JP7488938B2 - ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖-タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法 - Google Patents
ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖-タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、異なる多糖-タンパク質コンジュゲートを含有する多価免疫原性組成物を提
供する。各コンジュゲートは、担体タンパク質、好ましくはCRM197にコンジュゲー
ト化(conjugate)された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ(
Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)から製造された莢膜
多糖からなる。該免疫原性組成物は肺炎球菌疾患に対して広範な有効範囲をもたらす。
書に組み入れることとする)を含む。2019年12月3日付で作成された前記ASCI
Iコピーは24683WOPCT-SEQTXT-03DEC2019と称され、6キロ
バイトのサイズを有する。
ae)はグラム陽性菌であり、乳幼児における侵襲性細菌性疾患(例えば、肺炎、細菌血
症、髄膜炎および中耳炎)の最も一般的な原因である。肺炎球菌は、血清型特異性をもた
らす化学結合多糖で被包されている。肺炎球菌には90個を超える公知血清型が存在し、
莢膜は肺炎球菌の主要な病原性決定因子である。なぜなら、莢膜は細菌の内表面を補体か
ら保護するだけでなく、それ自体は低免疫原性であるからである。多糖はT細胞非依存的
抗原であり、ほとんどの場合、T細胞と相互作用するようにプロセシングされたりMHC
分子上に提示されたりすることはない。しかし、それは、B細胞上の表面受容体の架橋を
含む代替メカニズムによって免疫系を刺激しうる。
における肺炎球菌疾患の予防に有用であることが判明している。しかし、乳幼児は非コン
ジュゲート化肺炎球菌多糖に対する応答が不十分である。乳幼児において侵襲性肺炎球菌
疾患を当時引き起こしていた最も頻繁に分離された7つの血清型(4、6B、9V、14
、18C、19Fおよび23F)を含有する肺炎球菌コンジュゲートワクチンPrevn
ar(登録商標)が2000年2月に米国で最初に認可された。Prevnar(登録商
標)が米国で広く使用された後、小児における侵襲性肺炎球菌疾患は、Prevnar(
登録商標)中に存在する血清型によって、有意に減少している。Centers for
Disease Control and Prevention,MMWR Mor
b Mortal Wkly Rep 2005,54(36):893-7を参照され
たい。しかし、世界の或る地域においてはPrevnar(登録商標)による血清型の有
効範囲が限定され、米国においては、ある新興血清型(例えば、19Aなど)の、幾つか
の証拠が存在する。O’Brienら,2004,Am J Epidemiol 15
9:634-44;Whitneyら,2003,N Engl J Med 348:
1737-46;Kyawら,2006,N Engl J Med 354:1455
-63;Hicksら,2007,J Infect Dis 196:1346-54
;Traoreら,2009,Clin Infect Dis 48:S181-S1
89を参照されたい。
、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fを含む13価肺炎球菌
多糖-タンパク質コンジュゲートワクチンを記載している。中国特許出願公開番号CN1
01590224Aは、血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、
18C、19A、19Fおよび23Fを含む14価肺炎球菌多糖-タンパク質コンジュゲ
ートワクチンを記載している。
しているが(米国特許公開番号2011/0195086)、幾つかの血清型において免
疫干渉が観察されており(例えば、GSKのPCV-11における血清型3に関する、よ
り低い防御)、ファイザー(Pfizer)のPCV-13[PREVNAR(登録商標
)13]においては、血清型6Bに対する、より低い応答率が観察されている。Prym
ulaら,2006,Lancet 367:740-48およびKieningerら
,Safety and Immunologic Non-inferiority
of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vacc
ine Compared to 7-valent Pneumococcal Co
njugate Vaccine Given as a 4-Dose Series
in Healthy Infants and Toddlers(48th An
nual ICAAC/ISDA 46th Annual Meeting,Wash
ington DC,2008年10月25~28日において発表)を参照されたい。
発生率を低下させるのに有効である。しかし、現在利用可能なワクチンに存在しない血清
型を発現する肺炎球菌の保有率が増加してきている。したがって、現在利用可能なワクチ
ンに存在しない肺炎球菌血清型に対する防御をもたらしうる追加的な肺炎球菌ワクチン組
成物が必要とされている。
本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ(S.pneumoniae)(肺炎球
菌)多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジ
ュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・
ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、以下のものか
らなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む:
a)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、D
eOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fお
よび35B;
b)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B
;
c)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A
、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33
Fおよび35B;
d)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A
、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5B;
e)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B
、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
f)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24
F、33Fおよび35B;
g)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F
および35B;
h)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F
および35B;
i)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5B;
j)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
k)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
l)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
m)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
n)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
o)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
p)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
q)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
r)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
s)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
t)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
u)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
v)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
w)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
x)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
y)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
z)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;ならびに
aa)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、1
5A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよ
び35B。
提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化され
たストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F
、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、
33Fおよび35Bから製造される。
提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化され
たストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュ
ゲートは、1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、
15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35
Bからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む
。
提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化され
たストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、1
2F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24
F、33Fおよび35Bから製造される。
ゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体
タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢
膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートは、肺炎球菌のストレプ
トコッカス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A
、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、
24F、33Fおよび35B由来の多糖を含み、担体タンパク質はCRM197である。
提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化され
たストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、1
1A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23
F、24F、33Fおよび35Bから製造される。
ゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体
タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢
膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートはそれぞれストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、1
1A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23
F、24F、33Fおよび35B由来の多糖を含み、キャリアタンパク質はCRM197
である。
提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化され
たストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖を含み、多糖はストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、1
1A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23
F、24F、33Fおよび35Bから製造される。
ゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体
タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢
膜多糖を含み、それぞれの異なる多糖タンパク質コンジュゲートはそれぞれストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、1
1A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23
F、24F、33Fおよび35B由来の多糖を含み、担体タンパク質はCRM197であ
る。
物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化
されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コン
ジュゲートは、1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F
、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、
33Fおよび35Bからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型
、更に7C、9N、16F、21、23A、31、34、35Fおよび38から選択され
る1、2、3、4、5、6、7、8または9個の追加的なストレプトコッカス・ニューモ
ニエ血清型を含む群の多糖を含む。
物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化
されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コン
ジュゲートは、1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F
、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、
33Fおよび35Bからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型
、更に7C、9N、16F、23A、35Fおよび38から選択される1、2、3、4、
5または6個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ血清型を含む群の多糖を含む
。
物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化
されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コン
ジュゲートは、1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F
、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、
33Fおよび35Bからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型
、更に7C、9N、16F、21、23A、31、34、35Fおよび38から選択され
る1、2、3、4、5、6、7、8または9個の追加的なストレプトコッカス・ニューモ
ニエ血清型の群の多糖を含む。
物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化
されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コン
ジュゲートは、1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F
、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、
33Fおよび35Bからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型
、更に7C、9N、16F、23A、35Fおよび38から選択される1、2、3、4、
5または6個の追加的なストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む。
プロトン性溶媒、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)を含むコンジュゲート化反応
により形成される。特定の実施形態においては、多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞ
れは、非プロトン性溶媒、例えば(DMSO)を含むコンジュゲート化反応により形成さ
れる。 本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与することを含む、ヒト患者において防
御免疫応答を誘導するための方法も提供する。本発明の方法の幾つかの実施形態において
は、患者は以前に多価肺炎球菌ワクチンで治療されていた。
一部として使用されうる。したがって、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物を患者に
投与すること、そして更に、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与することを、任意の順序
で含む、ヒト患者において防御免疫応答を誘導する方法を提供する。特定の実施形態にお
いては、多価肺炎球菌ワクチンは複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク
質コンジュゲートから構成され、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質
にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む。
他の実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは非コンジュゲート化莢膜多糖から構成
されている。 本発明はまた、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジ
ュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担
体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の
多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの選択された血清型は、他の選択された
血清型に対して交差反応性をもたらす。
本発明は、肺炎球菌多糖-タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供
し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたス
トレプトコッカス・ニューモニエ(S.pneumoniae)血清型由来の多糖を含み
、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は本明細書中に定義されているとおりであ
る。
パク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそ
れぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ
血清型由来の多糖を含み、多糖タンパク質コンジュゲートは、以下のものからなる群から
選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む:
a)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、D
eOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fお
よび35B;
b)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B
;
c)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A
、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33
Fおよび35B;
d)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A
、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5B;
e)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B
、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
f)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24
F、33Fおよび35B;
g)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F
および35B;
h)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F
および35B;
i)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5B;
j)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
k)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
l)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
m)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
n)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
o)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
p)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
q)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
r)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
s)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
t)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
u)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
v)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
w)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
x)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
y)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
z)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
aa)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、1
5A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよ
び35B;
bb)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、DeOA
c15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B
および39;
cc)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39
;
dd)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、De
OAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、3
5Bおよび39;
ee)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび
39;
ff)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18
C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
gg)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、3
3F、35Bおよび39;
hh)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35
Bおよび39;
ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35
Bおよび39;
jj)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび
39;
kk)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
ll)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
mm)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
nn)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
oo)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
pp)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
qq)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
rr)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
ss)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
tt)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
uu)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
vv)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
ww)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
xx)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
yy)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
zz)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
aaa)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、
15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bお
よび39;ならびに
bbb)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、
15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bお
よび39。
B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、2
2F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;またはii)1、3、4、5、6
A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、
19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;またはiii)1、3
、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
またはiv)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、
14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、3
3Fおよび35Bからなる群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型を
含む。特定の実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成物は複数の肺炎球菌ストレ
プトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲ
ートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニュ
ーモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型
:i)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
またはii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、1
5A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよ
び35B;またはiii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11
A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F
、24F、33Fおよび35Bを含む。該組成物はマウス、ウサギおよび/またはサルに
おいて免疫原性であり、試験された全ての用量においてワクチン型細菌株を殺滅する機能
的抗体を生成することが判明した。
に対して患者を免疫化するのに、および/または異なる補足的肺炎球菌ワクチンによる治
療レジメンの一部として有用である。したがって、本発明は、本発明の多価免疫原性組成
物を患者に投与すること、そして更に、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与することを、
任意の順序で含む、ヒト患者において防御免疫応答を誘導する方法を提供する。他の実施
形態においては、本発明の多価免疫原性組成物は、異なる多価肺炎球菌ワクチンで以前に
免疫化された患者に投与される。
ートを、非プロトン性溶媒、例えばDMSO中での還元的アミノ化を用いて製造する。他
の実施形態においては、多価免疫原性組成物は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化
を用いてそれぞれが製造される肺炎球菌コンジュゲートを含む。DMSO溶媒の使用は、
担体タンパク質の表面上のリジン残基の直接消費により、タンパク質への多糖の共有結合
を増強する。共有結合の増強は、DMSO中でコンジュゲート化された多糖抗原を含む多
価免疫原性組成物の多糖タンパク質コンジュゲートの安定性の増強に直接的利益をもたら
す。
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体において、以下の略語が適用される。
APC 抗原提示細胞
CI 信頼区間
DMSO ジメチルスルホキシド
DS 多糖-タンパク質薬物
GMC 幾何平均濃度
GMT 幾何平均力価
HPSEC 高速サイズ排除クロマトグラフィー
IM 筋肉内または筋内
IRM 乳仔アカゲザル
LOS リポオリゴ糖
LPS リポ多糖
MALS 多角度光散乱
MBC 一価バルクコンジュゲート
Mn 数平均分子量
MOPA 多重オプソニン作用アッセイ
MW 分子量
NMWCO 公称分子量カットオフ
NZWR ニュージーランド白(New Zealand White)ウサギ
OPA オプソニン作用アッセイ
PCV 肺炎球菌コンジュゲートワクチン
PD1 投与後1
PD2 投与後2
PD3 投与後3
PnPs 肺炎球菌多糖
Ps 多糖
PS-20 ポリソルベート-20
RI 屈折率
UV 紫外線
w/v 重量/体積
本発明がより容易に理解されうるように、幾つかの科学技術用語を以下に具体的に定義
する。本明細書中の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書中で用いる他の全て
の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有する。
かに矛盾しない限り、その複数対象物を含む。
き、可能性の一方または両方を示す。幾つかの場合においては、一方または両方の可能性
を強調するために「および/または」を用いた。
は「水性条件」なる語は、コンジュゲート化反応のための溶媒としての水の使用を指す。
水はバッファーおよび他の成分を含みうるが、ただし、有機溶媒は存在しない。
媒」、「DMSO溶媒」または「DMSO条件」なる語は、コンジュゲート化反応用の溶
媒としての非プロトン性溶媒または複数の非プロトン性溶媒(または適用可能な場合には
DMSO)の組合せの使用を指す。非プロトン性溶媒は、幾らかの水、例えば最大1%、
2%、5%、10%または20%の水を含有しうる。
よび賦形剤のような任意の他の成分の包含、または具体的に挙げられていない1以上の多
糖-タンパク質コンジュゲートの添加を意味する。多価多糖-タンパク質コンジュゲート
混合物に関して用いられた場合の「からなる」なる語は、それらの特定のストレプトコッ
カス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含有し、異なる血清型に由来する他
のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含有しない混合物
を指す。「から実質的になる」およびその派生語、例えば「から実質的になり」または「
から実質的になって」は、列挙されている任意の要素または要素群の包含、および列挙要
素と類似した又は異なる性質の他の要素であって、特定されている投与レジメン、方法ま
たは組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない要素の随意的包含(すなわち
、包含されていても包含されていなくてもよい)を示す。
カス・ニューモニエの感染性の可能性または重症度を有意に低下させる抗体を誘導するの
