CN108543066A - 一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法 - Google Patents
一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108543066A CN108543066A CN201810785585.0A CN201810785585A CN108543066A CN 108543066 A CN108543066 A CN 108543066A CN 201810785585 A CN201810785585 A CN 201810785585A CN 108543066 A CN108543066 A CN 108543066A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polysaccharide
- pneumococcus
- antigen
- antibody
- types
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229940031960 pneumococcal polysaccharide vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 40
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 title abstract description 12
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 404
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 403
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 403
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 96
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 63
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 31
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims description 28
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 claims description 27
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- -1 Freeze-dried Substances 0.000 claims description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 abstract 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 11
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229940031999 pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940049548 pneumovax Drugs 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 208000025301 tympanitis Diseases 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法‑免疫速率散射比浊法，免疫速率散射比浊至少包括将多糖抗原与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。本发明的速率散射比浊法是一种基于免疫化学方法建立的技术手段，速率散射比浊可测量悬浮于小杯中抗原抗体复合物颗粒的散射光强度变化，从而测得反应速率，该速率在某一范围内与抗原和/或抗体浓度呈线性关系，反应一旦开始便有光强变化，因此可在几十秒内得出反应结果。该法特异性强，灵敏度高，节约检测时间，且抗原抗体直接接触，有利于低浓度样品检测，可用于疫苗生产过程中原液和/或半成品和/或成品的鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及医疗领域，具体的涉及疫苗及疫苗的鉴别，尤其是一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法。
背景技术
肺炎链球菌于1881年首次被分离，在呼吸道感染可引起支气管炎、肺炎、中耳炎等疾病，侵入血液则会引起脑膜炎、败血症等更为严重的疾病。是导致儿童脑膜炎、菌血症、肺炎等严重疾病的首位病原菌。有效安全的疫苗接种是预防肺炎链球菌感染的有效措施，其中肺炎疫苗质量控制尤为重要。鉴别试验是利用药物的分子结构所表现的特殊化学行为(如进行化学反应、测定药物的理化常数等)或光谱、色谱、生物学等特征，来判断药品的真伪。药物的鉴别在药物质量检验工作中属首项工作，只有药物被鉴别无误、证实被分析药物组分正确后，才有必要进行检查和含量测定等分析工作。尤其当疫苗中存在多种抗原时，鉴别试验在检测疫苗的质量稳定性，疫苗组分正确性的过程中起到了至关重要的作用。除此之外，利用特异性免疫反应对疫苗进行鉴别试验，还可以间接证明疫苗中各有效成分是否具有相应的抗原性，疫苗制备的工艺过程是否会破坏各成分的抗原性。
