CN109771640A

CN109771640A - 多价肺炎球菌结合疫苗

Info

Publication number: CN109771640A
Application number: CN201910149597.9A
Authority: CN
Inventors: 杜琳; 杜真晖; 蒋凌峰
Original assignee: Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co Ltd; Chongqing Zhi Fei Biological Products Ltd By Share Ltd; Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co Ltd; Chongqing Zhi Fei Biological Products Ltd By Share Ltd; Chongqing Zhifei Biological Products Co Ltd; Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-05-21

Abstract

本发明提供一种多价肺炎球菌结合疫苗的血清型组合。本发明的多价肺炎球菌结合疫苗血清型组合中，含有肺炎球菌血清型24和35(24F和35B)，用于预防由所包含血清型的肺炎球菌所引起的感染。

Description

多价肺炎球菌结合疫苗

技术领域

本发明涉及一种多价肺炎球菌结合疫苗，至少包含肺炎球菌血清型24和血清型35，用于预防由所包含血清型的肺炎球菌所引起的感染。

背景技术

肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起儿童和老人罹患肺炎、脑膜炎、菌血症等的主要病原菌，在全球有很高的发病率和死亡率。目前已有预防用制剂(疫苗)在不同人群中使用，包括在2岁以上人群中使用的肺炎球菌多糖疫苗和能在婴幼儿中使用的肺炎球菌结合疫苗。肺炎球菌多糖疫苗只有一种，是23价肺炎球菌多糖疫苗，包括的肺炎血清型为1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和33F。肺炎球菌结合疫苗包括7价、10价和13价，其中13价是7价的升级产品，包含7价所含的所有血清型。10价肺炎球菌结合疫苗包含的血清型为1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F，13价肺炎球菌结合疫苗包含的血清型为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。

肺炎球菌结合疫苗是目前疫苗开发的一个热点，许多研究机构和制造企业参与其中，有许多专利申请和文献公开。在多价肺炎球菌结合疫苗血清型组合中，美国专利9,107,872公开了已上市10价结合疫苗组合，美国专利9,981,035公开了已上市13价结合疫苗组合。另外，美国专利8,192,746公开了一种15价结合疫苗组合，含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。美国专利10,058,607公开了另一种15价结合疫苗组合，含血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F。美国专利9,981,029公开了一种13价疫苗结合组合，含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F中的任何12种，另从血清型2或9N中选1种，组成13价疫苗。美国专利5,623,057公开了一种23价结合疫苗组合，血清型组合与23价多糖疫苗相同。美国专利申请20180207262公开了一种13价结合疫苗组合，含血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F。WO 2013/191459Al公开了一种15价结合疫苗组合，血清型包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F。WO 2014/092378Al公开了一种13价结合疫苗组合，其中12种血清型选自1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，另一种血清型选自22F或33F。WO 2016/207905公开了一种12价以上组合物，其中血清型选自1、3、4、5、6B、7F、9N、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的组合。中国专利申请公开号CN 101590224公开了14价结合疫苗组合，含血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F。中国专利申请公开号CN 103623401公开了另一种14价结合疫苗组合，包含血清型1、3、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。中国专利申请公开号CN 103656631 A公开了24价肺炎结合疫苗组合，血清型除23价多糖疫苗所包含的型别外，另添加了6A血清型。中国专利申请公开号CN 104069488 A公开了一种14价肺炎结合疫苗组合，血清型包括1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。中国专利申请公开号CN 107810010A公开了一种12价结合疫苗组合，血清型选自1、3、4、5、6B、7F、9N、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F。中国专利申请公开号CN1081144056A公开了一种多价结合疫苗组合，血清型选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、16F、17F、18C、19A、19F、20、20F、23A、23F和33F。中国专利申请公开号CN 109091668A公开了一种16价结合疫苗组合，包含血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F和23F。