に必要な用量を意味する。
、肺炎球菌肺炎、肺炎球菌髄膜炎、肺炎球菌性菌血症、ストレプトコッカス・ニューモニ
エにより引き起こされる侵襲性疾患およびストレプトコッカス・ニューモニエにより引き
起こされる中耳炎(これらに限定されるものではない)を含むストレプトコッカス・ニュ
ーモニエの任意の血清型により引き起こされる1以上の疾患の予防に関して、ワクチンま
たは免疫原性組成物が米国食品医薬品局(US Food and Drug Admi
nistration)のような1以上の規制当局により承認されることを意味する。
り引き起こされる疾患または病態に対する能動免疫をもたらす複数の活性物質(例えば、
肺炎球菌莢膜多糖または肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲート)を含む医薬製剤である
。
LOS)」、「リポ多糖(LPS)」、「グリコシラート」、「複合糖質」など(これら
に限定されるものではない)を含む、免疫学および細菌ワクチン技術で一般に使用される
任意の抗原性糖要素(または抗原単位)を含むと意図される。
juvanted)」なる語は、PCV8、PCV15、PCV22、PCV23および
PCV24(これらに限定されるものではない)を含む肺炎球菌多糖組成物であって、ア
ジュバントを含有しない組成物を意味する。
0A、-12F、-15A、-15C、-23B、-24Fおよび-35Bを含有する免
疫原性組成物を意味する。
3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-14、-18C、-19A、-1
9F、-22F、-23Fおよび-33Fを含有する免疫原性組成物を意味する。
3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-10A、-12F、-14、-1
5A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-2
4F、-33Fおよび-35Bを含有する免疫原性組成物を意味する。
3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-12F、-14
、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F
、-24F、-33Fおよび-35Bを含有する免疫原性組成物を意味する。
3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、-12
F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B
、-23F、-24F、-33Fおよび-35Bを含有する免疫組成物を意味する。
クレオチド」および同様の用語は、非メチル化CpG部分を含有する6~50ヌクレオチ
ド長のヌクレオチド分子を意味する。例えば、Wangら,2003,Vaccine
21:4297を参照されたい。CpG含有オリゴヌクレオチドには、任意の合成ヌクレ
オシド間結合、修飾塩基および/または修飾糖を用いた修飾オリゴヌクレオチドが含まれ
る。
強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与された場合に弱免疫原性
である(例えば、抗体価または細胞性免疫応答を全く又は弱くしか誘導しない)抗原に対
する免疫応答を増強し、抗原に対する抗体価を増加させ、および/または個体における免
疫応答を達成するのに有効な抗原の用量を減少させうる。したがって、アジュバントは、
免疫応答を増強するためにしばしば投与され、当業者によく知られている。
カス・ニューモニエに感染しうる哺乳動物を意味する。好ましい実施形態においては、患
者はヒトである。患者は予防的または治療的に治療されうる。予防的治療は、肺炎球菌疾
患またはその影響、例えば肺炎球菌肺炎の可能性または重症度を低下させるのに十分な防
御免疫をもたらす。ストレプトコッカス・ニューモニエ感染またはその臨床効果の重症度
を低減し、または再発を予防するために、治療的治療が行われうる。予防的治療は、本明
細書に記載されているとおり、本発明の多価免疫原性組成物を使用して行われうる。本発
明の組成物は、一般集団、または肺炎球菌感染の高リスク者、例えば高齢者または高齢者
と同居している若しくは高齢者の世話をしている者に投与されうる。
した者、以前にストレプトコッカス・ニューモニエに対してワクチン接種された者、易感
染者、または感染可能性の低減が望ましい任意の者、例えば免疫不全者、高齢者、小児、
成人または健常個体が含まれる。
も少なくとも1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、12ヶ月間および/または24
カ月間、有意な変化が観察されない組成物である。また、「安定」組成物は、25℃およ
び37℃を含む温度で、1ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、12ヶ月間および/または24
ヶ月間を含む期間にわたって所望の特徴を示すものを含む。安定性に関する典型的な許容
基準は以下のとおりである:以下のうちの1以上において約5%、約10%、約15%ま
たは約20%以下の変動:(a)組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖
タンパク質コンジュゲートの数平均分子量(Mn)、(b)組成物におけるストレプトコ
ッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの重量平均分子量(Mw)、(c)
組成物における総多糖濃度、(d)特定の励起波長、例えば280ナノメートルで固有タ
ンパク質蛍光分光法を用いて測定された、組成物における最大発光、および(e)特定の
励起波長で固有タンパク質蛍光分光法を用いて測定された、組成物における蛍光強度。「
安定」なる語は、多価免疫原性組成物内の個々の肺炎球菌コンジュゲートに関しても用い
られうる。そのような使用において、この用語は、特定の温度において経時的に所望の特
性を示すコンジュゲートを指し、そのような特性は、示されている時間にわたって及び示
されている温度において約5%、約10%、約15%または約20%以下しか変動しない
。
本発明は、複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを
含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク
質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む
。本発明の多価免疫原性組成物の種々の態様および実施形態を以下に記載する。
ート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖をそれぞれが含む
複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫
原性組成物を提供し、ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は、i)1、
3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B、またはii
)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B、
またはiii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F
、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、
33Fおよび35Bを含み、またはそれらからなり、またはそれらから実質的になる。実
施形態E1の下位実施形態においては、免疫原性組成物は他のストレプトコッカス・ニュ
ーモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含まない。
は血清型15C肺炎球菌多糖と実質的に同等であり、実質的に同一のNMRスペクトルを
有する(データ非表示)。本明細書中で用いる脱O-アセチル化血清型15B肺炎球菌多
糖および血清型15C肺炎球菌多糖はそれぞれ、反復単位当たり0~5%の範囲または0
~4%の範囲または0~3%の範囲または0~2%の範囲または0~1%の範囲または0
~0.5%の範囲または0~0.1%の範囲または0%のO-アセチル含有量を有する。
Spencer B.L.らの報告によると、肺炎球菌多糖15Cは僅かにO-アセチル
化されている可能性がある(Spencer,B.L.ら,Clin.Vac.Immu
no.(2017)24(8):1-13)。したがって、本明細書における多価免疫原
性組成物の実施形態のいずれにおいても、血清型15Cの代わりに脱Oアセチル化血清型
15B(DeOAc15B)が使用されうる。脱O-アセチル化方法は、例えば、Raj
amら,Clinical and Vaccine Immunology,2007
,14(9):1223-1227に記載されているとおり、当技術分野で公知である。
ずれかの特定の実施形態においては、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。
1つの実施形態においては、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパ
ク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれ
ぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型6Cを含むストレプトコッカ
ス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血
清型6Cはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型6Aおよび6Bに対する交差反応
性をもたらす。
ク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれ
ぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型6Aを含むストレプトコッカ
ス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血
清型6Aはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型6Bおよび/または6Cに対する
交差防御をもたらす。
ク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれ
ぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型6Bを含むストレプトコッカ
ス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血
清型6Bはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型6Aおよび/または6Cに対する
交差防御をもたらす。
ク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれ
ぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型15Cを含むストレプトコッ
カス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの
血清型15Cはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型15Bに対する交差防御をも
たらす。
ク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートのそれ
ぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清型15Bを含むストレプトコッ
カス・ニューモニエ血清型に由来する多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの
血清型15Bはストレプトコッカス・ニューモニエの血清型15Cに対する交差防御をも
たらす。
本発明の特定の実施形態においては、担体タンパク質としてCRM197を使用する。
CRM197は、以下のアミノ酸配列を有するジフテリア毒素の無毒性変異体(すなわち
、トキソイド)である:
内で増殖したコリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium di
phtheria)株C7(β197)の培養物から単離される。もう1つの実施形態に
おいては、CRM197は、米国特許第5,614,382号に記載されている方法に従
い組換え的に製造される。典型的には、CRM197は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈
殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せにより精製される。幾つかの実施形態に
おいては、CRM197は、Pfenex Expression Technolog
y(商標)(Pfenex Inc.,San Diego,CA)を使用して、シュー
ドモナス・フルオレセンス(シュードモナス・フルオレッセンス)において製造される。
ジフテリアトキソイド)またはDTの断片B(DTFB)、TT(破傷風トキソイド)ま
たはTTの断片C、百日咳トキソイド、コレラトキソイド(例えば、WO 2004/0
83251に記載されているもの)、大腸菌(E.coli)LT、大腸菌(E.col
i)ST、およびシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aerug
inosa)由来の外毒素Aが含まれる。細菌外膜タンパク質、例えば外膜タンパク質複
合体(OMPC)、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク
質A(PspA;WO 02/091998を参照されたい)、肺炎球菌アドヘシンタン
パク質(PsaA)、群Aもしくは群Bストレプトコッカス由来のC5aペプチダーゼ、
またはヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae
)プロテインD、肺炎球菌ニューモリシン(Kuoら,1995,Infect Imm
un 63;2706-13)、例えば何らかの様態で解毒されたply、例えばdPL
Y-GMBS(WO 04/081515を参照されたい)もしくはdPLY-フォルモ
ール(formol)、PhtX、例えばPhtA、PhtB、PhtD、PhtEおよ
びPhtタンパク質の融合物、例えばPhtDE融合物、PhtBE融合物(WO 01
/98334およびWO 03/54007を参照されたい)も使用されうる。他のタン
パク質、例えばオボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血
清アルブミン(BSA)またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)、Por
B(N.meningitidis由来)、PD(Haemophilus influ
enzaeプロテインD;例えばEP 0 594 610 Bを参照されたい)、また
はその免疫学的に機能的な同等物、合成ペプチド(EP0378881およびEP042
7347を参照されたい)、熱ショックタンパク質(WO 93/17712およびWO
94/03208を参照されたい)、百日咳タンパク質(WO 98/58668および
EP0471177を参照されたい)、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホ
ルモン(WO 91/01146を参照されたい)、種々の病原体由来抗原からの複数の
ヒトCD4+ T細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugiら,2001,E
ur J Immunol 31:3816-3824を参照されたい)、例えばN19
タンパク質(Baraldoiら,2004,Infect Immun 72:488
4-7を参照されたい)、鉄取り込みタンパク質(WO 01/72337を参照された
い)、クロストリジウム・ディフィシレ(C.difficile)の毒素AまたはB(
WO 00/61761を参照されたい)、およびフラゲリン(Ben-Yedidia
ら,1998,Immunol Lett 64:9を参照されたい)も担体タンパク質
として使用されうる。
ら,1973,J Biol Chem 218:3838-3844);CRM9、C
RM45、CRM102、CRM103およびCRM107、ならびにNicholls
およびYoule,Genetically Engineered Toxins,F
rankel編,Maecel Dekker Inc,1992に記載されている他の
突然変異を有するもの;Glu-148の欠失またはそれからAsp、GlnまたはSe
rへの突然変異および/またはAla 158からGlyへの突然変異およびU.S.4
,709,017またはU.S.4,950,740に開示されている他の突然変異を有
するもの;Lys 516、Lys 526、Phe 530および/またはLys 5
34の少なくとも1以上の残基の突然変異およびU.S.5,917,017号または米
国特許第6,455,6735号に開示されている他の突然変異を有するもの;またはU
.S.5,843,711に開示されている断片も、担体タンパク質として使用されうる
。そのようなDT突然変異体は、エピトープ領域を含有するB断片を含むDTFB変異体
を製造するためにも使用されうる。
破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、プロテインD(タンパク質D)およびCRM
197からなる群から選択される。
ュゲートの1以上に、第2担体が使用されうる。第2担体タンパク質は、好ましくは、無
毒性かつ無反応性であり、十分な量および純度で入手可能なタンパク質である。第2担体
タンパク質も、抗原の免疫原性を増強するために高ストレプトコッカス・ニューモニエ多
糖にコンジュゲート化または結合される。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲート化
法に適合しているべきである。1つの実施形態においては、第1担体タンパク質にコンジ
ュゲート化されていない各莢膜多糖は、同じ第2担体タンパク質にコンジュゲート化され
ている(例えば、各莢膜多糖分子は、単一の担体タンパク質にコンジュゲート化されてい
る)。もう1つの実施形態においては、第1担体タンパク質にコンジュゲート化されてい
ない莢膜多糖は2以上の担体タンパク質にコンジュゲート化されている(各莢膜多糖分子
は、単一の担体タンパク質にコンジュゲート化されている)。そのような実施形態におい
ては、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には、同じ担体タンパク質にコンジュゲート化
されている。
血清型の1以上(適用可能な場合には、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、2
5、26、27、28、29、30個以上を含む)がCRM197にコンジュゲート化さ
れている。実施形態E1およびその任意の下位実施形態を含む本発明の他の実施形態にお
いては、多糖血清型のそれぞれがCRM197にコンジュゲート化されている。
ている方法を使用して達成されうる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組成物
を製造するために生理的に許容されるビヒクルを使用して製剤化されうる。そのようなビ
ヒクルの例には、水、緩衝生理食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレン
グリコール、液体ポリエチレングリコール)およびデキストロース溶液が含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。
チジンバッファー中で製剤化される。
アジュバントにコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の
莢膜多糖を含む複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲート
を含み、ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型は本明細書に記載されている
とおりである。組成物の有効性を増強するための適切なアジュバントには、以下のものが
含まれるが、それらに限定されるものではない:
(1)アルミニウム塩(ミョウバン)、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニ
ウム、硫酸アルミニウムなど;
(2)水中油型エマルジョン製剤[他の特定の免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド
(後記に定義されている)または細菌細胞壁成分を含有する又は含有しない]、例えば、
(a)モデル110Yマイクロフルイダイザー(Microfluidics,Newt
on,MA)のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子内に製剤化さ
れた、5% スクアレン、0.5% Tween(トゥイーン)80および0.5% S
pan(スパン)85(所望により、種々の量のMTP-PEを含有していてもよい)を
含有するMF59(国際特許出願公開番号WO 90/14837)、(b)サブミクロ
ンエマルジョンへとマイクロフルイダイズされた、またはより大きな粒子サイズのエマル
ジョンを生成させるためにボルテックスされた、10% スクアレン、0.4% Twe
en 80、5% プルロニックブロック化ポリマーL121およびthr-MDPを含
有するSAF、(c)Ribi(商標)アジュバント系(RAS)(Corixa,Ha
milton,MT)であって、以下のものを含有するもの:2% スクアレン、0.2
% Tween80、および以下のものからなる群からの1以上の細菌細胞壁成分:米国
特許第4,912,0945号に記載されている3-O-脱アシル化モノリン脂質A(M
PL(商標))、トレハロースジミコラート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)、好
ましくはMPL+CWS(Detox(商標))、ならびに(d)モンタニド(Mont
anide)ISA;
(3)サポニンアジュバント、例えばQuil(クイル)AまたはSTIMULON
(商標)QS-21(Antigenics,Framingham,MA)(例えば、
米国特許第5,057,540号を参照されたい)、またはそれから生成された粒子、例
えばISCOM(コレステロール、サポニン、リン脂質および両親媒性タンパク質の組合
せから形成される免疫刺激複合体)およびIscomatrix(登録商標)(タンパク
質を含有しないこと以外はISCOMと実質的に同じ構造を有する)が使用されうる;
(4)細菌性リポ多糖、合成リピドA類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホ
スファート化合物(AGP)またはその誘導体もしくは類似体(これらはCorixaか
ら入手可能であり、米国特許第6,113,918号に記載されている;1つのそのよう
なAGPは2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]エチル
2-デオキシ-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテ
トラデカノイル]-2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ
]-β-D-グルコピラノシド[これは529(以前はRC529として公知であった)
としても公知であり、水性形態または安定エマルジョンとして製剤化される]である;
(5)合成ポリヌクレオチド、例えば、CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチ
ド(米国特許第6,207,646号);
(6)サイトカイン、例えばインターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL
-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18など)、イ
ンターフェロン(例えば、ガンマインターフェロン)、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因
子(TNF)、共刺激分子B7-1およびB7-2など;ならびに
(7)補体、例えば、補体成分C3dの三量体。
はそれ以上の混合物、例えば、SBAS2(3-脱アシル化モノホスホリルリピドAおよ
びQS21をも含有する水中油型エマルジョン)である。
(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニン-2-(1’、2’ジ
パルミトイル-sn-グリセロ)-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(
MTP-PE)などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
ジュバントはミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンでありうる。アルミ
ニウム塩アジュバントは当技術分野で周知であり、例えば、Harlow,E.およびD
.Lane(1988;Antibodies:A Laboratory Manua
l Cold Spring Harbor Laboratory)ならびにNick
las,W.(1992;Aluminum salts.Research in I
mmunology 143:489-493)に記載されている。アルミニウム塩には
、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物(ATH)、アルミニウム水和物、
アルミニウム三水和物、アルヒドロゲル(Alhydrogel)、スーパーホス(Su
perfos)、アンホゲル(Amphogel)、水酸化アルミニウム(III)、ヒ
ドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩、リン酸アルミニウムアジュバント(APA)、アモ
ルファスアルミナ、三水和アルミナまたはトリヒドロキシアルミニウムが含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。
ウムとリン酸ナトリウムとを1:1の体積比で混合してヒドロキシリン酸アルミニウムを
沈殿させることにより製造される。混合プロセスの後、物質を高せん断ミキサーでサイズ
減少させて、単分散粒子サイズ分布を得る。ついで、生成物を生理食塩水に対してダイア
フィルトレーションし、蒸気滅菌する。1つの実施形態においては、アルミニウム塩の用
量は10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、3
00、500または700μg、あるいは1、1.2、1.5、2、3、5mgまたはそ
れ以上である。更にもう1つの実施形態においては、前記のミョウバン塩の用量は組換え
タンパク質1μg当たりである。
μgの比でタンパク質を吸着させるために、商業的に入手可能なAl(OH)3[例えば
、Denmark/Accurate Chemical and Scientifi
c Co.,Westbury,NYのアルヒドロゲル(Alhydrogel)または
スーパーホス(Superfos)]を使用する。もう1つの実施形態においては、タン
パク質の吸着はタンパク質のpI(等電点pH)および培地のpHに左右される。より低
いpIを有するタンパク質は、より高いpIを有するタンパク質より強く、正荷電アルミ
ニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は、2~3週間にわたってゆっくりと放出さ
れる抗原のデポを形成し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、
ならびに/または自然免疫機構を刺激しうる(これは、おそらく、尿酸の刺激によるもの
であろう)。例えば、Lambrechtら,2009,Curr Opin Immu
nol 21:23を参照されたい。
8μg/mLに希釈されうる)を除く全ての血清型に関して目標濃度4μg/mLに希釈
する。希釈したら、バッチを濾過滅菌し、等体積のリン酸アルミニウムアジュバントを無
菌的に添加して、250μg/mLの最終アルミニウム濃度を目標にする。アジュバント
化され製剤化されたバッチを、使い捨ての0.5mL/用量バイアル内に充填する。
G含有オリゴヌクレオチド、特にCpG含有オリゴデオキシヌクレオチド(CpG OD
N)である。もう1つの実施形態においては、アジュバントはODN 1826であり、
これはColey Pharmaceutical Gorpから入手可能である。
1999,J Immunol.162:6284-93;Verthelyi,200
6,Methods Mol Med.127:139-58;およびYasudaら,
2006,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:
89-110に記載されている。
はその任意の下位実施形態において記載されている複数のストレプトコッカス・ニューモ
ニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、アジュバントを含まない。
本発明の多価免疫原性組成物は単回投与用バイアル、複数回投与用バイアルまたは予充
填ガラスもしくはプラスチックシリンジとして製剤化されうる。
って、経口投与に適した形態で、すなわち、固体または液体製剤として製剤化される。固
体経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが含まれる。液体経
口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液(エマルジョン)、油などが含まれる。
は油である。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール
、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。水性担体には
、水、アルコール性/水性の溶液、乳濁液または懸濁液(生理食塩水および緩衝媒体を含
む)が含まれる。油の例としては、動物、植物または合成由来のものが挙げられ、例えば
ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、他の魚油、またはミルクも
しくは卵由来の脂質が挙げられる。
または注射用の組成物は投与時に実質的に等張性であることがしばしば好ましい。したが
って、貯蔵用には、組成物は、好ましくは、等張性または高張性でありうる。組成物が貯
蔵用に高張性である場合、それは投与前に等張液となるように希釈されうる。
物ありうる。イオン性等張化剤の例には、NaCl、CaCl2、KClおよびMgCl
2が含まれるが、これらに限定されるものではない。非イオン性等張化剤の例には、マン
ニトール、ソルビトールおよびグリセロールが含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。
かの目的のにおいては、例えば、医薬組成物が注入または注射を意図したものである場合
、該組成物は、4~10の範囲のpH、例えば5~9のpH、例えば6~8のpHに溶液
を緩衝化しうるバッファーを含むことがしばしば望ましい。
ト、タルトラート、ホスファート、シトラート、カルボナート、グリシナート、ヒスチジ
ン、グリシン、スクシナートおよびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択
されうる。
ーから選択されうる。例えば、バッファーは、一塩基酸、例えば酢酸、安息香酸、グルコ
ン酸、グリセリン酸および乳酸;二塩基酸、例えばアコニット酸、アジピン酸、アスコル
ビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸;多塩基酸、例えばクエ
ン酸およびリン酸;ならびに塩基、例えばアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、
トリエタノールアミンおよびTRISからなる群から選択されうる。
液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液
および不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充剤、電解質補充
剤、例えば、リンゲルデキストロースに基づくものなどが含まれる。例示としては、界面
活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加の存在下または非存在下の例え
ば水および油のような無菌液が挙げられる。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロー
スおよび関連糖溶液、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリ
コール、ポリソルベート80(PS-80)、ポリソルベート20(PS-20)および
ポロキサマー188(P188)が、特に注射可能溶液の場合に、好ましい液体担体であ
る。油の例としては、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油
、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、他の魚油、またはミルクもしくは卵由来の脂質が挙
げられる。
が、それらに限定されるものではない:ポロキサマー-188(P188;プルロニック
;F68 NF)、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(一般にTwee
n(トゥイーン)と称される)、特にPS-20およびPS-80;DOWFAX(商標
)の商品名で販売されているエチレンオキシド(EO)、プロピレンオキシド(PO)お
よび/またはブチレンオキシド(BO)のコポリマー、例えば直鎖状EO/POブロック
コポリマー;オクトキシノール[これは、反復エトキシ(オキシ-1,2-エタンジイル
)基の数において様々でありうるが、オクトキシノール-9(Triton X-100
またはt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)に特に関心が持たれる];(オ
クチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール(IGEPAL CA-630/NP-40
);リン脂質、例えばホスファチジルコリン(レシチン);ノニルフェノールエトキシラ
ート、例えばTergitol(商標)NPシリーズ;ラウリル、セチル、ステアリルお
よびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル(Brij界面
活性剤として公知である)、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル(Br
ij 30);ならびにソルビタンエステル(一般にSPANとして公知である)、例え
ばソルビタントリオレアート(スパン85)およびソルビタンモノラウラート。エマルジ
ョン中に配合するための好ましい界面活性剤はPS-80である。
シエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート(
PS-80)と、オクトキシノール、例えばt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノ
ール(トリトンX-100)との組合せも好適である。もう1つの有用な組合せは、ラウ
レス9に加えて、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノー
ルを含む。
.1%のポリオキシエチレンソルビタンエステル(例えば、PS-80);0.001~
0.1%、特に0.005~0.02%のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエ
タノール(例えば、Triton X-100またはTritonシリーズにおける他の
界面活性剤);0.1~20%、好ましくは0.1~10%、特に0.1~1%または約
0.5%のポリオキシエチレンエーテル(例えば、ラウレス9)。
ムアジュバント)の存在下、ヒスチジン(20mM)、生理食塩水(150mM)および
0.2% PS-20(pH5.8)から実質的になる。PS-20は0.005%~0
.3%(w/v)の範囲でありうる。もう1つの実施形態においては、PS-20は0.
