TW202038996A - 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物之組合物及其使用方法 - Google Patents

包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物之組合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202038996A
TW202038996A TW108146273A TW108146273A TW202038996A TW 202038996 A TW202038996 A TW 202038996A TW 108146273 A TW108146273 A TW 108146273A TW 108146273 A TW108146273 A TW 108146273A TW 202038996 A TW202038996 A TW 202038996A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
polysaccharide
streptococcus pneumoniae
immunogenic composition
protein
kda
Prior art date
Application number
TW108146273A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI788610B (zh
Inventor
智全安達 阿貝甘沃德阿那
亞東 崔
羅姆洛 費雷羅
健 何
路伊 默賽伊
塔納茲 彼得加拉
裘利 Ｍ 絲琪納
Original Assignee
美商默沙東藥廠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商默沙東藥廠 filed Critical 美商默沙東藥廠
Publication of TW202038996A publication Critical patent/TW202038996A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI788610B publication Critical patent/TWI788610B/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/116—Polyvalent bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Abstract

本發明係關於多價免疫原性組合物，其包含超過一種肺炎鏈球菌(S. pneumoniae )多醣蛋白質共軛物，其中該等共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型如本文所定義。亦提供用於誘導人類患者之保護性免疫反應的方法，其包含向該患者投與本發明之該等多價免疫原性組合物。

Description

包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物之組合物及其使用方法
本發明提供具有不同多醣-蛋白質共軛物之多價免疫原性組合物。每種共軛物由莢膜多醣組成，其由共軛至載體蛋白質(較佳CRM197)之不同血清型之肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )製備。免疫原性組合物廣泛覆蓋了針對肺炎鏈球菌疾病。
本申請案含有已以ASCII格式、以電子方式提交且特此以全文引用之方式併入之序列表。該ASCII複本創建於2019年12月3日，命名為24683WOPCT-SEQTXT-03DEC2019且大小為6千位元組。
肺炎鏈球菌為一種革蘭氏陽性細菌及為嬰兒及兒童之侵襲性細菌性疾病(諸如肺炎、菌血症、腦膜炎及中耳炎)的最常見原因。肺炎鏈球菌囊封有賦予血清型特異性之以化學方式連接的多醣。存在超過90種已知的肺炎鏈球菌之血清型，及莢膜為肺炎鏈球菌之首要毒性決定因素，因為莢膜不僅保護細菌之內表面免受補體侵害，及自身免疫原性亦很差。多醣為T細胞獨立抗原，及在大多數情況下，不可處理或呈遞到MHC分子上與T細胞相互作用。然而，其可經由涉及B細胞上表面受體交聯之替代機制刺激免疫系統。
已特許多年之多價肺炎鏈球菌多醣疫苗已證明在預防成人(尤其老年人及處於高風險下者)之肺炎鏈球菌疾病方面具有價值。然而，嬰兒及兒童對非共軛肺炎鏈球菌多醣反應不良。2000年2月，美國首先授權肺炎鏈球菌共軛物疫苗Prevnar® ，其含有7種最常見的分離型血清型(4、6B、9V、14、18C、19F及23F)，當時在幼兒及兒童中引發了侵襲性肺炎鏈球菌疾病。在美國普遍使用Prevnar® 後，由於Prevnar® 中存在血清型，兒童中之侵襲性肺炎鏈球菌疾病已顯著減少。參見疾病控制與預防中心，MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7。然而在世界某些區域，Prevnar® 之血清型覆蓋具有侷限性及一些證據表明，美國出現了某些新興的血清型(例如，19A及其他)。參見O'Brien等人, 2004,Am J Epidemiol 159:634-44; Whitney等人, 2003,N Engl J Med 348:1737-46; Kyaw等人, 2006,N Engl J Med 354:1455-63; Hicks等人, 2007,J Infect Dis 196:1346-54; Traore等人, 2009,Clin Infect Dis 48:S181-S189。
美國專利申請案第US 2006/0228380號描述了一種13價肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物疫苗，其包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F。中國專利申請公開案第CN 101590224 A號描述了一種14價肺炎肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物疫苗，其包括血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F及23F。
其他PCV覆蓋了包含於PCV-15 (美國公開第2011/0195086號)中之血清型7、10、11或13，但已觀測到對一些血清型之免疫干擾(例如，對GSK之PCV-11中的血清型3的保護降低)及降低了對Pfizer之PCV-13 (PREVNAR® 13)中之血清型6B的反應率。參見Prymula等人, 2006, Lancet 367:740-48 and Kieninger等人, Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, 在第48屆年度ICAAC/ISDA第46屆年度會議上提出, Washington DC, October 25-28, 2008。
當前多價肺炎鏈球菌疫苗已有效降低與存在於疫苗中之彼等血清型相關的肺炎鏈球菌疾病的發生率。然而，愈來愈多當前可供使用的疫苗中不存在肺炎鏈球菌表現血清型。因此，需要額外肺炎鏈球菌疫苗組合物，其可提供針對當前可用疫苗中不存在的肺炎鏈球菌血清型的保護。
本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣： a)     1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； b)     1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； c)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； d)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； e)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； f)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； g)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； h)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； i)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； j)     1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； k)     1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； l)     1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； m)    1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； n)     1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； o)     1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； p)     1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； q)     1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； r)     1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； s)     1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； t)     1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； u)     1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； v)     1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； w)    1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； x)     1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； y)     1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； z)     1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；及 aa)   1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含22種不同多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中多醣由肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B製備。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含22種不同多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含23種不同多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中多醣由肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B製備。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含23種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中每種不同多醣蛋白質共軛物包含分別來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之多醣，且其中載體蛋白質為CRM197。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含24種不同多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中多醣由肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B製備。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含24種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中每種不同多醣蛋白質共軛物包含分別來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之多醣，且其中載體蛋白質為CRM197。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含24種不同多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中多醣由肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B製備。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含24種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中每種不同多醣蛋白質共軛物包含分別來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之多醣，且其中載體蛋白質為CRM197。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含多達33種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B，進一步包括選自7C、9N、16F、21、23A、31、34、35F及38之一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或九種額外肺炎鏈球菌血清型。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含多達30種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B，進一步包括選自7C、9N、16F、23A、35F及38之一種、兩種、三種、四種、五種或六種額外肺炎鏈球菌血清型。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含多達33種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B，進一步包括選自7C、9N、16F、21、23A、31、34、35F及38之一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或九種額外肺炎鏈球菌血清型。
本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含多達30種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B，進一步包括選自7C、9N、16F、23A、35F及38之一種、兩種、三種、四種、五種或六種額外肺炎鏈球菌血清型。
在一些實施例中，多醣蛋白質共軛物中之至少一者由包含非質子性溶劑(例如二甲亞碸(DMSO))之共軛反應形成。在特定實施例中，多醣蛋白質共軛物中之每一者由包含非質子性溶劑(例如(DMSO))之共軛反應形成。
亦提供用於誘導人類患者之保護性免疫反應的方法，其包含向患者投與本發明之該等多價免疫原性組合物。在本發明方法的一些實施例中，患者先前經多價肺炎鏈球菌疫苗處理。
本發明之多價免疫原性組合物可與不同互補肺炎鏈球菌疫苗一起用作治療方案之一部分。因此，本發明提供一種誘導人類患者之保護性免疫反應的方法，其包含向患者投與本發明之多價免疫原性組合物，進一步包含以任何次序向患者投與多價肺炎鏈球菌疫苗。在特定實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣。在其他實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含非共軛莢膜多醣。
本發明亦提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中選擇肺炎鏈球菌之血清型提供與其他選擇血清型之交叉反應性。
本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型如本文所定義。
在一些實施例中，本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣： a)        1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； b)        1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； c)        1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； d)        1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； e)        1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； f)         1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； g)        1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； h)        1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； i)         1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； j)         1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； k)        1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； l)         1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； m)       1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； n)        1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； o)        1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； p)        1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； q)        1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； r)         1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； s)        1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； t)         1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； u)        1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； v)        1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； w)       1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； x)        1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； y)        1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； z)        1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； aa)      1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； bb)     1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； cc)      1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； dd)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ee)      1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ff)       1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； gg)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； hh)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ii)       1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； jj)       1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； kk)     1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ll)       1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； mm)   1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； nn)     1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； oo)     1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； pp)     1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； qq)     1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； rr)       1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ss)      1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； tt)       1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； uu)     1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； vv)     1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ww)   1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； xx)     1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； yy)     1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； zz)      1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； aaa)   1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39；及 bbb)  1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39。
在一些實施例中，多價免疫原性組合物包含選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型：i) 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或ii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或iii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或iv) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。在一特定實施例中，本發明之多價免疫原性組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：i) 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或ii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或iii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。已發現該等組合物在小鼠、兔及/或猴中具有免疫原性及產生功能性抗體，其在所有測試劑量下殺死疫苗型細菌性菌株。
本發明之多價免疫原性組合物適用於針對疫苗型肺炎鏈球菌血清型免疫患者及/或用作具有不同互補肺炎鏈球菌疫苗之治療方案的一部分。因此，本發明提供一種誘導人類患者之保護性免疫反應的方法，其包含向患者投與本發明之多價免疫原性組合物，及進一步包含以任何次序向患者投與多價肺炎鏈球菌疫苗。在其他實施例中，將本發明之多價免疫原性組合物投與先前已用不同多價肺炎鏈球菌疫苗免疫之患者。
在本發明之實施例中，來自至少一種肺炎鏈球菌血清型之共軛物使用非質子性溶劑(諸如DMSO)中之還原胺化製備。在其他實施例中，多價免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌共軛物，其各使用非質子性溶劑中之還原胺化製備。使用DMSO溶劑經由直接消耗載體蛋白質表面上之離胺酸殘基增大了多醣與蛋白質之共價關聯。共價關聯增大對增加包含DMSO中共軛之多醣抗原的多價免疫原性組合物之多醣蛋白質共軛物的穩定性具有直接益處。
I.定義及縮寫 如整個說明書及隨附申請專利範圍中使用，適用以下縮寫： APA          磷酸鋁佐劑 APC          抗原呈遞細胞 CI             信賴區間 DMSO       二甲亞碸 DS            多醣-蛋白質原料藥 GMC         幾何平均濃度 GMT         幾何平均力價 HPSEC      尺寸排阻高效液相層析 IM             肌肉內或肌肉內 IRM          恆河猴幼猴 LOS          脂寡醣 LPS           脂多醣 MALS        多角度光散射 MBC          單價主體共軛物 Mn            數目平均分子量 MOPA       多工調理吞噬活性分析 MW           分子量 NMWCO    標稱分子量截止值 NZWR       紐西蘭白兔 OPA          調理吞噬作用分析 PCV          肺炎鏈球菌共軛物疫苗 PD1           給藥後1 PD2           給藥後2 PD3           給藥後3 PnPs          肺炎鏈球菌多醣 Ps             多醣 PS-20        聚山梨醇酯-20 RI             折射率 UV            紫外 w/v           重量/體積
為使本發明可較容易理解，在下文中特定地定義某些技術及科學術語。除非在本文件中其他地方特定地定義，否則本文所用之所有其他技術及科學術語均具有本發明所屬領域之一般技術者通常所理解之含義。
除非上下文另外明確指示，否則如本說明書通篇及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。
除非上下文明確指示所指示之可能性中的一者，否則提及「或」表示任一種或兩種可能性。在一些情況下，採用「及/或」來突出顯示任一種或兩種可能性。
當與共軛(諸如還原胺化)一起使用時，術語「水性溶劑」或「水性條件」係指使用水作為共軛反應之溶劑。水可含有緩衝液及其他組分，不同之處在於不存在有機溶劑。
當與共軛(諸如還原胺化)一起使用時，術語「非質子性溶劑」、「DMSO溶劑」或「DMSO條件」係指使用非質子性溶劑或非質子性溶劑之組合(或DMSO，如適用)作為共軛反應之溶劑。非質子性溶劑可能存在一些水，例如至多1%、2%、5%、10%或20%。
當與本發明之免疫原性組合物一起使用時，術語「包含」係指包括任何其他組分，諸如佐劑及賦形劑，或添加一或多種未明確列舉之多醣-蛋白質共軛物。當與多價多醣-蛋白質共軛物混合物一起使用時，術語「由……組成」係指具有彼等特定肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物之混合物，及無來自不同血清型之其他肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物。「基本上由……組成」及諸如「基本上由……組成」或「基本上由……組成」之變化形式表示包含具有與所述元件類似或不同性質的任何所述元件或元件組，且視情況包含具有與所述元件類似或不同性質之其他元件，該等元件並不實質上改變指定劑量方案、方法或組合物的基本或新穎特性。
本發明之組合物的「有效量」係指引發抗體所需的劑量，該等抗體顯著降低了後續攻擊期間微生物(例如肺炎鏈球菌)感染的可能性或嚴重程度。
如本文所用，短語「指示用於預防肺炎鏈球菌疾病」意謂疫苗或免疫原性組合物經一或多個調控機構(諸如美國食品藥物管理局)批准用於預防由任何血清型之肺炎鏈球菌引起的一或多種疾病，包括(但不限於)：通常肺炎鏈球菌疾病，肺炎鏈球菌肺炎、肺炎鏈球菌腦膜炎、肺炎鏈球菌菌血症、由肺炎鏈球菌引起的侵襲性疾病及由肺炎鏈球菌引起的中耳炎。
「多價肺炎鏈球菌疫苗」為一種醫藥製劑，其包含超過一種活性劑(例如，肺炎鏈球菌莢膜多醣或肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物)，活性劑向由超過一種血清型之肺炎鏈球菌引起的疾病或病理性條件提供活性免疫。
術語「多醣」意謂包括免疫性及細菌性疫苗領域中常用的任何抗原醣元件(或抗原單元)，包括(但不限於)：「醣」、「寡醣」、「多醣」、「脂醣」、「脂寡醣(LOS)」、「脂多醣(LPS)」、「醣化物」、「糖共軛物」及類似物。
在本發明之疫苗或免疫原性組合物的情形下，術語「無佐劑之」意謂肺炎鏈球菌多醣組合物，包括(但不限於)：PCV8、PCV15、PCV22、PCV23及PCV24，其中組合物不含佐劑。
「PCV8」係指含有肺炎鏈球菌多醣(PnPs)血清型-8、-10A、-12F、-15A、-15C、-23B、-24F及-35B之免疫原性組合物。
「PCV15」係指含有肺炎鏈球菌多醣(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-14、-18C、-19A、-19F、-22F、-23F及-33F之免疫原性組合物。
「PCV22」係指含有肺炎鏈球菌多醣(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F及-35B之免疫原性組合物。
「PCV23」係指含有肺炎鏈球菌多醣(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F及-35B之免疫原性組合物。
「PCV24」係指含有肺炎鏈球菌多醣(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、-12F,-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F及-35B之免疫原性組合物。
「含CpG-核苷酸」、「含CpG-寡核苷酸」、「CpG寡核苷酸」及類似術語係指包含未甲基化CpG部分之長度為6至50個核苷酸的核苷酸分子。參見例如Wang等人, 2003,Vaccine 21:4297。含CpG-寡核苷酸包括使用任何合成核苷酸間鍵聯之經修飾寡核苷酸、經修飾鹼及/或經修飾糖。
如本文所定義，「佐劑」為用來增強本發明之免疫原性組合物之免疫原性的物質。當單獨投與時，免疫佐劑可增強對免疫原性較弱之抗原的免疫反應，例如不誘發或誘發低抗體力價或細胞介導之免疫反應、增大對抗原之抗體力價及/或降低可有效地達成個體之免疫反應的抗原劑量。因此，通常提供佐劑以增強免疫反應且為熟習此項技術者熟知的。
「患者」(或者在本文中稱為「個體」)係指能夠感染肺炎鏈球菌之哺乳動物。在較佳實施例中，患者為人類。患者可經預防性或治療性處理。預防性處理提供足夠的保護性免疫，以降低肺炎鏈球菌之可能性或嚴重程度或其作用，例如肺炎鏈球菌肺炎。可進行治療性處理，以降低肺炎鏈球菌感染或其臨床作用之嚴重程度或預防其復發。預防性處理可使用本文所述之本發明的多價免疫原性組合物進行。可將本發明之組合物投與至一般群體或投與至肺炎鏈球菌感染風險增大的人中，例如老年人，或與其同住或照護老年人者。
