BR112021011961A2 - Composições compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína de streptococcus pneumoniae e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

composições compreendendo conjugados de polissacarídeoproteína de streptococcus pneumoniae e métodos de uso dos mesmos. a presente invenção está relacionada a composições imunogênicas multivalentes compreendendo mais do que um conjugado de polissacarídeo-proteína de s. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de s. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de s. pneumoniae são como definidos na presente invenção. em algumas modalidades, pelo menos um dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico. em modalidades adicionais, cada um dos conjugados de polissacarídeos-proteína é formado por uma reação de conjugação que compreende um solvente aprótico. também são fornecidos métodos para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente humano compreendendo administrar as composições imunogênicas multivalentes da presente invenção ao paciente. as composições imunogênicas multivalentes são úteis para fornecer proteção contra infecção por s. pneumoniae e/ou doenças pneumocócicas causadas por s. pneumoniae. as composições da presente invenção também são úteis como parte de regimes de tratamento que fornecem proteção complementar para pacientes que foram vacinados com uma vacina multivalente indicada para a prevenção de doença pneumocócica.

Description

COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO CONJUGADOS DE POLISSACARÍDEO- PROTEÍNA DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que têm conjugados de polissacarídeo-proteína distintos. Cada conjugado consiste em um polissacarídeo capsular preparado a partir de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, preferencialmente CRM197. As composições imunogênicas fornecem abrangência ampla contra doença pneumocócica. O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e que é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A referida cópia de ASCII, criada em 3 de dezembro de 2019, é denominada 24683WOPCT-SEQTXT- 03DEC2019 e tem 6 quilobites de tamanho.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O Streptococcus pneumoniae é uma bactéria gram-positiva e a causa mais comum de doença bacteriana invasiva (como pneumonia, bacteremia, meningite e Otite média) em recém-nascidos e crianças pequenas. Pneumocócico é encapsulado com um polissacarídeo quimicamente ligado que confere especificidade de sorotipo. Há mais de 90 sorotipos de pneumocócicos conhecidos, e a cápsula é o principal determinante de virulência para pneumocócicos, visto que a cápsula não apenas protege a superfície interna das bactérias contra complemento, mas o próprio também é imunogenicamente insatisfatório. Os polissacarídeos são antígenos independentes de célula T, e, na maioria dos casos, podem não ser processados ou estarem presentes em moléculas de MHC para interagir com as células T. Os mesmos podem, no entanto, estimular o sistema imunológico através de um mecanismo alternativo que envolve ligação cruzada de receptores de superfície em células B.

As vacinas de polissacarídeo pneumocócico multivalentes que foram licenciadas por muitos anos se provaram valiosas em prevenir doença pneumocócica em adultos, particularmente, os idosos e aqueles com alto risco.

No entanto, recém-nascidos e crianças pequenas responderam insatisfatoriamente a polissacarídeos pneumocócicos não conjugados.

A vacina de conjugado pneumocócico, Prevnar®, que contém os 7 sorotipos mais frequentemente isolados (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que causam doença pneumocócica invasiva em crianças pequenas e recém-nascidos no momento, foi primeiro licenciada nos Estados Unidos em fevereiro de 2000. Após o uso universal de Prevnar® nos Estados Unidos, houve uma redução significativa em doença pneumocócica invasiva em crianças devido aos sorotipos presentes em Prevnar®. Ver Centros para Controle e Prevenção de Doença, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36): 893 a 897. No entanto, há limitações em abrangência de sorotipo com Prevnar® em determinadas regiões do mundo e alguma evidência de determinados sorotipos emergentes no Estados Unidos (por exemplo, 19A e outros). Ver O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159: 634 a 644; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348: 1.737 a 1.746; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354: 1.455 a 1.463; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196: 1.346 a 1.354; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48: S181 a S189. Publicação de Pedido de Patente US 2006/0228380 descreve uma vacina pneumocócica conjugada polissacarídeo-proteína 13-valente incluindo sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F.

Publicação de Pedido de Patente chinesa CN 101590224 A descreve uma vacina pneumocócica conjugada polissacarídeo-proteína 14-valente incluindo sorotipos 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F.

Outros PCVs abrangeram 7, 10, 11 ou 13 dos sorotipos contidos em PCV-15 (Publicação US 2011/0195086), mas observou-se interferência imunológica para alguns sorotipos (por exemplo, proteção inferior para sorotipo 3 em PCV-11 da GSK) e taxas de resposta inferiores para sorotipo 6B em PCV-13 da Pfizer (PREVNAR® 13). Ver Prymula et al., 2006, Lancet 367: 740 a 748 e Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugado Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugado Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, apresentado no 48o ICAAC/ISDA Anual, 46o Encontro Anual, Washington Capital, 25 a 28 de outubro de 2008. As vacinas pneumocócicas multivalentes atuais foram eficazes em reduzir a incidência de doença pneumocócica associada àqueles sorotipos presentes nas vacinas. No entanto, a prevalência dos sorotipos que expressam pneumocócicos não presente nas vacinas atualmente disponíveis tem sido crescente. Consequentemente, há uma necessidade por composições de vacina pneumocócica adicionais que podem fornecer proteção contra sorotipos pneumocócicos não presentes em vacinas atualmente disponíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B;

b) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; c) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; d) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; e) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; f) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; g) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; h) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; j) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; k) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; l) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; m) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; n) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; o) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B,

23F, 24F, 33F e 35B; p) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; q) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; r) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; s) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; t) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; u) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; v) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; w) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; x) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; y) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; z) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; e aa) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo 22 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os polissacarídeos são preparados a partir de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo 22 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo 23 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os polissacarídeos são preparados a partir de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo 23 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que cada conjugado de polissacarídeo-proteína distinto compreende um polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B,

respectivamente, e em que a proteína carreadora é CRM197. A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo 24 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os polissacarídeos são preparados a partir de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

A composição imunogênica multivalente compreendendo 24 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que cada conjugado de polissacarídeo-proteína distinto compreende um polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, respectivamente, e em que a proteína carreadora é CRM197. A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo 24 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os polissacarídeos são preparados a partir de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo 24 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que cada conjugado de polissacarídeo-proteína distinto compreende um polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, respectivamente, e em que a proteína carreadora é CRM197. A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo até 33 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, incluindo adicionalmente um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove sorotipos de S. pneumoniae adicionais selecionados a partir de 7C, 9N, 16F, 21, 23A, 31, 34, 35F e 38. A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, incluindo adicionalmente um, dois, três, quatro, cinco ou seis sorotipos de S. pneumoniae adicionais selecionados a partir de 7C, 9N, 16F, 23A, 35F e 38. A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo até 33 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, incluindo adicionalmente um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove sorotipos de S. pneumoniae adicionais selecionados a partir de 7C, 9N, 16F, 21, 23A, 31, 34, 35F e 38. A presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, incluindo adicionalmente um, dois, três, quatro, cinco ou seis sorotipos de S. pneumoniae adicionais selecionados a partir de 7C, 9N, 16F, 23A, 35F e 38. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico, por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO). Em modalidades específicas, cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico, por exemplo, (DMSO). Também são fornecidos métodos para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente humano compreendendo administrar as composições imunogênicas multivalentes da presente invenção ao paciente.

Em algumas modalidades dos métodos da presente invenção, o paciente foi anteriormente tratado com uma vacina pneumocócica multivalente. A composição imunogênica multivalente da presente invenção pode ser usada como parte de um regime de tratamento com uma vacina pneumocócica complementar diferente. Consequentemente, a presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente humano compreendendo administrar uma composição imunogênica multivalente da presente invenção ao paciente, compreendendo adicionalmente administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente em qualquer ordem. Em modalidades particulares, a vacina pneumocócica multivalente é compreendida de múltiplos conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora. Em outras modalidades, a vacina pneumocócica multivalente é compreendida de polissacarídeos capsulares não conjugados. A presente invenção também fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae fornecem reação cruzada para outros sorotipos selecionados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIGURA 1. Tituladores de diluição de anticorpo IgG de pré-imunização (Pre), de pós-dose 1 (PD1), 2 (PD2) e 3 (PD3), como determinado por ECL para camundongos imunizados com PCV22 sem adjuvante (PCV22 sem adj) ou formulado com adjuvante de fosfato de alumínio (PCV22/APA). Leitura da esquerda para direita; Pre PCV22 sem adj, Pre PCV22/APA, PD1 PCV22 sem adj, PD1 PCV22/APA, PD2 PCV22 sem adj, PD2 PCV22/APA, PD3 PCV22 sem adj, e PD3

PCV22/APA.

FIGURA 2. Razão de titulador de diluição de ECL de PCV22/APA em comparação ao PCV22 sem adjuvante (PCV22 sem adj) a PD3. FIGURA 3. Tituladores de diluição de OPA sorotipo-específica- específica (pré-imune, PD1, PD2, PD3) para camundongos imunizados com PCV22 sem adjuvante (PCV22 sem adj) ou formulado com APA (PCV22/APA). Leitura da esquerda para direita; Pre PCV22 sem adj, Pre PCV22/APA, PD1 PCV22 sem adj, PD1 PCV22/APA, PD2 PCV22 sem adj, PD2 PCV22/APA, PD3 PCV22 sem adj, e PD3 PCV22/APA.

FIGURA 4. Razão de titulador de diluição de OPA de PCV22/APA em comparação ao PCV22 sem adjuvante (PCV22 sem adj) a PD3. FIGURA 5. Camundongos PCV22 imunizados são protegidos de desafio intratraqueal de 24F de S. pneumoniae.

FIGURA 6. Titulador de diluição de anticorpo IgG de pré-imunização (Pre), de PD1 e PD2 como determinado por ECL para coelhos imunizados com PCV22 sem adjuvante ou PCV22/APA.

As barras de erro representam os intervalos de confiança (CI) de 95% do titulador médio geométrico (GMT). Leitura da esquerda para a direita; Pre PCV22 sem adj, Pre PCV22/APA, PD1 PCV22 sem adj, PD1 PCV22/APA, PD2 PCV22 sem adj e PD2 PCV22/APA.

FIGURA 7. Relação de GMT de ECL de PCV22/APA em comparação ao PCV22 sem adjuvante a PD2. As barras de erro representam os intervalos de confiança (CI) de 95%. FIGURA 8. Titulador de diluição de OPA sorotipo-específica-específica (pré-imunológico “Pre” e PD2) para coelhos imunizados com PCV22 sem adjuvante ou PCV22/APA.

As barras de erro representam a variação em títulos de anticorpo funcional para cinco coelhos.

FIGURA 9. Tituladores de diluição de anticorpo de IgG pré-

imunológicos (Pre), de PD1, PD2 e PD3 como determinado por ECL para IRMs imunizados com A) PCV23 sem adjuvante, B) PCV23 (DMSO)/APA, C) PCV23(DMSO+Aq)/APA e D) PCV15/APA + PCV8/APA.

As barras de erro representam os intervalos de confiança (CI) de 95% do titulador médio geométrico (GMT). FIGURA 10. Comparação de respostas de anticorpo de ECL em IRMs (8 a 9 por grupo) seguindo a vacinação com PCV23 com ou sem APA.

Os símbolos indicam razões em A) PD1, B) PD2 ou C) PD3. As razões de GMT com barras de erro representam os CIs de 95%. FIGURA 11. Comparação de respostas de anticorpo de ECL em IRMs (9 por grupo) após a vacinação com PCV23 (DMSO+Aq)/APA ou coadministrada com PCV15/APA + PCV8/APA.

Os símbolos indicam razões em A) PD1, B) PD2 e C) PD3. As relações de GMT com barras de erro representam os CIs de 95%. FIGURA 12. Comparação de respostas de anticorpo impulsionada por ECL em IRMs (8 a 9 por grupo) seguindo a vacinação com PCV23 sem adjuvante, PCV23(DMSO)/APA, PCV23(DMSO+Aq)/APA ou PCV15/APA + PCV8/APA.

A) PD1/Pre, B) PD2/Pre, C) PD3/Pre, D) PD2/PD1 e E) PD3/PD2. Os símbolos são relações de GMT com barras de erro que representam os CIs de 95%. FIGURA 13. (A) Tituladores de diluição de anticorpo IgG de pré- imunológicos (Pre), de pós-dose 1 (PD1) e 2 (PD2) como determinado por ECL para coelhos Nova Zelândia brancos imunizados com PCV24 formulado com adjuvante de fosfato de alumínio (PCV24/APA). As barras de erro representam os intervalos de confiança (CI) de 95% do titulador médio geométrico (GMT). (B) Titulador de diluição de OPA sorotipo-específica (pré-imunológico e PD2) para NZWRs imunizados com PCV24/APA.

As barras de erro representam a variação em títulos de anticorpo funcional para oito NZWRs.

FIGURA 14. (A) Tituladores de diluição de anticorpo de IgG de pré-

imunização (Pre), de pós-dose 1 (PD1), 2 (PD2) e 3 (PD3) como determinado por ECL para macacos Rhesus recém-nascidos (IRMs) imunizados com PCV24 formulado com adjuvante de fosfato de alumínio (PCV24/APA). As barras de erro representam os intervalos de confiança (CI) de 95% do titulador médio geométrico (GMT). (B) Titulador de diluição de OPA sorotipo-específica (pré- imunológico e PD3) para IRMs imunizados com PCV24/APA. As barras de erro representam a variação em títulos de anticorpo funcional para cinco IRMs.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são como definido na presente invenção. Em algumas modalidades a presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; b) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; c) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B;

d) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; e) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; f) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; g) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; h) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; j) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; k) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; l) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; m) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; n) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; o) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; p) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; q) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F,

23B, 23F, 24F, 33F e 35B; r) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; s) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; t) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; u) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; v) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; w) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; x) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; y) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; z) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; aa) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; bb) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; cc) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; dd) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39;

ee) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ff) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; gg) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; hh) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; jj) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; kk) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ll) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; mm) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; nn) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; oo) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; pp) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; qq) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; rr) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B,

23F, 24F, 33F, 35B e 39; ss) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; tt) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; uu) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; vv) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ww) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; xx) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; yy) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; zz) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; aa) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; e bb) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39. Em algumas modalidades, a composição imunogênica multivalente compreende sorotipos pneumocócicos selecionados a partir do grupo que consiste em: i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou ii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou iii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou iv)

1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em uma modalidade particular, uma composição imunogênica multivalente da presente invenção compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae pneumocócicos em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos: i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou ii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou iii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Constatou-se que as referidas composições são imunogênicas em camundongos, coelhos e/ou macacos e geram anticorpo funcional que matou cepas bacterianas do tipo da vacina em todas as doses testadas.

As composições imunogênicas multivalentes da presente invenção são úteis para imunizar um paciente contra sorotipos de S. pneumoniae do tipo de vacina e/ou como parte de um regime de tratamento com vacina pneumocócica complementar diferente (ou vacinas). Consequentemente, a presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente humano compreendendo administrar uma composição imunogênica multivalente da presente invenção ao paciente, e compreendendo adicionalmente administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente, em qualquer ordem.

Em outras modalidades, as composições imunogênicas multivalentes da presente invenção são administradas a um paciente que foi anteriormente imunizado com uma vacina pneumocócica multivalente diferente.

Nas modalidades da presente invenção, os conjugados de pelo menos um sorotipo pneumocócico são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico como DMSO.

Em modalidades adicionais, a composição imunogênica multivalente compreende conjugados pneumocócicos que são, cada um, preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico.

O uso de solvente de DMSO aumenta as associações covalentes de polissacarídeo a proteína através de consumo direto de resíduos de lisina na superfície da proteína carreadora.

A associação covalente aumentada tem um benefício direto para aumentar a estabilidade do conjugado de polissacarídeo-proteína de composições imunogênicas multivalentes compreendendo antígenos de polissacarídeo conjugados em DMSO.

I.

Definições e Abreviações Como usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações anexas, as seguintes abreviações se aplicam: APA adjuvante de fosfato de alumínio APC célula apresentadora de antígeno CI intervalo de confiança DMSO dimetilsulfóxido DS Substância Farmacológica de polissacarídeo-proteína GMC concentração média geométrica GMT titulador médio geométrico HPSEC cromatografia por exclusão de tamanho de alta eficiência IM intramuscular ou intramuscularmente IRM macaco rhesus recém-nascido LOS lipo-oligossacarídeo LPS lipopolissacarídeo MALS dispersão de luz em múltiplos ângulos MBC conjugado de volume monovalente

Mn peso molecular numérico médio MOPA ensaios opsonofagocíticos multiplexados MW peso molecular NMWCO corte de peso molecular nominal NZWR Coelho Nova Zelândia Branco OPA ensaio de opsonofagocitose PCV vacina cojugada pneumocócica PD1 pós-dose 1 PD2 pós-dose 2 PD3 pós-dose 3 PnPs Polissacarídeo Pneumocócico Ps polissacarídeo PS-20 polissorbato-20 RI índice refratário UV ultravioleta p/v peso por volume De modo que a presente invenção possa ser mais prontamente entendida, determinados termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo.

Salvo especificamente definido em outra parte neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o significado como comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta presente invenção pertence.

Como usado ao longo do relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referências plurais, a menos que o contexto estabeleça claramente o contrário.

A referência a “ou” indica qualquer uma ou ambas as possibilidades, a menos que o contexto indique claramente uma dentre as possibilidades indicadas.

Em alguns casos, “e/ou” foi empregado para destacar qualquer uma ou ambas as possibilidades.

Os termos “solvente aquoso” ou “condições aquosas” quando usados com conjugação, como aminação redutiva, se refere ao uso de água, como o solvente para a reação de conjugação.

A água pode conter tampões e outros componentes exceto que nenhum solvente orgânico está presente.

Os termos “solvente aprótico”, “solvente de DMSO” ou “condições de DMSO” quando usados com conjugação, como aminação redutiva, se refere ao uso de um solvente aprótico ou uma combinação de solventes apróticos, (ou DMSO, como aplicável), como o solvente para a reação de conjugação.

O solvente aprótico pode ter alguma água presente, por exemplo, até 1 %, 2 %, 5 %, 10 % ou 20 %. O termo "compreende" quando usado com a composição imunogênica da presente invenção se refere à inclusão de quaisquer outros componentes, como adjuvantes e excipientes, ou a adição de um ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína que não são especificamente enumerados.

O termo "que consiste em" quando usado com a mistura de conjugado de polissacarídeo-proteína multivalente se refere a uma mistura que têm aqueles conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae particulares e nenhum outro conjugado de polissacarídeo-proteína S. pneumoniae de um sorotipo diferente. "Consiste essencialmente de" e variações como "consiste essencialmente em" ou “que consiste essencialmente em", indicam a inclusão de quaisquer elementos ou grupo de elementos citados, e a inclusão opcional de outros elementos, de natureza similar ou diferente dos elementos citados, que não alteram materialmente as propriedades básicas ou inovadoras do regime de dosagem especificado, método ou composição. "Quantidade eficaz" de uma composição da presente invenção se refere a uma dose exigida para obter anticorpos que reduzem significativamente a probabilidade ou gravidade de infecciosidade de um micróbio, por exemplo, S. pneumoniae, durante um desafio subsequente.

Como usado na presente invenção, a frase “indicado para a prevenção de doença pneumocócica” significa que uma vacina ou composição imunogênica é aprovada por uma ou mais autoridades regulatórias, como a Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA, para a profilaxia de uma ou mais doenças causadas por qualquer sorotipo de S. pneumoniae, incluindo, mas não limitada a: doença pneumocócica geral, pneumonia pneumocócica, meningite pneumocócica, bacteremia pneumocócica, doença invasiva causada por S. pneumoniae, e otite média causada por S. pneumoniae.

Uma “vacina pneumocócica multivalente” é uma preparação farmacêutica compreendendo mais que um agente ativo (por exemplo, polissacarídeo capsular pneumocócico ou conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócico) que fornece imunidade ativa a doença ou condição patológica causada por mais que um sorotipo de S. pneumoniae.

O termo "polissacarídeo" pretende incluir qualquer elemento de sacarídeo antigênico (ou unidade antigênica) comumente usado nas técnicas de vacina imunológica e bacteriana, incluindo, mas não limitado a, um "sacarídeo", um "oligossacarídeo", um "polissacarídeo", um “lipossacarídeo", um "lipo- oligossacarídeo (LOS)", um "lipopolissacarídeo (LPS)", um "glicosilato", um "glicoconjugado" e similares.

O termo “sem adjuvante”, no contexto de uma vacina ou composição imunogênica da presente invenção, significa uma composição de polissacarídeo pneumocócico, incluindo, mas não limitado a, PCV8, PCV15, PCV22, PCV23 e PCV24, em que a composição não contém adjuvante. “PCV8” se refere a uma composição imunogênica que contém polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae (PnPs) -8, -10A, -12F, -15A, -15C, - 23B, -24F e -35B. “PCV15” se refere a uma composição imunogênica que contém polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae (PnPs) -1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, - 9V, -14, -18C, -19A, -19F, -22F, -23F e -33F. “PCV22” se refere a uma composição imunogênica que contém polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae (PnPs) -1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, - 9V, -10A, -12F, -14, -15A, -15C, -18C, -19A, -19F, -22F, -23B, -23F, -24F, -33F e - 35B. “PCV23” se refere a uma composição imunogênica que contém polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae (PnPs) -1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, - 8, -9V, -10A, -12F, -14, -15A, -15C, -18C, -19A, -19F, -22F, -23B, -23F, -24F, -33F e - 35B. “PCV24” se refere a uma composição imunogênica que contém polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae (PnPs) -1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, - 8, -9V, -10A, -11A, -12F, -14, -15A, -15C, -18C, -19A, -19F, -22F, -23B, -23F, -24F, - 33F e -35B. "Nucleotídeo que contém CpG”, "oligonucleotídeo que contém CpG", "oligonucleotídeo de CpG”, e termos similares se referem a uma molécula de nucleotídeo de 6 a 50 nucleotídeos de comprimento que contém uma porção química de CpG não metilada.

