タグ」、すなわち、キャリアタンパク質の単離及び／又は同定を可能にするアミノ酸の配列に修飾され得る。
本発明において有用なＥＰＡキャリアタンパク質は、本開示を鑑みて当該技術分野で知られる方法によって生成され得る。例えば、開示が全体として参照により本明細書に組み込まれるＩｈｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ９，６１、並びに国際公開第２００６／１１９９８７号パンフレット、国際公開第２００９／１０４０７４号パンフレット、及び国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレットにおける関連する開示を参照されたい。
他の実施形態では、キャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７である。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不能である。ＣＲＭ１９７は、毒素産生性のコリネファージベータのニトロソグアニジン変異誘発によって作製される非毒素産生性のファージβ１９７ｔｏｘ－によって感染されたコリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって生成される（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９７１）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３３：８－１１）。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子における単一の塩基変化（グアニンからアデニン）によってそれとは異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質においてアミノ酸置換（グリシンに対するグルタミン酸）をもたらし、ジフテリア毒素の毒性特性を除去する。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖類のための安全で効果的なＴ細胞依存性キャリアである。ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２０に示される。ＣＲＭ１９７及びその生成についてのさらなる詳細は、例えば、米国特許第５，６１４，３８２号明細書において見出され得る。ある実施形態では、本発明のＯ抗原多糖は、ＣＲＭ１９７タンパク質又はＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートされる（中国特許第１０３４９５１６１号明細書を参照のこと）。ある実施形態では、本発明のＯ抗原多糖は、遺伝子組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現を介して得られるＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートされる（中国特許第１０３４９５１６１号明細書を参照のこと）。ある実施形態では、本発明のＯ抗原多糖は、それぞれ独立して、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる。ある実施形態では、本発明のＯ抗原多糖は、それぞれ独立して、ＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートされる。
コンジュゲート
用語「バイオコンジュゲート」は、宿主細胞バックグラウンド、好ましくは、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞（宿主細胞機構は、抗原をタンパク質に連結する（例えば、Ｎ結合））において調製されるタンパク質（例えば、キャリアタンパク質）と糖又は糖類抗原（例えば、オリゴ糖及び多糖）の間のコンジュゲートを指す。好ましくは、用語「バイオコンジュゲート」は、宿主細胞バックグラウンド（宿主細胞機構は、抗原をタンパク質に連結する（例えば、Ｎ結合））において調製されるタンパク質（例えば、キャリアタンパク質）とＯ抗原、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、Ｏ７５など）の間のコンジュゲートを指す。バイオコンジュゲートは、宿主細胞機構によって宿主細胞において調製されるため、抗原及びタンパク質は、グリコシド結合又はバイオコンジュゲートにおける結合を介して共有結合的に連結される。バイオコンジュゲートは、Ｏ抗原を合成し及び／又はＯ抗原を標的タンパク質に連結するのに必要な細胞機構を発現するために操作された組換え宿主細胞において調製され得る。本明細書に記載されるとおりのバイオコンジュゲートは、化学的に調製されるグリココンジュゲートを超える有利な特性を有し、グリカンは、バクテリア細胞壁から精製され、続いてキャリアタンパク質に化学的にカップリングされ、例えば、バイオコンジュゲートは、製造においてより少ない化学物質を必要とし、作製される最終生成物に関してより均一であり、より少ない遊離グリカンを含有するか又は遊離グリカンを含有しない（すなわち、キャリアタンパク質に結合されない）。リピドＡのないＯ抗原の精製及びその後のキャリアタンパク質への化学的コンジュゲーションは、冗長で面倒なプロセスである。さらに、精製、リピドＡ無毒化及び化学的コンジュゲーションプロセスは、エピトープの消失、抗原不均一性及びコンジュゲートされた多糖の免疫原性の低減をもたらし得る。バイオコンジュゲーションによるグリココンジュゲートの合成は、古典的な精製及び化学的コンジュゲーションのこれらの制約を克服することができる。したがって、典型的な実施形態では、バイオコンジュゲートは、化学的に生成されるグリココンジュゲートより好ましい。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原及びＥＰＡキャリアタンパク質を生成し、Ｏ抗原をＥＰＡキャリアタンパク質に共有結合的に結合して、本発明において有用なバイオコンジュゲートを形成することができる。例えば、開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｉｈｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ９，６１、並びに国際公開第２００６／１１９９８７号パンフレット、国際公開第２００９／１０４０７４号パンフレット、及び国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレットにおける関連する開示を参照されたい。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、本発明において有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原にＮ結合される。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）（配列番号２）、好ましくは、Ａｓｐ（Ｇｌｕ）－Ｘ－Ａｓｎ－Ｚ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（Ｘ及びＺは、独立して、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸から選択される）（配列番号３）などのキャリアタンパク質のグリコシル化配列におけるＡｓｎ残基に連結される。
或いは、グリココンジュゲートは、化学合成によって調製され得る、すなわち、宿主細胞の外部（インビトロ）で調製され得る。例えば、本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原、例えば、Ｏ７５抗原は、多糖／オリゴ糖及びタンパク質キャリアにおける活性化反応性基を使用する手段によるものを含む、当業者に知られる方法を使用してキャリアタンパク質にコンジュゲートされ得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるＰａｗｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１８７３－１８８５；及びＲｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：７９７４－７９７８を参照されたい。そのような手法は、宿主細胞からの抗原性多糖／オリゴ糖の抽出、多糖／オリゴ糖を精製すること、多糖／オリゴ糖を化学的に活性化させること、及び多糖／オリゴ糖をキャリアタンパク質にコンジュゲートすることを含む。キャリアタンパク質への化学的コンジュゲーションを使用してキャリアタンパク質にコンジュゲートされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のグリココンジュゲート、及びそのようなグリココンジュゲートを含む組成物を作製する方法はまた、国際公開第２０２０／０３９３５９号パンフレットにおいて記載されている。
例えば、コンジュゲートは、ＣＤＡＰ化学反応を使用して調製され得る。これらの実施形態では、多糖は、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化されてシアン酸エステルを形成する。次に、活性化された多糖は、直接的に又はスペーサー（リンカー）基を介してキャリアタンパク質（例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７）上のアミノ基にカップリングされる。例えば、スペーサーは、マレイミド活性化キャリアタンパク質（例えば、Ｎ－［γ－マレイミドブチルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ））又はハロアセチル化キャリアタンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、Ｎ－スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ－ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、又はスクシンイミジル３－［ブロモアセトアミド］プロプリオネート（ＳＢＡＰ））との反応後に得られるチオエステル結合を介してキャリアにカップリングされ得るチオール化多糖を得るためにシスタミン又はシステアミンであり得る。好ましくは、シアン酸エステル（任意選択によりＣＤＡＰ化学反応により作製される）は、ヘキサンジアミン又はアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングされ、アミノ誘導体化糖は、タンパク質キャリア上のカルボキシル基を介するカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣ又はＥＤＣ）化学反応を使用してキャリアタンパク質（例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７）にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートは、例えば、国際公開第９３／１５７６０号パンフレット、国際公開第９５／０８３４８号パンフレット及び国際公開第９６／１２９０９４号パンフレットにおいて記載される。
コンジュゲーションのための他の好適な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。多くが国際公開第９８／４２７２１号パンフレットに記載される。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９７９）１．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２－２５７４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９－５１８）に続く、カルバミン酸結合を形成するためのタンパク質との反応によって形成され得るカルボニルリンカーを含み得る。これは、アノマー末端の第一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意選択の保護／脱保護、ＣＤＩカルバミン酸中間体を形成するための第一級ヒドロキシル基とＣＤＩの反応及びタンパク質上のアミノ基とＣＤＩカルバミン酸中間体のカップリングを含み得る。
他の実施形態では、コンジュゲートは、還元的アミノ化を使用して調製される。還元的アミノ化は、２つの工程、（１）多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成するための活性化多糖及びキャリアタンパク質の還元を含む。酸化の前に、多糖は任意選択により加水分解される。機械的又は化学的加水分解が利用され得る。化学的加水分解は、酢酸を使用して実行され得る。
酸化工程は、過ヨウ素酸塩との反応を含み得る。本発明の目的のために、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸の両方を含み；その用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）及びオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方を含み、過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム及び過ヨウ素酸カリウム）を含む。ある実施形態では、莢膜多糖は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化される。別の実施形態では、莢膜多糖は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化される。
ある実施形態では、酸化剤は、第一級ヒドロキシルを選択的に酸化する酸化体の存在下でピペリジン－Ｎ－オキシ又はピロリジン－Ｎ－オキシ化合物などの安定なニトロキシル又はニトロキシドラジカル化合物である（国際公開第２０１４／０９７０９９号パンフレットに記載されるとおり）。前記反応において、実際の酸化体は、触媒サイクルにおいてＮ－オキソアンモニウム塩である。ある態様では、前記安定なニトロキシル又はニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン－Ｎ－オキシ又はピロリジン－Ｎ－オキシ化合物である。ある態様では、前記安定なニトロキシル又はニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）又はＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を有する。ある態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ又はその誘導体である。ある態様では、前記酸化体は、Ｎ－ハロ部分を有する分子である。ある態様では、前記酸化体は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシアヌル酸及び１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオンからなる群から選択される。好ましくは、前記酸化体は、Ｎ－クロロスクシンイミドである。
任意選択により、酸化反応は、消去剤の添加によってクエンチされる。消去剤は、ビシナルジオール、１，２－アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩又は亜リン酸（グリセロール、エチレングリコール、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，２－ジオール又はブタン－２，３－ジオール、アスコルビン酸など）から選択される。
多糖の酸化工程の後、多糖は活性化されたと言われ、本明細書の下で「活性化多糖」と称される。活性化多糖及びキャリアタンパク質は、独立して（別々の凍結乾燥）又は合わせて（共凍結乾燥）凍結乾燥され得る。一実施形態では、活性化多糖及びキャリアタンパク質は、共凍結乾燥される。別の実施形態では、活性化多糖及びキャリアタンパク質は、独立して凍結乾燥される。
一実施形態では、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行われ、考えられる非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトール及びパラチニットが挙げられる。
コンジュゲーションプロセスの第２の工程は、還元剤を使用するコンジュゲートを形成するための活性化多糖及びキャリアタンパク質の還元（還元的アミノ化と呼ばれる）である。好適である還元剤としては、シアノ水素化ホウ素（ブレンステッド又はルイス酸の存在下でのシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム又は水素化ホウ素ナトリウム若しくは水素化ホウ素亜鉛など）、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３若しくは５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）などのアミンボラン又はボロヒドリド交換レジンが挙げられる。一実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
ある実施形態では、還元反応は、水性溶媒（例えば、６．０～８．５、７．０～８．０、又は７．０及び７．５のｐＨのＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ビス－トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシン又はＨＥＰＢから選択される）中で実行され、別の実施形態では、反応は、非プロトン性溶媒中で実行される。ある実施形態では、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。ＤＭＳＯ又はＤＭＦ溶媒は、凍結乾燥された活性化多糖及びキャリアタンパク質を再構成するために使用され得る。
還元反応の最後に、コンジュゲート中に残っている未反応のアルデヒド基が存在する場合があり、これらは、好適なキャップ付加剤を使用してキャップ付加され得る。一実施形態では、このキャップ付加剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。
他の実施形態では、コンジュゲートは、国際公開第２０１４／０２７３０２号パンフレットに記載されるものなどのｅＴＥＣコンジュゲーションを使用して調製される。前記グリココンジュゲートは、１つ以上のｅＴＥＣスペーサーを介してキャリアタンパク質に共有結合的にコンジュゲートされた糖を含み、糖は、カルバミン酸結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされ、キャリアタンパク質は、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有結合的にコンジュゲートされる。本発明のｅＴＥＣ連結グリココンジュゲートは、一般式（Ｉ）：