彼等「需要處理」包括先前暴露於或感染肺炎鏈球菌者、先前已針對肺炎鏈球菌接種者以及易於感染者或需要降低感染可能性的任何個人，例如免疫功能不全的人、老年人、兒童、成人或健康個體。
「穩定的」多價免疫原性組合物為在冷藏溫度下(例如在2℃至8℃或4℃下)至少1個月、2個月、3個月、6個月、12個月及/或24個月未觀測到顯著變化的組合物。另外，「穩定的」組合物包括在包括25℃及37℃之溫度下持續1個月、3個月、6個月、12個月及/或24個月之時段展現出所需特徵的組合物。穩定性之典型可接受標準如下：在以下之一或多者中，變化不超過約5%、約10%、約15%或約20%：(a)組合物中之肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物的數目平均分子量(Mn)，(b)組合物中之肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物的重量平均分子量(Mw)，(c)組合物中之總多醣濃度，(d)使用內源蛋白質螢光光譜分析在特定激發波長(例如280奈米)下量測的組合物之發射最大值，及(e)使用內源蛋白質螢光光譜分析在特定激發波長下量測的組合物中之螢光強度。術語「穩定的」亦可用於指代多價免疫原性組合物內之特定肺炎鏈球菌共軛物。在此類用途中，術語係指在特定溫度下隨時間展現出所需特性之共軛物，及此類特性在所指時間及溫度下變化不超過約5%、約10%、約15%或約20%。
II.多價免疫原性組合物 本發明提供多價免疫原性組合物，其包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣。本發明之多價免疫原性組合物的不同態樣及實施例描述於下文中。
在一個實施例(實施例E1)中，本發明提供一種多價免疫原性組合物，其包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其各自包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含以下各者、由以下各者組成或基本上由以下各者組成：i) 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B或ii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B或iii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。在實施例E1之子實施例中，免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物。
如本文所用，去O-乙醯化血清型15B (DeOAc15B)肺炎鏈球菌多醣實質上等效於血清型15C肺炎鏈球菌多醣及具有實質上一致的NMR譜(資料未示出)。如本文所用，去O-乙醯化血清型15B肺炎鏈球菌多醣及血清型15C肺炎鏈球菌多醣之每重複單元的O-乙醯基含量各自可能在0至5%範圍內或0至4%範圍內或0至3%範圍內或0至2%範圍內或0至1%範圍內或0至0.5%範圍內或0至0.1%範圍內。在Spencer B.L.等人之報導中，肺炎鏈球菌多醣15C可為略微O-乙醯化的(Spencer, B.L.等人, Clin. Vac. Immuno. (2017) 24(8): 1-13)。因此，在本文之多價免疫原性組合物的任一實施例中，可使用去O-乙醯化血清型15B (DeOAc15B)替代血清型15C。用於去乙醯化之製程為此項技術中已知的，例如在Rajam等人, Clinical and Vaccine Immunology, 2007, 14(9):1223-1227所述。
在任一本發明之多價免疫原性組合物的某些實施例中，包括實施例E1及其任何子實施例，組合物進一步包含醫藥學上可接受之載體。
交叉反應性 在一實施例中，本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型6C)的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型6C提供針對肺炎鏈球菌之血清型6A及6B交叉反應性。
在一實施例中，本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型6A)的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型6A提供針對肺炎鏈球菌之血清型6B及/或6C交叉保護。
在一實施例中，本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型6B)的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型6B提供針對肺炎鏈球菌之血清型6A及/或6C交叉保護。
在一實施例中，本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型15C)的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型15C提供針對肺炎鏈球菌之血清型15B交叉保護。
在一實施例中，本發明提供多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型15B)的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型15B提供針對肺炎鏈球菌之血清型15C交叉保護。
載體蛋白質 在本發明之特定實施例中，CRM197用作載體蛋白質。CRM197為具有以下胺基酸序列之白喉毒素的無毒變異體(亦即類毒素)：
Figure 02_image001
在一個實施例中，由酪蛋白質胺基酸及酵母提取物類培養基中生長的白喉棒狀桿菌菌株C7 (β197)之培養物分離CRM197。在另一實施例中，根據U.S. 5,614,382中所述之方法以重組方式製備CRM197。通常，經由超過濾、硫酸銨沈澱及離子交換層析之組合純化CRM197。在一些實施例中，在螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens )中使用Pfenex表現技術™ (Pfenex公司, San Diego, CA)製備CRM197。
其他適合之載體蛋白質包括額外未經活化細菌性毒素，諸如DT(白喉類毒素)或DT之片段B (DTFB)、TT (破傷風類毒素)或TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如WO 2004/083251中所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST及來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )之外毒素A。亦可使用細菌性外膜蛋白質，諸如外膜蛋白質複合物(OMPC)、孔蛋白質、轉鐵蛋白結合蛋白質、肺炎鏈球菌表面蛋白質A (PspA；參見WO 02/091998)、肺炎鏈球菌黏附蛋白質(PsaA)、來自A群或B群鏈球菌之C5a肽酶或流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )蛋白質D、肺炎鏈球菌溶血素(Kuo等人, 1995, Infect Immun 63; 2706-13)，包括以一些方式解毒之肺炎鏈球菌溶血素，例如dPLY-GMBS (參見WO 04/081515)或dPLY-formol、PhtX (包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE)及Pht蛋白質之融合物(例如，PhtDE融合物、PhtBE融合物)(參見WO 01/98334及WO 03/54007)。其他蛋白質，諸如卵白蛋白、匙孔螺血氰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之經純化蛋白質衍生物(PPD)、PorB (來自奈瑟氏腦膜炎菌(N. meningitidis ))、PD(流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )蛋白質D；參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫功能等效物、合成肽(參見EP0378881及EP0427347)、熱休克蛋白質(參見WO 93/17712及WO 94/03208)、百日咳蛋白質(參見WO 98/58668及EP0471177)、細胞介素、淋巴介質、生長因子或激素(參見WO 91/01146)、包含多種人類CD4+T細胞抗原決定基(來自各種由病原體衍生之抗原)的人工蛋白質(參見Falugi等人, 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824)，諸如N19毒素(參見Baraldoi等人, 2004, Infect Immun 72:4884-7)、鐵吸收蛋白質(參見WO 01/72337)、艱難梭菌之毒素A或B (參見WO 00/61761)及鞭毛蛋白質(參見Ben-Yedidia等人, 1998, Immunol Lett 64:9)亦可用作載體蛋白質。
其他DT突變體可用作載體蛋白質，諸如CRM176、CRM228、CRM45 (Uchida等人, 1973, J Biol Chem 218:3838-3844)；CRM9、CRM45、CRM102、CRM103及CRM107；及Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992中所述的其他突變體；葡萄糖148缺失或突變為Asp、Gln或Ser及/或Ala 158為Gly及揭示於U.S. 4,709,017或U.S. 4,950,740中之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534及揭示於U.S. 5,917,017或U.S. Pat. No. 6,455,673中之其他突變；或揭示於U.S. 5,843,711中之片段。此類DT突變體亦可用於製成變異體包含含有抗原決定基區域之片段B的DTFB變異體。
在某些實施例中，載體蛋白質選自由以下組成之群：外膜蛋白質複合物(OMPC)、破傷風類毒素、白喉類毒素、蛋白質D及CRM197。
在本發明之一些實施例中，第二載體可用於多價免疫原性組合物中之一或多種多醣蛋白質共軛物。第二載體蛋白質較佳為無毒及非反應原性之蛋白質及可以足夠量及純度得到。第二載體蛋白質亦與肺炎鏈球菌多醣共軛或接合，以增強抗原之免疫原性。載體蛋白質應符合標準共軛程序。在一個實施例中，未共軛至第一載體蛋白質之每種莢膜多醣共軛至相同的第二載體蛋白質(例如每種莢膜多醣分子共軛至單一載體蛋白質)。在另一實施例中，未共軛至第一載體蛋白質之莢膜多醣共軛至兩種或更多種載體蛋白質(每種莢膜多醣分子共軛至單一載體蛋白質)。在此類實施例中，相同血清型之每種莢膜多醣通常共軛至相同的載體蛋白質。
在本發明之實施例中，包括實施例E1及其任何子實施例，多醣血清型(包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多者，適當時)中之一或多者共軛至CRM197。在本發明之其他實施例中，包括實施例E1及其任何子實施例，多醣血清型中之每一者共軛至CRM197。
本發明之多醣-蛋白質共軛物的調配物可使用此項技術中公認的方法實現。舉例而言，可將個別肺炎鏈球菌共軛物用生理學上可接受之媒劑調配來製備組合物。此類媒劑之實例包括(但不限於)水、緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇)及右旋糖溶液。
在一較佳實施例中，疫苗組合物調配為具有氯化鈉之L-組胺酸緩衝液。
在本發明之一些實施例中，多價免疫原性組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其包含來自共軛至載體蛋白質及佐劑之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中肺炎鏈球菌血清型如本文所述。增強組合物之有效性的適合佐劑包括(但不限於)： (1) 鋁鹽(礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等； (2) 水包油乳液調配物(含或不含其他特定免疫刺激劑，諸如氮芥肽(下文定義)或細菌性細胞壁組分)，諸如：(a) MF59(國際專利申請公開案第WO 90/14837號)，其含有5%角鯊烯、0.5% Tween 80及0.5% Span 85(視情況含有各種量之MTP-PE)，該等盤使用微流化床調配至次微米粒子中，該微流化床諸如模型110Y微流化床(Microfluidics, Newton, MA)，(b) SAF，其含有10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5%普洛尼克阻斷聚合物L121及thr-MDP(微流化至次微米乳液或渦旋以產生較大粒度乳液)，(c) Ribi™佐劑系統(RAS)，(Corixa, Hamilton, MT)含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種來自由以下組成之群的細菌性細胞壁組分：美國專利第4,912,094號中所述之3-O-去醯化單磷醯脂A (MPL™)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁構架(CWS)，較佳MPL+CWS (Detox™)；及(d)Montanide ISA； (3) 可使用皂素佐劑，諸如Quil A或STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (參見例如美國專利案第5,057,540號)或由其產生之粒子，諸如ISCOM (由膽固醇、皂素、磷脂及兩性蛋白質之組合形成的免疫刺激複合物)與Iscomatrix® (具有與ISCOM基本上相同之結構，但不具有蛋白質)； (4) 細菌性脂多醣、合成脂質A類似物，諸如胺基烷基葡糖胺磷酸化合物(AGP)或其衍生物或類似物，其可購自Corixa，及描述於美國專利案第6,113,918號；一類AGP為2-[(R)-3-四癸醯基氧基四癸醯基胺基]乙基2-去氧-4-O-膦醯基-3-O-[(R)-3-四癸醯基氧基四癸醯基]-2-[(R)-3-四癸醯基氧基四癸醯基胺基]-ß-D-葡萄哌喃糖苷，其亦稱為529 (先前稱為RC529)，其調配成水性形式或調配成穩定乳液 (5) 合成聚核苷酸，諸如含有CpG基元之寡核苷酸(美國專利第6,207,646號)； (6) 細胞介素，諸如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干擾素(例如γ干擾素)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、共刺激分子B7-1及B7-2等；及 (7) 補體，諸如補體組分C3d之三聚體。
在另一實施例中，佐劑為以上佐劑中之2種、3種或更多種的混合物，例如SBAS2 (亦含有3-去醯化單磷醯基脂質A及QS21的水包油乳液)。
胞壁醯肽包括(但不限於)：N-乙醯基胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(1',2'二軟脂醯基-sn-丙三氧基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在某些實施例中，佐劑為鋁鹽。鋁鹽佐劑可為礬沈澱型疫苗或礬吸附型疫苗。鋁鹽佐劑為此項技術中熟知的及描述於例如Harlow, E.及D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)及Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)。鋁鹽包括(但不限於)水合氧化鋁、水合氧化鋁、三水合氧化鋁(ATH)、水合鋁、三水合鋁、水凝膠、Superfos、Amphogel、氫氧化鋁(III)、羥基磷酸鋁、磷酸鋁佐劑(APA)、非晶氧化鋁、水合氧化鋁或三羥基鋁。
APA為羥基磷酸鋁之水性懸浮液。將氯化鋁與磷酸鈉以1:1體積比摻合以沈澱羥基磷酸鋁來製造APA。在摻合製程之後，藉由高剪切混合器減小材料尺寸，以達成單分散粒度分佈。隨後使產物針對生理鹽水進行透濾及蒸汽滅菌。在一個實施例中，鋁鹽之劑量為10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700 µg，或1、1.2、1.5、2、3、5 mg或更大。在另一實施例中，上文所述之礬鹽的劑量為每µg重組蛋白質。
在某些實施例中，使用市售Al(OH)3 (例如Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury的鋁膠或Superfos, NY)以50至200 µg蛋白質/mg氫氧化鋁之比率吸附蛋白質。在另一實施例中，蛋白質之吸附取決於蛋白質之pI (等溫pH)及培養基之pH。具有較低pI之蛋白質比具有較高pI之蛋白質更強效地吸附至帶正電的鋁離子。鋁鹽可建立在2至3週時段內緩慢釋放之抗原儲存庫，參與巨噬細胞之非特異性活化及補體活化及/或刺激先天性免疫機制(可能經由尿酸刺激)。參見例如Lambrecht等人, 2009, Curr Opin Immunol 21:23。
單價主體水性共軛物通常摻合在一起及對於除6B (其可稀釋至目標8 µg/mL)之外的所有血清型稀釋至目標4 µg/mL。一經稀釋，則將對批料進行過濾滅菌，及無菌添加等體積之磷酸鋁佐劑以靶向250 µg/mL之最終鋁濃度。經佐劑調配之批料將填充至單次使用之0.5 mL/劑量小瓶中。
在某些實施例中，佐劑為含CpG-核苷酸序列，例如含CpG-寡核苷酸，尤其含CpG-寡去氧核苷酸(CpG ODN)。在另一實施例中，佐劑為ODN 1826，其可自Coley醫藥組獲取。
使用CpG寡核苷酸之方法為此項技術中熟知的及描述於例如Sur等人, 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58；及Yasuda等人, 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110。
在替代性實施例中，免疫原性組合物包含本文所述之多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，例如實施例E1或其任何子實施例中，且不包含佐劑。
配製物 本發明之多價免疫原性組合物可調配成單劑量小瓶、多劑量小瓶或預填式玻璃或塑膠注射器。
在另一實施例中，本發明之多價免疫原性組合物經口投與，及因此調配成適於經口投與之形式，亦即固體或液體製劑。固體口服調配物包括錠劑、膠囊、丸劑、粒劑、團塊及類似物。液體口服調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及類似物。
液體調配物之醫藥學上可接受之載體為水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇溶液/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。油之實例為動物、植物或合成來源之彼等，例如花生油、大豆油、橄欖油、葵花子油、魚肝油、另一海洋油，或來自牛奶或蛋之脂質。
本發明之多價免疫原性組合物可為等張、低張或高張的。然而，當投與時，用於輸注或注射之組合物為基本上等張的通常為較佳的。因此對於儲存，組合物較佳可為等張或高張的。若對於儲存，組合物為高張的，則其可在投與之前經稀釋以變成等張溶液。
等張劑可為離子性等張劑(諸如鹽)或非離子性等張劑(諸如碳水化合物)。離子性等張劑之實例包括(但不限於) NaCl、CaCl2 、KCl及MgCl2 。非離子性等張劑之實例包括(但不限於)甘露醇、山梨糖醇及丙三醇。
至少一種醫藥學上可接受之添加劑為緩衝液亦為較佳的。出於一些目的，例如當醫藥組合物意欲用於輸注或注射時，通常需要組合物包含緩衝液，其能夠將溶液緩衝至在4至10，諸如5至9，例如6至8範圍內之pH。
緩衝液可例如選自由以下組成之群：TRIS、乙酸鹽、麩胺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、組胺酸、甘胺酸、丁二酸鹽及三乙醇胺緩衝液。
緩衝液可選自用於非經腸用途之USP相容性緩衝液(特定言之，當醫藥調配物用於非經腸用途時)。舉例而言，緩衝液可選自由以下組成之群：一元酸，諸如乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甘油酸及乳酸；二元酸，諸如烏頭酸、己二酸、抗壞血酸、碳酸、麩胺酸、蘋果酸、丁二酸及酒石酸；多元酸，諸如檸檬酸及磷酸；及鹼，諸如氨水、二乙醇胺、甘胺酸、三乙醇胺及TRIS。
非經腸媒劑(用於皮下、靜脈內、動脈內或肌肉內注射)包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏溶液及不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之補充劑)及類似物。實例為添加或不添加界面活性劑及其他醫藥學上可接受之佐劑的無菌液體，諸如水及油。一般而言，水、鹽水、右旋糖水溶液及相關糖溶液、二醇(諸如丙二醇或聚乙二醇)、聚山梨醇酯80 (PS-80)、聚山梨醇酯20 (PS-20)及泊洛沙姆188 (P188)為較佳液體載體，尤其對於可注射溶液而言。油之實例為動物、植物或合成來源之彼等，例如花生油、大豆油、橄欖油、葵花子油、魚肝油、另一海洋油，或來自牛奶或蛋之脂質。
本發明之調配物亦可含有界面活性劑。較佳界面活性劑包括(但不限於)：泊洛沙姆188 (P188; 普流尼克；F68 NF)；聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑(通常被稱作Tweens)，尤其PS-20及PS-80；在DOWFAX™商標名下銷售之氧化乙烯(EO)、環氧丙烷(PO)及/或環氧丁烷(BO)之共聚物，諸如線性EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚醇，其之重複乙氧基(氧基-1,2-乙二基)之數目可變化，其中辛苯聚醇-9 (TRITON X-100或第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)尤其受關注；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，諸如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，諸如Tergitol™ NP系列；衍生於月桂醇、鯨蠟醇、十八烷醇及油醇之聚氧化乙烯脂肪醚(被稱為Brij界面活性劑)，諸如三乙二醇醚(Brij 30)；及脫水山梨糖醇酯(通常被稱為SPAN)，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)及脫水山梨糖醇單月桂酸酯。包含於乳液中之較佳界面活性劑為PS-80。
可使用界面活性劑之混合物，例如PS-80/Span 85混合物。聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯(諸如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(PS-80))與辛苯聚醇(諸如第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)之組合亦為適合的。另一適用組合包含月桂醇醚9加聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯及/或辛苯聚醇。
較佳界面活性劑之量(重量%)為：0.01至1%，特定言之約0.1%的聚氧化乙烯脫水山梨糖醇酯(諸如PS-80)；0.001至0.1%，特定言之0.005至0.02%的辛基-或壬基苯氧基聚氧乙烯醇(諸如Triton X-100；或Triton系列中之其他清潔劑)；0.1%至20%、較佳0.1%至10%及特定言之0.1%至1%或約0.5%的聚氧化乙烯醚(諸如月桂醇醚9)。
在某些實施例中，組合物基本上由組胺酸(20 mM)、鹽水(150 mM)及0.2% PS-20 (pH 5.8)及250 µg/mL APA(磷酸鋁佐劑)組成。PS-20可在0.005%至0.3% (w/v)範圍內。在另一實施例中，PS-20可在0.025%至0.8% (w/v)範圍內。在另一實施例中，PS-20可在0.05%至0.8% (w/v)範圍內。在另一實施例中，PS-20可在0.05%至0.2% (w/v)範圍內。該製程由以下組成：將多達24種血清型之摻合物於組胺酸、鹽水及PS-20中組合，隨後將此經摻合材料與APA及鹽水(含或不含抗微生物防腐劑)組合。
在特定實施例中，多價免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中多醣蛋白質共軛物中之肺炎鏈球菌的血清型包含本文所闡述之血清型中的任一者，及進一步包含20 mM至80 mM組胺酸(pH 5.8)及150 mM NaCl。在一些實施例中，多價免疫原性組合物進一步包含0.2%至0.8% w/v聚山梨醇酯20。
多價免疫原性組合物PCV24藉由使用非質子性溶劑(亦稱為DMSO化學反應)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F及-35B，及在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)、150 mM NaCl及0.1% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中調配，每種多醣血清型為4 µg/mL及8 µg/mL，總多醣濃度分別為96 µg/mL或192 µg/mL，及稱為「PCV24 unadj」。在另一特定實施例中，在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)、150 mM NaCl及0.2% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中製備多價免疫原性組合物PCV24，每種多醣血清型為4 µg/mL，總多醣濃度為96 µg/mL，進一步包含呈磷酸鋁佐劑形式之250 µg [Al]/mL。此被稱為「PCV24/APA」。
界面活性劑之選擇可能需要針對不同藥品及原料藥最佳化。對於具有15種或更多種血清型之多價疫苗，PS-20及P188為較佳的。用於製成共軛物之化學物質的選擇亦可在調配物之穩定化中起重要作用。特定言之，當多價組合物中用於製備不同多醣蛋白質共軛物之共軛反應包括水性溶劑及DMSO溶劑時，特定界面活性劑系統具有顯著的穩定性差異。發現具有單獨聚山梨醇酯20或與多元醇組合的泊洛沙姆188之聚烯烴蛋白質共軛物的穩定性得以改善。
特定清潔劑如何保護生物治療劑之確切機制未充分理解，及無法憑經驗預測。可能的穩定化機制包括較佳水合、較佳排阻、生物治療劑與表面之間的空氣/液體界面競爭、表面張力及/或清潔劑與生物治療劑之直接結合，以掩蓋用作聚集之種子的疏水性斑塊。
泊洛沙姆亦可用於本發明之組合物中。泊洛沙姆為由側接有聚氧化乙烯(聚(環氧乙烷))之兩個親水性鏈的聚氧化丙烯(聚(環氧丙烷))之中心疏水性鏈構成的非離子型三嵌段共聚物。泊洛沙姆亦由商標Pluronic® 得知。因為可定製聚合物嵌段長度，所以特性略微不同的多種不同泊洛沙姆。對於通用術語「泊洛沙姆」，此等共聚物通常以字母「P」命名(泊洛沙姆)，後接三位數字，前兩位數字×100得到聚氧化丙烯核心之近似分子量，及最後一位數字×10得到聚氧化乙烯含量百分比(例如，P407=泊洛沙姆，其聚氧化丙烯分子量為4,000 g/mol及聚氧化乙烯含量為70%)。對於商標Pluronic® ，此等共聚物之編碼以字母開頭，以定義其在室溫下的物理形式(L=液體，P=糊劑，F=片(固體))，接著為兩位或三位數字。數字名稱中的第一位數字(三位數字中的兩位數字)乘以300表示疏水物的近似分子量；及最後一位數字×10表示聚氧化乙烯含量百分比(例如，L61=Pluronic® ，其聚氧化丙烯分子量為1,800 g/mol，聚氧化乙烯含量為10%)。參見美國專利第3,740,421號。
泊洛沙姆之實例具有通式：HO(C2 H4 O)a (C3 H6 O)b (C2 H4 O)a H，其中a及b嵌段具有以下值：
Pluronic® 泊洛沙姆 A B 分子量
L31 2 16 1100 (平均)
L35       1900 (平均)
L44NF 124 12 20 2090至2360
L64          2900 (平均)
L81          2800 (平均)
L121          4400 (平均)
P123    20 70 5750 (平均)
F68NF 188 80 27 7680至9510
F87NF 237 64 37 6840至8830
F108NF 338 141 44 12700至17400
F127NF 407 101 56 9840至14600
如本文所用，分子量單元以為道爾頓(Da)或g/mol為單位。
較佳地，泊洛沙姆之分子量通常在1,100至17,400 Da、7,500至15,000 Da或7,500至10,000 Da之範圍內。泊洛沙姆可選自泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。調配物中之泊洛沙姆的最終濃度為0.001重量/體積%至5重量/體積%，或0.025重量/體積%至1重量/體積%。在某些態樣中，多元醇為丙二醇及最終濃度為1重量/體積%至20重量/體積%。在某些態樣中，多元醇為聚乙二醇400及最終濃度為1重量/體積%至20重量/體積%。
用於本發明之調配物的適合多元醇為聚合多元醇，尤其為聚醚二醇，其包括(但不限於)丙二醇及聚乙二醇、聚乙二醇單甲醚。可獲得單體分子量範圍為約425至約2,700的丙二醇。亦可獲得在約200至約35,000之分子量範圍內的聚乙二醇及聚乙二醇單甲醚，包括(但不限於) PEG200、PEG300、PEG400、PEG1000、PEG MME 550、PEG MME 600、PEG MME 2000、PEG MME 3350及PEG MME 4000。較佳聚乙二醇為聚乙二醇400。本發明調配物之多元醇的最終濃度可為1重量/體積%至20重量/體積%或6重量/體積%至20重量/體積%。
調配物亦含有pH緩衝鹽水溶液。緩衝液可例如選自由以下組成之群：TRIS、乙酸鹽、麩胺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、組胺酸、甘胺酸、丁二酸鹽、HEPES (4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)、MES (2-(N-嗎啉基)乙磺酸)及三乙醇胺緩衝液。緩衝液能夠將溶液之pH緩衝至4至10、5.2至7.5或5.8至7.0範圍內。在本發明之某些態樣中，緩衝液選自由以下組成之群：磷酸鹽、丁二酸鹽、組胺酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸鹽或檸檬酸鹽。緩衝液還可選自例如用於非經腸用途之USP相容性緩衝液(特定言之，當醫藥調配物用於非經腸用途時)。在一個實施例中，緩衝液濃度將在1 mM至100 mM範圍內。在另一實施例中，緩衝液之濃度將在10 mM至80 mM範圍內。在另一實施例中，緩衝液濃度將在1 mM至50 mM或5 mM至50 mM範圍內。在某些態樣中，緩衝液為最終濃度為5 mM至50 mM之組胺酸或最終濃度為1 mM至10 mM之丁二酸鹽。在某些態樣中，組胺酸緩衝液之最終濃度為20 mM±2 mM。
雖然鹽水溶液(例如，含NaCl溶液)為較佳的，但適用於調配物之其他鹽包括(但不限於) CaCl2 、KCl及MgCl2 及其組合。可使用包括(但不限於)蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇及甘油之非離子性等張劑來代替鹽。適合之鹽範圍包括(但不限於) 20 mM至500 mM或40 mM至170 mM。在一個態樣中，鹽水為NaCl，視情況以25 mM至170 mM之濃度存在。
在一較佳實施例中，調配物包含具有氯化鈉之L-組胺酸緩衝液。
在另一實施例中，醫藥組合物以控制釋放系統遞送。舉例而言，藥劑可使用靜脈內輸注、經皮貼片、脂質體或其他投與模式來投與。在另一實施例中，使用聚合材料；例如以微球體形式或以植入物形式。
選擇每種劑量組合物中之共軛物的量作為誘導免疫保護性反應而無顯著不良作用的量。此類量可視肺炎鏈球菌血清型而變化。一般而言，對於多醣類共軛物，每種劑量將包含0.08至100 μg之各多醣。在本發明之一些實施例中，各多醣共軛物之劑量為0.08至10 μg。在其他實施例中，各共軛物之劑量為1至5 g、0.4至4 g、0.4至3 g、0.4至2 g或0.4至1 μg。在一些實施例中，一或多種多醣共軛物之劑量為100、150、200、250、300、400、500或750 μg或0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90或100 μg。
在本發明之組合物的一些實施例中，所有多醣共軛物以相同量存在於組合物中。在其他實施例中，多醣共軛物以不同量存在於組合物中(亦即至少一種多醣共軛物以不同於組合物之一或多種其他多醣共軛物的量存在)。
特定免疫原性組合物之組分的最佳量可藉由涉及觀測個體中之適當免疫反應之標準研究來確定。舉例而言，在另一實施例中，由動物研究向人類資料外推來確定人類接種之劑量。在另一實施例中，劑量憑經驗確定。
本發明之組合物亦可包括一或多種來自肺炎鏈球菌之蛋白質。適用於包括的肺炎鏈球菌蛋白質之實例包括國際專利申請公開案第WO 02/083855號及第WO 02/053761號中鑑別之肺炎鏈球菌蛋白質。
在某些實施例中，藉由熟習此項技術者已知之一或多種方法向個體投與本發明之組合物，諸如非經腸、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、經皮內、經鼻內、皮下、腹膜內，及相應地調配。在一個實施例中，本發明之組合物經由表皮注射、肌肉內注射、靜脈內、動脈內、皮下注射或呼吸黏膜內注射液體製劑來投與。用於注射之液體調配物包括溶液及類似物。