025%~0.8%(w/v)の範囲でありうる。もう1つの実施形態においては、PS
-20は0.05%~0.8%(w/v)の範囲でありうる。もう1つの実施形態におい
ては、PS-20は0.05%~0.2%(w/v)の範囲でありうる。該方法は、ヒス
チジン、生理食塩水およびPS-20中で最大24個の血清型の混合物(ブレンド)を一
緒にし、ついでこの混合物質を、抗微生物保存剤の存在下または非存在下、APAおよび
生理食塩水と一緒にすることからなる。
多糖タンパク質コンジュゲート、そして更に、20~80mM ヒスチジン(pH5.8
)および150mM NaClを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タン
パク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を
含み、多糖タンパク質コンジュゲートにおけるストレプトコッカス・ニューモニエの血清
型は、本明細書に記載されている血清型の組合せのいずれかを含む。幾つかの実施形態に
おいては、多価免疫原性組成物は0.2%~0.8% w/v ポリソルベート20を更
に含む。
で還元的アミノ化を用いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖(PnP)血清型-
1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、
-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-
23B、-23F、-24F、-33Fおよび-35BにCRM197タンパク質を個々
にコンジュゲート化することにより製造され、20mM L-ヒスチジン(pH5.8)
、150mM NaClおよび0.1% w/v ポリソルベート-20(PS-20)
中、各多糖血清型4μg/mLまたは8μg/mL(総多糖濃度はそれぞれ96μg/m
Lまたは192μg/mL)で製剤化され、「PCV24 unadj」と称される。も
う1つの特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物PCV24は、20mM L-
ヒスチジン(pH5.8)、150mM NaClおよび0.2% w/v ポリソルベ
ート-20(PS-20)中、更にリン酸アルミニウムアジュバントの形態の[Al]2
50μg/mLを含有させて、各多糖血清型4μg/mL(総多糖濃度は96μg/mL
)で製造される。これは「PCV24/APA」と称される。
。15個以上の血清型を含有する多価ワクチンの場合、PS-20およびP188が好ま
しい。コンジュゲートを製造するために用いられる化学法の選択も製剤の安定化において
重要な役割を果たしうる。特に、多価組成物中の種々の多糖タンパク質コンジュゲートを
製造するために用いられるコンジュゲート化反応が水性溶媒とDMSO溶媒との両方を含
む場合、個々の界面活性剤系は安定性における有意差をもたらす。多糖タンパク質コンジ
ュゲートの安定性の改善が、ポリソルベート20のみ、またはポロキサマー188とポリ
オールとの組合せで認められた。
十分には理解されておらず、事前に予測することができない。可能な安定化メカニズムに
は、優先的水和、優先的排除、生物療法物質と表面との間の気/液界面競合、表面張力、
および/または凝集のシード(seed)として働く疎水性パッチをマスクするための界
面活性剤と生物療法物質との直接的結合が含まれる。
チレン(ポリ(エチレンオキシド))の2つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン
(ポリ(プロピレンオキシド))の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロッ
クコポリマーである。ポロキサマーは商品名Pluronic(登録商標)としても公知
である。ポリマーブロックの長さはカスタマイズ可能であるため、わずかに異なる特性を
有する多数の異なるポロキサマーが存在する。一般的な用語「ポロキサマー」の場合、こ
れらのコポリマーは、一般に、文字「P」(ポロキサマーの場合)およびそれに続く3桁
の数字として命名され、ここで、最初の2桁の数字×100はポリオキシプロピレンコア
のおおよその分子量を示し、最後の桁の数字×10はポリオキシエチレン含有量の百分率
を示す(例えば、P407は4,000g/molのポリオキシプロピレン分子量および
70%のポリオキシエチレン含有量のポロキサマーである)。Pluronic(登録商
標)商品名の場合、これらの共重合体の記号は、室温でのその物理的形状を定める文字(
L=液体、P=ペースト、F=フレーク(固体))で始まり、2桁または3桁の数字が続
く。数字表示部分における最初の桁(3桁数字の場合には2桁)×300は該疎水性物質
のおおよその分子量を示し、最後の桁×10はポリオキシエチレン含有量の百分率を示す
(例えば、L61は、1,800g/molのポリオキシプロピレン分子量および10%
のポリオキシエチレン含有量を有するPluronic(登録商標)である)。米国特許
第3,740,421号を参照されたい。
15,000Daまたは7,500~10,000Daの範囲の分子量を有する。ポロキ
サマーはポロキサマー188またはポロキサマー407から選択されうる。製剤中のポロ
キサマーの最終濃度は0.001%~5%(重量/体積)または0.025%~1%(重
量/体積)である。特定の態様においては、ポリオールはプロピレングリコールであり、
最終濃度は1%~20%(重量/体積)である。特定の態様においては、ポリオールはポ
リエチレングリコール400であり、最終濃度は1%~20%(重量/体積)である。
ル、例えばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコー
ルモノメチルエーテル(これらに限定されるものではない)である。プロピレングリコー
ルは約425~約2,700の単量体分子量の範囲のものが入手可能である。ポリエチレ
ングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルは約200~約35,0
00の範囲の分子量範囲のもの、例えばPEG200、PEG300、PEG400、P
EG1000、PEG MME 550、PEG MME 600、PEG MME 2
000、PEG MME 3350およびPEG MME4000(これらに限定される
ものではない)が入手可能である。好ましいポリエチレングリコールはポリエチレングリ
コール400である。本発明の製剤におけるポリオールの最終濃度は1%~20%(重量
/体積)または6%~20%(重量/体積)でありうる。
グルタマート、ラクタート、マレアート、タルトラート、ホスファート、シトラート、カ
ルボナート、グリシナート、ヒスチジン、グリシン、スクシナート、HEPES(4-(
2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、MOPS(3-(N-モ
ルホリノ)プロパンスルホン酸)、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)
およびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択されうる。バッファーは4~
10、5.2~7.5または5.8~7.0の範囲のpHに溶液を緩衝化しうる。本発明
の特定の態様においては、バッファーは、ホスファート、スクシナート、ヒスチジン、M
ES、MOPS、HEPES、アセタートまたはシトラートからなる群から選択される。
バッファーは更に、例えば、特に医薬製剤が非経口用である場合には、非経口用のUSP
適合性バッファーから選択されうる。1つの実施形態においては、バッファーの濃度は1
mM~100mMの範囲である。もう1つの実施形態においては、バッファーの濃度は1
0mM~80mMの範囲である。もう1つの実施形態においては、バッファーの濃度は1
mM~50mMまたは5mM~50mMの範囲である。特定の態様においては、バッファ
ーは5mM~50mMの最終濃度のヒスチジンまたは1mM~10mMの最終濃度のスク
シナートである。特定の態様においては、ヒスチジンバッファーは20mM±2mMの最
終濃度である。
、CaCl2、KClおよびMgCl2ならびにそれらの組合せ(これらに限定されるも
のではない)が含まれる。塩の代わりに、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソ
ルビトールおよびグリセロール(これらに限定されるものではない)を含む非イオン性等
張化剤が使用されうる。適切な塩濃度範囲には、20mM~500mMまたは40mM~
170mMが含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの態様においては、食
塩水はNaClであり、所望により、25mM~170mMの濃度で存在しうる。
ファーを含む。
テムで送達される。例えば、物質は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソームまたは他の投
与様式を用いて投与されうる。もう1つの実施形態においては、例えばミクロスフェアま
たはインプラントにおいて、高分子材料が使用される。
御応答を誘導する量として選択される。そのような量は肺炎球菌血清型に応じて変動しう
る。一般に、多糖に基づくコンジュゲートの場合、各用量は0.08~100μgの各多
糖を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、各多糖コンジュゲートの用量は0.0
8~10μgである。他の実施形態においては、各コンジュゲートの用量は1~5μg、
0.4~4μg、0.4~3μg、0.4~2μgまたは0.4~1μgである。幾つか
の実施形態においては、1以上の多糖コンジュゲートの用量は100、150、200、
250、300、400、500もしくは750ng、または0.4、0.5、0.6、
0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8
、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、4
0、50、60、70、80、90または100μgである。
で組成物中に存在する。他の実施形態においては、多糖コンジュゲートは、異なる量で組
成物中に存在する(すなわち、少なくとも1つの多糖コンジュゲートは、組成物のその他
の多糖コンジュゲートの1以上とは異なる量で存在する)。
準的な研究により確認されうる。例えば、もう1つの実施形態においては、ヒトワクチン
接種の投与量は動物研究からヒトデータへの外挿により決定される。もう1つの実施形態
においては、投与量は経験的に決定される。
うる。配合に適したストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質の例には、国際特許出
願公開番号WO 02/083855およびWO 02/053761において特定され
ているものが含まれる。
例えば非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内に、
対象に投与され、それに応じて製剤化される。1つの実施形態においては、本発明の組成
物は液体製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射または呼吸器内粘膜注
射により投与される。注射用の液体製剤には、溶液などが含まれる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な技術に
より製造されうる。例えば、多糖は細菌から単離可能であり、公知方法により(例えば、
欧州特許番号EP497524およびEP497525を参照されたい)、好ましくは、
ホモジナイザーを使用して達成されるマイクロフルイダイゼーションにより、または化学
的加水分解により、ある程度サイジングされうる。1つの実施形態においては、各ストレ
プトコッカス・ニューモニエ多糖血清型を、ダイズに基づく培地内で増殖させる。ついで
個々の多糖を、遠心分離、沈殿および限外濾過を含む標準的な工程で精製する。例えば、
米国特許出願公開番号2008/0286838および米国特許第5,847,112号
を参照されたい。多糖サンプルの粘度を低減するために、および/またはコンジュゲート
化産物の濾過性を改善するために、機械的または化学的サイジングのような技術を用いて
、多糖をサイジングすることが可能である。化学的加水分解は、酢酸を使用して行われう
る。機械的サイジングは、高圧均質化せん断を用いて行われうる。
可能である。精製された多糖はリンカーに連結されうる。各莢膜多糖は、活性化され又は
リンカーに連結されたら、タンパク質に個々にコンジュゲート化されて糖コンジュゲート
(複合糖質)を形成する。多糖コンジュゲートは、公知のカップリング技術により製造さ
れうる。
る多糖-リンカー中間体を形成しうる。したがって、リンカーは、少なくとも1つの末端
がエステル基であるリンカーである。他方の末端は、それが多糖と反応して多糖-リンカ
ー中間体を形成しうるように選択される。
の場合、リンカーは、典型的には、両方の末端にエステル基を有する。これは、エステル
基の1つを多糖の第一級アミン基と求核アシル置換により反応させることにより、カップ
リングが生じることを可能にする。該反応は、多糖がアミド結合を介してリンカーにカッ
プリングされた多糖-リンカー中間体を生成する。したがって、該リンカーは、多糖の第
一級アミン基と反応するための第1エステル基と、担体分子の第一級アミン基と反応する
ための第2エステル基とを提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーはアジピ
ン酸N-ヒドロキシスクシンイミドジエステル(SIDEA)である。
ングの前に多糖を誘導体化するために使用される追加的リンカーを使用して行われうる。
ングされる。このカップリングは、以下の2つの工程、すなわち、(a1)カルボニル基
を追加的リンカーと反応させる工程、および(a2)追加的リンカーの遊離末端をリンカ
ーと反応させる工程を含む。これらの実施形態においては、追加的リンカーは、典型的に
は、両方の末端に第一級アミン基を有し、それにより、第一級アミン基の1つを多糖のカ
ルボニル基と還元的アミノ化により反応させることにより工程(a1)を行うことを可能
にする。多糖のカルボニル基と反応性である第一級アミン基が使用される。ヒドラジドま
たはヒドロキシルアミノ基が好適である。同じ第一級アミン基が、典型的には、追加的リ
ンカーの両方の末端に存在する。該反応は、多糖がC-N結合を介して追加的リンカーに
カップリングされた多糖-追加的リンカー中間体を生成する。
ップリングされうる。このカップリングは、以下の2つの工程、すなわち、(a1)該基
を追加的リンカーと反応させる工程、および(a2)追加的リンカーの遊離末端をリンカ
ーと反応させる工程を含む。この場合、追加的リンカーは、典型的には、両方の末端に第
一級アミン基を有し、それにより、第一級アミン基の1つを多糖のカルボキシル基とED
AC活性化により反応させることにより工程(a1)を行うことを可能にする。多糖のE
DAC活性化カルボキシル基と反応性である第一級アミン基が使用される。ヒドラジド基
が好適である。同じ第一級アミン基が、典型的には、追加的リンカーの両方の末端に存在
する。該反応は、多糖がアミド結合を介して追加的リンカーにカップリングされた多糖-
追加的リンカー中間体を生成する。
による担体タンパク質へのコンジュゲート化は、米国特許第4,365,170号,第4
,673,574号および第4,902,506号、米国特許出願公開番号2006/0
228380、2007/184072、2007/0231340および2007/0
184071、ならびにWO2006/110381、WO2008/079653およ
びWO2008/143709に記載されている手段により達成されうる。該化学法は、
末端ヒドロキシル基をアルデヒドへと酸化する任意の酸化剤、例えばペルヨーダート(過
ヨウ素酸塩)(過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸を含む)と
の反応による肺炎球菌多糖の活性化を含みうる。該反応は、反応性アルデヒド基の形成と
共に、カルボヒドラートの隣接ヒドロキシル基のランダムな酸化的切断をもたらす。
還元的アミノ化によるものである。例えば、コンジュゲート化は、活性化多糖と担体タン
パク質との混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤と反応させることによ
り行われうる。コンジュゲート化反応は水溶液またはDMSOの存在下で生じるうる。例
えば、US2015/0231270、US2011/0195086およびEP 04
71 177 B1を参照されたい。ついで未反応アルデヒドを水素化ホウ素ナトリウム
のような強力な還元剤の添加によりキャップ化(cap)する。
ヒドを形成させる工程、(2)活性化多糖と担体タンパク質との間で形成されたイミン(
シッフ塩基)を還元して安定なアミンコンジュゲート結合を形成させる工程を含む。酸化
前に、多糖は、所望により、サイズ縮小されうる。機械的方法(例えば、均質化)または
化学的加水分解が用いられうる。化学的加水分解は、酢酸を使用して行われうる。酸化工
程はペルヨーダートとの反応を含みうる。本発明の目的においては、「ペルヨーダート」
なる語は過ヨウ素酸塩(ペルヨーダート)および過ヨウ素酸の両方を含む。この用語はま
た、メタペルヨーダート(IO4-)およびオルトペルヨーダート(IO6-)の両方を
含み、ペルヨーダートの種々の塩(例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリ
ウム)を含む。1つの実施形態においては、莢膜多糖は、メタペルヨーダートの存在下、
好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)の存在下で酸化される。もう1つの実
施形態においては、莢膜多糖は、オルトペルヨーダートの存在下、好ましくは、過ヨウ素
酸の存在下で酸化される。
の存在下の、安定なニトロキシルまたはニトロオキシドラジカル化合物、例えばピペリジ
ン-N-オキシまたはピロリジン-N-オキシ化合物(WO 2014/097099に
記載されている)である。前記反応においては、実際の酸化剤は触媒サイクルにおけるN
-オキソアンモニウム塩である。1つの態様においては、前記の安定なニトロキシルまた
はニトロキシドラジカル化合物はピペリジン-N-オキシまたはピロリジン-N-オキシ
化合物である。1つの態様においては、前記の安定なニトロキシルまたはニトロキシドラ
ジカル化合物はTEMPO(2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)
またはPROXYL(2,2,5,5-テトラメチル-1-ピロリジニルオキシ)部分を
含有する。1つの態様においては、前記の安定なニトロキシルラジカル化合物はTEMP
Oまたはその誘導体である。1つの態様においては、前記酸化剤は、N-ハロ部分を含有
する分子である。1つの態様においては、前記酸化剤は、N-クロロスクシンイミド、N
-ブロモスクシンイミド、N-ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、1,3
,5-トリクロロ-1,3,5-トリアジナン-2,4,6-トリオン、ジブロモイソシ
アヌル酸、1,3,5-トリブロモ-1,3,5-トリアジナン-2,4,6-トリオン
、ジヨードイソシアヌル酸および1,3,5-トリヨード-1,3,5-トリアジナン-
2,4,6-トリオンからなる群から選択される。好ましくは、前記酸化剤はN-クロロ
スクシンイミドである。
キシ(TEMPO)フリーラジカルおよび共酸化剤としてのN-クロロスクシンイミド(
NCS)である(WO 2014/097099に記載されている)。したがって、1つ
の態様においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ由来の複合糖質は、a)糖を水性
溶媒中で2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ(TEMPO)および
N-クロロスクシンイミド(NCS)と反応させて活性化糖を得、b)活性化糖を、1以
上のアミン基を含む担体タンパク質と反応させる工程を含む方法(以下、該方法は「TE
MPO/NCS-還元的アミノ化」と称される)により入手可能である。
隣接ジオール、1,2-アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、スルフィト、ビス
ルファート、ジチオニト、メタビスルフィト、チオスルファート、ホスフィト、ヒポホス
フィトまたは亜リン酸(例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロパン-1,2
-ジオール、ブタン-1,2-ジオールまたはブタン-2,3-ジオール、アスコルビン
酸)から選択されうる。
を利用する、血清型8ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖-タンパク質コンジュゲー
トの製造方法を提供し、ここで、コンジュゲート化反応はシアノボロヒドリドを使用しな
い。他の実施形態においては、コンジュゲート化反応はシッフ塩基還元または還元的アミ
ノ化である。他の実施形態においては、タンパク質は破傷風トキソイド、ジフテリアトキ
ソイドまたはCRM197である。更に他の実施形態においては、タンパク質はCRM1
97である。他の実施形態においては、コンジュゲート化反応は還元的アミノ化である。
他の実施形態においては、還元的アミノ化はジメチルスルホキシド(DMSO)中で行わ
れる。
0kDaの分子量を有する。分子量は、多角度光散乱検出器(MALS)および屈折率検
出器(RI)と組合されたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により計算されうる
。幾つかの実施形態においては、多糖は50kDa~300kDaの分子量を有する。幾
つかの実施形態においては、多糖は50kDa~1,000kDaの分子量を有する。追
加的な実施形態においては、多糖は70kDa~900kDaの分子量を有する。他の実
施形態においては、多糖は100kDa~800kDaの分子量を有する。他の実施形態
においては、多糖は200kDa~600kDaの分子量を有する。他の実施形態におい
ては、多糖は100kDa~1,000kDa、100kDa~900kDa、100k
Da~800kDa、100kDa~700kDa、100kDa~600kDa、10
0kDa~500kDa、100kDa~400kDa、100kDa~300kDa、
150kDa~1,000kDa、150kDa~900kDa、150kDa~800
kDa、150kDa~700kDa、150kDa~600kDa、150kDa~5
00kDa、150kDa~400kDa、150kDa~300kDa、200kDa
~1,000kDa、200kDa~900kDa、200kDa~800kDa、20
0kDa~700kDa、200kDa~600kDa、200kDa~500kDa、
200kDa~400kDa、200kDa~300、250kDa~1,000kDa
、250kDa~900kDa、250kDa~800kDa、250kDa~700k
Da、250kDa~600kDa、250kDa~500kDa、250kDa~40
0kDa、250kDa~350kDa、300kDa~1,000kDa、300kD
a~900kDa、300kDa~800kDa、300kDa~700kDa、300
kDa~600kDa、300kDa~500kDa、300kDa~400kDa、4
00kDa~1,000kDa、400kDa~900kDa、400kDa~800k
Da、400kDa~700kDa、400kDa~600kDa、または500kDa
~600kDaの分子量を有する。
との間のイミン(シッフ塩基)結合を還元して、安定なコンジュゲート結合を形成させる
こと(いわゆる還元的アミノ化)である。適切な還元剤には、シアノボロヒドリド(例え
ば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムなど)が含まれる。1
つの実施形態においては、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
ン性溶媒の混合物)中で行われる。1つの実施形態においては、還元反応はDMSOまた
はDMF(ジメチルホルムアミド)溶媒中で行われる。活性化多糖および担体タンパク質
が凍結乾燥されている場合には、それらを再構成させるために、DMSOまたはDMF溶
媒が使用されうる。1つの実施形態においては、非プロトン性溶媒はDMSOである。
あり、これは、適切なキャップ化剤を使用してキャップ化されうる。1つの実施形態にお
いては、このキャップ化剤は水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)である。適切な代替
物には、ブロンステッドまたはルイス酸の存在下のナトリウムもしくは亜鉛ボロヒドリド
またはナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、アミンボラン、例えばピリジンボラン、
2-ピコリンボラン、2,6-ジボラン-メタノール、ジメチルアミン-ボラン、t-B