欧洲药典《European Pharmacopoeia 8.0》、WHO规程《WHO Technical ReportSeries》均要求对肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖结合疫苗进行鉴别。《EuropeanPharmacopoeia 8.0》中肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖结合疫苗生产过程中原液及成品中多糖的鉴别方法推荐免疫学方法和核磁共振氢谱，《WHO Technical Report Series》中肺炎球菌多糖结合疫苗中多糖的鉴别方法推荐使用免疫学方法和核磁共振波谱；《中华人民共和国药典》(2015版三部)虽未收载肺炎球菌多糖和肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗，但对收载的多糖疫苗均要求进行鉴别，如：伤寒Vi多糖疫苗、A群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗，推荐的鉴别方法为凝胶免疫双扩散法，该法是在琼脂板上打孔，抗原抗体加入相应孔中，待其自由扩散后，抗原抗体形成可见的沉淀线。其中抗原抗体自由扩散的速度受分子量影响，分子量小者，扩散快，反之较慢。自由扩散这一性质使得该法耗时长，且对于分子量较大的样品沉淀线不明显。
《中华人民共和国药典》(2015年版3部)中收载的多糖疫苗采用免疫学鉴别方法(凝胶免疫双扩散法)，该法具体操作是：取琼脂糖加生理盐水煮沸溶胀成1.5％溶液，趁热倾倒于水平玻板上(每平方厘米加0.19ml琼脂糖)，凝固后，在玻板上打方阵型孔(直径3mm，孔距3mm)。根据需要确定方阵型图数量。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加入相应阳性对照血清，每孔加样20μl，然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24h。用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5％氨基黑溶液中染色。用脱色液脱至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。整个过程耗时2天左右甚至更长，且采用自由扩散的方式使抗原抗体接触，样品分子量不宜过大，浓度不宜过低，否则均较难形成清晰的沉淀线，自由扩散过程的稀释，导致浓度太小无法产生沉淀线，样品分子量过大也不利于扩散，影响试验效果，尤其对于在制备过程中因一系列反应使抗原性降低的样品，更难以达到免疫双扩散法中需求的适宜的抗原浓度，从而导致鉴别试验实施困难。
发明内容
为了克服现有疫苗鉴别技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种24价肺炎球菌多糖及其鉴别方法以及由上述多糖制备的多糖疫苗及其鉴别方法，本发明的速率散射比浊法是一种基于免疫化学方法建立的技术手段，速率散射比浊法可测量悬浮于小杯中的抗原抗体复合物聚集体颗粒所造成的散射光强度变化，可在几十秒内得出反应速率值。抗原或抗体浓度的不同形成颗粒的速率不同。该法特异性强，灵敏度高，节约检测时间，且抗原抗体直接接触，有利于低浓度样品检测，可用于疫苗生产过程中原液和/或半成品和/或成品的鉴别。
本发明提供了一种24价肺炎球菌多糖，所述多糖是采用免疫速率散射比浊进行鉴别，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖抗原与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。即本发明利用抗原与抗体特异结合形成抗原抗体复合物所测得的速率单位值对多糖进行鉴别，本发明克服了现有鉴别技术灵敏度差、抗原抗体使用量大、耗时长的缺陷，具有良好的效果。
优选的是，所述多糖至少包括肺炎球菌24个血清型荚膜多糖。
上述任一方案优选的是，所述肺炎球菌24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
上述任一方案优选的是，24价肺炎球菌多糖在诊断、预防和治疗肺炎球菌所致疾病的药物中的应用。
本发明还提供一种鉴别24价肺炎球菌多糖的免疫速率散射比浊方法，包括下列步骤：
(1)检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值；
(2)改变反应时间检测抗原抗体反应速率值；
(3)标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值；
(4)测试多糖供试样品。
优选的是，所述步骤(1)中检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值包括以下步骤：
a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值。
b)选择a)中抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值。
上述任一方案优选的是，步骤a)中抗体稀释倍数大于1倍，优选为大于2倍，更有选为大于4倍。
上述任一方案优选的是，步骤b)中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中通过选择确定的多糖抗原标准品浓度和抗体稀释倍数，改变反应时间检测抗原抗体反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中通过选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中通过选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，用不同浓度的多糖抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中通过选择确定的抗体稀释倍数和步骤(2)的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中应用标定曲线的方法测试多糖供试样品，其速率值大于抗原抗体反应浓度-速率曲线最低点速率值判定多糖供试样品原液鉴别试验合格。
上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，测试多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于阴性对照速率值判定多糖供试样品原液鉴别试验合格。
上述任一方案优选的是，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水。