III.製成方法 來自肺炎鏈球菌之莢膜多醣可藉由熟習此項技術者已知之標準技術製備。舉例而言，多醣可由細菌分離及可藉由已知方法一定程度地尺寸化(參見例如歐洲專利第EP497524號及第EP497525號)；及較佳藉由使用均質機或藉由化學水解實現微流體化。在一個實施例中，每種肺炎鏈球菌多醣血清型生長於大豆類培養基中。隨後經由標準步驟(包括離心、沈澱及超過濾)純化個別多醣。參見例如美國專利申請公開案第2008/0286838號及美國專利第5,847,112號。多醣可尺寸化以降低多醣樣品中之黏度及/或使用諸如機械或化學尺寸化來改善用於經共軛產物的可過濾性。可使用乙酸進行化學水解。機械尺寸化可使用高壓均質化剪切來進行。
經純化多醣可以化學方式活化來使醣能夠與載體蛋白質反應。經純化多醣可連接至連接子。每種莢膜多醣一經活化或連接至連接子，則分別共軛至載體蛋白質以形成糖共軛物。多醣共軛物可藉由已知偶合技術製備。
多醣可共軛至連接子以形成多醣連接子中間物，其中連接子之自由端為酯基。因此，連接子為至少一端為酯基的連接子。選擇另一端使得其可與多醣反應以形成多醣連接子中間物。
多醣可使用多醣中之一級胺基偶合至連接子。在此情況下，連接子通常在兩端具有酯基。此允許藉由使酯基中之一者與多醣中之一級胺基藉由親核醯基取代反應進行偶合。反應產生多醣經由醯胺鍵聯偶合至連接子的多醣-連接子中間物。連接子因此為雙官能連接子，其提供與多醣中之一級胺基反應的第一酯基及與載體分子中之一級胺基反應的第二酯基。典型的連接子為己二酸N-羥基丁二醯亞胺二酯(SIDEA)。
偶合亦可間接地進行，亦即用偶合至連接子前用於衍生多醣之額外連接子。
使用羰基將多醣在還原多醣端時偶合至額外連接子。此偶合包含兩個步驟：(a1)使羰基與額外連接子反應；及(a2)使額外連接子之自由端與連接子反應。在此等實施例中，額外連接子通常在兩端處具有一級胺基，藉此允許藉由利用還原胺化使一級胺基中之一者與多醣中之羰基反應來進行步驟(a1)。使用可與多醣中之羰基反應的一級胺基。醯肼或羥基胺基為適合的。相同的一級胺基通常存在於額外連接子的兩端處。反應產生多醣經由C—N鍵聯偶合至額外連接子的多醣-額外連接子中間物。
多醣可使用多醣中之不同基團，尤其羧基偶合至額外連接子。此偶合包含兩個步驟：(a1)使基團與額外連接子反應；及(a2)使額外連接子之自由端與連接子反應。在此情況下，額外連接子通常在兩端處具有一級胺基，藉此允許藉由利用EDAC活化使一級胺基中之一者與多醣中之羧基反應來進行步驟(a1)。使用可與多醣中之經EDAC活化之羧基反應的一級胺基。醯肼基團為適合的。相同的一級胺基通常存在於額外連接子的兩端處。反應產生多醣經由醯胺鍵聯偶合至連接子的多醣-額外連接子中間物。
在一個實施例中，多醣之化學活化及隨後藉由還原胺化共軛至載體蛋白質可藉由在以下中所述的方式達成：美國專利第4,365,170、4,673,574及4,902,506號，美國專利申請案公開案第2006/0228380、2007/184072、2007/0231340及2007/0184071號，及WO2006/110381號、第WO2008/079653號及第WO2008/143709號。化學物質可包括藉由將肺炎鏈球菌多醣與使末端羥基氧化成醛(諸如高碘酸鹽(包括高碘酸鈉、高碘酸鉀或過碘酸))的任何氧化劑反應來活化。反應導致碳水化合物之鄰接羥基的隨機氧化裂解及形成反應性醛基。
偶合至載體蛋白質藉由經由直接胺化至蛋白質之離胺醯基來還原胺化。舉例而言，共軛可藉由使經活化多醣及載體蛋白質之混合物與還原劑(諸如氰基硼氫化鈉)反應進行。共軛反應可在水溶液或DMSO存在下進行。參見例如US2015/0231270、US2011/0195086及EP 0471 177 B1。隨後添加諸如硼氫化鈉之強效還原劑將未反應之醛封端。
還原胺化包含兩個步驟：(1)使多醣氧化形成反應性醛；(2)降低經活化多醣與載體蛋白質之間形成的亞胺(希夫鹼)，以形成穩定的胺共軛物鍵。在氧化前，視情況減小多醣尺寸。可採用機械方法(例如均質化)或化學水解。可使用乙酸進行化學水解。氧化步驟可涉及與過碘酸鹽反應。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸；術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及正過碘酸鹽(IO6 - )及包括各種過碘酸(例如高碘酸鈉及高碘酸鉀)之鹽。在一實施例中，莢膜多醣在偏過碘酸鹽存在下，較佳地在過碘酸鈉(NaIO4 )存在下氧化。在另一實施例中，莢膜多醣在原過碘酸(鹽)存在下，較佳地在過碘酸存在下氧化。
在一個實施例中，氧化劑為穩定的硝醯基或氮氧化物基團化合物，諸如哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物，在氧化劑存在下選擇性地氧化一級羥基(如WO 2014/097099中所述)。在該反應中，在催化週期中，實際氧化劑為N-氧銨鹽。在一態樣中，該穩定的硝醯基或氮氧化物基團化合物為哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物。在一態樣中，該穩定的硝醯基或氮氧化物基團化合物攜帶TEMPO (2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL (2,2,5,5-四甲基-1-吡咯啶氧基)部分。在一態樣中，該穩定硝醯基團化合物為TEMPO或其衍生物。在一態樣中，該氧化劑為攜帶N-鹵基部分之分子。在一態樣中，該氧化劑選自由以下組成之群：N-氯代二醯亞胺、N-溴代丁二醯亞胺、N-碘丁二醯亞胺、二氯異三聚氰酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二溴異三聚氰酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二碘異三聚氰酸及1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮。較佳地，該氧化劑為N-氯丁二醯亞胺。
在某些態樣中，氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)自由基及作為共氧化劑之N-氯代二醯亞胺(NCS)(如WO 2014/097099中所述)。因此，在一個態樣中，來自肺炎鏈球菌之糖共軛物可藉由包含以下步驟之方法獲得：a)使醣與2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)及N-氯代二醯亞胺(NCS)在水性溶劑中反應以產生活化醣；及b)使經活化醣與包含一或多個胺基之載體蛋白質反應(該方法在其後稱為「TEMPO/NCS-還原胺化」)。
視情況，藉由添加抑制劑來淬滅氧化反應。淬滅劑可選自鄰二醇、1,2-胺基醇、胺基酸、谷胱甘肽、亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二亞硫磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、亞磷酸鹽或亞磷酸(諸如甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2-二醇或丁-2,3-二醇、抗壞血酸)。
在某些實施例中，本發明提供一種利用非質子性溶劑中之共軛反應製備血清型8肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物的方法，其中共軛反應不使用氰基硼氫化鈉。在其他實施例中，共軛反應為希夫鹼還原或還原胺化。在其他實施例中，蛋白質為破傷風類毒素、白喉類毒素或CRM197。在其他實施例中，蛋白質為CRM197。在其他實施例中，共軛反應為還原胺化。在其他實施例中，還原胺化在二甲亞碸(DMSO)中進行。
在一些實施例中，共軛前經氧化多醣之分子量在30 kDa與1,000 kDa之間。分子量可藉由尺寸排阻層析(SEC)與多角度光散射偵測器(MALS)及折射率偵測器(RI)組合計算。在一些實施例中，多醣之分子量在50 kDa與300 kDa之間。在一些實施例中，多醣之分子量在50 kDa與1,000 kDa之間。在額外實施例中，多醣之分子量在70 kDa與900 kDa之間。在其他實施例中，多醣之分子量在100 kDa與800 kDa之間。在其他實施例中，多醣之分子量在200 kDa與600 kDa之間。在其他實施例中，多醣之分子量為100 kDa至1,000 kDa；100 kDa至900 kDa；100 kDa至800 kDa；100 kDa至700 kDa；100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；150 kDa至1,000 kDa；150 kDa至900 kDa；150 kDa至800 kDa；150 kDa至700 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；200 kDa至1,000 kDa；200 kDa至900 kDa；200 kDa至800 kDa；200 kDa至700 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；200 kDa至300；250 kDa至1,000 kDa；250 kDa至900 kDa；250 kDa至800 kDa；250 kDa至700 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至1,000 kDa；300 kDa至900 kDa；300 kDa至800 kDa；300 kDa至700 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至1,000 kDa；400 kDa至900 kDa；400 kDa至800 kDa；400 kDa至700 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa。
共軛製程之第二步驟為使用還原劑使經活化多醣與載體蛋白質之間的亞胺(希夫鹼)鍵還原，以形成穩定的共軛物鍵(稱作還原胺化)。適合之還原劑包括氰基硼氫化物(諸如氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉)。在一個實施例中，還原劑為氰基硼氫化鈉。
在某些實施例中，還原胺化反應在非質子性溶劑(或非質子性溶劑之混合物)中進行。在一個實施例中，還原反應在DMSO或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。DMSO或DMF溶劑可用於將經活化多醣及載體蛋白質(若凍乾)復原。在一個實施例中，非質子性溶劑為DMSO。
在還原反應結束時，共軛物中可能存在剩餘的未反應醛基，其可使用適合之封端劑進行封端。在一個實施例中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH4 )。適合之替代方式包括在布朗斯特酸或路易斯酸存在下的三乙醯氧基硼氫化鈉或硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷(諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe'PrN-BH3 、苯甲胺-BH3 或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)或硼氫化物交換樹脂)。在共軛(還原反應及視情況封端)之後，可藉由熟習此項技術者已知的多種技術來純化(相對於多醣-蛋白質共軛物之量增濃)糖共軛物。此等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾、沈澱/溶離、管柱層析(離子交換層析、多峰離子交換層析、DEAE或疏水相互作用層析)及深度過濾。在一實施例中，藉由透濾或離子交換層析或尺寸排阻層析來純化糖共軛物。
使用非質子性溶劑中之還原胺化製備的糖共軛物一般用於多價肺炎鏈球菌共軛物疫苗。因此，在並非所有血清型均在非質子性溶劑中製備之多價組合物的某些實施例中，對於剩餘血清型的氧化反應在選自以下之水性溶劑中進行：PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)、MES (2-(N-嗎啉基)乙磺酸)、HEPES (4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、Bis-tris、ADA (N-(2-乙醯胺基)亞胺二乙酸)、PIPES (哌嗪-N,N'-雙(2-乙磺酸))、MOPSO (3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸)、BES (N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙烷磺酸)、MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)、DIPSO (3-雙(2-羥基乙基) 胺基-2-羥基丙-1-磺酸)、MOBS (4-(N-嗎啉基)丁磺酸)、HEPPSO (N-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙磺酸))、POPSO (哌嗪-1,4-雙(2-羥基-3-丙磺酸))、TEA (三乙醇胺)、EPPS (4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-丙磺酸)或二甘胺酸，在pH 6.0與8.5、7.0與8.0或7.0與7.5之間。
可使用非質子性溶劑中之還原胺化製備的肺炎鏈球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物包括(但不限於)肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。多醣可以寡醣形式使用。此等宜由經純化多醣之片段化(例如藉由水解)形成，其通常繼之以所需尺寸之片段的純化。
在某些實施例中，使用非質子性溶劑中之還原胺化來製備肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B中之一或多者的肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物。在某些實施例中，使用非質子性溶劑中之還原胺化來製備多價免疫原性組合物中之共軛物中的每一者。在某些實施例中，本發明之多價組合物中的一或多種血清型的多醣使用非質子性溶劑中之還原胺化共軛至載體蛋白質及使用水性溶劑中之還原胺化共軛一或多種血清型多醣。在某些實施例中，本發明之多價組合物中的兩種或更多種血清型的多醣使用非質子性溶劑中之還原胺化共軛至載體蛋白質。在其他實施例中，本發明之多價組合物中的三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種、十一種或更多種、十二種或更多種、十三或更多種、十四或更多種、十五或更多種、十六或更多種、十七種或更多種、十八種或更多種、十九種或更多種、二十種或更多種、二十一種或更多種、二十二種或更多種、二十三種或更多種或二十四種或更多種血清型的多醣使用非質子性溶劑中之還原胺化共軛至載體蛋白質。在某些實施例中，來自本發明之多價組合物中的一或多種血清型的多醣使用可在非質子性溶劑中或在水性溶劑中之其他化學物質共軛至載體蛋白質。
因此，本發明係關於一種多價免疫原性組合物，其包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其各自包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型如本文所述(亦即在第II部分，「多價免疫原性組合物」)，其中多醣蛋白質共軛物中之一或多者的肺炎鏈球菌多醣共軛至載體蛋白質的共軛反應在非質子性溶劑中進行。在某些實施例中，多價免疫原性組合物中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之肺炎鏈球菌血清型在非質子性溶劑中共軛。將血清型之剩餘部分使用替代性化學物質共軛及/或在水性溶劑中共軛。
已確定相對於在水性條件下製備的相同共軛物，在多醣-蛋白質共軛物之還原胺化期間使用DMSO作為溶劑對彼等血清型產生了出乎意料的優越穩定性及提高之免疫原性(參見美國申請案第62/463,216號及第62/555,444號)。
在本發明之某些實施例中，組合物中之總多醣濃度為約0.02至約0.288 mg/mL。在本發明之某些實施例中，組合物中之總多醣濃度為約0.03至約0.192 mg/mL。在本發明之某些實施例中，組合物中之總多醣濃度為約0.04 mg/mL至約0.192 mg/mL。在其他實施例中，組合物中之總多醣濃度為約0.065至約0.096 mg/mL、約0.070至約0.080 mg/mL、約0.065至約0.080 mg/mL、約0.070至約0.085 mg/mL、約0.110至約0.128 mg/mL、約0.110至約0.175 mg/mL、約0.10至約0.175 mg/mL、約0.110至約0.170 mg/mL、約0.115至約0.15 mg/mL、約0.110至約0.15 mg/mL、約0.110至約0.125 mg/mL、約0.150至約0.170 mg/mL、約0.150至約0.165 mg/mL、約0.140至約0.170 mg/mL、約0.130至約0.170 mg/mL、約0.150至約0.175 mg/mL、約0.070至約0.170 mg/mL、約0.065至約0.175 mg/mL或約0.065至約0.180 mg/mL。
在非質子性溶劑中製備多價免疫原性組合物中之一或多種或所有多醣-蛋白質共軛物的本發明之實施例中，組合物中之總多醣濃度在37℃下穩定4週或更久、在25℃下穩定4週或更久、在4℃下穩定12週或更久。
在非質子性溶劑中製備多價免疫原性組合物中之一或多種或所有多醣-蛋白質共軛物的本發明之某些實施例中，組合物中之所有肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物之平均分子量(Mw) (組合物中所有共軛物之平均值)為約2,000至約6,500 kDa、約2,500至約6,000 kDa、約3,000至約5,500 kDa、約3,500至約5,000 kDa、約3,500至約4,500 kDa、約3,500至約4,700 kDa、約3,500至約4,600 kDa、約3,500至約4,500 kDa、約3,500至約4,400 kDa、約3,500至約4,300 kDa、約3,500至約4,200 kDa、約3,600至約4,700 kDa、約3,600至約4,600 kDa、約3,600至約4,500 kDa、約3,600至約4,400 kDa、約3,600至約4,300 kDa、約3,600至約4,200 kDa、約3,700至約4,700 kDa、約3,700至約4,600 kDa、約3,700至約4,500 kDa、約3,700至約4,400 kDa、約3,700至約4,300 kDa、約3,700至約4,200 kDa、約3,800至約4,700 kDa、約3,800至約4,600 kDa、約3,800至約4,500 kDa、約3,800至約4,400 kDa、約3,800至約4,300 kDa、約3,800至約4,200 kDa、約3,900至約4,700 kDa、約3,900至約4,600 kDa、約3,900至約4,500 kDa、約3,900至約4,400 kDa、約3,900至約4,300 kDa或約3,900至約4,200 kDa。
在非質子性溶劑中製備多價免疫原性組合物中之多醣-蛋白質共軛物的本發明之某些實施例中，組合物中之肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物中之每一者的Mw (對於單一血清型)為約1,000至約10,000 kDa、約1,500至約5,500 kDa、約1,500至約5,600 kDa、約1,500至約5,700 kDa、約1,500至約5,800 kDa、約1,500至約5,900 kDa、約1,500至約6,000 kDa、約1,000至約5,500 kDa、約1,000至約5,000 kDa、約1,000至約4,000 kDa、約1,000至約4,500 kDa、約1,000至約4,000 kDa或約1,000至約3,500 kDa。在其他實施例中，來自組合物內之單一血清型之共軛物的Mw為約1,000 kDa、約1,100 kDa、約1,200 kDa、約1,300 kDa、約1,400 kDa、約1,500 kDa、約1,600 kDa、約1,700 kDa、約1,800 kDa、約1,900 kDa、約2,000 kDa、約2,100 kDa、約2,200 kDa、約2,300 kDa、約2,400 kDa、約2,500 kDa、約2,600 kDa、約2,700 kDa、約2,800 kDa、約2,900 kDa、約3,000 kDa、約3,100 kDa、約3,200 kDa、約3,300 kDa、約3,400 kDa、約3,500 kDa、約3,600 kDa、約3,700 kDa、約3,800 kDa、約3,900 kDa、約4,000 kDa、約4,100 kDa、約4,200 kDa、約4,300 kDa、約4,400 kDa、約4,500 kDa、約4,600 kDa、約4,700 kDa、約4,800 kDa、約4,900 kDa、約5,000 kDa、約5,100 kDa、約5,200 kDa、約5,300 kDa、約5,400 kDa或約5,500 kDa。
在本發明之某些實施例中，在非質子性溶劑中製備多價免疫原性組合物中之多醣-蛋白質共軛物。在某些實施例中，在非質子性溶劑中製備的肺炎鏈球菌血清型特異性共軛物的百分比(藉由非質子性溶劑中製備的多醣血清型之數目除以多醣血清型之總數計算，其中總數包括非質子性溶劑或質子性溶劑中製備的血清型)可大於50%、或大於60%、或大於70%、或大於80%、或大於90%或為100%。
在本發明之某些實施例中，在非質子性溶劑中製備組合物中之血清型3多醣-蛋白質共軛物，及共軛物之Mw為約1,000至約5,000 kDa、或約1,000至約4,000 kDa、或約1,000至約3,000 kDa、或約1,000至約2,500 kDa、或約1,000至約2,000 kDa。
在非質子性溶劑中製備多價免疫原性組合物中之一或多種或所有多醣-蛋白質共軛物的本發明之某些實施例中，組合物中之肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物之平均分子量(Mw) (組合物中所有共軛物之平均值)為約900至約3,000 kDa、約1,000至約3,000 kDa、約1,000至約2,500 kDa、約1,500至約2,500 kDa、約1,800至約2,500 kDa、約1,900至約2,500 kDa或約2,000至約2,500 kDa。
在非質子性溶劑中製備多價免疫原性組合物中之一或多種或所有多醣-蛋白質共軛物的本發明之某些實施例中，組合物中之所有肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物中之每一者的Mn (對於單一血清型)為約700至約7,000 kDa、約1,000至約6,000 kDa、約1,000至約5,000 kDa、約1,000至約4,000 kDa、約1,000至約3,000 kDa、約900至約5,500 kDa、約900至約5,000 kDa、約900至約4,500 kDa、約900至約4,000 kDa、約900至約3,500 kDa或約900至約3,000 kDa。
在本發明之實施例中，組合物中之肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物的Mw及/或Mn在37℃下穩定4週或更久、在25℃下穩定4週或更久及/或在4℃下穩定12週或更久。
在本發明之實施例中，使用HPSEC UV/MALS/RI測定多醣濃度、Mw及/或Mn。
在非質子性溶劑中製備多價免疫原性組合物中之一或多種或所有多醣-蛋白質共軛物的本發明之一些實施例中，使用280奈米(nm)之激發波長的內源性蛋白質螢光光譜分析量測的組合物之發射最大值為約335 nm至約342 nm。在一些實施例中，發射最大值保持在約335 nm至約342 nm及螢光強度在37℃下穩定至少1週。在一些實施例中，發射最大值保持在約335 nm至約342 nm及螢光強度在37℃下穩定1週。
在一些實施例中，使用DMSO中之還原胺化來製備多價組合物中之所有肺炎鏈球菌多醣共軛物。在某些子實施例中，包含均使用DMSO製備的多醣共軛物的多價組合物不包含佐劑。
不受任何特定理論束縛，觀測到在DMSO中製備的糖共軛物之免疫原性增強的一種可能機制包括載體蛋白質表面上之碳水化合物(莢膜多醣)與離胺酸殘基之間鍵聯數目增加，其將在蛋白質與多醣之間產生額外的連接點，以賦予穩定性及抵抗肽碳水化合物鍵之反向化學解聚合或分解。參見例如Hsieh, Characterization of Saccharide-CRM197 Conjugate Vaccines in Brown F, Corbel M, Griffiths E (編): Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines. Dev. Biol. Basel, Karger, 2000, 第103期, 第93-104頁。在DMSO溶劑中共軛期間產生的多醣-蛋白質鍵聯增加的額外益處可能為肽解碳水化合物成功地呈遞至T細胞之額外機會。藉由在DMSO溶劑中共軛觀測到免疫原性增強的一種可能機制可歸因於CRM197在有機溶劑中變性，其使多醣鍵聯之額外離胺酸暴露，增大了APC表面處醣肽呈遞的幾率，從而對不同肽抗原決定基產生T細胞依賴性反應。參見Avci等人, 2011, Nature Medicine 17: 1602-1610。
在有機溶劑中共軛產生共軛物中之變性CRM197的又一益處可為降低針對原生CRM197抗原決定基之抗體的免疫干擾。DMSO溶劑中共軛期間產生的多醣-蛋白質鍵聯增加的另一益處可為較大尺寸化多醣蛋白質共軛物形成，使得免疫原性增強。咸信本發明之組合物在引發人類反應方面提供了顯著優勢。
在某些實施例中，共軛反應藉由還原胺化進行，其中鎳用於提高共軛反應效率及有助於移除游離氰化物。已知過渡金屬與氰化物形成穩定的錯合物，且已知改善了蛋白質胺基之還原甲基化及氰基硼氫化鈉之甲醛化(S Gidley等人, Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft等人Anal Biochem. 1980, 106: 186-190)。藉由錯合殘留的抑制性氰化物，添加鎳增加了共軛期間之蛋白質消耗及致使形成更大可能更具免疫原性的共軛物。
氰基硼氫化鈉試劑批次中起始氰化物含量之差異亦導致共軛效能不一致，產生可變的產物屬性，諸如共軛物尺寸及Ps與CRM197共軛比率。添加鎳降低了藉由錯合氰化物共軛的不一致性，消除了氰基硼氫化鈉批次的差異。
適合之替代化學物質包括用1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓四氟硼酸(CDAP)活化醣形成氰酸酯。因此，經活化醣可直接或經由間隔(連接子)基團偶合至載體蛋白質上之胺基。舉例而言，間隔基團可為胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多醣，其可經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或經鹵素乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯醯亞胺[例如乙基碘乙醯醯胺HCl]或N-丁二醯亞胺基溴乙酸鹽或SIAB，或SIA，或SBAP)反應後得到的硫醚鍵聯偶合至載體。較佳地，將氰酸酯(視情況由CDAP化學方法製成)與己烷二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，及使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學方法，經由蛋白質載體上之羧基，將經胺基衍生之醣共軛至載體蛋白質。此類共軛物描述於國際專利申請公開案第WO 93/15760號、第WO 95/08348號及第WO 96/29094號；及Chu等人，1983, Infect. Immunity 40:245-256。
其他適合之共軛技術使用碳二醯亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基丁二醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多描述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。共軛可涉及可藉由將醣之游離羥基與CDI反應形成的羰基連接子(參見Bethell等人, 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn等人, 1981, J. Chromatogr. 218:509-18)，接著與蛋白質反應形成胺基甲酸酯鍵聯。此可涉及將變旋異構端還原成一級羥基，視情況選用之保護/去保護該一級羥基，該一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間物，及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上之胺基偶合。
在莢膜多醣共軛至載體蛋白質後，藉由一或多種技術對多醣-蛋白質共軛物進行純化(相對於多醣-蛋白質共軛物之量增濃)。此等技術之實例為熟習此項技術者熟知的及包括濃縮/透濾操作、超過濾、沈澱/溶離、管柱層析及深度過濾。參見例如美國專利第6,146,902號。
在對個別糖共軛物純化後，將其進行混配以調配本發明之免疫原性組合物。可藉由分離製程製備此等肺炎鏈球菌共軛物及將其調配成單劑量調配物。
表徵本發明之糖共軛物的替代方法為藉由載體蛋白質(例如CRM197)中與醣共軛之離胺酸殘基的數目，其可表徵為一系列經共軛離胺酸(共軛程度)。載體蛋白質之由於與多醣共價鍵聯所致之離胺酸修飾的證據可藉由胺基酸分析，使用熟習此項技術者已知之常規方法得到。共軛致使所回收的離胺酸殘基數目相較於用於產生共軛物材料之載體蛋白質起始物質而減少。在一個較佳實施例中，如藉由本發明之糖共軛物的離胺酸消耗量測，共軛程度在2與15之間、2與13之間、2與10之間、2與8之間、2與6之間、2與5之間、2與4之間、3與15之間、3與13之間、3與10之間、3與8之間、3與6之間、3與5之間、3與4之間、5與15之間、5與10之間、8與15之間、8與12之間、10與15或10與12之間。在一實施例中，本發明之糖共軛物的共軛程度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在另一實施例中，本發明之糖共軛物的共軛程度在4與7之間。在一些此類實施例中，載體蛋白質為CRM197。
本發明之組合物的糖共軛物亦可藉由多醣與載體蛋白質(Ps:Pr)之比率(重量/重量)表徵。在一些實施例中，組合物中糖共軛物的多醣與載體蛋白質之比率(w/w)在0.5與3.0之間(例如約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1 、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1 、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0)。在其他實施例中，多醣與載體蛋白質之比率(w/w)在0.5與2.5之間、0.5與1.5之間、0.8與2.5之間、0.5與1.0之間、1.0與1.5之間、1.0與2.0之間、0.8與2.4之間、0.8與2.3之間、0.8與2.2之間、0.8與2.1之間、0.8與2.0之間、0.8與1.9之間、0.8與1.8之間、0.8與1.7之間、0.8與1.6之間、0.8與1.5之間、0.8與1.4之間、0.8與1.3之間、0.9與2.4之間、0.9與2.3之間、0.9與2.2之間、0.9與2.1之間、0.9與2.0之間、0.9與1.9之間、0.9與1.8之間、0.9與1.7之間、0.9與1.6之間、0.9與1.5之間、0.9與1.4之間、0.9與1.3之間、0.9與1.2之間、1.0與2.4之間、1.0與2.3之間、1.0與2.2之間、1.0與2.1之間、1.0與2.0之間、1.0與1.9之間、1.0與1.8之間、1.0與1.7之間、1.0與1.6之間、1.0與1.5之間、1.0與1.4之間、1.0與1.3或1.0與1.2。在其他實施例中，醣與載體蛋白質比率(w/w)在0.8與1.2之間。在一些此類實施例中，載體蛋白質為CRM197。本發明之糖共軛物及免疫原性組合物可含有未共價共軛至載體蛋白質但仍存在於糖共軛物組合物中之游離醣。游離醣可與糖共軛物非共價結合(例如非共價結合至、吸附至或包埋在其中)。
在特定實施例中，血清型15A共軛物之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.0至約2.0、約1.25至約1.75或約1.3至約1.7。在其他實施例中，血清型15A之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定實施例中，血清型15C共軛物之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.0至約2.0、約1.25至約1.75或約1.3至約1.7。在其他實施例中，血清型15C之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定實施例中，血清型33F共軛物之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.0至約2.0、約1.25至約1.75或約1.3至約1.7。在其他實施例中，血清型33F之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定實施例中，血清型35B共軛物之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.25至約2.25、約1.25至約2.0或約1.3至約1.8。在其他實施例中，血清型35B之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。
在特定實施例中，血清型24F共軛物之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約0.5至約1.5、約0.75至約1.25或約0.8至約1.0。在其他實施例中，血清型24F之醣與載體蛋白質的比率(w/w)為約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。