（式中、ｅＴＥＣスペーサーを含む原子は、中央の箱に含有される）によって表され得る。
ｅＴＥＣスペーサーは、７個の直鎖状原子（すなわち、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）を含み、糖とキャリアタンパク質の間に安定なチオエーテル及びアミド結合をもたらす。ｅＴＥＣ連結グリココンジュゲートの合成は、糖にカルバミン酸結合を形成してチオール化糖をもたらす、チオアルキルアミン試薬、例えば、シスタミン若しくはシステアミン又はその塩のアミノ基と糖の活性化ヒドロキシル基の反応を含む。１つ以上の遊離スルフヒドリル基の生成は、活性化チオール化糖をもたらす還元剤との反応によって達成される。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基のアミン含有残基上に１つ以上のα－ハロアセトアミド基を有する活性化キャリアタンパク質との反応は、チオエーテル結合を生成してコンジュゲートを形成し、キャリアタンパク質は、アミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに結合される。
本明細書に記載されるコンジュゲートは、タンパク質の精製のために当該技術分野で知られる任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アニオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な手法によって精製され得る。例えば、Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．ＩＤ＃３１２７０９（ｐ．１－１８）を参照のこと；国際公開第２００９／１０４０７４号パンフレットに記載される方法も参照のこと。特定のコンジュゲートを精製するために使用される実際の条件は、合成戦略（例えば、組換え体生成に対する合成による生成）並びにバイオコンジュゲートの実効電荷、疎水性、及び／又は親水性などの因子に部分的に依存することになり、当業者に明らかであろう。
宿主細胞
本明細書では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原及びそのような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含むバイオコンジュゲートを生成することができる宿主細胞、例えば、原核宿主細胞が記載される。本明細書に記載される宿主細胞は、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖及び／又はそのバイオコンジュゲートを生成するために使用される宿主細胞機構（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）をコードする核酸の１つ以上を含む（例えば、遺伝子操作を介して）ように改変される。
古細菌、原核宿主細胞、及び真核宿主細胞を含む当業者に知られる任意の宿主細胞を使用して、本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５多糖）及び本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含むバイオコンジュゲート（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲート）を生成することができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、原核宿主細胞である。本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖及び本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含むバイオコンジュゲートの生成における使用のための例示的な原核宿主細胞としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、キサントモナス（Ｘｈａｎｔｏｍｏｎａｓ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖及び本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含むバイオコンジュゲートを生成するために使用される宿主細胞は、原核宿主細胞であり、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖及びバイオコンジュゲートを生成するために使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、所望のＯ抗原血清型のｒｆｂ遺伝子クラスターを含む異種核酸、１つ以上のキャリアタンパク質及び／又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含むように操作される。特定の実施形態では、異種ｒｆｂ遺伝子、及び／又はグリコシル化経路（例えば、原核及び／又は真核グリコシル化経路）に関与するタンパク質をコードする異種核酸が、本明細書に記載される宿主細胞に導入され得る。そのような核酸は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ及び／又はグリコシルトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されないタンパク質をコードし得る。
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖及びそのバイオコンジュゲートを調製するために使用され得る組換え宿主細胞を作製する際に有用なグリコシルトランスフェラーゼをコードする様々な遺伝子及び遺伝子クラスターの配列は、本明細書に記載される。当業者は、遺伝暗号の縮重に起因して、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質が複数の異なる核酸によってコードされ得ることを認識するであろう。したがって、当業者は、本明細書で提供される核酸が、核酸によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、その配列が本明細書で提供される配列とは異なるように改変され得ることを理解するであろう。
本明細書では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、Ｏ１Ａ抗原多糖、Ｏ２抗原多糖、グリコシル化若しくは非グルコシル化Ｏ４抗原多糖、Ｏ６Ａ抗原多糖、Ｏ８抗原多糖、Ｏ１５抗原多糖、Ｏ１６抗原多糖、Ｏ１８Ａ抗原多糖、又はＯ２５Ｂ抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成するための宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）が記載される。本明細書に記載される宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を生成することができる酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）をコードする核酸を含む。本明細書に記載される宿主細胞は、目的のＯ抗原を生成することができる核酸を天然に発現することができるか、又は宿主細胞は、そのような核酸を発現するために作製され得る。ある特定の実施形態では、核酸は、宿主細胞に対して異種であり、当該技術分野で知られる遺伝的手法を使用して宿主細胞に導入される。例えば、核酸は、遺伝子操作によって宿主細胞に導入され得る（例えば、遺伝子クラスターは、プラスミド又はプラスミド（複数）上で発現されるか又は宿主細胞ゲノムに組み込まれる（例えば、国際公開第２０１４／０３７５８５号パンフレット、国際公開第２０１４／０５７１０９号パンフレット、国際公開第２０１５／０５２３４４号パンフレットを参照のこと））。
また、本明細書では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化若しくは非グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、又はＯ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成することができる宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）が記載される。そのような宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）は、Ｏ抗原多糖に特異的なｒｆｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を含む。ｒｆｂ遺伝子クラスターは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から単離され、１つの宿主細胞内でオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＰｇｌＢ）及びキャリアタンパク質（例えば、ＥＰＡ）をコードする核酸と組み合わせて、目的の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原及びそのバイオコンジュゲートを生成する組換え宿主細胞を得ることができる。例えば、そのような宿主細胞は、国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレット、国際公開第２０１４／０３７５８５号パンフレット、国際公開第２００９／１０４０７４号パンフレット、及び国際公開第２００９／０８９３９６号パンフレットに記載されるものなどのバイオコンジュゲーション技術を使用してｒｆｂ遺伝子クラスター、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、ＰｇｌＢ）及びキャリアタンパク質（例えば、ＥＰＡ）を含む１つ以上のプラスミドを含むように組換え手法を使用して操作され得る。好ましくは、宿主細胞は、それらのゲノムに組み込まれたｒｆｂ遺伝子クラスターを含む。オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、キャリアタンパク質、及び該当する場合、ｇｔｒＳ遺伝子をコードする核酸もまた、ある特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。異種又は同種のｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ遺伝子もまた、ある特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ及びＯ２５Ｂ抗原のためのバイオコンジュゲートの調製は、国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレット及び国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレットにおいて詳細に記載されている。各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原（ｒｆｂ座位）のための例示的な遺伝子クラスターは、Ｉｇｕｃｈｉ Ａ，ｅｔ ａｌ，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１－７、及びＤｅｂＲｏｙ Ｃ，ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１６，１１（１）：ｅ０１４７４３４；Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ．２０１６，１１（４）：ｅ０１５４５５１における訂正）において記載されている。内部でコードされるタンパク質のためのｒｆｂクラスター及びアミノ酸配列に関する核酸配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的なデータベースにおいて見出され得る。本明細書で開示される血清型の多糖抗原を有するバイオコンジュゲートのための産生株において使用され得るｒｆｂクラスターの例示的配列もまた、配列番号９及び１１～１９において提供される。したがって、上述の所望のバイオコンジュゲートの各々に関して、それぞれのｒｆｂクラスターを宿主細胞に導入して、所望のＯ抗原のための特定のｒｆｂクラスターを有し、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼ及びキャリアタンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を得ることができる。上で示される理由のために、好ましくは、宿主細胞は、組換え宿主細胞であり、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）実験又は産生株、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１などの比較的よく知られる特徴を有する株に由来する。好ましくは、ｒｆｂクラスターは、宿主細胞に対して異種であり、例えば、宿主細胞の前駆体細胞に導入され、好ましくは、そのゲノムに組み込まれる。好ましくは、元のｒｆｂ遺伝子クラスターは、それが前駆体細胞に存在した場合、宿主細胞において目的のＯ抗原のためのｒｆｂ遺伝子クラスターによって置き換えられており、目的のＯ抗原のバイオコンジュゲートの生成を可能にする。好ましくは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種であり、ある特定の実施形態では、そのようなオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
本明細書に記載される宿主細胞のいずれか（例えば、組換え宿主細胞、好ましくは、組換え原核宿主細胞）は、タンパク質のＮ－グリコシル化において活性の追加の酵素をコードする核酸を含み、例えば、本明細書に記載される宿主細胞はさらに、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸又は他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み得る。
本明細書に記載される宿主細胞は通常、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。そのようなオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、脂質に連結されたオリゴ糖を、Ｎ－グリコシル化コンセンサスモチーフを含む新生のポリペプチド鎖のアスパラギン残基に移す。オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞に対して生得的であり得るか、又は遺伝的手法を使用して宿主細胞に導入され得る。好ましい実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを天然に含まず、したがって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がバイオコンジュゲートの生成のために宿主細胞として使用される場合、異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、例えば、遺伝子操作による導入時にそのような宿主細胞において含まれる。オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、本開示に鑑みて当該技術分野で知られる任意の供給源に由来し得る。
ある特定の実施形態では、例えば、非限定的な例のＰｇｌＬとしてのＯ－グリコシルトランスフェラーゼなどのＮ－グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するオリゴサッカリルトランスフェラーゼに対する代替物は、例えば、国際公開第２０１６／８２５９７号パンフレット及び国際公開第２０２０／１２０５６９号パンフレットに記載されるとおり、キャリアタンパク質においてそれ自体の異なるグリコシル化コンセンサス配列と組み合わせて使用され得る。したがって、Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼなどの他のグリコシルトランスフェラーゼはまた、本発明によるオリゴサッカリルトランスフェラーゼとしても使用され得る。
ある特定の好ましい実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。例えば、一実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（すなわち、ｐｇｌＢ；例えば、Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０－１７９３；また、例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３２３１７７５，ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｏ８６１５４を参照のこと）。別の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７４１０９８６を参照のこと）。
特定の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼであり、国際公開第２０１６／１０７８１８号パンフレット及び国際公開第２０１６／１０７８１９号パンフレットに記載されるものなどの天然（野生型）タンパク質又はその任意のバリアントを含む。ＰｇｌＢは、脂質に連結されたオリゴ糖を、コンセンサス配列の配列番号１及び配列番号２におけるアスパラギン残基に移すことができる。特定の実施形態では、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、配列番号６、又はそのバリアントを含む。ある特定の実施形態では、野生型ＰｇｌＢにおける１つ以上の内在性グリコシル化コンセンサス配列は、ＰｇｌＢ自己グリコシル化を回避するために変異された（例えば、変異Ｎ５３４Ｑを含む配列番号６）。本明細書で提供される組換え宿主細胞における使用に好適なバリアントＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼの例としては、Ｎ３１１Ｖ、Ｋ４８２Ｒ、Ｄ４８３Ｈ、Ａ６６９Ｖ、Ｙ７７Ｈ、Ｓ８０Ｒ、Ｑ２８７Ｐ、及びＫ２８９Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む配列番号６のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼが挙げられる。１つの特定の実施形態では、バリアントＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、変異Ｎ３１１Ｖを含む配列番号６を有する。別の特定の実施形態では、バリアントＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、変異Ｙ７７Ｈ及びＮ３１１Ｖを含む配列番号６を有する。別の特定の実施形態では、バリアントＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、変異Ｎ３１１Ｖ、Ｋ４８２Ｒ、Ｄ４８３Ｈ、及びＡ６６９Ｖを含む配列番号６を有する。別の特定の実施形態では、バリアントＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、変異Ｙ７７Ｈ、Ｓ８０Ｒ、Ｑ２８７Ｐ、Ｋ２８９Ｒ、及びＮ３１１Ｖを含む配列番号６を有する。ある特定のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼバリアントは、特定の血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原バイオコンジュゲートの生成において収量を驚くほど向上させることが、２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４１５において見出され、記載された。所与の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のための向上されたか又は最適なＰｇｌＢバリアントは、予測可能ではなかった。したがって、本発明はまた、ある特定の態様では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼとして特定のＰｇｌＢバリアントを使用して、特定の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のバイオコンジュゲートを生成するための方法を開示する。配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、好ましくは本明細書における組み合わせにおいて開示される指定の位置に特定のアミノ酸の１つ以上を有するオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性を依然として有するＰｇｌＢのさらなるバリアント（例えば、７７Ｙ、８０Ｓ、２８７Ｑ、２８９Ｋ、３１１Ｎ、４８２Ｋ、４８３Ｄ、６６９Ａ；又は３１１Ｖ；又は３１１Ｖ、４８２Ｒ、４８３Ｈ、６６９Ｖ；又は７７Ｈ、８０Ｒ、２８７Ｐ、２８９Ｒ、３１１Ｖ；又は７７Ｈ、３１１Ｖなど）もまた、バイオコンジュゲートの生成のために使用され得る。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成することができる宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）はさらに、配列番号６、又は好ましくは変異Ｎ３１１Ｖを含む配列番号６のアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）に由来するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
他の特定の実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ６Ａ、又はＯ１５抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成することができる宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）はさらに、配列番号６、又は好ましくは変異Ｎ３１１Ｖ、Ｋ４８２Ｒ、Ｄ４８３Ｈ、及びＡ６６９Ｖを含む配列番号６のアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）に由来するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成することができる宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）はさらに、配列番号６、又は好ましくは変異Ｎ３１１Ｖを含む配列番号６、又はより好ましくは変異Ｙ７７Ｈ及びＮ３１１Ｖを含む配列番号６のアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）に由来するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートの生成のための組換え宿主細胞はさらに、配列番号４のアミノ酸配列（又は配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるそのバリアント）を有し、グルコースの付加により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖を修飾して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖を生成することができるグルコシルトランスフェラーゼＧｔｒＳをコードする配列、及びそれぞれ配列番号７及び８（又はそれぞれ配列番号７及び８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有するそのバリアント）のアミノ酸配列を有するトランスロカーゼＧｔｒＡ及びグリコシルトランスフェラーゼＧｔｒＢをコードするヌクレオチド配列を含み、トランスロカーゼは、バクトプレノール連結型グルコースを移行させることができ、グリコシルトランスフェラーゼは、バクトプレノールをグルコシル化することができる。キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）非グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートの生成のために、細胞は、ＧｔｒＳ、ＧｔｒＡ、及びＧｔｒＢタンパク質をコードするそのような配列を必要としない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖のグルコシル化に特異的な新規のＧｔｒＳを使用するキャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートの生成は、全体として参照により本明細書に組み込まれる２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４０４において記載される。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成することができる宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）はさらに、配列番号６、又は好ましくは変異Ｙ７７Ｈ、Ｓ８０Ｒ、Ｑ２８７Ｐ、Ｋ２８９Ｒ、及びＮ３１１Ｖを含む配列番号６のアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）に由来するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、又はＯ２抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成することができる宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）はさらに、配列番号６のアミノ酸配列を有するカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）に由来するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、配列番号６は、７７、８０、２８７、２８９、３１１、４８２、４８３、及び６６９位でアミノ酸変異を含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞のいずれかは、キャリアタンパク質、例えば、バイオコンジュゲートを形成するために宿主細胞グリコシル化機構によって生成されるＯ抗原多糖が結合され得るタンパク質をコードする核酸を含む。宿主細胞は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄを含むが、これらに限定されない本開示を鑑みて当業者に知られる任意のキャリアタンパク質をコードする核酸を含み得る。
好ましい実施形態では、宿主細胞はさらに、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）をコードする核酸を含む。好ましくは、ＥＰＡキャリアタンパク質は、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列、及びより好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有するグリコシル化コンセンサス配列を含む１～１０個のグリコシル化部位、好ましくは２～４個のグリコシル化部位、最も好ましくは４個のグリコシル化部位、例えば、１～１０個、好ましくは２～４個、及びより好ましくは４個のグリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、宿主細胞はさらに、配列番号３を含むＥＰＡ－４キャリアタンパク質をコードする核酸を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞によるバイオコンジュゲートの作製において使用されるキャリアタンパク質は、「タグ」、すなわち、キャリアタンパク質の単離及び／又は同定を可能にするアミノ酸の配列を含む。例えば、タグをキャリアタンパク質に付加することは、そのタンパク質の精製、及びしたがって、タグ付けされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製において有用であり得る。本明細書で使用され得る例示的なタグとしては、ヒスチジン（ＨＩＳ）タグ（例えば、ヘキサ－ヒスチジン－タグ、又は６ＸＨｉｓ－タグ）、ＦＬＡＧ－ＴＡＧ、及びＨＡタグが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、例えば、それらがもはや必要なくなってから、例えば、タンパク質が精製された後に化学薬品又は酵素的手段による除去など、除去可能である。他の実施形態では、キャリアタンパク質は、タグを含まない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるキャリアタンパク質は、キャリアタンパク質を発現する宿主細胞の細胞膜周辺腔にキャリアタンパク質を標的化するシグナル配列を含む。特定の実施形態では、シグナル配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｓｂＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）、エルウィニア・カロトボランス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａｎｓ）ペクチン酸リアーゼ（ＰｅｌＢ）、ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）エンドキシラナーゼ（ＸｙｎＡ）、熱不安定性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エンテロトキシンＬＴＩＩｂ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）エンドキシラナーゼＸｙｎＡ、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｇＩ）に由来する。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号１０を含む。シグナル配列は、タンパク質の周辺質への移行後に切断される場合があり、したがって、バイオコンジュゲートの最終的なキャリアタンパク質中にはもはや存在しない場合がある。
ある特定の実施形態では、追加の修飾が、本明細書に記載される宿主細胞に導入され得る（例えば、組換え手法を使用して）。例えば、グリコシル化経路と場合によっては競合するか又は干渉する（例えば、宿主細胞に組換えにより導入されるグリコシル化に関与する１つ以上の異種遺伝子と競合するか又は干渉する）部分を形成するタンパク質をコードする宿主細胞核酸（例えば、遺伝子）は、それらを不活性／機能不全にするように宿主細胞バックグラウンド（ゲノム）において欠失され得るか又は改変され得る（すなわち、欠失される／改変される宿主細胞核酸は、機能性タンパク質をコードしない）。ある特定の実施形態では、核酸が本明細書で提供される宿主細胞のゲノムから欠失されるとき、それらは、望ましい配列、例えば、Ｏ抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートの精製に有用な配列によって置き換えられる。
宿主細胞において欠失され得る（及び、いくつかの場合、他の所望の核酸配列で置き換えられる）例示的な遺伝子又は遺伝子クラスターは、ｗａａＬ（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０２：３０１６－３０２１を参照のこと）、リピドＡコア生合成クラスター（ｗａａ）、ガラクトースクラスター（ｇａｌ）、アラビノースクラスター（ａｒａ）、結腸酸クラスター（ｗｃ）、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール－ｐ生合成遺伝子（例えば、ｕｐｐＳ、ｕｐｐＰ）、ｕｎｄ－Ｐ再利用遺伝子、ヌクレオチド活性化糖生合成に関与する代謝酵素、腸内細菌共通抗原クラスター（ｅｃａ）、及びｇｔｒＡＢＳクラスター又はその領域のようなプロファージＯ抗原修飾クラスターなどの糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子又は遺伝子クラスターを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞は、それらが所望のＯ抗原多糖、例えば、グルコシル化Ｏ４抗原多糖以外の任意のＯ抗原多糖を生成しないように改変される。
特定の実施形態では、ｗａａＬ遺伝子は、本明細書で提供される宿主細胞（例えば、組換え宿主細胞）のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活性化される。用語「ｗａａＬ」及び「ｗａａＬ遺伝子」は、周辺質に位置する活性部位を有する膜結合型酵素をコードするＯ抗原リガーゼ遺伝子を指す。コードされた酵素は、ウンデカプレニルホスフェート（ＵＰＰ）結合Ｏ抗原をリピドＡコアに移行させて、リポ多糖を形成する。内在性ｗａａＬ遺伝子（例えば、ΔｗａａＬ株）の欠失又は破壊は、Ｏ抗原のリピドＡへの移行を妨害し、代わりにＯ抗原のキャリアタンパク質などの別の生体分子への移行を強化することができる。
別の特定の実施形態では、ｗａａＬ遺伝子、ｇｔｒＡ遺伝子、ｇｔｒＢ遺伝子、ｇｔｒＳ遺伝子、及びｒｆｂ遺伝子クラスターの１つ以上が、本明細書で提供される原核宿主細胞の元のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活性化される。
一実施形態では、本明細書で使用される宿主細胞は、グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートを生成する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、ｗａａＬ遺伝子が、宿主細胞のゲノムから欠失されるか又は機能的に不活性化され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖に特異的なｇｔｒＳ遺伝子が挿入される。グルコシル化Ｏ４Ｏ抗原のバイオコンジュゲートのための産生株に関するある特定の実施形態では、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有するグルコシルトランスフェラーゼをコードするｇｔｒＳ遺伝子が、Ｏ４抗原のグルコシル化に関与するものを有する親株におけるｇｔｒＳ遺伝子を置き換えるために親株のｇｔｒＳ遺伝子の代わりに挿入される。そのような親株の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株Ｗ３１１０である。ｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ遺伝子は、親株に対して同種であり得るか、或いはこれらの遺伝子の一方又は両方は、親株に対して異種であり得る。通常、ｇｔｒＳ遺伝子とは異なり、これらのｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ遺伝子は、Ｏ抗原構造に対して特異的ではない。
また、本明細書では、組換え宿主細胞を作製する方法が記載される。本明細書に記載される方法によって生成される組換え宿主細胞を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のバイオコンジュゲートを生成することができる。方法は、１つ以上の組換え核酸分子を細胞に導入して、組換え宿主細胞を生成することを含む。通常、組換え核酸分子は、異種である。本開示を鑑みて当該技術分野で知られる任意の方法を使用して、組換え核酸分子を宿主細胞に導入することができる。組換え核酸は、当業者に知られる任意の方法、例えば、エレクトロポレーション、化学的形質転換、熱ショック、天然の形質転換、ファージ形質導入、及び接合を使用して本明細書に記載される宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、組換え核酸は、プラスミドを使用して本明細書に記載される宿主細胞に導入される。例えば、異種核酸は、プラスミド（例えば、発現ベクター）によって宿主細胞において発現され得る。別の特定の実施形態では、異種核酸は、例えば、国際公開第２０１４／０３７５８５号パンフレット、国際公開第２０１４／０５７１０９号パンフレット、又は国際公開第２０１５／０５２３４４号パンフレットに記載されるとおりのゲノムへの挿入の方法を使用して本明細書に記載される宿主細胞に導入される。
ツール及びモデル生物の両方として分子生物学において日常的に使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、例えば、ある特定の実施形態における宿主細胞のための親として使用され得る。非限定的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株（例えば、Ｗ１４８５、Ｗ２６３７、Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、ＤＨ１、ＤＨ５α、ＤＨ１０など）、Ｂ株（例えば、ＢＬ－２１、ＲＥＬ６０６など）、Ｃ株、又はＷ株が挙げられる。１つの特定の実施形態では、宿主株は、親株Ｗ３１１０に由来する。この株は、例えば、ＹａｌｅのＥ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから得ることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するさらなる情報については、例えば、Ｅｃｏｌｉｗｉｋｉ．ｎｅｔを参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞を使用して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含むバイオコンジュゲートを生成することができる。宿主細胞を使用してそのようなバイオコンジュゲートを生成する方法は、当該技術分野で知られる。例えば、国際公開第２００３／０７４６８７号パンフレット及び国際公開第２００６／１１９９８７号パンフレットを参照されたい。そのような方法は、バイオコンジュゲートの生成のための条件下で本明細書に記載される組換え宿主細胞のいずれかを培養することを含む。バイオコンジュゲートは、本開示を鑑みて当該技術分野で知られる任意の方法を使用して組換え宿主細胞から、単離され、分離され、及び／又は精製され得る。例えば、バイオコンジュゲートは、タンパク質の精製のために当該技術分野で知られる任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アニオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な手法によって精製され得る。例えば、国際公開第２００９／１０４０７４号パンフレットに記載される方法を参照されたい。さらに、バイオコンジュゲートを、異種ポリペプチド配列に融合して、精製を容易にすることができる。特定のバイオコンジュゲートを精製するために使用される実際の条件は、バイオコンジュゲートの実効電荷、疎水性、及び／又は親水性などの因子に部分的に依存することになり、当業者に明らかであろう。Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、及びＯ２５Ｂのためのバイオコンジュゲート、並びにこれらを含むワクチン組成物の調製は、例えば、国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレット及び国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレットに記載されている。
また、本明細書に記載される方法によって、すなわち、本明細書に記載される組換え宿主細胞を使用して生成されるバイオコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲートを調製する方法は、（ｉ）（ａ）Ｏ抗原多糖のためのｒｆｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１、好ましくは配列番号２を有するグリコシル化コンセンサス配列を含む少なくとも１つのグリコシル化部位、及びより好ましくは配列番号２を有するグリコシル化コンセンサス配列をそれぞれ含む４つのグリコシル化部位を含むキャリアタンパク質、好ましくはＥＰＡをコードするヌクレオチド配列；並びに（ｃ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、例えば、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を提供することを含む。
ある特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖は、特定の多糖とタンパク質の重量比（ｗ／ｗ）でキャリアタンパク質に共有結合的に結合される。キャリアタンパク質に共有結合されるＯ抗原多糖の量のこの重量比は、「グリカン／タンパク質比」又は「多糖／タンパク質比」又は「ＰＳ／タンパク質比」と称される。いくつかの実施形態では、Ｏ抗原多糖は、約１：２０～２０：１、好ましくは、１：１０～１０：１、より好ましくは１：３～３：１の多糖とタンパク質（ｗ／ｗ）比でキャリアタンパク質に共有結合的に結合される。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートのためのある特定の非限定的な実施形態では、グリカン／タンパク質比は、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、又は０．５などの約０．１～０．５である。そのような実施形態では、Ｏ抗原多糖：タンパク質の重量比は、特定のＯ抗原血清型に応じて、１：１０：１：９：１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、又は１：２などの約１：１０～１：２である。ある特定の実施形態では、グリカン／タンパク質比は、約０．１５～約０．４５である。一般に、より高いＯ抗原多糖とキャリアタンパク質のグリカン／タンパク質比は、高い量のキャリアタンパク質がいくつかの例において免疫学的干渉を引き起こす可能性があるため好ましい。また、より高いグリカン／タンパク質比は、キャリアタンパク質の量を比較的低く維持しながら、バイオコンジュゲートの形態で十分なＯ抗原多糖を投与するのに役立つことになり、これは、複数の血清型が組成物、例えば、少なくとも４種の異なるＯ抗原、少なくとも５種の異なるＯ抗原、少なくとも６種の異なるＯ抗原、少なくとも７種の異なるＯ抗原、少なくとも８種の異なるＯ抗原、少なくとも９種の異なるＯ抗原、少なくとも１０種の異なるＯ抗原などのからのバイオコンジュゲートを含む組成物によって包含されることになる多価組成物に特に有益である。
本発明によるコンジュゲートのグリカン／タンパク質比は、タンパク質量及びグリカン量を決定することによって決定され得る。タンパク質量は、２８０ｎｍ（Ａ２８０）のＵＶ吸光度の測定によって決定され得る。グリカン量は、反復単位における糖の（例えば、表１のＯ８についてはＭａｎの、及び表１の他のグリカンについてはＧｌｃＮＡｃの）アンペロメトリック電気化学検出法によるイオンクロマトグラフィー（ＩＣ－ＰＡＤ）に基づいて決定することができ、その後、反復単位の構造情報を使用して、総グリカン量を計算することができる（例えば、Ｏ１Ａの反復単位は、８４５Ｄａのモル質量を有し、そのような反復単位の１モルは、ＧｌｃＮＡｃの１モルを含有し、ＧｌｃＮＡｃの量がＩＣ－ＰＡＤによって決定されたときに総グリカン量の計算が可能になる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのキャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖のバイオコンジュゲートは、Ｌ－Ｒｈ糖の２位である特定の程度のアセチル化を有する。（バイオ）コンジュゲートにおけるＯ２５Ｂ抗原多糖のＯ－アセチル化の程度は、好ましくは、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％などの少なくとも５０％である。
同様に、（バイオ）コンジュゲートにおける大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖のＯ－アセチル化の程度は、好ましくは、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％などの少なくとも５０％である。
特定の実施形態では、Ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲートを調製する方法は、生成されることになるＯ抗原多糖バイオコンジュゲートに応じて、特定のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素、特に、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ又はそのバリアントをコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞を提供することを含む。特定のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素バリアントは、宿主細胞によって生成されるバイオコンジュゲートの収量に影響を及ぼし得る。通常、収量は特定のバイオコンジュゲートを生成するためのコストに影響を及ぼすことになるため、より高い収量が好ましく、これはいくつかの異なるバイオコンジュゲートを含む多価組成物にとって特に重要である。
１つの特定の実施形態では、Ｏ抗原がＯ７５抗原多糖であるとき、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｎ３１１Ｖのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異は、配列番号６のアミノ酸配列を有する野生型ＰｇｌＢに対するものである。
別の特定の実施形態では、Ｏ抗原がＯ１Ａ、Ｏ６Ａ、又はＯ１５抗原多糖であるとき、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｎ３１１Ｖ、Ｋ４８２Ｒ、Ｄ４８３Ｈ、及びＡ６６９Ｖのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異は、配列番号６のアミノ酸配列を有する野生型ＰｇｌＢに対するものである。
別の特定の実施形態では、Ｏ抗原がグルコシル化Ｏ４抗原多糖であるとき、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、アミノ酸変異Ｎ３１１Ｖ、又はＹ７７Ｈ及びＮ３１１Ｖのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異は、配列番号６のアミノ酸配列を有する野生型ＰｇｌＢに対するものである。
別の特定の実施形態では、Ｏ抗原がＯ１６抗原多糖であるとき、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Ｙ７７Ｈ、Ｓ８０Ｒ、Ｑ２８７Ｐ、Ｋ２８９Ｒ、及びＮ３１１Ｖのアミノ酸変異を含み、アミノ酸変異は、配列番号６のアミノ酸配列を有する野生型ＰｇｌＢに対するものである。
別の特定の実施形態では、Ｏ抗原がＯ８、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、又はＯ２抗原多糖であるとき、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、配列番号６は、７７、８０、２８７、２８９、３１１、４８２、４８３、及び６６９位にアミノ酸変異を含まない。そのある特定の実施形態では、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上で示されるＯ抗原／ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ対毎にオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素をコードする組換え宿主細胞によって生成されるＯ抗原多糖のバイオコンジュゲートは、好ましくは、本明細書に記載される好ましい特質、例えば、グリカン／タンパク質比及び／又は多グリコシル化キャリアタンパク質のパーセントの１つ以上を有する。
組成物及び組合せ物
本明細書では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物及び組合せ物が提供され、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、任意選択により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てをさらに含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。Ｏ抗原多糖又はコンジュゲート、例えば、バイオコンジュゲートの組合せ物は、複数の組成物を含み得るが、それは、Ｏ抗原多糖又はコンジュゲート、例えば、バイオコンジュゲートの組み合わせが同じ組成物中に存在する場合に好ましい。
本明細書に記載される組成物及び組合せ物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による対象（例えば、ヒト対象）の感染の治療及び予防、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の予防において有用である。いくつかの実施形態では、組成物は、免疫原性組成物である。本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」は、組成物が投与される宿主又は対象において免疫応答を誘発することができる組成物を指す。組成物及び免疫原性組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」は動物、より特にはヒトにおける使用のために、連邦若しくは州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、本明細書中で薬学的に許容される担体に関連して使用される場合、医薬組成物が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。生理食塩水並びに水性デキストロース溶液及びグリセロール溶液も液体担体として利用されてもよく、特に注射液のための液体担体として利用されてもよい。好適な賦形剤として、下記が挙げられる：デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなど。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”において記載される。