Ver, por exemplo, Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297. Os oligonucleotídeos que contêm CpG incluem oligonucleotídeos modificados usando quaisquer ligações internucleosídicas sintéticas, base modificada e/ou açúcar modificado.

Um "adjuvante", como definido na presente invenção, é uma substância que serve para aumentar a imunogenicidade de uma composição imunogênica da presente invenção.

Um adjuvante imunológico pode aumentar uma resposta imunológica a um antígeno que é fracamente imunogênico quando administrado sozinho, por exemplo, induzindo nenhum ou fracos títulos de anticorpo ou resposta imune mediada por células, aumenta títulos de anticorpo ao antígeno e/ou diminui a dose do antígeno eficaz para obter uma resposta imunológica no indivíduo.

Desse modo, os adjuvantes são frequentemente fornecidos para impulsionar a resposta imunológica e são bem conhecidos aos técnicos no assunto.

Um "paciente" (alternativamente referido na presente invenção como "indivíduo") se refere a um mamífero capaz de ser infectado com um S. pneumoniae.

Nas modalidades preferidas, o paciente é um ser humano.

Um paciente pode ser tratado profilática ou terapeuticamente.

O tratamento profilático fornece imunidade protetora suficiente para reduzir a probabilidade ou gravidade de uma infecção pneumocócica ou os efeitos da mesma, por exemplo, pneumonia pneumocócica.

O tratamento terapêutico pode ser desempenhado para reduzir a gravidade ou prevenir a recorrência de uma infecção por S. pneumoniae ou os efeitos clínicos da mesma.

O tratamento profilático pode ser desempenhado com o uso de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção, como descrito na presente invenção.

A composição da presente invenção pode ser administrada à população geral ou àquelas pessoas em um risco aumentado de infecção pneumocócica, por exemplo, os idosos, ou aqueles que vivem com ou cuidam de idosos.

Aqueles “em necessidade de tratamento” incluem aqueles anteriormente expostos a ou infectados com S. pneumoniae, aqueles que foram anteriormente vacinados contra S. pneumoniae, bem como aqueles propensos a ter uma infecção ou qualquer pessoa na qual uma redução na probabilidade de infecção é desejada, por exemplo, os imunocomprometidos, os idosos, as crianças, adultos ou indivíduos saudáveis.

Uma composição imunogênica multivalente "estável" é uma composição que não tem alterações significativas observadas a uma temperatura refrigerada (por exemplo, 2 a 8 °C ou 4 °C) por pelo menos 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 12 meses e/ou 24 meses.

Adicionalmente, uma composição "estável" inclui uma que exiba características desejadas a temperaturas incluindo a 25 °C e 37 °C por períodos que incluem 1 mês, 3 meses, 6 meses, 12 meses e/ou 24 meses.

Os critérios aceitáveis típicos para estabilidade são como a seguir: não mais que cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 % ou cerca de 20 % de variabilidade em um ou mais dos seguintes: (a) o peso molecular numérico médio (Mn) dos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae na composição, (b) peso molecular ponderal médio (Mw) dos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae na composição, (c) concentração de polissacarídeo total na composição, (d) máximo de emissão da composição medida usando espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca em um comprimento de onda de excitação particular, por exemplo, 280 nanômetros, e (e) a intensidade de fluorescência da composição medida usando espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca em um comprimento de onda de excitação particular.

O termo “estável” também pode ser usado para se referir a um conjugado pneumocócico particular em uma composição imunogênica multivalente.

Em tal uso, o termo se refere a um conjugado que exibe as propriedades desejadas ao longo do tempo, a uma temperatura particular, e tais propriedades variam não mais que cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 % ou cerca de 20 % ao longo do tempo e da temperatura observados.

II.

Composições Imunogênicas Multivalentes A presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora.

Os aspectos e as modalidades diferentes das composições imunogênicas multivalentes da presente invenção são descritos, infra.

Em uma modalidade (Modalidade E1), a presente invenção fornece uma composição imunogênica multivalente compreendendo múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae, em que cada um compreende polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em: i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B ou ii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B ou iii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Nas submodalidades de Modalidade E1, a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae.

Como usado na presente invenção, polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 15B de-O-acetilado (DeOAc15B) é substancialmente equivalente a polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 15C e tem espectros de RMN substancialmente idênticos (dados não mostrados). Como usado na presente invenção, polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 15B de-O-acetilado e polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 15C pode, cada um, ter um teor de O- Acetila por unidade de repetição na faixa de 0 a 5 %, ou na faixa de 0 a 4 %, ou na faixa de 0 a 3 %, ou na faixa de 0 a 2 %, ou na faixa de 0 a 1 %, ou na faixa de 0 a 0,5 %, ou na faixa de 0 a 0,1 % ou no teor de O-acetila.

Em um relatório por Spencer B.L., et al., polissacarídeo pneumocócico 15C pode ser ligeiramente O- acetilado (Spencer, B.L. et al., Clin.

Vac.

Immuno. (2017) 24(8): 1 a 13). Desse modo, em qualquer uma das modalidades das composições imunogênicas multivalentes na presente invenção, sorotipo 15B de-O-acetilado (DeOAc15B) pode ser usado no lugar do sorotipo 15C.

Os processos para de-O-acetilação são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como descrito em Rajam et al., Clinical and Vaccine Immunology, 2007, 14(9):1223–1227. Em determinadas modalidades de qualquer uma das composições imunogênicas multivalentes da presente invenção, incluindo a Modalidade E1 e qualquer submodalidade das mesmas, a composição compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

Reatividade Cruzada Em uma modalidade a presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 6C, conjugado a uma proteína carreadora, em que sorotipo 6C de S. pneumoniae fornece reação cruzada contra sorotipos 6A e 6B de S. pneumoniae.

Em uma modalidade a presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 6A, conjugado a uma proteína carreadora, em que sorotipo 6A de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipos 6B e/ou 6C de S. pneumoniae.

Em uma modalidade a presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 6B, conjugado a uma proteína carreadora, em que sorotipo 6B de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipos 6A e/ou 6C de S. pneumoniae.

Em uma modalidade a presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 15C, conjugado a uma proteína carreadora, em que sorotipo 15C de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 15B de S. pneumoniae. Em uma modalidade a presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 15B, conjugado a uma proteína carreadora, em que sorotipo 15B de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 15C de S. pneumoniae. Proteína Carreadora Em modalidades particulares da presente invenção, CRM197 é usado como a proteína carreadora. CRM197 é uma variante não tóxica (isto é, toxoide) de toxina diftérica que tem a seguinte sequência de aminoácidos:

GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI

SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS (SEQ ID NO:1) Em uma modalidade, CRM197 é isolado de culturas de cepa C7 de Corynebacterium diphtheria (197) cultivada em ácidos casamino e meio à base de extrato de levedura. Em outra modalidade, CRM197 é preparado recombinantemente de acordo com os métodos descritos em US 5.614.382. Tipicamente, CRM197 é purificado através de uma combinação de ultrafiltração, precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica.

Em algumas modalidades, CRM197 é preparado em Pseudomonas fluorescens usando Pfenex Expression Technology™ (Pfenex Inc., São Diego, CA). Outras proteínas carreadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas adicionais, como DT (Toxoide diftérico) ou fragmento B de DT (DTFB), TT (toxoide tetânico) ou fragmento C de TT, toxoide pertússico, toxoide colérico (por exemplo, como descrito em WO 2004/083251), E. coli LT, E. coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa.

As proteínas de membrana externa bacteriana como complexo de proteína de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação de transferrina, proteína de superfície pneumocócica A (PspA; Ver WO 02/091998), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), peptidase C5a de streptococcus do Grupo A ou Grupo B, ou proteína D Haemophilus influenzae, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13) incluindo ply detoxificada de alguma maneira, por exemplo, dPLY-GMBS (Ver WO 04/081515) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteínas Pht, por exemplo, fusões de PhtDE, fusões de PhtBE (Ver os WO 01/98334 e WO 03/54007), também podem ser usadas.

Outras proteínas, como ovalbumina, hemocianina lapa buraco de fechadura (KLH - keyhole limpet hemocyanin), albumina sérica bovina (BSA) ou derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D de Haemophilus influenzae; ver, por exemplo, EP 0 594 610 B), ou equivalentes imunologicamente funcionais das mesmas, peptídeos sintéticos (Ver EP0378881 e EP0427347), proteínas de choque térmico (Ver WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas pertússicas (Ver WO 98/58668 e EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores ou hormônios de crescimento (Ver WO 91/01146), proteínas artificiais compreendendo múltiplos epítopos de célula T CD4+ humana de vários antígenos derivados de patógenos (Ver Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:

3.816 a 3.824) como proteína N19 (Ver Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:

4.884 a 4.887), proteínas de captação de ferro (Ver WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (Ver WO 00/61761), e flagelina (Ver Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9) também podem ser usadas como proteínas carreadoras. Outros mutantes de DT podem ser usados como a proteína carreadora, como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Editores: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações reveladas em US 4.709.017 ou US 4.950.740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações reveladas em US 5.917.017 ou Patente US

6.455.673; ou fragmento revelado em US 5.843.711. Tais mutantes de DT também podem ser usados para produzir variantes de DTFB em que as variantes compreendem o fragmento B que contém as regiões de epítopo. Em determinadas modalidades, a proteína carreadora é selecionada a partir do grupo que consiste em: Complexo de Proteína de Membrana Externa (OMPC), toxoide tetânico, toxoide diftérico, proteína D e CRM197. Em algumas modalidades da presente invenção, um segundo carreador pode ser usado para um ou mais dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína na composição imunogênica multivalente. A segunda proteína carreadora é preferencialmente uma proteína que é não tóxica e não reatogênica e obtenível em quantidade e pureza suficientes. A segunda proteína carreadora também é conjugada ou ligada com o polissacarídeo de S. pneumoniae para aumentar a imunogenicidade do antígeno. As proteínas carreadoras devem ser receptivas para procedimentos de conjugação padrão.

Em uma modalidade, cada polissacarídeo capsular não conjugado à primeira proteína carreadora é conjugado à mesma segunda proteína carreadora (por exemplo, cada molécula de polissacarídeo capsular que é conjugada a uma proteína carreadora simples). Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares não conjugados à primeira proteína carreadora são conjugados a duas ou mais proteínas carreadoras (cada molécula de polissacarídeo capsular é conjugada à uma proteína carreadora simples). Em tais modalidades, cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é tipicamente conjugado à mesma proteína carreadora.

Nas modalidades da presente invenção, incluindo a Modalidade E1 e qualquer submodalidade da mesma, um ou mais (incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais, quando aplicável) dos sorotipos de polissacarídeo é conjugado a CRM197. Em modalidades adicionais da presente invenção, incluindo a Modalidade E1 e qualquer submodalidade da mesma, cada um dos sorotipos de polissacarídeo é conjugado a CRM197. A formulação dos conjugados de polissacarídeo-proteína da presente invenção pode ser obtida com o uso de métodos reconhecidos no estado da técnica.

Por exemplo, conjugados pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição.

Exemplos de tais veículos incluem, mas não são limitados a, água, salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e soluções de dextrose.

Em uma modalidade preferida, a composição de vacina é formulada em tampão de L-histidina com cloreto de sódio.

Em algumas modalidades da presente invenção, a composição imunogênica multivalente compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo- proteína de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora e um adjuvante, em que os sorotipos de S. pneumoniae são como descritos na presente invenção.

Adjuvantes adequados para aumentar a eficácia da composição incluem, mas não são limitados a: (1) sais de alumínio (alum), como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos como peptídeos muramila (definidos abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), como, por exemplo, (a) MF59 (Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 90/14837), contendo 5% de Squalene, 0,5 % de Tween 80, e 0,5 % de Span 85 (contendo opcionalmente várias quantidades de MTP-PE) formulados em partículas submícron usando um microfluidizador como microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10 % de Squalene, 0,4 % de Tween 80, 5 % de polímero bloqueado por plurônico L121 e thr-MDP microfluidizado em uma emulsão submícron ou vortexado para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, (c) sistema de adjuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2 % de Squalene, 0,2 % de Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana do grupo que consiste em monofosforilipídeo A 3-O-desacetilado (MPL™) descrito na Patente US 4.912.094, dimicolato de trealose (TDM), e estrutura de parede celular (CWS), preferencialmente MPL+CWS (Detox™); e (d) um ISA de Montanide; (3) adjuvantes de saponina, como Quil A ou STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (ver, por exemplo, Patente US 5.057.540) podem ser usados ou as partículas geradas a partir da mesma como ISCOM (complexos imunoestimulantes formados pela combinação de colesterol, saponina, fosfolipídeo e proteínas anfipáticas) e Iscomatrix® (que têm essencialmente a mesma estrutura como um ISCOM, mas sem a proteína); (4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos de lipídeo sintéticos A como compostos de fosfato de glicosamina de aminoalquila (AGP), ou derivados ou análogos dos mesmos, que são disponibilizados a partir de Corixa, e que são descritos na Patente US 6.113.918; um tal AGP é 2-Desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)- 3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]- ß-D-glicopiranosídeo de 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etila, que também é conhecido como 529 (antigamente conhecido como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável (5) polinucleotídeos sintéticos como oligonucleotídeos contendo motivo(s) de CpG (Patente US 6.207.646); (6) citocinas, como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferons (por exemplo, interferon gama), fator estimulante de colônia de macrófago e granulócito (GM-CSF), fator estimulante de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimulatórias B7-1 e B7-2, etc.; e (7) complemento, como um trímero de componente de complemento C3d.

Em outra modalidade, o adjuvante é uma mistura de 2, 3 ou mais dos adjuvantes acima, por exemplo, SBAS2 (uma emulsão óleo em água contendo também lipídeo de monofosforila 3-desacetilada A e QS21). Os peptídeos de muramila incluem, mas não são limitados a, N- acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L- alanina-2-(1', 2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Em determinadas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio.

O adjuvante de sal de alumínio pode ser uma vacina de alum precipitado ou uma vacina com alum adsorvido.

Os adjuvantes de sal de alumínio são bem conhecidos no estado da técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow, E. e D.

Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) e Nicklas, W. (1992; Aluminum salts.

Research in Immunology 143: 489 a 493). O sal de alumínio inclui, mas não é limitado a, alumina hidratada, hidrato de alumina, tri-hidrato de alumina (ATH), hidrato de alumínio, tri-hidrato de alumínio, alhydrogel, Superfos, Amphogel, hidróxido de alumínio (III), sulfato de hidroxifosfato de alumínio, Adjuvante de Fosfato de Alumínio (APA), alumina amorfa, alumina tri-hidratada ou tri-hidroxialumínio.

APA é uma suspensão aquosa de hidroxifosfato de alumínio.

APA é fabricado mesclando-se cloreto de alumínio e fosfato de sódio em uma razão volumétrica de 1:1 para precipitar hidroxifosfato de alumínio.

Após o processo de mesclagem, o material é reduzido em tamanho com um misturador de alto cisalhamento para obter uma distribuição de tamanho de partícula monodispersada.

O produto é, então, diafiltrado contra solução salina fisiológica e vapor esterilizado.

Em uma modalidade, a dose do sal de alumínio é 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 ou 700 µg, ou 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 mg ou mais.

Em ainda outra modalidade, a dose de sal de alum descrita acima é por µg de proteína recombinante.

Em determinadas modalidades, um Al(OH)3 comercialmente disponível (por exemplo, Alhydrogel ou Superfos de Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) é usado para adsorver proteínas em uma razão de 50 a 200 µg de proteína/mg de hidróxido de alumínio.

A adsorção de proteína é dependente, em outra modalidade, do pI (pH Isoelétrico) da proteína e o pH do meio.

A proteína com um pI inferior se adsorve para o íon de alumínio positivamente carregado mais fortemente que uma proteína com um pI superior.

Os sais de alumínio podem estabelecer um depósito de antígeno que é lentamente liberado ao longo de um período de 2 a 3 semanas, serem envolvidos em ativação não específica de macrófagos e ativação de complemento, e/ou estimula o mecanismo imunológico inato (possivelmente através de estimulação de ácido úrico). Ver, por exemplo, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23. Os conjugados aquosos de volume monovalente são tipicamente mesclados em conjunto e diluídos para alvejar 4 g/mL para todos os sorotipos exceto 6B, que pode ser diluído para alvejar 8 g/mL.

Uma vez diluído, o lote será esterilizado por filtro, e um volume igual de adjuvante de fosfato de alumínio adicionado assepticamente para alvejar uma concentração de alumínio final de 250 g/mL.

O lote formulado e adjuvado será preenchido em ampolas de 0,5 mL/dose de uso único.

Em determinadas modalidades, o adjuvante é uma sequência de nucleotídeo contendo CpG, por exemplo, um oligonucleotídeo contendo CpG, em particular, um oligodesoxinucleotídeo contendo CpG (ODN de CpG). Em outra modalidade, o adjuvante é ODN 1826, que pode ser obtido a partir do Grupo Coley Pharmaceutical.

Os métodos para uso de oligonucleotídeos de CpG são bem conhecidos no estado da técnica e são descritos, por exemplo, em Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6.284 a 6.293; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58; e Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110. Em modalidades alternativas, a composição imunogênica compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae como descrito na presente invenção, por exemplo, na Modalidade E1 ou qualquer submodalidade da mesma, e não compreende um adjuvante.

Formulações

As composições imunogênicas multivalentes da presente invenção podem ser formuladas como ampolas de dose única, ampolas de múltiplas doses ou como seringas de vidro ou plástico pré-preenchidas.

Em outra modalidade, as composições imunogênicas multivalentes da presente invenção são administradas oralmente, e são, desse modo, formuladas em uma forma adequada para administração oral, isto é, como uma preparação sólida ou líquida.

As formulações orais sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, pellets e similares.

As formulações orais líquidas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e similares.

Carreadores farmaceuticamente aceitáveis para formulações líquidas são soluções aquosas ou não aquosas, suspensões, emulsões ou óleos.

Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila.

Carreadores aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meio tamponado.

Exemplos de óleos são aqueles de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou um lipídio de leite ou ovos.

As composições imunogênicas multivalentes da presente invenção podem ser isotônicas, hipotônicas ou hipertônicas.

No entanto, frequentemente prefere-se que uma composição para infusão ou injeção seja essencialmente isotônica, quando administrada.

Dessa forma, para o armazenamento, uma composição pode ser preferencialmente isotônica ou hipertônica.

Se a composição é hipertônica para armazenamento, essa pode ser diluída para se tornar uma solução isotônica antes da administração.

O agente isotônico pode ser um agente isotônico iônico como um sal ou um agente isotônico não iônico como um carboidrato.

Exemplos de agentes isotônicos iônicos incluem, mas não são limitados a, NaCl, CaCl2, KCl e MgCl2. Exemplos de agentes isotônicos não iônicos incluem, mas não são limitados a, manitol, sorbitol e glicerol.

Prefere-se também que pelo menos um aditivo farmaceuticamente aceitável seja um tampão.

Para alguns propósitos, por exemplo, quando a composição farmacêutica se destina para infusão ou injeção, é frequentemente desejado que a composição compreenda um tampão, que tem a capacidade para tamponar uma solução para um pH na faixa de 4 a 10, como 5 a 9, por exemplo, 6 a 8. O tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em tampão de TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato e trietanolamina.

O tampão pode ser selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral.

Por exemplo, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos monobásicos como acético, benzóico, glucônico, glicérico e láctico; ácidos dibásicos como aconítico, adípico, ascórbico, carbônico, glutâmico, málico, succínico e tartárico, ácidos polibásicos como cítrico e fosfórico; e bases como amônia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e TRIS.

Os veículos parenterais (para injeção subcutânea, intravenosa, intra- arterial ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer lactado e fixados.

Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluido e nutriente, reabastecedores de eletrólito como aqueles à base de dextrose de Ringer e similares.

Os exemplos são líquidos estéreis como água e óleos, com ou sem a adição de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

De modo geral, água, salina,

dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, glicóis como propileno glicóis ou polietilenoglicol, Polissorbato 80 (PS-80), Polissorbato 20 (PS-20), e Poloxâmero 188 (P188) são carreadores líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis.

Exemplos de óleos são aqueles de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou um lipídio de leite ou ovos.

As formulações da presente invenção também podem conter um tensoativo.

Os tensoativos preferidos incluem, mas não limitado a: Poloxâmero - 188 (P188; Pluorônico; F68 NF), os tensoativos de ésteres de sorbitano de polioxietileno (comumente denominados Tweens), especialmente PS-20 e PS-80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de butileno (BO), vendido sob o nome de marca DOWFAX™, como copolímeros em bloco de EO/PO lineares; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etoxi (óxi-l,2-etanedi-il) de repetição, com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t- octilfenoxipolietoxietanol) sendo de interesse particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídios como fosfatidilcolina (lecitina); nonifenol etoxilados, como o Tergitol™ série NP; éteres graxos de polioxietileno derivados de lauril, cetil, estearil e álcoois oleil (conhecidos como tensoativos de bBrij), como éter de monolauril de trietilenoglicol (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como SPANs), como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano.