本发明所涉及的24和35血清型是未包含在目前已上市产品中的血清型，包括23价肺炎球菌多糖疫苗。在可查阅的专利中，也没有含有该两种血清型的结合疫苗组合。在发表文献中，也没有这两种血清型制备结合物的报道，但这两个血清型却是目前国际上引起发病上升最快的血清型，尤其是这两种血清型通常具有耐药性，对治疗也造成困难。意大利在2002年就报道了多重耐药的24F血清型引起的脑膜炎(Pantosti A,et al.A novel,multiple drug-resistant,serotype 24F strain of streptococcus pneumoniae thatcaused meningitis in patients in Naples,Italy.Clin Infect Dis.2002,35(2):205-208)，而多重耐药的35B血清型在1999年就有报道(Ríos AM,et al.The impact ofantimicrobial resistance and streptococcus pneumoniae serotype distributionon the mortality of children under 5years of age with invasive disease.RevPanam Salud Publica.1999,5(2):69-76.)。这两种血清型随着肺炎球菌结合疫苗的使用引起的发病率明显上升，成为疫苗非涵盖血清型中发病率最高的血清型之一。美国肺炎疫苗使用后的调查发现，当下引起肺炎侵袭性疾病的最常见非疫苗涵盖血清型就是35B，而且多有抗药性(Beall B,et al.A population-based descriptive atlas of invasivepneumococcal strains recovered within the U.S.During2015-2016.FrontMicrobiol.2018,9:2670)。日本引起儿童急性中耳炎的肺炎血清型中，35B也是最主要非疫苗涵盖血清型，对青霉素的抗性也在增长(Ubukata K,et al.Etiology of acute otitismedia and characterization of pneumococcal isolates after introduction of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Japanese children.Pediatr Infect DisJ.2018,37(6):598-604.)。实际上，日本在肺炎疫苗使用后，肺炎球菌引起疾病的最主要非疫苗涵盖血清型也是35B(Miyazaki H,et al.Serotype distribution andantimicrobial susceptibility of streptococcus pneumoniae strains isolated inJapan after introduction of the routine immunization program.J InfectChemother.2017Apr；23(4):234-240.)。在法国，也发现了青霉素抗性的肺炎球菌35B，但在分离菌中，出现频率最高的非疫苗涵盖血清型是24F(Varon E,et al.Invasive diseasepotential of pneumococci before and after 13-valent pneumococcal conjugatevaccine implementation in children.Vaccine.2015,33(46):6178-85.)。在欧洲的西班牙，使用7价肺炎结合疫苗后，引起2岁以下肺炎球菌侵袭性疾病的非疫苗涵盖最主要血清型也是24F(Salleras L,et al.Changes in serotypes causing invasive pneumococcaldisease(2005-2007vs.1997-1999)in children under 2years of age in a populationwith intermediate coverage of the 7-valent pneumococcal conjugatedvaccine.Clin Microbiol Infect.2009,15(11):997-1001.)。欧洲的德国(van derLinden M,et al.Effects of infant pneumococcal conjugate vaccination onserotype distribution in invasive pneumococcal disease among children andadults in Germany.PLoS One.2015,10(7):e0131494.)、意大利(Camilli R,etal.Impact of pneumococcal conjugate vaccine(PCV7and PCV13)on pneumococcalinvasive diseases in Italian children and insight into evolution ofpneumococcal population structure.Vaccine.2017,35(35Pt B):4587-4593.)、葡萄牙(Silva-Costa C,et al.Dominance of vaccine serotypes in pediatric invasivepneumococcal infections in Portugal.Sci Rep.2019,9(1):6.)在使用肺炎结合疫苗后，引起肺炎球菌侵袭性疾病的非疫苗涵盖血清型主要也是24F。我国肺炎结合疫苗的使用历史不长，2017年13价结合疫苗才开始使用，疫苗使用前(2000～2016年)我国肺炎球菌主要血清型的荟萃分析发现，10价、13价和23价疫苗保护覆盖率仅为52.3％、68.4％和65.5％，即有超过30％的分离菌是非疫苗涵盖血清型(Chen K,et al.Serotypedistribution of streptococcus pneumoniae and potential impact of pneumococcalconjugate vaccines in China:A systematic review and meta-analysis.Hum VaccinImmunother.2018,14(6):1453-1463.)。一项在国内17个城市开展的(2011～2016年)分离肺炎球菌血清型的分布同样发现，7价和13价肺炎结合疫苗的对型覆盖率为37.5％和58.3％(Zhao C,et al.Serotype distribution and antibiotic resistance ofstreptococcus pneumoniae isolates from 17Chinese cities from 2011to 2016.BMCInfect Dis.2017,17(1):804.)。以上资料显示，我国分离的肺炎球菌中，还有一大部分不在目前疫苗所涵盖的血清型范围内，在研制肺炎疫苗时，必须要加以考虑。