一実施形態では、本発明の組成物は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．４（例えば、トリス、ＮａＣｌ及びＫＣｌを、例えばそれぞれ２５ｍＭ、１３７ｍＭ及び２．７ｍＭで含有する）中の本明細書に記載されるとおりの（バイオ）コンジュゲートを含む。他の実施形態では、本発明の組成物は、約７．０のｐＨの約１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、約５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、約１０ｍＭメチオニン、及び約０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０中の本明細書に記載されるとおりの（バイオ）コンジュゲートを含む。他の実施形態では、本発明の組成物は、約７．０のｐＨの約１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、約８％（ｗ／ｖ）スクロース、約１ｍＭ ＥＤＴＡ及び約０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０中の本明細書に記載されるとおりの（バイオ）コンジュゲートを含む（例えば、ＥＰＡキャリアタンパク質に共有結合的に結合された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のバイオコンジュゲートのための好適な緩衝液については国際公開第２０１８／０７７８５３号パンフレットを参照のこと）。他の実施形態では、本発明の組成物は、約５ｍＭ コハク酸塩／０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の本明細書に記載されるとおりの（バイオ）コンジュゲートを含む。
本明細書では、多価組成物、例えば、二価、三価、四価などの組成物である組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）が提供される。例えば、多価組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原、グリココンジュゲート、又はそのバイオコンジュゲートなどの２種以上の抗原を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される多価組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲート及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される多価組成物は、少なくとも１つの追加の抗原又はバイオコンジュゲートを含む。
通常、本発明の組成物は、まずキャリアタンパク質にこれらのＯ抗原多糖を独立して共有結合的に連結することによって、例えば、化学的コンジュゲーション又はバイオコンジュゲーションによって本明細書に記載されるとおりの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の各々に関する個々のグリココンジュゲートを得ること、及びその後に本明細書に記載されるとおりの量及び比で個々のグリココンジュゲートを混合して本発明による組成物を得ることによって調製され得る。
一実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）は、本明細書に記載されるとおりのキャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、及び少なくとも１つの追加の抗原を含む多価組成物である。
いくつかの実施形態では、追加の抗原は、好ましくはキャリアタンパク質にそれぞれ個別にコンジュゲートされた抗原糖又は多糖、より好ましくは、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２５血清型及びその亜血清型の１つ以上の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖であり、各血清型に関するキャリアタンパク質は、同じであってもよいし、いくつか又は全ての血清型間で異なっていてもよい。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５多糖の（バイオ）コンジュゲートを含む多価組成物はさらに、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２５血清型又はその亜血清型の各々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含む。いくつかの実施形態では、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の各々は、グリココンジュゲートであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖は、別の化学種、例えば、タンパク質、ペプチド、脂質など、最も好ましくは、キャリアタンパク質に、化学的又は酵素的方法などによって共有結合的に連結されていることを意味する。好ましい実施形態では、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の各々は、Ｏ抗原多糖が宿主細胞機構による酵素的なグリコシド結合を介して、例えば、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたバイオコンジュゲートである。ある特定の実施形態では、多価組成物はさらに、Ｏ８血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を、好ましくはグリココンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの形態で含む。ある特定の実施形態における本明細書で提供される組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０種の追加のグリココンジュゲート又は好ましくはバイオコンジュゲートなどの１～２０種の追加のグリココンジュゲート、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み得る。他の抗原は、ペプチド、タンパク質、又は脂質抗原などの本明細書で提供される組成物中に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖の（バイオ）コンジュゲート及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖の（バイオ）コンジュゲート、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８抗原多糖、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖、好ましくは少なくとも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖、より好ましくは、少なくとも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８抗原多糖からなる群から選択される少なくとも１つの追加の抗原多糖を含む。好ましくは、Ｏ１抗原多糖は、Ｏ１Ａ抗原多糖であり、Ｏ６抗原多糖は、Ｏ６Ａ抗原多糖であり、Ｏ４抗原多糖は、グルコシル化Ｏ４抗原多糖であり、Ｏ１８抗原多糖は、Ｏ１８Ａ抗原多糖であり、Ｏ２５抗原多糖は、Ｏ２５Ｂ抗原多糖である。好ましくは、追加のＯ抗原多糖の各々は、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、より好ましくは、バイオコンジュゲートである。
いくつかの実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、又はＯ６抗原多糖の少なくとも１つ、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１又はＯ６抗原多糖の少なくとも１つを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖の濃度の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。好ましい実施形態では、組成物はさらに、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖を含み、Ｏ２５抗原多糖とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖の濃度の比は、約１．５：１～約４：１、好ましくは、約２：１である。そのような実施形態では、好ましくは、Ｏ２５抗原多糖とＯ７５抗原多糖の濃度の比は、約２：１～約１：１、好ましくは、約１．５：１、より好ましくは、約１：１である。そのある特定の実施形態では、Ｏ２５抗原多糖とＯ２抗原多糖の濃度の比は、約４：１～約２：１である。ある特定の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ６及びＯ２５抗原多糖を含み、好ましくは、Ｏ１、Ｏ６及びＯ２５抗原多糖はそれぞれ、Ｏ１Ａ、Ｏ６Ａ及びＯ２５Ｂ多糖であり、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、抗原多糖Ｏ７５：Ｏ１：Ｏ２：Ｏ６：Ｏ２５の濃度の比は、約２：１：１：１：２である。ある特定の実施形態では、Ｏ抗原は、例えば、キャリアタンパク質におけるＡｓｎ残基に対するＮ結合を介して、バイオコンジュゲーションによりキャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中のＯ７５抗原多糖の濃度は、約８～６４μｇ／ｍＬ、好ましくは、約１６～３２μｇ／ｍＬ、好ましくは約２８～３６μｇ／ｍＬ、例えば、３２μｇ／ｍＬである。ある特定の実施形態では、組成物はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、Ｏ４はグルコシル化されており、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａである。ある特定の実施形態では、組成物はさらに、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８抗原多糖を含む。ある特定の実施形態では、これらの各々が組成物中に存在する限りにおける抗原多糖Ｏ７５：Ｏ４：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ８の濃度比は、約２：１：１：１：１：１である。追加の実施形態では、組成物は、１つ以上のさらなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含んでもよく、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。
一実施形態では、Ｏ１抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ１抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１Ａ）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ１抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ１抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ２抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ２抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ２）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ２抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ２抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ４抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ４抗原多糖は、グルコシル化Ｏ４抗原多糖であり、特定の実施形態では、表１に示されるとおりの式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ４抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ４抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ６抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ６抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ６Ａ）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ６抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ６抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ８抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ８抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ８）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ８抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ８抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ１５抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ１５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１５）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ１５抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ１５抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ１６抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ１６抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１６）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ１６抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結される。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ１６抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ１８抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ１８抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１８Ａ）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ１８抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ１８抗原多糖間の重量比は、約１．２：１と８：１の間、好ましくは、約１．５：１と４：１の間、より好ましくは、約２：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、又は２．５：１である。
一実施形態では、Ｏ２５抗原多糖（例えば、グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートの単離された形態又は一部）は、本明細書で提供される組成物中で使用される（例えば、Ｏ７５抗原多糖又はそのバイオコンジュゲートと組み合わせて）。特定の実施形態では、Ｏ２５抗原多糖は、Ｏ２５Ｂ抗原多糖を含み、特定の実施形態では、表１に示されるとおりの式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、Ｏ２５抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であり、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結される。ある特定の実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ２５抗原多糖間の重量比は、約１：４と１：０．５の間、好ましくは、約１：２と１：１の間、より好ましくは、約１：１、例えば、約１：１．５、１：１．４、１：１．３、１：１．２、１：１．１、１：１．０、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、又は１：０．５である。
別の実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）は少なくとも、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６及びＯ２５抗原多糖、好ましくは、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７（すなわち、少なくとも六価組成物）に共有結合的に連結されたＯ７５、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ及びＯ２５Ｂ抗原多糖のバイオコンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ２５抗原多糖間の重量比は、約２：１：１：１：１：２である。
好ましい実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）は少なくとも、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５及びＯ７５抗原多糖、好ましくは、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７（すなわち、少なくとも九価組成物）に共有結合的に連結されたＯ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５抗原多糖間の重量比は、約２：１：１：１：１：１：１：１：２である。
別の好ましい実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）は少なくとも、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５及びＯ７５抗原多糖、好ましくは、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７（すなわち、少なくとも十価組成物）に共有結合的に連結されたＯ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物中の及び／又は対象に投与される場合のＯ７５：Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ８：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５抗原多糖間の重量比は、約２：１：１：１：１：１：１：１：１：２である。
また、本明細書では、他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する追加のＯ抗原（例えば、単離された形態において、又はグリココンジュゲート若しくはバイオコンジュゲートの一部として）を任意選択によりさらに含む組成物が企図される。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）は、少なくとも上記のとおりの六価、九価又は十価組成物を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖などの１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖、好ましくは、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７に共有結合的に連結された抗原多糖の（バイオ）コンジュゲートをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記のとおりの六価、九価又は十価組成物は、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖又はそのコンジュゲートを含まず、すなわち、そのような組成物は、好ましくはコンジュゲート、好ましくはバイオコンジュゲートの形態でそれぞれ６、９、又は１０種を含むがさらなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含まない。したがって、それは、９種のコンジュゲート、特に、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５及びＯ７５抗原多糖、好ましくは、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ及びＣＲＭ１９７（すなわち、九価組成物）に共有結合的に連結されたＯ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の追加のコンジュゲートを含まない組成物を提供する実施形態である。したがって、それは、１０種のコンジュゲート、特に、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５及びＯ７５抗原多糖、好ましくは、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ及びＣＲＭ１９７（すなわち、十価組成物）に共有結合的に連結されたＯ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原の追加のコンジュゲートを含まない組成物を提供する別の実施形態である。
いくつかの好ましい実施形態では、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、及び／又はＯ２５抗原多糖の各々は、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。Ｏ抗原多糖は、化学的又は他の合成方法によりキャリアタンパク質に連結されていてもよいし、Ｏ抗原多糖は、バイオコンジュゲートの一部であってもよく、好ましくは、バイオコンジュゲートの一部である。好ましくは、組成物により包含される血清型毎のＯ抗原は、キャリアタンパク質にそれぞれ別々にカップリングされ、すなわち、特定の血清型を包含する各グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートは、本発明に従って組成物中で混合される前に別々に生成され得る。キャリアタンパク質は、好ましくは、組成物中の各グリココンジュゲート又はバイオコンジュゲートについて同じであってもよいし、或いは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のいくつか又は全てについて異なってもよく、例えば、異なる血清型のＯ抗原はまた、異なるキャリアタンパク質にコンジュゲートされてもよい。本開示の観点から、当業者に知られている任意のキャリアタンパク質を使用することができる。好適なキャリアタンパク質としては、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、キャリアタンパク質は、ＥＰＡ又はＣＲＭ１９７である。
いくつかの実施形態では、追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１（Ａ）、Ｏ２、（グルコシル化）Ｏ４、Ｏ６（Ａ）、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８（Ａ）、及び／又はＯ２５（Ｂ）抗原多糖の各々は、特にバイオコンジュゲートの一部であるとき、キャリアタンパク質におけるアスパラギン（Ａｓｎ）残基に共有結合的に連結され、Ａｓｎ残基は、グリコシル化コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）を含むグリコシル化部位に存在し、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸（配列番号１）であってもよく、好ましくは、Ａｓｎ残基は、グリコシル化コンセンサス配列Ａｓｎ（Ｇｌｕ）－Ｘ－Ａｓｎ－Ｚ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）を含むグリコシル化部位に存在し、Ｘ及びＺは、独立して、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸（配列番号２）から選択される。キャリアタンパク質は、１～１０個のグリコシル化部位、好ましくは、２～４個のグリコシル化部位、最も好ましくは、４個のグリコシル化部位を含んでもよく、各々がグリコシル化コンセンサス配列を含む。特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、ＥＰＡ－４キャリアタンパク質、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡ－４キャリアタンパク質である。
特定の実施形態では、本明細書において、（ｉ）配列番号３（ＥＰＡ－４キャリアタンパク質）を含む緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａキャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖は、式（Ｏ７５）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；（ｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；（ｉｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖は、式（Ｏ２）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；（ｉｖ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖は、式（Ｏ６Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；（ｖ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖は、式（Ｏ１５）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；（ｖｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖は、式（Ｏ１６）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；（ｖｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１８Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；（ｖｉｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖は、式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；及び（ｉｘ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖は、式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含む）のバイオコンジュゲート（式の各々は、表１で提供され、式の各々について、独立して、ｎは、１～１００、例えば、１～５０、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である）を含む組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）が提供される。
特定の実施形態では、前記組成物（例えば、医薬組成物及び／又は免疫原性組成物）はさらに、（ｘ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８抗原多糖のバイオコンジュゲート（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８抗原多糖は、表１に示されるとおりの式（Ｏ８）の構造を含み、この構造に関するｎは、１～１００、例えば、１～５０、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のコンジュゲート、及び少なくとも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖、好ましくは、Ｏ６Ａ抗原多糖のコンジュゲートを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のコンジュゲートは、約１．２～８倍、例えば、約２～４倍高い、例えば、組成物中に存在するＯ６抗原多糖の濃度より１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、３、４、５、６、７、又は８倍高い濃度（全ての濃度は、Ｏ抗原多糖の重量に基づく）で組成物中に存在する。好ましくは、組成物中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖は、組成物中のＯ６抗原多糖の濃度の約１．５～２．５倍、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、又は２．５倍である濃度で存在する。
特定の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、Ｏ１Ａ：Ｏ２：グルコシル化Ｏ４：Ｏ６Ａ：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５Ｂ：Ｏ７５のバイオコンジュゲートは、１：１：１：１：１：１：１：２：２、１：１：１：１：１：１：１：２：１．５、２：１：１：２：１：１：１：４：３、２：１：１：２：１：１：１：４：４、２：１：２：２：２：２：２：４：４、好ましくは、約１：１：１：１：１：１：１：２：２の比（Ｏ抗原多糖の重量）で存在する。
特定の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、Ｏ１Ａ：Ｏ２：グルコシル化Ｏ４：Ｏ６Ａ：Ｏ８：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８Ａ：Ｏ２５Ｂ：Ｏ７５のバイオコンジュゲートは、１：１：１：１：１：１：１：１：２：２、２：１：２：２：２：２：２：２：４：４、２：１：１：２：１：１：１：１：４：３、又は２：１：１：２：１：１：１：１：４：４、好ましくは、約１：１：１：１：１：１：１：１：２：２の比（Ｏ抗原多糖の重量）で存在する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲート、及び少なくとも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートは、約８～約５０μｇ／ｍＬ、好ましくは約１２～約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１６～約３２μｇ／ｍＬ、例えば、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２μｇ／ｍＬ、好ましくは約３２μｇ／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートの濃度は、好ましくは、組成物中に存在するＯ６バイオコンジュゲートの濃度より約１．２～約８倍、例えば、約２～４倍高い、例えば、１．５、２、３、４、５、６、７、又は８倍高い。
１つの特定の実施形態では、医薬組成物が提供され、その組成物は、
（ｉ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート；
（ｉｉ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖のバイオコンジュゲート；
（ｉｉｉ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲート；
（ｉｖ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート；
（ｖ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖のバイオコンジュゲート；
（ｖｉ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖のバイオコンジュゲート；
（ｖｉｉ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート；
（ｖｉｉｉ）約２８～３６、好ましくは、約３２μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖のバイオコンジュゲート；及び
（ｉｘ）約２８～３６、好ましくは、約３２μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖は、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造をそれぞれ含み、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、より好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。
ある特定の実施形態では、そのような組成物はさらに、
（ｘ）約１２～２０、好ましくは、約１６μｇ／ｍＬの多糖濃度でＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み；
Ｏ８抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ８）の構造を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、より好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。
一実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含む組成物が提供され、Ｏ７５抗原多糖は、少なくとも約３２μｇ／ｍＬの濃度である。
一実施形態では、
（ｉ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｉｉ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖は、式（Ｏ２）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖は、式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｉｖ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖は、式（Ｏ６Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖は、式（Ｏ１５）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖｉ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖は、式（Ｏ１６）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１８Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖｉｉｉ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖は、式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；及び
（ｉｘ）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖は、式（Ｏ７５）の構造を含む）のバイオコンジュゲートを含む組成物が提供され；
式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造の各々は、表１に示され、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、より好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
組成物中に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４－Ｇｌｃ＋、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５からなる。好ましくは、キャリアタンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ－４）であり、より好ましくは、ＥＰＡ－４は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。好ましくは、Ｏ７５抗原多糖とＯ１Ａ、Ｏ２、及び／又はＯ６Ａ抗原多糖の濃度の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である。好ましくは、組成物中に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、１：１：１：１：１：１：１：２：２の比でＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４－Ｇｌｃ＋、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５からなる。
１つの一般的な態様では、本明細書では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物が提供され、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の濃度の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～４：１、好ましくは、約１．５：１～約２．５：１、より好ましくは、約２：１である。
ある特定の実施形態では、組成物はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、
好ましくは、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４はグルコシル化されており、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂである。
ある特定の実施形態では、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１Ａ）の構造を含み、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ２）の構造を含み、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含み、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ６Ａ）の構造を含み、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１５）の構造を含み、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１６）の構造を含み、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ１８Ａ）の構造を含み、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含み、及び
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ７５）の構造を含み、
各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。
ある特定の実施形態では、Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の重量比は、１：１：１：１：１：１：１：２：２である。
ある特定の実施形態では、Ｏ７５抗原多糖の濃度は、約８～約５０μｇ／ｍＬ、好ましくは、１２～４０μｇ／ｍＬ、例えば、１６～３２μｇ／ｍＬ、好ましくは、約３２μｇ／ｍＬである。
ある特定の実施形態では、組成物はさらに、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含む。
特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ８）を有するＯ８抗原多糖を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。
ある特定の実施形態では、各キャリアタンパク質は、独立して、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択される。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）又はＣＲＭ１９７である。
ある特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列を有する１～２０個、例えば、１～１０個、又は２～４個のグリコシル化コンセンサス配列を含み、最も好ましくは、キャリアタンパク質は、４個のグリコシル化コンセンサス配列を含む。
特定の実施形態では、各キャリアタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡである。
ある特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲーション又は化学的コンジュゲーションによりキャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。化学的コンジュゲーションは、例えば、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）、単一末端コンジュゲーション、（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバミン酸塩（ｅＴＥＣ）スペーサーによるコンジュゲーション、ＡＤＨスペーサーを伴うか又は伴わないシアニル化化学反応（ＣＮＢｒ、ＣＤＡＰ）、チオエーテル化学反応（マレイミド／ブロモアセチルリンカー系）、又はＥＤＣ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドゼロリンカー化学反応を含み得る。
ある特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲーションによってキャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、多糖は、キャリアタンパク質中のグリコシル化部位のＡｓｎ残基に共有結合的に連結されている。
別の態様では、本明細書では、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ－４）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲート（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１Ａ）の構造を含む）；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖は、式（Ｏ２）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖は、式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖は、式（Ｏ６Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖は、式（Ｏ１５）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖は、式（Ｏ１６）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１８Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖は、式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；及び
ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖は、式（Ｏ７５）の構造を含む）のバイオコンジュゲートを含む組成物が提供され；
ＥＰＡ－４は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造の各々は、表１に示され、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、より好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
Ｏ７５抗原多糖とＯ６Ａ抗原多糖の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である。
ある特定の実施形態では、組成物はさらに、キャリアタンパク質にそれぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含む。
ある特定の実施形態では、組成物は、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含み、ｎは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートは、
（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖についてのｒｆｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するグルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（グルコシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖を修飾して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖を生成することができる）；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７及び８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するトランスロカーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（トランスロカーゼは、バクトプレノール連結型グルコースを移行させることができ、グリコシルトランスフェラーゼは、バクトプレノールをグルコシル化することができる）；
（ｉｖ）キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列；及び
（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖をキャリアタンパク質に共有結合的に連結することができるオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（好ましくは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＰｇｌＢである）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において生成されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物はさらに、水銀誘導体チロメサールなどの保存剤を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、０．００１％～０．０１％のチメロサールを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、保存剤を含まない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば、免疫原性組成物）はアジュバントを含むか、又はアジュバントと組み合わせて投与される。本明細書に記載される組成物と組み合わせた投与のためのアジュバントは、前記組成物の投与の前（例えば、７２時間、４８時間、２４時間、１２時間、６時間、２時間、１時間、１０分位内）、それと同時に、又はその後（例えば、７２時間、４８時間、２４時間、１２時間、６時間、２時間、１時間、１０分位内）に投与され得る。いくつかの実施形態では、用語「アジュバント」は、本明細書に記載される組成物と組み合わせて、又はその一部として投与される場合、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を増加、増強、及び／又は増大させるが、アジュバント化合物が単独で投与される場合、バイオコンジュゲートに対する免疫応答を生成しない化合物を指す。いくつかの実施形態では、アジュバントは、バイオコンジュゲートペプチドに対して免疫応答を引き起こし、アレルギー又は他の有害な反応をもたらさない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかの機構によって、免疫応答を増強し得る。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される組成物は、バイオコンジュゲートを除いてアジュバントを含まず、及び／又はバイオコンジュゲートを除いてアジュバントと組み合わせて投与されない（バイオコンジュゲートがいくつかの固有のアジュバント特性を含む場合、これらは無視され、これらの実施形態では、外来性のアジュバントは添加されない）。