Um tensoativo preferido para inclusão na emulsão é PS-80. As misturas de tensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas de PS-80/Span 85. A combinação de um éster de sorbitano de polioxietileno como mono-oleato de sorbitano de polioxietileno (PS-80) e um octoxinol como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) também é adequado.

Outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster de sorbitano de polioxietileno e/ou um octoxinol.

As quantidades preferidas de tensoativos (% por peso) são: ésteres de sorbitano de polioxietileno (como PS-80) de 0,01 a 1 %, em particular, cerca de 0,1 %; polioxietanóis de octil ou nonilfenóxi (como Triton X-100, ou outros detergentes na série Triton) de 0,001 a 0,1 %, em particular, 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (como laureth 9) de 0,1 a 20 %, preferencialmente, 0,1 a 10 % e, em particular, 0,1 a 1 % ou cerca de 0,5%. Em determinadas modalidades, a composição consiste essencialmente em histidina (20 mM), salina (150 mM) e PS-20 a 0,2% a um pH de 5,8 com 250 µg/mL de APA (Adjuvante de Fosfato de Alumínio). PS-20 pode estar na faixa de 0,005 % a 0,3 % (p/v). Em outra modalidade, PS-20 pode estar na faixa de 0,025 % a 0,8 % (p/v). Em outra modalidade, PS-20 pode estar na faixa de 0,05% a 0,8 % (p/v). Em outra modalidade, PS-20 pode estar na faixa de 0,05% a 0,2% (p/v). O processo consiste em combinar uma mescla de até 24 sorotipos em histidina, salina e PS-20, então, combinar esse material mesclado com APA e salina com ou sem conservantes antimicrobianos.

Em modalidades particulares, a composição imunogênica multivalente compreende conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae nos conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem qualquer um dos conjuntos de sorotipos estabelecidos na presente invenção, e compreende adicionalmente 20 a 80 mM de histidina pH 5,8 e NaCl 150 mM.

Em algumas modalidades, a composição imunogênica multivalente compreende adicionalmente de 0,2 % a 0,8 % de p/v de polissorbato 20.

A composição imunogênica multivalente de PCV24 é preparada por conjugar individualmente a proteína CRM197 a polissacarídeo (PnPs) de S. pneumoniae de sorotipos -1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, -8, -9V, -10A, -11A, -12F, -14, -15A, -15C, -18C, -19A, -19F, -22F, -23B, -23F, -24F, -33F e -35B usando aminação redutiva em um solvente aprótico (também referido como produto químico de DMSO) e formulada em L-Histidina 20 mM pH 5,8, NaCl 150 mM e Polissorbato- 20 (PS-20) a 0,1 % p/v a 4 µg/mL ou 8 µg/mL de cada sorotipo de polissacarídeo para uma concentração de polissacarídeo total de 96 µg/mL ou 192 µg/mL, respectivamente, e denominado “PCV24 sem adj”. Em outra modalidade específica, a composição imunogênica multivalente de PCV24 é preparada em L- Histidina 20 mM pH 5,8, NaCl 150 mM e 0,2 % p/v de Polissorbato-20 (PS-20) a 4 µg/mL de cada sorotipo de polissacarídeo para uma concentração de polissacarídeo total de 96 µg/mL compreendendo adicionalmente 250 µg [Al]/mL na forma de Adjuvante de Fosfato de Alumínio.

Isso é denominado “PCV24/APA”. A escolha de tensoativo pode precisar ser otimizada para diferentes produtos farmacológicos e substâncias farmacológicas.

Para vacinas multivalentes que têm 15 ou mais sorotipos, PS-20 e P188 são preferidos.

A escolha de produto químico usada para preparar os conjugados também pode desempenhar um papel importante na estabilização da formulação.

Em particular, quando as reações de conjugação usadas para preparar conjugados de polissacarídeo-proteína diferentes em uma composição multivalente incluem tanto solvente aquoso quanto solvente de DMSO, sistemas de tensoativo particulares fornecem diferenças significativas em estabilidade.

A estabilidade aprimorada de conjugados de polissacarídeo-proteína foi observada com polissorbato 20 sozinho ou com poloxâmero 188 em combinação com um poliol.

O mecanismo exato de como um detergente específico protege uma bioterapia é insuficientemente entendido e não pode ser previsto a priori. Os mecanismos de estabilização possíveis incluem hidratação preferencial, exclusão preferencial, competição de interface de ar/Líquido entre a bioterapia e a superfície, a tensão superficial e/ou associação direta do detergente com a bioterapia para mascarar adesivos hidrofóbicos que servem como sementes para agregação. O poloxâmero também pode ser usado nas composições da presente invenção. Um poloxâmero é um copolímero em tribloco não iônico composto por um cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueado por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)). Os poloxâmeros também são conhecidos pelo nome de marca Pluronic®. Devido ao fato de os comprimentos dos blocos de polímero poderem ser personalizados, existem muitos poloxâmeros diferentes que têm propriedades ligeiramente diferentes. Para o termo genérico "poloxâmero", esses copolímeros são comumente nomeados pela letra "P" (para poloxâmero) seguido por três dígitos, os primeiros dois dígitos x 100 fornecem a massa molecular adequada do núcleo de polioxipropileno, e o último dígito x 10 fornece a porcentagem de teor de polioxietileno(por exemplo, P407 = Poloxâmero com uma massa molecular de polioxipropileno de 4.000 g/mol e um teor de polioxietileno de 70 %). Para o nome de marca Pluronic®, a codificação desses copolímeros começa com uma letra para definir sua forma física à temperatura ambiente (L = líquido, P = pasta, F = floco (sólido)) seguido por dois ou três dígitos. O primeiro dígito (dois dígitos em um número de três dígitos) na designação numérica, multiplicado por 300, indica o peso molecular aproximado do hidrófobo; e o último dígito x 10 fornece a porcentagem de teor de polioxietileno (por exemplo, L61 = Pluronic® com uma massa molecular de polioxipropileno de

1.800 g/mol e um teor de polioxietileno de 10 %). Ver a Patente US 3.740.421.

Exemplos de poloxâmeros têm a fórmula geral: HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH, em que os blocos a e b têm os seguintes valores: Pluronic® Poloxâmero A B Peso molecular L31 2 16 1.100 (média) L35 1.900 (média) L44NF 124 12 20 2.090 a 2.360 L64 2.900 (média) L81 2.800 (média) L121 4.400 (média) P123 20 70 5.750 (média) F68NF 188 80 27 7.680 a 9.510 F87NF 237 64 37 6.840 a 8.830 F108NF 338 141 44 12.700 a 17.400 F127NF 407 101 56 9.840 a 14.600 As unidades de peso molecular, como usado na presente invenção, estão em Dalton (Da) ou g/mol. Preferencialmente, o poloxâmero, de modo geral, tem um peso molecular na faixa de 1.100 a 17.400 Da, de 7.500 a 15.000 Da, ou de 7.500 a

10.000 Da. O poloxâmero pode ser selecionado a partir de poloxâmero 188 ou poloxâmero 407. A concentração final do poloxâmero nas formulações é de

0.001 % a 5 % peso/volume, ou 0,025 % a 1 % peso/volume. Em determinados aspectos, o poliol é propilenoglicol e está na concentração final de 1 % a 20 % de peso/volume. Em determinados aspectos, o poliol é polietilenoglicol 400 e está na concentração final de 1 % a 20 % de peso/volume. Os polióis adequados para as formulações da presente invenção são polióis poliméricos, particularmente, dióis de poliéter que incluem, mas não estão limitados a, propilenoglicol e polietilenoglicol, éteres de monometil de polietileno glicol. Propileno glicol está disponível em uma faixa de pesos moleculares do monômero de ~425 a ~2.700. O Polietileno glicol e éter de monometil de Polietileno glicol também está disponível em uma faixa de pesos moleculares variando de ~200 a ~35.000 incluindo, mas não limitado a, PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 e PEG MME 4000. Um polietilenoglicol preferido é polietilenoglicol

400. A concentração final do poliol nas formulações da presente invenção pode ser de 1 % a 20 % peso/volume ou 6 % a 20 % peso/volume. A formulação também contém uma solução salina de Ph tamponado. O tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em tampão de TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)- 1-piperazinaetanossulfônico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico) e trietanolamina. O tampão tem a capacidade para tamponar uma solução para um pH na faixa de 4 a 10, 5,2 a 7,5 ou 5,8 a 7,0. Em determinado aspecto da presente invenção, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato, succinato, histidina, MES, MOPS, HEPES, acetato ou citrato. O tampão pode adicionalmente, por exemplo, ser selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. Em uma modalidade, a concentração de tampão estará na faixa de 1 mM a 100 mM. Em outra modalidade, a concentração de tampão estará na faixa de 10 mM a 80 mM. Em outra modalidade, a concentração de tampão estará na faixa de 1 mM a 50 mM, ou 5 mM a 50 mM. Em determinados aspectos, o tampão é histidina a uma concentração final de 5 mM a 50 mM, ou succinato a uma concentração final de 1 mM a 10 mM. Em determinados aspectos, o tampão de histidina está a uma concentração final de 20 mM ± 2 mM. Embora a solução salina (por exemplo, uma solução contendo NaCl)

seja preferida, outros sais adequados para formulação incluem, mas não são limitados a, CaCl2, KCl e MgCl2 e combinações dos mesmos.

Agentes isotônicos não iônicos que incluem, mas não limitado a, sacarose, trealose, manitol, sorbitol e glicerol podem ser usados em vez de um sal.

As faixas de sal adequadas incluem, mas não são limitadas a, 20 mM a 500 mM ou 40 mM a 170 mM.

Em um aspecto, a solução salina é NaCl, opcionalmente presente a uma concentração de 25 mM a 170 mM.

Em uma modalidade preferida, as formulações compreendem um tampão de L-histidina com cloreto de sódio.

Em outra modalidade, a composição farmacêutica é entregue em um sistema de liberação controlada.

Por exemplo, o agente pode ser administrado usando infusão intravenosa, um adesivo transdérmico, lipossomos, ou outros modos de administração.

Em outra modalidade, os materiais poliméricos são usados; por exemplo, em microesferas em ou um implante.

A quantidade de conjugado em cada dose da composição é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos adversos significativos.

Tal quantidade pode variar dependendo do sorotipo pneumocócico.

De modo geral, para conjugados à base de polissacarídeo, cada dose compreenderá 0,08 a 100 g de cada polissacarídeo.

Em algumas modalidades da presente invenção, a dose de cada conjugado de polissacarídeo é de 0,08 a 10 g.

Em modalidades adicionais, a dose de cada conjugado é de 1 a 5 g, de 0,4 a 4 g, de 0,4 a 3 g, de 0,4 a 2 g, ou de 0,4 a 1 g.

Em algumas modalidades, a dose de uma ou mais conjugados de polissacarídeo é de 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, ou 750 ng ou 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,75, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 g.

Em algumas modalidades das composições da presente invenção,

todos dentre os conjugados de polissacarídeo estão presentes na composição na mesma quantidade.

Em modalidades adicionais, os conjugados de polissacarídeo estão presentes na composição em quantidades diferentes (isto é, pelo menos um conjugado de polissacarídeo está presente em uma quantidade que é diferente de uma ou mais dos outros conjugados de polissacarídeo da composição). As quantidades ideais de componentes para uma composição imunogênica particular podem ser determinadas por estudos padrão que envolvem a observação de respostas imunológicas adequadas em indivíduos.

Por exemplo, em outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação a partir de estudos em animais para dados humanos.

Em outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.

As composições dessa presente invenção também podem incluir uma ou mais proteínas de S. pneumoniae.

Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para inclusão incluem aqueles identificados nas Publicações de Pedido de Patente Internacional WO 02/083855 e WO 02/053761. Em determinadas modalidades, as composições da presente invenção são administradas a um indivíduo por um ou mais métodos conhecidos por um técnico no assunto, como parentalmente, transmucosalmente, transdermicamente, intramuscularmente, intravenosamente, intradermicamente, intranasalmente, subcutâneamente, intraperitonealmente e formuladas de acordo.

Em uma modalidade, as composições da presente invenção são administradas via injeção epidérmica, injeção intramuscular, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, ou injeção mucosal intra-respiratória de uma preparação líquida.

As formulações líquidas para injeção incluem soluções e similares.

III.

Métodos de Preparo

Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae podem ser preparados por técnicas padrão conhecidas pelos técnicos no assunto.

Por exemplo, os polissacarídeos podem ser isolados de bactérias e podem ser dimensionados em certo grau por métodos conhecidos (ver, por exemplo, Patentes Européias EP497524 e EP497525); e preferencialmente por microfluidização obtida usando um homogeneizador ou por hidrólise química.

Em uma modalidade, cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico é cultivado em um meio à base de soja.

Os polissacarídeos individuais são, então, purificados através de etapas padrão que incluem centrifugação, precipitação e ultrafiltração.

Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2008/0286838 e Patente US 5.847.112. Os polissacarídeos podem ser dimensionados a fim de reduzir a viscosidade em amostras de polissacarídeo e/ou para aprimorar a capacidade de filtração para produtos conjugados usando técnicas como dimensionamento mecânico ou químico.

A hidrólise química pode ser conduzida usando ácido acético.

O dimensionamento mecânico pode ser conduzido usando Cisalhamento de Homogeneização de Alta Pressão.

Os polissacarídeos purificados podem ser quimicamente ativados para preparar os sacarídeos capazes de reagir com a proteína carreadora.

Os polissacarídeos purificados podem ser conectados a um ligante.

Uma vez ativados ou conectados a um ligante, cada polissacarídeo capsular é separadamente conjugado a uma proteína carreadora para formar um glicoconjugado.

Os conjugados de polissacarídeo podem ser preparados por técnicas de acoplamento conhecidas.

O polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante para formar um intermediário de ligante de polissacarídeo em que a terminação livre do ligante é um grupo éster.

O ligante é, portanto, um em que pelo menos uma terminação é um grupo éster.

A outra terminação é selecionada de modo que possa reagir com o polissacarídeo para formar o intermediário de ligante de polissacarídeo.

O polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante usando um grupo amina primária no polissacarídeo.

Nesse caso, o ligante tipicamente tem um grupo éster em ambas as terminações.

Isso permite que o acoplamento ocorra reagindo-se um dos grupos éster com o grupo amina primária no polissacarídeo por substituição de acila nucleofílica.

A reação resulta em um intermediário de ligante de polissacarídeo em que o polissacarídeo é acoplado ao ligante por meio de uma ligação de amida.

O ligante é, portanto, um ligante bifuncional que fornece um primeiro grupo éster para reagir com o grupo amina primária no polissacarídeo e um segundo grupo éster para reagir com o grupo amina primária na molécula carreadora.

Um ligante típico é diéster de N-hidroxissuccinimida de ácido adípico (SIDEA). O acoplamento também pode ocorrer indiretamente, isto é, com um ligante adicional que é usado para derivar o polissacarídeo antes de acoplar ao ligante.

O polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional usando um grupo carbonila na terminação de redução do polissacarídeo.

Esse acoplamento compreende duas etapas: (a1) reagir o grupo carbonila com o ligante adicional; e (a2) reagir a terminação livre do ligante adicional com o ligante.

Nessas modalidades, o ligante adicional tipicamente tem um grupo amina primária em ambas as terminações, portanto, permitindo que a etapa (a1) ocorra reagindo- se um dos grupos de amina primária com o grupo carbonila no polissacarídeo por aminação redutiva.

Um grupo amina primária é usado, o qual é reativo com o grupo carbonila no polissacarídeo.

Grupos hidrazida ou hidroxilamino são adequados.

O mesmo grupo amina primária está tipicamente presente em ambas as terminações do ligante adicional.

A reação resulta em um intermediário de ligante adicional de polissacarídeo no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional via uma ligação C—N. O polissacarídeo pode ser acoplado ao ligante adicional usando um grupo diferente no polissacarídeo, particularmente, um grupo carboxila. Esse acoplamento compreende duas etapas: (a1) reagir o grupo com o ligante adicional; e (a2) reagir a terminação livre do ligante adicional com o ligante. Nesse caso, o ligante adicional tipicamente tem um grupo amina primária em ambas as terminações, portanto, permitindo que a etapa (a1) ocorra reagindo- se um dos grupos de amina primária com o grupo carboxila no polissacarídeo por ativação de EDAC. Um grupo amina primária é usado, o qual é reativo com o grupo carboxila ativado por EDAC no polissacarídeo. Um grupo hidrazida é adequado. O mesmo grupo amina primária está tipicamente presente em ambas as terminações do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário de ligante adicional de polissacarídeo na qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional por meio de uma ligação de amida. Em uma modalidade, a ativação química dos polissacarídeos e conjugação subsequente à proteína carreadora por aminação redutiva podem ser obtidas por meios descritos nas Patentes US 4.365.170, 4.673.574 e

4.902.506, Publicações de Pedido de Patente US 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 e 2007/0184071, e WO2006/110381, WO2008/079653 e WO2008/143709. O produto químico pode incluir a ativação de polissacarídeo pneumocócico por reação com qualquer agente oxidante que oxida um grupo hidroxila terminal em um aldeído, como periodato (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio, ou ácido periódico). A reação leva à uma clivagem oxidativa aleatória de grupos hidroxila vicinal dos carboidratos com a formação de grupos aldeído reativos. O acoplamento à proteína carreadora é por aminação redutiva por meio de aminação direta aos grupos lisila da proteína. Por exemplo, a conjugação pode ser realizada reagindo-se uma mistura do polissacarídeo ativado e proteína carreadora com um agente redutor como cianoboro-hidreto de sódio.

A reação de conjugação pode ocorrer sob solução aquosa ou na presença de DMSO.

Ver, por exemplo, US 2015/0231270, US 2011/0195086 e EP 0471 177 B1. Os aldeídos não reagidos são, então, capeados com a adição de um agente redutor forte, como boro-hidreto de sódio.

A aminação redutiva envolve duas etapas, (1) oxidação do polissacarídeo para formar aldeídos reativos, (2) redução da imina (base de Schiff) formada entre polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação de conjugado de amina estável.

Antes da oxidação, o polissacarídeo tem o tamanho opcionalmente reduzido.

Os métodos mecânicos (por exemplo, homogeneização) ou a hidrólise química pode ser empregada.

A hidrólise química pode ser conduzida usando ácido acético.

A etapa de oxidação pode envolver a reação com periodato.

Para os fins da presente invenção, o termo "periodato" inclui tanto periodato quanto ácido periódico; o termo também inclui tanto metaperiodato (IO4-) quanto ortoperiodato (IO6-) e inclui os vários sais de periodato (por exemplo, periodato de sódio e periodato de potássio). Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de metaperiodato, preferencialmente na presença de periodato de sódio (NaIO4). Em outra modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de ortoperiodato, preferencialmente na presença de ácido periódico.

Em uma modalidade, o agente oxidante é um composto de radical nitroxil estável ou nitróxido, como compostos piperidina-N-oxi ou pirrolidina-N- oxi, na presença de um oxidante para oxidar seletivamente hidroxilas primárias (como descrito em WO 2014/097099). Na referida reação, o oxidante real é o sal de N-oxoamônio, em um ciclo catalítico.

Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxil estável ou nitróxido são compostos piperidina-N-oxi ou pirrolidina-N-oxi.

Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxil estável ou nitróxido suporta uma porção TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi) ou PROXYL (2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi). Em um aspecto, o referido composto de radical nitroxil estável é TEMPO ou um derivado do mesmo.

Em um aspecto, o referido oxidante é uma molécula que suporta uma porção N-halo.

Em um aspecto, o referido oxidante é selecionado a partir do grupo que consiste em N-Clorosuccinimida, N-Bromosuccinimida, N-lodosuccinimida, Ácido dicloroisocianúrico, 1,3,5-tricloro-1,3,5-triazinano-2,4,6-triona, Ácido dibromoisocianúrico, 1,3,5-tribromo-1,3,5-triazinano-2,4,6-triona, Ácido di- iodoisocianúrico e 1,3,5-tri-iodo-1,3,5-triazinano-2,4,6-triona.

Preferencialmente, o referido oxidante é N- Clorosuccinimida.

Em determinados aspectos, o agente oxidante é radical livre de 2,2,6,6-Tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) e N-Clorosuccinimida (NCS) como o co-oxidante (como descrito em WO 2014/097099). Portanto em um aspecto, os glicoconjugados de S. pneumoniae são obteníveis por um método compreendendo as etapas de: a) reagir um sacarídeo com 2,2,6,6-tetrametil-1- piperidiniloxi (TEMPO) e N-clorosuccinimida (NCS) em um solvente aquoso para produzir um sacarídeo ativado; e b) reagir o sacarídeo ativado com uma proteína carreadora compreendendo um ou mais grupos amina (o referido método é posteriormente designado "aminação redutiva de TEMPO/NCS"). Opcionalmente, a reação de oxidação é arrefecida por adição de um agente de arrefecimento.

O agente de arrefecimento pode ser selecionado a partir de dióis vicinais, 1,2-aminoálcoois, aminoácidos, glutationa, sulfito, bissulfato, ditionito, metabissulfito, tiossulfato, fosfitos, hipofosfitos ou ácido fosforoso (como glicerol, etilenoglicol, propan-1,2-diol, butan-1 ,2-diol ou butan- 2,3-diol, ácido ascórbico). Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece um método para preparar um conjugado de polissacarídeo-proteína de Streptococcus pneumoniae de sorotipo 8 utilizando uma reação de conjugação em um solvente aprótico, em que a reação de conjugação não usa cianoboro- hidreto.