不同细菌荚膜多糖由于结构的不同，并不能保证都能够制备出免疫原性符合要求的结合物，本发明的发明人发现用24F和35B血清型的荚膜多糖可以制备结合物，所制备结合物可以诱导动物产生特异性免疫应答，而且再次注射时，具有加强免疫应答效果(Booster Response)。另外，由于载体抑制现象的存在，制备多价结合疫苗时，会不可预测的抑制到一些血清型别的特异性抗体诱导能力(赵娜娜等.糖结合疫苗及其免疫干扰的研究进展.《中国医学创新》2013年24期；谭亚军等.多糖蛋白结合疫苗中载体蛋白的研究及应用.《中国疫苗和免疫》2013年04期)，但发明人发现，24F和35B血清型的结合物与其他血清型的肺炎球菌结合物混合制备多价疫苗时，不影响自体的免疫应答效果，同时也不影响其他血清型的免疫应答。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多价肺炎球菌结合疫苗。

本发明所述的结合疫苗，至少由选自肺炎球菌血清型24和35的肺炎球菌结合物组合制备而成。

其中，肺炎球菌血清型24选自：24A、24B、24F中的一种，最优选24F。

其中，肺炎球菌血清型35选自：35A、35B、35C、35D、35F中的一种，最优选35B。

本发明所述的结合疫苗，除了肺炎球菌血清型24和35的肺炎球菌结合物，还包括选自肺炎球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9A、9N、9V、10A、11A、12F、12A、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F、45、46中的一种或多种肺炎球菌结合物。

优选的，本发明所述的结合疫苗，由选自肺炎球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9A、9N、9V、10A、11A、12F、12A、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、24F、33F、35B、45、46的肺炎球菌结合物组合制备而成。

更优选，本发明所述的结合疫苗，由选自肺炎球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、15B、18C、19F、19A、22F、23F、24F、33F、35B、45、46的肺炎球菌结合物组合制备而成。

进一步优选，本发明所述的结合疫苗，由选自肺炎球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18C、19F、19A、22F、23F、24F、33F、35B的肺炎球菌结合物组合制备而成。

更进一步优选，本发明所述的结合疫苗，由选自肺炎球菌血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19F、19A、23F、24F、35B的肺炎球菌结合物组合制备而成。

最优选，本发明所述的结合疫苗，由选自肺炎球菌血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19F、19A、23F、24F、35B的肺炎球菌结合物组合制备而成。

本发明所述结合疫苗还含有佐剂，佐剂是铝佐剂，铝佐剂是磷酸铝佐剂。

本发明所述结合疫苗还可是不含佐剂的冻干剂型。本发明所述冻干剂型是以乳糖为赋形剂的冻干制品。

本发明所述结合物是采用肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白质通过化学偶联而制备的。

本发明所述多种型别结合物中，每种结合物的含量是1～5μg/剂。

本发明中，各血清型的结合物由细菌荚膜多糖和载体蛋白通过化学偶联而制备，多糖与蛋白质可直接连接，也可通过间隔剂连接。结合物制备的化学偶联方法都是本领域众所周知的方法，包括利用多糖和载体蛋白质上已有化学基团直接或经由间隔物基团连接；也包括用溴化氢或1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖形成氰酸酯，再直接或经由间隔物基团偶联至载体蛋白上；还包括用高碘酸钠氧化形成醛基，再直接或经由间隔物基团偶联至载体蛋白上。制备结合物的肺炎球菌荚膜多糖可以是纯化的原始多糖，也可以是经过物理和(或)化学手段降解的多糖片段，物理降解手段包括超声、微波、减压等，化学降解手段包括酸水解、碱水解、氧化水解等。