好適なアジュバントの例としては、アルミニウム塩（アラム）（アラム又はナノアラム製剤を含むナノ粒子を含む水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び酸化アルミニウムなど）、リン酸カルシウム、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）又は３－デ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）（例えば、英国特許第２２２０２１１号明細書、欧州特許第０９７１７３９号明細書、欧州特許第１１９４１６６号明細書、米国特許第６４９１９１９号明細書を参照されたい）、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３及びＡＳ０４（全てＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；例えば、ＡＳ０４に関しては、欧州特許第１１２６８７６号明細書、米国特許第７３５７９３６号明細書、ＡＳ０２に関しては、欧州特許第０６７１９４８号明細書、欧州特許第０７６１２３１号明細書、米国特許第５７５０１１０号明細書を参照されたい）、ＭＦ５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イミダゾピリジン化合物（国際公開第２００７／１０９８１２号パンフレットを参照されたい）、イミダゾキノキサリン化合物（国際公開第２００７／１０９８１３号パンフレットを参照されたい）、デルタ－インスリン、ＳＴＩＮＧ－活性化合成環状ジヌクレオチド（例えば、米国特許出願公開第２０１５００５６２２４号明細書）、レシチン及びカルボマーホモポリマーの組み合わせ（例えば、米国特許第６６７６９５８号明細書）、並びにサポニン、例えば、ＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１（例えば、Ｚｈｕ Ｄ ａｎｄ Ｗ Ｔｕｏ，２０１６，Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ３：ｅ１１３、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ、Ｉｓｃｏｍｓ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘなど、これらは、任意選択により、ＱＳ７と組み合わされる（Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号明細書を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントは、フロイントアジュバント（完全又は不完全）である。他のアジュバントは、水中油型エマルション（例えば、スクアレン又は落花生油）であり、任意選択によりモノホスホリルリピドＡなどの免疫賦活剤と組み合わせられる（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６－９１（１９９７）を参照のこと）。別のアジュバントは、ＣｐＧである。アジュバントのさらなる例は、免疫賦活剤を含むリポソーム（例えば、例えばＳ０１Ｅ及びＡＳ０１Ｂ中のＭＰＬ及びＱＳ２１（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２０６７５８号明細書）である。アジュバントの他の例は、イミダゾキノリン（イミキモド及びＲ８４８など）である。例えば、Ｒｅｅｄ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１９：１５９７－１６０８を参照されたい。ある特定の実施形態では、アジュバントは、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含有する。ＴＬＲ４アゴニストは、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ ａｎｄ ＳＧ Ｒｅｅｄ，２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １２：７９３－８０７を参照されたい。ある特定の実施形態では、アジュバントは、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９（例えば、欧州特許第１３８５５４１号明細書）、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ（グリコピラノシルリピドアジュバント、合成二糖糖脂質；例えば、米国特許出願公開第２０１００３１０６０２号明細書、米国特許第８７２２０６４号明細書）、ＳＬＡ（例えば、Ｃａｒｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：ｅ１０８（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１６．６３）、これは、ヒトワクチン用のＴＬＲ４リガンドを最適化するための構造－機能アプローチを説明している）、ＰＨＡＤ（リン酸化ヘキサアシル二糖）、３Ｄ－ＰＨＡＤ（この構造は、ＧＬＡの構造と同一である）、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ（３Ｄ（６Ａ）－ＰＨＡＤ）（ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、及び３Ｄ（６Ａ）ＰＨＡＤは、合成リピドＡバリアントである、例えば、これらの分子の構造も提供するａｖａｎｔｉｌｉｐｉｄｓ．ｃｏｍ／ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ／ａｄｊｕｖａｎｔｓを参照されたい）、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０－６３－６）、ＯＮＯ４００７、ＯＭ－１７４などのリピドＡ、又はその類似体若しくは誘導体を含むＴＬＲ４アゴニストを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、アジュバントを含まず、アジュバントと組み合わせて投与されない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、対象への意図した投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、皮下投与、非経口投与、経口投与、皮内投与、経皮投与、結腸直腸投与、腹腔内投与、及び直腸投与に好適であるように製剤化され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、経口投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、気管内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、皮内投与、経皮投与、又は肺投与のために製剤化され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、筋肉内注射によって投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物はさらに、１種以上の緩衝液（例えば、トリス緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、又はスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液）を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物はさらに、１種以上の塩（例えば、トリス－塩酸塩、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、又はアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アラム（硫酸アルミニウムカリウム）、又はそのようなアルミニウム塩の混合物）を含む。
本明細書に記載される組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、又はディスペンサに含まれ得る。
本明細書に記載される組成物は、使用前に保存されてもよく、例えば、組成物は、（例えば、約－２０℃又は約－７０℃で）凍結保存され得るか；冷蔵条件下（例えば、約４℃で）保存され得るか；又は室温で保存され得る。
一態様では、本発明はまた、本発明による組成物を調製する方法であって、要求されるＯ抗原コンジュゲートの各々を（例えば、これらを、例えば、原体の形態で得ること又は製造することによって）提供すること、及び所望の比及び／又は量でそれらを混合して、本発明の組成物（例えば、多価大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、特に、ＥｘＰＥＣ、ワクチン組成物、場合により製剤と称される）を得ることを含む方法を提供する。
免疫応答を誘導する方法
本明細書で提供されるバイオコンジュゲート及び組成物を使用して、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に対する抗体を誘導することができるか、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して対象をワクチン接種することができる。本明細書に記載される対象において免疫応答を誘導する方法は、Ｏ抗原が組成物中に存在するＥｘＰＥＣ株による感染に対する対象のワクチン接種をもたらす。Ｏ抗原亜型が使用されるとき、本発明の方法はまた、同様の抗原性を有する別のＯ抗原亜型に対する免疫応答を誘導することができる。例は、亜血清型間の交差反応性であり、例えば、Ｏ２５Ｂ抗原による免疫化は、Ｏ２５Ｂ及びＯ２５Ａ血清型の両方のＯ－ＬＰＳを認識する抗体を誘導し、グルコシル化Ｏ４による免疫化は、グルコシル化Ｏ４及び非グルコシル化Ｏ４血清型の両方のＯ－ＬＰＳを認識する抗体を誘導し、他の例では、異なるＯ抗原を有するが、抗原性構造において依然として多少の類似性を共有する他の血清型に対する交差免疫化もあり得る（例えば、いくつかの血清は、血清型判定試験において交差反応するように見える）。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ＥｘＰＥＣ感染又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクのあるヒトである。
いくつかの実施形態では、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患は、敗血症を含む。いくつかの実施形態では、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患は、菌血症を含む。いくつかの実施形態では、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患は、尿路感染症、手術部位感染、腹部感染又は骨盤内感染、肺炎、骨髄炎、蜂巣炎、敗血症、菌血症、創傷感染、腎盂腎炎、髄膜炎、腹膜炎、胆管炎、軟部組織感染、化膿性筋炎、化膿性関節炎、眼内炎、化膿性甲状腺炎、副鼻腔炎、心内膜炎、及び前立腺炎の１つ以上を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与後に対象において誘導される免疫応答は、対象における侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか、又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防する。一実施形態では、対象は、投与時に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＥｘＰＥＣ）感染を有する。好ましい実施形態では、対象は、投与時に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＥｘＰＥＣ）感染を有しない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与後に対象において誘導される免疫応答は、組成物で投与された対象のＥｘＰＥＣ感染に起因する症状を、好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％予防するか又は低減するのに有効である。ＥｘＰＥＣ感染の症状は、感染の性質に応じて変動する場合があり、排尿障害、尿意頻数若しくは尿意切迫の増加、膿尿、血尿症、背痛、骨盤痛、排尿中の疼痛、発熱、悪寒、及び／又は嘔気（例えば、ＥｘＰＥＣによって引き起こされる尿路感染症を有する対象において）；高熱、頭痛、肩こり、嘔気、嘔吐、痙攣、眠気、及び／又は光感受性（例えば、ＥｘＰＥＣによって引き起こされる髄膜炎を有する対象における）；発熱、心拍数の増加、呼吸数の増加、尿量の減少、血小板数の減少、腹痛、呼吸困難、及び／又は心機能異常（例えば、ＥｘＰＥＣによって引き起こされる敗血症を有する対象における）を含み得るが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与後の対象において誘導される免疫応答は、ＥｘＰＥＣ感染に罹患している対象の入院の可能性を低減するのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与後の対象において誘導される免疫応答は、ＥｘＰＥＣ感染に罹患している対象の入院の期間を減少させるのに有効である。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物によるワクチン接種は、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患（ＩＥＤ）例えば、尿路性敗血症、菌血症、敗血症などを予防するためのものである。ある特定の実施形態では、ワクチン接種は、尿路感染症の発生又は重症度を予防するか又は低減することである。ある特定の実施形態では、ＩＥＤは、例えば、泌尿生殖器及び／又は腹腔の処置若しくは手術を経ている患者において院内感染の可能性がある。ある特定の実施形態では、ＩＥＤは、例えば、病院、外来外科センター、末期腎疾患施設、長期ケア施設などにおいて、例えば、中心ライン、カテーテルなどを介して、別の状態のために医療を受ける患者において医療関連感染である可能性がある。ある特定の実施形態では、ＩＥＤは、例えば、健康管理リスクに最近曝されていなかった患者において市中感染である可能性がある。
いくつかの実施形態では、対象において腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法は、本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、対象において腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法は、第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖を対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、及び第１の有効量と第２の有効量の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、より好ましくは、約２：１である。いくつかの好ましい実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ６抗原多糖は、１つの組成物として投与される。いくつかの代替的な実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ６抗原多糖は、別々の組成物の組み合わせとして投与される。
いくつかの実施形態では、対象において腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。好ましくは、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４抗原はグルコシル化Ｏ４抗原多糖であり、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂである。好ましくは、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、及びＯ７５抗原はそれぞれ、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造を有し、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。本発明によれば、Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、キャリアタンパク質に、それぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、そのような追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原は、表１に示されるとおりの式（Ｏ８）の構造を好ましくは有するＯ８抗原多糖を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つの組成物として投与される。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、２つ以上の別々の組成物の組み合わせとして投与される。別々の投与の回数を制限することが好ましく、そのため抗原の大部分又は全てを含む単一の組成物の使用が好ましい。
一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を誘導するための組成物を投与する方法であり、組成物は、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、及び投与されるＯ７５抗原多糖の濃度は、用量当たり少なくとも１６μｇである。
いくつかの実施形態では、対象において腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法は、第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖を対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、及び第１の有効量と第２の有効量の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、より好ましくは、約２：１である。いくつかの好ましい実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ１抗原多糖は、１つの組成物として投与される。いくつかの代替的な実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ１抗原多糖は、組成物の組み合わせとして投与される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。好ましくは、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４抗原はグルコシル化Ｏ４抗原多糖であり、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂである。好ましくは、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、及びＯ７５抗原はそれぞれ、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造を有し、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。本発明によれば、Ｏ７５抗原多糖とＯ１抗原多糖の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、キャリアタンパク質に、それぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、そのような追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原は、表１に示されるとおりの式（Ｏ８）の構造を好ましくは有するＯ８抗原多糖を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つの組成物として投与される。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、２つ以上の別々の組成物の組み合わせとして投与される。別々の投与の回数を制限することが好ましく、そのため抗原の大部分又は全てを含む単一の組成物の使用が好ましい。
いくつかの実施形態では、対象において腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法は、第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖を対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、及び第１の有効量と第２の有効量の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、例えば、約１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、より好ましくは、約２：１である。いくつかの好ましい実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ２抗原多糖は、１つの組成物として投与される。いくつかの代替的な実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ２抗原多糖は、組成物の組み合わせとして投与される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。好ましくは、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４抗原はグルコシル化Ｏ４抗原多糖であり、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂである。好ましくは、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、及びＯ７５抗原はそれぞれ、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造を有し、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。本発明によれば、Ｏ７５抗原多糖とＯ２抗原多糖の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、キャリアタンパク質に、それぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を対象に投与することを含む。好ましくは、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つの組成物として投与される。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、２つ以上の別々の組成物の組み合わせとして投与される。別々の投与の回数を制限することが好ましく、そのため抗原の大部分又は全てを含む単一の組成物の使用が好ましい。
いくつかの実施形態では、対象において腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法は、第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖を対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、第１の有効量と第２の有効量の比は、約１：４～１：０．５、好ましくは、約１：２～１：１、より好ましくは、約１：１、例えば、約１：１．５、１：１．４、１：１．３、１：１．２、１：１．１、１：１．０、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、又は１：０．５である。いくつかの好ましい実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ２５抗原多糖は、１つの組成物として投与される。いくつかの代替的な実施形態では、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ７５抗原多糖及びキャリアタンパク質に共有結合的に連結されたＯ２５抗原多糖は、組成物の組み合わせとして投与される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結されている。好ましくは、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４抗原はグルコシル化Ｏ４抗原多糖であり、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂである。好ましくは、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、及びＯ７５抗原はそれぞれ、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造を有し、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。本発明によれば、Ｏ７５抗原多糖とＯ２５抗原多糖の比は、約１：４～約１：０．５、好ましくは、約１：２～約１：１、より好ましくは、約１：１である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、キャリアタンパク質に、それぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、そのような追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原は、表１に示されるとおりの式（Ｏ８）の構造を好ましくは有するＯ８抗原多糖を含み、ｎは、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である。好ましくは、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖は、バイオコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、１つの組成物として投与される。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、２つ以上の別々の組成物の組み合わせとして投与される。別々の投与の回数を制限することが好ましく、そのため抗原の大部分又は全てを含む単一の組成物の使用が好ましい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、組合せ物、及びバイオコンジュゲートは、抗体、好ましくは、オプソニン作用活性を有する抗体の生成を含む免疫応答を誘導するために対象に投与され得る。そのような抗体は、当業者に知られる手法（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈殿など）を使用して単離され得る。
本明細書に記載されるバイオコンジュゲート及び組成物の対象において免疫応答を生成する能力は、当業者に知られるか又は本明細書に記載される任意の手法を使用して評価され得る。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートの対象において免疫応答を生成する能力は、対象（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はサル）又は対象のセットを本明細書に記載されるバイオコンジュゲートで免疫化し、対照（例えば、ＰＢＳ）で追加の対象（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はサル）又は対象のセットを免疫化することによって評価され得る。その後、対象又は対象のセットは、ＥｘＰＥＣでチャレンジされ、ＥｘＰＥＣの対象又は対象のセットにおいて疾患（例えば、ＵＴＩ、菌血症、又は他の疾患）を引き起こす能力が決定され得る。当業者は、対照で免疫化された対象又は対象のセットがＥｘＰＥＣによるチャレンジの後に疾患に罹患するが、本明細書に記載されるバイオコンジュゲート又はその組成物で免疫化された対象又は対象のセットが疾患に罹患しにくいか又は疾患に罹患しない場合、バイオコンジュゲートが対象において免疫応答を生成できることを認識するであろう。本明細書に記載されるバイオコンジュゲート又はその組成物のＥｘＰＥＣに由来するＯ抗原と交差反応する抗血清を誘導する能力は、例えば、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（例えば、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｖａｃｃｉｎｅ ３４：４１５２－４１６０を参照のこと）、又はＥＣＬ系イムノアッセイなどによって試験され得る。
例えば、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートの対象において免疫応答を生成する能力は、グリココンジュゲート系ワクチンの承認を得るために使用された確立され、承認された方法を表す血清殺菌力アッセイ（ＳＢＡ）又はオプソニン作用死滅アッセイ（ＯＰＫアッセイ、又はＯＰＫＡ）を使用して評価され得る。そのようなアッセイは、当該技術分野でよく知られており、簡潔に述べると、目的の標的（例えば、Ｏ抗原多糖、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖）に対する抗体を、対象（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はサル）にそのような抗体を誘発する化合物を投与することによって生成する工程及び単離する工程を含む。その後、抗体の殺菌能が、例えば、抗体及び補体並びに（アッセイに応じて）好中球の存在下で目的の細菌（例えば、関連する血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を培養し、例えば、標準的な微生物学的手法を使用して細菌の死滅及び／又は中和を媒介する抗体の能力を評価することによって評価され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バイオコンジュゲートワクチンのためのＯＰＫアッセイの例については、例えば、Ａｂｂａｎａｔ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：ｅ００１２３－１７を参照されたい。ＯＰＫアッセイは、モノプレックス又はマルチプレックス形式で実施することができ、マルチプレックス形式（例えば、同時に複数の血清型を試験すること）が典型的には好ましい。マルチプレックスＯＰＫアッセイは、本明細書で「ＭＯＰＡ」と称される場合がある。
特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のバイオコンジュゲート及び少なくとも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖のバイオコンジュゲートを含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖の有効量は、組成物中に存在する他のバイオコンジュゲートのいずれかの濃度より約１．２～８倍、例えば、約２～４倍高く、例えば、１．５、２、３、４、５、６、７又は８倍高い。そのような実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖の有効量は、例えば、投与当たり５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８μｇなど、投与当たり約５～１８μｇである。好ましくは、約８～１６μｇのＯ７５抗原多糖が、投与毎に投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、１つ以上の他の療法（例えば、抗細菌又は免疫調節性療法）と組み合わせて対象に投与される。１つ以上の他の療法は、ＥｘＰＥＣ感染の治療又は予防において有益であり得るか又はＥｘＰＥＣ感染と関連する症状又は状態を寛解させ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の他の療法は、鎮痛剤又は抗熱剤である。ある特定の実施形態では、療法は、５分未満間隔から１週間未満間隔で投与される。当業者に知られる任意の抗細菌剤（例えば、抗生物質）が、本明細書に記載される組成物と組み合わせて使用され得る。
ある特定の実施形態では、本発明によるバイオコンジュゲート又は組成物は、対象に１回投与される。ある特定の実施形態では、本発明によるバイオコンジュゲート又は組成物は、例えば、プライム－ブーストレジメンにおいて対象に２回以上投与される。ある特定の実施形態では、２回の投与間の時間は、少なくとも２週、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、又は少なくとも１５年である。ヒトにおいて、所望の免疫応答は、典型的には、本発明によるバイオコンジュゲート又は組成物の１回の投与によって生成され得る。ある特定の実施形態では、例えば、１０年後の反復投与が提供される。
本明細書で提供される組成物は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に対する抗体を誘導し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、特に、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対して対象をワクチン接種するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「対象」は、本明細書で提供されるバイオコンジュゲート又は組成物を投与されることになるか又は投与された任意の動物、好ましくは、哺乳動物を意味する。用語「哺乳動物」は本明細書で使用する場合、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又は類人猿などの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、ヒトなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ヒト対象は、任意の年齢であり得る。ある特定の実施形態では、対象は、約２ヶ月～約１８歳、例えば、１歳～１８歳のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、少なくとも１８歳のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、１５～５０歳、例えば、１８～４５歳、例えば、２０～４０歳のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト男性である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト女性である。ある特定の実施形態では、対象は、免疫無防備状態である。ある特定の実施形態では、対象は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、１００歳を超えないか、９５歳を超えないか、９０歳を超えないか、８５歳を超えないか、８０歳を超えないか、又は７５歳を超えないヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、少なくとも６０歳であり、及び８５歳を超えないヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、安定した健康状態のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、安定した健康状態の少なくとも６０歳であり、及び８５歳以下のヒト成人である。ある特定の実施形態では、対象は、尿路感染症（ＵＴＩ、すなわち、尿道、膀胱、尿管、及び／又は腎臓における細菌感染；いくつかの実施形態では、これは腎盂腎炎を含む）の病歴を有する、すなわち、対象の生涯において少なくとも１回のＵＴＩエピソードを有したヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、過去２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１年でＵＴＩの病歴を有するヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、過去２年でＵＴＩの病歴を有するヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、再発性ＵＴＩの病歴を有する、すなわち、６ヶ月で少なくとも２回のＵＴＩ又は１年で少なくとも３回のＵＴＩを有したヒト対象である。ある特定の実施形態では、対象は、過去２年で再発性ＵＴＩの病歴を有するヒト対象である。ある特定の実施形態では、対象は、安定した健康状態の６０歳以上のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、過去２年でＵＴＩの病歴を有する６０歳以上のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、過去２年でＵＴＩの病歴を有する少なくとも６０歳であり、及び７５歳未満のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、過去２年でＵＴＩの病歴を有する７５歳以上のヒト対象である。ある特定の実施形態では、対象は、待機的な泌尿生殖器及び／又は腹腔の処置若しくは手術、例えば、経直腸的超音波ガイド前立腺針生検（ＴＲＵＳ－ＰＮＢ）にかけられるために予定された患者である。ある特定の実施形態では、対象は、急性細菌性前立腺炎（ＡＢＰ）、すなわち、前立腺の細菌感染を含むがこれらに限定されない前立腺炎の病歴を有し、すなわち、対象の生涯において、例えば、最近の１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１年で少なくとも１回の前立腺炎エピソードを有したヒトである。
好ましい実施形態では、本発明に従って免疫応答を誘導する組成物又は方法によって誘導される免疫応答は、オプソニン作用活性を有する抗体を含む。キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のグリココンジュゲート）を含む組成物は、ヒトにおいてこの型の機能性抗体を誘導できることが示されており、そのような抗体は、インビボでの細菌の死滅を媒介し、この機構を介して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染から保護することができることが示されている。
別の態様では、本明細書において、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に本明細書に記載されるとおり組成物を投与することを含む方法が提供される。
別の態様では、本明細書において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対して対象にワクチン接種する方法であって、対象に本明細書に記載されるとおり組成物を投与することを含む方法が提供される。ある特定の態様では、本明細書において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、ＥｘＰＥＣに対する抗体を誘導する際の使用のための本明細書に記載されるとおりの組成物が提供される。ある特定の態様では、本明細書において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、ＥｘＰＥＣに対するワクチン接種の際の使用のための本明細書に記載されるとおりの組成物が提供される。ある特定の態様では、本明細書において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、ＥｘＰＥＣに対して対象において抗体を誘導するための医薬の製造のための本明細書に記載されるとおりの組成物の使用が提供される。ある特定の態様では、本明細書において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、ＥｘＰＥＣに対して対象にワクチン接種するための医薬の製造のための本明細書に記載されるとおりの組成物の使用が提供される。
ある特定の態様では、本明細書において、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法における使用のための本明細書に記載されるとおりの組成物が提供される。ある特定の態様では、本明細書において、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における本明細書に記載されるとおりの組成物の使用が提供される。
別の態様では、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖を対象に投与することを含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、第１の有効量と第２の有効量の比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である方法が提供される。
ある特定の実施形態では、免疫応答は、対象における侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防する。
ある特定の実施形態では、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患は、敗血症及び／又は菌血症を含む。
ある特定の実施形態では、方法はさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを対象に投与することを含み、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、
好ましくは、Ｏ１抗原はＯ１Ａであり、Ｏ４はグルコシル化されており、Ｏ６抗原はＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原はＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原はＯ２５Ｂであり、
より好ましくは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖の各々は、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造をそれぞれ含み、各ｎは、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の比は、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である。
ある特定の実施形態では、方法はさらに、キャリアタンパク質に、それぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、キャリアタンパク質の各々は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、対象は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、ＥｘＰＥＣ）感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクのあるヒトである。
ある特定の実施形態では、約８～１６μｇ、好ましくは、約１６ｇのＯ７５抗原多糖が、投与毎に投与される。
ある特定の実施形態では、Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の投与される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の重量比は、１：１：１：１：１：１：１：２：２である。
ある特定の実施形態では、グルコシル化Ｏ４は、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖は、表１に示される式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含み、ｎは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートは、
（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖についてのｒｆｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するグルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（グルコシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖を修飾して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖を生成することができる）；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７及び８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するトランスロカーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（トランスロカーゼは、バクトプレノール連結型グルコースを移行させることができ、グリコシルトランスフェラーゼは、バクトプレノールをグルコシル化することができる）；
（ｉｖ）キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列；及び
（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖をキャリアタンパク質に共有結合的に連結することができるオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（好ましくは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＰｇｌＢである）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において生成されている。
一態様では、本発明はまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５及びＯ７５抗原多糖（それぞれ、各抗原について上で示されるとおりの構造を有する）を含む組成物を提供し、抗原多糖の各々は、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、及び組成物は、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯＯ抗原多糖を含まない（すなわち、九価組成物）。この態様のある特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、ＥＰＡである。この態様の他の実施形態では、キャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７である。この態様のある特定の実施形態では、共有結合は、化学的コンジュゲーションの結果である。他の実施形態では、共有結合は、バイオコンジュゲーションの結果である。この態様のある特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７であり、共有結合は、化学的コンジュゲーションの結果である。この態様の他の実施形態では、キャリアタンパク質は、ＥＰＡであり、共有結合は、バイオコンジュゲーションの結果である。この態様の好ましい実施形態では、組成物は、Ｏ１、Ｏ２、又はＯ６抗原多糖と比較して、好ましくは、Ｏ１、Ｏ２、及びＯ６抗原多糖の各々の１つと比較して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖の増加した量、好ましくは約１．５～４倍の増加、好ましくは、約２倍増加した量を含む。
実施形態
実施形態１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖並びにＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、及びＯ１８からなる群から選択される少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含む組成物であって、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖の濃度と追加のＯ抗原多糖の濃度との比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、好ましくは約１．５～１～２．５：１、より好ましくは約２：１である組成物である。
実施形態１ａは、少なくとも１つの追加のＯ抗原多糖が、Ｏ１、好ましくは、Ｏ１Ａである、実施形態１の組成物である。
実施形態１ａ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１抗原多糖の濃度との比が、２：１である、実施形態１ａの組成物である。
実施形態１ｂは、少なくとも１つの追加のＯ抗原多糖が、Ｏ２である、実施形態１の組成物である。
実施形態１ｂ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１抗原多糖の濃度との比が、２：１である、実施形態１ｂの組成物である。
実施形態１ｃは、少なくとも１つの追加のＯ抗原多糖が、Ｏ４、好ましくは、グルコシル化Ｏ４である、実施形態１の組成物である。
実施形態１ｃ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ４抗原多糖の濃度との比が、２：１である、実施形態１ｃの組成物である。
実施形態１ｄは、少なくとも１つの追加のＯ抗原多糖が、Ｏ６、好ましくは、Ｏ６Ａである、実施形態１の組成物である。
実施形態１ｄ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ６抗原多糖の濃度との比が、２：１である、実施形態１ｄの組成物である。
実施形態１ｅは、少なくとも１つの追加のＯ抗原多糖が、Ｏ１５である、実施形態１の組成物である。
実施形態１ｅ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１５抗原多糖の濃度との比が、２：１である、実施形態１ｅの組成物である。
実施形態１ｆは、少なくとも１つの追加のＯ抗原多糖が、Ｏ１６である、実施形態１の組成物である。
実施形態１ｆ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１６抗原多糖の濃度との比が、２：１である、実施形態１ｆの組成物である。
実施形態１ｇは、少なくとも１つの追加のＯ抗原多糖が、Ｏ１８、好ましくは、Ｏ１８Ａである、実施形態１の組成物である。
実施形態１ｇ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ１８抗原多糖の濃度との比が、２：１である、実施形態１ｇの組成物である。
実施形態１ｈは、キャリアタンパク質に独立して共有結合的に連結されたＯ２５抗原多糖をさらに含み、好ましくは、Ｏ２５抗原がＯ２５Ｂである、実施形態１の組成物である。
実施形態１ｈ１は、Ｏ７５抗原多糖の濃度とＯ２５抗原多糖の濃度との比が、１：１である、実施形態１ｈの組成物である。
実施形態２は、組成物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の２種以上、好ましくは全てを含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、Ｏ４がグルコシル化されており、Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原がＯ２５Ｂである、実施形態１の組成物である。
実施形態３は、
（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖が、式（Ｏ１Ａ）の構造：