Em modalidades adicionais, a reação de conjugação é uma redução de base de Schiff ou aminação redutiva.

Em modalidades adicionais, a proteína é toxoide tetânico, toxoide diftérico, ou CRM197. Em modalidades ainda adicionais, a proteína é CRM197. Em modalidades adicionais, a reação de conjugação é aminação redutiva.

Em modalidades adicionais, a aminação redutiva é desempenhada em dimetilsulfóxido (DMSO). Em algumas modalidades, os polissacarídeos oxidados antes da conjugação têm um peso molecular entre 30 kDa e 1.000 kDa.

O peso molecular pode ser calculado por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) combinada com detector de dispersão de luz de múltiplos ângulos (MALS) e detector de índice refratário (RI). Em algumas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 300 kDa.

Em algumas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 50 kDa e 1.000 kDa.

Em modalidades adicionais, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 70 kDa e 900 kDa.

Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 100 kDa e 800 kDa.

Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular entre 200 kDa e 600 kDa.

Em modalidades adicionais, o polissacarídeo tem um peso molecular de 100 kDa a 1.000 kDa; 100 kDa a 900 kDa; 100 kDa a 800 kDa; 100 kDa a 700 kDa; 100 kDa a 600 kDa; 100 kDa a 500 kDa; 100 kDa a 400 kDa; 100 kDa a 300 kDa; 150 kDa a 1.000 kDa; 150 kDa a 900 kDa; 150 kDa a 800 kDa; 150 kDa a 700 kDa; 150 kDa a 600 kDa; 150 kDa a 500 kDa; 150 kDa a 400 kDa; 150 kDa a 300 kDa; 200 kDa a 1.000 kDa; 200 kDa a 900 kDa; 200 kDa a 800 kDa; 200 kDa a 700 kDa; 200 kDa a 600 kDa; 200 kDa a 500 kDa; 200 kDa a 400 kDa; 200 kDa a 300; 250 kDa a 1.000 kDa; 250 kDa a 900 kDa; 250 kDa a 800 kDa; 250 kDa a 700 kDa;

250 kDa a 600 kDa; 250 kDa a 500 kDa; 250 kDa a 400 kDa; 250 kDa a 350 kDa; 300 kDa a 1 .000 kDa; 300 kDa a 900 kDa; 300 kDa a 800 kDa; 300 kDa a 700 kDa; 300 kDa a 600 kDa; 300 kDa a 500 kDa; 300 kDa a 400 kDa; 400 kDa a 1.000 kDa; 400 kDa a 900 kDa; 400 kDa a 800 kDa; 400 kDa a 700 kDa; 400 kDa a 600 kDa; ou 500 kDa a 600 kDa.

A segunda etapa do processo de conjugação é a redução da ligação de imina (base de Schiff) entre polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação de conjugado estável (a chamada aminação redutiva), usando um agente redutor.

Os agentes redutores que são adequados incluem os cianoboro-hidretos (como cianoboro-hidreto de sódio ou boro-hidreto de sódio). Em uma modalidade, o agente redutor é cianoboro-hidreto de sódio.

Em determinadas modalidades, a reação de aminação redutiva é realizada em solvente aprótico (ou uma mistura de solventes apróticos). Em uma modalidade, a reação de redução é realizada em solvente DMSO ou em solvente DMF (dimetilformamida). O solvente DMSO ou DMF pode ser usado para reconstituir o polissacarídeo ativado e a proteína carreadora, se liofilizado.

Em uma modalidade, o solvente aprótico é DMSO.

Ao fim da reação de redução, pode haver grupos aldeído não reagidos restantes nos conjugados, que podem ser capeados usando um agente de capeamento adequado.

Em uma modalidade, esse agente de capeamento é boro-hidreto de sódio (NaBH4). As alternativas adequadas incluem triacetoxiboro-hidreto de sódio ou sódio ou boro-hidreto de zinco na presença de ácidos de Bronsted ou Lewis), boranos de amina como boranos de piridina, Borano de 2-Picolino, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina-borano, t-BuMe'PrN- BH3, benzilamina-BH3 ou boranos de 5-etil-2-metilpiridina (PEMB) ou resina de troca de boro-hidreto.

Após a conjugação (a reação de redução e opcionalmente o capeamento), os glicoconjugados podem ser purificados (enriquecidos com relação à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas conhecidas pelo técnico no assunto.

Essas técnicas incluem diálise, operações de concentração/diafiltração, filtração de fluxo tangencial, precipitação/eluição, cromatografia em coluna (cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca iônica multimodal, DEAE ou cromatografia por interação hidrofóbica) e filtração profunda.

Em uma modalidade, os glicoconjugados são purificados por diafiltração ou cromatografia de troca iônica ou cromatografia por exclusão de tamanho.

Os glicoconjugados preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico são, de modo geral, usados em vacinas de conjugado pneumocócico multivalentes.

Desse modo, em determinadas modalidades para composições multivalentes em que nem todos os sorotipos são preparados em um solvente aprótico, a reação de redução para o restante dos sorotipos é realizada em solvente aquoso (por exemplo, selecionado a partir de PBS (salina tamponada em fosfato), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico), Bis-tris, ADA (ácido N-(2- Acetamido)iminodiacético ), PIPES (piperazina-N,N′-bis(ácido 2- etanossulfônico)), MOPSO (ácido 3-Morfolino-2-hidroxipropanossulfônico), BES (ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico), MOPS (ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico), DIPSO (ácido 3-Bis(2-hidroxietil) amino-2- hidroxipropano-1-sufônico), MOBS (ácido 4-(N-morfolino)butanossulfônico), HEPPSO (N-(2-Hidroxietil)piperazina-N‫׳‬-(ácido 2-hidroxipropanossulfônico)), POPSO (Piperazina-1,4-bis(ácido 2-hidroxi-3-propanossulfônico)), TEA (trietanolamina), EPPS (ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-propanossulfônico), ou Bicina a um pH entre 6,0 e 8,5, 7,0 e 8,0, ou 7,0 e 7,5). Os conjugados capsulares de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae que podem ser preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico, incluem, mas não são limitados a, S. pneumonia e sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Os polissacarídeos podem ser usados na forma de oligossacarídeos.

Esses são convenientemente formados por fragmentação de polissacarídeo purificado (por exemplo, por hidrólise), que será frequentemente seguido por purificação dos fragmentos do tamanho desejado.

Em determinadas modalidades, os conjugados de polissacarídeo- proteína pneumocócicos de um ou mais dentre os sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico.

Em determinadas modalidades, cada um dos conjugados na composição imunogênica multivalente é preparado usando aminação redutiva em um solvente aprótico.

Em determinadas modalidades, polissacarídeos de uma ou mais sorotipos em uma composição multivalente da presente invenção são conjugados a uma proteína carreadora usando aminação redutiva em um solvente aprótico e polissacarídeos de uma ou mais sorotipos são conjugados usando aminação redutiva em um solvente aquoso.

Em determinadas modalidades, os polissacarídeos de dois ou mais sorotipos em uma composição multivalente da presente invenção são conjugados a uma proteína carreadora usando aminação redutiva em um solvente aprótico.

Em outras modalidades, polissacarídeos de três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais, doze ou mais, treze ou mais, quatorze ou mais, quinze ou mais, dezesseis ou mais, dezessete ou mais, dezoito ou mais, dezenove ou mais, vinte ou mais, vinte e um ou mais, vinte e dois ou mais, vinte e três ou mais, ou vinte e quatro ou mais sorotipos em uma composição multivalente da presente invenção são conjugados a uma proteína carreadora usando aminação redutiva em um solvente aprótico.

Em determinadas modalidades, os polissacarídeos de um ou mais sorotipos em uma composição multivalente da presente invenção são conjugados a uma proteína carreadora usando outros produtos químicos que podem ser um solvente aprótico ou em um solvente aquoso.

Desse modo, a presente invenção se refere a uma composição imunogênica multivalente compreendendo múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são como descrito na presente invenção (isto é, na Seção II, “Composições Imunogênicas Multivalentes”), em que a reação de conjugação pela qual o polissacarídeo de S. pneumonia de um ou mais dos conjugados de polissacarídeo-proteína é conjugado à proteína carreadora é em um solvente aprótico.

Em determinadas modalidades, pelo menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % do sorotipos pneumocócicos em uma composição imunogênica multivalente são conjugados em um solvente aprótico.

O restante dos sorotipos é conjugado usando um produto químico alternativo e/ou em um solvente aquoso.

Determinou-se que o uso de DMSO como um solvente durante a aminação redutiva de conjugados de polissacarídeo-proteína resulta no estabilidade inesperadamente superior e imunogenicidade melhorada para aqueles sorotipos relativos aos mesmos conjugados preparados sob condições aquosas (Ver Pedido em Série US 62/463.216 e 62/555.444). Em determinadas modalidades da presente invenção, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,02 a cerca de 0,288 mg/mL.

Em determinadas modalidades da presente invenção, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,03 a cerca de 0,192 mg/mL.

Em determinadas modalidades da presente invenção, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,04 a cerca de 0,192 mg/mL.

Em outras modalidades, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,065 a cerca de 0,096 mg/mL, cerca de 0,070 a cerca de 0,080 mg/mL, cerca de 0,065 a cerca de 0,080 mg/mL, cerca de 0,070 a cerca de 0,085 mg/mL, cerca de 0,110 a cerca de 0,128 mg/mL, cerca de 0,110 a cerca de 0,175 mg/mL, cerca de 0,10 a cerca de 0,175 mg/mL, cerca de 0,110 a cerca de 0,170 mg/mL, cerca de 0,115 a cerca de 0,15 mg/mL, cerca de 0,110 a cerca de 0,15 mg/mL, cerca de 0,110 a cerca de 0,125 mg/mL, cerca de 0,150 a cerca de 0,170 mg/mL, cerca de 0,150 a cerca de 0,165 mg/mL, cerca de 0,140 a cerca de 0,170 mg/mL, cerca de 0,130 a cerca de 0,170 mg/mL, cerca de 0,150 a cerca de 0,175 mg/mL, cerca de 0,070 a cerca de 0,170 mg/mL, cerca de 0,065 a cerca de 0,175 mg/mL, ou cerca de 0,065 a cerca de 0,180 mg/mL.

Nas modalidades da presente invenção em que um ou mais, ou todos, dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, a concentração de polissacarídeo total na composição é estável por 4 semanas ou mais a 37 °C, 4 semanas ou mais a 25 °C, ou 12 semanas ou mais a 4 °C.

Em determinadas modalidades da presente invenção em que um ou mais, ou todos, dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o peso molecular médio (Mw) de todos dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae na composição (média de todos os conjugados na composição) é de cerca de 2.000 a cerca de 6.500 kDa, de cerca de 2.500 a cerca de 6.000 kDa, de cerca de 3.000 a cerca de 5.500 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 5.000 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.300 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.200 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.300 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.200 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.300 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.200 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.300 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.200 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.300 kDa, ou de cerca de 3.900 a cerca de 4.200 kDa. Em determinadas modalidades da presente invenção em que os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o Mw de cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae na composição (para um sorotipo simples) é de cerca de 1.000 a cerca de 10.000 kDa, de cerca de

1.500 a cerca de 5.500 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 5.600 kDa, de cerca de

1.500 a cerca de 5.700 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 5.800 kDa, de cerca de

1.500 a cerca de 5.900 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 6.000 kDa, de cerca de

1.000 a cerca de 5.500 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 kDa, de cerca de

1.000 a cerca de 4.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de

1.000 a cerca de 4.000 kDa, ou de cerca de 1.000 a cerca de 3.500 kDa. Em outras modalidades, o Mw de um conjugado de um sorotipo simples na composição é de cerca de 1.000 kDa, cerca de 1.100 kDa, cerca de 1.200 kDa, cerca de 1.300 kDa, cerca de 1.400 kDa, cerca de 1.500 kDa, cerca de 1.600 kDa, cerca de 1.700 kDa, cerca de 1.800 kDa, cerca de 1.900 kDa, cerca de 2.000 kDa, cerca de 2.100 kDa, cerca de 2.200 kDa, cerca de 2.300 kDa, cerca de 2.400 kDa, cerca de 2.500 kDa, cerca de 2.600 kDa, cerca de 2.700 kDa, cerca de 2.800 kDa, cerca de 2.900 kDa, cerca de 3.000 kDa, cerca de 3.100 kDa, cerca de 3.200 kDa, cerca de 3.300 kDa, cerca de 3.400 kDa, cerca de 3.500 kDa, cerca de 3.600 kDa, cerca de 3.700 kDa, cerca de 3.800 kDa, cerca de 3.900 kDa, cerca de 4.000 kDa, cerca de 4.100 kDa, cerca de 4.200 kDa, cerca de 4.300 kDa, cerca de 4.400 kDa, cerca de 4.500 kDa, cerca de 4.600 kDa, cerca de 4.700 kDa, cerca de 4.800 kDa, cerca de 4.900 kDa, cerca de 5.000 kDa, cerca de 5.100 kDa, cerca de 5.200 kDa, cerca de 5.300 kDa, cerca de 5.400 kDa, ou cerca de 5.500 kDa. Em determinadas modalidades da presente invenção, os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico. Em determinadas modalidades, a porcentagem (como calculada pelo número de sorotipos de polissacarídeo preparados em um solvente aprótico divido pelo número total de sorotipos de polissacarídeo, em que o número total inclui aqueles preparados em um solvente aprótico ou um solvente prótico) de conjugados específicos de sorotipo de S. pneumoniae preparados em um solvente aprótico pode ser maior que 50 %, ou maior que 60 %, ou maior que 70 %, ou maior que 80 %, ou maior que 90 % ou são de 100 %. Em determinadas modalidades da presente invenção, o conjugado de polissacarídeo-proteína de sorotipo 3 na composição é preparado em um solvente aprótico e o Mw do referido conjugado é de cerca de 1.000 a cerca de

5.000 kDa, ou de cerca de 1.000 a cerca de 4.000 kDa, ou de cerca de 1.000 a cerca de 3.000 kDa, ou de cerca de 1.000 a cerca de 2.500 kDa, ou de cerca de

1.000 a cerca de 2.000 kDa.

Em determinadas modalidades da presente invenção em que um ou mais, ou todos, dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o peso molecular numérico médio (Mn) dos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae na composição (média de todos os conjugados na composição) é de cerca de 900 a cerca de 3.000 kDa, de cerca de

1.000 a cerca de 3.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 2.500 kDa, de cerca de

1.500 a cerca de 2.500 kDa, de cerca de 1.800 a cerca de 2.500 kDa, de cerca de

1.900 a cerca de 2.500 kDa, ou de cerca de 2.000 a cerca de 2.500 kDa. Em determinadas modalidades da presente invenção em que um ou mais, ou todos, dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o Mn de cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae na composição (para um sorotipo simples) é de cerca de 700 a cerca de 7.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 6.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 4.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 3.000 kDa, de cerca de 900 a cerca de 5.500 kDa, de cerca de 900 a cerca de

5.000 kDa, de cerca de 900 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 900 a cerca de 4.000 kDa, de cerca de 900 a cerca de 3.500 kDa, ou de cerca de 900 a cerca de 3.000 kDa. Nas modalidades da presente invenção, o Mw e/ou Mn dos conjugados de polissacarídeo-proteína de S, pneumoniae na composição é estável por 4 semanas ou mais a 37 °C, 4 semanas ou mais a 25 °C, e/ou 12 semanas ou mais a 4 °C. Nas modalidades da presente invenção, a concentração de polissacarídeo, Mw, e/ou Mn são determinados usando HPSEC UV/MALS/RI. Em algumas modalidades da presente invenção, em que um ou mais,

ou todos, dentre os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o máximo de emissão da composição medida usando espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca com um comprimento de onda de excitação a 280 nanômetros (nm) é de cerca de 335 nm a cerca de 342 nm.

Em algumas modalidades, o máximo de emissão permanece de cerca de 335 nm a cerca de 342 nm e a intensidade de fluorescência é estável por pelo menos 1 semana a 37 °C.

Em algumas modalidades, o máximo de emissão permanece de cerca de 335 nm a cerca de 342 nm e a intensidade de fluorescência é estável por 1 semana a 37 °C.

Em algumas modalidades, todos dentre os conjugados de polissacarídeo pneumocócico na composição multivalente são preparados usando aminação redutiva em DMSO.

Em determinadas submodalidades, a composição multivalente compreendendo conjugados de polissacarídeo que foram todos preparados usando DMSO não compreende um adjuvante.

Sem estar ligado por qualquer teoria particular, um mecanismo possível para a imunogenicidade melhorada observada com glicoconjugados preparados em DMSO incluem um número aumentado de ligações entre o carboidrato (polissacarídeo capsular) e resíduos de lisina na superfície da proteína carreadora que resultaria em pontos de fixação adicionais entre a proteína e o polissacarídeo para transmitir estabilidade e neutralizar despolimerização química ou quebra da ligação de carboidrato de peptídeo.

Ver, por exemplo, Hsieh, Characterization of Saccharide-CRM197 Conjugado Vaccines em Brown F, Corbel M, Griffiths E (editores): Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines.

Dev.

Biol.

Basel, Karger, 2000, volume 103, páginas 93 a 104. Um benefício adicional das ligações de polissacarídeo-proteína aumentadas que são criadas durante a conjugação no solvente de DMSO podem ser oportunidades adicionais para apresentação bem-sucedida de peptídeo- carboidrato para células T.

Um mecanismo possível de imunogenicidade melhorada observado por conjugação no solvente de DMSO pode ser devido à desnaturação de CRM197 em solvente orgânico, que expõe lisinas adicionais para ligações de polissacarídeo fornecendo chances aumentadas para apresentação de glicopeptídeo na superfície de um APC para resposta dependente de célula T para epítopos de peptídeo diferentes.

Ver Avci et al., 2011, Nature Medicine 17: 1602-1610. Ainda outro benefício de conjugação em um solvente orgânico que gera CRM197 desnaturado nos conjugados pode ser interferência imunológica reduzida de anticorpos contra epítopos de CRM197 nativos.

Um benefício adicional das ligações de polissacarídeo-proteína aumentadas que são criadas durante a conjugação no solvente de DMSO pode ser a formação de conjugados de polissacarídeo-proteína de tamanho maior resultando em imunogenicidade melhorada.

Acredita-se que as composições da presente invenção fornecem vantagens significativas em provocar uma resposta humana.

Em determinadas modalidades, a reação de conjugação é desempenhada por aminação redutiva em que níquel é usado para melhorar a eficácia de reação de conjugação e para auxiliar em remoção de cianeto livre.

Metais de transição são conhecidos por formar complexos estáveis com cianeto e são conhecidos por aprimorar metilação redutiva de grupos amino proteína e formaldeído com cianoboro-hidreto de sódio (S Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331 a 334; Jentoft et al.

Anal Biochem. 1980, 106: 186 a 190). Complexando- se cianeto inibitório residual, a adição de níquel aumenta o consumo de proteína durante a conjugação e levando à formação de conjugados maiores e potencialmente mais imunogênicos.

As diferenças em níveis de cianeto de partida em lotes de reagente de cianoboro-hidreto de sódio também levam a desempenho de conjugação inconsistente, resultando em atributos variáveis de produto, como tamanho de conjugado e razão de Ps conjugado a CRM197. A adição de níquel reduziu a inconsistência de conjugação complexando-se cianeto, eliminando diferenças em lotes de cianoboro-hidreto de sódio.

Os produtos químicos alternativos adequados incluem a ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de piridínio de 1-ciano-4-dimetilamino (CDAP) para formar um éster de cianato.

O sacarídeo ativado pode, desse modo, ser acoplado diretamente ou por meio de um grupo espaçador (ligante) a um grupo amino na proteína carreadora.

Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para gerar um polissacarídeo tiolado que pode ser acoplado ao carreador por meio de uma ligação de tioéter obtido após a reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo, usando GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo usando iodoacetimida [por exemplo, HCl de etil iodoacetimida] ou bromoacetato de N-succinimidila ou SIAB, ou SIA, ou SBAP). Preferencialmente, o éster de cianato (opcionalmente produzido por produto químico de CDAP) é acoplado com hexano diamina ou di- hidrazida de ácido adípico (ADH) e o sacarídeo derivado de amino é conjugado à proteína carreadora usando produto químico de carbodi-imida (por exemplo, EDAC ou EDC) por meio de um grupo carboxila na proteína carreador.

Tais conjugados são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 93/15760, WO 95/08348 e WO 96/29094; e Chu et al., 1983, Infect.

Immunity 40: 245 a 256. Outras técnicas de conjugação adequadas usam carbodi-imidas, hidrazidas, ésters ativos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N- hidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU.

Muitos são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligante de carbonila que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Ver Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 2.572 a

2.574; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218: 509 a 518) seguido pela reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isso pode envolver a redução da terminação anomérica a um grupo hidroxila primária, proteção/desproteção opcional do grupo hidroxila primária, reação do grupo hidroxila primária com CDI para formar um intermediário de carbamato de CDI e acoplar o intermediário de carbamato de CDI com um grupo amino em uma proteína. Após a conjugação do polissacarídeo capsular à proteína carreadora, os conjugados de polissacarídeo-proteína são purificados (enriquecidos com relação à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma ou mais dentre uma variedade de técnicas. Exemplos dessas técnicas são bem conhecidos pelo técnico no assunto e incluem operações de concentração/diafiltração, ultrafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna e filtração profunda. Ver, por exemplo, a Patente US 6.146.902. Após os glicoconjugados individuais serem purificados, os mesmos são compostos para formular a composição imunogênica da presente invenção. Esses conjugados pneumocócicos podem ser preparados por processos separados e formulados por volume em uma formulação de dosagem única. Um método alternativo para caracterizar os glicoconjugados da presente invenção é pelo número de resíduos de lisina na proteína carreadora (por exemplo, CRM197) que se torna conjugado ao sacarídeo que pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas (grau de conjugação). A evidência para modificação de lisina da proteína carreadora, devido a ligações covalentes aos polissacarídeos, pode ser obtida por análise de aminoácido usando métodos de rotina conhecidos pelos técnicos no assunto. A conjugação resulta em uma redução no número de resíduos de lisina recuperados, em comparação ao material de partida de proteína carreadora usado para gerar os materiais conjugados.