载体蛋白可以是任何生理可接受的蛋白质，包括细菌外毒素及其衍生物，如：破伤风类毒素(TT)和其片段、白喉类毒素(DT)和其片段、交叉反应物质197(CRM197)、交叉反应物质9(CRM9)、百日咳类毒素(PT)、霍乱毒素B亚单位、减毒的绿脓杆菌外毒素A；细菌外膜蛋白及其复合物，如：脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMPC)、孔蛋白(Por)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白质(PsaA)、流感嗜血杆菌D蛋白(PD)；其他蛋白质，如钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、铁传递蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、C5a肽酶。优选TT、DT、CRM197、PD蛋白。

在结合物组合中，不同的结合物可采用同一种载体蛋白，也可采用不同的载体蛋白。在结合物组合中，每一次使用剂量(1人剂)含有各型多糖0.1至50μg，这种量可以根据肺炎球菌血清型变化，通常，每种疫苗剂量包含每种多糖0.1至50μg的、优选地0.5至10μg、更优选地1至5μg。

本发明中，可以根据选择的结合物组合按常规配制产品，采用的稀释剂包括水、盐溶液、缓冲液。其中缓冲液包括：磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、氨基酸缓冲液。另外，所配制产品中还可以包含佐剂、稳定剂、防腐剂、冻干赋形剂。佐剂包括铝佐剂、油乳佐剂、免疫激活寡核酸佐剂、多肽佐剂、细胞因子佐剂、CpG、MF59、MPL、QS21、TLR激动剂，佐剂可以是其中的一种，也可以是两种或两种以上形成的组合。佐剂优选铝佐剂，最优选磷酸铝佐剂。另外，产品剂型可以是液体剂型，也可以是冻干剂型。产品终分装形式可以是单剂量小瓶、多剂量小瓶或预填充的注射器。

本发明的多价肺炎球菌结合疫苗可采用疫苗领域的常规途径接种，包括粘膜途径和肠道外途径，粘膜途径包括口服、喷鼻、滴眼、肛门和(或)阴道给药，肠道外途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、微针贴片给药，以上接种途径可单一使用，也可联合使用。接种途径优选口服、喷鼻、肌肉注射、皮下注射，最优选肌肉注射。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。

实施例1肺炎球菌24F结合物制备：

将肺炎球菌24F的荚膜多糖用生理盐水溶解为10～20mg/ml，调整pH值至9.0左右，按质量比1:0.75加入CDAP，维持pH值为9.00反应5min，与CDAP等体积加入2％三乙胺溶液，pH值为10.00-11.00，反应5min，调整pH值为8.60，按多糖蛋白质量比1:1加入载体蛋白TT，维持pH值8.6反应120分钟以上，甘氨酸终止反应，超滤后获得多糖结合物。结合物经Sepharose 4FF层析纯化，收集V₀附近洗脱峰，获得肺炎球菌24F结合物。

实施例2、肺炎球菌35B结合物

将肺炎球菌35B的荚膜多糖用注射用水溶解为10～20mg/ml，调整pH值至9.0左右，按质量比1:0.75加入CDAP，维持pH值为9.00反应5min，与CDAP等体积加入2％三乙胺溶液，pH值为10.00-11.00，反应5min，调整pH值为8.60，按多糖蛋白质量比1:0.5加入载体蛋白TT，维持pH值8.6反应120分钟以上，甘氨酸终止反应，超滤后获得多糖结合物。结合物经Sepharose 4FF层析纯化，收集V₀附近洗脱峰，获得肺炎球菌35B结合物。

实施例3、其他型别肺炎球菌结合物

肺炎球菌1、3、4、5、6A、6B、8、9A、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、23F、33F采用实施例1的方法制备；肺炎球菌2、7F、12F、12A、22F、45、46采用实施例2的方法制备。