选择确定的抗体稀释倍数和步骤(2)的反应时间，测试肺炎球菌多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定多糖鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。
上述任一方案优选的是，所述多糖至少包括肺炎球菌24个血清型荚膜多糖。
上述任一方案优选的是，所述肺炎球菌24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
本发明还公开一种24价肺炎球菌多糖疫苗，所述多糖疫苗是采用免疫速率散射比浊进行鉴别的，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖疫苗供试样品与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。即本发明利用抗原与抗体特异结合形成抗原抗体复合物所测得的速率单位值对多糖疫苗进行鉴别。
优选的是，所述24价肺炎球菌多糖疫苗中多糖至少包括肺炎球菌24个血清型荚膜多糖。
上述任一方案优选的是，所述肺炎球菌24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
本发明还公开一种鉴别24价肺炎球菌多糖疫苗的免疫速率散射比浊方法，包括下列步骤：
(1)检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值；
(2)改变反应时间检测抗原抗体反应速率值；
(3)标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值；
(4)测试多糖供试样品，。
优选的是，所述步骤(1)中检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值包括以下步骤：
a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值。
b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值。
上述任一方案优选的是，步骤a)中抗体稀释倍数大于1倍，优选为大于2倍，更优选为大于4倍。
上述任一方案优选的是，步骤b)中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中通过选择确定的多糖抗原标准品浓度和抗体稀释倍数，改变反应时间检测抗原抗体反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中通过选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中通过选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，用不同浓度的多糖抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中通过选择确定的抗体稀释倍数和步骤(2)的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。
上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中应用标定曲线的方法测试多糖供试样品，其速率值大于抗原抗体反应浓度-速率曲线最低点速率值判定多糖供试样品原液鉴别试验合格。
上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中选择确定的抗体稀释倍数和反应时间，测试多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于阴性对照速率值判定多糖供试样品原液鉴别试验合格。
上述任一方案优选的是，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水。
选择确定的抗体稀释倍数和步骤(2)的反应时间，测试肺炎球菌多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定多糖鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。
上述任一方案优选的是，所述24价肺炎球菌多糖疫苗中多糖至少包括肺炎球菌24个血清型荚膜多糖。
上述任一方案优选的是，所述肺炎球菌24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
上述任一方案优选的是，24价肺炎球菌多糖疫苗在诊断、预防和治疗肺炎球菌所致疾病的药物中的应用。
上述任一方案优选的是，其为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊。
有益效果：
(1)本发明的一种肺炎球菌多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法与现有技术及文献不同。在现有文献报道和上述典籍的方案中，多糖的鉴别方法为免疫学方法或核磁共振技术。其中免疫学方法涉及样品在体系中的扩散，因此样品需较高的浓度；核磁共振技术样品需求量大，且对样品纯度要求高。本发明的免疫速率散射比浊法，抗原抗体直接接触，不会因扩散稀释样品，形成的抗原抗体复合物由仪器通过散射光强的改变直接检测，所需样品浓度小，通常只需几十微克，几微克，甚至可鉴别浓度小于1μg/ml的样品，灵敏度高。
(2)本发明的一种肺炎球菌多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，是基于免疫学原理建立的，抗原仅与其对应的抗体发生特异性反应，形成抗原抗体复合物聚集体，对于含多组分的样品尤其适用，鉴别样品中某一组分时可排除其他组分的干扰，特异性好。
(3)本发明的一种肺炎球菌多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，整个鉴别过程在免疫化学系统(Immunochemistry System)中进行，从取样、反应到检测均由仪器完成，速率比浊检测器通过检测抗原抗体复合物聚集颗粒的光散射强度变化，将其转换成速率单位值，将结果数字化直接读取，更加直观。而现有的技术典籍中推荐的免疫沉淀和免疫电泳法，采用肉眼观察，这就要求形成的沉淀线足够清晰，核磁共振技术则需要解析图谱，寻找特征峰，对于结构复杂的多糖图谱解析困难。