Em uma modalidade preferida, a extensão de conjugação, como medido por consumo de lisina do glicoconjugado da presente invenção está entre 2 e 15, entre 2 e 13, entre 2 e 10, entre 2 e 8, entre 2 e 6, entre 2 e 5, entre 2 e 4, entre 3 e 15, entre 3 e 13, entre 3 e 10, entre 3 e 8, entre 3 e 6, entre 3 e 5, entre 3 e 4, entre 5 e 15, entre 5 e 10, entre 8 e 15, entre 8 e 12, entre 10 e 15 ou entre 10 e 12. Em uma modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da presente invenção é de cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15. Em outra modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da presente invenção está entre 4 e 7. Em algumas modalidades, a proteína carreadora é CRM197. Os glicoconjugados das composições da presente invenção também podem ser caracterizados pela razão (peso/peso) de polissacarídeo para proteína carreadora (Ps:Pr). Em algumas modalidades, a razão de polissacarídeo para proteína carreadora dos glicoconjugados (p/p) na composição está entre 0,5 e 3,0 (por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1 , cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1 , cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, ou cerca de 3,0). Em outras modalidades, a razão de polissacarídeo para proteína carreadora (p/p) está entre 0,5 e 2,5, entre 0,5 e 1,5, entre 0,8 e 2,5, entre 0,5 e 1,0, entre 1,0 e 1,5, entre 1,0 e 2,0, entre 0,8 e 2,4, entre 0,8 e 2,3, entre 0,8 e 2,2, entre 0,8 e 2,1, entre 0,8 e 2,0, entre 0,8 e 1,9, entre 0,8 e 1,8, entre 0,8 e 1,7, entre 0,8 e 1,6, entre 0,8 e 1,5, entre 0,8 e 1,4, entre 0,8 e 1,3, entre 0,9 e 2,4, entre 0,9 e 2,3, entre 0,9 e 2,2, entre 0,9 e

2,1, entre 0,9 e 2,0, entre 0,9 e 1,9, entre 0,9 e 1,8, entre 0,9 e 1,7, entre 0,9 e 1,6, entre 0,9 e 1,5, entre 0,9 e 1,4, entre 0,9 e 1,3, entre 0,9 e 1,2, entre 1,0 e 2,4, entre 1,0 e 2,3, entre 1,0 e 2,2, entre 1,0 e 2,1, entre 1,0 e 2,0, entre 1,0 e 1,9, entre 1,0 e 1,8, entre 1,0 e 1,7, entre 1,0 e 1,6, entre 1,0 e 1,5, entre 1,0 e 1,4, entre 1,0 e 1,3 ou entre 1,0 e 1,2. Em modalidades adicionais, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) está entre 0,8 e 1,2. Em algumas tais modalidades, a proteína carreadora é CRM197. Os glicoconjugados e as composições imunogênicas da presente invenção podem conter sacarídeo livre que não é covalentemente conjugado à proteína carreadora, mas está, não obstante, presente na composição de glicoconjugado.

O sacarídeo livre pode ser não covalentemente associado (por exemplo, não covalentemente ligado a, adsorvido a ou preso em ou com) ao glicoconjugado.

Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o conjugado de sorotipo 15A é de cerca de 1,0 a cerca de 2,0, de cerca de 1,25 a cerca de 1,75, ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,7. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 15A é de cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7 ou 1,8. Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 15C conjugado é de cerca de 1,0 a cerca de 2,0, de cerca de 1,25 a cerca de 1,75, ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,7. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 15C é de cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7 ou 1,8. Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 33F conjugado é de cerca de 1,0 a cerca de 2,0, de cerca de 1,25 a cerca de 1,75, ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,7. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 33F é de cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7 ou 1,8.

Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 35B conjugado é de cerca de 1,25 a cerca de 2,25, de cerca de 1,25 a cerca de 2,0, ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,8. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 35B é de cerca de 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2,0. Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o sorotipo 24F conjugado é de cerca de 0,5 a cerca de 1,5, de cerca de 0,75 a cerca de 1,25, ou de cerca de 0,8 a cerca de 1,0. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para sorotipo 24F é de cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0. Em uma modalidade preferida, a composição de glicoconjugado compreende menos que cerca de 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % ou 15 % de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo.

Em uma modalidade preferida, a composição de glicoconjugado compreende menos que cerca de 25 % de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo.

Em uma modalidade preferida, a composição de glicoconjugado compreende menos que cerca de 20 % de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo.

Em uma modalidade preferida, a composição de glicoconjugado compreende menos que cerca de 15 % de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo.

IV.

MÉTODOS DE USO As modalidades da presente invenção também incluem uma ou mais das composições imunogênicas multivalentes descritas na presente invenção (i) para uso em, (ii) para uso como um medicamento ou composição para, ou (iii) para uso na preparação de um medicamento para: (a) terapia (por exemplo, do corpo humano); (b) medicina; (c) inibição de infecção com Streptococcus pneumoniae; (d) indução de uma resposta imunológica ou uma resposta imunológica protetora contra S. pneumoniae; (e) profilaxia de infecção por S. pneumoniae; (f) prevenção de recorrência de infecção por S. pneumoniae; (g) redução da progressão, estabelecimento ou gravidade de sintomas patológicos associados a infecção por S. pneumoniae incluindo a prevenção de complicações associadas, como dano cerebral, perda de audição e convulsões, (h) redução da probabilidade de uma infecção por S. pneumoniae ou, (i) tratamento, profilaxia de ou atraso no estabelecimento, gravidade ou progressão de doença (ou doenças) pneumocócica, incluindo, mas não limitado a: doença pneumocócica, bacteremia pneumocócica, meningite pneumocócica, otite média e sinusite.

Nesses usos, as composições de conjugado de polissacarídeo pneumocócico multivalente da presente invenção podem ser opcionalmente empregadas em combinação com um ou mais adjuvantes, ou sem um adjuvante.

Consequentemente, a presente invenção fornece métodos para o tratamento profilático de (isto é, proteção contra) infecção por S. pneumoniae ou doença pneumocócica compreendendo administrar um ou mais dentre as composições de conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócico imunogênico multivalentes da presente invenção a um paciente em necessidade de tratamento.

As composições e formulações da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano suscetível a infecção, por exemplo, uma infecção pneumocócica, por meio da administração de tal composição ou formulação por meio de uma via sistêmica ou mucosal.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imunológica a S. pneumoniae, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para vacinar um ser humano contra uma infecção pneumocócica, compreendendo a etapa de administração ao ser humano de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Desse modo, em um aspecto, a presente invenção fornece um método para (1) induzir uma resposta imunológica em um paciente humano, (2) induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente humano, (3) vacinar um paciente humano contra uma infecção com S. pneumoniae, ou (4) reduzir a probabilidade de uma infecção por S. pneumoniae em um paciente humano, o método compreendendo administrar uma composição imunogênica multivalente da presente invenção ao paciente (isto é, qualquer composição imunogênica multivalente descrita na presente invenção, como as composições imunogênicas multivalentes descritas na Seção II, intitulada “Composições Imunogênicas Multivalentes”, supra). Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para a prevenção de pneumonia pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva em um recém-nascido (menos que 1 ano de idade), bebê (aproximadamente 12 a 24 meses), ou criança pequena (aproximadamente 2 a 5 anos). Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a prevenção de pneumonia pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva em um paciente de 6 semanas a 17 anos de idade.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a prevenção pneumonia pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva em um paciente de 6 meses a 17 anos de idade.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a prevenção de pneumonia pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva em adultos de 18 anos de idade e mais velhos.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a prevenção de pneumonia pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva em adultos de 50 anos de idade e mais velhos.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a prevenção de pneumonia pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva em adultos de 65 anos de idade e mais velhos.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a prevenção de doença pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva causada por uma ou mais dentre as seguintes cepas de Streptococcus pneumoniae: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em uma modalidade dos métodos acima, a composição compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B ou sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em outra modalidade dos métodos acima, a composição compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae consistem em sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B ou sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em uma modalidade dos métodos acima, a composição compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B ou sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em outra modalidade dos métodos acima, a composição compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae consistem em sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B ou sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em uma modalidade dos métodos acima, a composição compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em outra modalidade dos métodos acima, a composição compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae consistem em sorotipos: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B ou sorotipos: . Mostrou-se que uma vacina de conjugado pneumocócico compreendendo polissacarídeo de sorotipo 6A pode fornecer alguma proteção cruzada contra sorotipo 6C (Cooper et al., Vaccine 29 (2011) 7.207 a 7.211).

Portanto, em algumas modalidades dos métodos acima, a presente invenção também fornece uso de composições imunogênicas multivalentes que não compreendem conjugado de polissacarídeo de sorotipo 6C, mas em vez disso compreende conjugado de polissacarídeo de sorotipo 6A ou conjugados de polissacarídeo de sorotipos 6A e 6B.

Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende conjugados de polissacarídeo pneumocócico de sorotipos 6A, 6B e 6C.

Em modalidades particulares dos métodos acima, as composições imunogênicas multivalentes compreendem conjugados pneumocócicos que incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; b) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; c) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; d) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; e) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; f) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; g) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; h) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B;

i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; j) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; k) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; l) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; m) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; n) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; o) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; p) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; q) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; r) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; s) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; t) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; u) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; v) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B,

23F, 24F, 33F e 35B; w) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; x) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; y) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; z) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; e aa) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Em modalidades adicionais dos métodos acima, a composição compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos: i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou ii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou iii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; ou iv) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

Mostrou-se também que uma vacina de conjugado pneumocócico compreendendo polissacarídeo de sorotipo 10A pode fornecer alguma proteção cruzada contra sorotipo 39 (ver WO 2017/ 085586). Portanto, em algumas modalidades dos métodos acima, a presente invenção também fornece uso de composições imunogênicas multivalentes que não compreendem conjugado de polissacarídeo de sorotipo 10A, mas em vez disso compreendem conjugado de polissacarídeo de sorotipo 39. Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende conjugados de polissacarídeo pneumocócico de sorotipos 10A e 39. Em modalidades particulares dos métodos acima, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um grupo de sorotipos selecionados a partir do grupo que consiste em: bb) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; cc) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; dd) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ee) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ff) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; gg) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; hh) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; jj) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; kk) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ll) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39;

mm) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; nn) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; oo) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; pp) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; qq) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; rr) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ss) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; tt) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; uu) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; vv) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ww) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; xx) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; yy) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; zz) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B,

23F, 24F, 33F, 35B e 39; aaa) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; e bbb) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39. Mostrou-se também que conjugados imunogênicos compreendendom polissacarídeo capsular de sorotipo 15B de S. pneumoniae covalentemente ligados a uma proteína carreadora podem fornecer alguma proteção cruzada contra sorotipo 15C e/ou sorotipo 15A (ver WO 2015/110942). Portanto, em algumas modalidades dos métodos acima, a presente invenção também fornece uso de composições imunogênicas multivalentes que não compreendem conjugado de polissacarídeo de sorotipo 15C (ou 15B de-O- acetilado), mas em vez disso compreendem conjugado de polissacarídeo de sorotipo 15B (isto é, o polissacarídeo de sorotipo 15B não é substancialmente de-O-acetilado). Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende conjugados de polissacarídeo pneumocócico de sorotipos 15B e 15C (ou 15B de-O-acetilado). As composições da presente invenção são úteis em métodos para fornecer proteção complementar contra S. pneumoniae em pacientes que receberam anteriormente uma vacina pneumocócica multivalente.

Nesse uso, as composições da presente invenção podem fornecer proteção contra sorotipos particulares de S. pneumoniae que um paciente não foi anteriormente vacinado contra, pode fornecer proteção adicional contra sorotipos de S. pneumoniae que um paciente foi anteriormente vacinado contra, ou pode fornecer proteção contra tanto os sorotipos de S. pneumoniae que um paciente não foi anteriormente vacinado contra quanto os sorotipos de S. pneumoniae que um paciente foi anteriormente vacinado contra.

Desse modo, a presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imunológica, vacinação ou induzir uma resposta imunológica protetora contra S. pneumoniae em um paciente, compreendendo administrar uma composição imunogênica multivalente ao paciente, a composição compreendendo múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae , em que os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que o paciente foi anteriormente vacinado contra S. pneumoniae.

Em modalidades desse aspecto da presente invenção, a composição imunogênica multivalente pode ser qualquer composição imunogênica multivalente descrita na presente invenção.

Em modalidades particulares dos métodos da presente invenção, a composição imunogênica multivalente é administrada a um paciente que foi anteriormente tratado com uma vacina pneumocócica multivalente.

A vacina imunogênica multivalente pode ser qualquer vacina que é indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por mais que um sorotipo de S. pneumoniae.

Em modalidades específicas do método acima, o paciente foi anteriormente tratado com uma vacina pneumocócica multivalente que é indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por um ou mais sorotipos de S. pneumoniae em um grupo de sorotipos selecionados a partir do grupo que consiste em: i. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; ii. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A; iii. 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; iv. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F e 33F; v. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20; e vi. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 10A, 11A, 12F e 15B.

Em modalidades específicas do método acima, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora.

Em outras modalidades, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae que não são conjugados a uma proteína carreadora.

Em modalidades adicionais do método acima, o paciente foi anteriormente tratado com PREVNAR® 13 (Vacina de Conjugado 13-valente Pneumocócico [Proteína CRM197 Diftérica], Pfizer, Inc., Filadélfia, PA, EUA). Em modalidades adicionais do método acima, o paciente foi anteriormente tratado com PNEUMOVAX® 23 (Vacina Polivalente Pneumocócica, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EUA). Em modalidades ainda adicionais do método acima, o paciente foi anteriormente tratado com SYNFLORIX™ (Vacina de conjugado de polissacarídeo pneumocócico (adsorvido), GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Rixensart, Bélgica). Em modalidades do método acima, a composição imunogênica multivalente da presente invenção é administrada a um paciente a qualquer momento após o paciente ter recebido uma vacina pneumocócica multivalente, de acordo com o regime de tratamento fornecido pelo profissional médico, por exemplo, um médico.

Em modalidades particulares, a composição imunogênica multivalente da presente invenção é administrada a um paciente de cerca de 1 mês a cerca de 5 anos após o paciente ter recebido a vacina pneumocócica multivalente, alternativamente, de 1 mês a 1 ano, de 1 mês a 2 anos, de 1 mês a 3 anos, de 1 mês a 4 anos, de 1 mês a 6 meses, de 2 meses a 6 meses, de 2 meses a 1 ano, de 1 ano a 5 anos, de 6 meses a 5 anos, de 6 meses a 4 anos, de 6 meses a 3 anos, de 6 meses a 2 anos, de 6 meses a 1 ano, de 1 ano a 4 anos, de 1 ano a 3 anos, ou de 1 ano a 2 anos, após o paciente ter recebido a vacina pneumocócica multivalente.

Em modalidades adicionais, a composição imunogênica multivalente é administrada ao paciente cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, cerca de 6 meses, cerca de 7 meses, cerca de 8 meses, cerca de 9 meses, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses, cerca de 1 ano, cerca de 1,25 ano, cerca de 1,5 ano, cerca de 1,75 ano, cerca de 2 anos, cerca de 2,25 anos, cerca de 2,5 anos, cerca de 2,75 anos, cerca de 3 anos, cerca de 3,25 anos, cerca de 3,5 anos, cerca de 3,75 anos, cerca de 4 anos, cerca de 4,25 anos, cerca de 4,5 anos, cerca de 4,75 anos, ou cerca de 5 anos após o paciente ter recebido a vacina pneumocócica multivalente.

Em modalidades adicionais, a presente invenção fornece um método para (1) induzir uma resposta imunológica em um paciente humano, (2) induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente humano, (3) vacinar um paciente humano contra uma infecção com S. pneumoniae, ou (4) reduzir a probabilidade de uma infecção por S. pneumoniae em um paciente humano, o método compreendendo administrar uma composição imunogênica multivalente da presente invenção e administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente, em qualquer ordem.

Por exemplo, é administrado ao paciente uma vacina pneumocócica multivalente primeiro, e é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção após isso.

Alternativamente, é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção primeiro e é administrada uma vacina pneumocócica multivalente após isso.

A vacina pneumocócica multivalente pode ser qualquer vacina indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por mais que um sorotipo de S. pneumoniae.

Em modalidades específicas do método acima, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da presente invenção e uma vacina pneumocócica multivalente que é indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por um ou mais sorotipos de S. pneumoniae de um grupo de sorotipos selecionados a partir do grupo que consiste em: i. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; ii. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A; iii. 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; iv. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F e 33F; v. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20; e vi. 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 10A, 11A, 12F e 15B.

Em modalidades específicas do método acima, a vacina pneumocócica multivalente compreende polissacarídeos capsulares de sorotipos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A.

Em modalidades específicas do método acima, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora.

Em outras modalidades, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae que não são conjugados a uma proteína carreadora.

Em modalidades adicionais do método acima, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da presente invenção e é tratado com PREVNAR® 13 (Vacina de Conjugado 13-valente Pneumocócico

[Proteína CRM197 Diftérica], Pfizer, Inc., Filadélfia, PA, EUA), em qualquer ordem.

Em uma modalidade, é administrado ao paciente PREVNAR® 13 primeiro, e é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção após isso.

Em modalidades alternativas, é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção primeiro e é administrado PREVNAR® 13 após isso.

Em modalidades adicionais do método acima, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da presente invenção e é tratado com PNEUMOVAX® 23 (vacina pneumocócica polivalente, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EUA), em qualquer ordem.

Em uma modalidade, é administrado ao paciente PNEUMOVAX ® 23 primeiro, e é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção após isso.

Em modalidades alternativas, é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção primeiro e é administrado PNEUMOVAX ® 23 após isso.

Em modalidades ainda adicionais do método acima, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da presente invenção e é tratado com SYNFLORIX™ (Vacina de conjugado de polissacarídeo pneumocócico (adsorvido), GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Rixensart, Bélgica), em qualquer ordem.

Em uma modalidade, é administrado ao paciente SYNFLORIX™ primeiro, e é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção após isso.

Em uma modalidade alternativa, é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção primeiro e é administrado SYNFLORIX™ após isso.

Em algumas modalidades do método acima, a composição imunogênica multivalente e a vacina pneumocócica multivalente são administradas simultaneamente.

Como usado na presente invenção, “administração simultânea” não se limita a dosagem de duas composições ao mesmo tempo, mas inclui a administração de uma logo após a outra em qualquer ordem.

Em algumas modalidades, a composição imunogênica multivalente e a vacina pneumocócica multivalente são administradas por meio de administração intramuscular ou subcutânea em sítios anatômicos separados, por exemplo, dois braços diferentes.

Em algumas modalidades do método acima, a quantidade de tempo entre a administração da composição imunogênica multivalente da presente invenção e a vacina pneumocócica multivalente é de cerca de 4 semanas a cerca de 1 ano.

Em modalidades alternativas, a quantidade de tempo é de cerca de 1 mês a cerca de 5 anos.

Em uma modalidade, é administrado ao paciente a vacina pneumocócica multivalente primeiro e a composição imunogênica multivalente da presente invenção após isso.

Em modalidades alternativas, é administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da presente invenção primeiro e é administrada a vacina pneumocócica multivalente após isso.

Também é fornecido um método para induzir uma resposta imunológica, vacinar ou induzir uma resposta imunológica protetora contra S. pneumoniae em um paciente, compreendendo: (1) administrar uma composição imunogênica multivalente da presente invenção ao paciente, (2) esperar por uma quantidade predeterminada de tempo para passar, e (3) administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente.

Nesse método, a composição imunogênica multivalente pode compreender qualquer combinação de conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae estabelecidos na presente invenção e a vacina pneumocócica multivalente pode ser qualquer vacina indicada para a prevenção de doença causada por mais que um sorotipo de S. pneumoniae.

Também é fornecido pela presente invenção um método para induzir uma resposta imunológica, vacinar ou induzir uma resposta imunológica protetora contra S. pneumoniae em um paciente, compreendendo: (1) administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente, (2) esperar por uma quantidade predeterminada de tempo para passar, e (3) administrar uma composição imunogênica multivalente da presente invenção ao paciente.

Nesse método, a composição imunogênica multivalente pode compreender qualquer combinação de conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae estabelecidos na presente invenção e a vacina pneumocócica multivalente pode ser qualquer vacina indicada para a prevenção de doença causada por mais que um sorotipo de S. pneumoniae.

Em algumas modalidades dos métodos acima, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora.

Em modalidades alternativas, a vacina pneumocócica multivalente compreende polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae que não são conjugados a uma proteína carreadora.

Em qualquer uma das modalidades dos métodos da presente invenção (isto é, qualquer um dos métodos descritos na presente invenção), o método pode compreender adicionalmente administrar uma ou mais doses adicionais de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção ao paciente.