实施例4多价肺炎球菌结合疫苗配制：

本实施例配制含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19F、19A、23F、24F和35B的16价组合。根据以上各型结合物原液的多糖含量，精确计算至终浓度4μg/ml所需结合物原液量。

在配制容器加入生理盐水，在150rpm连续搅拌下，按计算的结合物原液量，依次缓慢滴加各型结合物原液，维持pH6.0，各型结合物原液滴加完成后，继续搅拌10分钟以上，滴加磷酸铝佐剂至铝离子含量0.4mg/ml，补充生理盐水至终体积，调整pH值至5.8，继续搅拌1小时以上，静置，即获得多价结合物。以上配制均需在无菌条件下进行。

实施例5免疫原性研究：

在小鼠模型中评价本发明疫苗的免疫原性。免疫组包括16价疫苗组合(实施例4)和16种单价结合物，以生理盐水免疫组为阴性对照。

试验采用NIH小鼠，皮下免疫2针，间隔2周，剂量为0.1ml。每针免疫后14天采血，分离血清，测定特异性血清效价。阴性对照平均值加2倍SD作为cutoff值判定血清抗体滴度，取对数后(log2)进行数据分析。结果可以看出，各型单价结合物和16价疫苗在免疫后都可以诱导小鼠产生特异性的免疫应答，免疫2针的抗体效价各型基本都高于1针，具有加强免疫效果。24F和35B也具有较好的免疫应答，也具有明显的加强免疫效果。

16价肺炎球菌结合疫苗及各型单价结合物在小鼠免疫应答状况

Claims

1.一种多价肺炎球菌结合疫苗，至少由选自肺炎球菌血清型24和35的肺炎球菌结合物组合制备而成。

2.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于，肺炎球菌血清型24选自：24A、24B、24F中的一种，最优选24F。

3.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于，肺炎球菌血清型35选自：35A、35B、35C、35D、35F中的一种，最优选35B。

4.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于，除了肺炎球菌血清型24和35的肺炎球菌结合物，还包括选自肺炎球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9A、9N、9V、10A、11A、12F、12A、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F、45、46中的一种或多种肺炎球菌结合物。

5.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于，由选自肺炎球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9A、9N、9V、10A、11A、12F、12A、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、24F、33F、35B、45、46的肺炎球菌结合物组合制备而成。

6.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于，由选自肺炎球菌血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19F、19A、23F、24F、35B的肺炎球菌结合物组合制备而成。

7.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于，还含有佐剂，佐剂是铝佐剂，铝佐剂是磷酸铝佐剂。

8.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于，结合物是采用肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白质通过化学偶联而制备的。

9.肺炎球菌24F结合物的制备，包括以下步骤：

将肺炎球菌24F的荚膜多糖以注射用水溶解为10～20mg/ml，调整pH值至9.0左右，按质量比1:0.75加入CDAP，维持pH值为9.00反应5min，与CDAP等体积加入2％三乙胺溶液，pH值为10.00-11.00，反应5min，调整pH值为8.60，按多糖蛋白质量比1:1加入载体蛋白TT，维持pH值8.6反应120分钟以上，甘氨酸终止反应，超滤后获得多糖结合物。结合物经Sepharose4FF层析纯化，收集V₀附近洗脱峰，获得肺炎球菌24F结合物。用类似条件和方法也可制备和获得肺炎球菌35B结合物。

10.权利要求1所述的结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

取肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19F、19A、23F、24F和35B的肺炎球菌结合物，根据以上各型结合物原液的多糖含量，精确计算至终浓度4μg/ml所需结合物原液量，

在配制容器加入生理盐水，在150rpm连续搅拌下，按计算的结合物原液量，依次缓慢滴加各型结合物原液，维持pH6.0，各型结合物原液滴加完成后，继续搅拌10分钟以上，滴加磷酸铝佐剂至铝离子含量0.4mg/ml，补充生理盐水至终体积，调整pH值至5.8，继续搅拌1小时以上，静置，即得。