(4)本发明的一种肺炎球菌多糖及其制备的多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，抗原抗体直接接触反应，节约扩散的时间，在反应开始后的10分钟内便可得出结果，且可同时检测72个样品。而常用的免疫沉淀法通过自由扩散使抗原抗体接触，耗时长达十几个小时，免疫电泳法使抗原抗体接触，也需几十分钟甚至更长，而后还需染色脱色至少几小时甚至几天，方可观察结果，步骤繁琐耗时长。
(5)本发明的一种肺炎球菌荚膜多糖及其制备的肺炎球菌多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，因其较高的灵敏度，所需抗原抗体浓度低，无需染色剂脱色液，不必制备凝胶板，大大节约鉴别试验成本。
(6)本发明的24价肺炎球菌荚膜多糖及其制备的24价肺炎球菌多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，是经过免疫速率散射比浊检测肺炎球菌多糖及多糖疫苗中抗原与相应抗体的反应速率值，可大大提高疫苗生产过程中鉴别的效率，缩短时间。
(7)本发明的24价肺炎球菌荚膜多糖及其制备的24价肺炎球菌多糖疫苗的鉴别方法–免疫速率散射比浊法，该方法基于抗原抗体特异性反应的免疫学原理，抗原抗体在37℃直接接触，在反应开始后10min内由检测器直接读取速率值，直观表达速率值，无需染色脱色，可对低浓度样品进行鉴别，灵敏度高，结果可靠；且将自由扩散后的接触改为直接接触，缩短试验时间，大大提高了鉴别效率，可应用于疫苗生产中原液、半成品和成品鉴别，在生产中具有很大的应用价值。
以上公开的内容对本发明进行了一般性描述，可以通过如下实施例，但非限制，举例进一步理解本发明的核心内容或精神。所述实施例仅用于阐述本发明的概念和几个优选的实施方案，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。应当理解本发明并不限于如下具体实施方案，并且对如下实施例进行的多种变化、调整、修饰、修改、改变、改良、改进、减少、简化、增加、增添等可以由本领域技术人员实施，而不背离本发明的范围或精神。本发明的其它实施例在不背离本发明的核心的前提下为本领域技术人员所预见。
附图说明
图1为肺炎球菌14型免疫双扩散鉴别试验结果；图中1、2、3、4、为肺炎球菌14型多糖，5为阳性对照，6为阴性对照，7为肺炎球菌14型抗血清。
图2为24价肺炎球菌多糖疫苗14型多糖免疫双扩散鉴别试验结果；图中1、2、3为肺炎球菌14型抗血清稀释2倍，4、5为肺炎球菌14型抗血清稀释6倍，6为阴性对照，7为24价肺炎球菌多糖疫苗。
具体实施方式
本发明可通过结合如下实施例进一步论述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件，除非另行定义，文中使用的所有专业与科学用语及缩写与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
以下实施例中使用的免疫化学系统(Immunochemistry System)(购自BeckmanCoulter公司，型号：IMMAGE 800)、所用配套稀释液I、缓冲液I、清洗液(均购自BeckmanCoulter公司)。
实施例1
本发明提供一种肺炎球菌多糖，所述多糖是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖溶液与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。换言之，利用抗原与抗体特异结合形成抗原抗体复合物所测得的速率单位值对多糖进行鉴别。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述24价肺炎球菌多糖包括肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
一种鉴别24价肺炎球菌荚膜多糖的免疫速率散射比浊方法，所述方法包括下列步骤：
a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中，抗体稀释倍数大于1倍，优选为大于2倍，更优选为大于4倍。
b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。
c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。
d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。
e)应用标定曲线的方法测试肺炎球菌多糖供试样品，其速率值大于d)曲线最低点速率值判定多糖鉴别试验合格。
本发明还提供了一种鉴别24价肺炎球菌荚膜多糖的免疫速率散射比浊方法，所述方法至少包括下列步骤：
a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中，抗体稀释倍数大于1倍，优选为大于2倍，更优选为大于4倍。
b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。
c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。
d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，测试肺炎球菌多糖供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定多糖鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。该方法和上述鉴别方法区别仅在于步骤(d)。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述24价肺炎球菌多糖包括肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
在实施例中，建立了一种肺炎球菌荚膜多糖的鉴别方法-免疫速率散射比浊鉴别法，确定了抗原抗体反应的适宜浓度，合适的反应时间，并对方法进行精密度、准确度和专属性验证，应用建立的方法鉴别24价肺炎球菌荚膜多糖。