Em tais métodos, o paciente pode já ter recebido uma vacina pneumocócica multivalente antes de receber uma primeira dose de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção, supra, ou pode não ter sido vacinado contra S. pneumoniae antes de receber uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Desse modo, em uma modalidade, é administrado a um paciente que recebeu uma vacina pneumocócica multivalente indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por S. pneumoniae duas ou mais doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Em modalidades alternativas, é administrado a um paciente que não foi anteriormente tratado com qualquer vacina indicada para a prevenção de doença pneumocócica, duas ou mais doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Em modalidades do método acima, as duas ou mais doses são da mesma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Em modalidades alternativas, as duas ou mais doses são de composições imunogênicas multivalentes diferentes da presente invenção.

Em modalidades específicas de qualquer um desses métodos, é administrado ao paciente duas, três ou quatro doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Em modalidades particulares, o paciente é imunocomprometido (por exemplo, está em um regime imunossupressivo após um transplante de célula tronco). Em algumas modalidades, a quantidade de tempo entre administração de cada dose de composição imunogênica multivalente da presente invenção é de cerca de 4 semanas a cerca de 1 ano.

Na modalidade alternativa, a quantidade de tempo entre administração de cada dose de composição imunogênica multivalente da presente invenção é de cerca de 1 mês a cerca de 5 anos.

Em modalidades de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente a ser tratado com a composição (ou composições) da presente invenção é um ser humano.

Em determinadas modalidades, o paciente humano é um recém-nascido (aproximadamente 6 semanas a 12 meses). Em determinadas modalidades, o paciente humano é um bebê (aproximadamente 12 a 24 meses), ou criança pequena (aproximadamente 2 a 5 anos). As composições dessa presente invenção também são adequadas para o uso com crianças mais velhas, adolescentes e adultos (por exemplo, com idade de 18 a 45 anos, com idade de 18 a 50 anos, com idade de 18 a 55 anos, com idade de 18 a 60 anos ou 18 a 65 anos). Em outras modalidades de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente é de cerca de 2 a cerca de 18 anos de idade.

Em modalidades adicionais de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente tem 18 anos de idade ou mais.

Em modalidades adicionais dos métodos da presente invenção, o paciente é um recém-nascido e o recém-nascido é administrado com 1, 2 ou 3 doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

A quantidade de tempo entre a administração de cada dose pode variar, mas um exemplo de uma programação de dosagem inclui a administração de uma dose a 2 meses de idade, então, outra administração de uma dose a 4 meses de idade, e finalmente uma administração final de uma dose a 6 meses de idade.

Outro exemplo de uma programação de administração em recém-nascidos é a administração de uma dose a 2 meses de idade e, então, outra administração de uma dose a 3 meses de idade.

Outro exemplo de uma programação de administração em recém-nascidos é a administração de uma dose a 2 meses de idade e, então, outra administração de uma dose a 3 meses de idade, e finalmente uma administração final de uma dose a 6 meses de idade.

Em modalidades adicionais, um paciente recém-nascido pode receber uma dose de “reforço” adicional de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção quando o recém-nascido se torna um bebê.

Por exemplo, um recém-

nascido recebe a dose a 2 meses de idade, então, outra administração de uma dose a 4 meses de idade, e finalmente uma administração final de uma dose a 6 meses de idade, então, quando o recém-nascido chega à idade de um bebê, uma dose de "reforço" adicional de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção é administrada entre 11 a 15 meses de idade.

Em uma modalidade, é administrado a um recém-nascido 2 doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Em uma modalidade, é administrado a um recém-nascido 3 doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção.

Em uma modalidade, é administrado a um paciente 3 doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção, em que as primeira e segunda doses são administradas entre 2 e 10 meses de idade e a terceira dose é administrada entre 11 a 15 meses de idade.

Em uma modalidade, é administrado a um paciente 4 doses de uma composição imunogênica multivalente da presente invenção, em que a primeira dose é administrada a 2 meses de idade, a segunda dose é administrada a 4 meses de idade, a terceira dose é administrada a 6 meses de idade e a quarta dose é administrada entre 11 a 15 meses de idade.

Em modalidades adicionais dos métodos da presente invenção, o paciente humano é idoso.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente tem 50 anos de idade ou mais.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente tem 55 anos de idade ou mais.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente tem 60 anos de idade ou mais.

Em modalidades ainda adicionais de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente tem 65 anos de idade ou mais.

Em modalidades adicionais de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente tem 70 anos de idade ou mais.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da presente invenção, o paciente a ser tratado com uma composição imunogênica da presente invenção é imunocomprometido.

Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da presente invenção, a composição imunogênica multivalente da presente invenção é administrada simultaneamente com uma vacina contra influenza.

Em determinadas modalidades, a vacina de influenza é uma “vacina contra a gripe de idosos”, uma vacina contra a gripe de dose alta indicada para os idosos, por exemplo, pessoas com idade de 65 e mais velhos.

A presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente contra uma infecção pneumocócica compreendendo a etapa de administração ao paciente de uma quantidade imunologicamente eficaz de qualquer uma das composições de conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócico imunogênico multivalentes descritas na presente invenção.

As quantidades ideais de componentes para uma vacina particular (por exemplo, uma composição imunogênica multivalente da presente invenção) podem ser determinadas por estudos padrão que envolvem a observação de respostas imunológicas adequadas em indivíduos.

Por exemplo, em outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação a partir de estudos em animais para dados humanos.

Em outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para a prevenção e/ou redução de síndromes clínicas primárias causadas por micróbios, por exemplo, S. pneumoniae, incluindo tanto infecções invasivas (meningite, pneumonia e bacteremia) quanto infecções não invasivas (otite média aguda e sinusite).

A administração das composições da presente invenção pode incluir uma ou mais dentre: injeção por meio das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por meio da administração mucosal aos tratos oral/alimentar, respiratório ou geniturinário.

Em uma modalidade, a administração intranasal é usada para o tratamento de pneumonia ou otite média (como transporte nasofaríngeo de pneumocócicos pode ser mais eficazmente prevenido, desse modo, atenuando a infecção em seu estágio mais inicial). Em modalidades específicas, as composições da presente invenção são administradas ao paciente por meio de administração intramuscular ou subcutânea.

Todas as publicações mencionadas na presente invenção são incorporadas a título de referência para propósitos de descrição e revelação de metodologias e materiais que possam ser usados em conexão com a presente invenção.

Descrevendo-se modalidades diferentes da presente invenção na presente invenção com referência aos desenhos anexos, deve-se entender que a presente invenção não é limitada àquelas modalidades precisas, e que várias alterações e modificações podem ser efetuadas nessas por um técnico no assunto sem se afastar do escopo ou do espírito da presente invenção, como definido nas reivindicações anexas.

Os seguintes exemplos ilustram, porém não limitam, a presente invenção.

EXEMPLO 1 Preparação de Polissacarídeos Capsulares de S. pneumoniae Os métodos para cultivar pneumocócicos são bem conhecidos no estado da técnica.

Ver, por exemplo, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Os métodos para preparar polissacarídeos capsulares pneumocócicos também são bem conhecidos no estado da técnica.

Ver, por exemplo, Patente européia EP 0 497 524 B1. O processo descrito abaixo segue, de modo geral, o método descrito na Patente européia EP 0 497 524 B1 e é aplicável, de modo geral, a todos os sorotipos pneumocócicos.

Os isolados de cepas pneumocócicas para sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 33F e 35B foram obtidos a partir da Coleta de Cultura da Merck.

As cepas para sorotipos 23B foram obtidas a partir de Centros de Controle e Prevenção de Doença e Universidade de Alabama, Birmingham.

As cepas para o sorotipo 24F foram obtidas a partir de Coleta de Cultura da Merck e Universidade de Alabama, Birmingham.

Quando necessário, os subtipos foram diferenciados com base na reação de Quellung usando antissoros específicos.

Ver, por exemplo, a patente US 5.847.112. Os isolados obtidos foram adicionalmente isolados clonalmente por plaqueamento em série em dois estágios nas placas de ágar que consistem em um meio isento de componente animal contendo peptona de soja, extrato de levedura e glicose sem hemina.

Para o sorotipo 7F, as placas de ágar usadas também contiveram hemina.

Os isolados clonais para cada sorotipo foram adicionalmente expandidos em cultura líquida usando média isento de componente animal contendo peptona de soja, extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de potássio, glicose e glicerol para preparar os bancos de célula pré-principais.

A produção de cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico consistiu em um expansão celular e fermentação de produção de lote seguida por inativação química antes de purificação a jusante.

Uma ampola de banco celular descongelada a partir de cada sorotipo foi expandida usando um frasco ou garrafa de cultura agitada contendo um meio de crescimento isento de componente animal pré-esterilizado contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou ultrafiltrado de extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de potássio e glicose.

A cultura de expansão celular foi cultivada em um frasco ou garrafa agitada vedada para minimizar troca de gás com controle de temperatura e agitação.

Durante a expansão celular desses sorotipos, a temperatura, o pH, a pressão e a agitação foram controlados.

A sobreposição de fluxo de ar também foi controlada visto que a pulverização não foi usada.

Após a obtenção de uma densidade de cultura especificada, como medido por densidade óptica a 600 nm, uma porção da cultura de expansão celular foi transferida para um fermentador de produção contendo meio de crescimento isento de componente animal pré-esterilizado contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou ultrafiltrado de extrato de levedura, cloreto de sódio, fosfato de potássio e glicose.

A temperatura, o pH, a pressão e a agitação foram controlados.

A sobreposição de fluxo de ar também foi controlada visto que a pulverização não foi usada.

A fermentação de lote foi terminada por meio da adição de um agente de inativação químico, fenol, quando a glicose foi quase esgotada.

O fenol puro foi adicionado a uma concentração final de 0,8 a 1,2 % para inativar as células e liberar o polissacarídeo capsular da parede celular.

A inativação primária ocorre por um tempo específico no fermentador em que a temperatura e a agitação continuam a ser controladas.

Após inativação primária, o lote foi transferido para outro recipiente em que foi mantido por um tempo adicional específico em temperatura e agitação controladas para a inativação completa.

Isso foi confirmado por técnicas de plaqueamento microbiano ou por verificação da concentração de fenol e do tempo específico.

O caldo inativado foi, então, purificado.

EXEMPLO 2

Purificação de Polissacarídeos Pneumocócicos O processo de purificação para os polissacarídeos pneumocócicos consistiu em diversas etapas de centrifugação, filtração profunda, operações de concentração/diafiltração e precipitação.

Todos os procedimentos foram desempenhados em temperatura ambiente, salvo especificado o contrário.

O caldo inativado das culturas de fermentador de S. pneumoniae foi floculado com um polímero catiônico (como BPA-1000, TRETOLITE® (Baker Hughes Inc., Houston, TX), Espectro 8160, poli(etilenoimina), e Millipore pDADMAC). Os polímeros catiônicos se ligaram às proteínas de impureza, aos ácidos nucleicos e aos resíduos celulares.

Após a etapa de floculação e um período de envelhecimento, os sólidos floculados foram removidos por meio de etapas de centrifugação e múltiplas filtrações profundas.

O caldo clarificado foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de MWCO de 100 kDa a 500 kDa (corte de peso molecular). A diafiltração foi obtida usando Tris, tampão de MgCl2 e tampão de fosfato de sódio.

A diafiltração removeu ácido nucleico e proteína residuais.

A remoção de impurezas adicionais foi obtida por re-precipitação do polissacarídeo em acetato de sódio e fenol com álcool e/ou isopropanol desnaturado.

Durante a etapa de precipitação de fenol, acetato de sódio em tampão de solução salina de fosfato de sódio e fenol (fenóis liquefeitos ou fenóis sólidos) foram carregados para o retentado diafiltrado.

O fracionamento de álcool do polissacarídeo foi, então, conduzido em dois estágios.

No primeiro estágio um álcool de percentual baixo foi adicionado à preparação para precipitar resíduos celulares e outras impurezas indesejadas, enquanto o polissacarídeo bruto permaneceu em solução.

As impurezas foram removidas por meio de centrifugação seguida por uma etapa de filtração profunda.

O polissacarídeo foi, então, recuperado a partir da solução adicionando-se isopropanol adicional ou álcool desnaturado ao lote.

O pellet de polissacarídeo precipitado foi recuperado por centrifugação, triturado e seco como um pó e armazenado congelado a - 70 °C.

EXEMPLO 3 Preparação de Conjugado de Sorotipo 1 para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por diálise antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 25.000 kPa/5 passadas (250 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 15 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 2,5 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 10 % p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi dialisado a aproximadamente 4 C por 3 dias contra cloreto de sódio 150 mM, 0,05 % (p/v) de polissorbato 20, usando um cassete de diálise de NMWCO de 300 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron) , dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 4 Preparação de Conjugado de Sorotipo 1 para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 25.000 kPa/5 passadas (250 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 15 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 6,9 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 120 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O polissorbato 20 foi adicionado ao lote de retentado a uma concentração de 0,05 % (p/v), então, o lote foi filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 5 Preparação de Conjugado de Sorotipo 1 para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 25.000 kPa/5 passadas (250 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 15 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 6,9 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 120 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O polissorbato 20 foi adicionado ao lote de retentado a uma concentração de 0,05 % (p/v), então, o lote foi filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 6 Preparação de Conjugado de Sorotipo 3 para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 81.000 kPa/6 passadas (810 bar/6 passadas) seguido por 90.000 kPa/3 passadas (900 bar/3 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 12 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 2,5 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 10 % p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,25 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,35. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 7 Preparação de Conjugado de Sorotipo 3 para Estudos Polivalentes de PCV22 e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 38.000 kPa/5 passadas (380 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 12 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrado em 0,2 mícron e combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,6. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 4,1 g/L e 150 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 120 horas a 10 °C para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio

Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote foi filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 8 Preparação de Conjugado de Sorotipo 4 para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por diálise antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura,

concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 30.000 kPa/5 passadas (300 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 50 °C e pH 4,1 com um tampão de acetato de sódio para parcialmente decetalizar o polissacarídeo.

A solução de polissacarídeo foi, então, resfriada para 22 °C antes de ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi dialisado a aproximadamente 4 C por 3 dias contra cloreto de sódio 150 mM, 0,05 % (p/v) de polissorbato 20, usando um cassete de diálise de NMWCO de 300 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 9 Preparação de Conjugado de Sorotipo 4 para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO + Aq) e PCV22 Usando Conjugação Aquosa

O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 30.000 kPa/5 passadas (300 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 50 °C e pH 4,1 com um tampão de acetato de sódio para parcialmente decetalizar o polissacarídeo.

A solução de polissacarídeo foi, então, foi resfriada para 22 °C antes de ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrado em 0,2 mícron e combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 8,3 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 120 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

Então, o lote foi filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 10 Preparação de Conjugado de Sorotipo 5 para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por diálise antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 60.000 kPa/5 passadas (600 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 4°C e pH 4,1 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 4°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra Acetato de Sódio 10 mM, pH 4,1 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa, seguido pela diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

A solução de polissacarídeo foi aumentada com cloreto de sódio a uma concentração de 20 mM.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado,

e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Diluição e neutralização O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi dialisado a aproximadamente 4 C por 3 dias contra cloreto de sódio 150 mM, 0,05 % (p/v) de polissorbato 20, usando um cassete de diálise de NMWCO de 300 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 11 Preparação de Conjugado de Sorotipo 5 para Estudos Polivalentes de PCV22 e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 60.000 kPa/5 passadas (600 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 4°C e pH 4,1 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 4°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de acetato de sódio, pH 4,1 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,4. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 3,8 g/L e 150 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 96 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Purificação e neutralização

Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra 300 mM de bicarbonato de sódio pH 9,3 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, neutralizado com fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0. Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O polissorbato 20 foi adicionado ao lote de retentado a uma concentração de 0,05 % (p/v) e, então, o lote foi filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 12 Preparação de Conjugado de Sorotipo 6A para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO+Aq) e PCV 22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 20.000 kPa/5 passadas (200 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 1,5 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,4. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 °C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 13 Preparação de Conjugado de Sorotipo 6B para Estudos Polivalentes de PCV 23 (DMSO) e PCV 23 (DMSO/Aq) Usando Conjugação de DMSO

O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 20.000 kPa/5 passadas (200 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 1,85 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,35. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 14 Preparação de Conjugado de Sorotipo 6B para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 20.000 kPa/5 passadas (200 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 1,75 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,35. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio

O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 15 Preparação de Conjugado de Sorotipo 7F para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 15.000 kPa/7 passadas (150 bar/7 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 4°C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 4°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,6 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 16 Preparação de Conjugado de Sorotipo 7F para Estudo Polivalente de PCV22

Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 15.000 kPa/7 passadas (150 bar/7 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 4°C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 4°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,04 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 17 Preparação de Conjugado de Sorotipo 8 para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 60.000 kPa/6 passadas (600 bar/6 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 4,5 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

Após a mescla, a reação de conjugação prosseguiu a 22 °C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 18 Preparação de Conjugado de Sorotipo 9V para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 23.000 kPa/5,5 passadas (230 bar/5,5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 6 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de

3,0g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,3. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com um pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 19 Preparação de Conjugado de Sorotipo 9V para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 10.000 kPa/5 passadas (100 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 6 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O

CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrado em 0,2 mícron e combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,7. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 10,0 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 120 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O polissorbato 20 foi adicionado ao lote de retentado a uma concentração de 0,05 % (p/v), então, o lote foi filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 20 Preparação de Conjugado de Sorotipo 9V para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 10.000 kPa/5 passadas (100 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 6 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrado em 0,2 mícron e combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,7. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 10,0 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 120 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM,

pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O polissorbato 20 foi adicionado ao lote de retentado a uma concentração de 0,05 % (p/v), então, o lote foi filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 21 Preparação de Conjugado de Sorotipo 10A para Estudo Polivalente de PCV23 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 61.500 kPa/5 passadas (615 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,5 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,6. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 22 Preparação de Conjugado de Sorotipo 10A para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 60.000 kPa/5 passadas (600 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,4 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,6. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM, pH 7 seguido por diafiltração contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 23 Preparação de Conjugado de Sorotipo 10A para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 60.000 kPa/5 passadas (600 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,8 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,75. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa. Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa. O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO X Preparação de Conjugado de Sorotipo 11A para Estudo Polivalente de PCV24 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração. O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron. Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados. Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo

O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 80.000 kPa/8 passadas (800 bar/8 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e

CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,3 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4°C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 24 Preparação de Conjugado de Sorotipo 12F para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi reduzido em tamanho por hidrólise ácida adicionando-se ácido acético a 200 mM, incubando-se a 80 °C por 155 minutos, então, neutralizando-se por adição de tampão fosfato de potássio frio de pH 7 a 400 mM.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,7 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,8. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 25 Preparação de Conjugado de Sorotipo 12F para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi reduzido em tamanho por hidrólise ácida adicionando-se ácido acético a 200 mM, incubando-se a 90°C por 60 minutos, então, neutralizando-se por adição de tampão fosfato de potássio frio de pH 7 a 400 mM.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7,0, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 26 Preparação de Conjugado de Sorotipo 14 para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por diálise antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 20.000 kPa/6 passadas (200 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e

CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 1,8 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi dialisado a aproximadamente 4 C por 22,5 horas contra cloreto de sódio 150 mM, 0,05 % de polissorbato 20, usando um cassete de diálise de MWCO de 300 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 27 Preparação de Conjugado de Sorotipo 14 para Estudo Polivalente de PCV22 e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 20.000 kPa/6 passadas (200 bar/6 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrado em 0,2 mícron e combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 3,8 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 72 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote foi, então, filtrado em 0,2 mícron.

O lote foi ajustado para uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 28 Preparação de Conjugado de Sorotipo 15A para Estudos Polivalentes de

PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 21.000 kPa/5 passadas (210 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO que foram pré-aquecidos a 34 °C.

A solução de polissacarídeo foi aumentada com cloreto de sódio a uma concentração de 25 mM.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 34°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 34°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 29 Preparação de Conjugado de Sorotipo 15A para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 20.000 kPa/5 passadas (200 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de

NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5 % p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO que foram pré-aquecidos a 34 °C.

A solução de polissacarídeo foi aumentada com cloreto de sódio a uma concentração de 25 mM.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 34°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 30 Preparação de Conjugado de Sorotipo 15C para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O derivado de polissacarídeo de sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, submetido a hidrólise de base amena para liberar grupos O-acetila, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho de polissacarídeo, hidrólise de base e oxidação O pó de Ps capsular pneumocócico de sorotipo 15B purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 30.000 kPa/5 passadas (300 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi aquecida a 60 °C e o tampão de pH9 de bicarbonato de sódio foi adicionado a uma concentração final de 50 mM.

O lote foi incubado com mistura por 13 horas a 60 °C para liberar grupos O-acetila.

O tampão fosfato de potássio de pH 6 foi adicionado a uma concentração final de 136 mM para neutralizar pH e a solução foi resfriada à temperatura ambiente.

A solução foi, então, concentrada e diafiltrada contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM,

pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,75. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio

150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 31 Preparação de Conjugado de Sorotipo 15C para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação de DMSO O derivado de polissacarídeo de sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, submetido a hidrólise de base amena para liberar grupos O-acetila, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho de polissacarídeo, hidrólise de base e oxidação O pó de Ps capsular pneumocócico de sorotipo 15B purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 30.000 kPa/5 passadas (300 bar/5 passadas). A solução de polissacarídeo reduzido em tamanho foi aquecida a 60 °C e tampão de pH 9,4 de bicarbonato de sódio foi adicionado a uma concentração final de 50 mM.