在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物組合物包含低於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含低於約25%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含低於約20%之游離多醣。在一較佳實施例中，相較於多醣之總量，糖共軛物包含低於約15%之游離多醣。
IV.使用方法 本發明之實施例亦包括(i)用於以下、(ii)用作供以下用之藥劑或組合物或(iii)用於製備供以下用之藥劑的本文所述之一或多種多價免疫原性組合物：(a) (例如，人體之)療法；(b)藥物；(c)抑制肺炎鏈球菌感染；(d)誘導針對肺炎鏈球菌之免疫反應或保護性免疫反應；(e)預防肺炎鏈球菌感染；(f)預防肺炎鏈球菌感染復發；(g)降低與肺炎鏈球菌感染相關之病理性症狀的進展、發作或嚴重程度，包括預防相關併發症，諸如大腦損傷、聽覺喪失及癲癇，(h)降低肺炎鏈球菌感染之可能性，或(i)治療、預防或延緩肺炎鏈球菌疾病(包括(但不限於)肺炎鏈球菌肺炎、肺炎鏈球菌菌血症、肺炎鏈球菌腦膜炎、中耳炎及鼻竇炎)之發作、嚴重程度或進展。在此等用途中，本發明之多價肺炎鏈球菌多醣-共軛物組合物可視情況與一或多種佐劑組合或不與佐劑組合使用。
因此，本發明提供肺炎鏈球菌感染或肺炎鏈球菌疾病之預防性處理(亦即對其保護)的方法，其包含向需要處理之患者投與本發明之多價免疫原性肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物組合物中的一或多者。
本發明之組合物及調配物可用於藉助於經由全身性或黏膜途徑投與此類組合物或調配物來保護或處理易受感染(例如肺炎鏈球菌感染)之人類。
在一個實施例中，本發明提供一種誘導對肺炎鏈球菌之免疫反應的方法，其包含向患者投與免疫有效量之本發明的多價免疫原性組合物。在另一實施例中，本發明提供一種針對肺炎鏈球菌感染接種人類的方法，其包含向人類投與免疫有效量之本發明的多價免疫原性組合物之步驟。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種用於(1)誘導人類患者之免疫反應、(2)誘導人類患者之保護性免疫反應、(3)針對肺炎鏈球菌感染接種人類患者或(4)降低人類患者之肺炎鏈球菌感染之可能性的方法，該方法包含向患者投與本發明之多價免疫原性組合物(亦即本文所述之任何多價免疫原性組合物，諸如第II部分中所述之稱為「多價免疫原性組合物」的多價免疫原性組合物)。
在一個實施例中，本發明提供一種預防嬰兒(不到1歲)、幼兒(約12至24個月)或兒童(約2至5歲)之肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病的方法。
在另一實施例中，本發明提供一種預防6週至17歲患者之肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病的方法。
在另一實施例中，本發明提供一種用於預防6個月至17歲患者之肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病的方法。
在另一實施例中，本發明提供一種預防18歲及更大年齡成人之肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病的方法。
在另一實施例中，本發明提供一種預防50歲及更大年齡成人之肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病的方法。
在另一實施例中，本發明提供一種預防65歲及更大年齡成人之肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病的方法。
在另一實施例中，本發明提供一種用於預防由以下肺炎鏈球菌菌株中之一或多者引起的肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病之方法：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
在上述方法之一個實施例中，組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B或血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。在上述方法之另一實施例中，組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B或血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。在上述方法之一個實施例中，組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B或血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。在上述方法之另一實施例中，組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B或血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。在上述方法之一個實施例中，組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。在上述方法之另一實施例中，組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
已表明，包含血清型6A多醣之肺炎鏈球菌共軛物疫苗可提供針對血清型6C一些交叉保護(Cooper等人, Vaccine 29 (2011) 7207- 7211)。因此，在上述方法之一些實施例中，本發明亦提供不包含血清型6C多醣共軛物，但替代地包含血清型6A多醣共軛物或血清型6A及6B多醣共軛物之多價免疫原性組合物的用途。在其他實施例中，免疫原性組合物包含血清型6A、6B及6C之肺炎鏈球菌多醣共軛物。
在上述方法之特定實施例中，多價免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌共軛物，其包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之多醣： a)    1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； b)   1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； c)    1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； d)   1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； e)    1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； f)    1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； g)   1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； h)   1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； i)    1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； j)    1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； k)   1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； l)    1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； m)  1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； n)   1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； o)   1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； p)   1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； q)   1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； r)    1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； s)    1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； t)    1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； u)   1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； v)   1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； w)  1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； x)   1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； y)   1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； z)    1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；及 aa) 1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
在上述方法之其他實施例中，本發明之多價免疫原性組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中肺炎鏈球菌之血清型包含血清型：i) 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或ii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或iii) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B；或iv) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
亦已表明，包含血清型10A多醣之肺炎鏈球菌共軛物疫苗可提供針對血清型39一些交叉保護(參見WO 2017/085586)。因此，在上述方法之一些實施例中，本發明亦提供不包含血清型10A多醣共軛物，但替代地包含血清型39多醣共軛物之多價免疫原性組合物的用途。在其他實施例中，免疫原性組合物包含血清型10A及39之肺炎鏈球菌多醣共軛物。在上述方法之特定實施例中，肺炎鏈球菌之血清型包含選自由以下組成之群的血清型之群： bb)     1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； cc)      1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； dd)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ee)      1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ff)       1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； gg)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； hh)     1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ii)       1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； jj)       1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； kk)     1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ll)       1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； mm)   1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； nn)     1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； oo)     1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； pp)     1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； qq)     1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； rr)       1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ss)      1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； tt)       1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； uu)     1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； vv)     1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ww)   1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； xx)     1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； yy)     1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； zz)      1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； aaa)   1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39；及 bbb)  1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39。
亦已表明共價連接至載體蛋白質之包含肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣的免疫原性共軛物可提供針對血清型15C及/或血清型15A一些交叉保護(參見WO 2015/110942)。因此，在上述方法之一些實施例中，本發明亦提供不包含血清型15C (或去O-乙醯化15B)多醣共軛物，但替代地包含血清型15B多醣共軛物(亦即血清型15B多醣未實質地去O-乙醯化)之多價免疫原性組合物的用途。在其他實施例中，免疫原性組合物包含血清型15B及15C (或去O-乙醯化15B)之肺炎鏈球菌多醣共軛物。
本發明之組合物適用於提供先前已接受多價肺炎鏈球菌疫苗之患者之針對肺炎鏈球菌互補保護的方法。在此用途中，本發明之組合物可提供先前尚未接種患者之針對特定肺炎鏈球菌血清型保護，可提供對先前已針對肺炎鏈球菌血清型接種患者的額外保護，或可提供先前尚未針對肺炎鏈球菌血清型接種患者及先前已針對肺炎鏈球菌血清型接種患者的保護。
因此，本發明提供一種誘導患者之針對肺炎鏈球菌的免疫反應、接種或誘導保護性免疫反應的方法，其包含向患者投與多價免疫原性組合物，組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中多醣蛋白質共軛物包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中患者先前已針對肺炎鏈球菌接種。在本發明之此態樣的實施例中，多價免疫原性組合物可為本文所述之任何多價免疫原性組合物。在本發明之方法的特定實施例中，向先前經多價肺炎鏈球菌疫苗處理之患者投與多價免疫原性組合物。多價免疫原性疫苗可為指示用於預防由超過一種血清型之肺炎鏈球菌引起的肺炎鏈球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法之特定實施例中，患者預先經指示用於預防選自由以下組成之群的血清型之群內的一或多種肺炎鏈球菌血清型引起的肺炎鏈球菌疾病之多價肺炎鏈球菌疫苗處理： i.     4、6B、9V、14、18C、19F及23F； ii.   4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F及19A； iii.  1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F； iv.  4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F及33F； v.    4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F及20；及 vi.  4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B。
在上述方法之特定實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含多種多醣蛋白質共軛物，其中多醣蛋白質共軛物包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣。在其他實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含未共軛至載體蛋白質之多種肺炎鏈球菌莢膜多醣。
在上述方法之額外實施例中，患者先前經PREVNAR® 13 (肺炎鏈球菌13價共軛物疫苗[白喉CRM197蛋白質], Pfizer, Inc., Philadelphia, PA, USA)處理。
在上述方法之其他實施例中，患者先前經PNEUMOVAX® 23 (Pneumococcol Vaccine Polyvalent, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA)處理。
在上述方法之其他實施例中，患者先前經SYNFLORIX™ (肺炎鏈球菌多醣共軛物疫苗(吸附型), GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Rixensart, Belgium)處理。
在上述方法之實施例中，根據由醫療專業人士(例如醫師)提供之治療方案，在患者已接受多價肺炎鏈球菌疫苗之後的任何時間向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。在特定實施例中，在患者已接受多價肺炎鏈球菌疫苗約1個月至約5年之後，或者在患者已接受多價肺炎鏈球菌疫苗1個月至1年、1個月至2年、1個月至3年、1個月至4年、1個月至6個月、2個月至6個月、2個月至1年、1年至5年、6個月至5年、6個月至4年、6個月至3年、6個月至2年、6個月至1年、1年至4年、1年至3年或1年至2年之後，向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。在其他實施例中，在患者已接受多價肺炎鏈球菌疫苗約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約1年、約1.25年、約1.5年、約1.75年、約2年、約2.25年、約2.5年、約2.75年、約3年、約3.25年、約3.5年、約3.75年、約4年、約4.25年、約4.5年、約4.75年或約5年之後，向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。
在其他實施例中，本發明提供一種用於(1)誘導人類患者之免疫反應、(2)誘導人類患者之保護性免疫反應、(3)針對肺炎鏈球菌感染接種人類患者或(4)降低人類患者之肺炎鏈球菌感染之可能性的方法，該方法包含以任何次序向患者投與本發明之多價免疫原性組合物及投與多價肺炎鏈球菌疫苗。舉例而言，首先向患者投與多價肺炎鏈球菌疫苗，及其次向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。或者，首先向患者投與本發明之多價免疫原性組合物，及其次投與多價肺炎鏈球菌疫苗。多價肺炎鏈球菌疫苗可為指示用於預防由超過一種血清型之肺炎鏈球菌引起的肺炎鏈球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法之特定實施例中，患者經本發明之多價免疫原性組合物及指示用於預防選自由以下組成之群的血清型之群的一或多種肺炎鏈球菌血清型引起的肺炎鏈球菌疾病之多價肺炎鏈球菌疫苗處理： i.     4、6B、9V、14、18C、19F及23F； ii.   4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F及19A； iii.  1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F； iv.  4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F及33F； v.    4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F及20；及 vi.  4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B。
在上述方法之特定實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F及20A之莢膜多醣。
在上述方法之特定實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含多種多醣蛋白質共軛物，其中多醣蛋白質共軛物包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣。在其他實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含未共軛至載體蛋白質之多種肺炎鏈球菌莢膜多醣。
在上述方法之額外實施例中，患者以任何次序經本發明之多價免疫原性組合物處理及經PREVNAR® 13 (肺炎鏈球菌13價共軛物疫苗[白喉CRM197蛋白質], Pfizer, Inc., Philadelphia, PA, USA)處理。在一個實施例中，首先向患者投與PREVNAR®13，及其次向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。在替代性實施例中，首先向患者投與本發明之多價免疫原性組合物，及其次投與PREVNAR®13。
在上述方法之其他實施例中，患者以任何次序經本發明之多價免疫原性組合物處理及經PNEUMOVAX® 23 (肺炎鏈球菌疫苗多價, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA)處理。在一個實施例中，首先向患者投與PNEUMOVAX®23，及其次向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。在替代性實施例中，首先向患者投與本發明之多價免疫原性組合物，及其次投與PNEUMOVAX®23。
在上述方法之其他實施例中，患者以任何次序經本發明之多價免疫原性組合物處理及經SYNFLORIX™ (肺炎鏈球菌多醣共軛物疫苗(吸附型), GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Rixensart, Belgium)處理。在一個實施例中，首先向患者投與SYNFLORIX™，及其次向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。在一替代性實施例中，首先向患者投與本發明之多價免疫原性組合物，及其次投與SYNFLORIX™。
在上述方法之一些實施例中，同時投與多價免疫原性組合物及多價肺炎鏈球菌疫苗。如本文所用，「同時投與」不限於同時給予兩種組合物，而包括以任何次序一個接一個投與。在一些實施例中，將多價免疫原性組合物及多價肺炎鏈球菌疫苗經由肌肉內或皮下投與來投與至各別解剖學位點(例如兩個不同臂)。
在上述方法之一些實施例中，投與本發明之多價免疫原性組合物與多價肺炎鏈球菌疫苗之間的時間量為約4週至約1年。在替代性實施例中，時間量為約1個月至約5年。
在一個實施例中，首先向患者投與本發明之多價肺炎鏈球菌疫苗，及其次投與第二免疫原性組合物。在替代性實施例中，首先向患者投與本發明之多價免疫原性組合物，及其次投與多價肺炎鏈球菌疫苗。
亦提供一種誘導患者之針對肺炎鏈球菌之免疫反應、接種或誘導保護性免疫反應的方法，其包含： (1) 向患者投與本發明之多價免疫原性組合物， (2) 等待預定的時間過去，及 (3) 向患者投與多價肺炎鏈球菌疫苗。
在此方法中，多價免疫原性組合物可包含本文所闡述之肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物的任何組合，及多價肺炎鏈球菌疫苗可為指示用於預防由超過一種血清型之肺炎鏈球菌引起的疾病的任何疫苗。
本發明亦提供一種誘導患者之針對肺炎鏈球菌之免疫反應、接種或誘導保護性免疫反應的方法，其包含： (1) 向患者投與多價肺炎鏈球菌疫苗， (2) 等待預定的時間過去，及 (3) 向患者投與本發明之多價免疫原性組合物。
在此方法中，多價免疫原性組合物可包含本文所闡述之肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物的任何組合，及多價肺炎鏈球菌疫苗可為指示用於預防由超過一種血清型之肺炎鏈球菌引起的疾病的任何疫苗。
在上述方法之一些實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中多醣蛋白質共軛物包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣。在替代性實施例中，多價肺炎鏈球菌疫苗包含未共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌莢膜多醣。
在本發明之方法(亦即本文所述之方法中的任一者)的任何實施例中，方法可進一步包含向患者投與一或多種額外劑量之本發明的多價免疫原性組合物。在此類方法中，患者在接受第一劑量之本發明的多價免疫原性組合物(見上文)之前可能已接受多價肺炎鏈球菌疫苗，或在接受本發明之多價免疫原性組合物之前可能尚未針對肺炎鏈球菌接種。因此，在一個實施例中，向已接受指示用於預防由肺炎鏈球菌引起的肺炎鏈球菌疾病的多價肺炎鏈球菌疫苗的患者投與兩次或更多次劑量之本發明的多價免疫原性組合物。在替代性實施例中，向先前尚未經指示用於預防肺炎鏈球菌疾病之任何疫苗處理的患者投與兩次或更多次劑量之本發明的多價免疫原性組合物。
在上述方法之實施例中，兩次或更多次劑量為本發明之相同多價免疫原性組合物。在替代性實施例中，兩次或更多次劑量為本發明之不同多價免疫原性組合物。
在任一此等方法之特定實施例中，向患者投與兩次、三次或四次劑量之本發明的多價免疫原性組合物。在特定實施例中，患者免疫功能不全(例如在幹細胞移植後的免疫抑止方案中)。
在一些實施例中，投與每次劑量之本發明的多價免疫原性組合物之間的時間量為約4週至約1年。在替代性實施例中，投與每次劑量之本發明的多價免疫原性組合物之間的時間量為約1個月至約5年。
在任一本發明之方法的實施例中，待用一或多種本發明之組合物處理的患者為人類。在某些實施例中，人類患者為嬰兒(約6週至12個月)。在某些實施例中，人類患者為幼兒(約12至24個月)或兒童(約2至5年)。本發明之組合物亦適合於兒童、青少年及成人使用(例如年齡18至45歲、年齡18至50歲、年齡18至55歲、年齡18至60歲或18至65歲)。在任一本發明之方法的其他實施例中，患者為約2歲至約18歲。在任一本發明之方法的其他實施例中，患者為18歲或更大年齡。
在本發明之方法的其他實施例中，患者為嬰兒及向嬰兒投與1、2或3次劑量之本發明的多價免疫原性組合物。投與每次劑量間的時間量可變化，但給藥時程之實例包括在2個月大時投與劑量，接著在4個月大時再投與劑量，及在6個月大時投與最終劑量。嬰兒的投與時程之另一實例為在2個月大時投與一劑量及隨後在3個月大時投與另一劑量。嬰兒的投與時程之另一實例為在2個月大時投與一劑量，及隨後在3個月大時投與另一劑量，及最後在6個月大時投與最終劑量。在其他實施例中，嬰兒患者可在嬰兒到幼兒時接受本發明之多價免疫原性組合物的額外「輔助」劑量。舉例而言，在2個月大時對嬰兒給藥，隨後在4個月大時投與另一劑量，及最後在6個月大時投與最終劑量，隨後當嬰兒到幼兒年齡時，在11至15個月之間投與本發明之多價免疫原性組合物的額外「輔助」劑量。
在一個實施例中，向嬰兒投與2次劑量的本發明之多價免疫原性組合物。
在一個實施例中，向嬰兒投與3次劑量的本發明之多價免疫原性組合物。
在一個實施例中，向患者投與3次劑量的本發明之多價免疫原性組合物，其中在2個月與10個月之間投與第一劑量及第二劑量，及在11個月至15個月之間投與第三劑量。
在一實施例中，向患者投與4次劑量之本發明的多價免疫原性組合物，其中在2個月大時投與第一劑量，在4個月大時投與第二劑量，在6個月大時投與第三劑量及在11至15個月大時投與第四劑量。
在本發明之方法的其他實施例中，人類患者為老年人。在任一本發明之方法的一些實施例中，患者為50歲或更大年齡。在任一本發明之方法的一些實施例中，患者為55歲或更大年齡。在任一本發明之方法的一些實施例中，患者為60歲或更大年齡。在任一本發明之方法的其他實施例中，患者為65歲或更大年齡。在任一本發明之方法的額外實施例中，患者為70歲或更大年齡。
在任一本發明之方法的一些實施例中，待經本發明之免疫原性組合物處理的患者免疫功能不全。
在任一本發明之方法的一些實施例中，本發明之多價免疫原性組合物與針對流感之疫苗同時投與。在某些實施例中，流感疫苗為「高級流感疫苗」，一種指示用於老年人(例如65歲及更大年齡者)之高劑量流感疫苗。
本發明提供一種誘導患者之針對肺炎鏈球菌感染之保護性免疫反應的方法，其包含向患者投與免疫有效量之本文所述的多價免疫原性肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物組合物中之任一者的步驟。特定疫苗之組分(例如本發明之多價免疫原性組合物)的最佳量可藉由涉及觀測個體中之適當免疫反應的標準研究來確定。舉例而言，在另一實施例中，由動物研究向人類資料外推來確定人類接種之劑量。在另一實施例中，劑量憑經驗確定。
本發明之方法可用於預防及/或降低由微生物(例如肺炎鏈球菌)引起的原發性臨床症狀，包括侵襲性感染(腦膜炎、肺炎及菌血症)及非侵襲性感染(急性中耳炎及鼻竇炎)。
投與本發明之組合物可包括以下中之一或多者：經由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下途徑注射；或經由黏膜投與至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一個實施例中，鼻內投與用於治療肺炎或中耳炎(因為可更有效地避免肺炎鏈球菌之鼻咽載運，因此在早期緩解感染)。在特定實施例中，本發明之組合物經由肌肉內或皮下向患者投與。
出於描述及揭示可結合本發明使用之方法及材料的目的，本文提及之所有公開案以引用之方式併入。
已參考附圖描述本發明之實施例，應理解，本發明不限於確切實施例，且各種變化及修改可由熟習此項技術者在不偏離本發明之如所附申請專利範圍如定義的範疇或精神之情況下於其中實現。
以下實例說明但不限制本發明。
實例1 製備肺炎鏈球菌莢膜多醣 培養肺炎鏈球菌之方法為此項技術中熟知的。參見例如Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52。製備肺炎鏈球菌莢膜多醣之方法亦為此項技術中熟知的。參見例如歐洲專利第EP 0 497 524 B1號。下文所述之製程一般遵循歐洲專利第EP 0 497 524 B1號中所述之方法及一般適用於所有肺炎鏈球菌血清型。
血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B之肺炎鏈球菌菌株的分離物獲自Merck Culture Collection。血清型23B之菌株獲自疾病控制及預防中心及阿拉巴馬大學伯明翰分校。血清型24F之菌株獲自Merck Culture Collection及阿拉巴馬大學伯明翰分校。必要時，使用特異性抗血清根據Quellung反應區分亞型。參見例如美國專利第5,847,112號。藉由在瓊脂盤上分兩步連續接種進一步純系分離得到的分離物，瓊脂盤由無動物組分的培養基組成，該培養基含有大豆蛋白質腖、酵母提取物及不含血紅素的葡糖。對於血清型7F，所用瓊脂盤亦含有血紅素。在液體培養基中進一步擴增每種血清型之純系分離物，其使用含有大豆蛋白質腖、酵母提取物、HEPES、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸鉀、葡糖及甘油之無動物組分的培養基。
產生每種血清型之肺炎鏈球菌多醣由細胞擴增及批料產生醱酵組成，接著在下游純化之前化學不活化。使用含有預先滅菌之無動物組分的生長培養基(其含有大豆蛋白質腖或大豆蛋白質腖超濾液、酵母提取物或酵母提取物超濾液、HEPES、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸鉀及葡萄糖)的搖瓶或培養瓶擴增來自每種血清型之解凍細胞庫小瓶。使細胞擴增培養物在密封搖瓶或瓶中生長，使溫度及攪拌控制下的氣體交換降至最低。在此等血清型之細胞擴增期間，控制溫度、pH、壓力及攪拌。亦如不使用通氣攪動來控制氣流覆蓋。藉由在600 nm之光學密度下量測，在達成指定培養物密度後，將一部分細胞擴增培養物轉移至生產醱酵器，其含有預先滅菌之無動物組分的生長培養基(含有大豆蛋白質腖或大豆蛋白質腖超濾液、酵母提取物或酵母提取物超濾液、氯化鈉、磷酸鉀及葡萄糖)。控制溫度、pH、壓力及攪拌。亦如不使用通氣攪動來控制氣流覆蓋。