を含み、
（ｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖が、式（Ｏ２）の構造：

を含み、
（ｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖が、式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造：

を含み、
（ｉｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖が、式（Ｏ６Ａ）の構造：

を含み、
（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖が、式（Ｏ１５）の構造：
［→２）－β－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→３）－α－Ｌ－ＦｕｃｐＮＡｃ－（１→３）－β－Ｄ－ＧｌｃｐＮＡｃ－（１→］ｎ
を含み、
（ｖｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖が、式（Ｏ１６）の構造：

を含み、
（ｖｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８抗原多糖が、式（Ｏ１８Ａ）の構造：

を含み、
（ｖｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖が、式（Ｏ２５Ｂ）の構造：

を含み、及び
（ｉｘ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖が、式（Ｏ７５）の構造：

を含み、
各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である、実施形態２の組成物である。
実施形態４は、Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の重量比が、１：１：１：１：１：１：１：２：２である、実施形態２又は３の組成物である。
実施形態５は、Ｏ７５抗原多糖の濃度が、約８～約５０μｇ／ｍＬ、好ましくは、１２～４０μｇ／ｍＬ、例えば、１６～３２μｇ／ｍＬ、好ましくは、約２６～３８μｇ／ｍＬ、好ましくは、約３２μｇ／ｍＬである、実施形態１～４のいずれか１つの組成物である。
実施形態６は、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された少なくとも１つの他の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖をさらに含む、実施形態１～５のいずれか１つの組成物である。
実施形態７は、１つの他の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、式（Ｏ８）：
α－Ｄ－Ｍａｎｐ３Ｍｅ－（１→［３）－β－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→２）－α－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→２）－α－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→］ｎ
を有するＯ８抗原多糖を含み、
ｎが、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である、実施形態６の組成物である。
実施形態８は、各キャリアタンパク質が、独立して、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１つの組成物である。
実施形態９は、キャリアタンパク質が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）又はＣＲＭ１９７である、実施形態８の組成物である。
実施形態１０は、キャリアタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列を有する１～２０個、例えば、１～１０個、又は２～４個のグリコシル化コンセンサス配列を含み、最も好ましくは、キャリアタンパク質が、４個のグリコシル化コンセンサス配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つの組成物である。
実施形態１１は、各キャリアタンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡである、実施形態１～１０のいずれか１つの組成物である。
実施形態１２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、バイオコンジュゲーション又は化学的コンジュゲーション、例えば、還元的アミノ化化学反応（ＲＡＣ）、単一末端コンジュゲーション、又は（２－（（２－オキソエチル）チオ）エチル）カルバミン酸塩（ｅＴＥＣ）スペーサーによるコンジュゲーションによってキャリアタンパク質に共有結合的に連結されている、実施形態１～１１のいずれか１つの組成物である。
実施形態１３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、バイオコンジュゲーションによってキャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、多糖が、キャリアタンパク質中のグリコシル化部位のＡｓｎ残基に共有結合的に連結されている、実施形態１２の組成物である。
実施形態１４は、
（ｉ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ－４）キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖は、式（Ｏ２）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｉｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖は、式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｉｖ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖は、式（Ｏ６Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖は、式（Ｏ１５）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖は、式（Ｏ１６）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８Ａ抗原多糖は、式（Ｏ１８Ａ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；
（ｖｉｉｉ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖は、式（Ｏ２５Ｂ）の構造を含む）のバイオコンジュゲート；及び
（ｉｘ）ＥＰＡ－４キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖は、式（Ｏ７５）の構造を含む）のバイオコンジュゲートを含み；
ＥＰＡ－４が、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造の各々が、表１に示され、各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、より好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、及び
Ｏ７５抗原多糖とＯ６Ａ抗原多糖の比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である、組成物である。
実施形態１５は、キャリアタンパク質にそれぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖をさらに含む、実施形態１４の組成物である。
実施形態１６は、グリコシル化Ｏ４が、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖が、表１に示される式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含み、ｎが、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートが、
（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖についてのｒｆｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するグルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（グルコシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖を修飾して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖を生成することができる）；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７及び８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するトランスロカーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（トランスロカーゼは、バクトプレノール連結型グルコースを移行させることができ、グリコシルトランスフェラーゼは、バクトプレノールをグルコシル化することができる）；
（ｉｖ）キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列；及び
（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖をキャリアタンパク質に共有結合的に連結することができるオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（好ましくは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＰｇｌＢである）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において生成されている、実施形態２～１５のいずれか１つの組成物である。
実施形態１７は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、実施形態１～１６のいずれか１つの組成物を対象に投与することを含む方法である。
実施形態１７ａは、対象が前記免疫応答を必要とする、実施形態１７の方法である。
実施形態１８は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ））に対する免疫応答を誘導する方法であって、第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖、及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖を対象に投与することを含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、及び第１の有効量と第２の有効量の比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である方法である。
実施形態１８ａは、対象が前記免疫応答を必要とする、実施形態１８の方法である。
実施形態１９は、免疫応答が、対象において侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防する、実施形態１７～１８ａのいずれか１つの方法である。
実施形態２０は、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患が、敗血症及び／又は菌血症を含む、実施形態１９の方法である。
実施形態２０ａは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患が、敗血症を含む、実施形態２０の方法である。
実施形態２０ｂは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患が、菌血症を含む、実施形態２０の方法である。
実施形態２１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てを対象に投与することをさらに含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、
好ましくは、Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、Ｏ４がグルコシル化されており、Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原がＯ２５Ｂであり、
より好ましくは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖の各々が、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造をそれぞれ含み、各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の重量比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは約１．５：１～約４：１、より好ましくは約２：１である、実施形態１８～２０のいずれか１つの方法である。
実施形態２２は、キャリアタンパク質にそれぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を対象に投与することをさらに含む、実施形態１８～２１のいずれか１つの方法である。
実施形態２３は、キャリアタンパク質の各々が、配列番号３のアミノ酸を含む、実施形態１８～２２のいずれか１つの方法である。
実施形態２４は、対象が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、ＥｘＰＥＣ）感染又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクのあるヒトである、実施形態１７～２３のいずれか１つの方法である。
実施形態２５は、約８～１６μｇ、好ましくは、約１６μｇのＯ７５抗原多糖が、投与毎に投与される、実施形態１７～２４のいずれか１つの方法である。
実施形態２６は、Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の投与される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の重量比が、１：１：１：１：１：１：１：２：２である、実施形態２１～２５のいずれか１つの方法である。
実施形態２７は、グリコシル化Ｏ４が、キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖が、表１に示される式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を含み、ｎが、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
キャリアタンパク質に共有結合的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートが、
（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖についてのｒｆｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するグルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（グルコシルトランスフェラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖を修飾して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖を生成することができる）；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７及び８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するトランスロカーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（トランスロカーゼは、バクトプレノール連結型グルコースを移行させることができ、グリコシルトランスフェラーゼは、バクトプレノールをグルコシル化することができる）；
（ｉｖ）キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列；及び
（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原多糖をキャリアタンパク質に共有結合的に連結することができるオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（好ましくは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＰｇｌＢである）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において生成されている、実施形態２１～２６のいずれか１つの方法である。
実施形態２７は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法のける使用のための実施形態１～１６のいずれか１つの組成物である。
実施形態２８は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における実施形態１～１６のいずれか１つの組成物である。
実施形態２９は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法における使用のための第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖の組合せ物であって、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、及び第１の有効量と第２の有効量の比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である組合せ物である。
実施形態２９ａは、第１の有効量及び第２の有効量が、同じ組成物中にある、実施形態２９の組合せ物である。
実施形態２９ｂは、第１の有効量及び第２の有効量が、別々の組成物中にある、実施形態２９の組合せ物である。
実施形態２９ｃは、対象が前記免疫応答を必要とする、実施形態２９～２９ｂのいずれか１つの組合せ物である。
実施形態３０は、免疫応答が、対象において侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防する、実施形態２９～２９ｃのいずれか１つの組合せ物である。
実施形態３１は、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患が、敗血症及び／又は菌血症を含む、実施形態３０の組合せ物である。
実施形態３２は、有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てをさらに含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、Ｏ４がグルコシル化されており、Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原がＯ２５Ｂであり、好ましくは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖の各々が、それぞれ表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造を含み、各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、及びＯ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である、実施形態２９～３１のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態３３は、キャリアタンパク質にそれぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の有効量をさらに含む、実施形態２９～３２のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態３４は、キャリアタンパク質の各々が、配列番号３のアミノ酸を含む、実施形態２９～３３のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態３５は、対象が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、ＥｘＰＥＣ）感染又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクのあるヒトである、実施形態２９～３４のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態３６は、Ｏ７５抗原多糖の有効量が、約８～１６μｇ、好ましくは、約１６μｇである、実施形態２９～３５のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態３７は、対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における第１の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖及び第２の有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖の組合せ物であって、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、及び第１の有効量と第２の有効量の比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である組合せ物である。
実施形態３７ａは、対象が前記免疫応答を必要とする、実施形態３７の組合せ物である。
実施形態３８は、免疫応答が、対象において侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防する、実施形態３７又は３７ａの組合せ物である。
実施形態３９は、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患が、敗血症及び／又は菌血症を含む、実施形態３８の組合せ物である。
実施形態４０は、医薬の製造において有効量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５抗原多糖の１つ以上、好ましくは全てをさらに含み、抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、Ｏ４がグルコシル化されており、Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及びＯ２５抗原がＯ２５Ｂであり、好ましくは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖の各々が、それぞれ表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造を含み、各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、及びＯ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の比が、約１．２：１～約８：１、好ましくは、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である、実施形態３７～３９のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態４１は、医薬の製造においてキャリアタンパク質にそれぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の有効量をさらに含む、実施形態３７～４０のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態４２は、キャリアタンパク質の各々が、配列番号３のアミノ酸を含む、実施形態３７～４１のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態４３は、対象が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、ＥｘＰＥＣ）感染又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクのあるヒトである、実施形態３７～４２のいずれか１つの組合せ物である。
実施形態４４は、対象への投与のための１つの用量におけるＯ７５抗原多糖の有効量が、約８～１６μｇ、好ましくは、約１６μｇである、実施形態３７～４３のいずれか１つの組合せ物である。
実施例１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染の疫学的データ
菌血症を引き起こす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ血清型分布を決定するために、国際調査研究が実施された。２０１１年と２０１７年の間に、３２００種を超える大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血流分離株が、北米、欧州、アジア太平洋領域、及び南米内の国々において入院した６０歳以上の患者から回収された。各株は、古典的な凝集手法及び配列に基づくＯ遺伝子型判定を使用してＯ抗原血清型について解析された。下の表２を参照されたい。
単離されたヒト血液試料を解析して、その中の病原体の同一性及びそれらの抗生物質耐性パターンを決定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）分離株は、以下の解析に従って試料から得られた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の同一性は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって検証された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）分離株に対するさらなる解析を、抗血清に基づく凝集アッセイを使用して実施して、Ｏ抗原血清型を決定した（ＤｅｂＲｏｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎｉｍａｌ ｈｅａｌｔｈ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｅｒｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １２，１６９－１８５）。凝集法により分類可能ではない分離株はさらに、全ゲノム配列決定に続くＯ血清型特異的ｗｚｙ及びｗｚｘ遺伝子配列に基づくＯ遺伝子型判定によって解析された。
菌血症に関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の世界的規模のセットにおける地理的な位置の階層化は、位置に依存しない上位１０種のＯ血清型の罹患率を示したが、このことは、これらが菌血症を引き起こす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と関連する世界的規模に支配的なＯ血清型となることを示唆している。
菌血症に関連する多剤耐性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）分離株（ｎ＝３４５）、すなわち、臨床的に意味のある抗菌剤の少なくとも３つのクラスに対して耐性であるそれらの株の世界的規模のセットにおいて、上位１０種のＯ血清型の罹患率は、７５．４％である。
疫学解析からの全ての情報をまとめると、１０種の支配的なＯ血清型は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）関連菌血症感染の推定で６０～８０％を包含することができ、分類可能ではない株の下位部分を包含すると仮定した。
菌血症を引き起こす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型の著しい割合を包含する多価ワクチンは非常に有用であろう。したがって、表２のＯ血清型は、Ｏ抗原に基づく多価ワクチンのための良好な候補であろう。そのようなワクチンは、化学的コンジュゲーション又はバイオコンジュゲーション技術を使用して有利に調製することができた。
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原バイオコンジュゲート及び結果として生じるバイオコンジュゲート生成物の生成。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ－ＥＰＡバイオコンジュゲート、Ｏ２－ＥＰＡバイオコンジュゲート、Ｏ４－Ｇｌｃ＋－ＥＰＡバイオコンジュゲート（本明細書の下でＯ４－ＥＰＡとも称される、すなわち、下の例において、Ｏ４抗原多糖のバイオコンジュゲートは、Ｏ４がグルコシル化されており、表１に示されるグリカン構造（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）を有するバリアントである；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）グルコシル化Ｏ４抗原を生成するためのグルコースの付加により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖を特異的に修飾することができる新規の今までに報告されていない未知のグルコシルトランスフェラーゼＧｔｒＳを使用してこのバリアントを作製する記述は、参照により本明細書に組み込まれる２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４０４において詳細が提供される）、Ｏ６Ａ－ＥＰＡバイオコンジュゲート、Ｏ８－ＥＰＡバイオコンジュゲート、Ｏ１５－ＥＰＡバイオコンジュゲート、Ｏ１６－ＥＰＡバイオコンジュゲート、Ｏ１８Ａ－ＥＰＡバイオコンジュゲート、Ｏ２５Ｂ－ＥＰＡバイオコンジュゲート、及びＯ７５－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む１０種のバイオコンジュゲートが生成された。これらのコンジュゲートのグリカンの構造は、表１のそれぞれの式において見ることができる。１０種のバイオコンジュゲートを含む組成物は、本明細書で「ＥｘＰＥＣ１０Ｖ」と称される。Ｏ１Ａ－ＥＰＡ、Ｏ２－ＥＰＡ、Ｏ６Ａ－ＥＰＡ及びＯ２５Ｂ－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む組成物は、「ＥｘＰＥＣ４Ｖ」と称される（例えば、国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレット及び国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレットにおいて以前に記載された）。これらの１０種のバイオコンジュゲート、及びこれらのバイオコンジュゲートのための例示的な産生株の生成は、参照により本明細書に組み込まれる２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４０４において詳細が記載された。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０親株
非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株Ｗ３１１０が、１０種全ての産生株の構築のための親株として使用された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株Ｗ３１１０は、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ（ＣＴ）、ＵＳＡ、製品番号ＣＧＳＣ＃４４７４）から得られた。その関連する遺伝子型は、以前に記載された（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０、Ｆ－、ラムダ－、ＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１、ｒｐｈ－１）、そのゲノム配列は、以前に公表された（Ｈａｙａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２００６．０００７（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００４９）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０株を遺伝子改変して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原バイオコンジュゲートの各々の生成を可能にした（表３）。
バイオコンジュゲート産生株
「ＥｘＰＥＣ４Ｖ」及び「ＥｘＰＥＣ１０Ｖ」組成物は両方ともに、同じ産生株に由来するＯ２－ＥＰＡ及びＯ２５Ｂ－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む。「ＥｘＰＥＣ４Ｖ」組成物は、ｓｔＧＶＸＮ４４１１又はｓｔＬＭＴＢ１０２１７産生株からのＯ１Ａ－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む一方で、「ＥｘＰＥＣ１０Ｖ」組成物は、ｓｔＬＭＴＢ１０２１７産生株からのＯ１Ａ－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む。「ＥｘＰＥＣ４Ｖ」組成物は、ｓｔＧＶＸＮ４１１２産生株からのＯ６Ａ－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む一方で、「ＥｘＰＥＣ１０Ｖ」組成物は、ｓｔＬＭＴＢ１０９２３産生株からのＯ６Ａ－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む。さらに、「ＥｘＰＥＣ１０Ｖ」組成物は、「ＥｘＰＥＣ４Ｖ」のために使用されない産生株からのＯ４－ＥＰＡ（すなわち、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）－ＥＰＡ）、Ｏ８－ＥＰＡ、Ｏ１５－ＥＰＡ、Ｏ１６－ＥＰＡ、Ｏ１８Ａ－ＥＰＡ、及びＯ７５－ＥＰＡバイオコンジュゲートを含む。異なる産生株は、以下に示されるとおり、ＥＰＡキャリアタンパク質及び／又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢの発現のためのプラスミドが異なる可能性がある。いくつかの例示的な産生株の概要は、下の表３において与えられる。
代替的な産生株もまた、例えば、収量の向上及び／又はバイオコンジュゲートのある特定の特徴の変化を有するクローンを発見するためのバイオコンジュゲートのいくつかのために調製され、使用された。
Ｏ抗原生合成（ｒｆｂ）遺伝子クラスター
全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原産生株において、天然に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ゲノムＯ１６：：ＩＳ５－抗原生合成（ｒｆｂ）遺伝子クラスターは、血清型特異的Ｏ抗原構造（これらのＯ抗原構造については表１を参照のこと）のためにコードする選択された血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に由来する選択されたＯ抗原特異的生合成クラスターによって置き換えられた。１０種のドナーｒｆｂクラスターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血液分離株の全ゲノム解析後に選択されたか又は確認された。Ｏ抗原生合成において欠陥のあるＷ３１１０ Ｏ１６：：ＩＳ５ ｒｆｂ遺伝子クラスターの置き換えは、１回の相同組換え事象において達成された。Ｏ１６及びＯ１８Ａ ｒｆｂ遺伝子クラスターの場合、ドナーＤＮＡは、隣接ｇｎｄ及びｒｍｌＣＡ遺伝子を介して組み換えた一方で、他の株のためのｒｆｂ遺伝子クラスターは、隣接ｇｎｄ及びｇａｌＦ遺伝子を介して組み換えた。産生株におけるｒｆｂクラスターの配列は、配列番号９及び１１～１９において提供される。
Ｏ抗原リガーゼ（ｗａａＬ）遺伝子
全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原産生株は、ｗａａＬ遺伝子によってコードされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ゲノムＯ抗原リガーゼの人工的に導入された欠失を保有する。ｗａａＬ株において、Ｏ抗原のリピドＡの移行は妨害され、代わりに生成物収量を増加させるためにＯ抗原のキャリアタンパク質への移行を指示する。
Ｏ抗原グルコシル化（ｇｔｒＡＢＳ）遺伝子
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５産生株において、Ｏ１６Ｏ抗原グルコシル化に関与する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ゲノムｇｔｒＡＢＳ遺伝子は、欠失されている。異なる血清型におけるｇｔｒＡ及びｇｔｒＢ遺伝子は、高度に相同であり及び互換的であるが、ｇｔｒＳ遺伝子は、血清型特異的Ｏ抗原グリコシルトランスフェラーゼをコードする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０において、ＧｔｒＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６Ｏ抗原のα－ｌ－Ｒｈａ－（１→３）－ｄ－ＧｌｃＮＡｃモチーフにおいてグルコース（Ｇｌｃ）残基をＧｌｃＮＡｃ糖に移行させることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ２及びＯ６Ａ産生株において、ｇｔｒＡＢＳ遺伝子の欠失又は置き換えは発生しなかった。これらのＯ抗原は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６ ｇｔｒＳのための天然の基質であるα－ｌ－Ｒｈａ－（１→３）－ｄ－ＧｌｃＮＡｃモチーフを欠損している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４産生株において、Ｗ３１１０ ｇｔｒＳ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４ Ｏ抗原の適切なグルコシル化に適応させるために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４ ｇｔｒＳ遺伝子と置き換えられている（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４ ｇｔｒＳ遺伝子のコード配列は、配列番号５として本明細書で提供され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４ ＧｔｒＳタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４として本明細書で提供される；例えば、２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４０４も参照されたい）。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢ
全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原産生株は、Ｎ－グリコシル化によってキャリアタンパク質のアミノ酸コンセンサス配列上にＯ抗原を移行させることができるＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）グリコシルトランスフェラーゼＰｇｌＢのバリアントを発現した。ＰｇｌＢは、広範な基質認識を有するが、生成物収量が低いため、改変された基質特異性を有するＰｇｌＢバリアントを発現するいくつかの産生株が作製され、生成物収量の向上をもたらした（例えば、国際公開第２０１６／１０７８１８号パンフレット、国際公開第２０１６／１０７８１９号パンフレットを参照のこと）。ｐｇｌＢ遺伝子は、プラスミド上のイソプロピルβ－ｄ－１－チオガルクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの後に配置された。下の表４は、上記のＥｘＰＥＣ４Ｖ及びＥｘＰＥＣ１０Ｖ組成物のためのバイオコンジュゲート用の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原産生株の生成のために使用されるプラスミドによってコードされるＰｇｌＢバリアントを列挙する。ベクター骨格、抗生物質耐性マーカー、及び／又は代替的なＰｇｌＢバリアントにおけるバリエーションを有するさらなるプラスミドもまた、バイオコンジュゲート生成について首尾よく試験されている。
キャリアタンパク質（ＥＰＡ）
全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原産生株は、Ｏ抗原のためのキャリアタンパク質として遺伝的に無毒化された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼトキソイド（ＥＰＡ）を発現した。ＥＰＡトキソイドは、２つの残基における野生型ＥＰＡ毒素とは異なる：Ｌｅｕ５５２はＶａｌに変更され、Ｇｌｕ５５３（触媒ドメインにおける）は欠失された。Ｇｌｕ５５３欠失は、毒性を著しく低減することが報告された。無毒化変異に加えて、４つ（ＥＰＡ－４）のコンセンサスＮ－グリコシル化部位モチーフが導入された。ｅｐａ遺伝子は、プラスミド上のｌ－アラビノース（Ａｒａ）誘導性プロモーターの後に配置された（表４）。表４は、上記の「ＥｘＰＥＣ４Ｖ」及び「ＥｘＰＥＣ１０Ｖ」組成物において使用されるバイオコンジュゲートのための産生株において使用されるプラスミドに限定される。ベクター骨格、抗生物質耐性マーカー、及び／又はＥＰＡバリアントにおけるバリエーション、例えば、コンセンサスＮ－グリコシル化部位モチーフ（例えば、２つのそのようなモチーフを有する、ＥＰＡ－２）の数の変動を有するプラスミドもまた、バイオコンジュゲート生成について首尾よく試験されている。
実施例３：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のバイオコンジュゲートの生成のためのオリゴサッカリルトランスフェラーゼの最適化。