O lote foi incubado com mistura por 12 horas a 60 °C para liberar grupos O-acetila.

O tampão fosfato de potássio de pH 6 foi adicionado a uma concentração final de 150 mM para neutralizar pH e a solução foi resfriada à temperatura ambiente.

A solução foi, então, concentrada e diafiltrada contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,2 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,75. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 32 Preparação de Conjugado de Sorotipo 18C para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi reduzido em tamanho por hidrólise ácida adicionando-se ácido acético a 200 mM, incubando-se a 90°C por 160 minutos, então, neutralizando-se por adição de tampão fosfato de potássio frio de pH 7 a 400 mM.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM,

pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,49 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio

150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 33 Preparação de Conjugado de Sorotipo 18C para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi reduzido em tamanho por hidrólise ácida adicionando-se ácido acético a 200 mM, incubando-se a 90°C por 160 minutos, então, neutralizando-se por adição de tampão fosfato de potássio frio de pH 7 a 400 mM.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,49 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 34 Preparação de Conjugado de Sorotipo 19A para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,22 mícron.

O polissacarídeo foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,8 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,33. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 35 Preparação de Conjugado de Sorotipo 19A para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,22 mícron.

O polissacarídeo foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 3,8 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,33. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 36 Preparação de Conjugado de Sorotipo 19F para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO), PCV23 (DMSO + Aq) e PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 15.000 kPa/5 passadas (150 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 4°C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 4°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,2. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, incubado a 22 °C por 4,5 dias.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 37 Preparação de Conjugado de Sorotipo 22F para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 81.000 kPa/5 passadas (810 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,3 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron com pré-filtro de 0,5 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 38 Preparação de Conjugado de Sorotipo 22F para Estudos Polivalentes de PCV22 e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 35.000 kPa/5 passadas (350 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O

CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrado em 0,2 mícron e combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,6. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram de 7,5 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 120 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

Fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote foi filtrado em 0,2 mícron e foi ajustada para uma concentração de polissacarídeo de 1.0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 39 Preparação de Sorotipo 23B Conjugado para PCV23 (DMSO), Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO + Aq) e PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 40.000 kPa/5 passadas (400 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando um 30 kD membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 40 Preparação de Conjugado de Sorotipo 23F para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 40.000 kPa/5 passadas (400 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 5 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,1 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,25. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 41 Preparação de Conjugado de Sorotipo 23F para Estudo Polivalente de PCV22

Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 40.000 kPa/5 passadas (400 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,1 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,25. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron, então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60°C.

EXEMPLO 42 Preparação de Conjugado de Sorotipo 24F para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23(DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi reduzido em tamanho por hidrólise ácida adicionando-se ácido acético a 200 mM, incubando-se a 80°C por 150 minutos, então, neutralizando-se por adição de tampão fosfato de potássio frio de pH 7 a 400 mM.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 2 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 10% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

A solução de polissacarídeo foi aumentada com cloreto de sódio a uma concentração final de 10 mM.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 1,4 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando um 30 kD membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 43 Preparação de Conjugado de Sorotipo 24F para Estudo Polivalente de PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi reduzido em tamanho por hidrólise ácida adicionando-se ácido acético a 200 mM, incubando-se a 80°C por 150 minutos, então, neutralizando-se por adição de tampão fosfato de potássio frio de pH 7 a 400 mM.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 2 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 10% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

A solução de polissacarídeo foi aumentada com cloreto de sódio a uma concentração final de 25 mM.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 1,4 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando um 30 kD membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 44 Preparação de Conjugado de Sorotipo 33F para Estudo Polivalente de PCV23 (DMSO) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 51.000 kPa/5 passadas (510 bar/5 passadas). O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 2,5 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 1,75. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

O cianoboro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu a 22°C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 45 Preparação de Conjugado de Sorotipo 33F para Estudos Polivalentes de PCV22 e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação Aquosa O polissacarídeo foi dissolvido, tamanho reduzido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O CRM197 purificado foi, então, conjugado ao polissacarídeo ativado utilizando o cloreto de níquel na mistura de reação, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho e oxidação de polissacarídeo O pó de polissacarídeo capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água, e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular.

A pressão de homogeneização e número de passadas através do homogeneizador foram controlados a 35.000 kPa/5 passadas (350 bar/5 passadas) para reduzir o tamanho para uma massa molecular alvo.

O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 A solução de polissacarídeo oxidada foi misturada com água e fosfato de potássio 1,5 M, pH 7,0. O pH do tampão selecionado foi para aprimorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação.

O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrado em 0,2 mícron e combinado com a solução de polissacarídeo tamponada a uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 0,7. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram 6,5 g/L e 100 mM, respectivamente.

A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante.

A solução foi, então, filtrada em 0,2 mícron.

O cloreto de níquel foi adicionado a aproximadamente 2 mM usando uma solução de cloreto de níquel 100 mM.

O cianoboro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado.

A conjugação prosseguiu por 96 horas para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boro-hidreto de sódio Após a reação de conjugação, o lote foi diluído para uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,5 g/L, resfriada a 2 a 8 °C, e filtrada em 1,2 mícron.

O lote foi diafiltrado contra fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa.

O lote, recuperado no retentado, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e pH ajustado com a adição de bicarbonato de sódio 1,2 M, pH 9,4. O boro-hidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. fosfato de potássio 1,5 M, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra L-histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote foi filtrado em 0,2 mícron e foi ajustada para uma concentração de polissacarídeo de 1.0 g/L com L-histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, tampão de pH 7,0. O lote foi dispensado em alíquotas e congelado a ≤ −60 °C.

EXEMPLO 46 Preparação de Conjugado de Sorotipo 35B para Estudos Polivalentes de PCV23 (DMSO) e PCV23 (DMSO + Aq) Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

A solução de polissacarídeo foi aumentada com cloreto de sódio a uma concentração final de 20 mM.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 6,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 3,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

A conjugação prosseguiu a 34 °C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 34°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando um 30 kD membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO 47 Preparação de Conjugado de Sorotipo 35B para Estudo Polivalente de

PCV22 Usando Conjugação de DMSO O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativados e tampão trocado por ultrafiltração.

O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo.

O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron.

Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados.

Oxidação de polissacarídeo O pó de Ps capsular pneumocócico purificado foi dissolvido em água e filtrado em 0,45 mícron.

O polissacarídeo dissolvido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação.

A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio 100 mM.

A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22°C.

O produto ativado foi diafiltrado contra fosfato de potássio 10 mM, pH 6,4 seguido por diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197 O CRM197 purificado, obtido através de expressão em Pseudomonas fluorescens como anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrado contra fosfato 2 mM, tampão de pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrado em 0,2 mícron.

O polissacarídeo ativado foi formulado por liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% p/v.

CRM197 foi formulado por liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1 % p/v.

As soluções de Ps e CRM197 formuladas foram individualmente liofilizadas.

Os materiais de Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO.

A solução de polissacarídeo foi aumentada com cloreto de sódio a uma concentração final de 20 mM.

As soluções de polissacarídeo e CRM197 foram mescladas para obter uma concentração de polissacarídeo de 6,0 g de Ps/L e uma razão de massa de polissacarídeo para CRM197 de 3,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão de polissacarídeo para CRM197 no conjugado resultante.

A conjugação prosseguiu a 34 °C.

Redução com boro-hidreto de sódio O boro-hidreto de sódio (2 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado após a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 34°C.

O lote foi diluído em cloreto de sódio 150 mM, com aproximadamente 0,025 % (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 C.

O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH.

O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 C contra cloreto de sódio 150 mM, fosfato de potássio 25 mM pH 7, usando um 30 kD membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO.

Filtração final e armazenamento de produto O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra histidina 10 mM em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0, com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

O lote de retentado foi filtrado em 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com histidina 10 mM adicional em cloreto de sódio 150 mM, pH 7,0 com 0,015 % (p/v) de polissorbato 20, dispensado em alíquotas e congelado a ≤ -60°C.

EXEMPLO Y Preparação de Sorotipos para Estudo Polivalente de PCV24 Usando Conjugação de DMSO Os conjugados foram preparados para o estudo de PCV24 usando métodos similares àqueles descritos em Exemplos anteriores. Para cada sorotipo, o polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativado e o tampão trocado por ultrafiltração. O polissacarídeo ativado e CRM197 purificado foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de polissacarídeo e CRM197 redissolvidas foram, então, combinadas e conjugadas como descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração final de 0,2 mícron. Diversos parâmetros de processo em cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para render os conjugados com atributos desejados. As diferenças dos Exemplos anteriores podem incluir: pressão de homogeneização e número de passadas, tempo de oxidação, concentração de polissacarídeo e sacarose para liofilização, concentração de polissacarídeo durante a conjugação, razão de massa de polissacarídeo para CRM197 e concentração de sal na reação de conjugação. EXEMPLO 48 Formulação de Vacinas de Conjugado Pneumocócico Os conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos individuais preparados utilizando produtos químicos diferentes, como descrito no Exemplos, supra, foram usados para a formulação de vacinas de conjugado pneumocócico

8-, 15-, 22-, 23- e 24-valentes.

O produto farmacológico de vacina de PCV8/APA é preparado por conjugação individual da proteína CRM197 para Tipos (-8, -10A, -12F, -15A, -15C, -23B, -24F e -35B) de Polissacarídeo pneumocócico (PnPs) usando aminação redutiva em um solvente aprótico (também denominado produto químico de DMSO) e formulado em L-Histidina 20 mM pH 5,8 e NaCl 150 mM, polissorbato 20 (PS-20) a 0,1 % p/v e 250 µg [Al]/mL na forma de Adjuvante de Fosfato de Alumínio como o adjuvante a 4 µg/mL, cada sorotipo para uma concentração de polissacarídeo total de 32 µg/mL.

O produto farmacológico de vacina de PCV15/APA é preparado por conjugação individual da proteína CRM197 para Tipos (-6A, -6B, -7F, -9V, -18C, - 19A, -19F, -23F) de Polissacarídeo pneumocócico (PnPs) usando aminação redutiva em um solvente aprótico (também denominado produto químico de DMSO) ou para Tipos -1, -3,-4, -5, -14, -22F e -33F usando aminação redutiva em um solvente prótico (também denominado produto químico aquoso) e formulado em L-Histidina 20 mM pH 5,8 e NaCl 150 mM, polissorbato-20 (PS-20) a 0,2 % p/v e 250 µg [Al]/mL na forma de Fosfato de Alumínio como o adjuvante a 4 µg/mL de cada sorotipo (exceto 6B a 8 µg/mL) para uma concentração de polissacarídeo total de 64 µg/mL.

O produto farmacológico de vacina de PCV22 usado para imunizar camundongos e coelhos foi preparado por conjugação individual da proteína CRM197 para Tipos (-1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, -9V, -10A, -12F,-14, -15A, -15C, - 18C, -19A, -19F, -22F, -23B, -23F, -24F, -33F e -35B) de Polissacarídeo pneumocócico (PnPs) usando aminação redutiva em soluções próticas e apróticas (DMSO/Aquoso “Aq”) e formuladas em L-Histidina 20 mM pH 5,8 e NaCl 150 mM e polissorbato-20 (PS-20) a 0,2 % p/v a 0,8 µg/mL, cada sorotipo (exceto 6B a 1,6 µg/mL) para uma concentração de polissacarídeo total de 18,4 µg/mL denominada PCV22 sem adjuvante ou sem adj.

Em outra modalidade específica, a formulação é preparada com 50 µg [Al]/mL na forma de Fosfato de Alumínio como o adjuvante denominado PCV22/APA.

O produto farmacológico de vacina de PCV23 é preparado por conjugação individual da proteína CRM197 para Tipos (-1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, -8, -9V, -10A, -12F, -14, -15A, -15C, -18C, -19A, -19F, -22F, -23B, -23F, -24F, -33F e -35B) de Polissacarídeo pneumocócico (PnPs) usando aminação redutiva em um solvente aprótico (também denominado produto químico de DMSO) e formulado em L-Histidina 20 mM pH 5,8 e NaCl 150 mM e polissorbato-20 (PS- 20) a 0,2 % p/v a 4 µg/mL, cada -sorotipo para uma concentração de polissacarídeo total de 92 µg/mL, denominado como PCV23 sem adjuv.

Em outra modalidade específica, a formulação é preparada com 250 µg [Al]/mL na forma de Adjuvante de Fosfato de Alumínio como o adjuvante denominado PCV23/APA.

Em outra modalidade, o produto farmacológico de vacina de PCV23 é preparado por conjugação individual da proteína CRM197 para Tipos (-1, -3, -4, -5, -9V, -14, -22F e -33F) de Polissacarídeo pneumocócico (PnPs) usando aminação redutiva em um solvente prótico (também denominado produto químico aquoso) e conjugando-se a proteína CRM197 para Tipos (-6A, -6B, -7F, -8, -10A, -12F, -15A, -15C, -18C, -19A, -19F, -23B, -23F, -24F e -35B) de Polissacarídeo pneumocócico (PnPs) usando aminação redutiva em um solvente aprótico (também denominado produto químico de DMSO). O produto farmacológico de vacina é formulado em L-Histidina 20 mM pH 5,8 e NaCl 150 mM e Polissorbato-20 (PS- 20) a 0,1 % p/v com CarboxiMetilCelulose (CMC) a 0,01 % a 4 µg/mL, cada sorotipo (exceto 6B a 8 µg/mL) para uma concentração de polissacarídeo total de 96 µg/mL e preparado com 250 µg [Al]/mL na forma de Adjuvante de Fosfato de Alumínio como o adjuvante e denominado PCV23 (DMSO + Aq)/APA.

A composição imunogênica multivalente de PCV24 é preparada por conjugação individual da proteína CRM197 para sorotipos de polissacarídeo (PnPs) de S. pneumoniae -1, -3, -4, -5, -6A, -6B, -7F, -8, -9V, -10A, -11A, -12F, -14, -15A, -15C, -18C, -19A, -19F, -22F, -23B, -23F, -24F, -33F e -35B usando aminação redutiva em um solvente aprótico (também denominado produto químico de DMSO) e formulada em L-Histidina 20 mM pH 5,8, NaCl 150 mM e Polissorbato- 20 (PS-20) a 0,1 % p/v a 4 µg/mL ou 8 µg/mL de cada sorotipo de polissacarídeo para uma concentração de polissacarídeo total de 96 µg/mL ou 192 µg/mL, respectivamente, e denominado “PCV24 sem adj”. Em outra modalidade específica, a composição imunogênica multivalente de PCV24 é preparada em L- Histidina 20 mM pH 5,8, NaCl 150 mM e 0,2 % p/v de Polissorbato-20 (PS-20) a 4 µg/mL de cada sorotipo de polissacarídeo para uma concentração de polissacarídeo total de 96 µg/mL compreendendo adicionalmente 250 µg [Al]/mL na forma de Adjuvante de Fosfato de Alumínio.

Isso é denominado “PCV24/APA”. O volume requerido de conjugados em massa necessários para obter a concentração-alvo de sorotipos individuais foi calculado com base no volume de lote e na concentração de concentrações individuais de polissacarídeo em massa.

Os conjugados individuais foram adicionados a uma solução de histidina, cloreto de sódio e Polissorbato-20 (PS-20) para produzir uma mescla de conjugado 2X a 4X.

O recipiente de formulação contendo a mescla de conjugado é misturado usando uma barra de agitação magnética, filtrada estéril em outro recipiente.

A mescla 2x a 4x filtrada estéril é adicionada a outro recipiente contendo Adjuvante de Fosfato de Alumínio ou diluída com salina para obter as concentrações de polissacarídeo total alvo desejadas, excipiente e adjuvante APA (se exigido). As formulações são, então, preenchidas em ampolas ou seringas de vidro e armazenadas a 2 a 8 °C.

EXEMPLO 49

Imunogenicidade de PCV22 e Anticorpo Funcional em Camundongos Os camundongos Balb/c fêmea jovens (6 a 8 semanas de idade, n = 10/grupo) foram imunizados com 0,1 mL de uma vacina de conjugado pneumocócico 22-valente (PCV22/APA ou PCV22 sem adjuvante) no dia 0, dia 14 e dia 28. PCV22 foi dosado a 0,08 µg de cada polissacarídeo pneumocócico (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B) e 6B a 0,16 µg e todos foram conjugados a CRM197 sem adjuvante ou com 5 µg de adjuvante de fosfato de alumínio (APA) por imunização.

Os camundongos foram observados pelo menos diariamente por equipe de cuidados de animais treinada quanto a quaisquer sinais de doença ou desconforto.

As formulações de vacina em camundongos foram consideradas como seguras e bem toleradas, visto que nenhum evento adverso relacionada a vacina foi observado.

No dia 52 os camundongos foram desafiados intratraquealmente com sorotipo 24F de Streptococcus pneumoniae.

As culturas de fase exponenciais de S. pneumoniae foram centrifugadas, lavadas e suspensas em PBS estéril.

Os camundongos foram anestesiados com isoflurano antes do desafio. 105 cfu de S. pneumoniae em 0,1 mL de PBS foi colocado na garganta de camundongos suspensos na vertical por seus incisivos.

A aspiração das bactérias foi induzida puxando-se gentilmente a língua para fora e cobrindo as narinas.

Os camundongos foram pesados diariamente e eutanasiados se a perda de peso tiver excedido 20 % do peso de partida.

O sangue foi coletado a 24 horas, 48 horas e 72 horas para avaliar quanto a bacteremia.

Os camundongos foram observados pelo menos duas vezes ao dia por equipe de cuidados de animais treinada quanto a quaisquer sinais de doença ou desconforto.

Todos os experimentos animais foram desempenhados em conformidade rigorosa com as recomendações no Guia para Cuidados e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos de Saúde Nacionais.

O protocolo experimental de camundongo foi aprovado pelo Comitê Institucional de

Cuidados e Uso de Animais na Merck & Co., Inc.

Os soros de camundongo foram avaliados quanto a imunogenicidade de IgG usando um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexada (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para o uso com soro de camundongo com base no ensaio humano descrito por Marchese et al.[3] usando tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão da MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) utilizando uma marcação SULFO-TAG™ que emite luz mediante o estímulo eletromagnético.

O IgG anti-camundongo marcado com SULFO-TAG™ foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de camundongo.

O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios opsonofagocíticos multiplexados (MOPA) com base em protocolos descritos anteriormente em www.vaccine.uab.edu e software Opsotiter® 3 pertencente a e licenciado pela Fundação de Pesquisa da Universidade de Alabama (UAB)[1, 2]. Os soros de camundongo foram agrupados para cada grupo e testados em ensaios eletroquimioluminescente multiplexados para determinar títulos de anticorpo.

PCV22 gerou títulos de anticorpo em camundongos para todos os sorotipos após as imunizações 1, 2 e 3 com a vacina (FIGURA 1). PCV22 mostrou a reação cruzada para sorotipo 15B, como evidenciado por títulos de IgG (FIGURA 1). PCV22 formulado com APA tende para imunogenicidade superior em comparação ao PCV22 sem adjuvante em camundongos a PD2 (dados não mostrados) e PD3 (FIGURA 2). Os soros de camundongo foram agrupados para cada grupo e testados em ensaios opsonofagocíticos multiplexados (MOPA) para determinar títulos de anticorpo funcional.

PCV22 gerou títulos de anticorpo funcional em camundongos que exterminaram sorotipos bacterianos do tipo de vacina após as 3 imunizações com a vacina (FIGURA 3). PCV22 formulado com APA tendeu para títulos de anticorpo funcional superiores em comparação ao PCV22 sem adjuvante a PD2 (dados não mostrados) e PD3 (FIGURA 4), similar a títulos de IgG (FIGURA 2). Os camundongos imunizados com PCV22 foram protegidos contra desafio intratraqueal com 24F de S. pneumoniae (FIGURA 5). O teste de classificação de log Mantel Cox indicou que tanto o PCV22 sem adjuvante (PCV22 sem adj) quanto os grupos PCV22/APA foram significativamente protegidos contra o desafio quando comparados ao grupo naïve (P<0,0001). De modo semelhante, ambos os grupos de camundongo imunizados PCV22 tiveram pouca ou nenhuma bacteremia, que foi significativamente menores quando comparadas ao grupo naïve (dados não mostrados). EXEMPLO 50 Imunogenicidade de PCV22 e Anticorpo Funcional em Coelhos Os coelhos Nova Zelândia brancos adultos (NZWR, n = 5/grupo) foram intramuscularmente (IM) imunizados com 0,1 mL de uma vacina de conjugado pneumocócico 22-valente (PCV22/APA ou PCV22 sem adjuvante) no dia 0 e dia 14 (lados alternados). PCV22 foi dosado a 0,08 µg de cada polissacarídeo pneumocócico (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B) e 6B a 0,16 µg e todos conjugados a CRM197 e sem adjuvantes ou formulados com 5 µg de APA por imunização.

Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imunização) e nos dias 14 (PD1) e 28 (PD2). Os NZWRS foram observados pelo menos diariamente por equipe de cuidados de animais treinada quanto a quaisquer sinais de doença ou desconforto.

As formulações de vacina em NZWRS foram consideradas como seguras e bem toleradas, visto que nenhum evento adverso relacionada a vacina foi observado.

Todos os experimentos animais foram desempenhados em conformidade rigorosa com as recomendações no Guia para Cuidados e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos de Saúde Nacionais.