當葡萄糖幾乎耗盡時，經由添加化學不活化劑苯酚終止批料醱酵。添加純苯酚至最終濃度為0.8至1.2%，以使細胞不活化及自細胞壁釋放莢膜多醣。初級不活化發生於醱酵器內指定時間內，其中繼續控制溫度及攪拌。在初級不活化之後，將批料轉移至另一容器中，將其在該容器中在控制溫度及攪拌下再保持指定時間，以完全不活化。此藉由微生物接種技術或藉由驗證苯酚濃度及指定時間來證實。隨後對不活化培養液進行純化。
實例2  純化肺炎鏈球菌多醣 肺炎球菌多醣之純化製程由若干離心、深度過濾、濃縮/透濾操作及沈澱步驟組成。除非另外說明，否則所有程序均在室溫下進行。
將來自肺炎鏈球菌之醱酵培養器的不活化培養液與陽離子聚合物(諸如BPA-1000、TRETOLITE® (Baker Hughes Inc., Houston, TX)、波譜8160、聚(伸乙亞胺)及Millipore pDADMAC)絮凝。陽離子聚合物結合至雜質蛋白質、核酸及細胞碎片。在絮凝步驟及老化階段後，經由離心及多次深度過濾步驟移除經絮凝固體。濃縮澄清培養液及使用100 kDa至500 kDa MWCO(分子量截止值)過濾器進行透濾。使用Tris、MgCl2 緩衝液及磷酸鈉緩衝液實現透濾。透濾移除了殘餘核酸及蛋白質。
藉由利用變性醇及/或異丙醇使多醣於乙酸鈉及苯酚中再沈澱以移除其他雜質。在苯酚沈澱步驟期間，將含乙酸鈉之磷酸鈉鹽水緩衝液及苯酚(液化苯酚或固體苯酚)饋入經透濾保留物中。隨後分兩步進行多醣之醇分餾。在第一步中，將低百分比醇添加至製劑，以沈澱細胞碎片及其他不合需要之雜質，同時使粗多醣保留在溶液中。經由離心移除雜質，接著進行深度過濾步驟。隨後藉由向批料中添加額外異丙醇或變性醇自溶液回收多醣。藉由離心回收經沈澱多醣離心塊，濕磨及乾燥成粉末形式及在-70℃下冷凍儲存。
實例3 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)多價研究之血清型1共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於二甲亞碸(DMSO)中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由透析純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為250巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行15小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以2.5 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為10% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為1.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。在約4℃下使用300 kDa NMWCO透析盒，使批料針對150 mM氯化鈉、0.05% (w/v)聚山梨醇酯20進行透析，持續3天。
最終過濾及產物儲存 使批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例4 使用水性共軛，製備PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型1共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為250巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行15小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197(如先前所述(WO 2012/173876 A1))與經緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.5進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸酯濃度分別為6.9 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行120小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。將聚山梨醇酯20添加至保留物批料中至濃度為0.05% (w/v)，隨後將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例5 使用水性共軛，製備PCV22多價研究之血清型1共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為250巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行15小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))與經緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.5進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸酯濃度分別為6.9 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行120小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。將聚山梨醇酯20添加至保留物批料中至濃度為0.05% (w/v)，隨後將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例6 使用DMSO共軛，製備PCV 23 (DMSO)多價研究之血清型3共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於二甲亞碸(DMSO)中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為810巴/6次，接著為900巴/3次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行12小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以2.5 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為10% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.25 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.35。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例7 使用水性共軛，製備PCV22及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型3共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為380巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行12小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))以0.2微米過濾及與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.6進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸鹽濃度分別為4.1 g/L及150 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛在10℃下進行120小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例8 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)多價研究之血清型4共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由透析純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為300巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至50℃及pH 4.1，以使多醣部分地去縮酮化。隨後使多醣溶液冷卻至22℃，隨後活化。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為2.0。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。在約4℃下，使用300 kDa NMWCO透析盒使批料針對150 mM氯化鈉、0.05% (w/v)聚山梨醇酯20進行透析持續3天。
最終過濾及產物儲存 使批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例9 使用水性共軛，製備PCV23 (DMSO+Aq)及PCV22多價研究之血清型4共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為300巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至50℃及pH 4.1，以使多醣部分地去縮酮化。隨後使多醣溶液冷卻至22℃，隨後活化。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197(如先前所述(WO 2012/173876 A1))以0.2微米過濾及與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.5進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸鹽濃度分別為8.3 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行120小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。隨後將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例10 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)多價研究之血清型5共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由透析純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為600巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至4℃及pH 4.1，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在4℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM乙酸鈉(pH 4.1)進行透濾，接著使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣溶液外加氯化鈉至濃度為20 mM。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
稀釋及中和 在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。在約4℃下，使用300 kDa NMWCO透析盒使批料針對150 mM氯化鈉、0.05% (w/v)聚山梨醇酯20進行透析持續3天。
最終過濾及產物儲存 使保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例11 使用水性共軛，製備PCV22及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型5共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為600巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至4℃及pH 4.1，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在4℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM乙酸鈉(pH 4.1)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.4進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸鹽濃度分別為3.8 g/L及150 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行96小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
純化及中和 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜在2℃至8℃下使批料針對300 mM碳酸氫鈉(pH 9.3)進行透濾。隨後將保留物中回收之批料用1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)中和。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。將聚山梨醇酯20添加至保留物批料中至濃度為0.05% (w/v)，及隨後將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例12 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)及PCV 22多價研究之血清型6A共軛物 將多醣溶解，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為200巴/5次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為1.5 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.4。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例13 使用DMSO共軛，製備PCV 23 (DMSO)及PCV 23(DMSO/Aq)多價研究之血清型6B共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為200巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為1.85 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.35。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例14 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型6B共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為200巴/5次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為1.75 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.35。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例15 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型7F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為150巴/7次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至4℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在4℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.6 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例16 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型7F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為150巴/7次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至4℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在4℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.04 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例17 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型8共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為600巴/6次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為4.5 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。摻合後，在22℃下進行共軛反應。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例18 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)多價研究之血清型9V共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為230巴/5.5次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行6小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.0g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.3。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例19 使用水性共軛，製備PCV22多價研究之血清型9V共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為100巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行6小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197(如先前所述(WO 2012/173876 A1))以0.2微米過濾，再與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.7進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸酯濃度分別為10.0 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行120小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。將聚山梨醇酯20添加至保留物批料中至濃度為0.05% (w/v)，隨後將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例20 使用水性共軛，製備PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型9V共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為100巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行6小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197(如先前所述(WO 2012/173876 A1))以0.2微米過濾，再與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.7進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸酯濃度分別為10.0 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行120小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。將聚山梨醇酯20添加至保留物批料中至濃度為0.05% (w/v)，隨後將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例21 使用DMSO共軛，製備PCV23多價研究之血清型10A共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為615巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.5 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.6。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例22 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型10A共軛物
將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為600巴/5次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.4 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.6。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾，接著針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015%(w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例23 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型10A共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為600巴/5次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.8 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.75。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例X 使用DMSO共軛，製備PCV24多價研究之血清型11A共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為800巴/8次。使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
多醣共軛至 CRMl97 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.3 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例24 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型12F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。藉由酸水解(藉由將乙酸添加至200 mM，在80℃下培育155分鐘，隨後藉由添加低溫磷酸鉀(pH 7)緩衝液至400 mM進行中和)減小經溶解多醣尺寸。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.7 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.8。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例25 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型12F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。藉由酸水解(藉由將乙酸添加至200 mM，在90℃下培育60分鐘，隨後藉由添加低溫磷酸鉀(pH 7)緩衝液至400 mM進行中和)減小經溶解多醣尺寸。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例26 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)多價研究之血清型14共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由透析純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為200巴/6次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為1.8 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。在約4℃下使用300 kDa NMWCO透析盒，使批料針對150 mM氯化鈉、0.05% (w/v)聚山梨醇酯20進行透析，持續22.5小時。
最終過濾及產物儲存 使保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例27 使用水性共軛，製備PCV22及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型14共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為200巴/6次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197(如先前所述(WO 2012/173876 A1))與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為1.0進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸酯濃度分別為3.8 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行72小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。隨後將批料以0.2微米過濾。
用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液將批料之多醣濃度調節為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例28 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型15A共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為210巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行20小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中，將其預熱至34℃。將多醣溶液外加氯化鈉至25 mM之濃度。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為2.0。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在34℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在34℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例29 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型15A共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為200巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行20小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中，將其預熱至34℃。將多醣溶液外加氯化鈉至25 mM之濃度。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為2.0。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在34℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例30 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型15C共軛物
使由肺炎鏈球菌血清型15B衍生之多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，經受弱鹼水解以釋放O-乙醯基，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小、鹼水解及氧化 將經純化血清型15B肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為300巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
將多醣溶液加熱至60℃及添加碳酸氫鈉(pH 9)緩衝液至最終濃度為50 mM。將批料在60℃下混合培育13小時，以釋放O-乙醯基。添加磷酸鉀(pH 6)緩衝液至最終濃度為136 mM，以中和pH及將溶液冷卻至環境溫度。隨後將溶液濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.75。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例31 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型15C共軛物 使由肺炎鏈球菌血清型15B衍生之多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，經受弱鹼水解以釋放O-乙醯基，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小、鹼水解及氧化 將經純化血清型15B肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為300巴/5次。將經尺寸減小多醣溶液加熱至60℃及添加碳酸氫鈉(pH 9.4)緩衝液至最終濃度為50 mM。將批料在60℃下混合培育12小時，以釋放O-乙醯基。添加磷酸鉀(pH 6)緩衝液至最終濃度為150 mM，以中和pH及將溶液冷卻至環境溫度。隨後將溶液濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.2 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.75。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例32 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型18C共軛物
將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。藉由酸水解(藉由將乙酸添加至200 mM，在90℃下培育160分鐘，隨後藉由添加低溫磷酸鉀(pH 7)緩衝液至400 mM進行中和)減小經溶解多醣尺寸。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.49 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例33 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型18C共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。藉由酸水解(藉由將乙酸添加至200 mM，在90℃下培育160分鐘，隨後藉由添加低溫磷酸鉀(pH 7)緩衝液至400 mM進行中和)減小經溶解多醣尺寸。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.49 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例34 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型19A共軛物