バイオコンジュゲート生成のための収量の最適化は、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼＰｇｌＢの改変によって達成することができ、これは、より効率的な又はより高度のＥＰＡキャリアタンパク質に対する目的のＯ抗原のＮ－グリコシル化をもたらすことができる。グルコシル化Ｏ４（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）Ｏ抗原多糖によるバイオコンジュゲートの生成のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株において、そのような最適化戦略が適用され、バイオコンジュゲート生成物収量を向上させる（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）に特異的な最適化されたＰｇｌＢバリアントをもたらした。
この手法において、ＥＰＡ発現プラスミドを含有するＯ４－Ｇｌｃ＋Ｏ抗原多糖産生株は、様々な異なるＰｇｌＢ発現プラスミドで形質転換され、その各々は、基質特異性を改変するＰｇｌＢタンパク質において異なるアミノ酸置換を含有した。各株のバイオコンジュゲート産生レベル及びプロファイルは、浸透圧ショック実験において振盪フラスコレベルで評価され、読み取りは、Ｏ４－Ｇｌｃ＋特異的モノクローナル抗体を使用する周辺質抽出物に対するキャピラリー電気泳動イムノアッセイによって実施された。
Ｎ３１１Ｖアミノ酸置換を含有する試験されるＰｇｌＢバリアントの１つは、グルコシル化Ｏ４バイオコンジュゲートの生成物収量を著しく向上させることが見出された（全体として参照により本明細書に組み込まれる２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４１５を参照のこと）。
Ｎ３１１Ｖ ＰｇｌＢ－バリアントがさらに改変されたさらなる改善において、Ｙ７７Ｈアミノ酸置換はさらに、Ｏ４－Ｇｌｃ＋特異的生成物の収量を高め、Ｎ３１１Ｖ ＰｇｌＢ－バリアントと比較して増加した程度のジグリコシル化及びトリグリコシル化生成物を示し、他の改変は、生成物収量に対して中立の又は負の効果になることが見出された（全体として参照により本明細書に組み込まれる２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４１５を参照のこと）。プラスミドｐＬＭＴＢ４００８（ＳｐＲ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン使用が最適化され、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）－基質最適化された変異Ｙ７７Ｈ及びＮ３１１Ｖを有するＰｇｌＢバリアントをコードする。
野生型（ｗｔ）Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）グリコシルトランスフェラーゼＰｇｌＢと比較してＮ３１１Ｖ及びＹ７７Ｈアミノ酸置換を含有するＯ４－Ｇｌｃ＋Ｏ抗原多糖についての最適化された基質特異性を有するＰｇｌＢバリアントは、第１ラウンドの最適化されたＰｇｌＢ－Ｎ３１１Ｖバリアントと比較して２倍のバイオコンジュゲート収量であることが見出された。
同様に、選別を使用して、最適な収量のＰｇｌＢバリアントもまた、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ組成物における他の９種の血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原バイオコンジュゲート生成のために決定された（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる２０２０年３月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／２３４１５を参照のこと）。
Ｏ１Ａ、Ｏ６Ａ、又はＯ１５抗原多糖を有するバイオコンジュゲートのために、アミノ酸変異Ｎ３１１Ｖ、Ｋ４８２Ｒ、Ｄ４８３Ｈ、及びＡ６６９Ｖを有するＰｇｌＢが最も高い収量を得るために見出された。
Ｏ２、Ｏ８、Ｏ１８、又はＯ２５Ｂ抗原多糖を有するバイオコンジュゲートのために、野生型ＰｇｌＢ（すなわち、７７、８０、２８７、２８９、３１１、４８２、４８３及び６６９位でアミノ酸変異を有しない）が最も高い収量を得るために見出された。
Ｏ１６抗原多糖を有するバイオコンジュゲートのために、アミノ酸変異Ｙ７７Ｈ、Ｓ８０Ｒ、Ｑ２８７Ｐ、Ｋ２８９Ｒ、及びＮ３１１Ｖを有するＰｇｌＢが最も高い収量を得るために見出された。
Ｏ７５抗原多糖を有するバイオコンジュゲートのために、アミノ酸変異Ｎ３１１Ｖを有するＰｇｌＢが最も高い収量を得るために見出された。
これらの結果は、最適なＰｇｌＢバリアントが異なるＯ抗原について異なり、及び所与のＯ抗原多糖を有するバイオコンジュゲートを生成するための最適なＰｇｌＢバリアントが予測不可能であることを示した。
実施例４：１０種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ抗原のバイオコンジュゲートの品質特性。
標的Ｏ抗原のＯ－グリカン残基は、構造的に多様であり、可変的な繰り返し単位を有する。グリコシルトランスフェラーゼＰｇｌＢの特異性及び親和性は、グリカン構造に関連している。したがって、所望の品質特性、例えば、純度、グリカン／タンパク質比などを有するバイオコンジュゲートを作製することは、困難な単純明快ではない課題である。ＰｇｌＢ及びＥＰＡキャリアタンパク質の正しい組み合わせが収量を決定し、グリコシル化効率に影響を及ぼし得る。ＰｇｌＢ及びキャリアタンパク質を最適化することによって、所望の品質特性を有するバイオコンジュゲートが生成された。非常に多い量のキャリアタンパク質は、免疫学的干渉を引き起こす可能性があるため、特に１つ以上のＯ抗原バイオコンジュゲートがともに合わせられ、単一の組成物又はワクチンにおいて投与されるとき、全体的なキャリアタンパク質のより低い閾値を維持することも重要であり得る。そのような現象を回避するために、より高いグリカン／タンパク質比を有するコンジュゲートが好ましい。したがって、ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンに関して、少なくとも同等の（臨床試験に対する対象となった以前に記載されたＥｘＰＥＣ４Ｖワクチンに対して）グリコシル化比が開発された。
バイオコンジュゲートはそれぞれ、以前に記載された方法に従って、バイオリアクター（１０Ｌ及び／又は２００Ｌ体積）中でそれぞれの宿主細胞（実施例２、表３）を培養すること及びバイオコンジュゲートの発現によって生成された。各原体は、対応する多糖血清型の発現されたバイオコンジュゲートを含有するバイオマスを作製するための細菌フェドバッチ発酵によってバッチ式で製造された。細胞は、培養され、ＩＰＴＧ及びアラビノースで誘導された。バイオコンジュゲートは、浸透圧ショックに続くクロマトグラフィー精製によってバイオリアクター培養物中の細胞の周辺質から単離された。このプロセスは、１０種のバイオコンジュゲートの各々について実施された。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖ及びＥｘＰＥＣ４Ｖのための原体（ＤＳ）であるそのように調製された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原バイオコンジュゲートは、同等の重要な品質特性を示した：（１）プロセス関連純度（ＲＰ－ＨＰＬＣにより測定される）は、９５％より高く、（２）多糖／タンパク質比は、約０．１～０．５、大部分は０．１５～０．４５の範囲であり、（３）菌体内毒素（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．３）は、０．５ＥＵ／μｇ未満の多糖であった。個々の多糖鎖の平均長は通常、約１０～２０の繰り返し単位（高分解能ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して測定される）であった。
多糖反復単位の構造は、上記のＥｘＰＥＣ１０Ｖ組成物のためのＤＳである１０種全てのバイオコンジュゲートに関して、表１の対応する血清型についての式において示されるものであることが確認された（インタクトな又はトリプシン消化されたコンジュゲートのＮＭＲ及びＭＳ／ＭＳによって）。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖ製剤（ＤＰ）は、上記の１０種の一価ＤＳの混合物を含む。
実施例５：ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンの毒性学。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖによる単一用量の試験的毒性及び局所耐性試験（非ＧＬＰ）が、雌ＮＺＷウサギにおいて実行された。ある群（ｎ＝２）は、対照（生理食塩水）の筋肉内（ＩＭ）注射を受け（０日目）、第２の群（ｎ＝４）は、０．６ｍＬ（１７６μｇ ＰＳ／ｍＬ）の投与体積を使用して、１０５．６μｇの合計の多糖（ＰＳ）／用量のＥｘＰＥＣ１０ＶのＩＭ注射を受けた（それぞれＯ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５に関して用量当たり９．６：９．６：９．６：９．６：９．６：９．６：９．６：９．６：１９．２：９．６μｇのＰＳ）。剖検は、２日目に実施された。
死亡数は観察されなかった。加えて、臨床所見（ドレイズスコアリングを使用する注射部位の影響を含む）、体重、摂食量、及び体温に関して記載されるワクチンに関連する影響はなかった。組織病理学的には、投与部位又は排出（腸骨）リンパ節で観察されるワクチンに関連する変化はなかった。脾臓中の胚中心形成の最小限の増加は、４頭の治療された動物のうち１頭で観察され（２日目）、注射されたワクチンに対する正常な免疫応答とみなされた。全体的に見て、雌ウサギに対するＥｘＰＥＣ１０Ｖの単一のＩＭ用量の投与は、忍容性が良好であった。
実施例６：ウサギにおけるＥｘＰＥＣ１０Ｖ混合製剤の免疫原性。
ＥｘＰＥＣ４Ｖワクチン（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、及びＯ２５Ｂ血清型のバイオコンジュゲートを含む）は、ラット、ウサギ、及びヒトにおいてこれらの４種の血清型について免疫原性であることが以前に示されている（例えば、国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレット；国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレット；Ｈｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ１４７３－３０９９（１７）３０１０８－１；ＲＷ Ｆｒｅｎｃｋ Ｊｒ，ｅｔ ａｌ，２０１９，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９（６）：６３１－６４０，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ１４７３－３０９９（１８）３０８０３－Ｘ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ４－Ｇｌｕ＋、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、及びＯ７５（全てがキャリアタンパク質としてＥＰＡ－２を有する）のバイオコンジュゲートの免疫原性は、ラットに別々に投与されるとき（一価）、これらのバイオコンジュゲートの各々もまた、免疫原性であることが確認されたが、それは、ＥＬＩＳＡデータが、これらのバイオコンジュゲートの各々が、高レベルの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に特異的な抗体を誘発できたことを示したためである（示されない）。
上記のとおりの１０種のバイオコンジュゲートの混合物を含有した十価ワクチンの免疫原性も試験された。ニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギ（雌、１２～１６週齢）は、２週間隔で投与されるＥｘＰＥＣ１０Ｖ又は生理食塩水による３回の筋肉内免疫化を受けた（表５；０、１４、及び２７日目の投与）。これらの実験において使用されるＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンの一部である１０種の多糖は、４個のグリコシル化の部位（ＥＰＡ－４）を含有するキャリアタンパク質ＥＰＡにコンジュゲートされた。ワクチンは、３種の異なる用量で製剤化された：群１（「高用量」）：８μｇ／用量のＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ７５並びに１６μｇ／用量のＯ２５Ｂ；群２（「中用量」）：４μｇ／用量のＯ２、Ｏ４、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ７５、８μｇ／用量のＯ１Ａ及びＯ６Ａ並びに１６μｇ／用量のＯ２５Ｂ；群３（「低用量」）：０．４μｇ／用量のＯ２、Ｏ４、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ７５、０．８μｇ／用量のＯ１Ａ及びＯ６Ａ並びに１．６μｇ／用量のＯ２５Ｂ。対照群（群４）の動物は、生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液）（表５）のみを受容した。
抗体応答は、０日目（免疫化前）並びに免疫化後１４、２７及び４２日目に評価された。ワクチン中に含まれるバイオコンジュゲート及びキャリアタンパク質ＥＰＡの各々によって誘導される血清抗体レベルは、コーティング材料として型に特異的なＬＰＳを使用してＥＬＩＳＡ（総ＩｇＧ）によって測定された。抗体力価は、４パラメーターロジスティック非線形回帰モデルにおいてプロットされる二つ組の１２工程の滴定曲線に基づく５０％効果濃度に対応するＥＣ５０値として報告された。機能活性は、ＯＰＫによって決定された。
結果は図１において示され、表６において要約される。
高用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖ（群１）は、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ２５Ｂに関する生理食塩水対照と比較して、調査された全ての時点（免疫化後１４、２７及び４２日目）で著しく高いＩｇＧ抗体レベルを誘導した（図２、表６）。生理食塩水対照と比較してＯ８及びＯ７５コンジュゲートによって誘導される著しく高い抗体力価は、免疫化後２７及び４２日目に観察された（図１、表６）。
中用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖ（群２）及び低用量（群３）は、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１６及びＯ２５Ｂに関する生理食塩水対照と比較して、調査された全ての時点（免疫化後１４、２７及び４２日目）で著しく高い抗体レベルを誘導した（図１、表６）。生理食塩水対照と比較してＯ８、Ｏ１８Ａ及びＯ７５コンジュゲートによって誘導される著しく高い抗体力価は、免疫化後２７及び４２日目に観察され、ウサギにおけるブースト用量が、これらのＯ血清型に対する応答を増大させることを示唆している（図１、表６）。
Ｏ１５コンジュゲートに関して、対照群から外れ値の動物を取り除く感受性解析は、３つ全ての用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンが、生理食塩水対照と比較して免疫化後の１４、２７及び４２日目に抗体応答の著しい増大を誘導することを示した（図１、表６）。
キャリアタンパク質ＥＰＡによって誘導される抗体は、調査される全ての時点（１４、２７及び４２日目）で試験されたＥｘＰＥＣ１０Ｖの３つの用量（高、中及び低）に関する生理食塩水治療（対照）群におけるＥＰＡ抗体力価より著しく高かった（図１）。
用量間の比較（示されない）は、ワクチン接種後１４日目に、高用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖが、試験されるコンジュゲート（Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ２５Ｂ）の大部分について低用量と比較して著しく高い抗体応答を誘導したことを示した。中用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖもまた、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５に関する低用量と比較して著しく高い抗体応答を誘導した。Ｏ８コンジュゲートに関して、ＥｘＰＥＣ１０Ｖの３つ全ての製剤は、ワクチン接種後の１４日目に同様のレベルの抗体を誘導した。
低用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１６、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５コンジュゲートに関する高用量及び中用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖと比較してワクチン接種後の４２日目（プライム及び２回のブースト投与の後）に抗体応答の著しい増大を誘導した。これらの知見は、コンジュゲートワクチンによる他の実験と一致しており、例えば、用量と最初のワクチン接種に対する抗体応答の大きさの間の明白な関連性は、肺炎球菌ワクチンでワクチン接種された乳幼児において観察されなかった（Ｐｏｏｌｍａｎ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１３，１２（１２）：１３７９－９４）。
Ｏ６Ａ、Ｏ８及びＯ１５コンジュゲートに関するワクチン接種後の４２日目に試験されるＥｘＰＥＣ１０Ｖの３つの用量間で著しい差はなかった。Ｏ１８Ａコンジュゲートに関して、高用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖは、ワクチン接種後の４２日目に中用量と比較して著しく高い抗体応答を誘導した。
キャリアタンパク質（ＥＰＡ）に関して、高用量及び中用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖは、ワクチン接種後の１４日目に低用量と比較して著しく高い抗体応答を誘導した。高用量のワクチンはまた、ワクチン接種後の４２日目に低用量と比較して著しく高い抗体応答を誘導した。
結論として、０、１４、２７日目に筋肉内注射を介して投与されるＥｘＰＥＣ１０Ｖの３つの製剤（高、中及び低）は、ウサギにおいて免疫原性である。
今までに、ウサギにおいてこのワクチンによって誘導される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を死滅させることができる機能性抗体は、血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６及びＯ２５Ｂに関して示された。
さらなる実験において、ＥｘＰＥＣ１０ＶワクチンのＧＭＰバッチ（生成については上の実施例４を参照のこと）が調製され、毒性試験の一部としてＮＺＷウサギに注射された（表７）。この試験において、ＮＺＷウサギ（雄及び雌）は、ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンの３回の筋肉内注射（０．６ｍＬ）（１、１５及び２９日目）を受容し、対照群は、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液（生理食塩水）を受容した。ワクチンの各用量は、血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ７５に関して９．６μｇの多糖（ＰＳ）及び血清型Ｏ２５Ｂに関して１９．２μｇのＰＳを含有し、１０５．６μｇの総ＰＳ（１７６μｇの総ＰＳ／ｍＬ）及び３８２．８μｇの総ＥＰＡ（６３８μｇのＥＰＡ／ｍＬ）に対応する。Ｏ抗原及びキャリアタンパク質（ＥＰＡ）に対するＩｇＧ力価は、治療前期間中（１日目）並びに免疫化後の３１及び５０日目に回収される試料から決定された。
全てのＯ抗原及びキャリアタンパク質ＥＰＡに対する抗体応答における著しい増大は、生理食塩水のみを受容した対照群と比較してＥｘＰＥＣ１０Ｖを受容した群においてワクチン接種後の３１及び５０日目に観察された（図２、表８）。Ｏ１Ａ血清型に関して、ワクチン接種された動物が対照と比較されたとき、著しく高い抗体応答はまた１日目（ベースライン）に観察された。これらの結果は、一部の動物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に予め暴露されたか又はＯ１Ａ－ＬＰＳと交差反応する抗体を有することを示唆している。
実施例７：ヒトにおけるＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンによる第１／２ａ臨床試験
現在、ＩＥＤを予防するのに利用可能なワクチンは存在しない。ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンを含む血清型（Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５）は、ＳＴ１３１を含む抗菌剤耐性ＩＥＤを引き起こすＥｘＰＥＣ分離株の大部分も表す臨床的に意味のあるＥｘＰＥＣ株の大部分によって引き起こされる侵襲性疾患に対処するために選択された。選択される血清型は、高齢集団における血流感染を引き起こす１０種の流行しているＥｘＰＥＣ Ｏ血清型を代表するものであり、ＥｘＰＥＣによって引き起こされる血流感染のおよそ７０％に関与する。
侵襲性疾患の予防におけるコンジュゲートワクチンの作用機序は、抗生物質耐性機構によって影響されないと予想されるため、ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンは、薬物耐性及び薬物感受性Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５血清型によって引き起こされるＩＥＤに対する防御をもたらすと考えられる。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖにおいても見出される４種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原コンジュゲート（Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ及びＯ２５Ｂ）のサブセットで構成される初期のワクチン候補であるＥｘＰＥＣ４Ｖの先行する臨床実験がある。４つの完了した臨床試験（２つの第１相試験、２つの第２相試験）からの結果に基づいて、ＥｘＰＥＣ４Ｖは、試験参加者によって忍容性が良好であり、血清型（Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ及びＯ２５Ｂ）当たり最大１６μｇの多糖（ＰＳ）の用量でワクチンに関連する安全性シグナルは観察されなかった。最も多い有害事象（ＡＥ）は、グレード１及び２であり、非常に少ないグレード３のＡＥが報告された。遅発型の非自発的局所ＡＥ（ワクチン接種後の５日目の後に始まるＡＥ）は、より高い用量のＥｘＰＥＣ４Ｖで主に観察された。各試験において、ＥｘＰＥＣ４Ｖワクチンは、免疫原性であることが示されたが、これは、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）によって測定されるとおり、用量依存的ワクチン免疫応答、及びＯ抗原特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価の増大を実証している。抗体の機能活性は、ＥｘＰＥＣ４Ｖに最適化されたオプソニン作用死滅アッセイ（ＯＰＫＡ）により実証された。ＥＬＩＳＡ及びＯＰＫＡ試験結果の共同の解析は、アッセイ応答間の相関（第２相臨床試験［試験４Ｖ－ＢＡＣ２００１］において３０日目及び３６０日目についてそれぞれピアソン相関係数≧０．６１及び≧０．４８）を示したが、これは、ＥｘＰＥＣ４Ｖ抗体力価の主要な測定として及び機能抗体活性を予測するＥＬＩＳＡの使用を裏付けている。免疫原性データの解析は、ＥｘＰＥＣ４Ｖによるワクチン接種の後の３年間の免疫応答の耐久性を実証した。現在、ＥｘＰＥＣ４Ｖでワクチン接種され、血清型特異的オプソニン作用抗体の高い力価を有したヒトの血清は、引き続いてＯ２５Ｂ又はＯ２血清型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で腹腔内チャレンジされたマウスに受動的に移されるとき、血液、脾臓及び肝臓における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニー数（ＣＦＵ）の著しい減少によって実証される（データは示さず）インビボでの防御を媒介することができたことも観察されている。したがって、ＥｘＰＥＣ４Ｖ特異的オプソニン作用ヒト抗体は、インビボで細菌の死滅を媒介し、これは、提案される防御の機構が細菌の死滅を媒介するオプソニン作用抗体の誘導によるものである他のコンジュゲートワクチンに一致している。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖは、合計１０種の血清型を含み、６０歳以上の成人においてＥｘＰＥＣによって引き起こされる血流感染のカバー度を約５０％（ＥｘＰＥＣ４Ｖ）からおよそ７０％まで増加させる。ＥｘＰＥＣ４Ｖによる臨床実験、及び上の実施例において論じられるとおりのＥｘＰＥＣ１０Ｖに関する前臨床データに基づいて、ＥｘＰＥＣ１０Ｖの投与は、ヒトにおいても大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５に対する免疫応答を誘導することになることが予想された。Ｏ抗原多糖（ＰＳ）の各々は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａ（ＥＰＡ）の遺伝的に無毒化された形態であるキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされ、その生成は上で記載されている。Ｏ４ ＰＳは、表１の式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造を有するグルコシル化形態である。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンの３種の異なる用量の安全性、反応源性、及び免疫原性を評価するための無作為化観察者盲検ファースト・イン・ヒューマン第１／２相試験は、安定な健康状態の６０～８５歳のヒトにおいて実行される（試験１０Ｖ－ＢＡＣ１００１）。試験デザインは、２つのコホートを含む：合計８２４名の参加者が試験に登録され、コホート１において安定な健康状態の６０歳以上～８５歳以下の４０４名の参加者（１００名の参加者／ＥｘＰＥＣ１０Ｖ投与）及びコホート２において過去５年にＵＴＩの病歴を有する安定した健康状態の６０歳以上のおよそ４２０名の追加の参加者（ＥｘＰＥＣ１０Ｖ群において２８０名及びプラセボ群において１４０名）である（当初、コホート２において６００名の参加者を含むように計画されたが、この数は、プロトコルにいくつかの改変を伴って試験中におよそ４２０名まで減少された）。
目的及び評価項目
コホート１－非盲検の長期追跡調査期間を伴う第１／２ａ相観察者盲検期間（Ｎ＝４０４）：
コホート２－二重盲検長期追跡調査期間を伴う二重盲検期間（Ｎ＝４２０）：
全体的デザイン
これは、２つのコホートを含む無作為化多施設介入試験である。
コホート１に関して、試験は、観察者盲検実薬対照デザインを有し、ＵＴＩの病歴を有するか又は有しない安定した健康状態の６０歳以上～８５歳以下の合計で４０４名の成人参加者が含まれた。コホート１のための試験デザインは、３つの期間で構成される：最大２８日のスクリーニング期間、１日目のワクチン接種を伴う観察者盲検１８１日の追跡調査期間及びワクチン接種後の１８２日目から３年（１０９６日目）まで続く非盲検ＬＴＦＵ期間（図３Ａ）。ＥｘＰＥＣ１０Ｖ選択投与群（およそ１００名の参加者）の参加者及びプレブナー１３群の参加者のみが、ＬＴＦＵ期間に進む。コホート１の最後は、最後の参加者の３年目の来院（１０９６日目）である。
コホート２に関して、試験は、二重盲検プラセボ対照デザインであり、過去５年にＵＴＩの病歴を有する安定した健康状態の６０歳以上の合計でおよそ４２０名の成人参加者が含まれた。登録は、第１／２ａ相主要解析及びコホート１からのＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量選択の完了後に開始した。コホート２のための試験デザインは、３つの期間で構成される：最大２８日のスクリーニング期間、１日目のワクチン接種を伴う二重盲検の１８１日の追跡調査期間、及びワクチン接種後の１８２日目から３年（１０９６日目）まで続く二重盲検ＬＴＦＵ期間（図３Ｂ）。コホート２の全ての参加者は、ＬＴＦＵ期間に進む。試験の最後は、コホート２における最後の参加者の３年目の来院（１０９６日目）である。
コホート１：第１相
コホート１の第１相において、合計で８４名の参加者が、安全性評価の後に次の工程に進む段階的な用量漸増手順に従って段階的な手法で登録された。この試験のために社内のデータ審査委員会（ＤＲＣ）に委託し、これらの８４名の第１相参加者の身体検査データ（ベースライン及び標的化）、ベースライン人口統計データ及びワクチン接種後１４日間の安全性データ（非自発的局所及び全身性ＡＥ、自発的ＡＥ、ＳＡＥ、臨床検査データ及び生命徴候を含む）を審査した。試験のこの相において、参加者が登録され、６つの工程において無作為化された：
工程１：４名の歩哨の参加者が登録され、無作為化された；ＥｘＰＥＣ１０Ｖ低用量群において２名の参加者（表１１）、並びにＥｘＰＥＣ４Ｖ及びプレブナー１３群においてそれぞれ１名の参加者。
工程２：２４名の参加者が登録され、無作為化された；ＥｘＰＥＣ１０Ｖ低用量群において１８名の参加者（表１１）、及びＥｘＰＥＣ４Ｖ及びプレブナー１３群においてそれぞれ３名の参加者。
工程３：４名の歩哨の参加者が登録され、無作為化された；ＥｘＰＥＣ１０Ｖ中用量群において２名の参加者（表１１）、並びにＥｘＰＥＣ４Ｖ及びプレブナー１３群においてそれぞれ１名の参加者。
工程４：２４名の参加者が登録され、無作為化された；ＥｘＰＥＣ１０Ｖ中用量群において１８名の参加者（表１１）、並びにＥｘＰＥＣ４Ｖ及びプレブナー１３群においてそれぞれ３名の参加者。
工程５：４名の歩哨の参加者が登録され、無作為化された；ＥｘＰＥＣ１０Ｖ高用量群において２名の参加者（表１１）、並びにＥｘＰＥＣ４Ｖ及びプレブナー１３群においてそれぞれ１名の参加者。
工程６：２４名の参加者が登録され、無作為化された；ＥｘＰＥＣ１０Ｖ高用量群において１８名の参加者（表１１）、並びにＥｘＰＥＣ４Ｖ及びプレブナー１３群においてそれぞれ３名の参加者。
全ての参加者が、割り当てられた試験ワクチン接種群毎に１日目にＥｘＰＥＣ１０Ｖ（３つの用量のうちの１つ）、ＥｘＰＥＣ４Ｖ又はプレブナー１３のいずれかの単回の筋肉内（ＩＭ）注射を受けた。工程１、３及び５の各々の４名の歩哨の参加者は、安全性情報を収集するためにワクチン接種後の２４時間に電話によって連絡された。４名の歩哨の参加者の各群における盲検のワクチン接種後２４時間の安全性データは、研究代表者（ＰＩ）、試験責任医師（ＳＲＰ）及びスポンサーのメディカルリード（ＳＭＬ）によって審査された。次の工程のための追加の参加者の無作為化は、この２日目の歩哨の安全性評価が完了されるまで停止された。
いずれかの臨床的に意義のある知見が存在しない場合、追加の２４名の参加者（工程２、４、及び６に関する）が登録され、１日目のＥｘＰＥＣ１０Ｖ（３つの用量のうちの１つ）、ＥｘＰＥＣ４Ｖ又はプレブナー１３のいずれかの単回のＩＭ注射を受けるように３つの試験ワクチン接種群（表１１）のうちの１つに無作為化された。
各用量レベル（工程２における低用量、工程４における中用量、及び工程６における高用量）での追加の２４名の参加者のワクチン接種の後、各用量レベルでの２８名（４＋２４名）全ての参加者のワクチン接種後１４日の安全性データが、次の用量レベル又は第２ａ相に進む前にＤＲＣによって審査された。
コホート１：第２ａ相
初期の８４名の参加者に関するワクチン接種後の１４日の安全性データの審査の後にＤＲＣによって決定されるとおりの許容される安全性及び反応源性（いずれかの安全性の懸念又は特定の試験休止規則を満たすいずれかの事象が存在しない場合）に基づいて、コホート１からの残りの３２０名の参加者が無作為化され、試験の第２ａ相において投与された。これらの追加の３２０名の参加者が登録され、１日目のＥｘＰＥＣ１０Ｖ（３つの用量のうちの１つ）、ＥｘＰＥＣ４Ｖ又はプレブナー１３のいずれかの単回のＩＭ注射を受けるように５つの試験ワクチン接種群のうちの１つに２：２：２：１：１の比で並行して無作為化された（表１１）。初期の８４名の参加者に関する１４日の安全性審査を実施することに加えて、ＤＲＣはまた、試験の期間にわたるコホート１の安全性データを評価し、特定の試験ワクチン接種休止規則又は生じる可能性のあるいずれかの他の安全性の問題を満たすいずれかの事象を審査する。
コホート１に関して、主要解析は、全ての参加者が３０日目の来院（来院４）を完了したか又はより早期に中断したときに行われた。最終解析は、全ての参加者が１８１日目の来院を完了したか又はより早期に中断したときに行われる。非盲検の長期追跡調査（ＬＴＦＵ）期間（ＥｘＰＥＣ１０Ｖの選択された用量群及びプレブナー１３群）に進む参加者のために、年１回の追跡調査解析は、ワクチン接種後の１年目（３６６日目）、２年目（７３１日目）及び３年目（１０９６日目）の来院の期間まで収集された安全性及び免疫原性データ（マルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイ及びＭＯＰＡ）を含む。
コホート２
コホート２において、ＥｘＰＥＣ１０Ｖの選択された用量の安全性、反応源性、及び免疫原性（高用量が選択されたコホート１の主要解析結果に基づく）は、過去５年にＵＴＩの病歴を有する安定した健康状態の６０歳以上の参加者において評価される。コホート２に関して、試験は、二重盲検プラセボ対照デザインであり、合計でおよそ４２０名の参加者が登録され、２：１比で並行して無作為化された（ＥｘＰＥＣ１０Ｖ群においておよそ２８０名の参加者及びプラセボ群においておよそ１４０名）。
全ての参加者が、割り当てられた試験ワクチン接種群毎に１日目に選択された用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖ又はプラセボのいずれかの単回のＩＭ注射を受けた（表１２）。
コホート２に関して、主要解析は、安全性及び免疫原性データを含み、全ての参加者が３０日目の来院（来院４）を完了したか又はより早期に中断したときに行われる。最終解析は、全ての参加者が１８１日目の来院を完了したか又はより早期に中断したときに行われる。全ての参加者に関して、年１回の追跡調査解析は、ワクチン接種後の１年目（３６６日目）、２年目（７３１日目）（ＭＯＰＡに関しては該当しない）、及び３年目（１０９６日目）の来院の期間まで収集された安全性及び免疫原性データ（マルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイ及びＭＯＰＡ）を含む。
糞便試料の解析は、メタゲノム解析を使用して病原体（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））の罹患率に対するＥｘＰＥＣ１０Ｖの影響及び腸内フローラにおけるＥｘＰＥＣ１０Ｖ血清型を評価するために参加者の選択されたサブセットにおいて実施される。
参加者の数
合計でおよそ８２４名の参加者が試験に登録された；コホート１における４０４名の参加者及びコホート２におけるおよそ４２０名の参加者。
介入群：介入の説明
ＥｘＰＥＣ１０Ｖ：ＥＰＡキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされたＥｘＰＥＣ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ及びＯ７５のＯ抗原ＰＳを含有するリン酸緩衝溶液中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バイオコンジュゲートワクチン。１日目のＥｘＰＥＣ１０Ｖの３つの用量のうちの１つの単回の０．５ｍＬ ＩＭ（三角筋）注射。
ＥｘＰＥＣ４Ｖ：ＥＰＡキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされたＥｘＰＥＣ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ２５Ｂ（４：４：４：８μｇ ＰＳ／ＥｘＰＥＣ血清型）のＯ抗原ＰＳを含有する生理食塩水酸緩衝溶液中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バイオコンジュゲートワクチン。１日目のＥｘＰＥＣ４Ｖの単回の０．５ｍＬ ＩＭ（三角筋）注射。
プレブナー１３：非毒性ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質に個々に連結された肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、及び２３Ｆの莢膜抗原の糖の無菌懸濁液。単回用量プレフィルドシリンジにおいて供給される１日目の単回の０．５ｍＬ ＩＭ（三角筋）注射。
プラセボ：生理食塩水。１日目のプラセボの単回の０．５ｍＬ ＩＭ（三角筋）注射。
ＥｘＰＥＣ試験介入材料は、表９において記載される。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖは、１０種の一価原体（ＤＳ）で構成される。この臨床試験に関して、製剤（ＤＰ）の２種の異なる濃度（中及び高）が生成される（表１０）。第３の（低）濃度は、高濃度を製剤緩衝液と同じである希釈緩衝液で１：１に希釈することによってクリニックにおいて得られる。各ＤＰは、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム／リン酸カリウム緩衝液（０．０２％［ｗ／ｗ］ポリソルベート８０、５％［ｗ／ｗ］ソルビトール、１０ｍＭ メチオニン）中で製剤化される。
安全性評価
重要な安全性評価は、非自発的局所及び全身性ＡＥ、自発的ＡＥ、ＳＡＥ、身体検査、生命徴候測定、及び臨床検査を含む。
免疫原性評価
回収された血清の重要な免疫原性評価は、マルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイによって測定されるとおりのワクチンにより誘発されるＥｘＰＥＣ１０Ｖ及びＥｘＰＥＣ４Ｖ血清型特異的な総ＩｇＧ抗体レベル、並びにマルチプレックス形式（ＭＯＰＡ）におけるオプソニン作用死滅アッセイ（ＯＰＫＡ）によって測定されるとおりのＥｘＰＥＣ１０Ｖ及びＥｘＰＥＣ４Ｖ血清型特異的な機能性抗体の評価を含む。プレブナー１３によって誘発される肺炎球菌抗体力価の免疫原性評価は実施されない。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖによって誘導される血清抗体のレベルは、マルチプレックス電気化学発光（ＥＣＬ）系イムノアッセイによって測定される。このアッセイは、異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ－ＬＰＳ抗原又はキャリアタンパク質ＥＰＡでコーティングされている複数スポットの９６ウェル形式マイクロプレート中の高結合炭素電極を組み合わせる。血清試料中に存在する抗原特異的抗体のレベルは、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧで標識された二次抗体（抗ヒトＩｇＧ）を使用して検出される。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧは、電気刺激の存在下にて、結合されるＩｇＧ抗体の量に比例して増加する強度で光を放射する。このアッセイは、医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ）（ＩＣＨ）の勧告に従って認定された。
ＥｘＰＥＣ１０Ｖによって誘導される機能性抗体のレベルは、マルチプレックスオプソニン作用アッセイ（ＭＯＰＡ）によって測定される。簡潔に述べると、熱不活性化血清試料は、段階的に希釈され、異なる型の抗生物質に特異的に耐性である異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株とともにインキュベートされる。その後、ヒト補体及び貪食細胞（ＨＬ６０）を反応に加え、第２のインキュベーション期間の後、一定分量の反応混合物を、特定の抗生物質に耐性である株の増殖を選択的に可能にする特定の抗生物質が補充された培地を含有する異なるＰＶＤＦ親水性濾過膜プレートに移す。一晩の増殖の後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数して、生存している細菌の数を決定する。このアッセイは、ＩＣＨ勧告に従って認定された。
マルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイ及びＭＯＰＡによって測定されるとおりのＥｘＰＥＣ１０Ｖ血清型抗体、並びにマルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイによってのみ測定されるとおりのＥＰＡに関して、免疫原性の以下の測定値が評価され、全ての免疫原性時点に関して試験ワクチン接種群毎に作表される：
－ １日目（ワクチン接種前）の血清抗体力価における２倍以上及び４倍以上の増加を有する参加者の割合
－ 幾何平均力価（ＧＭＴ）
－ ＧＭＲ：ベースライン後／ベースライン値から計算されるベースラインからの倍率変化。
ＬＴＦＵ期間に関して、免疫原性の記述的な概要が、各血清型について提供される。
後期のための用量選択は、コホート１の主要解析の時点で利用可能なエビデンス（３０日目の結果）の全体性を考慮する。
試験のコホート２において登録される参加者に関する無作為化比は、２：１（ＥｘＰＥＣ１０Ｖ：プラセボ）である。コホート２において使用されるＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量は、コホート１の主要解析（３０日目）結果に基づき、これはコホート１において使用された高用量である。
状態
上記の試験のコホート１の登録及びワクチン接種が完了された。大幅な安全性の問題は同定されず、ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンは、許容される安全性プロファイルを有する。
コホート１臨床試料の免疫原性の解析が実施され、結果が下に記載される。
コホート２ワクチン接種は、高用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖを使用して開始され、試験のこの部分は進行中である。
コホート１の安全性及び免疫原性の結果
本明細書で示されるこれらの結果は、ＢＡＣ１００１臨床試験（コホート１）を指す。最大の解析対象集団には４１６名の参加者が存在した。各参加者は、ＥｘＰＥＣ１０Ｖの３つの単回の筋肉内投与される用量のうちの１つ又はＥｘＰＥＣ４Ｖ若しくはプレブナーの２つの実薬対照用量のうちの１つのいずれかに無作為化された；１０４名は、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ低用量でワクチン接種され、１０２名はＥｘＰＥＣ１０Ｖ中用量でワクチン接種され、１０４名は、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ高用量でワクチン接種され、５２名はＥｘＰＥＣ４Ｖ（４：４：４：８μｇ Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ及びＯ２５Ｂ多糖／用量）でワクチン接種され、５４名はプレブナーでワクチン接種された。合計で４１３名の参加者が３０日目の来院を完了した。１５日目の治験実施計画書に適合した免疫原性解析に含まれる３９２名（９４．２％）の参加者が存在した。