uMe’PrN-BH3、ベンジルアミン-BH3または5-エチル-2-メチルピリジ
ンボラン(PEMB)またはボロヒドリド交換樹脂が含まれる。コンジュゲート化(還元
反応、および所望により行われうるキャップ化)の後、複合糖質は、当業者に公知の種々
の技術により精製されうる(多糖-タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮されうる
)。これらの技術には、透析、濃縮/ダイアフィルトレーション操作、接線流濾過、沈殿
/溶出、カラムクロマトグラフィー(イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルイ
オン交換クロマトグラフィー、DEAEまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー)およ
びデプス濾過が含まれる。1つの実施形態においては、複合糖質はダイアフィルトレーシ
ョンまたはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより精
製される。
ジュゲートワクチンにおいて一般に使用される。したがって、全ての血清型が非プロトン
性溶媒中で製造されるわけではない多価組成物に関する特定の実施形態においては、残り
の血清型のための還元反応は水性溶媒[例えば、PBS(リン酸緩衝食塩水)、MES(
2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル
)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、ビス-トリス、ADA(N-(2-アセトアミ
ド)イミノ二酢酸)、PIPES(ピペラジン-N,N’-ビス(2-エタンスルホン酸
))、MOPSO(3-モルホリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、BES(N
,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸)、MOPS(3-
(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、DIPSO(3-ビス(2-ヒドロキシエチ
ル)アミノ-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホン酸)、MOBS(4-(N-モルホ
リノ)ブタンスルホン酸)、HEPPSO(N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-
N’-(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸))、POPSO(ピペラジン-1,4-ビ
ス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸))、TEA(トリエタノールアミン)、
EPPS(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-プロパンスルホン酸)または
ビシン(Bicine)(pH6.0~8.5、7.0~8.0または7.0~7.5)
]中で行われる。
ーモニエ莢膜多糖-タンパク質コンジュゲートには、ストレプトコッカス・ニューモニエ
血清型1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、
14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、2
4F、33Fおよび35Bが含まれるが、これらに限定されるものではない。多糖はオリ
ゴ糖の形態で使用されうる。これらは精製多糖の断片化(例えば、加水分解によるもの)
によって簡便に形成され、ついで、通常、所望のサイズの断片の精製が行われる。
、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B
、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5Bの1以上の肺炎球菌多糖-タンパク質コンジュゲートは、非プロトン性溶媒中での還
元的アミノ化を用いて製造される。特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物にお
けるコンジュゲートのそれぞれは、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて製造
される。特定の実施形態においては、本発明の多価組成物における1以上の血清型の多糖
は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート化
され、1以上の血清型の多糖は、水性溶媒中での還元的アミノ化を用いてコンジュゲート
化される。特定の実施形態においては、本発明の多価組成物における2以上の血清型の多
糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート
化される。他の実施形態においては、本発明の多価組成物における3個以上、4個以上、
5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上、12個
以上、13個以上、14個以上、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、1
9個以上、20個以上、21個以上、22個以上、23個以上または24個以上の血清型
が、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート化
される。特定の実施形態においては、本発明の多価組成物における1以上の血清型由来の
多糖は、非プロトン性溶媒または水性溶媒に存在しうる他の化学的性質を用いて担体タン
パク質にコンジュゲート化される。
・ニューモニエ血清型由来の莢膜多糖をそれぞれが含む複数のストレプトコッカス・ニュ
ーモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物に関するものであり、
ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は本明細書(すなわち、第II節に
おける「多価免疫原性組成物」)に記載されているとおりであり、ここで、1以上の多糖
タンパク質コンジュゲートのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖を担体タンパク質に
コンジュゲート化するコンジュゲート化反応は非プロトン性溶媒中で行われる。特定の実
施形態においては、多価免疫原性組成物における肺炎球菌血清型の少なくとも30%、3
5%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、8
5%、90%、95%または100%は非プロトン性溶媒中でコンジュゲート化される。
残りの血清型は、代替的化学法を用いて、および/または水性溶媒中でコンジュゲート化
される。
、それらの血清型に関して、水性条件下で製造された同じコンジュゲートと比較して予想
外に優れた安定性および免疫原性の増強をもたらすことが判明した(米国特許出願番号6
2/463,216および62/555,444を参照されたい)。
288mg/mLである。本発明の特定の実施形態においては、組成物における総多糖濃
度は約0.03~約0.192mg/mLである。本発明の特定の実施形態においては、
組成物における総多糖濃度は約0.04~約0.192mg/mLである。他の実施形態
においては、組成物における総多糖濃度は約0.065~約0.096mg/mL、約0
.070~約0.080mg/mL、約0.065~約0.080mg/mL、約0.0
70~約0.085mg/mL、約0.110~約0.128mg/mL、約0.110
~約0.175mg/mL、約0.10~約0.175mg/mL、約0.110~約0
.170mg/mL、約0.115~約0.15mg/mL、約0.110~約0.15
mg/mL、約0.110~約0.125mg/mL、約0.150~約0.170mg
/mL、約0.150~約0.165mg/mL、約0.140~約0.170mg/m
L、約0.130~約0.170mg/mL、約0.150~約0.175mg/mL、
約0.070~約0.170mg/mL、約0.065~約0.175mg/mL、また
は約0.065~約0.180mg/mLである。
プロトン性溶媒中で製造される本発明の実施形態においては、組成物における総多糖濃度
は37℃で4週間以上、25℃で4週間以上または4℃で12週間以上安定である。
プロトン性溶媒中で製造される本発明の特定の実施形態においては、組成物におけるスト
レプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの全ての平均分子量(Mw
)(組成物における全コンジュゲートの平均)は約2,000~約6,500kDa、約
2,500~約6,000kDa、約3,000~約5,500kDa、約3,500~
約5,000kDa、約3,500~約4,500kDa、約3,500~約4,700
kDa、約3,500~約4,600kDa、約3,500~約4,500kDa、約3
,500~約4,400kDa、約3,500~約4,300kDa、約3,500~約
4,200kDa、約3,600~約4,700kDa、約3,600~約4,600k
Da、約3,600~約4,500kDa、約3,600~約4,400kDa、約3,
600~約4,300kDa、約3,600~約4,200kDa、約3,700~約4
,700kDa、約3,700~約4,600kDa、約3,700~約4,500kD
a、約3,700~約4,400kDa、約3,700~約4,300kDa、約3,7
00~約4,200kDa、約3,800~約4,700kDa、約3,800~約4,
600kDa、約3,800~約4,500kDa、約3,800~約4,400kDa
、約3,800~約4,300kDa、約3,800~約4,200kDa、約3,90
0~約4,700kDa、約3,900~約4,600kDa、約3,900~約4,5
00kDa、約3,900~約4,400kDa、約3,900~約4,300kDa、
または約3,900~約4,200kDaである。
製造される本発明の特定の実施形態においては、(単一血清型に関する)組成物における
ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれのMwは約
1,000~約10,000kDa、約1500~約5,500kDa、約1500~約
5,600kDa、約1500~約5,700kDa、約1500~約5,800kDa
、約1500~約5,900kDa、約1500~約6000kDa、約1,000~約
5,500kDa、約1,000~約5,000kDa、約1,000~約4,000k
Da、約1,000~約4,500kDa、約1,000~約4,000kDa、または
約1,000~約3,500kDaである。他の実施形態においては、組成物における単
一血清型からのコンジュゲートのMwは約1,000kDa、約1,100kDa、約1
200kDa、約1,300kDa、約1,400kDa、約1,500kDa、約1,
600kDa、約1,700kDa、1,800kDa、約1,900kDa、約2,0
00kDa、約2,100kDa、約2,200kDa、約2,300kDa、約2,4
00kDa、約2,500kDa、約2,600kDa、約2,700kDa、約2,8
00kDa、約2,900kDa、約3,000kDa、約3,100kDa、約3,2
00kDa、約3,300kDa、約3,400kDa、約3,500kDa、約3,6
00kDa、約3,700kDa、約3,800kDa、約3,900kDa、約4,0
00kDa、約4,100kDa、約4,200kDa、約4,300kDa、約4,4
00kDa、約4,500kDa、約4,600kDa、約4,700kDa、約4,8
00kDa、約4,900kDa、約5,000kDa、約5,100kDa、約5,2
00kDa、約5,300kDa、約5,400kDaまたは約5,500kDaである
。
ンジュゲートは非プロトン性溶媒中で製造される。特定の実施形態においては、非プロト
ン性溶媒中で製造されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型特異的コンジュゲート
の割合(非プロトン性溶媒中で製造された多糖血清型の数を多糖血清型の総数で割り算す
ることにより計算されたもの;ここで、総数は、非プロトン性溶媒またはプロトン性溶媒
中で製造されたものを含む)は50%超(すなわち、50%を超える)または60%超ま
たは70%超または80%超または90%超または100%でありうる。
ュゲートは非プロトン性溶媒中で製造され、該コンジュゲートのMwは約1,000~約
5,000kDa、または約1,000~約4000kDa、または1,000~約3,
000kDa、または約1,000~約2,500kDa、または約1,000~約2,
000kDaである。
プロトン性溶媒中で製造される本発明の特定の実施形態においては、組成物におけるスト
レプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの数平均分子量(Mn)(
組成における全コンジュゲートの平均)は約900~約3,000kDa、約1,000
~約3,000kDa、約1,000~約2,500kDa、約1,500~約2,50
0kDa、約1,800~約2,500kDa、約1,900~約2,500kDa、ま
たは約2,000~約2,500kDaである。
プロトン性溶媒中で製造される本発明の特定の実施形態においては、組成物におけるスト
レプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートのそれぞれのMn(単一血
清型に関するもの)は約700~約7,000kDa、約1,000~約6,000kD
a、約1,000~約5,000kDa、約1,000~約4,000kDa、約1,0
00~約3,000kDa、約900~約5,500kDa、約900~約5,000k
Da、約900~約4,500kDa、約900~約4,000kDa、約900~約3
,500kDa、または約900~約3,000kDaである。
タンパク質コンジュゲートのMwおよび/またはMnは37℃で4週間以上、25℃で4
週間以上および/または4℃で12週間以上安定である。
V/MALS/RIを用いて決定される。
プロトン性溶媒中で製造される本発明の幾つかの実施形態においては、280ナノメート
ル(nm)の励起波長で内部タンパク質蛍光分光法を用いて測定された組成物の最大発光
は約335nm~約342nmである。幾つかの実施形態においては、最大発光は約33
5nm~約342nmのままであり、蛍光強度は37℃で少なくとも1週間安定である。
幾つかの実施形態においては、最大発光は約335nm~約342nmのままであり、蛍
光強度は37℃で1週間安定である。
は、DMSO中の還元的アミノ化を用いて製造される。特定の下位実施形態においては、
DMSOを使用して全てが製造された多糖コンジュゲートを含む多価組成物はアジュバン
トを含まない。
で観察される免疫原性の増強に関する1つの可能なメカニズムは炭水化物(莢膜多糖)と
担体タンパク質の表面上のリジン残基との間の結合の数の増加を含み、これは、該タンパ
ク質と多糖との間の追加的な結合点をもたらして、安定性を付与し、ペプチド炭水化物結
合の化学的解重合または分解に対抗するであろう。例えば、Hsieh,Charact
erization of Saccharide-CRM197 Conjugate
Vaccines in Brown F,Corbel M,Griffiths
E(編):Physico-Chemical Procedures for the
Characterization of Vaccines.Dev.Biol.B
asel,Karger,2000,vol 103,pp.93-104を参照された
い。DMSO溶媒中のコンジュゲート化中に生成される多糖-タンパク質結合の増加の追
加的な利点はT細胞へのペプチド-炭水化物の提示の成功のための追加的な機会であろう
。DMSO溶媒中のコンジュゲート化により観察される免疫原性の増強の可能なメカニズ
ムは有機溶媒中のCRM197の変性によるものであろう。これは多糖結合のための追加
的なリジンを露出させて、種々のペプチドエピトープに対するT細胞依存性応答のための
APC表面における糖ペプチド提示の可能性を増大させる。Avciら,2011,Na
ture Medicine 17:1602-1610を参照されたい。
の更にもう1つの利点は、天然CRM197エピトープに対する抗体の免疫学的干渉の低
減であろう。DMSO溶媒中のコンジュゲート化中に生成される多糖-タンパク質結合の
増加のもう1つの利点は、免疫原性の増強をもたらす、より大きなサイズの多糖タンパク
質コンジュゲートの形成であろう。本発明の組成物は、ヒトでの応答の誘導において重要
な利点をもたらすと考えられている。
の場合、より大きなコンジュゲート化反応効率のために、および遊離シアニドの除去を促
進させるために、ニッケルが使用される。遷移金属はシアニドとの安定錯体を形成するこ
とが公知であり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるタンパク質アミノ基およびホルム
アルデヒドの還元的メチル化を改善することが公知である(S Gidleyら,Bio
chem J.1982,203:331-334;Jentoftら Anal Bi
ochem.1980,106:186-190)。ニッケルの添加は、残留抑制性シア
ニドを錯化することにより、コンジュゲート化中のタンパク質の消費を増加させ、より大
きな、潜在的に、より免疫原性のコンジュゲートの形成をもたらす。
ュゲート化性能の非一貫性をもたらして、コンジュゲートサイズおよびコンジュゲートP
s対CRM197比のような産物特性の変動をもたらす。ニッケルの添加は、シアニドを
錯化してシアノ水素化ホウ素ナトリウムのロットにおける差異を排除することにより、コ
ンジュゲート化の非一貫性を低減した。
ラート(CDAP)での糖の活性化によるシアナートエステルの形成を含む。したがって
、活性化された糖は、直接的に、またはスペーサー(リンカー)基を介して、担体タンパ
ク質上のアミノ基にカップリングされうる。例えば、スペーサーは、マレイミド活性化担
体タンパク質(例えば、GMBSを使用)またはハロアセチル化担体タンパク質(例えば
、ヨードアセトイミド[例えば、エチルヨードアセトイミドHCl]またはN-スクシン
イミジルブロモアセテートまたはSIAB、またはSIA、またはSBAPを使用)との
反応の後で得られるチオエーテル結合により担体にカップリングされうるチオール化多糖
を得るためのシスタミンまたはシステアミンでありうる。好ましくは、シアナートエステ
ル(所望により、CDAP化学法により調製されうる)はヘキサンジアミンまたはアジピ
ン酸ジヒドラジド(ADH)にカップリングされ、アミノ誘導体化糖は、カルボジイミド
(例えば、EDACまたはEDC)化学法を用いて、タンパク質担体上のカルボキシル基
を介して担体タンパク質にコンジュゲート化される。そのようなコンジュゲートは国際特
許出願公開番号WO 93/15760、WO 95/08348およびWO 96/2
9094、ならびにChuら,1983,Infect.Immunity 40:24
5-256に記載されている。
ボルナン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、
TSTUを使用する。多数が国際特許出願公開番号WO 98/42721号に記載され
ている。コンジュゲート化は、糖の遊離ヒドロキシル基とCDIとの反応により形成され
うるカルボニルリンカー(Bethellら,1979,J.Biol.Chem.25
4:2572-4;Hearnら,1981,J.Chromatogr.218:50
9-18を参照されたい)を含むことが可能であり、ついでこれはタンパク質と反応して
カルバマート結合を形成する。これは第一級ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、所
望により実施してもよい第一級ヒドロキシル基の保護/脱保護、第一級ヒドロキシル基と
CDIとの反応によるCDIカルバマート中間体の形成、およびタンパク質上のアミノ基
へのCDIカルバマート中間体のカップリングを含みうる。
トを1以上の種々の技術により精製する(多糖-タンパク質コンジュゲートの量に関して
濃縮する)。これらの技術の例は当業者によく知られており、濃縮/ダイアフィルトレー
ション操作、限外濾過、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィーおよびデプス濾過を含む
。例えば、米国特許第6,146,902号を参照されたい。
る。これらの肺炎球菌コンジュゲートは別々の方法により製造可能であり、単一剤形にバ
ルク製剤化されうる。
タンパク質(例えば、CRM197)におけるリジン残基の数によるものであり、これは
コンジュゲート化リジンの範囲(コンジュゲート化の度合)として特徴づけられうる。多
糖への共有結合による担体タンパク質のリジン修飾の証拠は、当業者に公知の常套的方法
を用いるアミノ酸分析により得られうる。コンジュゲート化は、コンジュゲート物質の生
成に使用される担体タンパク質出発物質と比較して、回収されるリジン残基の数の減少を
もたらす。好ましい実施形態においては、本発明の複合糖質のリジン消費により測定され
るコンジュゲート化の度合は2~15、2~13、2~10、2~8、2~6、2~5、
2~4、3~15、3~13、3~10、3~8、3~6、3~5、3~4、5~15、
5~10、8~15、8~12、10~15、または10~12である。1つの実施形態
においては、本発明の複合糖質のコンジュゲート化の度合は約2、約3、約4、約5、約
6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14または約15である。
もう1つの実施形態においては、本発明の複合糖質のコンジュゲート化の度合は4~7で
ある。幾つかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はCRM197である。
によっても特徴づけられうる。幾つかの実施形態においては、組成物における複合糖質の
多糖対担体タンパク質の比(w/w)は0.5~3.0(例えば、約0.5、約0.6、
約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、
約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、
約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9または約3.
0)である。他の実施形態においては、多糖対担体タンパク質比(w/w)は0.5~2
.5、0.5~1.5、0.8~2.5、0.5~1.0、1.0~1.5、1.0~2
.0、0.8~2.4、0.8~2.3、0.8~2.2、0.8~2.1、0.8~2
.0、0.8~1.9、0.8~1.8、0.8~1.7、0.8~1.6、0.8~1
.5、0.8~1.4、0.8~1.3、0.9~2.4、0.9~2.3、0.9~2
.2、0.9~2.1、0.9~2.0、0.9~1.9、0.9~1.8、0.9~1
.7、0.9~1.6、0.9~1.5、0.9~1.4、0.9~1.3、0.9~1
.2、1.0~2.4、1.0~2.3、1.0~2.2、1.0~2.1、1.0~2
.0、1.0~1.9、1.0~1.8、1.0~1.7、1.0~1.6、1.0~1
.5、1.0~1.4、1.0~1.3または1.0~1.2である。他の実施形態にお
いては、糖対担体タンパク質比(w/w)は0.8~1.2である。幾つかのそのような
実施形態においては、担体タンパク質はCRM197である。担体タンパク質に共有結合
(共有結合コンジュゲート化)していないが、それでも複合糖質組成物に存在する遊離糖
を本発明の複合糖質および免疫原性組成物は含有しうる。遊離糖は複合糖質に非共有結合
的に会合していてもよい(例えば、複合糖質に非共有結合的に結合していても、吸着され
ていても、その内部に又はそれにより取り込まれていてもよい)。
/w)は約1.0~約2.0、約1.25~約1.75または約1.3~約1.7である
。他の実施形態においては、血清型15Aの糖対担体タンパク質比(w/w)は約1.1
、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7または1.8である。
/w)は約1.0~約2.0、約1.25~約1.75または約1.3~約1.7である
。他の実施形態においては、血清型15Cの糖対担体タンパク質比(w/w)は約1.1
、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7または1.8である。
/w)は約1.0~約2.0、約1.25~約1.75または約1.3~約1.7である
。他の実施形態においては、血清型33Fの糖対担体タンパク質比(w/w)は約1.1
、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7または1.8である。
/w)は約1.25~約2.25、約1.25~約2.0または約1.3~約1.8であ
る。他の実施形態においては、血清型35Bの糖対担体タンパク質比(w/w)は約1.