实施例2
本发明提供一种24价肺炎球菌多糖疫苗，所述肺炎球菌多糖疫苗是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖疫苗与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。换言之，利用抗原与抗体特异结合形成抗原抗体复合物所测得的速率单位值对多糖疫苗进行鉴别。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述24价肺炎球菌多糖疫苗中多糖包含肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述24价肺炎球菌多糖疫苗中肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
本实施例还提供了一种鉴别24价肺炎球菌荚膜多糖疫苗的免疫速率散射比浊方法，所述方法包括下列步骤：
a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中，抗体稀释倍数大于1倍，优选为大于2倍，更优选为大于4倍。
b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。
c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。
d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，用不同浓度的抗原标准品和抗体反应，标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值。
e)应用标定曲线的方法测试肺炎球菌多糖疫苗供试样品，其速率值大于d)曲线最低点速率值判定肺炎球菌多糖疫苗鉴别试验合格。
一种用于鉴别上述24价肺炎球菌荚膜多糖疫苗的免疫速率散射比浊方法，所述方法至少包括下列步骤：
a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中，抗体稀释倍数大于1倍，优选为大于2倍，更优选为大于6倍。
b)选择a)抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测抗原标准品与抗体反应速率值，其中抗原浓度大于0.1μg/ml，优选为大于0.5μg/ml，更优选为大于1μg/ml。
c)选择b)的抗原标准品浓度和a)的抗体稀释倍数，改变反应时间检测多糖抗原抗体反应速率值，其中反应时间为1.5～10min，优选为1.5～5min，更优选为1.5～2.5min。
d)选择确定的抗体稀释倍数和c)的反应时间，测试肺炎球菌多糖疫苗供试样品与抗体反应速率值，其速率值大于cutoff值(阴性对照速率值)判定球菌多糖疫苗鉴别试验合格，所述阴性对照至少包括PBS缓冲液、PB缓冲液、生理氯化钠溶液、注射用水、去离子水、蒸馏水，其中cutoff值为阴性对照平均速率值，优选为2.1倍阴性对照平均速率值，更优选为阴性对照平均速率值加上2个标准差，最优选为阴性对照平均速率值加3个标准差。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述24肺炎球菌多糖疫苗中多糖包括肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖。
本实施例进一步优化的技术方案是，所述24肺炎球菌多糖疫苗中肺炎球菌任意24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
在该实施例中，建立了一种肺炎球菌荚膜多糖疫苗的鉴别方法-免疫速率散射比浊鉴别法，确定了抗原抗体反应的适宜浓度，合适的反应时间，并对方法进行精密度、准确度和专属性验证，应用建立的方法鉴别24价肺炎球菌荚膜多糖疫苗。
本发明中建立的免疫速率散射比浊鉴别法，是将抗原抗体稀释至合适浓度，37℃直接接触反应，在10min内读取反应速率值。相较于免疫双扩散法，免疫速率散射比浊法操作简单，耗时短，无需凝胶板，无需染色脱色，直接接触也使抗原抗体可在较小的浓度范围进行反应，结果直观，对于抗原性降低的大分子样品尤为适合。
实施例3
(1)样品来源：肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F荚膜多糖标准品均购于ATCC，肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F抗血清购于丹麦国立血清研究所。
(2)按照本公司另一发明专利CN201010129404.2公布方法制备以下肺炎球菌多糖原液及多糖疫苗：肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖；24价肺炎球菌多糖疫苗。
(3)按世界卫生组织正式颁布的肺炎球菌结合疫苗制造及检定规程(WHOTechnical Report Series,No.927,2005)规定方法和标准对多糖进行鉴定。
以下实施例中抗体稀释倍数、多糖标准品浓度范围及反应时间仅限于本次试验，但非限制，因标准抗体无准确抗体含量或滴度，由其瓶号、批次、titer的不同，多糖标准品批次不同，各血清型抗原抗体反应特性的差异，可根据实际情况调整反应参数。
实施例4 24价肺炎球菌多糖鉴别
(1)根据发明内容实施例1所述方法，确定肺炎球菌各血清型荚膜多糖对应抗体稀释倍数(表1，具体为1：2～1：6之间)，肺炎多糖抗原标准品的浓度范围(0.5μg/ml～6μg/ml)，最佳反应时间(表1，具体为1.5min～2.5min)。根据确定的反应参数，将抗原抗体放入仪器对应位置，运行，抗原抗体取样量各20μl，记录各浓度下反应速率值(表2)，记录线性最低点速率值(表1)。并对方法进行精密度、准确度、专属性验证。
表1.肺炎球菌多糖鉴别试验参数范围
表2各浓度对应反应速率值
(2)将肺炎球菌多糖稀释至多糖浓度为1μg/ml～5.5μg/ml，将对应抗体稀释合适倍数，即肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F抗血清分别稀释4、5、4、5、6、2、2、6、6、2、3、5、6、4、6、3、5、4、4、4、6、5、6、5倍，同时取多糖溶剂系统(具体为生理氯化钠溶液)为阴性对照，将抗原抗体放入仪器对应位置，抗原抗体取样量各20μl，应用建立曲线的参数测试多糖速率值。