將多醣溶解，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.22微米過濾。將多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行20小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.8 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.33。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例35 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型19A共軛物 將多醣溶解，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.22微米過濾。將多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行20小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為3.8 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.33。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例36 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)、PCV23 (DMSO+Aq)及PCV22多價研究之血清型19F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為150巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至4℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在4℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.2。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。將保留物批料以0.2微米過濾，隨後在22℃下培育4.5天。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例37 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)多價研究之血清型22F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為810巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.3 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例38 使用水性共軛，製備PCV22及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型22F共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為350巴/5次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197(如先前所述(WO 2012/173876 A1))與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.6進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸酯濃度分別為7.5 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行120小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。
將批料以0.2微米過濾及用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液調節至多醣濃度為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例39 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)、PCV23 (DMSO+Aq)及PCV22多價研究之血清型23B共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為400巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例40 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型23F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為400巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行5小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.1 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.25。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例41 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型23F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為400巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.1 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.25。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育3小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例42 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型24F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。藉由酸水解(藉由將乙酸添加至200 mM，在80℃下培育150分鐘，隨後藉由添加低溫磷酸鉀(pH 7)緩衝液至400 mM進行中和)減小經溶解多醣尺寸。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以2 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為10% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣溶液外加氯化鈉至濃度為10 mM。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為1.4 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例43 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型24F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。藉由酸水解(藉由將乙酸添加至200 mM，在80℃下培育150分鐘，隨後藉由添加低溫磷酸鉀(pH 7)緩衝液至400 mM進行中和)減小經溶解多醣尺寸。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以2 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為10% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣溶液外加氯化鈉至濃度為25 mM。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為1.4 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.5。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例44 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)多價研究之血清型33F共軛物 將多醣溶解，尺寸化至目標分子質量，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低Ps之分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為510巴/5次。
使經尺寸減小多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為2.5 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為1.75。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，及在22℃下進行共軛。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在22℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例45 使用水性共軛，製備PCV22及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型33F共軛物 將多醣溶解，尺寸減小，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。隨後在反應混合物中利用氯化鎳使經純化CRM197共軛至經活化多醣，及在以最終0.2微米過濾前藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣尺寸減小及氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，及以0.45微米過濾。使經溶解多醣均質化，以降低分子質量。將均質化壓力及穿過均質器之次數控制為350巴/4次，以使尺寸減小至目標分子質量。隨後濃縮經尺寸減小之多醣及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 將經氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀(pH 7.0)混合。所選緩衝液pH用以提高共軛反應期間經活化多醣的穩定性。將經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197(如先前所述(WO 2012/173876 A1))與緩衝多醣溶液以多醣與CRM197質量比為0.7進行組合。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。多醣及磷酸酯濃度分別為6.5 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得共軛物之尺寸。隨後將溶液以0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。共軛進行96小時，以使多醣及蛋白質之消耗最大化。
用硼氫化鈉還原 共軛反應後，將批料稀釋至約3.5 g/L之多醣濃度，冷卻至2℃至8℃及以1.2微米過濾。使用100 kDa NMWCO切向流超過濾膜使批料在2℃至8℃下針對100 mM磷酸鉀(pH 7.0)進行透濾。隨後將保留物中回收的批料稀釋至約2.0 g多醣/L，及藉由添加1.2 M碳酸氫鈉(pH 9.4)調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀(pH 6.0)。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)進行透濾。將批料以0.2微米過濾及用額外含10 mM L-組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)緩衝液調節至多醣濃度為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例46 使用DMSO共軛，製備PCV23 (DMSO)及PCV23 (DMSO+Aq)多價研究之血清型35B共軛物 將多醣溶解，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。將經溶解多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣溶液外加氯化鈉至濃度為20 mM。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為6.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為3.0。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。共軛在34℃下進行。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在34℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例47 使用DMSO共軛，製備PCV22多價研究之血清型35B共軛物 將多醣溶解，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。
多醣氧化 將經純化肺炎鏈球菌莢膜Ps粉末溶解於水中及以0.45微米過濾。將多醣濃縮及使用10 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對水進行透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝液將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使因活化所致之多醣尺寸減小降至最低。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液來起始多醣活化。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超過濾膜使經活化產物針對10 mM磷酸鉀(pH 6.4)進行透濾，接著針對水進行透濾。超過濾在2℃至8℃下進行。
共軛至 CRM197 之多醣 使用5 kDa MWNCO切向流超過濾膜使經由螢光假單胞菌中表現獲得之經純化CRM197 (如先前所述(WO 2012/173876 A1))針對2 mM磷酸鹽(pH 7.2)緩衝液進行透濾且以0.2微米過濾。
調配經活化多醣來以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197來以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配Ps及CRM197溶液分別凍乾。將經凍乾Ps及CRM197物質分別再溶解於相同體積的DMSO中。將多醣溶液外加氯化鈉至濃度為20 mM。將多醣與CRM197溶液摻合，得到多醣濃度為6.0 g Ps/L及多醣與CRM197質量比為3.0。選擇此質量比以控制所得共軛物中之多醣與CRM197比率。共軛在34℃下進行。
用硼氫化鈉還原 在共軛反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)及在34℃下培育1小時。在約4℃下，將批料稀釋於150 mM氯化鈉及約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20中。隨後添加磷酸鉀緩衝液來中和pH。使批料濃縮及在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀(pH 7)進行透濾。
最終過濾及產物儲存 隨後使批料濃縮及在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超過濾膜針對含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行透濾。
將保留物批料以0.2微米過濾(具有0.5微米預過濾器)，隨後用額外含10 mM組胺酸之150 mM氯化鈉(pH 7.0)及0.015% (w/v)聚山梨醇酯20稀釋，分配成等分試樣及在≤-60℃下冷凍。
實例Y 使用DMSO共軛，製備PCV24多價研究之血清型共軛物 使用與先前實例中所述類似的方法製備PCV24研究之共軛物。對於每種血清型，將多醣溶解，以化學方式活化及藉由超過濾進行緩衝液交換。將經活化多醣及經純化CRM197分別凍乾及再溶解於DMSO中。隨後如下文所述，將經再溶解多醣與CRM197溶液組合及共軛。在以最終0.2微米過濾前，藉由超過濾純化所得共軛物。
控制各步驟內之若干製程參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，得到具有所需屬性之共軛物。與先前實例之差異可包括：均質化壓力及通過次數、氧化時間、用於凍乾之多醣及蔗糖濃度、共軛期間之多醣濃度、多醣與CRM197質量比及共軛反應中之鹽濃度。
實例48 調配肺炎鏈球菌共軛物疫苗 如上文實例中所述，使用利用不同化學物質製備的個別肺炎鏈球菌多醣-蛋白質共軛物調配8、15、22、23及24價肺炎鏈球菌共軛物疫苗。
PCV8/APA疫苗藥品藉由使用非質子性溶劑(亦稱為DMSO化學反應)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)型(-8、-10A、-12F、-15A、-15C、-23B、-24F及-35B)製備，及在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)及150 mM NaCl 0.1% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)及呈磷酸鋁佐劑形式之250 µg [Al]/mL中調配，每種多醣血清型為4 µg/mL，總多醣濃度為32 µg/mL。
PCV15/APA疫苗藥品藉由使用非質子性溶劑(亦稱為DMSO化學反應)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)型(-6A、-6B、-7F、-9V、-18C、-19A、-19F、-23F)製備及對於-1、-3、-4、-5、-14、-22F及-33F型使用質子性溶劑中之還原胺化，及在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)及150 mM NaCl 0.2% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)及呈磷酸鋁佐劑形式之250 µg [Al]/mL中調配，每種多醣血清型為4 µg/mL (除了6B為8 µg/mL)，總多醣濃度為64 µg/mL。
PCV22疫苗藥品藉由使用質子及非質子性溶液(DMSO/水性「Aq」)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)型(-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F及-35B)製備，及在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)及150 mM NaCl及0.2% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中調配，每種多醣血清型為0.8 µg/mL (除了6B為1.6 µg/mL)，總多醣濃度為18.4 µg/mL，稱為無佐劑之PCV22。在另一特定實施例中，用呈磷酸鋁佐劑形式之50 µg [Al]/mL製備調配物，稱為PCV22/APA。
PCV23疫苗藥品藉由使用非質子性溶劑(亦稱為DMSO化學反應)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)型(-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F及-35B)製備，及在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)及150 mM NaCl及0.2% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中調配，每種多醣血清型為4 µg/mL，總多醣濃度為92 µg/mL，稱為無佐劑之PCV23。在另一特定實施例中，用呈磷酸鋁佐劑形式之250 µg [Al]/mL製備調配物，稱為PCV23/APA。PCV23疫苗藥品藉由使用質子性溶劑(亦稱為水性化學反應)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)型(-1、-3、-4、-5、-9V、-14、-22F及-33F)及使用非質子性溶劑(亦稱為DMSO化學反應)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)型(-6A、-6B、-7F、-8、-10A、-12F、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-23B、-23F、-24F及-35B)製備。疫苗藥品在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)及150 mM NaCl及0.1% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)及0.01%羧甲基纖維素(CMC)中調配，每種多醣血清型為4 µg/mL (除了6B為8 µg/mL)，總多醣濃度為96 µg/mL，及用呈磷酸鋁佐劑形式之250 µg [Al]/mL製備，稱為PCV23 (DMSO+Aq)/APA。
多價免疫原性組合物PCV24藉由使用非質子性溶劑(亦稱為DMSO化學反應)中之還原胺化將CRM197蛋白質分別共軛至肺炎鏈球菌多醣(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F及-35B，及在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)、150 mM NaCl及0.1% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中調配，每種多醣血清型為4 µg/mL及8 µg/mL，總多醣濃度分別為96 µg/mL或192 µg/mL，及稱為「PCV24 unadj」。在另一特定實施例中，在20 mM L-組胺酸(pH 5.8)、150 mM NaCl及0.2% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中製備多價免疫原性組合物PCV24，每種多醣血清型為4 µg/mL，總多醣濃度為96 µg/mL，進一步包含呈磷酸鋁佐劑形式之250 µg [Al]/mL。此被稱為「PCV24/APA」。
基於批料體積及個別主體多醣濃度之濃度，計算得到個別血清型之目標濃度所需的主體共軛物之所需體積。將個別共軛物添加至組胺酸、氯化鈉及聚山梨醇酯-20 (PS-20)之溶液中，得到2倍至4倍共軛物摻合物。含有共軛物摻合物之調配容器使用磁性攪拌棒混合，無菌過濾至另一容器中。將經無菌過濾2倍至4倍摻合物添加至含有磷酸鋁佐劑之另一容器中或用鹽水稀釋，得到所需目標總多醣、賦形劑及APA佐劑(必要時)濃度。隨後將調配物填充至玻璃小瓶或注射器中及在2℃至8℃下儲存。
實例49 小鼠之PCV22免疫原性及功能性抗體 第0天、第14天及第28天時，將年輕雌性Balb/c小鼠(6至8週齡，n=10/組)用0.1 mL 22價肺炎鏈球菌共軛物疫苗(PCV22/APA或無佐劑之PCV22)免疫。將PCV22之每種肺炎鏈球菌多醣(1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B)以0.08 µg及6B以0.16 µg給藥，及所有共軛至無佐劑之CRM197或每次免疫使用5 µg磷酸鋁佐劑(APA)。藉由經培訓動物護理工作人員至少每天觀測小鼠是否有任何疾病或痛苦跡象。小鼠之疫苗調配物被視為安全及具有良好耐受性，因為未發現疫苗相關之不良事件。第52天時，用肺炎鏈球菌血清型24F氣管內攻擊小鼠。將肺炎鏈球菌之指數期培養物離心、洗滌及懸浮於無菌PBS中。在攻擊之前，將小鼠用異氟醚麻醉。將含105 cfu肺炎鏈球菌之0.1 mL PBS接種於由門齒垂直懸掛之小鼠喉嚨中。輕緩地向外拉動舌頭及覆蓋鼻孔來誘導細菌之抽吸。每日稱量小鼠及若體重減輕超過起始體重之20%，則使小鼠安樂死。24小時、48小時及72小時時收集血液，評估菌血症。藉由經培訓動物護理工作人員至少每天兩次觀測小鼠是否有任何疾病或痛苦跡象。所有動物實驗均嚴格遵照美國國家衛生研究院實驗室動物護理及使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health)中之建議進行。機構動物護理及使用委員會(Merck & Co., Inc)批准小鼠實驗方案。
使用多工電化學發光(ECL)分析評估小鼠血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人[ 3 ] 所述之人類分析研發了此分析用於小鼠血清，使用由MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics子公司, LLC, Gaithersburg, MD)研發技術，其利用電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標記。使用經SULFO-TAG™標記之抗小鼠IgG作為二級抗體來測試小鼠血清樣品。基於先前在www.vaccine.uab.edu所述方案及由阿拉巴馬大學(UAB)研究基金會擁有及許可的Opsotiter®3軟體[ 1 , 2 ] ，經由多工調理吞噬活性分析(MOPA)確定功能性抗體。
將各組小鼠血清合併及在多工電化學發光分析中測試，以確定抗體力價。用疫苗免疫1、2和3次後，PCV22在小鼠中對所有血清型產生了抗體力價(圖1)。如IgG力價證實，PCV22展現出與血清型15B之交叉反應性(圖1)。與無佐劑之PCV22相比，PD2(資料未示出)及PD3(圖2)時，小鼠中用APA調配之PCV22具有更高免疫原性。
將各組小鼠血清合併及在多工調理吞噬活性分析(MOPA)中測試，以確定功能性抗體力價。用疫苗免疫3次後，PCV22在殺死疫苗型細菌血清型小鼠中產生了功能性抗體力價(圖3)。與無佐劑之PCV22相比，PD2 (資料未示出)及PD3 (圖4)時，用APA調配之PCV22具有更高免疫原性，與IgG力價類似(圖2)。
保護經PCV22免疫小鼠免於肺炎鏈球菌24F氣管內攻擊(圖5)。Mantel Cox對數軼測試表示，當與未處理組(P＜0.0001)相比時，均顯著保護了無佐劑之PCV22 (PCV22 unadj)及PCV22/APA組免於攻擊。同樣，當與未處理組(資料未示出)相比時，經PCV22免疫之小鼠組具有極少甚至無菌血症。
實例50 兔之PCV22免疫原性及功能性抗體 第0天及第14天時，將成年紐西蘭白兔(NZWR，n=5/組)用0.1 mL 22價肺炎鏈球菌共軛物疫苗(PCV22/APA或無佐劑之PCV22)免疫(交替側)。將PCV22之每種肺炎鏈球菌多醣(1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B)以0.08 µg及6B以0.16 µg給藥，及所有共軛至無佐劑之CRM197或每次免疫用5 µg APA調配。在研究開始前(免疫前)及第14天(PD1)及第28天(PD2)時收集血清。藉由經培訓動物護理工作人員至少每天觀測NZWR是否有任何疾病或痛苦跡象。NZWR之疫苗調配物被視為安全及具有良好耐受性，因為未發現疫苗相關之不良事件。所有動物實驗均嚴格遵照美國國家衛生研究院實驗室動物護理及使用指南中之建議進行。機構動物護理及使用委員會(Merck & Co., Inc)及Covance(Denver,PA)批准NZWR實驗方案。
使用多工電化學發光(ECL)分析評估兔血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人[ 3 ] 所述之人類分析研發了此分析用於兔血清，使用由MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics子公司, LLC, Gaithersburg, MD)研發技術，其利用電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標記。使用經SULFO-TAG™標記之抗兔IgG作為二級抗體來測試兔血清樣品。基於先前在www.vaccine.uab.edu所述方案及由阿拉巴馬大學(UAB)研究基金會擁有及許可的Opsotiter®3軟體[ 1 , 2 ] ，經由多工調理吞噬活性分析(MOPA)確定功能性抗體。
在多工電化學發光分析中分別測試兔血清，以確定抗體力價。用疫苗免疫後，PCV22在兔中對所有血清型產生了抗體力價(圖6)。用PCV22對兔進行免疫亦產生結合至血清型15B多醣之抗體(圖6)。兔之APA與PCV22結合無任何益處，因為PD2時免疫原性與(血清型1)無佐劑之PCV22相當或更低(圖7)。
在多工調理吞噬活性分析(MOPA)中分別測試兔血清，以確定功能性抗體力價。用疫苗免疫2次後，PCV22在殺死疫苗型細菌性血清型兔中產生了功能性抗體力價(圖8)。與用APA調配之PCV22相比，PD1時無佐劑之PCV22的血清型4之功能性抗體力價更高(資料未示出)及PD2時，血清型1、3及4更高。與無佐劑之PCV22相比，PD1 (資料未示出)及PD2時，用APA調配之PCV22的大多數血清型不具有更高的功能性抗體力價(圖8)。
實例51 恆河猴幼猴之PCV23免疫原性 第0天、第28天及第56天時，將恆河猴幼猴(IRM，2至3月齡，n=8至9/組)用0.1 mL 23價肺炎鏈球菌共軛物疫苗(PCV23)肌肉內免疫。將PCV23之總肺炎鏈球菌多醣(1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F以9.6 µg及35B以0.4 µg、6B以0.8 µg給藥，及所有共軛至無佐劑之CRM197)或每次免疫用25 µg磷酸鋁佐劑(APA)調配。將另一組IRM用0.1 mL PCV15肌肉內免疫。按照與上述相同的時間表，在一個四頭肌中將PCV15之總肺炎鏈球菌多醣(1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F以6.4 µg及33F以0.4 µg、6B以0.8 µg給藥，及所有共軛至CRM197及每次免疫用25 µg APA)給藥，及在另一四頭肌中將0.1 mL PCV8 (8、10A、12F、15A、15C、23B、24F及35B以0.4 µg及所有共軛至CRM197，每次免疫用25 µg APA)給藥。在研究開始前(免疫前，第0天)及第14天(PD1)、第28天、第42天(PD2)、第56天及第70天(PD3)時收集血清。藉由經培訓動物護理工作人員至少每天觀測IRM是否有任何疾病或痛苦跡象。所有動物實驗均嚴格遵照美國國家衛生研究院實驗室動物護理及使用指南中之建議進行。機構動物護理及使用委員會(Merck & Co., Inc)及New New Research Center批准實驗方案。
使用多工電化學發光(ECL)分析評估恆河猴血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人[ 3, 4 ] 所述之人類分析研發了此分析用於恆河猴血清，使用由MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics子公司, LLC, Gaithersburg, MD)研發技術，其利用電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標記。使用經SULFO-TAG™標記之抗人類IgG作為二級抗體來測試恆河猴血清樣品。
對於所有經評估PCV23疫苗調配物，將IRM用PCV23免疫產生了所有血清型抗體力價(圖9A至圖9D)。亦注意到，如ECL中證實，含有多醣共軛物15A-CRM197及15C-CRM197之PCV23亦具有與血清型15B之交叉反應性(圖9A至圖9D)。IRM中使用一次劑量之疫苗的PCV23具有免疫原性(圖9A至圖9D)。
與無佐劑之PCV23相比，PD1時PCV23 (DMSO)/APA調配物的血清型22F之免疫原性更高，而與用無佐劑之PCV23相比，PD1時PCV23 (DMSO+Aq)/APA的血清型1及血清型15C之免疫原性更高(圖10A)。與無佐劑之PCV23相比，PD2時PCV23 (DMSO)/APA調配物的血清型18C之免疫原性更高(圖10B)。與無佐劑之PCV23相比，PD2時PCV23 (DMSO+Aq)/APA的大多數血清型(1、3、4、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、15C、18C、19F、22F及23F)之免疫原性更高(圖10B)。與無佐劑之PCV23相比，PD3時PCV23 (DMSO+Aq)/APA的血清型1、4及9V之免疫原性更高(圖10C)。