安全性
全体的に見て、全てのＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量は忍容性が良好であった。高用量で反応源性が増大する傾向があり、ＥｘＰＥＣ１０Ｖの高用量の反応源性は、紅斑、膨化及び嘔気を除いてプレブナーより低いか又は同等であった。プレブナーとは対照的に、より遅発性の局所反応源性が、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ群において観察され、注射部位紅斑及び膨化は、これらの局所事象を経験している参加者の＞９０％の遅発性事象として報告された。しかしながら、ＥｘＰＥＣ１０Ｖの反応源性プロファイルは、より高齢の成人集団において使用される他のライセンス化されたワクチンと比較して許容される。
免疫原性
ワクチンに誘導される免疫応答は、血清型特異的血清抗体（総免疫グロブリンＧ［ＩｇＧ］）のレベルを測定するマルチプレックス電気化学発光（ＥＣＬ）系イムノアッセイ及び抗体に媒介される細菌オプソニン作用死滅を測定するマルチプレックスオプソニン作用死滅アッセイ（ＭＯＰＡ）を使用してベースライン（１日目のワクチン接種前）及びワクチン接種後の１５日目で評価された。
抗原特異的血清抗体のレベル（ＥＣＬ）
Ｏ抗原特異的血清抗体（総ＩｇＧ）のレベルは、試験される全てのＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量及び全てのワクチン関連血清型に関してワクチン接種後の１５日目に著しく増大した。高用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンを受容した対象の少なくとも８０％は、Ｏ２５Ｂ、Ｏ６Ａ、Ｏ２、Ｏ１Ａ、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６及びＯ１８Ａを含む１０種の血清型のうちの８種に関してワクチン接種後の１５日目までにＯ抗原特異的抗体力価の２倍以上の増加を示したことが観察された。ＥｘＰＥＣ１０Ｖ中用量群に関して、対象の少なくとも８０％は、Ｏ２５Ｂ、Ｏ２、Ｏ１Ａ、Ｏ４及びＯ１５を含む１０種の血清型のうちの５種に関して；及びＥｘＰＥＣ１０Ｖ低用量群については、Ｏ２５Ｂ、Ｏ２、Ｏ１５及びＯ１６を含む１０種の血清型のうちの４種に関して、ワクチン接種後の１５日目までにＯ抗原特異的抗体力価の２倍以上の増加を示す（図４、表１３）。１日目から１５日目までのＧＭＴの最小限の変化が、プレブナー又はＥｘＰＥＣ４Ｖ（非ＥｘＰＥＣ４Ｖ血清型用）を受容した対象の群において観察された（図４、表１３）。
ＥＣＬアッセイに関して、全ての対象が解析され、全ての免疫原性サブセットに含まれた。治験実施計画書除外基準に従って主要な違反を有する対象は、治験実施計画書に適合した解析から除外された。ＥＣＬ系イムノアッセイにおいてベースラインから少なくとも２倍及び４倍の増加を有する参加者の幾何平均力価（ＧＭＴ）、ＧＭＴ ＦＩ（幾何平均力価倍率増加）及びパーセンテージは、下の表１３において要約される。
Ｏ７５多糖抗原に対する総ＩｇＧ応答は、同じ量で投与された他の抗原と比較して低い（例えば、１日目に対して１５日目に少なくとも２倍の増加を有する対象のパーセンテージの低下）とデータ（図４）から見ることができ、これは驚くべき結果であった。データはまた、組成物中のＯ７５多糖抗原の量の増加（すなわち、低及び中用量の４μｇに対する高用量の８μｇの投与）が、Ｏ７５多糖抗原に対して免疫応答の誘導を増加させたことを示している。
血清抗体の機能性（ＭＯＰＡ）
部分的なデータは、コホート１のＭＯＰＡ解析において含まれた。表１４は、１５日目のＭＯＰＡ ＧＭＴ解析において含まれる参加者の数を示す。部分的なデータが、ＥｘＰＥＣ１０Ｖによって誘導される抗体応答の機能性の評価のために使用されたが、解析の結論は、完全なデータセットが利用可能であったときに変化しなかった。
ＭＯＰＡによって測定されるオプソニン作用抗体のレベルは一般に、ＥＣＬ系イムノアッセイによって測定されるＯ抗原特異的抗体（総ＩｇＧ）のレベルと一致した。機能性抗体のレベルの増大は、試験された全ての用量群で１０種のＥｘＰＥＣ１０Ｖ血清型のうちの９種に関して１５日目に観察された（図５）。
他のＥｘＰＥＣ１０Ｖ血清型とは対照的に、血清型Ｏ８に関して、認定されたＭＯＰＡアッセイは、１日目のＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチン接種後の１５日目の機能性抗体のワクチンに媒介される増加を示すことができなかったが（図５）、血清型Ｏ８総ＩｇＧ力価の増大が観察された（図４）。試験は、認定されたアッセイが機能性Ｏ８抗体を検出できなかったかどうかを区別するために開始された。改変されたＭＯＰＡアッセイ並びに１日目及び１５日目の血清によるその後の実験は、１５日目の機能性抗体の２倍以上の増加を首尾よく示し（データは示さず）、ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンが血清型Ｏ８のための機能性抗体も実際に誘導したことを実証している。臨床開発のために、改変されたＯ８ ＭＯＰＡは、アッセイの再認定及び臨床試料の再検査を必要とし、かなりの時間を要するため、最初にＯ８多糖体抗原を含まないワクチン組成物の開発を進めることが決定された。しかしながら、十価ＥｘＰＥＣワクチン組成物におけるＯ８バイオコンジュゲートは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ８血清型に対して機能性抗体を誘導し、したがって、そのようなバイオコンジュゲートは、下の実施例に記載される九価ワクチン組成物に首尾よく加えられる可能性があることが後の実験から明白である。
最も高いレベルのオプソニン作用抗体は、血清型Ｏ２について観察された；高用量の当該ワクチンでワクチン接種された対象の９５％は、ワクチン接種後の１５日目の抗Ｏ２オプソニン抗体力価の２倍以上の増加を示した。限定的なレベルの機能性抗体が上で論じられるとおりに検出されたＯ８血清型を除いて、最も低いレベルのオプソニン作用抗体は、血清型７５について観察された；高用量のワクチンでワクチン接種された対象の３６％は、ワクチン接種後の１５日目の抗Ｏ７５オプソニン抗体力価の２倍以上の増加を示した。したがって、Ｏ７５血清型に関するＭＯＰＡデータは、上記のこの血清型に関するＥＣＬデータと一致し、同じ濃度の組成物中のいくつかの他のコンジュゲート、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６、Ｏ１、又はＯ２コンジュゲートと比較して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のコンジュゲートの相対的に低い免疫原性を確証している。加えて、１日目から１５日目までのＧＭＴの最小限の変化は、プレブナー又はＥｘＰＥＣ４Ｖ（非ＥｘＰＥＣ４Ｖ血清型用）を受容した対象の群において観察され（図５）、これはそれぞれのワクチン組成物中に存在しない血清型のための予想と一致している。
ＭＯＰＡにおいてベースラインから少なくとも２倍及び４倍の増加を有する参加者の幾何平均力価（ＧＭＴ）、幾何平均倍率増加（ＧＭＲ ＦＩ）及びパーセンテージは、１０種の血清型の各々について表１５において要約される。
用量選択
各用量群のベースラインから１５日目へのｌｏｇ１０倍率増加の平均に基づく免疫原性用量選択アルゴリズムは、２つの解析セット（ＰＰＩ及びＦＡＳ）及び２つのアッセイ（ＥＣＬ及びＭＯＰＡ）を考慮するこの臨床試験のコホート２に関するＥｘＰＥＣ１０Ｖ高用量を同定した。
血清型Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６及びＯ１８Ａに関して、高用量群は、両方のアッセイにおいて他の２つのＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量と比較して１５日目に２倍及び４倍の増加を有する参加者のより高いＧＭＴ、ＧＭＲ及びパーセンテージを有した。血清型Ｏ２５Ｂに関して、中用量群は一般に、３つのＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量群間で２倍及び４倍の増加を有する参加者のより高いＧＭＴ、ＧＭＲ及びパーセンテージを有した；この血清型に関して、Ｏ抗原用量は、中及び高ＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量群の両方に関して同じ（１６μｇ）であった。両方の血清型Ｏ１Ａ及びＯ６Ａに関して、結果は、高用量と中用量の間で混ぜられた。血清型Ｏ７５において、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ用量に関して測定可能な機能性抗体応答が存在した。測定可能な機能性抗体応答は、上で論じられるとおり、血清型Ｏ８に関して認定されたアッセイにおいて検出されなかった。非ＥｃＰＥＣ４Ｖ血清型において、低い機能性抗体応答は、２つの実薬対照において観察された；抗体応答は、ワクチンに誘導される応答からではなく既存の抗体から生じた。これらの結果に基づいて、高用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖが、ＢＡＣ１００１臨床試験のコホート２のために選択された。
結論
ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンは、ロバストな抗体応答を誘導し、Ｏ抗原特異的血清抗体の増加は、ベースライン（１日目）力価と比較してワクチン接種後の１５日目の全てのワクチン関連血清型に関して観察された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のオプソニン作用性の死滅を媒介したＥｘＰＥＣ１０Ｖに誘導される機能性抗体は、血清型Ｏ８を除いて、全てのワクチン関連血清型について認定されたＭＯＰＡにおいて検出された。血清型Ｏ８に関して、改変されたＭＯＰＡによるその後の試験は、機能性抗体応答を測定した。注目すべきことに、Ｏ７５応答は、同じ用量での他の血清型に関するものより４μｇ及び８μｇの用量でより弱く、これは、この試験からの驚くべきであり及び予測不可能な知見であった。多価グリココンジュゲート組成物によって生成される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５血清型に対する免疫応答を向上させるために、一態様において、本発明は、血清型Ｏ７５抗原多糖の用量を、例えば、他の血清型のいくつかの用量の約１．２～８倍、例えば、Ｏ６又はＯ１などの他の血清型のいくつかの用量の約１．５～４倍、例えば、約１．５～２．５倍、例えば、約２倍、例えば、約１６μｇまで増加させ、これは、例えば、最も関連し及び流行している血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、及びＯ６Ａの３つより高く、血清型Ｏ２５Ｂ抗原多糖と同様である。先行する実験において（例えば、この実施例の上記並びに実施例５及び６、すなわち、本明細書で開示されるＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンによる臨床データが利用可能になる前）、Ｏ７５抗原多糖の用量は、せいぜいＯ１Ａ、Ｏ２及びＯ６Ａ抗原多糖の用量と同程度に高いか、又は実際には、ある特定の試験群において、Ｏ１Ａ及びＯ６Ａ抗原多糖の２分の１でさえあり、Ｏ２５Ｂ抗原多糖の２～４分の１でさえあった。対照的に、本発明のある特定の態様では、Ｏ７５の用量は、Ｏ１、Ｏ２、及び／又はＯ６の用量と比較してそのように実際に増加される。
コホート２の安全性及び免疫原性の結果
この試験のコホート２において、過去５年にＵＴＩの病歴を有する安定した健康状態の６０歳以上の合計でおよそ４２０名の参加者が登録され、２：１の比で並行して無作為化された（完全な結果の解析が実施されたセットは、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ（高用量）群において２７８名の参加者及びプラセボ群において１３８名を含んだ）。
安全性
全体的に見て、ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンは忍容性が良好であった。反応源性プロファイルは一般に、コホート１における中用量及び高用量のＥｘＰＥＣ１０Ｖで観察されるものと同等であった。最も頻度の高い局所非自発的ＡＥは、疼痛／圧痛であり、最も頻繁に報告させる全身性ＡＥは、筋肉痛、頭痛、及び疲労であった。注射部位紅斑及び膨化は、最も一般的な遅発型事象（最初の発症までの時間はワクチン接種の５日より後）であった。ＥｘＰＥＣ１０Ｖの反応源性プロファイルは、より高齢の成人集団において使用される他のライセンス化されたワクチンと比較して許容される。
免疫原性
ワクチンに誘導される抗体応答は、血清型特異的血清抗体（総ＩｇＧ）のレベルを測定するマルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイを使用してベースライン（ワクチン接種前の１日目）並びにワクチン接種後の１５日目及び３０日目に評価された。
抗原特異的血清抗体のレベル（ＥＣＬ、１日目、１５日目及び３０日目）
ＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンは、ベースラインから１日目～１５日目に力価の少なくとも２倍の増加を有する参加者のＧＭＴ、ＧＭＴ ＦＩ及びパーセンテージの値の増加に基づいて、全ての血清型に対して免疫原性であった。１５日目～３０日目の３つ全ての測定値において変化は最小限であった。
最も高い抗体応答は、血清型Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５及びＯ１６に関して観察され、ＥｘＰＥＣ１０Ｖでワクチン接種された参加者の少なくとも８０％は、ワクチン接種後の１５日目及び３０日目までに抗体応答の２倍以上の増加を示した。血清型Ｏ１Ａ、Ｏ６Ａ及びＯ２５Ｂに関して、参加者の少なくとも７０％が、抗体応答において２倍以上の増加を示し、血清型Ｏ８及びＯ１８Ａに関して、参加者の少なくとも６０％が、抗体応答において２倍以上の増加を示す。より低い抗体応答は、血清型Ｏ７５に関して観察されたが、それにもかかわらず、抗原特異的抗体応答における２倍以上の増加が、参加者の少なくとも５０％において観察された。１日目から１５日目及び３０日目までのＧＭＴにおける最小限の変化が、プラセボを受容した対象の群において観察された（表１６）。
ＥＣＬ系イムノアッセイにおいてベースラインから少なくとも２倍及び４倍の増加を有する参加者の幾何平均力価（ＧＭＴ）、ＧＭＴ ＦＩ（幾何平均力価倍率増加）及びパーセンテージは、下の表１６において要約される。
１５日目の応答の大きさ（ＧＭＴ）は、全ての血清型についてコホート１と２の間で同様であった。
実施例８：新規のＥｘＰＥＣ組成物及びウサギにおける免疫原性。
新たな試験が設計され、これは、ＥｘＰＥＣワクチンの２種の適合した組成物（本明細書では適合した製剤とも称される）を含んだ（ＥｘＰＥＣ９Ｖ ａ及びｂ、表１７）。これらの適合した製剤は、低い免疫原性が第１／２ａ相臨床試験のコホート１の解析中にこれらの抗原について観察されたため、血清型Ｏ８多糖が除去され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ７５（ＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ）に関して増加した多糖含量を有する。上記の先行する実験を検証するための対照として、ＥｘＰＥＣ１０Ｖ組成物もまた評価された。生理食塩水対照（ワクチン未接種群）も含まれた。
試験の全体的な目的は、上記のＥｘＰＥＣ１０Ｖと比較したワクチン組成物における変化（Ｏ８多糖の枯渇及びＯ７５抗原多糖に対して特異的な用量増加）が、ワクチンに誘導される免疫応答に対して影響を及ぼすかどうかを評価することであった。特に、目的は、例えば、多価コンジュゲートワクチン組成物中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖のコンジュゲートと比較して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖のコンジュゲートの量を増加させることが、血清型Ｏ７５の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する免疫応答を実際に選択的に向上させ、それにより構成要素の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型にわたってより均一に免疫応答を上昇させるかどうかを理解することであった。そのために、ＥｘＰＥＣワクチンの異なる製剤によって誘導される抗体応答は、ニュージーランドホワイトラビット（ＮＺＷ）を使用して免疫原性の確立された前臨床モデルにおいて評価された。
実験デザイン
ニュージーランドホワイトラビット（ＮＺＷ、試験の開始時に１３週齢）は、２週間隔で投与されるＥｘＰＥＣワクチン又は生理食塩水の異なる製剤による３回の筋肉内免疫化（５００μＬ／注射）を受けた（表１７）。試験は、４種の異なる群（表１８）を含有した：群１（ＥｘＰＥＣ１０Ｖ）は、８μｇ／用量のＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ７５、並びに１６μｇ／用量のＯ２５Ｂ（すなわち、ＥＰＡキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされた各抗原多糖である１６μｇ／ｍＬのＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４－Ｇｌｃ＋、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ７５抗原多糖の各々、並びに３２μｇ／ｍＬのＯ２５Ｂ抗原多糖を含む０．５ｍＬの組成物、上の実施例を参照のこと）を受容した；群２（ＥｘＰＥＣ９Ｖ ａ）は、８μｇ／用量のＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ７５、並びに１６μｇ／用量のＯ２５Ｂ（すなわち、ＥＰＡキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされた各抗原多糖である１６μｇ／ｍＬのＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４－Ｇｌｃ＋、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ及びＯ７５抗原多糖の各々、並びに３２μｇ／ｍＬのＯ２５Ｂ抗原多糖を含む０．５ｍＬの組成物、上の実施例を参照のこと）を受容した；群３（ＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ）は、８μｇ／用量のＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６及びＯ１８Ａ、並びに１６μｇ／用量のＯ７５及びＯ２５Ｂ（すなわち、ＥＰＡキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされた各抗原多糖である１６μｇ／ｍＬのＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４－Ｇｌｃ＋、Ｏ１５、Ｏ１６、及びＯ１８Ａ抗原多糖の各々、並びに３２μｇ／ｍＬのＯ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖を含む０．５ｍＬの組成物、上の実施例を参照のこと）を受容した。
配合するために使用される緩衝液は、６．１９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、３．８１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５％ ソルビトール（ｗ／ｗ）、１０ｍＭ メチオニン、０．０２％ ＰＳ８０（ｗ／ｗ）、ｐＨ７．０を含有した。対照群（群４）の動物は、生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液）を受容した。各実験群は、１０頭の動物を含有した。ＥＬＩＳＡによって測定される血清抗体レベル（総ＩｇＧ）は、免疫化前（０日目）及び免疫化後（１４、２８及び４２日目）に評価された。
潜在的な注射部位応答は、各投与の前、各投与日の投与のおよそ６時間後、及び注射後の７日間毎日においてドレイズスコアリングシステムを使用してモニターされた。症例注射部位の影響が観察された場合、スコアが０に戻るまで毎日の観察が続けられた。
動物は、治療前の間に１回、各投与後の３日間毎日、その後週に１回個々に秤量された（グラム単位）。動物は、健康不良、又は有害な臨床効果のために１日に少なくとも１回観察された。投与日には、動物は、投与前及び治療のおよそ６時間後（注射部位の検査と同時）に治療に対する応答について試験された。体温は、直腸デジタル温度計を使用してモニターされ、投与前、各投与の６時間後及び２４時間後に記録された。温度が３８～４０℃のウサギに関する正常範囲外にある場合、追加の測定は、体温がこれらの値内に戻るまで毎日実行された。
動物は、２週間隔で投与されるＥｘＰＥＣ１０Ｖ、ＥｘＰＥＣ９Ｖ ａ、ＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ、又は生理食塩水により３回の筋肉内免疫化を受けた。抗体レベルは、０日目（ワクチン接種前）並びに１４、２８及び４２日目（ワクチン接種後）にＥＬＩＳＡによって測定された。
ＥｘＰＥＣワクチン組成物中に含まれるＯ抗原の各々によって誘導される血清抗体レベルは、Ｇｅｎ ５ソフトウェアを使用してＥＬＩＳＡによって解析された。４５０ｎｍでのＯＤは、４パラメーター（４ＰＬ）非線形回帰モデルにおいて解析された。５０％効果濃度（ＥＣ５０）は、二つ組の１２工程の滴定曲線に基づいてそれぞれの個々の試料について計算された。試料の結果は、ＥＣ５０力価として表される。
ＮＺＷウサギにおける抗原特異的血清抗体応答の評価は、試験された全てのＥｘＰＥＣワクチン組成物（ＥｘＰＥＣ１０Ｖ、ＥｘＰＥＣ９Ｖ ａ及びＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ）が、生理食塩水対照と比較したとき、ワクチン接種後の１４、２８及び４２日目に全てのワクチン抗原に対する抗体応答において著しい増加を誘導したことを示した（図６）。試験された全てのＥｘＰＥＣワクチン組成物の２回目の投与は、ワクチン接種後の１４日目から２８日目に抗原特異的抗体応答の著しい増加によって実証されるとおり抗体応答をブーストした。ＥｘＰＥＣワクチンの３回目の投与のさらなるブースト効果は、ある特定の抗原及び組成物に関して明らかであった。Ｏ７５抗原の幾何平均抗体力価（ＧＭＴ）は、Ｏ７５多糖の濃度の増加とともに増加した（図６）。増加した濃度の多糖Ｏ７５（１６μｇ）を含有するＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ組成物は、８μｇのＯ７５多糖のみを含有するＥｘＰＥＣ９Ｖ ａ及びＥｘＰＥＣ１０Ｖ組成物と比較したとき、ワクチン接種後の１４、２８及び４２日目により高いＯ７５ ＧＭＴ及びＧＭＴ倍率増加を誘導した（表１９）。
体重、体温及び注射部位応答の評価は、試験された全てのＥｘＰＥＣワクチン組成物が動物によって忍容性が良好であったことを示す（データは示さず）。
結論として、試験された全てのＥｘＰＥＣワクチン組成物は、ＮＺＷウサギにおいて免疫原性であり、抗原特異的血清抗体応答における著しい増加が、生理食塩水対照と比較したとき、ワクチン接種後の１４、２８及び４２日目に観察された。試験された全てのＥｘＰＥＣワクチン組成物は、多糖特異的抗体応答をブーストすることができた。加えて、試験された全てのＥｘＰＥＣワクチン組成物は、動物によって忍容性が良好であり、ワクチン関連有害事象は観察されなかった。重要なこととして、増加した濃度のＯ７５多糖を含有するＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ組成物は、より低い濃度のＯ７５多糖を含有する組成物（ＥｘＰＥＣ９Ｖａ及びＥｘＰＥＣ１０Ｖ）と比較したとき、より高いＯ７５抗体応答（ＧＭＴ及びＧＭＴ倍率増加）を誘導した。ＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ組成物中のＯ７５の用量の増加は、Ｏ７５血清型に対する免疫応答をそのように向上させ、したがって、そのような組成物は、ＥｘＰＥＣ９Ｖ ｂ組成物における血清型にわたって免疫応答のより均一な上昇をもたらす。
実施例９．新規のＥｘＰＥＣ９Ｖ組成物によるヒトにおける第３相有効性試験。
ヒトにおける有効性試験は、増加した濃度のＯ７５抗原多糖を有する九価ＥｘＰＥＣワクチン組成物で実行される。試験の表題は、「過去２年に尿路感染症の病歴を有する６０歳以上の成人における侵襲性腸管外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）疾患の予防におけるＥｘＰＥＣ９Ｖによるワクチン接種の有効性、安全性及び免疫原性を評価するための無作為化、二重盲検、プラセボ対照、多施設第３相試験」であり、それは、本明細書で「ＢＡＣ３００１」試験と称されることになる。
ＥｘＰＥＣ９Ｖは、６０歳以上の成人における侵襲性腸管外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）疾患（ＩＥＤ）の予防のための開発における九価ワクチン候補である。ＥｘＰＥＣ９Ｖは、前の実施例において詳述されるとおり、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａ（ＥＰＡ）の遺伝的に無毒化された形態であるキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされたＥｘＰＥＣ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５のＯ抗原多糖（ＰＳ）からなる。ＥｘＰＥＣ９Ｖワクチンは、全てのＩＥＤの約６５％に関与するＥｘＰＥＣの最も流行しているＯ血清型の中にある９種の示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型を包含する。
目的及び評価項目
全体的デザイン
これは、６０歳以上であり、過去２年にＵＴＩの病歴を有する医学的に安定したおよそ１８，５５６名の成人において実行されることになる無作為化、二重盲検、プラセボ対照、並行群、多施設、介入第３相試験である。
全ての参加者は、登録され、ＥｘＰＥＣ９Ｖ又はプラセボのいずれかに１：１比で並行して無作為化され、１日目に試験ワクチンを受容する（０．５ｍＬ 筋肉内注射（三角筋））。第１の主要評価項目のための最終的な解析（血液、他の無菌部位、又は尿からの微生物学的確認による）は、試験で７２件のワクチン血清型ＩＥＤ事象が観察されたとき、又は遅くとも最後の参加者がワクチン接種後３６ヶ月間追跡調査されたときに行われる。第２の主要評価項目（血液又は他の無菌部位からの微生物学的確認による）は、第１の主要評価項目が統計的有意性を示したときに階層的な様式で試験される。第２の主要評価項目（血液又は他の無菌部位からの微生物学的確認による）の最終的な解析に関して、第２の主要評価項目に従う５３件のワクチン血清型ＩＥＤ事象が観察される必要がある。ＥｘＰＥＣ９Ｖワクチン組成物は、ＥＰＡキャリアタンパク質に別々にバイオコンジュゲートされた各抗原多糖である１６μｇ／ｍＬのＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、Ｏ４－Ｇｌｃ＋、Ｏ１５、Ｏ１６、及びＯ１８Ａ抗原多糖の各々並びに３２μｇ／ｍＬのＯ２５Ｂ及びＯ７５抗原多糖を含む。上の実施例を参照されたい（例えば、これは、上の実施例８のウサギ免疫化の群３において使用される同じ組成物である；賦形剤は、実施例７のＢＡＣ１００１試験において使用されるＥｘＰＥＣ１０Ｖワクチンに関して記載されるものと同じである）。プラセボは、０．９％ ｗ／ｖ塩化ナトリウムである。
安全性評価
重要な安全性評価は、ＳＡＥ、身体検査、及び生命徴候を含む。加えて、非自発的局所及び全身性ＡＥ並びに自発的ＡＥは、「安全性サブセット」における参加者、すなわち、追加の評価のための無作為化前に所与のインフォームドコンセントを有する選択された試験現場からのおよそ４，０００名の参加者について記録される。
免疫原性評価
免疫原性の評価のために、９種のワクチンＯ血清型及びキャリアタンパク質ＥＰＡの各々に対するワクチンによって誘発されるＩｇＧ抗体レベルは、マルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイによって測定され、血清型特異的機能性抗体は、ＭＯＰＡによって測定される。免疫原性解析は、「免疫原性サブセット」における参加者、すなわち、追加の免疫原性評価のための無作為化の前に所与のインフォームドコンセントを有する選択された試験現場からのおよそ１，２００名の参加者、及び確定ＩＥＤ事象を有する全ての参加者、及びＵＴＩ又は急性細菌性前立腺炎（ＡＢＰ）事象を有する免疫原性サブセットにおける参加者について実施される。
有効性評価
主要目的は、ＥｘＰＥＣ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５によって引き起こされる第１のＩＥＤ事象の予防においてプラセボと比較してＥｘＰＥＣ９Ｖの有効性を実証することである。ＩＥＤ、ＵＴＩ、又はＡＢＰとして定義される事象は、全体的な試験期間（１，０９６日；３年）に全ての参加者に関して収集される。試験の追跡調査の間、参加者は、ＵＴＩ又はＡＢＰのいずれかの徴候又は症状を経験する場合、又は全身性感染によって引き起こされる可能性がある症状のいずれかの新たな発症又は悪化を経験する場合、可能な限り早く試験現場に通知することが期待される。加えて、全ての参加者は、ＵＴＩ、ＡＢＰ、又は潜在的なＩＥＤであった可能性がある、現場によって即時に把握されなかった過去の入院又は医学的事象についても質問されることになる。ＩＥＤ（全ての参加者）及びＵＴＩ又はＡＢＰ（免疫原性サブセットのみ）に関する医療との接触に関連する医療資源利用データが収集される。２つの患者報告アウトカム（ＰＲＯ）書類を使用して、健康に関連する生活の質を測定する：ＳＦ－３６バージョン２及びＥＱ－５Ｄ－５Ｌ。加えて、フレイルは、ＳＰＰＢ及びフレイル指標スコアを使用して評価される。
免疫原性評価
免疫原性の評価のために、９種のワクチンＯ血清型及びキャリアタンパク質ＥＰＡの各々に対するワクチンによって誘発されるＩｇＧ抗体レベルは、マルチプレックスＥＣＬ系イムノアッセイによって測定され、血清型特異的機能性抗体は、ＭＯＰＡによって測定される。免疫原性解析は、「免疫原性サブセット」における参加者、すなわち、追加の免疫原性評価のための無作為化の前に所与のインフォームドコンセントを有する選択された試験現場からのおよそ１，２００名の参加者、並びに確定ＩＥＤを有する全ての参加者及びＵＴＩ又はＡＢＰ事象を有する免疫原性サブセットにおける参加者について実施される。１日目及び３０日目の免疫原性血液試料は、全ての参加者から回収される。
安全性評価
重要な安全性評価は、ＳＡＥ、身体検査、及び生命徴候を含む。加えて、非自発的局所及び全身性ＡＥ並びに自発的ＡＥは、「安全性サブセット」における参加者、すなわち、追加の評価のための無作為化前に所与のインフォームドコンセントを有する選択された試験現場からのおよそ４，０００名の参加者について記録される。
有効性解析
第１の主要評価項目の主要解析は、治験実施計画書に適合した有効性（ＰＰＥ）集団において、プラセボ群と比較して、実薬ワクチン（ＥｘＰＥＣ９Ｖ）群におけるワクチン接種の少なくとも２９日後の発症を有するＥｘＰＥＣ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５によって引き起こされる少なくとも１つのＩＥＤ事象を有する参加者の数を評価する。第２の主要評価項目の主要解析は、ＰＰＥ集団において、プラセボ群と比較して、実薬ワクチン（ＥｘＰＥＣ９Ｖ）群におけるワクチン接種の少なくとも２９日後（３０日目から）の発症を有するＥｘＰＥＣ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５によって引き起こされる血液又は他の無菌部位における微生物学的確認による少なくとも１つのＩＥＤ事象を有する参加者の数を評価する。追跡調査期間もまた、考慮される。ＩＥＤ事象を有する参加者に関して、追跡調査期間は、ワクチン接種と最初の事象の発生の間の期間として定義される。ＩＥＤ事象を有しない参加者に関して、それはワクチン接種と最後の来院（又は試験を中断した参加者については最後の接触）の間の期間である。ＶＥ≦２０％の帰無仮説は、対立仮説ＶＥ＞２０％に対して試験される。
段階的な階層的試験戦略が以下の評価項目に適用される：
主要：
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる、血液、他の無菌部位、又は尿からの微生物学的確認による最初のＩＥＤ
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる、血液又は他の無菌部位からの微生物学的確認による最初のＩＥＤ
副次：
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる全てのＩＥＤ（参加者毎に複数のＩＥＤを含む）
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる最初の入院させられたＩＥＤ事象
－ ＥｘＰＥＣ Ｏ血清型によって引き起こされる敗血症に関する判定基準を満たす最初のＩＥＤ事象
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる最初の菌血症ＩＥＤ事象
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる最初の腎盂腎炎事象
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる最初のＵＴＩ
－ ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型によって引き起こされる全てのＵＴＩ（参加者毎に複数のＵＴＩを含む）
－ 任意のＥｘＰＥＣ Ｏ血清型によって引き起こされる最初のＩＥＤ事象
－ 任意のＥｘＰＥＣ Ｏ血清型によって引き起こされる最初の腎盂腎炎事象
－ 任意のＥｘＰＥＣ Ｏ血清型によって引き起こされる最初のＵＴＩ
この試験戦略において、第２の主要評価項目は、第１の主要評価項目が統計的有意性を示したときにのみ試験される。第１の主要評価項目が７２の事象により統計的有意性を示したとき、５３未満の事象がその時に観察される場合、中間解析が第２の主要評価項目について実施される（血液又は他の無菌部位からの微生物学的確認により）。第２の主要評価項目が非有意である場合、第２の主要評価項目の最終的な解析は、第２の主要評価項目定義に従う５３のワクチン血清型ＩＥＤ事象が観察されたときに実施される。さらに、第１の重要な副次評価項目は、両方の主要評価項目が統計的有意性を示したときにのみ試験される。第１の重要な副次評価項目は、追跡調査期間の最後までワクチン接種（ＰＰＥ）の少なくとも２９日後の発症を有する全てのＥｘＰＥＣ９Ｖ ＩＥＤ事象を含む。
参加者は、以下の判定基準を満たし、独立した評価項目判定委員会（ＩＥＡＣ）によって確認される場合にＩＥＤを有するとみなされる。
ＩＥＤと診断された成人参加者は、
● 以下のいずれかの存在によって示されるとおりの全身性細菌感染の徴候及び症状を有するいずれかの参加者である：
－ 体温＜３６．０℃（９６．８°Ｆ）又は＞３８．０℃（１００．４°Ｆ）、
－ 頻拍（ＨＲ）＞９０ｂｐｍ、
－ 頻呼吸（ＲＲ）＞２０呼吸／分、又は
－ ＷＢＣ数＜４又は＞１２ｘ１０９／Ｌ又は１０％未成熟（帯状）形態、
並びに
● 以下の培養による微生物学的確認：
－ 血液又は任意の他の無菌部位（例えば、脳脊髄液［ＣＳＦ］、胸膜）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
及び／又は
－ ＵＴＩ徴候／症状を有し及び感染の他の同定可能な部位を有さず及びベースラインから全体的な逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコア≧２点における急性の変化を有する尿中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（コロニー形成単位／ｍＬ ≧１０５）。
主要評価項目及び副次評価項目に関して、ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型（すなわち、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、又はＯ７５）のいずれかによって引き起こされるＩＥＤでは、Ｏ血清型判定が利用可能になる必要があり、ＩＥＤは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、又はＯ７５陽性であると確認される必要がある。任意のＥｘＰＥＣ Ｏ血清型に関連する副次評価項目に関して、Ｏ血清型判定は利用可能である必要はない。培養結果において複数の病原体を有する症例は、全身性感染がＩＥＡＣの判定に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にのみ起因する可能性がない場合、主要又は副次評価項目のために考慮されない。混合された病原体及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の存在を伴う症例は、感受性解析に含まれる。
参加者がＵＴＩの徴候及び症状を医師及び／又は試験現場に連絡した場合、以下の判定基準を満たし、腎盂腎炎の症例についてＩＥＡＣによって確認される場合、参加者は症候性ＵＴＩを有すると定義される。
記録された膿尿（白血球（ＷＢＣ）数≧１０細胞／ｍｍ３）及び尿中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養による微生物学的確認（コロニー形成単位≧１０５／ｍＬ）を有し、以下の徴候及び症状の定義のうちの１つを有する成人：
● 非複雑性ＵＴＩに関して、以下の徴候又は症状の少なくとも２つ：
－ 排尿障害、
－ 尿意頻数、
－ 尿意切迫、又は
－ 恥骨上痛。
● 複雑性ＵＴＩ（ｃＵＴＩ）に関して：
－ 以下の徴候又は症状の少なくとも２つ：
○ 発熱（例えば、３８．０℃以上の温度）を伴う悪寒、硬直若しくは温感、
○ 排尿障害、尿意頻数若しくは尿意切迫、
○ 下腹部痛若しくは骨盤痛、又は
○ 嘔気若しくは嘔吐、
及び
－ 以下の複雑化因子の少なくとも１つ：
○ 尿貯留の病歴（男性参加者において）、
○ 現在留置している尿路カテーテル、
○ 閉塞性尿路疾患、又は
○ 任意の関連する機能的若しくは解剖学的異常。
● 以下の症状の少なくとも２つを有する腎盂腎炎（尿路の根底にある異常に関係なく）に関して：
－ 発熱（例えば、３８．０℃以上の温度）を伴う悪寒、硬直若しくは温感、又は
－ 身体検査時の側腹部痛若しくは肋骨脊柱角の圧痛、又は
－ 嘔気若しくは嘔吐。
● 再発性ＵＴＩ（ｒＵＴＩ）に関して：
－ 最近６ヶ月における２回のＵＴＩの頻度を有する非複雑性及び／若しくは複雑性ＵＴＩの再発、又は
－ 年に少なくとも３回のＵＴＩの頻度を有する非複雑性及び／若しくは複雑性ＵＴＩの再発。
副次評価項目に関して、ＥｘＰＥＣ９Ｖ Ｏ血清型（すなわち、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、又はＯ７５）のいずれかによって引き起こされるＵＴＩでは、Ｏ血清型判定が利用可能になる必要があり、ＵＴＩは、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、又はＯ７５陽性であると確認される必要がある。任意のＥｘＰＥＣ Ｏ血清型に関連する副次評価項目に関して、Ｏ血清型判定は利用可能である必要はない。培養結果において複数の病原体を有し及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の存在を有する症例は、副次評価項目のために考慮されない。これらの症例は、感受性解析に含まれる。
探索的評価項目として、ＩＥＤ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の微生物学的確認を除く）又はＵＴＩの上の定義を満たすが、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に関して陽性の（ＵＴＩの場合の尿）試料を有する（ＵＴＩの場合コロニー形成単位≧１０５／ｍＬ）参加者は、それぞれ緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、又は緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＵＴＩに起因する侵襲性疾患を有すると報告される。血清型判定は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）については実施されない。混合された病原体とともに緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の存在を伴う試料は、この探索的評価項目のために考慮されない。
ＡＢＰのための探索的有効性評価項目として、ＥｘＰＥＣ血清型Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５によって引き起こされる事象が報告される。
参加者がＡＢＰの徴候及び症状を医師及び／又は試験現場に連絡した場合、以下の判定基準を満たす場合、参加者は症候性ＡＢＰを有すると定義される。
記録された膿尿（ＷＢＣ数≧１０細胞／ｍｍ３）及び尿中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養による微生物学的確認（コロニー形成単位≧１０５／ｍＬ）を有し、発熱及び以下の急性発症を有する成人：
● 刺激性の排尿症状：
○ 排尿障害、
○ 尿意頻数、
○ 尿意切迫、又は
● 閉塞性の排尿症状：
－ 排尿躊躇、
－ 不完全な排尿、
－ 腹圧性排尿、
－ 尿勢低下、及び
● 恥骨上痛、直腸痛、若しくは会陰部痛。
この広範な発明概念から逸脱することなく、上記の実施形態に対する変更形態がなされ得ることが当業者に理解されるであろう。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、本明細書によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形形態を包含することが意図されることを理解されたい。
配列
配列番号１（グリコシル化コンセンサス配列）
Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）
配列番号２（最適化されたグリコシル化コンセンサス配列）
Ａｓｐ（Ｇｌｕ）－Ｘ－Ａｓｎ－Ｚ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（Ｘ及びＺは、独立して、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸から選択される）
配列番号３（４個のグリコシル化コンセンサス配列を含むＥＰＡキャリアタンパク質（ＥＰＡ－４））