(3)24价肺炎球菌多糖鉴别结果见表3。由结果可以看出，肺炎球菌24个血清型荚膜多糖速率值均大于其对应曲线最低点速率值，且大于阴性对照平均值，24价肺炎球菌多糖鉴别试验合格。
表3.肺炎球菌多糖原液鉴别试验结果
实施例5 24价肺炎球菌多糖疫苗鉴别
(1)按照实施例2所述方法，取肺炎球菌多糖疫苗稀释至多糖浓度为1μg/ml～5.5μg/ml，同时取多糖溶剂系统(具体为生理氯化钠溶液)为阴性对照，将对应抗体稀释至一定倍数，即肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F抗血清分别稀释4、5、4、5、6、2、2、6、6、2、3、5、6、4、6、3、5、4、4、4、6、5、6、5倍，将抗原抗体放入仪器对应位置，抗原抗体取样量各20μl，应用建立曲线的参数测试多糖速率值。
(2)24价肺炎球菌多糖疫苗鉴别结果见表4。24价肺炎球菌多糖疫苗中24个血清型荚膜多糖速率值均大于其对应曲线最低点速率值，且大于阴性对照平均值，24价肺炎球菌多糖疫苗鉴别试验合格。
表4. 24价肺炎球菌多糖疫苗鉴别试验结果
实施例6 24价肺炎球菌多糖鉴别(免疫双扩散法，对比实施例)
(1)称取琼脂糖加生理氯化钠溶液煮沸使完全溶胀，配成1％琼脂糖溶液，将溶液倾倒于水平玻板上(每平方厘米约0.19ml琼脂糖)，待其凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm。中央孔加多糖对应血清型抗血清，各血清型抗血清稀释2～6倍，稀释倍数与免疫速率散射比浊法相同，即肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F抗血清分别稀释4、5、4、5、6、2、2、6、6、2、3、5、6、4、6、3、5、4、4、4、6、5、6、5倍，周边孔加肺炎球菌24价多糖溶液、阳性对照(多糖标准品)和阴性对照(生理氯化钠溶液)，肺炎球菌各血清型多糖溶液及阳性对照均稀释至100μg/ml～150μg/ml之间，每孔加样20μl，置水平湿盒中37℃扩散24小时。再用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板20min，以除去未结合的抗原抗体。将浸泡好的琼脂糖凝胶板取出，用滤纸压干后考马斯亮蓝G250染色液染色30min，用脱色液(乙醇：冰乙酸：水＝2:9:9体积比)脱色至背景无色，期间更换脱色液4次/天，共3天，沉淀线呈清晰的蓝色为止。
(2)图1以肺炎球菌14型多糖为例，说明免疫双扩散法鉴别试验。在凝胶中多糖供试品与肺炎球菌14型抗血清形成明显沉淀线，沉淀线之间无交叉，证明为同一种物质，阴性对照不形成沉淀线，肺炎球菌14型多糖鉴别试验合格，但由于多糖分子量较大，形成的免疫沉淀线靠近多糖，且弯向多糖一侧。
实施例7 24价肺炎球菌多糖疫苗鉴别(免疫双扩散法，对比实施例)
(1)称取琼脂糖加生理氯化钠溶液煮沸使完全溶胀，配成1％琼脂糖溶液，将溶液倾倒于水平玻板上(每平方厘米约0.19ml琼脂糖)，待其凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm。中央孔加24价肺炎球菌多糖疫苗，周边孔加对应型别抗血清和阴性对照(生理氯化钠溶液)，各血清型抗血清稀释2～6倍，因疫苗中各型多糖含量均小于50μg/ml，各型多糖对应抗血清均稀释2个倍数即肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F抗血清均稀释2倍和6倍，肺炎球菌多糖疫苗供试品不稀释，每孔加样20μl，置水平湿盒中37℃扩散24小时。再用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板20min，以除去未结合的抗原抗体。将浸泡好的琼脂糖凝胶板取出，用滤纸压干后考马斯亮蓝G250染色液染色30min，用脱色液(乙醇：冰乙酸：水＝2:9:9体积比)脱色至背景无色，期间更换脱色液4次/天，共3天，沉淀线呈清晰的蓝色为止。
(2)图2以24价肺炎球菌多糖疫苗中14型多糖为例，说明免疫双扩散法鉴别疫苗成品试验。在凝胶中24价肺炎球菌多糖疫苗中14型多糖与抗血清形成明显沉淀线，阴性对照不形成沉淀线，24价肺炎球菌多糖疫苗中14型多糖鉴别试验合格，但由于多糖分子量较大，形成的免疫沉淀线靠近多糖，且弯向多糖疫苗一侧，疫苗成品中多糖含量较低，与抗血清形成的沉淀线不如多糖原液与抗血清形成的沉淀线明显。
综合以上实施例，本发明的一种24价肺炎球菌多糖疫苗鉴别方法-免疫速率散射比浊法，用于24价肺炎球菌多糖及疫苗的鉴别，操作简单，从取样到读数均由机器完成，灵敏度高可检测1μg/ml以下样品，结果以速率值形式呈现更加直观，其优点在于(1)若判定标准采用与曲线最低点速率值比较方法，曲线一经建立，在抗体效价不变情况下，曲线无需重新标定可重复使用，样品鉴别时只需测试样品速率值；(2)若判定标准采用与阴性对照比较，无需标定曲线，样品测试时只需测试样品与阴性值；(3)可同时鉴别72个同血清型和/或不同血清型样品，有很强的实用价值。
Claims (10)
1.一种24价肺炎球菌多糖，所述多糖是采用免疫速率散射比浊进行鉴别，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖抗原与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。
2.根据权利要求1所述的24价肺炎球菌多糖，其特征在于，所述多糖至少包括肺炎球菌24个血清型荚膜多糖。
3.根据权利要求2所述的24价肺炎球菌多糖，其特征在于，所述肺炎球菌24个血清型荚膜多糖包括肺炎球菌1型荚膜多糖、肺炎球菌2型荚膜多糖、肺炎球菌3型荚膜多糖、肺炎球菌4型荚膜多糖、肺炎球菌5型荚膜多糖、肺炎球菌6A型荚膜多糖、肺炎球菌6B型荚膜多糖、肺炎球菌7F型荚膜多糖、肺炎球菌8型荚膜多糖、肺炎球菌9V型荚膜多糖、肺炎球菌9N型荚膜多糖、肺炎球菌10A型荚膜多糖、肺炎球菌11A型荚膜多糖、肺炎球菌12F型荚膜多糖、肺炎球菌14型荚膜多糖、肺炎球菌15B型荚膜多糖、肺炎球菌17F型荚膜多糖、肺炎球菌18C型荚膜多糖、肺炎球菌19A型荚膜多糖、肺炎球菌19F型荚膜多糖、肺炎球菌20型荚膜多糖、肺炎球菌22F型荚膜多糖、肺炎球菌23F型荚膜多糖、肺炎球菌33F型荚膜多糖中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的24价肺炎球菌多糖，其特征在于，24价肺炎球菌多糖在诊断、预防和治疗肺炎球菌所致疾病的药物中的应用。