在不同肢體中接種PCV23 (DMSO+Aq)/APA或共投與PCV15/APA+PCV8/APA的IRM在PD1時未顯示出許多免疫原性差異，除血清型10A之外，其在共投與組中具有更高免疫原性(圖11A)。然而，與共投與PCV15/APA+PCV8/APA相比，PD2時接種PCV23 (DMSO+Aq)/APA之IRM的大部分血清型1、3、4、5、7F、8、9V、14、15A、15B、15C、18C、19F、22F、23B及23F之免疫原性更高(圖11B)。PD3時兩種疫苗間不存在免疫原性差異(圖11C)。
當評估抗體增強作用時，與所有血清型之免疫前血清相比，PD1時所有PCV產生了初始免疫反應，除了用PCV23 (DMSO+Aq)/APA免疫之IRM的血清型23B之外(圖12A)。當與所有血清型之免疫前血清相比，PD2及PD3時所有經評估PCV產生了顯著較高的抗體力價(圖12B及圖12C)。與所有血清型之PD1相比，第二劑量之PCV增加了PD2之抗體力價，除了用無佐劑之PCV23、PCV23 (DMSO)/APA及PCV15/APA+PCV8/APA免疫之IRM中的血清型3及血清型1之外(圖12D)。第三劑量之PCV增大了大部分血清型之抗體力價，除了用PCV23 (DMSO+Aq)/APA免疫之IRM (PD3時與PD2時相比降低)之外，表明PD2時經PCV23 (DMSO+Aq)/APA免疫之IRM達到最大抗體反應(圖12E)。
實例Z 紐西蘭白兔及恆河猴幼猴之PCV24免疫原性 第0天及第14天時，將紐西蘭白兔(NZWR，n=8/組)用0.1 mL 24價肺炎鏈球菌共軛物疫苗(PCV24)肌肉內免疫。將PCV24之總肺炎鏈球菌多醣(1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、deOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F以9.6 µg及35B以0.4 µg給藥，及所有共軛至CRM197)或每次免疫用磷酸鋁佐劑(APA，25 µg)調配。在研究開始前(免疫前，第0天)及第14天(PD1)及第28天(PD2)時收集血清。藉由經培訓動物護理工作人員至少每天觀測NZWR是否有任何疾病或痛苦跡象。
第0天、第28天及第56天時，將恆河猴幼猴(IRM，2至3月齡，n=5/組)用0.1 mL 24價肺炎鏈球菌共軛物疫苗(PCV24)肌肉內免疫。將PCV24之總肺炎鏈球菌多醣(1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、deOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F以9.6 µg及35B以0.4 µg給藥，及所有共軛至CRM197)或每次免疫用磷酸鋁佐劑(APA，25 µg)調配。在研究開始前(免疫前，第0天)及第14天(PD1)、第28天、第42天(PD2)、第56天及第70天(PD3)時收集血清。藉由經培訓動物護理工作人員至少每天觀測IRM是否有任何疾病或痛苦跡象。所有動物實驗均嚴格遵照美國國家衛生研究院實驗室動物護理及使用指南中之建議進行。機構動物護理及使用委員會(Merck & Co., Inc)及New Iberia Research Center批准實驗方案。
使用多工電化學發光(ECL)分析評估恆河猴血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人及Shinner等人[ 3, 4 ] 所述之人類分析研發了此分析用於恆河猴血清，使用由MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics子公司, LLC, Gaithersburg, MD)研發技術，其利用電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標記。使用經SULFO-TAG™標記之抗人類IgG作為二級抗體來測試恆河猴血清樣品及使用經SULFO-TAG™標記之抗兔IgG測試紐西蘭白兔樣品。
基於先前在www.vaccine.uab.edu所述方案及由阿拉巴馬大學(UAB)研究基金會擁有及許可的Opsotiter®3軟體[ 1 , 2 ] ，經由多工調理吞噬活性分析(MOPA)確定功能性抗體。
將NZWR用PCV24免疫在疫苗中產生了所有血清型抗體力價(圖13A)。亦注意到，如ECL中證實，含有多醣共軛物15A-CRM197、deOAc15B-CRM197、6A-CRM197、6B-CRM197之PCV24亦具有與血清型15B及6C之交叉反應性(圖13A)。
在多工調理吞噬活性分析(MOPA)中分別測試NZWR血清，以確定功能性抗體力價。PCV24在殺死所有疫苗型細菌血清型NZWR中產生了功能性抗體力價(圖13B)。
將IRM用PCV24免疫在疫苗中產生了所有血清型抗體力價(圖14A)。亦注意到，如ECL中證實，含有多醣共軛物15A-CRM197 、deOAc15B-CRM197 、6A-CRM197 、6B-CRM197 之PCV24亦具有與血清型15B及6C之交叉反應性(圖14A)。
在多工調理吞噬活性分析中分別測試IRM血清，以確定功能性抗體力價。PCV24在殺死疫苗型細菌性血清型IRM中產生了功能性抗體力價(圖14B)，除33F之外，其在ECL中亦具有較低的PD3/預結合抗體力價。然而，當評估紐西蘭白兔之PCV24/APA時，PD2 33F OPA力價高於免疫前力價58倍(圖13B)。
文獻 1. Caro-Aguilar I, Indrawati L, Kaufhold RM, Gaunt C, Zhang Y, Nawrocki DK,等人 Immunogenicity differences of a 15-valent pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (PCV15) based on vaccine dose, route of immunization and mouse strain. Vaccine 2017 Feb 07;35(6):865-72。 2.  Burton RL, Nahm MH. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clin Vaccine Immunol 2006 Sep;13(9):1004-9。 3.  Marchese RD, Puchalski D, Miller P, Antonello J, Hammond O, Green T, Rubinstein LJ, Caulfield MJ, Sikkema D. Optimization and validation of a multiplex, electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in human serum. Clin Vaccine Immunol. 2009 Mar;16(3):387-96。 4. Skinner, J.M.,等人, Pre-clinical evaluation of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV15-CRM197) in an infant-rhesus monkey immunogenicity model. Vaccine, 2011.29 (48): 第8870-8876頁。
實例52 物質及方法游離多醣測試 藉由首先將游離蛋白質及共軛物用去氧膽酸鹽(DOC)及鹽酸沈澱來量測共軛物樣品中之游離多醣(未共軛至CRM197的多醣)。隨後濾出沈澱物及藉由HPSEC/UV/MALS/RI分析濾液之游離多醣濃度。將游離多醣以由HPSEC/UV/MALS/RI量測之總多醣的百分比計算。
游離蛋白質測試 游離多醣、多醣-CRM197共軛物及共軛物樣品中之游離CRM197藉由毛細管電泳在膠束電動力學層析(MEKC)模式中分離。簡言之，將樣品與含有25 mM硼酸鹽、100 mM SDS(pH 9.3)之MEKC操作緩衝液混合，及在預調節之裸熔融二氧化矽毛細管中分離。在200 nm下監測分離及用CRM197標準曲線定量游離CRM197。將游離蛋白質結果報導為由HPSEC/UV/MALS/RI程序測定之總蛋白質含量的百分比。
使用 HPSEC / UV / MALS / RI 分析 ， 對共軛物之分子量及濃度分析 注射共軛物樣品及由高效能尺寸排阻層析(HPSEC)分離。藉由串聯的紫外線(UV)、多角度光散射(MALS)及折射率(RI)偵測器實現偵測。使用消光係數，自UV280計算蛋白質濃度。使用dn/dc因子由RI信號(由蛋白質及多醣兩者得到)去卷積多醣濃度，dn/dc因子為溶液之折射率變化，溶質濃度的變化以mL/g表示。藉由Astra軟體(Wyatt技術公司，Santa Barbara，CA)，使用經量測濃度及整個樣品峰值兩端的光散射資訊計算樣品之平均分子量。存在多分散型分子之分子量的多種平均值形式。舉例而言，數量平均分子量Mn、重量平均分子量Mw及z平均分子量Mz (Molecules, 2015, 20, 10313-10341)。除非規定，否則分子量為重量平均分子量。
確定共軛蛋白質中之離胺酸消耗量作為多醣與載體蛋白質之間的共價連接數目的量度 水AccQ-Tag胺基酸分析(AAA)用於量測共軛物樣品之共軛程度。將樣品在Eldex工作站中使用氣相酸水解進行水解，以使載體蛋白質分解成其組分胺基酸。使用胺基甲酸6-胺基喹啉基-N-羥基丁二醯亞胺酯(AQC)衍生游離胺基酸。隨後在C18管柱上使用具有UV偵測之UPLC分析經衍生樣品。使用除離胺酸以外的代表性胺基酸得到平均蛋白質濃度。藉由共軛物中離胺酸之平均量測量與起始蛋白質中離胺酸之預期量間的差異確定共軛期間離胺酸消耗(亦即離胺酸損失)。
圖1：藉由ECL測定，用無佐劑之PCV22 (PCV22 unadj)免疫或磷酸鋁佐劑(PCV22/APA)調配之小鼠的免疫前(前)、給藥後1 (PD1)、2 (PD2)及3 (PD3)時IgG抗體稀釋力價。自左至右讀取；PCV22 unadj前、PCV22/APA前、PD1 PCV22 unadj、PD1 PCV22/APA、PD2 PCV22 unadj、PD2 PCV22/APA、PD3 PCV22 unadj及PD3 PCV22/APA。 圖2：PCV22/APA與無佐劑之PCV22 (PCV22 unadj) PD3時ECL稀釋力價比率。 圖3：用無佐劑之PCV22 (PCV22 unadj)免疫或APA (PCV22/APA)調配之小鼠(免疫前、PD1、PD2、PD3時)的血清型特異性OPA稀釋力價。自左至右讀取；PCV22 unadj前、PCV22/APA前、PD1 PCV22 unadj、PD1 PCV22/APA、PD2 PCV22 unadj、PD2 PCV22/APA、PD3 PCV22 unadj及PD3 PCV22/APA。 圖4：PCV22/APA與無佐劑之PCV22 (PCV22 unadj) PD3時OPA稀釋力價比率。 圖5：經PCV22免疫小鼠免受肺炎鏈球菌24F氣管內攻擊。 圖6：藉由ECL測定，用無佐劑之PCV22免疫或PCV22/APA之兔的免疫前(前)、PD1及PD2時IgG抗體稀釋力價。誤差條表示幾何平均力價(GMT)之95%信賴區間(CI)。自左至右讀取；PCV22 unadj前、PCV22/APA前、PD1 PCV22 unadj、PD1 PCV22/APA、PD2 PCV22 unadj及PD2 PCV22/APA。 圖7：PCV22/APA與無佐劑之PCV22在PD2時ECL GMT比率。誤差條表示95%信賴區間(CI)。 圖8：用無佐劑之PCV22免疫或PCV22/APA之兔(免疫前(「前」)及PD2時)的血清型特異性OPA稀釋力價。誤差條表示五隻兔之功能性抗體力價變化。 圖9：藉由ECL測定，用A)無佐劑之PCV23、B) PCV23 (DMSO)/APA、C) PCV23(DMSO+Aq)/APA及D) PCV15/APA + PCV8/APA免疫之小鼠免疫前(前)、PD1、PD2及PD3時IgG抗體稀釋力價。誤差條表示幾何平均力價(GMT)之95%信賴區間(CI)。 圖10：在用或不用APA之PCV23接種後，對IRM之ECL抗體反應進行比較(每組8至9)。符號表示A) PD1、B) PD2或C) PD3時之比率。GMT比率，誤差條表示95% CI。 圖11：在用PCV23 (DMSO+Aq)/APA接種或與PCV15/APA + PCV8/APA共投與後，對IRM中之ECL抗體反應進行比較(每組9)。符號表示A) PD1、B) PD2及C) PD3時之比率。GMT比率，誤差條表示95% CI。 圖12：無佐劑之PCV23、PCV23 (DMSO)/APA、PCV23 (DMSO+Aq)/APA或PCV15/APA+PCV8/APA接種後，對IRM之增強型ECL抗體反應進行比較(每組8至9)。A) PD1/前、B) PD2/前、C) PD3/前、D) PD2/PD1及E) PD3/PD2時。符號為GMT比率，誤差條表示95% CI。 圖13：(A)藉由ECL測定，用磷酸鋁佐劑調配之PCV24 (PCV24/APA)免疫的紐西蘭白兔免疫前(前)、給藥後1 (PD1)、2 (PD2)時IgG抗體稀釋力價。誤差條表示幾何平均力價(GMT)之95%信賴區間(CI)。(B)用PCV24/APA免疫之NZWR的血清型特異性OPA稀釋力價(免疫前及PD2)。誤差條表示八隻NZWR之功能性抗體力價變化。 圖14：(A)藉由ECL測定，用磷酸鋁佐劑調配之PCV24 (PCV24/APA)免疫的恆河猴幼猴免疫前(前)、給藥後1 (PD1)、2 (PD2)及3 (PD3)時IgG抗體稀釋力價。誤差條表示幾何平均力價(GMT)之95%信賴區間(CI)。(B)用PCV24/APA免疫之IRM(免疫前及PD3時)血清型特異性OPA稀釋力價。誤差條表示五隻IRM之功能性抗體力價變化。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (34)

  1. 一種多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌(S. pneumoniae )多醣蛋白質共軛物，其中該等共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中該等多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣： a)  1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； b)  1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； c)  1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； d)  1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； e)  1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； f)  1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； g)  1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； h)  1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； i)   1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； j)  1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； k)  1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； l)   1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； m) 1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； n)  1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； o)  1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； p)  1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； q)  1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； r)  1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； s)  1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； t)   1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； u)  1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； v)  1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； w) 1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； x)  1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； y)  1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； z)  1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； aa) 1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B； bb)   1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、deO-15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； cc) 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； dd)   1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、deO-15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ee) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ff) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； gg)   1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、deO-15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； hh)   1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ii)  1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； jj) 1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； kk)   1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ll)  1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； mm)  1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； nn)   1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； oo)   1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； pp)   1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； qq)   1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； rr) 1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ss) 1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； tt)  1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； uu)   1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； vv)   1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； ww)  1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； xx) 1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； yy) 1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； zz) 1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39； aaa)  1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39；及 bbb) 1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B及39。
  2. 如請求項1之多價免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物不包含具有來自任何其他肺炎鏈球菌血清型之多醣的多醣蛋白質共軛物。
  3. 如請求項1或2之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白質共軛物中之至少一者由包含非質子性溶劑之共軛反應形成。
  4. 如請求項1或2之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白質共軛物中之每一者由包含非質子性溶劑之共軛反應形成。
  5. 如請求項3或4之多價免疫原性組合物，其中該非質子性溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
  6. 如請求項1至5中任一項之多價免疫原性組合物，其中該載體蛋白質選自由以下組成之群：外膜蛋白質複合物(OMPC)、破傷風類毒素、白喉類毒素、蛋白質D及CRM197。
  7. 如請求項1至6中任一項之多價免疫原性組合物，其中該載體蛋白質為CRM197。
  8. 如請求項1至7中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  9. 如請求項1至7中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。
  10. 一種如請求項1至9中任一項之多價免疫原性組合物的用途，其用於製造用以誘導人類患者之免疫反應之藥劑。
  11. 一種如請求項1至9中任一項之多價免疫原性組合物的用途，其用於製造用以誘導人類患者之保護性免疫反應之藥劑。
  12. 一種如請求項1至9中任一項之多價免疫原性組合物的用途，其用於製造用以誘導人類患者中針對肺炎鏈球菌之保護性免疫反應之藥劑。
  13. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該患者先前經多價肺炎鏈球菌疫苗治療。
  14. 如請求項10至13中任一項之用途，其中該患者為6週至17歲。
  15. 一種如請求項1至9中任一項之多價免疫原性組合物的用途，其用於製造用以預防6週至17歲患者之肺炎鏈球菌肺炎及/或侵襲性肺炎鏈球菌疾病之藥劑。
  16. 一種多價免疫原性組合物，其包含23種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中該等共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中每種不同多醣蛋白質共軛物包含分別來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之多醣，且其中該載體蛋白質為CRM197。
  17. 如請求項16之多價免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物不包含具有來自任何其他肺炎鏈球菌血清型之多醣的多醣蛋白質共軛物。
  18. 如請求項16之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白質共軛物中之每一者由包含非質子性溶劑之共軛反應形成，其中該非質子性溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
  19. 如請求項16之多價免疫原性組合物，其中該組合物包含佐劑。
  20. 一種多價免疫原性組合物，其包含24種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中該等共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中每種不同多醣蛋白質共軛物包含分別來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之多醣，且其中該載體蛋白質為CRM197。
  21. 如請求項20之多價免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物不包含具有來自任何其他肺炎鏈球菌血清型之多醣的多醣蛋白質共軛物。
  22. 如請求項20之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白質共軛物中之每一者由包含非質子性溶劑之共軛反應形成，其中該非質子性溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
  23. 如請求項20之多價免疫原性組合物，其中該組合物包含佐劑。
  24. 一種多價免疫原性組合物，其包含24種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中該等共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中每種不同多醣蛋白質共軛物包含分別來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之多醣，且其中該載體蛋白質為CRM197。
  25. 如請求項24之多價免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物不包含具有來自任何其他肺炎鏈球菌血清型之多醣的多醣蛋白質共軛物。
  26. 如請求項24之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白質共軛物中之每一者由包含非質子性溶劑之共軛反應形成，其中該非質子性溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
  27. 如請求項24之多價免疫原性組合物，其中該組合物包含佐劑。
  28. 一種多價免疫原性組合物，其包含多達30種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中該等共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中該等多達30種多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
  29. 如請求項28之多價免疫原性組合物，其中該等多達30種多醣蛋白質共軛物進一步包括選自7C、9N、16F、23A、35F及38之一種、兩種、三種、四種、五種或六種額外肺炎鏈球菌血清型。
  30. 一種多價免疫原性組合物，其包含多達30種不同肺炎鏈球菌多醣蛋白質共軛物，其中該等共軛物中之每一者包含來自共軛至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型的多醣，且其中該等多達30種多醣蛋白質共軛物包括選自由以下組成之群的肺炎鏈球菌血清型之群的多醣：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B。
  31. 如請求項30之多價免疫原性組合物，其中該等多達30種多醣蛋白質共軛物進一步包括選自7C、9N、16F、23A、35F及38之一種、兩種、三種、四種、五種或六種額外肺炎鏈球菌血清型。
  32. 如請求項28至31中任一項之多價免疫原性組合物，其中該載體蛋白質為CRM197。
  33. 如請求項28至32中任一項之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白質共軛物中之每一者由包含非質子性溶劑之共軛反應形成，其中該非質子性溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
  34. 如請求項28至33中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物包含佐劑。
TW108146273A 2018-12-19 2019-12-17 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質結合物之組合物及其使用方法 TWI788610B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862781835P 2018-12-19 2018-12-19
US62/781,835 2018-12-19
US201962853331P 2019-05-28 2019-05-28
US62/853,331 2019-05-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202038996A true TW202038996A (zh) 2020-11-01
TWI788610B TWI788610B (zh) 2023-01-01

Family

ID=69173427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108146273A TWI788610B (zh) 2018-12-19 2019-12-17 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質結合物之組合物及其使用方法

Country Status (24)

Country Link
US (4) US11642406B2 (zh)
EP (1) EP3897705A2 (zh)
JP (3) JP7275277B2 (zh)
KR (1) KR20210104793A (zh)
CN (1) CN113453708A (zh)
AU (2) AU2019401535B2 (zh)
BR (1) BR112021011961A8 (zh)
CA (1) CA3123414A1 (zh)
CL (1) CL2021001572A1 (zh)
CO (1) CO2021008023A2 (zh)
CR (1) CR20210333A (zh)
DO (1) DOP2021000127A (zh)
EC (1) ECSP21044606A (zh)
IL (1) IL283896A (zh)
JO (1) JOP20210148A1 (zh)
MA (1) MA54533A (zh)
MX (1) MX2021007496A (zh)
NI (1) NI202100050A (zh)
PE (1) PE20211888A1 (zh)
PH (1) PH12021551448A1 (zh)
SG (1) SG11202106541WA (zh)
TW (1) TWI788610B (zh)
WO (1) WO2020131763A2 (zh)
ZA (1) ZA202104162B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11160855B2 (en) * 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN110225764A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 制备多糖-蛋白缀合物的方法
WO2018156491A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Enhancing immunogenicity of streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
US11395849B2 (en) 2017-09-07 2022-07-26 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
JP2020533437A (ja) * 2017-09-07 2020-11-19 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 肺炎球菌多糖体および免疫原性多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートでのその使用
MX2020002556A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina transportadora.