配列番号４（Ｏ４ ＧｔｒＳアミノ酸配列）

配列番号５（例のＯ４ ｇｔｒＳ核酸配列）

配列番号６（例のＰｇｌＢ配列（「野生型」））

配列番号７（例のｇｔｒＡアミノ酸配列；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ ｙｆｄＧ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１６２０９．１）
ＭＬＫＬＦＡＫＹＴＳＩＧＶＬＮＴＬＩＨＷＶＶＦＧＶＣＩＹＶＡＨＴＮＱＡＬＡＮＦＡＧＦＶＶＡＶＳＦＳＦＦＡＮＡＫＦＴＦＫＡＳＴＴＴＭＲＹＭＬＹＶＧＦＭＧＴＬＳＡＴＶＧＷＡＡＤＲＣＡＬＰＰＭＩＴＬＶＴＦＳＡＩＳＬＶＣＧＦＶＹＳＫＦＩＶＦＲＤＡＫ
配列番号８（例のｇｔｒＢアミノ酸配列－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ ｙｆｄＨ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１６２１０．１）

配列番号９（例のＯ４ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ４－ＥＰＡ産生株ＢＶＥＣ－Ｌ－００６８４ｆ）




配列番号１０（ＥＰＡキャリアタンパク質に関する例のシグナル配列）
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧ ＬＶＬＡＦＳＡＳＡ
配列番号１１（例のＯ１Ａ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ１Ａ－ＥＰＡ産生株ｓｔＧＶＸＮ４４１１及びｓｔＬＭＴＢ１０２１７）




配列番号１２（例のＯ２ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ２－ＥＰＡ産生株－ｓｔＧＶＸＮ４９０６）




配列番号１３（例のＯ６Ａ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ６Ａ－ＥＰＡ産生株ｓｔＧＶＸＮ４１１２及びｓｔＬＭＴＢ１０９２３）




配列番号１４（例のＯ８ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ８－ＥＰＡ産生株－ｓｔＬＭＴＢ１１７３４）




配列番号１５（例のＯ１５ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ１５－ＥＰＡ産生株－ｓｔＬＭＴＢ１１７３８）




配列番号１６（例のＯ１６ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ１６－ＥＰＡ産生株－ｓｔＬＭＴＢ１１７３９）




配列番号１７（例のＯ１８Ａ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ１８Ａ－ＥＰＡ産生株－ＢＶＥＣ－Ｌ－００５５９）




配列番号１８（例のＯ２５Ｂ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ２５Ｂ－ＥＰＡ産生株－ｓｔＧＶＸＮ４４５９）




配列番号１９（例のＯ７５ ｒｆｂ座位ヌクレオチド配列－Ｏ７５－ＥＰＡ産生株－ｓｔＬＭＴＢ１１７３７）





配列番号２０（例のＣＲＭ１９７配列）
本明細書に記載される実施形態は、単に例示であることが意図され、当業者は、通例の実験だけを使用して、本明細書に記載される特定の手順に対する多数の均等物を認識することになるか、又は確認することができるであろう。全てのそのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、以下の特許請求の範囲によって包含される。
本明細書で引用される全ての参考文献（特許出願、特許、及び出版物を含む）は、それぞれの個々の出版物又は特許若しくは特許出願が全ての目的のために全体として参照により具体的に及び個別に組み込まれることが示されるのと同程度に、全体として及び全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で引用される全ての参考文献（特許出願、特許、及び出版物を含む）は、それぞれの個々の出版物又は特許若しくは特許出願が全ての目的のために全体として参照により具体的に及び個別に組み込まれることが示されるのと同程度に、全体として及び全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物であって、前記抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５及びＯ２５抗原多糖の各々の濃度が、独立して、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度と比較して高い、組成物。
［２］
Ｏ７５抗原多糖の濃度と、独立してＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度との重量比が、約１．５：１～約２．５：１である、［１］に記載の組成物。
［３］
Ｏ７５抗原多糖の濃度と、独立してＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度との重量比が、約２：１である、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物であって、前記抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖の濃度との重量比が、約１：５：１～約４：１、好ましくは、約２：１である組成物。
［５］
Ｏ７５抗原多糖の濃度と、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６及び／又はＯ１８抗原多糖の濃度との重量比が、約１．５：１～約４：１、好ましくは、約２：１である、［４］に記載の組成物。
［６］
前記組成物中のＯ７５抗原多糖の濃度とＯ２５抗原多糖の濃度との重量比が、約１：１である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の組成物。
［７］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の濃度の重量比が、１：１：１：１：１：１：１：２：２である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の組成物。
［８］
前記Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、前記Ｏ４がグルコシル化されており、前記Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、前記Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及び前記Ｏ２５抗原がＯ２５Ｂであり、
（ｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖が、式（Ｏ１Ａ）の構造：

を含み、
（ｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖が、式（Ｏ２）の構造：

を含み、
（ｉｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖が、式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造：

を含み、
（ｉｖ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖が、式（Ｏ６Ａ）の構造：

を含み、
（ｖ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖が、式（Ｏ１５）の構造：
［→２）－β－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→３）－α－Ｌ－ＦｕｃｐＮＡｃ－（１→３）－β－Ｄ－ＧｌｃｐＮＡｃ－（１→］ｎ
を含み、
（ｖｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖が、式（Ｏ１６）の構造：

を含み、
（ｖｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８抗原多糖が、式（Ｏ１８Ａ）の構造：

を含み、
（ｖｉｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖が、式（Ｏ２５Ｂ）の構造：

を含み、及び
（ｉｘ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖が、式（Ｏ７５）の構造：

を含み、
各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である、［１］～［７］のいずれか一項に記載の組成物。
［９］
前記Ｏ７５抗原多糖の濃度が、約８～約６４μｇ／ｍＬ、好ましくは、約８～約５０μｇ／ｍＬ、好ましくは、約１２～約４０μｇ／ｍＬ、好ましくは、約１６～約３２μｇ／ｍＬ、好ましくは、約２８～約３６μｇ／ｍＬ、好ましくは、約３２μｇ／ｍＬである、［１］～［８］のいずれか一項に記載の組成物。
［１０］
前記組成物中に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖が、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６からなる、［１］～［９］のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］
キャリアタンパク質に共有結合的に連結された少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖をさらに含み、好ましくは、前記少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、式（Ｏ８）：
α－Ｄ－Ｍａｎｐ３Ｍｅ－（１→［３）－β－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→２）－α－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→２）－α－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→］ｎ
を有するＯ８抗原多糖を含み、
ｎが、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の組成物。
［１２］
前記キャリアタンパク質が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）又はＣＲＭ １９７ 、好ましくは、ＥＰＡであり、好ましくは、前記キャリアタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列を有する１～２０個、例えば、１～１０個、又は２～４個のグリコシル化コンセンサス配列を含み、より好ましくは、前記キャリアタンパク質が、４個の前記グリコシル化コンセンサス配列を含み、最も好ましくは、各キャリアタンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡである、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の組成物。
［１３］
前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、バイオコンジュゲーション又は化学的コンジュゲーションによって前記キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、バイオコンジュゲーションによって前記キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、前記多糖が、前記キャリアタンパク質中のグリコシル化部位におけるＡｓｎ残基に共有結合的に連結されている、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の組成物。
［１４］
対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、［１］～［１３］のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
［１５］
対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記対象に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖の各々の有効量を投与することを含み、前記抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５及びＯ２５抗原多糖の各々の前記有効量が、独立して、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々と比較して高い方法。
［１６］
ａ）Ｏ７５抗原多糖の前記有効量が、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々に対して独立して約１．５：１～約２．５：１、好ましくは、約２：１の重量比で投与されるか；又は
ｂ）Ｏ７５抗原多糖の前記有効量が、Ｏ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖に対して独立して約１．５：１～約４：１、好ましくは、約２：１の重量比で投与され、さらに、前記有効量のＯ７５抗原多糖が、Ｏ２５抗原多糖に対して１：１の重量比で投与される、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記免疫応答が、前記対象において侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防し、好ましくは、前記侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患が、敗血症及び／又は菌血症を含む、［１４］～［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
前記Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、前記Ｏ４がグルコシル化されており、前記Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、前記Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及び前記Ｏ２５抗原がＯ２５Ｂであり、
好ましくは、前記Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖が、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造をそれぞれ含み、各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、より好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の重量比が、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である、［１５］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
前記対象に投与される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖が、
ａ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６からなるか；又は
ｂ）キャリアタンパク質にそれぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖をさらに含む、［１５］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
前記対象が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、ＥｘＰＥＣ）感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクのあるヒトである、［１４］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
約８～１６μｇ、好ましくは、約１６μｇの前記Ｏ７５抗原多糖が、投与毎に投与される、［１４］～［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の投与された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の前記有効量が、１：１：１：１：１：１：１：２：２の重量比で投与される、［１４］～［２１］のいずれか一項に記載の方法。

Claims (22)

  1. 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物であって、前記抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５及びＯ２５抗原多糖の各々の濃度が、独立して、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度と比較して高い、組成物。
  2. Ｏ７５抗原多糖の濃度と、独立してＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度との重量比が、約１．５：１～約２．５：１である、請求項１に記載の組成物。
  3. Ｏ７５抗原多糖の濃度と、独立してＯ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々の濃度との重量比が、約２：１である、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖を含む組成物であって、前記抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５抗原多糖とＯ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖の濃度との重量比が、約１：５：１～約４：１、好ましくは、約２：１である組成物。
  5. Ｏ７５抗原多糖の濃度と、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６及び／又はＯ１８抗原多糖の濃度との重量比が、約１．５：１～約４：１、好ましくは、約２：１である、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記組成物中のＯ７５抗原多糖の濃度とＯ２５抗原多糖の濃度との重量比が、約１：１である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の濃度の重量比が、１：１：１：１：１：１：１：２：２である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、前記Ｏ４がグルコシル化されており、前記Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、前記Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及び前記Ｏ２５抗原がＯ２５Ｂであり、
    （ｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１抗原多糖が、式（Ｏ１Ａ）の構造：

    を含み、
    （ｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖が、式（Ｏ２）の構造：

    を含み、
    （ｉｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ４抗原多糖が、式（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）の構造：

    を含み、
    （ｉｖ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原多糖が、式（Ｏ６Ａ）の構造：

    を含み、
    （ｖ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５抗原多糖が、式（Ｏ１５）の構造：
    ［→２）－β－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１→３）－α－Ｌ－ＦｕｃｐＮＡｃ－（１→３）－β－Ｄ－ＧｌｃｐＮＡｃ－（１→］ｎ
    を含み、
    （ｖｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１６抗原多糖が、式（Ｏ１６）の構造：

    を含み、
    （ｖｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１８抗原多糖が、式（Ｏ１８Ａ）の構造：

    を含み、
    （ｖｉｉｉ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５抗原多糖が、式（Ｏ２５Ｂ）の構造：

    を含み、及び
    （ｉｘ）前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７５抗原多糖が、式（Ｏ７５）の構造：

    を含み、
    各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記Ｏ７５抗原多糖の濃度が、約８～約６４μｇ／ｍＬ、好ましくは、約８～約５０μｇ／ｍＬ、好ましくは、約１２～約４０μｇ／ｍＬ、好ましくは、約１６～約３２μｇ／ｍＬ、好ましくは、約２８～約３６μｇ／ｍＬ、好ましくは、約３２μｇ／ｍＬである、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記組成物中に存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖が、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６からなる、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. キャリアタンパク質に共有結合的に連結された少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖をさらに含み、好ましくは、前記少なくとも１つの追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、式（Ｏ８）：
    α－Ｄ－Ｍａｎｐ３Ｍｅ－（１→［３）－β－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→２）－α－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→２）－α－Ｄ－Ｍａｎｐ－（１→］ｎ
    を有するＯ８抗原多糖を含み、
    ｎが、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記キャリアタンパク質が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）又はＣＲＭ１９７、好ましくは、ＥＰＡであり、好ましくは、前記キャリアタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するコンセンサス配列を有する１～２０個、例えば、１～１０個、又は２～４個のグリコシル化コンセンサス配列を含み、より好ましくは、前記キャリアタンパク質が、４個の前記グリコシル化コンセンサス配列を含み、最も好ましくは、各キャリアタンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含むＥＰＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、バイオコンジュゲーション又は化学的コンジュゲーションによって前記キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖が、バイオコンジュゲーションによって前記キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、好ましくは、前記多糖が、前記キャリアタンパク質中のグリコシル化部位におけるＡｓｎ残基に共有結合的に連結されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  15. 対象において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくは、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記対象に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６抗原多糖の各々の有効量を投与することを含み、前記抗原多糖の各々が、独立して、キャリアタンパク質に共有結合的に連結され、Ｏ７５及びＯ２５抗原多糖の各々の前記有効量が、独立して、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々と比較して高い方法。
  16. ａ）Ｏ７５抗原多糖の前記有効量が、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８及びＯ６抗原多糖の各々に対して独立して約１．５：１～約２．５：１、好ましくは、約２：１の重量比で投与されるか；又は
    ｂ）Ｏ７５抗原多糖の前記有効量が、Ｏ１、Ｏ２、及び／又はＯ６抗原多糖に対して独立して約１．５：１～約４：１、好ましくは、約２：１の重量比で投与され、さらに、前記有効量のＯ７５抗原多糖が、Ｏ２５抗原多糖に対して１：１の重量比で投与される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記免疫応答が、前記対象において侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患の重症度を制限するか又は侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を予防し、好ましくは、前記侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患が、敗血症及び／又は菌血症を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記Ｏ１抗原がＯ１Ａであり、前記Ｏ４がグルコシル化されており、前記Ｏ６抗原がＯ６Ａであり、前記Ｏ１８抗原がＯ１８Ａであり、及び前記Ｏ２５抗原がＯ２５Ｂであり、
    好ましくは、前記Ｏ１Ａ、Ｏ２、グルコシル化Ｏ４、Ｏ６Ａ、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８Ａ、Ｏ２５Ｂ、及びＯ７５抗原多糖が、表１に示されるとおりの式（Ｏ１Ａ）、（Ｏ２）、（Ｏ４－Ｇｌｃ＋）、（Ｏ６Ａ）、（Ｏ１５）、（Ｏ１６）、（Ｏ１８Ａ）、（Ｏ２５Ｂ）、及び（Ｏ７５）の構造をそれぞれ含み、各ｎが、独立して、１～１００、好ましくは、３～５０、例えば、５～４０、より好ましくは、５～３０、例えば、７～２５、例えば、１０～２０の整数であり、
    Ｏ７５抗原多糖とＯ６抗原多糖の重量比が、約１．５：１～約４：１、より好ましくは、約２：１である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記対象に投与される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖が、
    ａ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２５、Ｏ７５及びＯ６からなるか；又は
    ｂ）キャリアタンパク質にそれぞれ独立して共有結合的に連結された１～１５種の追加の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖をさらに含む、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記対象が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（好ましくは、ＥｘＰＥＣ）感染、好ましくは、侵襲性ＥｘＰＥＣ疾患を有するか又は有するリスクのあるヒトである、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 約８～１６μｇ、好ましくは、約１６μｇの前記Ｏ７５抗原多糖が、投与毎に投与される、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. Ｏ１：Ｏ２：Ｏ４：Ｏ６：Ｏ１５：Ｏ１６：Ｏ１８：Ｏ２５：Ｏ７５の投与された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖の前記有効量が、１：１：１：１：１：１：１：２：２の重量比で投与される、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
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