O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais tanto na Merck & Co., Inc quanto na Covance (Denver, PA). Os soros de coelhos foram avaliados quanto a imunogenicidade de IgG usando um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexada (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soro de coelho com base no ensaio

[3] humano descrito por Marchese et al. usando tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão da MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) utilizando uma marcação SULFO-TAG™ que emite luz mediante o estímulo eletromagnético. O IgG anti-coelho marcado com SULFO-TAG™ foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de NZWR. O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios opsonofagocíticos multiplexados (MOPA) com base em protocolos descritos anteriormente em www.vaccine.uab.edu e software Opsotiter® 3 pertencente a e licenciado pela Fundação de Pesquisa da Universidade de Alabama (UAB)[1, 2]. Os soros de coelho foram testados individualmente em ensaios eletroquimioluminescente multiplexados para determinar títulos de anticorpo. PCV22 gerou títulos de anticorpo em coelhos para todos os sorotipos após as imunizações com a vacina (FIGURA 6). A imunização de coelhos com PCV22 também gera anticorpos que se ligam a polissacarídeo de sorotipo 15B (FIGURA 6). Não houve benefício em incluir APA com PCV22 em coelhos, visto que a imunogenicidade foi comparável a ou menor que (sorotipo 1) PCV22 sem adjuvante a PD2 (FIGURA 7). Os soros de coelho foram testados individualmente em ensaios opsonofagocíticos multiplexados (MOPA) para determinar títulos de anticorpo funcional. PCV22 gerou títulos de anticorpo funcional em coelhos que exterminaram sorotipos bacterianos do tipo de vacina após as 2 imunizações com a vacina (FIGURA 8). PCV22 sem adjuvante teve títulos de anticorpo funcional superiores a PD1 para o sorotipo 4 (dados não mostrados) e a PD2 para sorotipos 1, 3 e 4 em comparação ao PCV22 formulado com APA.

PCV22 formulado com APA não teve títulos de anticorpo funcional superiores a PD1 (dados não mostrados) e PD2 para a maior parte dos sorotipos em comparação ao PCV22 sem adjuvante (FIGURA 8). EXEMPLO 51 Imunogenicidade de PCV23 em Macacos Rhesus Recém-Nascidos Os macacos Rhesus recém-nascidos (IRM, 2 a 3 meses de idade, n = 8 a 9/grupo) foram intramuscularmente imunizados com 0,1 mL de uma vacina de conjugado pneumocócico 23-valente (PCV23) nos dias 0, 28 e 56. PCV23 foi dosado a 9,6 µg de polissacarídeo pneumocócico total (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B a 0,4 µg, 6B a 0,8 µg e todos conjugados a CRM197) sem adjuvante ou formulado com 25 µg de adjuvante de fosfato de alumínio (APA) por imunização.

Um grupo adicional de IRMs foi intramuscularmente imunizado com um 0,1 mL de PCV15. PCV15 foi dosado a 6,4 μg de polissacarídeo pneumocócico total (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F a 0,4 µg, 6B a 0,8 µg e todos conjugados a CRM197 com 25 µg de APA por imunização) em um quadríceps e 0,1 mL de PCV8 (8, 10A, 12F, 15A, 15C, 23B, 24F e 35B a 0,4 μg e todos conjugados a CRM197 com 25 µg de APA por imunização) em um quadríceps separado após a mesma programação, como descrito acima.

Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imunização, dia 0) e nos dias 14 (PD1), 28, 42 (PD2), 56 e 70 (PD3). Os IRMs foram observados pelo menos diariamente por equipe de cuidados de animais treinada quanto a quaisquer sinais de doença ou desconforto.

Todos os experimentos animais foram desempenhados em conformidade rigorosa com as recomendações no Guia para Cuidados e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos de Saúde Nacionais.

O protocolo experimental foi aprovado pelo

Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na Merck & Co., Inc e no New Iberia Research Center.

Os soros de Rhesus foram avaliados quanto a imunogenicidade de IgG usando um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexada (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soros de Rhesus com base no ensaio humano descrito por Marchese et al. e Skinner et al [3, 4] usando tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão da MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) utilizando uma marcação SULFO-TAG™ que emite luz mediante o estímulo eletromagnético.

O IgG anti-humano marcado com SULFO- TAG™ foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de Rhesus.

A imunização de IRM com PCV23 gerou títulos de anticorpo para todos os sorotipos para todas dentre as formulações de vacina de PCV23 avaliadas (FIGURAS 9A a 9D). Deve-se observar que PCV23, contendo conjugados de polissacarídeo 15A-CRM197 e 15C-CRM197, também fornece reação cruzada para 15B, como evidenciado em ECL (FIGURAS 9A a 9D). PCV23 foi imunogênico com uma dose de vacina nos IRMs (FIGURAS 9A a 9D). A formulação de PCV23 (DMSO)/APA teve imunogenicidade superior para o sorotipo 22F em comparação ao PCV23 sem adjuvante a PD1, enquanto PCV23 (DMSO+Aq)/APA teve imunogenicidade superior para o sorotipo 1 e sorotipo 15C em comparação ao PCV23 sem adjuvante a PD1 (FIGURA 10A). A formulação de PCV23 (DMSO)/APA teve imunogenicidade superior para o sorotipo 18C em comparação ao PCV23 sem adjuvante a PD2 (FIGURA 10B). O PCV23 (DMSO+Aq)/APA teve imunogenicidade superior para a maior parte de sorotipos (1, 3, 4, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19F, 22F e 23F) em comparação ao PCV23 sem adjuvante a PD2 (FIGURA 10B). O PCV23 (DMSO+Aq)/APA teve imunogenicidade superior para sorotipos 1, 4 e 9V em comparação ao PCV23 sem adjuvante a PD3 (FIGURA 10C). IRMs vacinados com PCV23 (DMSO+Aq)/APA ou com uma coadministração de PCV15/APA + PCV8/APA em membros separados não mostraram muitas diferenças de imunogenicidade a PD1, com a exceção de sorotipo 10A que teve imunogenicidade superior no grupo de coadministração (FIGURA 11A). No entanto, IRMs vacinados com PCV23 (DMSO+Aq)/APA teve imunogenicidade de PD2 superior para a maior parte dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 7F, 8, 9V, 14, 15A, 15B, 15C, 18C, 19F, 22F, 23B e 23F em comparação à coadministração de PCV15/APA + PCV8/APA (FIGURA 11B). Não houve diferenças em imunogenicidade entre as duas vacinas a PD3 (FIGURA 11C). Avaliando-se os efeitos estimulamtes de anticorpo, todos dentre os PCVs geraram respostas imunológicas primárias a PD1 em comparação a soros pré-imunes para todos os sorotipos com a exceção de sorotipo 23B em IRMs imunizados com PCV23 (DMSO+Aq)/APA (FIGURA 12A). Todos os PCVs avaliados geraram títulos de anticorpo significativamente superiores a PD2 e PD3 quando comparados aos soros pré-imunes para todos os sorotipos (FIGURAS 12B e 12C). Uma segunda dose de PCV resulta em títulos de anticorpo aumentados a partir de PD2 em comparação ao PD1 para todos os sorotipos exceto para o sorotipo 3 e sorotipo 1 em IRMs imunizados com PCV23 sem adjuvante, PCV23 (DMSO)/APA e PCV15/APA + PCV8/APA (FIGURA 12D). Uma terceira dose de PCV resulta em uma melhoria em títulos de anticorpo para a maior parte dos sorotipos, com a exceção de IRMs imunizados com PCV23 (DMSO+Aq)/APA em que há uma diminuição em PD3 em comparação ao PD2, sugerindo que IRMs PCV23 imunizados (DMSO+Aq)/APA alcançaram a resposta de anticorpo máxima a PD2 (FIGURA 12E).

EXEMPLO Z Imunogenicidade de PCV24 em Coelhos Nova Zelândia Brancos e Macacos

Rhesus Recém-Nascidos Os coelhos Nova Zelândia brancos (NZWR, n = 8/grupo) foram intramuscularmente imunizados com 0,1 mL de uma vacina de conjugado pneumocócico 24-valente (PCV24) nos dias 0 e 14. PCV24 foi dosado a 9,6 µg de polissacarídeo pneumocócico total (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, deOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B a 0,4 µg e todos conjugados a CRM197) e formulado com adjuvante de fosfato de alumínio (APA, 25 µg) por imunização.

Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré- imunização, dia 0) e nos dias 14 (PD1) e 28 (PD2). Os NZWRS foram observados pelo menos diariamente por equipe de cuidados de animais treinada quanto a quaisquer sinais de doença ou desconforto.

Os macacos Rhesus recém-nascidos (IRM, 2 a 3 meses de idade, n = 5/grupo) foram intramuscularmente imunizados com 0,1 mL de uma vacina de conjugado pneumocócico 24-valente (PCV24) nos dias 0, 28 e 56. PCV24 foi dosado a 9,6 µg de polissacarídeo pneumocócico total (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, deOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B a 0,4 µg e todos conjugados a CRM197) e formulado com adjuvante de fosfato de alumínio (APA, 25 µg) por imunização.

Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imunização, dia 0) e nos dias 14 (PD1), 28, 42 (PD2), 56 e 70 (PD3). Os IRMs foram observados pelo menos diariamente por equipe de cuidados de animais treinada quanto a quaisquer sinais de doença ou desconforto.

Todos os experimentos animais foram desempenhados em conformidade rigorosa com as recomendações no Guia para Cuidados e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos de Saúde Nacionais.

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na Merck & Co., Inc e no New Iberia Research Center.

Os soros de Rhesus foram avaliados quanto a imunogenicidade de IgG usando um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexada (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soros de Rhesus com base no ensaio humano descrito por Marchese et al. e Skinner et al [3, 4] usando tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão da MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) utilizando uma marcação SULFO-TAG™ que emite luz mediante o estímulo eletromagnético.

O IgG anti-humano marcado com SULFO- TAG™ foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de Rhesus e um IgG anti-coelho marcado com SULFO-TAG™ para as amostras de coelho Nova Zelândia branco.

O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios opsonofagocíticos multiplexados (MOPA) com base em protocolos descritos anteriormente em www.vaccine.uab.edu e software Opsotiter® 3 pertencente a e licenciado pela Fundação de Pesquisa da Universidade de Alabama (UAB) [1, 2]. A imunização de NZWR com PCV24 gerou títulos de anticorpo para todos os sorotipos na vacina (FIGURA 13A). Deve-se observar que PCV24, contendo conjugados de polissacarídeo 15A-CRM197, deOAc15B-CRM197, 6A- CRM197, 6B-CRM197 também fornece reação cruzada para 15B e 6C, como evidenciado em ECL (FIGURA 13A). Os soros de NZWR foram testados individualmente em ensaios opsonofagocíticos multiplexados (MOPA) para determinar títulos de anticorpo funcional.

PCV24 gerou títulos de anticorpo funcional em NZWRs que exterminou todos os sorotipos bacterianos do tipo de vacina (FIGURA 13B). A imunização de IRM com PCV24 gerou títulos de anticorpo para todos os sorotipos na vacina (FIGURA 14A). Deve-se observar que PCV24, contendo conjugados de polissacarídeo 15A-CRM197, deOAc15B-CRM197, 6A- CRM197, 6B-CRM197 também fornece reação cruzada para 15B e 6C, como evidenciado em ECL (FIGURA 14A). Os soros de IRM foram testados individualmente em ensaios opsonofagocíticos multiplexados (MOPA) para determinar títulos de anticorpo funcional. PCV24 gerou títulos de anticorpo funcional em IRMs que exterminaram sorotipos bacterianos do tipo de vacina (FIGURA 14B), com a exceção de 33F, que também teve títulos de anticorpo de ligação de PD3/Pre inferiores em ECL. No entanto, quando PCV24/APA foi avaliado em coelhos Nova Zelândia brancos, títulos de OPA de 33F de PD2 foram mais de 58 vezes maiores que títulos pré-imunológicos (FIGURA 13B). Referências

1. Caro-Aguilar I, Indrawati L, Kaufhold RM, Gaunt C, Zhang Y, Nawrocki DK, et al. Immunogenicity differences of a 15-valent pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (PCV15) based on vaccine dose, route of immunization and mouse strain. Vaccine, 07 de fevereiro de 2017;35(6): 865 a 872.

2. Burton RL, Nahm MH. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clin Vaccine Immunol, setembro de 2006;13(9): 1.004 a 1.009.

3. Marchese RD, Puchalski D, Miller P, Antonello J, Hammond O, Green T, Rubinstein LJ, Caulfield MJ, Sikkema D. Optimization and validation of a multiplex, electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in human serum. Clin Vaccine Immunol. março de 2009;16(3): 387 a 396.

4. Skinner, J.M., et al., Pre-clinical evaluation of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV15-CRM197) in an infant-rhesus monkey immunogenicity model. Vaccine, 2011. 29(48): páginas 8.870 a 8.876. EXEMPLO 52 Materiais e Métodos

Teste de polissacarídeo livre O polissacarídeo livre (polissacarídeo que não é conjugado com CRM197) em amostra de conjugado é medido primeiro precipitando-se proteína livre e conjugados com desoxicolato (DOC) e ácido clorídrico.

Os precipitados são, então, filtrados e os filtrados são analisados quanto à concentração de polissacarídeo livre por HPSEC/UV/MALS/RI.

O polissacarídeo livre é calculado como uma porcentagem de polissacarídeo total medida por HPSEC/UV/MALS/RI.

Teste de proteína livre O polissacarídeo livre, conjugado de polissacarídeo-CRM197 e CRM197 livre em amostras de conjugado são separados por eletroforese capilar em modo de cromatografia eletrocinética micelar (MEKC). Resumidamente, as amostras são misturadas com tampão de execução de MEKC contendo 25 mM de borato, 100 mM de SDS, pH 9,3, e são separadas em um capilar de sílica fusionado de modo simples pré-condicionado.

A separação é monitorada a 200 nm e CRM197 livre é quantificado com uma curva padrão de CRM197. Os resultados de proteína livre são relatados como uma porcentagem de total de teor de proteína determinado pelo procedimento de HPSEC/UV/MALS/RI.

Peso molecular e análise de concentração de conjugados usando ensaio de HPSEC/UV/MALS/RI As amostras de conjugado foram injetadas e separadas por cromatografia por exclusão de tamanho de alta eficiência (HPSEC). A detecção foi obtida com detectores de ultravioleta (UV), dispersão de luz em múltiplos ângulos (MALS) e índice refratário (RI) em série.

A concentração de proteína foi calculada a partir de UV280 usando um coeficiente de extinção.

A concentração de polissacarídeo foi deconvolutada a partir do sinal de RI (contribuído tanto por proteína quanto por polissacarídeo) com o uso dos fatores dn/dc, que são a alteração em um índice refratário da solução com uma alteração na concentração de soluto relatada em mL/g.

O peso molecular médio das amostras foi calculado por software Astra (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) com o uso das informações de concentração e dispersão de luz medidas ao longo do pico de amostra inteiro.

Há múltiplas formas de valores médios de peso molecular para moléculas polidispersadas.

Por exemplo, peso molecular numérico médio Mn, peso molecular ponderal médio Mw, e peso molecular médio z Mz (Moléculas, 2.015, 20, 10.313 a 10.341). A menos que especificado, os pesos moleculares são peso molecular ponderal médio.

Determinação de consumo de lisina em proteína conjugada como uma medição do número de fixações covalentes entre polissacarídeo e proteína carreadora A análise de aminoácido de Waters AccQ-Tag (AAA) foi usada para medir a extensão de conjugação em amostras de conjugado.

As amostras foram hidrolisadas usando hidrólise ácida de fase em vapor na estação de trabalho Eldex, para quebrar as proteínas carreadoras em seus aminoácidos componentes.

Os aminoácidos livres foram derivados usando carbamato de 6- aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidil (AQC). As amostras derivadas foram, então, analisadas usando UPLC com detecção de UV em uma coluna C18. A concentração de proteína média foi obtida usando aminoácidos representativos diferentes de lisina.

O consumo de lisina durante a conjugação (isto é, perda de lisina) foi determinado pela diferença entre a quantidade medida média de lisina no conjugado e a quantidade esperada de lisina na proteína de partida.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES

1. Uma composição imunogênica multivalente compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; b) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; c) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; d) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; e) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; f) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, DeOAc15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; g) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; h) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; i) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; j) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B;

k) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; l) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; m) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; n) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; o) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; p) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; q) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; r) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; s) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; t) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; u) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; v) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; w) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; x) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B,

23F, 24F, 33F e 35B; y) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; z) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; aa) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B; bb) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, deO-15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; cc) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; dd) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, deO-15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ee) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ff) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; gg) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, deO-15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; hh) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ii) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; jj) 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; kk) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39;

ll) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; mm) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; nn) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; oo) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; pp) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; qq) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; rr) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ss) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; tt) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; uu) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; vv) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; ww) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; xx) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; yy) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F,

24F, 33F, 35B e 39; zz) 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; aaa) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39; e bbb) 1, 3, 4, 5, 6C, 7F, 8, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F, 35B e 39.

2. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 1, em que a composição imunogênica não compreende conjugados de polissacarídeo- proteína que têm polissacarídeos a partir de quaisquer sorotipos de S. pneumoniae adicionais.

3. A composição imunogênica multivalente das reivindicações 1 ou 2, em que pelo menos um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico.

4. A composição imunogênica multivalente das reivindicações 1 ou 2, em que cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico.

5. A composição imunogênica multivalente das reivindicações 3 ou 4, em que o solvente aprótico é dimetilsulfóxido (DMSO).

6. A composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a proteína carreadora é selecionada a partir do grupo que consiste em Complexo de Proteína de Membrana Externa (OMPC), toxoide tetânico, toxoide diftérico, proteína D e CRM197.

7. A composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a proteína carreadora é CRM197.

8. A composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a composição compreende adicionalmente um adjuvante.

9. A composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a composição não compreende um adjuvante.

10. Um método para induzir uma resposta imunológica em um paciente humano compreendendo administrar a composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 a um paciente.

11. Um método para induzir uma resposta imunológica protetora em um paciente humano compreendendo administrar a composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 a um paciente.

12. Um método para induzir uma resposta imunológica protetora contra S. pneumoniae em um paciente humano compreendendo administrar a composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 a um paciente.

13. O método de qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que o paciente foi anteriormente tratado com uma vacina pneumocócica multivalente.

14. O método de qualquer uma das reivindicações 10 a 13, em que o paciente tem 6 semanas a 17 anos de idade.

15. Um método para prevenir a pneumonia pneumocócica e/ou doença pneumocócica invasiva em pacientes de 6 semanas a 17 anos de idade compreendendo administrar a composição imunogênica multivalente da reivindicação 1 a pacientes de 6 semanas a 17 anos de idade.

16. Uma composição imunogênica multivalente compreendendo 23 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que cada conjugado de polissacarídeo-proteína distinto compreende um polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A,

19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, respectivamente, e em que a proteína carreadora é CRM197.

17. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 16, em que a composição imunogênica não compreende conjugados de polissacarídeo- proteína que têm polissacarídeos a partir de quaisquer sorotipos de S. pneumoniae adicionais.

18. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 16, em que cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico, em que o solvente aprótico é dimetilsulfóxido (DMSO).

19. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 16, em que a composição compreende um adjuvante.

20. Uma composição imunogênica multivalente compreendendo 24 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que cada conjugado de polissacarídeo-proteína distinto compreende um polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, respectivamente, e em que a proteína carreadora é CRM197.

21. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 20, em que a composição imunogênica não compreende conjugados de polissacarídeo- proteína que têm polissacarídeos a partir de quaisquer sorotipos de S. pneumoniae adicionais.

22. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 20, em que cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico, em que o solvente aprótico é dimetilsulfóxido (DMSO).

23. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 20, em que a composição compreende um adjuvante.

24. Uma composição imunogênica multivalente compreendendo 24 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que cada conjugado de polissacarídeo-proteína distinto compreende um polissacarídeo de sorotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, respectivamente, e em que a proteína carreadora é CRM197.

25. A composição imunogênica multivalente, da reivindicação 24, em que a composição imunogênica não compreende conjugados de polissacarídeo- proteína que têm polissacarídeos a partir de quaisquer sorotipos de S. pneumoniae adicionais.

26. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 24, em que cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico, em que o solvente aprótico é dimetilsulfóxido (DMSO).

27. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 24, em que a composição compreende um adjuvante.

28. Uma composição imunogênica multivalente compreendendo até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: 1,

3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

29. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 28, em que os até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína incluem adicionalmente um, dois, três, quatro, cinco ou seis sorotipos de S. pneumoniae adicionais selecionados a partir de 7C, 9N, 16F, 23A, 35F e 38.

30. Uma composição imunogênica multivalente compreendendo até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína de S. pneumoniae distintos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, e em que os até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína incluem polissacarídeos de um grupo de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B.

31. A composição imunogênica multivalente da reivindicação 30, em que os até 30 conjugados de polissacarídeo-proteína incluem adicionalmente um, dois, três, quatro, cinco ou seis sorotipos de S. pneumoniae adicionais selecionados a partir de 7C, 9N, 16F, 23A, 35F e 38.

32. A composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 28 a 31, em que a proteína carreadora é CRM197.

33. A composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 28 a 32, em que cada um dos conjugados de polissacarídeo- proteína é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico, em que o solvente aprótico é dimetilsulfóxido (DMSO).

34. A composição imunogênica multivalente de qualquer uma das reivindicações 28 a 33, em que a composição compreende um adjuvante.