CN111683678B (zh) 2017-12-06 2024-01-26 默沙东有限责任公司 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法
KR20210002641A (ko) 2018-04-30 2021-01-08 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 디메틸술폭시드 중의 동결건조된 돌연변이체 디프테리아 독소의 균질 용액을 제공하는 방법
TWI788610B (zh) 2018-12-19 2023-01-01 美商默沙東有限責任公司 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質結合物之組合物及其使用方法
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物

Family Cites Families (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3740421A (en) 1966-09-19 1973-06-19 Basf Wyandotte Corp Polyoxyethylene-polyoxypropylene aqueous gels
EP0027888B1 (en) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Semiconductor switch
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
WO1990014837A1 (en) 1989-05-25 1990-12-13 Chiron Corporation Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
EP0482068A1 (en) 1989-07-14 1992-04-29 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
DE69113564T2 (de) 1990-08-13 1996-05-30 American Cyanamid Co Faser-Hemagglutinin von Bordetella pertussis als Träger für konjugierten Impfstoff.
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
NZ249704A (en) 1992-02-11 1996-11-26 Jackson H M Found Military Med A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
AU4230493A (en) 1992-05-06 1993-11-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
DK0616034T3 (da) 1993-03-05 2005-02-21 Wyeth Corp Plasmid til fremstilling af CRM-protein og diphtheria toxin
ATE254475T1 (de) 1993-09-22 2003-12-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ES2200059T3 (es) 1995-03-22 2004-03-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Produccion de construcciones inmunogenicas usando carbohidratos solubles activados mediante reactivos cianilados organicos.
EP0776216A1 (en) 1995-06-06 1997-06-04 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
DE69737125T3 (de) 1996-10-31 2015-02-26 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae-Antigene und Impfstoffe
KR19980067137A (ko) 1997-01-31 1998-10-15 박원훈 알긴산염 초미세과립구를 이용한 폐렴구균 감연중에 대한 백신
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
US6146902A (en) 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
PL203917B1 (pl) 1999-03-19 2009-11-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie
AU781027B2 (en) 1999-04-09 2005-04-28 Department Of Health & Human Services Recombinant toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
KR100927767B1 (ko) 2000-06-20 2009-11-20 아이디 바이오메디칼 코포레이션 스트렙토코커스 항원
PE20020126A1 (es) 2000-06-29 2002-04-27 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna
AU2002227450B2 (en) 2000-12-28 2008-02-28 Wyeth Recombinant protective protein from $I(streptococcus pneumoniae)
WO2002083855A2 (en) 2001-04-16 2002-10-24 Wyeth Holdings Corporation Novel streptococcus pneumoniae open reading frames encoding polypeptide antigens and uses thereof
AU2002309706A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
EP1409013B1 (en) 2001-07-26 2009-11-18 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Vaccines comprising aluminium adjuvants and histidine
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
WO2003054007A2 (en) 2001-12-20 2003-07-03 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
FR2850106B1 (fr) 2003-01-17 2005-02-25 Aventis Pasteur Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
WO2004071439A2 (en) 2003-02-10 2004-08-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof
DE602004010376T2 (de) 2003-03-13 2008-10-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Verfahren zur reinigung von bakteriellem cytolysin
WO2004083251A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
AU2003901717A0 (en) 2003-04-10 2003-05-01 Western Sydney Area Health Service Identification of streptococcus pneumoniae serotypes
US20090317412A1 (en) 2004-06-04 2009-12-24 Alexander Jeffery L Induction of an immune response against streptococcus pneumoniae polyaccharides
WO2006065137A2 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Stichting Top Institute Food And Nutrition Novel efficient production process for capsular polysaccharides of pathogenic grampositive bacteria by heterologous expression and secretion of complex polysaccharides in non-pathogenic, non-invasive gram- positive bacteria
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3466982B1 (en) 2005-04-08 2020-06-17 Wyeth LLC Separation of contaminants from streptococcus pneumoniae polysaccharide by ph manipulation
KR20150061019A (ko) 2005-04-08 2015-06-03 와이어쓰 엘엘씨 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7764278B2 (en) 2005-06-30 2010-07-27 Seiko Epson Corporation Integrated circuit device and electronic instrument
AR058707A1 (es) 2005-12-22 2008-02-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna, procedimiento para fabricarla y su uso
JP5285431B2 (ja) 2005-12-28 2013-09-11 ザ ユーエイビー リサーチ ファウンデイション 肺炎球菌血清型
WO2007087064A2 (en) 2005-12-28 2007-08-02 The Uab Research Foundation Pneumococcal serotypes
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
AU2007284878B2 (en) 2006-08-07 2013-01-17 President And Fellows Of Harvard College Protein matrix vaccines and methods of making and administering such vaccines
PT2074221E (pt) 2006-10-10 2010-09-06 Wyeth Llc Métodos melhorados para a separação de polissacáridos tipo 3 de streptococcus pneumoniae
PL3406635T3 (pl) 2007-03-23 2022-08-22 Wyeth Llc Skrócony sposób oczyszczania do wytwarzania polisacharydów otoczkowych Streptococcus pneumoniae
EA200901578A1 (ru) 2007-06-26 2010-08-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
US8540955B2 (en) 2007-07-10 2013-09-24 Wyeth Llc Process for producing aluminum phosphate
CN102257127B (zh) 2008-12-18 2014-01-01 惠氏有限责任公司 使用二氧化碳控制肺炎链球菌多糖分子量的方法
PT2379734T (pt) 2008-12-18 2018-04-27 Wyeth Llc Método para o controlo da massa molecular do polissacárido do serotipo 19a de streptococcus pneumoniae
CN101590224A (zh) 2009-06-30 2009-12-02 广州精达医学科技有限公司 高效14价肺炎球菌结合疫苗
KR20120104178A (ko) 2009-09-09 2012-09-20 메트리박스 리써치 앤 디벨롭먼트 코포레이션 면역원성이 개선된 단백질 매트릭스 백신
GB0917647D0 (en) 2009-10-08 2009-11-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Expression system
TW201136603A (en) 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
HUE048398T2 (hu) 2010-06-04 2020-07-28 Wyeth Llc Vakcinakészítmények
MX2013006539A (es) 2010-12-10 2013-07-22 Merck Sharp & Dohme Formulaciones novedosas que mitigan la agregacion inducida por agitacion de composiciones inmunogenicas.
CN102068690A (zh) 2010-12-31 2011-05-25 北京民海生物科技有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
US9724401B2 (en) 2011-05-18 2017-08-08 Matrivax, Inc. Protein matrix vaccine compositions including polycations
BR112013032225A2 (pt) 2011-06-13 2016-08-16 Merck Sharp & Dohme método para purificar toxina de difteria, e, formulação
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CN103623401A (zh) 2012-08-23 2014-03-12 北京科兴中维生物技术有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物及其制备方法
CN103656632B (zh) 2012-09-24 2016-01-13 北京科兴中维生物技术有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用
KR20140075201A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CA2943263C (en) 2012-12-20 2018-12-04 Pfizer Inc. Glycoconjugation process
ITMI20130142A1 (it) 2013-01-31 2014-08-01 Biosynth Srl Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati
CN104069488A (zh) 2013-03-29 2014-10-01 北京科兴中维生物技术有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物及其制备方法
EP4286000A3 (en) * 2014-01-21 2024-02-14 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
EP3096785B1 (en) 2014-01-21 2020-09-09 Pfizer Inc Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
KR102049826B1 (ko) 2014-01-21 2019-12-03 화이자 인코포레이티드 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 및 그의 접합체
HRP20230416T1 (hr) 2015-01-15 2023-07-07 Pfizer Inc. Imunogeni pripravci, namijenjeni upotrebi u cjepivima protiv pneumokoka
PE20180172A1 (es) 2015-05-04 2018-01-22 Pfizer Conjugados proteina-polisacarido de estreptococo grupo b, metodos para producir conjugados, composiciones inmunogenas que comprenden conjugados y sus usos
MY187461A (en) 2015-06-08 2021-09-23 Serum Inst Of India Private Ltd Methods for improving the adsorption of polysaccharide-protein conjugates and multivalent vaccine formulation obtained thereof
HUE053272T2 (hu) 2015-06-23 2021-06-28 Biological E Ltd Multivalens konjugált pneumococcus vakcina
WO2017011338A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 President And Fellows Of Harvard College Sortase-mediated coupling of immunogenic polysaccharide-protein conjugates and their use
CN108367063A (zh) 2015-07-21 2018-08-03 辉瑞公司 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2016357567B2 (en) 2015-11-17 2020-05-07 Pfizer Inc. Media and fermentation methods for producing polysaccharides in bacterial cell culture
JP6884145B2 (ja) * 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
JP7164200B2 (ja) * 2016-03-31 2022-11-01 ポゴナ， エルエルシー サッカライド－ポリペプチドコンジュゲートの組成物およびその使用の方法
WO2017220753A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN105999254A (zh) 2016-06-27 2016-10-12 北京智飞绿竹生物制药有限公司 含2型和12f血清型的15价肺炎球菌结合物组合疫苗
WO2018009906A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 President And Fellows Of Harvard College Whole cell-protein conjugates and methods of making the same
RU2735726C2 (ru) 2016-07-27 2020-11-06 Шарп Кабусики Кайся Способы и устройство беспроводной связи с использованием тега значения системной информации
BR112019001971A2 (pt) 2016-08-05 2019-05-07 Sanofi Pasteur, Inc. composição conjugada de polissacarídeo-proteína pneumocócica multivalente
EP3493840B1 (en) 2016-08-05 2022-08-24 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
JOP20190038B1 (ar) 2016-09-06 2023-09-17 Lg Chemical Ltd تركيب اقتراني من السكر المتعدد لكبسولة بكتيريا المكورات الرئوية وبروتين حامل واستخداماته
EP3518965A1 (en) * 2016-09-30 2019-08-07 Biological E Limited Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
KR20180043122A (ko) 2016-10-19 2018-04-27 동국대학교 산학협력단 신규링커를 통한 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 및 이의 용도
WO2018080213A1 (ko) 2016-10-28 2018-05-03 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
CN108144056A (zh) 2016-12-02 2018-06-12 武汉博沃生物科技有限公司 多价肺炎球菌多糖结合疫苗及其制备方法
JP7186166B2 (ja) 2016-12-30 2022-12-08 バックスサイト・インコーポレイテッド 非天然アミノ酸とのポリペプチド抗原接合体
MX2019008564A (es) 2017-01-20 2019-09-19 Pfizer Composiciones inmunogenicas para su uso en vacunas neumococicas.
CN110225757A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法
CN110225764A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 制备多糖-蛋白缀合物的方法
EP3585803A4 (en) 2017-02-24 2020-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. PNEUMOCOCCIC CONJUGATE VACCINE FORMULATIONS
WO2018156491A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Enhancing immunogenicity of streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
WO2018156467A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for improving filterability of polysaccharide-protein conjugate reactions
US11219680B2 (en) 2017-02-24 2022-01-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Polysaccharide-protein conjugates utilizing diphtheria toxin fragment B as a carrier
CN110520154B (zh) 2017-03-15 2023-08-04 株式会社Lg化学 多价肺炎链球菌疫苗组合物
CN107929728A (zh) 2017-04-19 2018-04-20 武汉博沃生物科技有限公司 一种肺炎球菌蛋白疫苗及其制备方法
WO2018227177A1 (en) 2017-06-10 2018-12-13 Inventprise, Llc Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity
CN109091668A (zh) 2017-06-20 2018-12-28 浙江博和瑞达生物科技有限公司 16价肺炎链球菌结合疫苗组合物
EP3668541A4 (en) 2017-08-16 2021-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. FORMULATIONS FOR PNEUMOCOCCAL CONJUGATE VACCINE
JP2020533437A (ja) 2017-09-07 2020-11-19 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 肺炎球菌多糖体および免疫原性多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートでのその使用
US11395849B2 (en) 2017-09-07 2022-07-26 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
JP2020533299A (ja) 2017-09-07 2020-11-19 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． キャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための肺炎球菌多糖の製剤方法
EP3678654A4 (en) 2017-09-07 2021-04-21 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTIPNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN POLYSACCHARIDE-CARRIER PROTEIN IMMUNOGENIC CONJUGATES
MX2020002556A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina transportadora.
EP3691677A4 (en) 2017-10-04 2021-07-07 Pogona, Llc COMPOSITIONS OF SACCHARIDE-POLYPEPTIDE CONJUGATES AND THEIR METHODS OF USE
US20200325020A1 (en) 2017-10-25 2020-10-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Adjuvanted vaccines
CN111683678B (zh) 2017-12-06 2024-01-26 默沙东有限责任公司 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法
JP2019118051A (ja) 2017-12-27 2019-07-18 株式会社デンソー 表示処理装置
CN108159408A (zh) 2017-12-29 2018-06-15 云南沃森生物技术股份有限公司 一种多价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用
CN108245674A (zh) 2018-01-18 2018-07-06 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种多价肺炎球菌结合物组合疫苗的处方及其制备方法
CN108079286B (zh) 2018-01-19 2020-07-31 云南沃森生物技术股份有限公司 一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用
WO2019152921A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR102486891B1 (ko) 2018-02-05 2023-01-10 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 다가 폐렴구균성 다당류-단백질 접합체 조성물
WO2019170068A1 (zh) 2018-03-05 2019-09-12 武汉博沃生物科技有限公司 一种肺炎链球菌疫苗及其制备方法
CA3096358A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Sk Bioscience Co., Ltd. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide and immunogenic conjugate thereof
JP2021522285A (ja) 2018-04-30 2021-08-30 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． リオスフィアから肺炎連鎖球菌莢膜多糖類キャリアタンパク質コンジュゲートを生産する方法
CN112074293A (zh) 2018-04-30 2020-12-11 默沙东公司 生产肺炎链球菌荚膜多糖载体蛋白缀合物的方法
KR20210002641A (ko) 2018-04-30 2021-01-08 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 디메틸술폭시드 중의 동결건조된 돌연변이체 디프테리아 독소의 균질 용액을 제공하는 방법
WO2019217183A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Lyophilization bag
CN108339115B (zh) 2018-05-11 2020-07-10 武汉博沃生物科技有限公司 使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗及其制备方法
WO2019220304A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Tergene Biotech Pvt. Ltd. 15 valent pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine
WO2019236435A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Lyosphere critical reagent kit
CN108524926B (zh) 2018-06-29 2021-06-29 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
WO2020009462A1 (ko) 2018-07-06 2020-01-09 주식회사 유바이오로직스 다가 폐렴구균 다당체-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 폐렴구균에 의한 질환 예방 백신
CN108543066A (zh) 2018-07-17 2018-09-18 成都安特金生物技术有限公司 一种24价肺炎球菌多糖疫苗及其鉴别方法
WO2020021416A1 (en) 2018-07-21 2020-01-30 Biological E Limited Vaccine formulations comprising preservative system
AU2019341723B2 (en) 2018-09-23 2024-03-21 Biological E Limited Purified capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae
BR112021012521A2 (pt) 2018-10-12 2021-09-14 Biological E Limited Vacina conjugada de polissacarídeo-proteína pneumocócica multivalente
CN109336989B (zh) 2018-10-22 2022-05-13 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法
WO2020121159A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
TWI788610B (zh) 2018-12-19 2023-01-01 美商默沙東有限責任公司 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質結合物之組合物及其使用方法
WO2020152706A1 (en) 2019-01-21 2020-07-30 Biological E Limited Multivalent pneumococcal conjugate vaccine compositions
WO2020157772A1 (en) 2019-01-28 2020-08-06 Biological E Limited Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine compositions
CN109771640A (zh) 2019-02-28 2019-05-21 北京智飞绿竹生物制药有限公司 多价肺炎球菌结合疫苗
EP3952906A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
BR112021024393A8 (pt) 2019-06-05 2023-01-31 Merck Sharp & Dohme Um conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócico de sorotipo 35b imunogênico e processo de conjugação para fabricar o mesmo
MX2021014948A (es) 2019-06-05 2022-01-24 Merck Sharp & Dohme Llc Metodos de tratamiento de pacientes con una composicion inmunogenica que protege contra el seroripo 29 de s. pneumoniae.
CN110302375A (zh) 2019-06-27 2019-10-08 康希诺生物股份公司 一种糖缀合物及其用途
KR20210010412A (ko) 2019-07-18 2021-01-27 (주)셀트리온 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
AU2020323498A1 (en) 2019-07-31 2022-03-03 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same
CN111821432B (zh) 2020-08-05 2022-10-18 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210104793A (ko) 2021-08-25
CO2021008023A2 (es) 2021-07-19
JP2023100823A (ja) 2023-07-19
JOP20210148A1 (ar) 2023-01-30
TWI788610B (zh) 2023-01-01
BR112021011961A2 (pt) 2021-09-08
CL2021001572A1 (es) 2021-12-24
US11642406B2 (en) 2023-05-09
MA54533A (fr) 2022-03-30
WO2020131763A2 (en) 2020-06-25
US20230277644A1 (en) 2023-09-07
JP2023100822A (ja) 2023-07-19
DOP2021000127A (es) 2021-07-30
AU2019401535A1 (en) 2021-07-22
ECSP21044606A (es) 2021-07-30
CN113453708A (zh) 2021-09-28
WO2020131763A3 (en) 2020-07-30
CR20210333A (es) 2021-08-18
IL283896A (en) 2021-07-29
PH12021551448A1 (en) 2021-12-06
SG11202106541WA (en) 2021-07-29
PE20211888A1 (es) 2021-09-22
US20220296695A1 (en) 2022-09-22
CA3123414A1 (en) 2020-06-25
BR112021011961A8 (pt) 2023-02-07
MX2021007496A (es) 2021-08-05
AU2024201265A1 (en) 2024-03-14
ZA202104162B (en) 2023-12-20
NI202100050A (es) 2021-12-06
AU2019401535B2 (en) 2023-12-14
EP3897705A2 (en) 2021-10-27
JP2022515098A (ja) 2022-02-17
US20230338498A1 (en) 2023-10-26
US20200197503A1 (en) 2020-06-25
JP7275277B2 (ja) 2023-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI725359B (zh) 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之組合物及其使用方法
TWI788610B (zh) 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質結合物之組合物及其使用方法
KR101538535B1 (ko) 15가 폐렴구균성 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신 조성물
JP2020533299A (ja) キャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための肺炎球菌多糖の製剤方法
US20220233674A1 (en) An immunogenic serotype 35b pneumococcal polysaccharide-protein conjugate and conjugation process for making the same
US20220218812A1 (en) Methods of treating patients with an immunogenic composition that protects against s. pneumoniae serotype 29