5.一种鉴别24价肺炎球菌多糖的免疫速率散射比浊方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值；
（2）改变反应时间检测抗原抗体反应速率值；
（3）标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值；
（4）测试多糖供试样品。
6.根据权利要求5所述的鉴别24价肺炎球菌多糖的免疫速率散射比浊方法，其特征在于，所述步骤（1）中检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值包括以下步骤：
a)固定多糖抗原标准品浓度，改变抗体稀释倍数，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值，
b)选择a)中抗体稀释倍数，改变多糖抗原标准品浓度，检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值。
7.一种24价肺炎球菌多糖疫苗，所述多糖疫苗是采用免疫速率散射比浊进行鉴别的，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖疫苗供试样品与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。
8.一种鉴别24价肺炎球菌多糖疫苗的免疫速率散射比浊方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值；
（2）改变反应时间检测抗原抗体反应速率值；
（3）标定抗原抗体反应浓度-速率曲线，记录最低点反应速率值；
（4）测试多糖供试样品。
9.根据权利要求7所述的24价肺炎球菌多糖疫苗，其特征在于，24价肺炎球菌多糖疫苗在诊断、预防和治疗肺炎球菌所致疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求7所述的24价肺炎球菌多糖疫苗，其特征在于，其为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810785585.0A CN108543066A (zh) | 2018-07-17 | 2018-07-17 | 一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810785585.0A CN108543066A (zh) | 2018-07-17 | 2018-07-17 | 一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108543066A true CN108543066A (zh) | 2018-09-18 |
Family
ID=63492233
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810785585.0A Pending CN108543066A (zh) | 2018-07-17 | 2018-07-17 | 一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108543066A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11116828B2 (en) | 2017-12-06 | 2021-09-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| CN113433122A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-09-24 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 检测细菌性疫苗的多糖分子大小的方法 |
| US11642406B2 (en) | 2018-12-19 | 2023-05-09 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101785857A (zh) * | 2010-03-05 | 2010-07-28 | 郑玉清 | 一种新的肺炎球菌结合疫苗及其制备方法 |
| CN103656632A (zh) * | 2012-09-24 | 2014-03-26 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用 |
-
2018
- 2018-07-17 CN CN201810785585.0A patent/CN108543066A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101785857A (zh) * | 2010-03-05 | 2010-07-28 | 郑玉清 | 一种新的肺炎球菌结合疫苗及其制备方法 |
| CN103656632A (zh) * | 2012-09-24 | 2014-03-26 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHI-JEN LEE: "quality control of polyvalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine by nephelometry", 《BIOLOGICALS》 * |
| 刘倩等: "检测23价肺炎球菌多糖疫苗各型多糖含量的速率散射比浊法的建立", 《国际生物制品学杂志》 * |
| 刘威等: "肺炎1型多糖含量的测定方法的建立", 《2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集》 * |