2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9または2.0である。
/w)は約0.5~約1.5、約0.75~約1.25または約0.8~約1.0である
。他の実施形態においては、血清型24Fの糖対担体タンパク質比(w/w)は約0.5
、0.6、0.7、0.8、0.9または1.0である。
45%、40%、35%、30%、25%、20%または15%未満の遊離多糖を含む。
好ましい実施形態においては、複合糖質組成物は、多糖の総量と比較して、約25%未満
の遊離多糖を含む。好ましい実施形態においては、複合糖質組成物は、多糖の総量と比較
して、約20%未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態においては、複合糖質組成物は
、多糖の総量と比較して、約15%未満の遊離多糖を含む。
本発明の実施形態はまた、(i)(a)治療(例えば、人体の治療)、(b)医薬、(
c)ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染の抑制、(d)ストレプトコッカス・
ニューモニエに対する免疫応答または防御免疫応答の誘導、(e)ストレプトコッカス・
ニューモニエによる感染の予防、(f)ストレプトコッカス・ニューモニエ感染の再発の
予防、(g)脳損傷、難聴および発作を含む関連合併症の予防を含む、ストレプトコッカ
ス・ニューモニエ感染に関連する病的症状の進行、発症または重症度の低減、(h)スト
レプトコッカス・ニューモニエ感染の可能性の低減、または、(i)肺炎球菌肺炎、肺炎
球菌細菌血症、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎および副鼻腔炎を含む肺炎球菌疾患の治療、予防
または発症、重症化もしくは進行の遅延における使用のための、(ii)それらのための
医薬または組成物としての使用のための、または(iii)それらのための医薬の製造に
おける使用のための、本明細書に記載されている多価免疫原性組成物の1以上を含む。こ
れらの使用においては、本発明の多価肺炎球菌多糖-コンジュゲート組成物は、所望によ
り、1以上のアジュバントと組合せて、またはアジュバント無しで使用されうる。
パク質コンジュゲート組成物の1以上を投与することを含む、ストレプトコッカス・ニュ
ーモニエ感染または肺炎球菌疾患(すなわち、それに対する防御)の予防的治療方法を提
供する。
り投与することにより、感染、例えば肺炎球菌感染に感受性であるヒトを防御または治療
するために使用されうる。
を患者に投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫応答を誘
導する方法を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明は、本発明の多価免疫原
性組成物の免疫学的有効量をヒトに投与する工程を含む、肺炎球菌感染に対してヒトにワ
クチン接種する方法を提供する。
ち、本明細書に記載されている任意の多価免疫原性組成物、例えば、前記の「多価免疫原
性組成物」と題された第II節に記載されている多価免疫原性組成物)を患者に投与する
ことを含む(1)ヒト患者において免疫応答を誘導する、(2)ヒト患者において防御免
疫応答を誘導する、(3)ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染に対してヒト患
者にワクチン接種する、または(4)ヒト患者におけるストレプトコッカス・ニューモニ
エ感染の可能性を低減するための方法を提供する。
たは小児(約2~5歳)における肺炎球菌肺炎および/または侵襲性肺炎球菌疾患の予防
方法を提供する。
および/または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
および/または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
び/または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
び/または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
び/または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
株、すなわち、1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、
12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、2
3F、24F、33Fおよび35Bの1以上により引き起こされる肺炎球菌肺炎および/
または侵襲性肺炎球菌疾患の予防方法を提供する。
ニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体
タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多
糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型1、3、4、5、6A、
6B、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35Bまたは血清型
1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、
15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、
33Fおよび35Bを含む。前記方法のもう1つの実施形態においては、組成物は複数の
ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コン
ジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス
・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は
血清型1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、1
5A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、3
3Fおよび35Bまたは血清型1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、1
0A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22
F、23B、23F、24F、33Fおよび35Bからなる。前記方法の1つの実施形態
においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュ
ゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート
化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカ
ス・ニューモニエの血清型は血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10
A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F
、24F、33Fおよび35Bまたは血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9
V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F
、23B、23F、24F、33Fおよび35Bを含む。前記方法のもう1つの実施形態
においては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュ
ゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート
化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカ
ス・ニューモニエの血清型は血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10
A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F
、24F、33Fおよび35Bまたは血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9
V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F
、23B、23F、24F、33Fおよび35Bからなる。前記方法の1つの実施形態に
おいては、組成物は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲ
ートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化
されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス
・ニューモニエの血清型は血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、1
2F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24
F、33Fおよび35Bを含む。前記方法のもう1つの実施形態においては、組成物は複
数のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、
コンジュゲートのそれぞれは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッ
カス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清
型は血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、
15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35
Bまたは血清型を含む。
交差防御をもたらしうることが示されている(Cooperら,Vaccine 29(
2011)7207-7211)。したがって、前記方法の幾つかの実施形態においては
、本発明はまた、血清型6C多糖コンジュゲートを含まないが、代わりに血清型6A多糖
コンジュゲートまたは血清型6Aおよび6B多糖コンジュゲートを含む多価免疫原性組成
物の使用を提供する。他の実施形態においては、免疫原性組成物は血清型6A、6Bおよ
び6Cの肺炎球菌多糖コンジュゲートを含む。
から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の群の多糖を含む肺炎球菌コン
ジュゲートを含む:
a)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、D
eOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fお
よび35B;
b)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B
;
c)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A
、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33
Fおよび35B;
d)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A
、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5B;
e)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B
、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
f)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24
F、33Fおよび35B;
g)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F
および35B;
h)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F
および35B;
i)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14
、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5B;
j)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
k)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
l)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
m)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
n)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
o)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
p)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
q)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
r)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
s)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
t)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
u)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
v)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
w)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
x)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;
y)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;
z)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび
35B;ならびに
aa)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、1
5A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよ
び35B。
エ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートのそれぞれは、担体タ
ンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖
を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は血清型:i)1、3、4、5、6
A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19
F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;またはii)1、3、4、
5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、1
9A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;またはiii)
1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A
、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび3
5B;またはiv)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、1
2F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24
F、33Fおよび35Bを含む。
の交差防御をもたらしうることも示されている(WO 2017/085586を参照さ
れたい)。したがって、前記方法の幾つかの実施形態においては、本発明はまた、血清型
10A多糖コンジュゲートを含まないが、代わりに血清型39多糖コンジュゲートを含む
多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態においては、免疫原性組成物は血清
型10Aおよび39の肺炎球菌多糖コンジュゲートを含む。前記方法の特定の実施形態に
おいては、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型は、以下のものからなる群から選
択される血清型の群を含む:
bb)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、DeOA
c15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B
および39;
cc)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、
18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39
;
dd)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、De
OAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、3
5Bおよび39;
ee)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15
C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび
39;
ff)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18
C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
gg)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、3
3F、35Bおよび39;
hh)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35
Bおよび39;
ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35
Bおよび39;
jj)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15
B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび
39;
kk)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
ll)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
mm)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
nn)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
oo)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
pp)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
qq)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
rr)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
ss)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
tt)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
uu)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
vv)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C
、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
ww)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
xx)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
yy)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、1
8C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよび39;
zz)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、1
5B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bおよ
び39;
aaa)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、
15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bお
よび39;ならびに
bbb)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、
15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35Bお
よび39。
糖を含む免疫原性コンジュゲートは血清型15Cおよび/または血清型15Aに対する幾
らかの交差防御をもたらしうることも示されている(WO 2015/110942を参
照されたい)。したがって、前記方法の幾つかの実施形態においては、本発明はまた、血
清型15C(または脱O-アセチル化15B)多糖コンジュゲートを含まないが、代わり
に血清型15B多糖コンジュゲートを含む(すなわち、血清型15B多糖は実質的に脱O
-アセチル化されていない)多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態におい
ては、免疫原性組成物は血清型15Bおよび15C(または脱O-アセチル化15B)の
肺炎球菌多糖コンジュゲートを含む。
コッカス・ニューモニエに対する補完的防御を付与するための方法において有用である。
この使用においては、本発明の組成物は、患者が以前にワクチン接種されていない特定の
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に対する防御をもたらすことが可能であり、患
者が以前にワクチン接種されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に対する追加的
な防御をもたらすことが可能であり、あるいは、患者が以前にワクチン接種されていない
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型と、患者が以前にワクチン接種されたストレプ
トコッカス・ニューモニエ血清型の両方に対する防御をもたらすことが可能である。
てストレプトコッカス・ニューモニエに対して免疫応答を誘導する、またはワクチン接種
する、または防御免疫応答を誘導する方法を提供し、該組成物は複数のストレプトコッカ
ス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コンジ
ュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニ
エ血清型由来の莢膜多糖を含み、患者は以前にストレプトコッカス・ニューモニエに対し
てワクチン接種されている。本発明のこの態様の実施形態においては、多価免疫原性組成
物は、本明細書に記載されている任意の多価免疫原性組成物でありうる。本発明の方法の
特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物は、多価肺炎球菌ワクチンで以前に治療
された患者に投与される。多価免疫原性ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエ
の複数の血清型により引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる任意のワクチンで
ありうる。
i.4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23F;
ii.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7Fお
よび19A;
iii.1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F;
iv.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、
19A、22Fおよび33F;
v.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、
22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17Fおよび20;
ならびに
vi.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、
19A、22F、33F、8、10A、11A、12Fおよび15B
からなる群から選択される血清型の群内の1以上のストレプトコッカス・ニューモニエ血
清型により引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる多価肺炎球菌ワクチンで以前
に治療されていた。
コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコ
ンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む。他の
実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲート化され
ていない複数の肺炎球菌莢膜多糖を含む。
炎球菌13価コンジュゲートワクチン(ジフテリアCRM197タンパク質),Pfiz
er,Inc.,Philadelphia,PA,USA]で以前に治療されていた。
肺炎球菌ワクチン多価(Pneumococcol Vaccine Polyvale
nt),Merck & Co.,Inc.,Kenilworth,NJ]で以前に治
療されていた。
肺炎球菌多糖コンジュゲートワクチン(吸着),GlaxoSmithKline Bi
ologicals s.a.,Rixensart,Belgium]で以前に治療さ
れていた。
医師により提供される治療レジメンに従い、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けた
後の任意の時点で患者に投与される。特定の実施形態においては、本発明の多価免疫原性
組成物は、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けてから約1ヶ月~約5年後に患者に
投与され、あるいは、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けてから1ヶ月~1年、1
ヶ月~2年、1ヶ月~3年、1ヶ月~4年、1ヶ月~6ヶ月、2ヶ月~6ヶ月、2ヶ月~
1年、1年~5年、6ヶ月~5年、6ヶ月~4年、6ヶ月~3年、6ヶ月~2年、6ヶ月
~1年、1年~4年、1年~3年、または1年~2年後に患者に投与される。他の実施形
態においては、多価免疫原性組成物は、患者が多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けてから
約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、
約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約1年、約1.25年、約1.5年、約1.75年
、約2年、約2.25年、約2.5年、約2.75年、約3年、約3.25年、約3.5
年、約3.75年、約4年、約4.25年、約4.5年、約4.75年または約5年後に
患者に投与される。
とと、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与することとを、任意の順序で含む、(1)ヒト
患者において免疫応答を誘導する、(2)ヒト患者において防御免疫応答を誘導する、(
3)ストレプトコッカス・ニューモニエによる感染に対してヒト患者にワクチン接種する
、または(4)ヒト患者においてストレプトコッカス・ニューモニエ感染の可能性を低減
するための方法を提供する。例えば、最初に多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与し、つい
で本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与する。あるいは、最初に本発明の多価免疫原
性組成物を患者に投与し、ついで多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与する。多価肺炎球菌
ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型により引き起こされる肺
炎球菌疾患の予防に適応となる任意のワクチンでありうる。
i.4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23F;
ii.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7Fお
よび19A;
iii.1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F;
iv.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、
19A、22Fおよび33F;
v.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、
22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17Fおよび20;
ならびに
vi.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、
19A、22F、33F、8、10A、11A、12Fおよび15B
からなる群から選択される血清型の群の1以上のストレプトコッカス・ニューモニエ血清
型により引き起こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる多価肺炎球菌ワクチンとで治療
される。
・ニューモニエ血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7
F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F
および20Aの莢膜多糖を含む。
コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコ
ンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型由来の多糖を含む。他の
実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲート化され
ていない複数のストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖を含む。
療、およびPREVNAR(登録商標)13[肺炎球菌13価コンジュゲートワクチン(
ジフテリアCRM197タンパク質),Pfizer,Inc.,Philadelph
ia,PA,USA]での治療を、任意の順序で受ける。1つの実施形態においては、最
初にPREVNAR(登録商標)13を患者に投与し、ついで本発明の多価免疫原性組成
物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の多価免疫原性組成物を
患者に投与し、ついでPREVNAR(登録商標)13を患者に投与する。
およびPNEUMOVAX(登録商標)23[肺炎球菌ワクチン多価(Pneumoco
ccol Vaccine Polyvalent),Merck & Co.,Inc
.,Kenilworth,NJ]での治療を、任意の順序で受ける。1つの実施形態に
おいては、最初にPNEUMOVAX(登録商標)23を患者に投与し、ついで本発明の
多価免疫原性組成物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の多価
免疫原性組成物を患者に投与し、ついでPNEUMOVAX(登録商標)23を患者に投
与する。
での治療、およびSYNFLORIX(商標)[肺炎球菌多糖コンジュゲートワクチン(
吸着),GlaxoSmithKline Biologicals s.a.,Rix
ensart,Belgium]での治療を、任意の順序で受ける。1つの実施形態にお
いては、最初にSYNFLORIX(商標)を患者に投与し、ついで本発明の多価免疫原
性組成物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の多価免疫原性組
成物を患者に投与し、ついでSYNFLORIX(商標)を患者に投与する。
チンを共投与する。本明細書中で用いる「共投与」は2つの組成物の同時投与には限定さ
れず、任意の順序で次々に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、多価免疫
原性組成物および多価肺炎球菌ワクチンを筋肉内または皮下投与により、別々の解剖学的
部位、例えば2つの異なる腕に投与する。
炎球菌ワクチンの投与との間の時間の長さは約4週~約1年である。代替的実施形態にお
いては、期間は約1ヶ月~約5年である。
明の多価免疫原性組成物を患者に投与する。代替的実施形態においては、最初に本発明の
多価免疫原性組成物を患者に投与し、ついで多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与する。
(1)本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与すること、
(2)所定時間が経過するのを待つこと、および
(3)多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与すること
を含む、患者においてストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫応答を誘導する、
またはワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法も提供する。この方法にお
いては、多価免疫原性組成物は、本明細書に記載されているストレプトコッカス・ニュー
モニエ多糖タンパク質コンジュゲートの任意の組合せを含むことが可能であり、多価肺炎
球菌ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型により引き起こされ
る疾患の予防に適応となる任意のワクチンでありうる。
(1)多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与すること、
(2)所定時間が経過するのを待つこと、および
(3)本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与すること
を含む、患者においてストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫応答を誘導する、
またはワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法を提供する。
ッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートの任意の組合せを含むことが可能で
あり、多価肺炎球菌ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニエの複数の血清型によ
り引き起こされる疾患の予防に適応となる任意のワクチンでありうる。
ッカス・ニューモニエ多糖タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖タンパク質コ
ンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニュー
モニエ血清型由来の莢膜多糖を含む。代替的実施形態においては、多価肺炎球菌ワクチン
は、担体タンパク質にコンジュゲート化されていないストレプトコッカス・ニューモニエ
莢膜多糖を含む。
)においては、該方法は、本発明の多価免疫原性組成物の、1以上の追加用量を患者に投
与することを更に含みうる。そのような方法においては、患者は、前記の本発明の多価免
疫原性組成物の初回用量の投与を受ける前に多価肺炎球菌ワクチンの投与を既に受けてい
ることが可能であり、あるいは、本発明の多価免疫原性組成物の投与を受ける前に、スト
レプトコッカス・ニューモニエに対してワクチン接種されていないことが可能である。し
たがって、1つの実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエにより引き起
こされる肺炎球菌疾患の予防に適応となる多価肺炎球菌ワクチンの投与を受けた患者に本
発明の多価免疫原性組成物の2以上の用量を投与する。代替的実施形態においては、肺炎
球菌疾患の予防に適応となるいずれのワクチンによっても以前に治療されていない患者に
本発明の多価免疫原性組成物の2以上の用量を投与する。
のである。代替的実施形態においては、2以上の用量は本発明の異なる多価免疫原性組成
物のものである。
2、3または4用量を患者に投与する。特定の実施形態においては、患者は(例えば、幹
細胞移植後の免疫抑制レジメンにより)免疫無防備状態である。
の長さは約4週~約1年である。代替的実施形態においては、本発明の多価免疫原性組成
物の各用量の投与の間の時間の長さは約1ヶ月~約5年である。
トである。特定の実施形態においては、ヒト患者は乳児(約6週~12ヶ月)である。特
定の実施形態においては、ヒト患者は幼児(約12~24ヶ月)または小児(約2~5歳
)である。本発明の組成物は、より年長の子供、青年および成人(例えば、18~45歳
、18~50歳、18~55歳、18~60歳または18~65歳)における使用にも適
している。本発明の方法のいずれかの他の実施形態においては、患者は約2歳~約18歳
である。本発明の方法のいずれかの他の実施形態においては、患者は18歳以上である。
成物の1、2または3用量を乳児に投与する。各用量の投与の間の時間の長さは変動可能
であるが、投薬スケジュールの例は、2月齢で用量を投与し、ついで4月齢で用量を更に
投与し、最後に6月齢で用量を最終投与することを含む。乳児における投与スケジュール
のもう1つの例は、2月齢で用量を投与し、ついで3月齢で用量を更に投与する。乳児に
おける投与スケジュールのもう1つの例は、2月齢で用量を投与し、ついで3月齢で用量
を更に投与し、最後に6月齢で用量を最終投与する。他の実施形態においては、乳児患者
は、乳児が幼児になった際に本発明の多価免疫原性組成物の追加的な「ブースター」用量
の投与を受けうる。例えば、乳児に2月齢で投与し、ついで4月齢で用量を更に投与し、
最後に6月齢で用量を最終投与し、ついで、乳児が幼児の年齢に達した際に、本発明の多
価免疫原性組成物の追加的な「ブースター」用量を11~15月齢で投与する。
こで、第1用量および第2用量を2~10月齢で投与し、第3用量を11~15月齢で投
与する。
こで、第1用量を2月齢で投与し、第2用量を4月齢で投与し、第3用量を6月齢で投与
し、第4用量を11~15月齢で投与する。
ずれかの幾つかの実施形態においては、患者は50歳以上である。本発明の方法のいずれ
かの幾つかの実施形態においては、患者は55歳以上である。本発明の方法のいずれかの
幾つかの実施形態においては、患者は60歳以上である。本発明の方法のいずれかの更に
他の実施形態においては、患者は65歳以上である。本発明の方法のいずれかの追加的な
実施形態においては、患者は70歳以上である。
療される患者は免疫無防備状態である。
はインフルエンザに対するワクチンと共に投与される。特定の実施形態においては、イン
フルエンザワクチンは「シニアインフルエンザワクチン」、すなわち、高齢者、例えば6
5歳以上の者に適応となる高用量インフルエンザワクチンである。
ゲート組成物のいずれかの免疫学的有効量を患者に投与する工程を含む、肺炎球菌感染に
対して患者において防御免疫応答を誘導するための方法を提供する。特定のワクチン(例
えば、本発明の多価免疫原性組成物)のための成分の最適量は、対象における適切な免疫
応答の観察を含む標準的な研究により確認されうる。例えば、もう1つの実施形態におい
ては、ヒトワクチン接種の投与量は動物研究からヒトデータへの外挿により決定される。
もう1つの実施形態においては、投与量は経験的に決定される。
(急性中耳炎および副鼻腔炎)の両方を含む、微生物、例えばストレプトコッカス・ニュ
ーモニエにより引き起こされる主要臨床症候群の予防および/または軽減のために使用さ
れうる。
口/消化管、呼吸器もしくは泌尿生殖器への粘膜投与による投与の1以上を含みうる。1
つの実施形態においては、肺炎または中耳炎の治療には鼻腔内投与が用いられる(なぜな
ら、肺炎球菌の鼻咽頭保菌がより有効に予防可能であり、したがって、その初期段階で感
染を減弱させることが可能だからである)。特定の実施形態においては、本発明の組成物
は筋肉内または皮下投与により患者に投与される。
材料を記載し開示する目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。
はそれらの厳密な実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲に定められている本発
明の範囲または精神から逸脱することなく種々の変更および修飾がそれらにおいて当業者
により行われうると理解されるべきである。
ストレプトコッカス・ニューモニエ(S.pneumoniae)莢膜多糖の製造
肺炎球菌の培養方法は当技術分野で周知である。例えば、Chase,1967,Me
thods of Immunology and Immunochemistry
1:52を参照されたい。肺炎球菌莢膜多糖の製造方法も当技術分野で周知である。例え
ば、欧州特許番号EP 0 497 524B1を参照されたい。後記プロセスは、一般
に、欧州特許番号EP 0 497 524 B1に記載されている方法に従い、全ての
肺炎球菌血清型に一般に適用可能である。
、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33Fおよび35Bの肺
炎球菌株の分離株はメルク・カルチャー・コレクション(Merck Culture
Collection)から入手した。血清型23Bの株は米国疾病予防管理センター(
Disease Control and Prevention)およびアラバマ大学
バーミンガム校(University of Alabama Birmingham
)から入手した。血清型24Fの株はメルク・カルチャー・コレクション(Merck
CultureCollection)およびアラバマ大学バーミンガム校(Unive
rsity of Alabama Birmingham)から入手した。必要な場合
には、特異的抗血清を使用するクェルング(Quellung)反応に基づいて亜型を区
別した。例えば、米国特許第5,847,112号を参照されたい。得られた分離株を、
ダイズペプトン、酵母エキスおよびグルコース(ヘミン非含有)を含有する動物成分非含
有培地からなる寒天プレート上で2段階で連続的にプレーティングすることにより更にク
ローン的に単離した。血清型7Fの場合には、使用した寒天プレートはヘミンも含有して
いた。各血清型のクローン分離株を、ダイズペプトン、酵母エキス、HEPES、塩化ナ
トリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、グルコースおよびグリセロールを含有す
る動物成分非含有培地を使用して液体培養内で更に増殖させて、プレマスター細胞バンク
を調製した。
く、下流精製前の化学的不活性化(化学的不活化)からなるものであった。各血清型から
の解凍された細胞バンクバイアルを、ダイズペプトンまたはダイズペプトン限外濾過液、
酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過液、HEPES、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウ
ム、リン酸カリウムおよびグルコースを含有する予め滅菌された動物成分非含有増殖培地
を含有する振とうフラスコまたは培養ボトルを使用して、増殖に付した。温度および攪拌
を制御しながらガス交換が最小限となるように、密封振とうフラスコまたはボトル内で該
細胞増殖培養物を増殖に付した。これらの血清型の細胞増殖中に、温度、pH、圧力およ
び攪拌を制御した。スパージング(sparging)を用いなかったため、気流オーバ
ーレイ(overlay)をも制御した。600nmでの光学密度による測定で、特定さ
れた培養密度が得られた後、該細胞増殖培養物の一部を、ダイズペプトンまたはダイズペ
プトン限外濾過液、酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過液、塩化ナトリウム、リン酸カ
リウムおよびグルコースを含有する予め滅菌された動物成分非含有増殖培地を含有する生
産発酵槽に移した。温度、pH、圧力および攪拌を制御した。スパージングを用いなかっ
たため、気流オーバーレイをも制御した。
発酵を終了させた。純粋フェノールを0.8~1.2%の最終濃度まで添加して、細胞を
不活性化し、細胞壁から莢膜多糖を遊離させた。発酵槽内で、特定された時間にわたって
一次不活性化を行い、この場合、温度および攪拌を制御し続ける。一次不活性化後、バッ
チをもう1つの容器に移し、それを、制御された温度および攪拌で、追加的な特定された
時間にわたって維持して、完全な不活性化を行った。これは、微生物プレーティング技術
またはフェノール濃度および特定された時間の検証のいずれかにより確認された。ついで
不活性化ブロスを精製した。
肺炎球菌多糖の精製
肺炎球菌多糖の精製プロセスは幾つかの遠心分離、デプス濾過、濃縮/ダイアフィルト
レーション操作および沈殿工程からなるものであった。特に示されていない限り、全ての
手順は室温で行った。
ポリマー[例えば、BPA-1000、TRETOLITE(登録商標)(Baker
Hughes Inc.,Houston,TX)、Spectrum 8160、ポリ
(エチレンイミン)およびMillipore pDADMAC]で凝集させた。カチオ
ン性ポリマーは不純物タンパク質、核酸、細胞破片に結合した。凝集工程および熟成期間
の後、凝集固体を遠心分離および複数のデプス濾過工程により除去した。清澄化ブロスを
濃縮し、100kDa~500kDa MWCO(分子量カットオフ)フィルターを使用
してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、Tris、MgCl
2バッファーおよびリン酸ナトリウムバッファーを使用して行った。ダイアフィルトレー
ションは残留核酸およびタンパク質を除去した。
よび/またはイソプロパノールで再沈殿させることにより達成された。フェノール沈殿工
程中に、リン酸ナトリウム生理食塩バッファー中の酢酸ナトリウムおよびフェノール(液
化フェノールまたは固体フェノール)を、ダイアフィルトレーションされた保持液に充填
した。ついで多糖のアルコール分画を2段階で行った。最初の段階においては、低比率の
アルコールを調製物に添加して、細胞破片および他の不要な不純物を沈殿させ、一方、粗
製多糖は溶液中に残存させた。不純物を遠心分離およびそれに続くデプス濾過工程により
除去した。ついで、追加的なイソプロパノールまたは変性アルコールをバッチに加えるこ
とにより、多糖を溶液から回収した。沈殿した多糖ペレットを遠心分離により回収し、粉
砕(トリチュレート)し、粉末として乾燥させ、-70℃で凍結保存した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型1コン
ジュゲートの製造
多糖を溶解し、標的分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、ジメチルスルホ
キシド(DMSO)中に再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液と
を一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析に
より精製した後、最後の0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲー
トが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度
および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化(ホモジナイズ)して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホ
モジナイザー通過回数を250bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で15時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションし、ついで、5kDa N
MWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾
過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)における発現
により得られた精製CRM197を、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して
2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対してダイアフィルトレーションし、
0.2ミクロンで濾過した。
に製剤化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍
結乾燥用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。1.0g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。300kDa NMWCO透析カセッ
トを使用して、150mM 塩化ナトリウム、0.05%(w/v)ポリソルベート20
に対して約4℃で3日間、バッチを透析した。
バッチを(0.5ミクロンプレフィルターで)0.2ミクロン濾過し、アリコートに分
注し、-60℃以下で凍結した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO+Aq)多価研究用の血清型1コ
ンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を250bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で15時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
緩衝化多糖溶液と0.5の多糖対CRM197質量比で一緒にした。得られるコンジュゲ
ートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を選択した。多糖および
ホスファートの濃度はそれぞれ6.9g/Lおよび100mMであった。得られるコンジ
ュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。100mM 塩化ニッケル
溶液を使用して、塩化ニッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(
多糖反復単位1モル当たり2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となる
ように、コンジュゲート化を120時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。ポリソルベート20を0.05%(w/v)の濃度まで保持液バッチに加え、バ
ッチを0.2ミクロンで濾過した。
pH 7.0)中の追加的な10mM L-ヒスチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃
度に調整した。バッチをアリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV22多価研究のための血清型1コンジュゲートの
製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を250bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で15時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
緩衝化多糖溶液と0.5の多糖対CRM197質量比で一緒にした。得られるコンジュゲ
ートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を選択した。多糖および
ホスファートの濃度はそれぞれ6.9g/Lおよび100mMであった。得られるコンジ
ュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を0.2ミクロ
ンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約2mMまで
加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル)を加えた。
多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を120時間進行さ
せた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。ポリソルベート20を0.05%(w/v)の濃度まで保持液バッチに加え、バ
ッチを0.2ミクロンで濾過した。
pH 7.0)中の追加的な10mM L-ヒスチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃
度に調整した。バッチをアリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型3コン
ジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、ジメチルスルホ
キシド(DMSO)中に再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液と
を一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾
過により精製した後、最後の0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュ
ゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、
濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を810bar/6回通過、ついで900bar/3回通過に制御した。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で12時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
に製剤化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍
結乾燥用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.25g Ps/Lの
多糖濃度および1.35の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCR
M197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制
御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モ
ル当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV22およびPCV23(DMSO+Aq)多価研
究用の血清型3コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を380bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で12時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH6.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
0.2ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と0.6の多糖対CRM197質量比で一緒にし
た。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比
を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ4.1g/Lおよび150mMで
あった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。つ
いで溶液を0.2ミクロンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化
ニッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲー
ト化を10℃で120時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。バッチを0.2ミクロンで濾過した。
スチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、
-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型4コン
ジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を300bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
糖を部分的に脱ケタール化した。ついで多糖溶液を活性化前に22℃に冷却した。多糖の
活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応
は22℃で4時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションし、ついで、5kDa N
MWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾
過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。5.0g Ps/Lの多
糖濃度および2.0の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。300kDa NMWCO透析カセッ
トを使用して、150mM 塩化ナトリウム、0.05%(w/v)ポリソルベート20
に対して約4℃で3日間、バッチを透析した。
バッチを(0.5ミクロンプレフィルターで)0.2ミクロン濾過し、アリコートに分
注し、-60℃以下で凍結した。
PCV23(DMSO+Aq)および水性コンジュゲート化を用いたPCV22多価研
究用の血清型4コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を300bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
糖を部分的に脱ケタール化した。ついで多糖溶液を活性化前に22℃に冷却した。多糖の
活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応
は22℃で4時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
0.2ミクロン濾過し、緩衝多糖溶液と0.5の多糖対CRM197質量比で一緒にした
。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を
選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ8.3g/Lおよび100mMであ
った。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。つい
で溶液を0.2ミクロンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニ
ッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当た
り2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート
化を120時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。ついでバッチを0.2ミクロンで濾過した。
スチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、
-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型5コン
ジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を600bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸
ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は4℃で4時間進行させた。
ナトリウム(pH4.1)に対してダイアフィルトレーションし、ついで、5kDa N
MWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾
過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウ
ムを20mMの濃度まで添加(スパイク)した。2.0g Ps/Lの多糖濃度および1
.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM197溶液とを混
合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質
量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を
加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
約0.025%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム
中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和し
た。300kDa NMWCO透析カセットを使用して、150mM 塩化ナトリウム、
0.05%(w/v)ポリソルベート20に対して約4℃で3日間、バッチを透析した。
保持液バッチを(0.5ミクロンプレフィルターで)0.2ミクロン濾過し、アリコー
トに分注し、-60℃以下で凍結した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV22およびPCV23(DMSO+Aq)多価研
究用の血清型5コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を600bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
化による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸
ナトリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は4℃で4時間進行させた。
ナトリウム(pH4.1)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH6.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
緩衝化多糖溶液と0.4の多糖対CRM197質量比で一緒にした。得られるコンジュゲ
ートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を選択した。多糖および
ホスファートの濃度はそれぞれ3.8g/Lおよび150mMであった。得られるコンジ
ュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。ついで溶液を0.2ミクロ
ンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルを約2mMまで
加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル)を加えた。
多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲート化を96時間進行させ
た。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、300mM 重炭酸ナトリウム(pH9.3)に対してバッチを2~8℃でダイアフ
ィルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを1.5M リン酸カリウ
ム(pH6.0)で中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。ポリソルベート20を0.05%(w/v)の濃度まで保持液バッチに加え、バ
ッチを0.2ミクロンで濾過した。
pH7.0)中の追加的な10mM L-ヒスチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃度
に調整した。バッチをアリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)およびPCV22多価研究用の血清型6Aコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖お
よび精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶解した。ついで、再溶解した
多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得
られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.2ミクロン濾過に付した
。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパ
ラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を200bar/5回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、10kDa NM
WCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションした。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。1.5g Ps/Lの多
糖濃度および1.4の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウムでバッチを約4℃で希釈した。ついでリン
酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMWC
O接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリウ
ム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O/Aq)多価研究用の血清型6Bコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を200bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。1.85g Ps/Lの
多糖濃度および1.35の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCR
M197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制
御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モ
ル当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究のための血清型6Bコンジュゲ
ートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を200bar/5回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、10kDa NM
WCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。1.75g Ps/Lの
多糖濃度および1.35の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCR
M197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制
御されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モ
ル当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型7Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を150bar/7回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、10kDa NM
WCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
よる多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナト
リウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は4℃で4時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.6g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究のための血清型7Fコンジュゲ
ートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を150bar/7回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、10kDa NM
WCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
よる多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナト
リウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は4℃で4時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.04g Ps/Lの
多糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型8コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を600bar/6回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で4時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。4.5g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。混合後、コンジュゲート化反応を22℃で進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型9Vコ
ンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を230bar/5.5回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、10kDa
NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で6時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.0g Ps/Lの多
糖濃度および1.3の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
5%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0
)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、60℃以下で凍結
した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型9Vコンジュゲートの製
造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を100bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で6時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
0.2ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と0.7の多糖対CRM197質量比で一緒にし
た。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比
を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ10.0g/Lおよび100mM
であった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。
ついで溶液を0.2ミクロンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩
化ニッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲ
ート化を120時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。ポリソルベート20を0.05%(w/v)の濃度まで保持液バッチに加え、バ
ッチを0.2ミクロンで濾過した。
pH7.0)中の追加的な10mM L-ヒスチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃度
に調整した。バッチをアリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO+Aq)多価研究用の血清型9V
コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を100bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で6時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
0.2ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と0.7の多糖対CRM197質量比で一緒にし
た。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比
を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ10.0g/Lおよび100mM
であった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。
ついで溶液を0.2ミクロンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩
化ニッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲ
ート化を120時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。ポリソルベート20を0.05%(w/v)の濃度まで保持液バッチに加え、バ
ッチを0.2ミクロンで濾過した。
pH7.0)中の追加的な10mM L-ヒスチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃度
に調整した。バッチをアリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23多価研究用の血清型10Aコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を615bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.5g Ps/Lの多
糖濃度および1.6の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
バッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.015
%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)
中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO+Aq)多価研究用の血清型
10Aコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を600bar/5回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、10kDa NM
WCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.4g Ps/Lの多
糖濃度および1.6の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリウム(p
H7)に対してダイアフィルトレーションし、ついで、300kDa NMWCO接線流
限外濾過膜を使用して、0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150m
M 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィ
ルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型10Aコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を600bar/5回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、10kDa NM
WCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.8g Ps/Lの多
糖濃度および1.75の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV24多価研究用の血清型11Aコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を800bar/8回通過に制御した。サイズ縮小多糖を濃縮し、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 Al)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.3g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウムでバッチを約4℃で希釈した。ついでリン
酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
M 塩化ナトリウム(pH7.0、0.015%(w/v)ポリソルベート20)中の追
加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型12Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を200mMまで加え
、80℃で155分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム(pH7)バッファー
を400mMまで加えて中和することにより行った。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.7g Ps/Lの多
糖濃度および1.8の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型12Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を200mMまで加え
、90℃で60分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム(pH7)バッファーを
400mMまで加えて中和することにより行った。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.0g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7.0)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型14コ
ンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを透析により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を200bar/6回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で4時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。1.8g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。300kDa MWCO透析カセット
を使用して、150mM 塩化ナトリウム、0.05% ポリソルベート20に対して、
バッチを約4℃で22.5時間透析した。
保持液バッチを(0.5ミクロンプレフィルターで)0.2ミクロン濾過し、アリコー
トに分注し、-60℃以下で凍結した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV22およびPCV23(DMSO+Aq)多価研
究用の血清型14コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を200bar/6回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で4時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
0.2ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と1.0の多糖対CRM197質量比で一緒にし
た。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比
を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ3.8g/Lおよび100mMで
あった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。つ
いで溶液を0.2ミクロンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化
ニッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲー
ト化を72時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。ついでバッチを0.2ミクロンで濾過した。
スチジンでバッチを1.0g/Lの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、
-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型15Aコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を210bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で20時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を、34℃に予熱された等体積のDMSO中に個別に再溶解した。多
糖溶液に塩化ナトリウムを25mMの濃度まで添加した。5.0g Ps/Lの多糖濃度
および2.0の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM197溶
液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるよ
うに、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1
モル)を加え、34℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、34℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型15Aコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を200bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で20時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を、34℃に予熱された等体積のDMSO中に個別に再溶解した。多
糖溶液に塩化ナトリウムを25mMの濃度まで添加した。5.0g Ps/Lの多糖濃度
および2.0の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM197溶
液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるよ
うに、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1
モル)を加え、34℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型15Cコンジュゲートの製造
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoni
ae)血清型15Bに由来する多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、O-アセチル
基を遊離させるために穏やかな塩基加水分解に付し、化学的に活性化し、限外濾過により
バッファー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSO
に再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のと
おりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、
最後の0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるよう
に、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御
した。
精製された血清型15B肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過
した。溶解した多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジ
ナイザー通過回数を300bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
濃度まで加えた。バッチを、混合しながら、60℃で13時間インキュベートして、O-
アセチル基を遊離させた。リン酸カリウム(pH6)バッファーを136mMの最終濃度
まで加えてpHを中和し、溶液を周囲温度に冷却した。ついで溶液を濃縮し、10kDa
NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.0g Ps/Lの多
糖濃度および1.75の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型15Cコンジュゲー
トの製造
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoni
ae)血清型15Bに由来する多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、O-アセチル
基を遊離させるために穏やかな塩基加水分解に付し、化学的に活性化し、限外濾過により
バッファー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSO
に再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のと
おりにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、
最後の0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるよう
に、各工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御
した。
精製された血清型15B肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過
した。溶解した多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジ
ナイザー通過回数を300bar/5回通過に制御し、サイズ縮小多糖溶液を60℃に加
熱し、重炭酸ナトリウム(pH9.4)バッファーを50mMの最終濃度まで加えた。バ
ッチを、混合しながら、60℃で12時間インキュベートして、O-アセチル基を遊離さ
せた。リン酸カリウム(pH6)バッファーを150mMの最終濃度まで加えてpHを中
和し、溶液を周囲温度に冷却した。ついで溶液を濃縮し、10kDa NMWCO接線流
限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.2g Ps/Lの多
糖濃度および1.75の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型18Cコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を200mMまで加え
、90℃で160分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム(pH7)バッファー
を400mMまで加えて中和することにより行った。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.49g Ps/Lの
多糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型18Cコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を200mMまで加え
、90℃で160分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム(pH7)バッファー
を400mMまで加えて中和することにより行った。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.49g Ps/Lの
多糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型19Aコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖お
よび精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶解した。ついで、再溶解した
多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得
られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.2ミクロン濾過に付した
。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパ
ラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.22ミクロンで濾過した。多糖を
濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルト
レーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で20時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.8g Ps/Lの多
糖濃度および1.33の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型19Aコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖お
よび精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶解した。ついで、再溶解した
多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得
られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.2ミクロン濾過に付した
。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパ
ラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.22ミクロンで濾過した。多糖を
濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルト
レーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で20時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。3.8g Ps/Lの多
糖濃度および1.33の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)、PCV23(DMSO+
Aq)およびPCV22多価研究用の血清型19Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を150bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
よる多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナト
リウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は4℃で4時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.0g Ps/Lの多
糖濃度および1.2の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。保持液バッチを0.2
ミクロンで濾過し、ついで22℃で4.5日間インキュベートした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)、4℃で10mM ヒスチジンに対してダイアフ
ィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型22F
コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を810bar/5回通過に制御した。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.3g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中
の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結し
た。
水性コンジュゲート化を用いたPCV22およびPCV23(DMSO+Aq)多価研
究用の血清型22Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を350bar/5回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
0.2ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と0.6の多糖対CRM197質量比で一緒にし
た。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比
を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ7.5g/Lおよび100mMで
あった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。つ
いで溶液を0.2ミクロンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化
ニッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲー
ト化を120時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。
ァー中の追加的な10mM L-ヒスチジンで1.0g/Lの多糖濃度に調整した。バッ
チをアリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)、PCV23(DMSO+
Aq)およびPCV22多価研究用の血清型23Bコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を400bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。5.0g Ps/Lの多
糖濃度および1.5の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM1
97溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御さ
れるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kD NMWC
O接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリウ
ム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型23Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を400bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で5時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.1g Ps/Lの多
糖濃度および1.25の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型23Fコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を400bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で4時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.1g Ps/Lの多
糖濃度および1.25の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で3時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリ
ウム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
ート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の追加的な10mM
ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型24Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を200mMまで加え
、80℃で150分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム(pH7)バッファー
を400mMまで加えて中和することにより行った。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
剤化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾
燥用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウ
ムを10mMの最終濃度まで添加した。1.4g Ps/Lの多糖濃度および1.5の多
糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM197溶液とを混合した。
得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を選
択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加え、2
2℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kD NMWC
O接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリウ
ム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型24Fコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を酸加水分解によりサイズ縮小した。該酸加水分解は、酢酸を200mMまで加え
、80℃で150分間インキュベートし、ついで冷リン酸カリウム(pH7)バッファー
を400mMまで加えて中和することにより行った。
てダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
剤化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾
燥用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウ
ムを25mMの最終濃度まで添加した。1.4g Ps/Lの多糖濃度および1.5の多
糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM197溶液とを混合した。
得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を選
択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加え、2
2℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kD NMWC
O接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリウ
ム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)多価研究用の血清型33F
コンジュゲートの製造
多糖を溶解し、目標分子量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によりバッフ
ァー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶
解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりに
コンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の
0.2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各
工程内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して、Psの分子量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザー通過
回数を510bar/5回通過に制御した。
してダイアフィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイ
アフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。2.5g Ps/Lの多
糖濃度および1.75の多糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM
197溶液とを混合した。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御
されるように、質量比を選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル
当たり1モル)を加え、22℃でコンジュゲート化を進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、22℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
水性コンジュゲート化を用いたPCV22およびPCV23(DMSO+Aq)多価研
究用の血清型33Fコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、サイズ縮小させ、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換し
た。ついで精製CRM197を、反応混合物中で塩化ニッケルを使用して活性化多糖にコ
ンジュゲート化させ、得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.
2ミクロン濾過に付した。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程
内の幾つかのプロセスパラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を均質化して分子量を減少させた。目標分子量にサイズ縮小するために、均質化圧
力およびホモジナイザー通過回数を350bar/4回通過に制御した。ついでサイズ縮
小多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
酸カリウム(pH6.4)に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は2~8℃
で行った。
酸化された多糖溶液を水および1.5M リン酸カリウム(pH7.0)と混合した。
選択されたバッファーpHは、コンジュゲート化反応中の活性化多糖の安定性を改善する
ためのものであった。既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A
1)シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を
0.2ミクロン濾過し、緩衝化多糖溶液と0.7の多糖対CRM197質量比で一緒にし
た。得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比
を選択した。多糖およびホスファートの濃度はそれぞれ6.5g/Lおよび100mMで
あった。得られるコンジュゲートのサイズが制御されるように、多糖濃度を選択した。つ
いで溶液を0.2ミクロンで濾過した。100mM 塩化ニッケル溶液を使用して、塩化
ニッケルを約2mMまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当
たり2モル)を加えた。多糖およびタンパク質の消費が最大となるように、コンジュゲー
ト化を96時間進行させた。
コンジュゲート化反応後、バッチを約3.5g/Lの多糖濃度に希釈し、2~8℃に冷
却し、1.2ミクロンで濾過した。100kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用し
て、バッチを100mM リン酸カリウム(pH7.0)に対して2~8℃でダイアフィ
ルトレーションした。ついで、保持液中に回収されたバッチを約2.0g多糖/Lに希釈
し、1.2M 重炭酸ナトリウム(pH9.4)の添加によりpHを調整した。水素化ホ
ウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり1モル)を加えた。ついで1.5M リン酸
カリウム(pH6.0)を加えた。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、15
0mM 塩化ナトリウム(pH7.0)中の10mM L-ヒスチジンに対して4℃で透
析した。バッチを0.2ミクロンで濾過し、150mM 塩化ナトリウム(pH7.0)
バッファー中の追加的な10mM L-ヒスチジンで1.0g/Lの多糖濃度に調整した
。バッチをアリコートに分注し、-60℃以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV23(DMSO)およびPCV23(DMS
O+Aq)多価研究用の血清型35Bコンジュゲートの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖お
よび精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶解した。ついで、再溶解した
多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得
られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.2ミクロン濾過に付した
。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパ
ラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウ
ムを20mMの最終濃度まで添加した。6.0g Ps/Lの多糖濃度および3.0の多
糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM197溶液とを混合した。
得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を選
択した。コンジュゲート化を34℃で進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、34℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kD NMWC
O接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリウ
ム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV22多価研究用の血清型35Bコンジュゲー
トの製造
多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバッファー交換した。活性化多糖お
よび精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに再溶解した。ついで、再溶解した
多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとおりにコンジュゲート化させた。得
られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最後の0.2ミクロン濾過に付した
。所望の特性を有するコンジュゲートが得られるように、各工程内の幾つかのプロセスパ
ラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。
精製された肺炎球菌莢膜Ps粉末を水に溶解し、0.45ミクロンで濾過した。溶解し
た多糖を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。
による多糖サイズ縮小を最小限に抑えた。多糖の活性化を100mM メタ過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液の添加により開始させた。酸化反応は22℃で2時間進行させた。
ションし、ついで、5kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して水に対してダイア
フィルトレーションした。限外濾過は2~8℃で行った。
既に記載されているとおりに(WO 2012/173876 A1)シュードモナス
・フルオレッセンスにおける発現により得られた精製CRM197を、5kDa NMW
CO接線流限外濾過膜を使用して2mM ホスファート(pH7.2)バッファーに対し
てダイアフィルトレーションし、0.2ミクロンで濾過した。
化した。CRM197を1% w/v スクロース濃度で6mg Pr/mLで凍結乾燥
用に製剤化した。
びCRM197物質を等体積のDMSO中に個別に再溶解した。多糖溶液に塩化ナトリウ
ムを20mMの最終濃度まで添加した。6.0g Ps/Lの多糖濃度および3.0の多
糖対CRM197質量比が得られるように、多糖溶液とCRM197溶液とを混合した。
得られるコンジュゲートにおける多糖対CRM197比が制御されるように、質量比を選
択した。コンジュゲート化を34℃で進行させた。
コンジュゲート化反応後、水素化ホウ素ナトリウム(多糖反復単位1モル当たり2モル
)を加え、34℃で1時間インキュベートした。約0.025%(w/v)ポリソルベー
ト20を含有する150mM 塩化ナトリウム中にバッチを約4℃で希釈した。ついでリ
ン酸カリウムバッファーを加えてpHを中和した。バッチを濃縮し、30kD NMWC
O接線流限外濾過膜を使用して、150mM 塩化ナトリウム、25mM リン酸カリウ
ム(pH7)に対して約4℃でダイアフィルトレーションした。
ついでバッチを濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を使用して、0.
015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(pH7
.0)中の10mM ヒスチジンに対して4℃でダイアフィルトレーションした。
0.015%(w/v)ポリソルベート20を含有する150mM 塩化ナトリウム(p
H7.0)中の追加的な10mM ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃
以下で凍結した。
DMSOコンジュゲート化を用いたPCV24多価研究用の血清型の製造
前記実施例に記載されたものと同様の方法を用いて、PCV24研究用のコンジュゲー
トを製造した。各血清型に関して、多糖を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によりバ
ッファー交換した。活性化多糖および精製CRM197を個別に凍結乾燥し、DMSOに
再溶解した。ついで、再溶解した多糖溶液とCRM197溶液とを一緒にし、後記のとお
りにコンジュゲート化させた。得られたコンジュゲートを限外濾過により精製した後、最
後の0.2ミクロン濾過に付した。
ラメータ、例えばpH、温度、濃度および時間を制御した。前記実施例との差異には、均
質化圧力および通過回数、酸化時間、凍結乾燥のための多糖およびスクロースの濃度、コ
ンジュゲート化中の多糖濃度、多糖対CRM197質量比、ならびにコンジュゲート化反
応における塩濃度が含まれうる。
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化
前記実施例に記載されている種々の化学的方法を用いて製造された個々の肺炎球菌多糖
-タンパク質コンジュゲートを8、15、22、23および24価肺炎球菌コンジュゲー
トワクチンの製剤化に使用した。
中で還元的アミノ化を用いて、CRM197タンパク質を肺炎球菌多糖(PnP)型(-
8、-10A、-12F、-15A、-15C、-23B、-24Fおよび-35B)に
個別にコンジュゲート化させることにより製造され、20mM L-ヒスチジン(pH5
.8)および150mM NaCl 0.1% w/v ポリソルベート-20(PS-
20)および250μg [Al]/mL(アジュバントとしてリン酸アルミニウムアジ
ュバントの形態)中で各血清型4μg/mL(32μg/mLの総多糖濃度)で製剤化さ
れる。
)中で還元的アミノ化を用いて、CRM197タンパク質を肺炎球菌多糖(PnP)型(
-6A、-6B、-7F、-9V、-18C、-19A、-19F、-23F)に個別に
コンジュゲート化させ、あるいは、型-1、-3、-4、-5、-14、-22Fおよび
-33Fの場合には、プロトン性溶媒(水性化学とも称される)中で還元的アミノ化を用
いて、CRM197タンパク質を肺炎球菌多糖(PnP)型に個別にコンジュゲート化さ
せることにより製造され、20mM L-ヒスチジン(pH5.8)および150mM
NaCl 0.2% w/v ポリソルベート-20(PS-20)および250μg
[Al]/mL(アジュバントとしてリン酸アルミニウムアジュバントの形態)中で各血
清型4μg/mL(ただし、6Bは8μg/mL)(64μg/mLの総多糖濃度)で製
剤化される。
ン性溶液および非プロトン性溶液(DMSO/水性「Aq」)中で還元的アミノ化を用い
て、CRM197タンパク質を肺炎球菌多糖(PnP)型(-1、-3、-4、-5、-
6A、-6B、-7F、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-
18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33Fおよ
び-35B)に個別にコンジュゲート化させることにより製造し、20mM L-ヒスチ
ジン(pH5.8)および150mM NaClおよび0.2% w/v ポリソルベー
ト-20(PS-20)中で各血清型0.8μg/mL(ただし、6Bは1.6μg/m
L)(18.4μg/mLの総多糖濃度)で製剤化した(PCV22非アジュバント化ま
たはunadjと称される)。もう1つの特定の実施形態においては、製剤は、アジュバ
ントとしてのリン酸アルミニウムの形態の50μg [Al]/mLを使用して製造され
、PCV22/APAと称される。
元的アミノ化を用いて、CRM197タンパク質を肺炎球菌多糖(PnP)型(-1、-
3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-12F、-14
、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F
、-24F、-33Fおよび-35B)に個別にコンジュゲート化させることにより製造
され、20mM L-ヒスチジン(pH5.8)および150mM NaClおよび0.
2% w/v ポリソルベート-20(PS-20)中で各血清型4μg/mL(92μ
g/mLの総多糖濃度)で製剤化され、PCV23 unadjuvと称される。もう1
つの特定の実施形態においては、製剤は、アジュバントとしてのリン酸アルミニウムの形
態の250μg [Al]/mLを使用して製造され、PCV23/APAと称される。
もう1つの実施形態においては、PCV23ワクチン医薬品は、プロトン性溶媒(水性化
学とも称される)中で還元的アミノ化を用いて、CRM197タンパク質を肺炎球菌多糖
(PnP)型(-1、3、-4、-5、-9V、-14、-22Fおよび-33F)に個
別にコンジュゲート化させ、および非プロトン性溶媒(DMSO化学とも称される)中で
還元的アミノ化を用いて、CRM197タンパク質を肺炎球菌多糖(PnP)型(-6A
、-6B、-7F、-8、-10A、-12F、-15A、-15C、-18C、-19
A、-19F、-23B、-23F、-24Fおよび-35B)に個別にコンジュゲート
化させることにより製造される。該ワクチン医薬品は、0.01% カルボキシメチルセ
ルロース(CMC)の存在下の20mM L-ヒスチジン(pH5.8)および150m
M NaClおよび0.1% w/v ポリソルベート-20(PS-20)中で各血清
型4μg/mL(ただし、6Bは8μg/mL)(96μg/mLの総多糖濃度)で製剤
化され、およびアジュバントとしてのリン酸アルミニウムの形態の250μg [Al]
/mLを使用して製造され、PCV23(DMSO+Aq)/APAと称される。
で還元的アミノ化を用いて、CRM197タンパク質をストレプトコッカス・ニューモニ
エ多糖(PnP)型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、
-10A、-11A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-
19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33Fおよび-35Bに個別にコ
ンジュゲート化させることにより製造され、20mM L-ヒスチジン(pH5.8)、
150mM NaClおよび0.1% w/v ポリソルベート-20(PS-20)中
で各血清型4μg/mLまたは8μg/mL(それぞれ96μg/mLまたは192μg
/mLの総多糖濃度)で製剤化され、「PCV24 unadj」と称される。もう1つ
の特定の実施形態においては、多価免疫原性組成物PCV24は、20mM L-ヒスチ
ジン(pH5.8)、150mM NaClおよび0.2% w/v ポリソルベート-
20(PS-20)、そして更に250μg [Al]/mL(アジュバントとしてリン
酸アルミニウムアジュバントの形態)中で各血清型4μg/mL(96μg/mLの総多
糖濃度)で製剤化される。これは「PCV24/APA」と称される。
のバルク多糖濃度のバッチ体積および濃度に基づいて計算した。個々のコンジュゲートを
ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびポリソルベート-20(PS-20)の溶液に加えて
、2×~4×コンジュゲート混合物を得た。該コンジュゲート混合物を含有する製剤容器
を、マグネチックスターラーを使用して混合し、別の容器内に滅菌濾過する。滅菌濾過し
た2×~4×混合物を、リン酸アルミニウムアジュバントを含有する別の容器に加え、ま
たは生理食塩水で希釈して、所望の目標総多糖、賦形剤およびAPAアジュバント(必要
な場合)濃度を得る。ついで製剤をガラスバイアルまたはシリンジ内に充填し、2~8℃
で貯蔵する。
マウスにおけるPCV22免疫原性および機能的抗体
若い雌Balb/cマウス(6~8週齢、n=10/群)を第0日、第14日および第
28日に0.1mLの22価肺炎球菌コンジュゲートワクチン(PCV22/APAまた
は非アジュバント化PCV22)で免疫化した。PCV22を各肺炎球菌多糖0.08μ
g(1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18
C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B)および0.1
6μg(6B)(全てはCRM197にコンジュゲート化されていた)で非アジュバント
化形態または5μgのリン酸アルミニウムアジュバント(APA)(免疫化ごと)の存在
下で投与した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくと
も毎日、マウスを観察した。ワクチン関連有害事象が認められなかったため、マウスにお
けるワクチン製剤は安全かつ高忍容性であるとみなされた。第52日に、マウスをストレ
プトコッカス・ニューモニエ血清型24Fで気管内チャレンジした。ストレプトコッカス
・ニューモニエの指数増殖期培養物を遠心分離し、洗浄し、滅菌PBS中に懸濁させた。
チャレンジ前に、マウスをイソフルランで麻酔した。0.1mLのPBS中の105 c
fuのストレプトコッカス・ニューモニエを、切歯でまっすぐに吊るしたマウスの喉内に
配置した。舌を穏やかに外側に引っ張り、鼻孔を覆うことにより、該細菌の吸引を誘導し
た。マウスを毎日秤量し、体重減少が開始体重の20%を超えた場合には安楽死させた。
細菌血症を評価するために、24時間、48時間および72時間の時点で採血した。熟練
した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、マウスを少なくとも1日2回
観察した。全ての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関する
指針(Guide for Care and Use of Laboratory
Animals of the National Institutes of He
alth)の推奨事項を厳守して行った。マウス実験プロトコルはメルク(Merck
& Co.,Inc.)の動物管理・使用委員会(Institutional Ani
mal Care and Use Committee)により承認された。
て評価した。このアッセイは、Marcheseら[3]により記載されているヒトアッ
セイに基づいてマウス血清で使用するために開発されたものであり、電気化学的刺激時に
発光するSULFO-TAG(商標)標識を利用するMesoScale Discov
ery(MesoScale Diagnostics,LLC,Gaithersbu
rg,MDの一部門)により開発された技術を用いる。SULFO-TAG(商標)標識
抗マウスIgGを、マウス血清サンプルを試験するための二次抗体として使用した。ww
w.vaccine.uab.eduに既に記載されているプロトコル、ならびにアラバ
マ大学(UAB)研究財団[Alabama(UAB)Research Founda
tion]により所有されライセンスされているOpsotiter(登録商標)3ソフ
トウェアに基づく多重オプソニン食作用アッセイ(MOPA)により、機能的抗体を決定
した[1,2]。
価を決定した。PCV22は、該ワクチンでの1、2および3回の免疫化の後、全ての血
清型に関して、マウスにおける抗体価を生成した(図1)。IgG力価により実証されて
いるとおり、PCV22は血清型15Bに対する交差反応性を示した(図1)。APAと
共に製剤化されたPCV22は、PD2(データ非表示)およびPD3(図2)のマウス
において、非アジュバント化PCV22と比較して、より高い免疫原性をもたらす傾向に
あった。
いて試験して機能的抗体価を決定した。PCV22は、該ワクチンでの3回の免疫化の後
、ワクチン型細菌血清型を殺滅する機能的抗体価をマウスにおいて生成した(図3)。A
PAと共に製剤化されたPCV22は、IgG力価(図2)と同様に、PD2(データ非
表示)およびPD3(図4)において、非アジュバント化PCV22と比較して、より高
い機能的抗体力価をもたらす傾向にあった。
ンジから防御された(図5)。マンテル・コックス(Mantel Cox)対数順位検
定は、非アジュバント化PCV22(PCV22 unadj)群とPCV22/APA
群との両方が、ナイーブ群と比較して、チャレンジから有意に防御されることを示した(
P<0.0001)。同様に、両方のPCV22免疫化マウス群は細菌血症をほとんど又
は全く示さず、これは、ナイーブ群と比較して有意に少なかった(データ非表示)。
ウサギにおけるPCV22免疫原性および機能的抗体
成体New Zealand(ニュージーランド)白ウサギ(NZWR、n=5/群)
を、第0日および第14日(交互の側)に、0.1mLの22価肺炎球菌コンジュゲート
ワクチン(PCV22/APAまたは非アジュバント化PCV22)で筋肉内(IM)免
疫化した。PCV22を各肺炎球菌多糖0.08μg(1、3、4、5、6A、7F、9
V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B
、23F、24F、33F、35B)および0.16μg(6B)(全てはCRM197
にコンジュゲート化されていた)で非アジュバント化形態または5μgのリン酸アルミニ
ウムアジュバント(APA)(免疫化ごと)の存在下で投与した。研究開始前(免疫前)
ならびに第14日(PD1)および第28日(PD2)に血清を収集した。熟練した動物
管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、NZWRを観察した
。ワクチン関連有害事象が認められなかったため、NZWRにおけるワクチン製剤は安全
かつ高忍容性であるとみなされた。全ての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の
管理および使用に関する指針(Guide for Care and Use of
Laboratory Animals of the National Insti
tutes of Health)の推奨事項を厳守して行った。NZWR実験プロトコ
ルはメルク(Merck & Co.,Inc.)およびコバンス(Covance)(
Denver,PA)の両方の動物管理・使用委員会(Institutional A
nimal Care and Use Committee)により承認された。
て評価した。このアッセイは、Marcheseら[3]により記載されているヒトアッ
セイに基づいてウサギ血清で使用するために開発されたものであり、電気化学的刺激時に
発光するSULFO-TAG(商標)標識を利用するMesoScale Discov
ery(MesoScale Diagnostics,LLC,Gaithersbu
rg,MDの一部門)により開発された技術を用いる。SULFO-TAG(商標)標識
抗ウサギIgGを、NZWR血清サンプルを試験するための二次抗体として使用した。w
ww.vaccine.uab.eduに既に記載されているプロトコル、ならびにアラ
バマ大学(UAB)研究財団[Alabama(UAB)Research Found
ation]により所有されライセンスされているOpsotiter(登録商標)3ソ
フトウェアに基づく多重オプソニン食作用アッセイ(MOPA)により、機能的抗体を決
定した[1,2]。
験した。PCV22は、該ワクチンでの免疫化の後、全ての血清型に対するウサギにおけ
る抗体価を生成した(図6)。PCV22でのウサギの免疫化は、血清型15B多糖に結
合する抗体をも生成する(図6)。ウサギにおいては、PCV22と共にAPAを配合す
る利点はなかった。なぜなら、PD2において、(血清型1)非アジュバント化PCV2
2と比較して、免疫原性が同等以下だったからである(図7)。
ウサギ血清を個別に試験した。PCV22は、該ワクチンでの2回の免疫化の後、ワクチ
ン型細菌血清型を殺滅する機能的抗体価をウサギにおいて生成した(図8)。非アジュバ
ント化PCV22は、APAと共に製剤化されたPCV22と比較して、血清型4ではP
D1(データ非表示)において、そして血清型1、3および4ではPD2において、より
高い機能的抗体価を示した。APAと共に製剤化されたPCV22は、非アジュバント化
PCV22と比較して、血清型のほとんどに関して、PD1(データ非表示)およびPD
2において、より高い機能的抗体価を示さなかった(図8)。
乳児アカゲザルにおけるPCV23免疫原性
乳児アカゲザル(IRM、2~3月齢、n=8~9/群)を、第0日、第28日および
第56日に、0.1mLの23価肺炎球菌コンジュゲートワクチン(PCV23)で筋肉
内免疫化した。PCV23を総肺炎球菌多糖9.6μg(0.4μgの1、3、4、5、
6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、
22F、23B、23F、24F、33Fおよび35Bならびに0.8μgの6B;全て
はCRM197にコンジュゲート化されている)で、非アジュバント化形態または免疫化
ごとに25μgのリン酸アルミニウムアジュバント(APA)と共に製剤化された形態で
投与した。前記と同じスケジュールに従い、PCV15を総肺炎球菌多糖6.4μg(0
.4μgの1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F
、23Fおよび33Fならびに0.8μgの6B;全てはCRM197にコンジュゲート
化されており、免疫化ごとに25μgのAPAが配合される)で1つの四頭筋に投与し、
0.1mLのPCV8(0.4μgの8、10A、12F、15A、15C、23B、2
4Fおよび35B;全てはCRM197にコンジュゲート化されており、免疫化ごとに2
5μgのAPAが配合される)を別の四頭筋に投与した。研究開始前(免疫前、第0日)
ならびに第14日(PD1)、第28日、第42日(PD2)、第56日および第70日
(PD3)に血清を収集した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関
して、少なくとも毎日、IRMを観察した。全ての動物実験は、米国国立衛生研究所の実
験動物の管理および使用に関する指針(Guide for Care and Use
of Laboratory Animals of the National I
nstitutes of Health)の推奨事項を厳守して行った。実験プロトコ
ルはメルク(Merck & Co.,Inc.)およびニューイベリア研究所(New
Iberia Research Center)の動物管理・使用委員会(Inst
itutional Animal Care and Use Committee)
により承認された。
関して評価した。このアッセイは、MarcheseらおよびSkinnerら[3,4
]により記載されているヒトアッセイに基づいてアカゲザル血清で使用するために開発さ
れたものであり、電気化学的刺激時に発光するSULFO-TAG(商標)標識を利用す
るMesoScale Discovery(MesoScale Diagnosti
cs,LLC,Gaithersburg,MDの一部門)により開発された技術を用い
る。SULFO-TAG(商標)標識抗ヒトIgGを、アカゲザル血清サンプルを試験す
るための二次抗体として使用した。
全ての血清型に関して抗体価を生成した(図9A~9D)。多糖コンジュゲート15A-
CRM197および15C-CRM197を含有するPCV23は、ECLにおいて実証
されているとおり、15Bに対する交差反応性をももたらすことにも注目すべきである(
図9A~9D)。PCV23は、IRMにおいて、1用量のワクチンで免疫原性であった
(図9A~9D)。
3より高い、血清型22Fに関する免疫原性を示し、一方、PCV23(DMSO+Aq
)/APAは、PD1において、非アジュバント化PCV23より高い、血清型1および
血清型15Cに関する免疫原性を示した(図10A)。PCV23(DMSO)/APA
製剤は、PD2において、非アジュバント化PCV23より高い、血清型18Cに関する
免疫原性を示した(図10B)。PCV23(DMSO+Aq)/APAは、PD2にお
いて、大多数の血清型(1、3、4、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、
15C、18C、19F、22Fおよび23F)に関して、非アジュバント化PCV23
より高い免疫原性を示した(図10B)。PCV23(DMSO+Aq)/APAは、P
D3において、非アジュバント化PCV23より高い、血清型1、4および9Vに関する
免疫原性を示した(図10C)。
るPCV15/APA+PCV8/APAの共投与でワクチン接種されたIRMは、PD
1において、多数の免疫原性の差異を示さなかった。ただし、血清型10Aは、共投与群
において、より高い免疫原性を示した(図11A)。しかし、PCV23(DMSO+A
q)/APAでワクチン接種されたIRMは、血清型1、3、4、5、7F、8、9V、
14、15A、15B、15C、18C、19F、22F、23Bおよび23Fの大多数
に関して、PCV15/APA+PCV8/APAの共投与より高いPD2免疫原性を示
した(図11B)。PD3においては、それらの2つのワクチンの間で免疫原性の差異は
認められなかった(図11C)。
たIRMにおける血清型23Bを除く全ての血清型に関して、PCVの全てが、免疫前血
清と比較して、PD1における一次免疫応答を引き起こした(図12A)。評価された全
てのPCVは、全ての血清型に関して、免疫前血清と比較して、PD2およびPD3にお
ける、有意に高い抗体価を生成した(図12Bおよび12C)。PCVの第2用量は、非
アジュバント化PCV23、PCV23(DMSO)/APAおよびPCV15/APA
+PCV8/APAで免疫化されたIRMにおける血清型3および血清型1を除く全ての
血清型に関して、PD1と比較して、PD2からの抗体価の増加を引き起こす(図12D
)。PCVの第3用量は、大多数の血清型に関して、抗体価の増加をもたらすが、例外的
に、PCV23(DMSO+Aq)/APAで免疫化されたIRMにおいては、PD2と
比較してPD3における減少が認められ、このことは、PCV23(DMSO+Aq)/
APAで免疫化されたIRMがPD2において最大抗体応答に達したことを示唆している
(図12E)。
New Zealand白ウサギおよび幼児アカゲザルにおけるPCV24免疫原性
New Zealand白ウサギ(NZWR、n=8/群)を、第0日および第14日
に、0.1mLの24価肺炎球菌コンジュゲートワクチン(PCV24)で筋肉内免疫化
した。PCV24を総肺炎球菌多糖9.6μg(0.4μgの1、3、4、5、6A、6
B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、deOAc15B、18
C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;全てはC
RM197にコンジュゲート化されている)を投与した。該PCV24は免疫化ごとにリ
ン酸アルミニウムアジュバント(APA、25μg)と共に製剤化された。研究開始前(
免疫前、第0日)ならびに第14日(PD1)および第28日(PD2)に、血清を収集
した。熟練した動物管理スタッフが、疾患または苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、
NZWRを観察した。
に、0.1mLの24価肺炎球菌コンジュゲートワクチン(PCV24)で筋肉内免疫化
した。PCV24を総肺炎球菌多糖9.6μg(0.4μgの1、3、4、5、6A、6
B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、deOAc15B、18
C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35B;全てはC
RM197にコンジュゲート化されている)を投与した。該PCV24は免疫化ごとにリ
ン酸アルミニウムアジュバント(APA、25μg)と共に製剤化された。研究開始前(
免疫前、第0日)ならびに第14日(PD1)、第28日、第42日(PD2)、第56
日および第70日(PD3)に、血清を収集した。熟練した動物管理スタッフが、疾患ま
たは苦痛の兆候に関して、少なくとも毎日、IRMを観察した。全ての動物実験は、米国
国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関する指針(Guide for Car
e and Use of Laboratory Animals of the N
ational Institutes of Health)の推奨事項を厳守して行
った。実験プロトコルはメルク(Merck & Co.,Inc.)およびニューイベ
リア研究所(New Iberia Research Center)の動物管理・使
用委員会(Institutional Animal Care and Use C
ommittee)により承認された。
関して評価した。このアッセイは、MarcheseらおよびSkinnerら[3,4
]により記載されているヒトアッセイに基づいてアカゲザル血清で使用するために開発さ
れたものであり、電気化学的刺激時に発光するSULFO-TAG(商標)標識を利用す
るMesoScale Discovery(MesoScale Diagnosti
cs,LLC,Gaithersburg,MDの一部門)により開発された技術を用い
る。SULFO-TAG(商標)標識抗ヒトIgGを、アカゲザル血清サンプルを試験す
るための二次抗体として使用し、SULFO-TAG(商標)標識抗ウサギIgGをNe
w Zealand白ウサギサンプルのために使用した。
コル、ならびにアラバマ大学(UAB)研究財団[Alabama(UAB)Resea
rch Foundation]により所有されライセンスされているOpsotite
r(登録商標)3ソフトウェアに基づく多重オプソニン食作用アッセイ(MOPA)によ
り決定した[1,2]。
生成した(図13A)。多糖コンジュゲート15A-CRM197、deOAc15B-
CRM197、6A-CRM197、6B-CRM197を含有するPCV24は、EC
Lにおいて実証されているとおり、15Bおよび6Cに対する交差反応性をももたらすこ
とにも注目すべきである(図13A)。
、NZWR血清を個別に試験した。PCV24は、全てのワクチン型細菌血清型を殺滅す
る機能的抗体価をNZWRにおいて生成した(図13B)。
成した(図14A)。多糖コンジュゲート15A-CRM197、deOAc15B-C
RM197、6A-CRM197、6B-CRM197を含有するPCV24は、ECL
において実証されているとおり、15Bおよび6Cに対する交差反応性をももたらすこと
にも注目すべきである(図14A)。
、IRM血清を個別に試験した。PCV24は、ワクチン型細菌血清型を殺滅する機能的
抗体価をIRMにおいて生成した(図14B)。ただし、33Fは例外的に、ECLにお
いて、より低いPD3/Pre結合抗体価を示した。しかし、PCV24/APAをNe
w Zealand白ウサギにおいて評価したところ、PD2 33F OPA力価は免
疫前力価より58倍以上高かった(図13B)。
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実施例52
材料および方法
遊離多糖試験
コンジュゲートサンプルにおける遊離多糖(CRM197にコンジュゲート化されてい
ない多糖)を、まず、遊離タンパク質およびコンジュゲートをデオキシコラート(DOC
)および塩酸で沈殿させることにより測定する。ついで沈殿物を濾去し、濾液をHPSE
C/UV/MALS/RIにより遊離多糖濃度に関して分析する。遊離多糖を、HPSE
C/UV/MALS/RIにより測定された全多糖に対する百分率として計算する。
コンジュゲートサンプル中の遊離多糖、多糖-CRM197コンジュゲートおよび遊離
CRM197をミセル界面動電クロマトグラフィー(MEKC)モードのキャピラリー電
気泳動により分離する。簡潔に説明すると、サンプルを、25mM ボラート、100m
M SDS(pH9.3)を含有するMEKCランニングバッファーと混合し、前処理さ
れたベアフューズド(bare-fused)シリカキャピラリーで分離する。分離を2
00nmでモニターし、遊離CRM197をCRM197標準曲線で定量する。遊離タン
パク質の結果を、HPSEC/UV/MALS/RI法により決定された総タンパク質含
有量に対する百分率として表す。
度分析
コンジュゲートサンプルを注入し、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)
により分離した。紫外線(UV)、多角度光散乱光散乱(MALS)および屈折率(RI
)検出器を直列で使用して、検出を行った。吸光係数を使用して、UV280からタンパ
ク質濃度を計算した。mL/gで表された溶質濃度の変化に伴う溶液の屈折率の変化であ
るdn/dc係数を使用して、RIシグナル(タンパク質と多糖との両方が寄与)から多
糖濃度をデコンボリューションした。測定濃度および光散乱情報(サンプルピーク全体に
わたるもの)を用いて、Astraソフトウェア(Wyatt Technology
Corporation,Santa Barbara,CA)により、サンプルの平均
分子量を計算した。多分散分子の分子量の平均値には複数の形態が存在する。例えば、数
平均分子量Mn、重量平均分子量Mwおよびz平均分子量Mz(Molecules,2
015,20,10313-10341)が挙げられる。特に示されていない限り、分子
量は重量平均分子量である。
質におけるリジン消費の決定
Waters AccQ-Tagアミノ酸分析(AAA)を用いて、コンジュゲートサ
ンプルにおけるコンジュゲート化の度合を測定した。Eldexワークステーションにお
いて気相酸加水分解を用いて、サンプルを加水分解して、担体タンパク質をそれらの成分
アミノ酸に分解した。6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバマー
ト(AQC)を使用して、遊離アミノ酸を誘導体化した。ついで、C18カラム上のUV
検出付きUPLCを使用して、誘導体化サンプルを分析した。リジン以外の代表的なアミ
ノ酸を使用して、平均タンパク質濃度を得た。コンジュゲートにおけるリジンの平均測定
量と出発タンパク質におけるリジンの予想量との差により、コンジュゲート化中のリジン
消費(すなわち、リジン損失)を決定した。
Claims (6)
- 24個の異なるストレプトコッカス・ニューモニエ(S.pneumoniae)多糖担体タンパク質コンジュゲートを含む、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)および肺炎球菌肺炎(PP)の予防のための多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化された特定のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型が1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、脱O-アセチル化15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35Bであり、担体タンパク質がCRM197であり、該組成物が、いずれの他のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の多糖を含有する多糖担体タンパク質コンジュゲートをも含まない、多価免疫原性組成物。
- アジュバントを含む、請求項1に記載の多価免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウムアジュバントである、請求項2に記載の多価免疫原性組成物。
- ストレプトコッカス・ニューモニエ(S.pneumoniae)多糖担体タンパク質コンジュゲートを含む、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)および肺炎球菌肺炎(PP)の予防のための多価免疫原性組成物であって、該コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲート化された特定のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型の多糖を含み、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型が1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、脱O-アセチル化15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33Fおよび35Bからなり、担体タンパク質がCRM197である、多価免疫原性組成物。
- アジュバントを含む、請求項4に記載の多価免疫原性組成物。
- アジュバントが、リン酸アルミニウムアジュバントである、請求項5に記載の多価免疫原性組成物。
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