| 石继春等: "肺炎链球菌荚膜多糖抗原活性的评价方法", 《中华微生物学和免疫学杂志》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11116828B2 (en) | 2017-12-06 | 2021-09-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| US11850278B2 (en) | 2017-12-06 | 2023-12-26 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| US12097250B2 (en) | 2017-12-06 | 2024-09-24 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| US11642406B2 (en) | 2018-12-19 | 2023-05-09 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| US12016914B2 (en) | 2018-12-19 | 2024-06-25 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| CN113433122A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-09-24 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 检测细菌性疫苗的多糖分子大小的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108543066A (zh) | 一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法 | |
| CN108279309B (zh) | 一种pla2r抗体的检测试纸条及检测方法 | |
| Lal et al. | Development and evaluation of a tetraplex flow cytometric assay for quantitation of serum antibodies to Neisseria meningitidis serogroups A, C, Y, and W-135 | |
| CN202794178U (zh) | 降钙素原快速定量免疫层析检测试剂盒 | |
| CN108414748A (zh) | 一种thsd7a抗体的检测试纸条及检测方法 | |
| CN107796938A (zh) | 一种核酸适配体荧光试纸条及其制备方法和应用 | |
| WO2018120854A1 (zh) | 检测ck-mb的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
| CN101825640A (zh) | 一种胶体金免疫层析定性定量两用检测hcg试纸 | |
| CN111812321A (zh) | 基于纳米等离子共振的新型冠状病毒颗粒定量检测方法 | |
| CN103487586B (zh) | 一种定量检测可溶性生长刺激表达蛋白2的试验装置 | |
| Konradsen et al. | A modified enzyme-linked immunosorbent assay for measuring type-specific anti-pneumococcal capsular polysaccharide antibodies | |
| CN105929154A (zh) | 快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条及其试剂盒 | |
| CN109142758A (zh) | 一种检测糖化血红蛋白的免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
| CN102012433A (zh) | 禽流感病毒h9亚型阳性血清和阴性血清标准物质及制备方法 | |
| CN103197063A (zh) | 一种免疫层析试剂盒及其检测方法 | |
| CN101320041A (zh) | 一种快速定量检测c-反应蛋白的胶体金法及其应用 | |
| CN109010813A (zh) | 一种免疫原性多糖疫苗及其鉴别方法 | |
| CN102346191B (zh) | 番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂及其制备方法 | |
| CN108387543A (zh) | 一种测定肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖的方法 | |
| CN106771145A (zh) | 一种检测d‑二聚体斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法 | |
| CN101718783B (zh) | 广谱抗人球蛋白卡的制备方法 | |
| CN109856397A (zh) | 一种快速检测兔瘟病毒的胶体金检测卡及其制备方法 | |
| Lee | The quantitative immunochemical determination of pneumococcal and meningococcal capsular polysaccharides by light scattering rate nephelometry | |
| Yao et al. | Effects of pH on structure and function of single living erythrocyte | |
| CN110172087A (zh) | 一种o抗原亲和介质及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180918 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |