JP6072777B2 - ポリカチオンを含むタンパク質マトリックスワクチン組成物 - Google Patents

Description

関連出願の引照
本出願は、US Provisional Appln. No. 61/487,663 ,2011年5月18日出願に基づく優先権を主張し、その内容を全体として本明細書に援用する。

発明の分野
本発明は、免疫原組成物、ワクチンを製造する方法、およびワクチンを投与する方法に関する。具体的には、本発明は、架橋したキャリヤータンパク質マトリックスに目的とする抗原を捕捉させ、その際、抗原を捕捉するタンパク質マトリックスの形成に際してポリ−Ｌ−リジンまたは他のポリカチオン（単数または複数）を用いることを特徴とする、タンパク質マトリックスワクチンに関する。

細菌感染症に対するワクチン接種は重要な医療手段であり、実質的にあらゆる個体に推奨される予防的な医療介入である。細菌感染または細菌感染症発病に対抗するワクチンの設計は、しばしば細菌タンパク質、たとえば細菌が産生する毒素を標的とする。たとえば炭疽病、ジフテリアおよび破傷風に対するワクチンがそうである。他のワクチン法は細菌の外莢膜を標的とするが、細菌性病原体の莢膜層を構成する抗原の多くは長期免疫応答をほとんどまたは全く刺激せず、このことがそれらを有効なワクチンの製造に使用するのを困難にしている。莢膜は多くの細菌の外面を構成し、一般に有機化合物、たとえば炭水化物、アミノ酸またはアルコール類のポリマーからなる。莢膜は化学的にきわめて多様である。多糖類を基礎とする莢膜については、糖単位が多様な分子構造で互いに連結している可能性があり、さらにホスフェート、窒素、スルフェートおよび他の化学修飾体で置換されている可能性がある。莢膜は、微生物が宿主のマクロファージおよび多形核白血球によって効果的にファゴサイトーシスされて死滅するのを阻害することによる、ビルレンス員子である可能性がある。

莢膜に対する抗体は、微生物の表面における補体結合を仲介することにより、莢膜を備えた生物に対する有効な防御を提供し、その結果、ファゴサイトーシス作用する宿主免疫細胞により細菌が溶解またはオプソニン化され、取り込まれて死滅する。微生物莢膜に対して最も有効な抗体はＩｇＧ抗体である。莢膜抗原は、Ｔ細胞の補助を伴なわない免疫応答を誘発するので一般にＴ細胞−非依存性抗原として分類され、したがって持続性の免疫記憶応答を誘発しない。しかし、あるタンパク質が莢膜抗原に共有結合すると莢膜抗原は“Ｔ細胞依存性”になり、そのようなＴ細胞依存性抗原は次いでヘルパーＴ細胞仲介による（Ｔ_ｈ−依存性）ＩｇＧに基づく記憶Ｂ細胞応答、すなわち既往性応答(anamnestic response)を誘発する。

ワクチン抗原をより免疫原性にし、かつ理想的にはＴ細胞依存性にするために、さまざまな方法が研究された。大部分の細菌表面多糖類はそれ自体が免疫原性であり、微生物莢膜中の天然抗原を認識する免疫応答を誘発することができる。しかし、莢膜多糖類のみをワクチンとして用いた場合、それらは一般に持続免疫を促進せず、また２歳未満の小児の免疫化にはそれほど有効ではない。多糖抗原をキャリヤータンパク質に共有結合させると、その多糖の免疫原性を大幅に増大させて希望するＴ細胞依存性免疫応答（すなわち免疫記憶）を促進することができ、これによりその抗原を保有する微生物によるその後の感染に対して宿主が防御されることが立証された。たとえば、コンジュゲートしていない肺炎球菌ワクチン、たとえばＭｅｒｃｋのＰｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）は個体における浸潤性肺炎球菌性疾患に対しては有効であるが、それは、長期免疫を誘発して反復免疫化の必要性が避けられる免疫記憶および希望する防御免疫を誘発するのには無効である（たとえば乳児において）。コンジュゲート肺炎球菌ワクチン、たとえばＰｆｉｚｅｒのＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）(Pfizer Inc., USA)は、２か月齢の乳児においてすら免疫原性が高く、Ｔ細胞依存性免疫を誘発し、有効性が高いことが示された。

しかし、コンジュゲートワクチンは免疫学的に有望ではあるが、それらは製造がきわめて困難かつ複雑（かつ高価）であり、これがワクチン接種を必要とする世界中の人々にワクチンを配布するのを著しく妨げている。たとえば、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）７の場合、コンジュゲーションに用いる７種類の多糖抗原を供給するそれぞれの肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)株をバイオリアクター内で増殖させ；細胞を収穫し；多糖を抽出し、精製し、加水分解して適切なサイズにし；個々の抗原を次いでタンパク質キャリヤーにコンジュゲートさせ；そのコンジュゲートを再精製し、同様な方法で調製したさらに６種類の他の多糖−タンパク質複合体（コンジュゲート）と混合し；そして最後にそのマルチコンジュゲート混合物にアジュバントであるミョウバンを添加する。この７価Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンの製造には２００を超えるＧＭＰ工程があると推定される。

最近、コンジュゲートワクチンに代わるものとしてタンパク質マトリックスワクチンが提唱された。参照：米国特許公開US-2008-0095803 (Mekalanos, J.), 2008年4月24日公開;国際特許出願公開番号WO 2008/021076 (Mekalanos, J.), 2008年2月21日公開;および国際特許出願公開番号WO 2011/031893 (Killeen, K., et. al.), 2011年3月17日公開)；本明細書に援用する。タンパク質マトリックスワクチンは、目的とする抗原をキャリヤーに共有結合によりコンジュゲートさせるのではなく、目的とする抗原の存在下でキャリヤータンパク質を架橋させることにより調製したキャリヤータンパク質マトリックスに抗原を捕捉する。抗原がキャリヤータンパク質に有意に共有結合するのが避けられる；むしろ、抗原はマトリックス形成（架橋反応）に際してタンパク質キャリヤーにより捕捉された状態になることによって、マトリックスと会合した状態を維持する。そのようなタンパク質マトリックスワクチンは、抗原のみを用いて製造されたワクチンより大きな免疫原性を誘発することが立証された；また、タンパク質マトリックスワクチンは、コンジュゲートワクチンでみられる種類の免疫応答も誘発できる（すなわち、Ｔ細胞依存性免疫の誘導）。タンパク質マトリックスワクチンの合成は複雑なコンジュゲーション反応を伴なわず、一般に要求される処理工程がより少なく、これによってタンパク質マトリックスワクチンはコンジュゲートワクチンより製造経費が低くなる。

タンパク質マトリックスワクチンは幾つかの利点をもたらすが、タンパク質マトリックスワクチンにより誘発される抗原特異的抗体の力価は、対応するコンジュゲートワクチンにより誘発される力価よりしばしば低い。WO 2011/031893には、タンパク質マトリックスワクチンをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、高分子量のタンパク質マトリックス粒子を含有する画分を免疫化のために選択すると、コンジュゲート多糖ワクチンにより誘発されるものと類似の力価を得ることができると教示されている。しかし、この新たな科学的有望性ならびに製造および経費上の利点を利用するために、免疫原性の高いタンパク質マトリックスワクチンを製造する手段を提供することが当技術分野における継続的な技術的課題である。増強された免疫原性または効力をもつ改良されたタンパク質マトリックスワクチンが依然として求められている。

US-2008-0095803 WO 2008/021076 WO 2011/031893 WO 2011/031893

多糖類または他の抗原を捕捉するタンパク質マトリックスの形成に際してポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）または他のポリカチオンを用いて本発明に従って製造したワクチンで、タンパク質マトリックスワクチンの有効性および収率における意外な前進が達成された。こうして、抗原（単数または複数）の修飾によってではなく、抗原（単数または複数）を捕捉するために用いるマトリックスの性質および組成に着目することによって、タンパク質マトリックスワクチンの品質および収率が改善された。

本明細書には、新規なタンパク質マトリックスワクチン、およびマトリックスによる多糖類の捕捉を第一級アミン含有ポリカチオンの使用によって改善するための方法を記載する。

本発明の１態様は、（１）１種類以上の目的とする抗原、（２）１種類以上のキャリヤータンパク質、および（３）１種類以上のポリカチオンを含む免疫原組成物であって、キャリヤータンパク質および場合によりポリカチオンが架橋してタンパク質マトリックスを形成し、目的とする抗原がそのタンパク質マトリックスにより捕捉されている組成物である。そのような組成物は、抗原、キャリヤータンパク質およびポリカチオン成分を混合し、架橋反応を開始してキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンを架橋させることによって、容易に調製できる。本発明に従ってポリカチオン、たとえばα−ＰＬＬを含有させたタンパク質マトリックスワクチン組成物は、抗原単独と比較して、抗原およびキャリヤーの混合物と比較して、またポリカチオンを含有しないタンパク質マトリックスワクチン組成物と比較して、増大した免疫原性をもつ。

好ましい態様において、免疫原組成物の１種類以上のポリカチオンは下記のものからなる群から選択される：ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリオルニチン、スペルミジン、スペルミン、キトサン［２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮ）と２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ−（１−４）−連結コポリマー］、分枝ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミンＮ７（ＣＡＳ ２９３２０−３８−５）、およびエチレンジアミノメチルポリスチレン（ＣＡＳ １７７９８７−９３−８）。望ましい態様において、ポリカチオンはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）である。

他の望ましい態様において、ポリ−Ｌ−リジンはアルファ−ポリ−Ｌ−リジン（α−ＰＬＬ；αＰＬＬ）またはイプシロン−ポリ−Ｌ−リジン（ε−ＰＬＬ；εＰＬＬ）である。

好ましい態様において、組成物は、直径５０ｎｍより大きい平均粒度を有するタンパク質マトリックス粒子からなる。そのような組成物は、抗原、キャリヤータンパク質およびポリカチオン成分を混合し、架橋反応を開始してキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンを架橋させ、続いて反応生成物を処理して低分子量の種を除去することによって、容易に調製できる。

本発明の１態様は、目的とする抗原およびキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスを含有するワクチン組成物であり、その際、抗原はキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスで捕捉されて複合体を形成している。本発明の望ましい態様において、抗原／キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス複合体は直径５０ｎｍより大きい平均粒度をもつ。本発明のより望ましい態様において、複合体は、直径１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、１０００ｎｍより大きい、２０００ｎｍより大きい、またはさらに大きい、たとえばタンパク質マトリックス粒子の分離方法の限界までの平均粒度をもつ。本発明のよりさらに望ましい態様において、ワクチン組成物の抗原／キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス複合体は、直径５０ｎｍより大きい平均粒度、たとえば直径５０〜２０００ｎｍの範囲、またはたとえば１００〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、２５０〜５００ｎｍ、１２０〜１０００ｎｍ、２００〜２０００ｎｍの範囲、もしくはそのような粒度範囲内で選択される他の粒度を含むであろう。本発明のよりさらに望ましい態様において、組成物は直径５０〜１５０ｎｍの粒度をもつ複合体を含有する。

本発明の他の望ましい態様において、抗原：キャリヤータンパク質のモル比は１：１０〜１０：１である。
好ましい態様において、反応混合物中のポリカチオンの重量パーセントは０．００５〜０．１０％、または０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲である。

他の望ましい態様において、免疫原組成物はさらに、２種類以上の目的とする抗原、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３種類以上の目的とする抗原を含有する。

本発明の望ましい態様において、本発明のタンパク質マトリックスワクチン組成物は、哺乳動物に投与した際にその哺乳動物においてＴ細胞依存性免疫応答を誘発する（すなわち、ワクチン接種された宿主において免疫記憶を発生させる）。

本発明の望ましい態様において、目的とする抗原は多糖類である。
本発明の他の望ましい態様において、多糖類は下記のものからなる群から選択される：肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の多糖類、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)の多糖類、炭疽菌(Bacillus anthracis)の多糖類、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)の多糖類、サルモネラ・チフィ（チフス菌）(Salmonella typhi)の多糖類、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)の多糖類、サルモネラ属(Salmonella)菌種の多糖類、赤痢菌属(Shigella)の多糖類、または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)の多糖類。グラム陰性細菌のＯ抗原、すなわちユニークな、しばしば細菌感染に対する防御抗原であるＬＰＳ（リポ多糖）の一部も、本発明に使用するのに適した、目的とする抗原である。

本発明のさらに望ましい態様において、肺炎連鎖球菌の多糖類は、莢膜タイプ３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６からなる群の１種類以上の多糖類から選択される。

好ましい態様において、１種類以上のキャリヤータンパク質は、下記のものからなる群から選択される：ジフテリアトキソイド、たとえば無毒性のジフテリア毒素タンパク質フラグメントＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン(flagellin)、ニューモリシン(pneumolysin)、髄膜炎菌(Neisseria menningitidis)の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌(Escherichia coli)易熱性エンテロトキシン、志賀毒素様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、リステリオリシン(listeriolysin)Ｏ、細菌の全細胞からのタンパク質抽出物、炭疽菌(Bacillus anthracis)の防御抗原の優性ネガティブインヒビター（ＤＮＩ）変異体、または大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼ。

本発明の望ましい態様において、免疫原組成物はキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスに捕捉された目的とする抗原を含み、さらに医薬的に許容できる賦形剤を含有する。

好ましい態様において、本発明はワクチン組成物を調製するための他の方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）１種類以上の目的とする抗原、１種類以上のキャリヤータンパク質、および１種類以上のポリカチオンを混合し、（ｉｉ）キャリヤータンパク質分子間、同じキャリヤータンパク質分子の異なる部位間、および／またはキャリヤータンパク質分子とポリカチオンの間に架橋を形成できる架橋剤を添加し、そして（ｉｉｉ）架橋反応を開始することを伴なう。他の態様において、本発明によるワクチンを製造する方法は、さらに他の工程、すなわち（ｉｖ）場合により架橋反応生成物から直径５０ｎｍより大きい平均粒度をもつ複合体を選択する工程をも含むであろう。架橋剤の反応基とキャリヤータンパク質の反応部位が接触した際に反応する特定の場合、混合工程と開始工程、すなわち（ｉｉ）と（ｉｉｉ）は同時に起き、あるいは１工程とみなすことができる。さらに、反応開始工程の後に、たとえば適宜な失活剤または遮断剤の添加により架橋反応を減衰させる工程を含めることによって、架橋反応を停止することが有利な場合がある。

本発明の望ましい態様において、本発明は、哺乳動物において目的とする抗原に対して免疫応答を誘発する方法、または対象に感染因子に対するワクチンを接種する方法であって、その哺乳動物または対象に本明細書に記載する免疫原組成物を投与することを含む方法を特徴とする。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。

本発明の他の望ましい態様において、本発明は、本明細書に記載する免疫原組成物を２種類以上含むワクチン組成物を特徴とする。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１は、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を含む、または含まないＶｉ−ＣＲＭ１９７ ＰＣＭＶ反応物の、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離を示すグラフである。Ｖｉ多糖単独、ＰＬＬを含むＶｉ−ＣＲＭ１９７ ＰＣＭＶ反応物、およびＰＬＬを含まないＶｉ−ＣＲＭ−ＰＣＭＶを、５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離した。画分中のＶｉ多糖の量を、Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌアッセイにより測定した。 図２は、サイズ排除クロマトグラフィーによるＶｉ−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）ＰＣＭＶの分離を示すグラフである。ＰＣＭＶ反応物を１５０ｍＬ（３０ｃｍ×２．６ｃｍ）のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００カラムで分離した。画分中のＶｉ多糖およびタンパク質の量を、それぞれＳｔａｉｎｓ−ａｌｌアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより測定した。影付きボックスは、プールして前臨床試験でマウスの免疫化に用いた画分を示す。 図３は、サイズ排除クロマトグラフィーによるＶｉ−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）ＰＣＭＶの分離を示すグラフである。ＰＣＭＶ反応物を５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離した。画分中のＶｉ多糖およびタンパク質の量を、それぞれＳｔａｉｎｓ−ａｌｌアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより測定した。影付きボックスは、プールして前臨床試験でマウスの免疫化に用いた画分を示す。 図４は、サイズ排除クロマトグラフィーによる肺炎球菌の多糖１８Ｃ（ＰＰＳ１８Ｃ）およびＰＰＳ１８Ｃ−ＣＲＭ−αＰＬＬ（１５〜３０ｋＤａ）−ＰＣＭＶの分離を示すグラフである。ＰＰＳ１８ＣおよびＰＰＳ１８Ｃ−ＣＲＭ−ＰＬＬ−ＰＣＭＶを５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離した。画分中の多糖の量をＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイにより測定し、タンパク質の量をｍｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイにより測定した。 図５は、捕捉されたＶｉの量がαＰＬＬ量の増加に伴なって増加することを示すグラフである。４ｍｇ／ｍＬのＶｉを、０．０１％のαＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）、０．０２％のαＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）、または０．０４％のαＰＬＬ（１５〜３０ｋＤａ）を含有するＰＣＭＶ反応物に添加した。グルタルアルデヒドおよびＣＲＭ１９７の添加後、反応物を５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００サイズ排除カラムで分離した。画分を多糖およびタンパク質について、それぞれＳｔａｉｎｓ−ａｌｌアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより分析した。 図６は、サイズ排除クロマトグラフィーによるバッチ型３価ＰＰＳ（ＰＰＳ４、ＰＰＳ１８Ｃ、ＰＰＳ２３Ｆ）−ＣＲＭ１９７−εＰＬＬ ＰＣＭＶの分離を示すグラフである。３種類の肺炎球菌多糖類（それぞれ１．３ｍｇ／ｍＬのＰＰＳ４、ＰＰＳ１８Ｃ、およびＰＰＳ２３Ｆ）を単一のＰＣＭＶ反応物に添加した。反応物を５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離した。カラム画分を総多糖類およびタンパク質について、それぞれＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより分析した。影付きボックスは、プールして前臨床免疫原試験でマウスの免疫化に用いた画分を示す。 図７は、サイズ排除クロマトグラフィーによるバッチ型１３価ＰＰＳ−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）ＰＣＭＶの分離を示すグラフである。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチン中に存在する１３種類の肺炎球菌多糖類（０．３ｍｇ／ｍＬのそれぞれの多糖）を単一のＰＣＭＶ反応物に添加した。反応物を５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離した。カラム画分を総多糖類およびタンパク質について、それぞれＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより分析した。影付きボックスは、プールして前臨床免疫原試験でマウスの免疫化に用いた画分を示す。 図８は、サイズ排除クロマトグラフィーによるバッチ型３価ＰＰＳ（ＰＰＳ４、ＰＰＳ１８Ｃ、ＰＰＳ２３Ｆ）−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）ＰＣＭＶの分離を示すグラフである。３種類の肺炎球菌多糖類（それぞれ１．３ｍｇ／ｍＬのＰＰＳ４、ＰＰＳ１８Ｃ、およびＰＰＳ２３Ｆ）を単一のＰＣＭＶ反応物に添加した。反応物を５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離した。カラム画分を総多糖類およびタンパク質について、それぞれＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより分析した。影付きボックスは、プールして前臨床免疫原試験でマウスの免疫化に用いた画分を示す。 図９は、サイズ排除クロマトグラフィーによるバッチ型２３価ＰＰＳ−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）ＰＣＭＶの分離を示すグラフである。単独のPneumovax（登録商標）中に存在する２３種類の多糖類（０．１７ｍｇ／ｍＬのそれぞれの多糖）を単一のＰＣＭＶ反応物に添加した。反応物を５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離した。カラム画分を総多糖類およびタンパク質について、それぞれＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより分析した。影付きボックスは、プールして前臨床免疫原試験でマウスの免疫化に用いた画分を示す。

タンパク質マトリックスワクチン、特にタンパク質莢膜マトリックスワクチン(protein capsular matrix vaccine)（ＰＣＭＶ）は、米国特許公開US-2008-0095803 (Mekalanos, J.), 2008年4月24日公開;国際特許出願公開番号WO 2008/021076 (Mekalanos, J.), 2008年2月21日公開;及び国際特許出願公開番号WO 2011/031893 (Killeen, K.等), 2011年3月17日公開に記載されている；すべてを全体として本明細書に援用する。これらの公開出願は、タンパク質マトリックスワクチンは典型的なＰＳ−タンパク質コンジュゲートワクチンがもつ有効な免疫学的特性を備えているが、目的とする抗原をキャリヤータンパク質にカップリングさせる有意の共有結合が起きないという点でコンジュゲートワクチンとは望ましい相異をもつことを教示する。したがって、タンパク質マトリックスワクチン（キャリヤータンパク質マトリックス／抗原複合体）は、抗原がキャリヤーに共有結合した一般的なコンジュゲートワクチンと区別される。タンパク質マトリックスワクチンにおいて、目的とする抗原、たとえば多糖類、莢膜有機ポリマーまたは他の抗原は、キャリヤータンパク質マトリックス内に捕捉されている。

病原体の莢膜バイオポリマーまたは多糖類が、架橋したタンパク質マトリックスに捕捉されている場合、そのようなワクチンはタンパク質莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）と呼ばれる。WO 2008/021076およびUS 2008-0095803に記載されるように、モデルのＴ細胞−非依存性莢膜抗原であるポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、およびアルギン酸（アルギネート）およびデキストランと、代表的なキャリヤータンパク質である優性ネガティブインヒビター（ＤＮＩ）変異体を基礎とするものを含むＰＣＭＶが製造された。ＤＮＩは炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の変異型であり、大腸菌からBenson, et al., Biochemistry, 37:3941-3948 (1998)の方法により製造された。他のＰＣＭＶ態様、およびＰＣＭＶ粒子のサイズ分画の有益性は、WO 2011/031893に記載されている。

本発明は、タンパク質マトリックス内に抗原を捕捉する改良法によりタンパク質マトリックスワクチン組成物の免疫原性および収率を増強させることに関して得られた知見および所見に関連する。

本発明をより明確に理解できるために、下記の略号および用語を下記の定義に従って用いる。
名称を挙げた１以上の要素または工程を“含む(comprising)”と本明細書中に記載した組成物または方法は、無制限(open-ended)である；これは、名称を挙げたその要素または工程が必須であるが、その組成物または方法の範囲内の他の要素または工程を加えてもよいことを意味する。冗長になるのを避けるために、名称を挙げた１以上の要素または工程を“含む(comprisingまたはcomprising)”と本明細書中に記載したいずれかの組成物または方法は、同じ名称の要素または工程“から本質的に構成される(consisting essentially of、またはconsists essentially of)”、対応する、より限定された組成物または方法をも記載していることも理解される；これは、その組成物または方法が名称を挙げた必須の要素または工程を含み、かつその組成物または方法の基本的な新規特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさない他の要素または工程をも含んでもよいことを意味する。名称を挙げた１以上の要素または工程を“含む”または“から本質的に構成される”と本明細書中に記載したいずれかの組成物または方法は、名称を挙げた１以上の要素または工程を“含む(comprisingまたはcomprising)”、対応する、より限定された、かつ制限された(closed-ended)組成物または方法であって、名称を挙げた１以上の要素または工程を除外したものをも記載していることも理解される。本明細書に開示するいずれかの組成物または方法において、名称を挙げたいずれか必須の要素または工程の既知または開示した均等物をその要素または工程の代わりに用いてもよい。“からなる群から選択される”要素または工程は、それに続くリスト中の１以上の要素または工程を表わし、これには列記した２以上の要素または工程のいずれかの組合わせが含まれることも理解される。

本明細書中でワクチン組成物に関連して用いる用語“投与する”は、ヒトなどの対象に、対象において免疫応答を誘発するのに十分な用量でワクチン組成物を供給することを意味し、その際、その免疫応答の結果、ワクチン組成物に含有される抗原を特異的に結合する抗体が産生される（すなわち、療法ワクチン中のその抗原は、病原体における抗原マーカーに相当する）。投与には、望ましくは、投与すべきワクチン組成物の剤形ならびに性質および活性に適した筋肉内注射、皮内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下もしくは経皮注射、吸入、または服用が含まれる。投与は、ワクチンの単回投与またはワクチンの多数回投与を伴なうことができる。望ましくは、感染因子の感染を予防するために、対象における抗体の産生を追加する２回目の（“追加免疫”）投与を計画する。ワクチン投与の頻度および量はワクチンの個々の活性に依存し、ルーチン実験によって容易に決定できる。

用語“架橋(cross-linkまたはcrosslink)”は、２つの分子、高分子、もしくは分子の組合わせ、たとえばキャリヤータンパク質分子の間での、または同じ分子の２つの部位、たとえば同じタンパク質の２つのアミノ酸残基の間での、またはキャリヤータンパク質分子とポリカチオン分子の間での共有結合の形成を表わし、これは“ゼロ長さ”のリンカーを用いる場合は直接的であり（直接結合を形成）、あるいは２つの反応部位間に分子橋または連結を形成する２官能性架橋剤分子の使用による。２官能性架橋剤は２つの官能基を提示し、それぞれが２つの別の分子のうちの１つと、または同じ分子の２つの別の基の間で（すなわち、それによりキャリヤータンパク質などの分子内で“ループ”または“フォールド”を形成する）、共有結合を形成することができる。代表的なリンカーには、２つのキャリヤータンパク質分子、および／または２つのポリカチオン分子、および／またはキャリヤータンパク質分子とポリカチオン分子を架橋することができる、２官能性架橋剤が含まれる。

本明細書中で用いる用語“抗原”は、抗体または抗体フラグメントが特異的に結合するいずれかの分子または分子の組合わせを表わす。
本明細書中で用いる用語“２官能性架橋剤(bifunctional cross-linker)”または“２官能性リンカー(bifunctional linker)”は、２つの官能基をもち、それぞれが別個に、互いに連結させたい別の２つの分子、原子もしくは分子集合体上の反応基と共有結合を形成できる化合物を意味する。代表的な２官能性リンカーは、たとえばG. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996)、およびDick and Beurret, “Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens”, Conjugate Vaccines (Cruse and Lewis, eds), Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, vol.10, pp. 48-114)に記載されている。望ましくは、２官能性リンカーはグルタルアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、またはアジプイミド酸ジメチル(dimethyl adipimidate)である。

本明細書中で用いる用語“リンカー”または“架橋剤”は、２以上の分子または同じ分子の２以上の部位を連結する共有化学結合または橋を形成できる化合物を表わす。望ましいリンカーには、たとえば下記のものが含まれる；グルタルアルデヒド、または式ＯＨＣ−Ｒ−ＣＨＯの他のジアルデヒド：式中のＲは、炭素原子１〜１２個の線状または分枝した二価アルキレン部分、原子１〜１２個の線状または分枝した二価ヘテロアルキル部分、炭素原子２〜１２個の線状または分枝した二価アルケニレン部分、炭素原子２〜１２個の線状または分枝した二価アルキニレン部分、炭素原子５〜１０個の二価芳香族基、原子３〜１０個の環系、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｑＣＨ_２ＣＨ_２−（式中のｑは、１〜４、または２つのアルデヒド基を連結する直接化学結合である）である。連結は、連結（架橋）分子を用いずに直接的であってもよい。たとえば、キャリヤータンパク質中のカルボキシル基、たとえばＡｓｐまたはＧｌｕ残基の側鎖上のカルボキシル基を、たとえばＬｙｓ残基の側鎖上の遊離アミノ基にカルボジイミド化学操作を用いて直接連結させることができ、あるいは酵素により、たとえば遊離アミノ基とＧｌｎ残基上のカルボキサミド基の間の架橋を触媒できるトランスグルタミナーゼを用いて直接連結させることができる。

抗体産生の誘発に関する用語“追加免疫する”は、２回目の抗原曝露に際して起きる記憶Ｂ細胞活性化を表わす。これは、“追加免疫応答”とも呼ばれ、持続的な抗体産生能力をもたらす持続的な“二次”記憶免疫応答の指標である。

ワクチン組成物に関する用語“キャリヤータンパク質”は、ワクチン組成物中に用いられるタンパク質を表わし、それは、それ自体に対する免疫応答および／またはそのようなキャリヤータンパク質およびポリカチオンと会合もしくは複合体形成した抗原に対する免疫応答を誘発する。本発明のタンパク質マトリックスワクチン組成物において、抗原は、相互および／またはポリカチオンと架橋したキャリヤータンパク質のマトリックス内に捕捉され、好ましくは抗原はマトリックスに有意に共有結合していない。コンジュゲートワクチン組成物においては、意図的に抗原をキャリヤータンパク質と反応させ、したがって抗原とキャリヤータンパク質は互いに共有結合している。望ましくは、キャリヤータンパク質はヘルパーＴ細胞が認識するエピトープを含む。“キャリヤータンパク質”の定義には、複数の反応部位をもつ分枝ペプチドである多抗原ペプチド(multi-antigenic peptide)（ＭＡＰ）も含まれる。望ましくは、ＭＡＰはリジン（Ｌｙｓ）残基を含む。代表的な望ましいキャリヤータンパク質には毒素およびトキソイド（化学的または遺伝的）が含まれ、それらはたとえば反応原性(reactogenicity)が低下するように変異していてもよい。適切なキャリヤータンパク質には、たとえば下記のものが含まれる：ジフテリア毒素もしくはその無毒性変異体、たとえばジフテリアトキソイド、破傷風毒素もしくはその無毒性変異体、たとえば破傷風トキソイド、緑膿菌外毒素Ａもしくはその無毒性変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ、および関連分子）、髄膜炎菌の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌易熱性エンテロトキシン、志賀毒素様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌の全細胞からのタンパク質抽出物、炭疽菌の防御抗原の優性ネガティブインヒビター（ＤＮＩ）変異体、または大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼ、あるいは架橋して目的とする抗原を捕捉できるマトリックスを形成できる他のいずれかのタンパク質。

本明細書中で抗原に関して用いる用語“捕捉された”は、抗原とキャリヤータンパク質およびポリカチオンとの、特に架橋してマトリックスを形成したキャリヤータンパク質（場合によりポリカチオン分子とも架橋）との、会合または複合体形成を意味する；マトリックスは抗原と会合または複合体形成し、それにより抗原は生理的条件下でキャリヤータンパク質およびポリカチオンとの複合体の状態を維持する。望ましくは、抗原は、抗原とキャリヤータンパク質／ポリカチオンとの間に有意の共有結合が存在しない状態で、キャリヤータンパク質およびポリカチオンとの複合体内に捕捉される。本明細書中で用いる“有意の共有結合が存在しない”は、５０％を超える抗原がキャリヤータンパク質と共有結合してはいないことを表わす。望ましくは、４０％を超える抗原、３０％を超える抗原、２０％を超える抗原、１０％を超える抗原、望ましくは、５％を超える抗原がタンパク質マトリックスワクチン組成物においてキャリヤータンパク質またはポリカチオンに共有結合してはいない。以下の開示内容から認められるように、タンパク質マトリックスワクチンを設計および製造する目的は、コンジュゲートワクチンの主な特徴である、抗原をキャリヤーに化学的に連結させる面倒な作業を避けることである。タンパク質マトリックスワクチンにおいて、抗原は、キャリヤーへのコンジュゲーションによってではなく、架橋マトリックス内に捕捉されることによって、実際に抗原のキャリヤータンパク質への架橋またはキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスへの架橋の可能性が避けられる程度にキャリヤーと会合している。タンパク質マトリックスワクチンの製造方法においては、架橋させる予定のマトリックス成分の混合物に抗原を含有させるが、意図的に抗原を架橋反応に関与させないか、あるいは少なくとも有意量の架橋に関与させない。しかし、抗原の存在下でのタンパク質マトリックス形成の実施により抗原がキャリヤータンパク質マトリックス（または、本発明の１態様においては、キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス）に捕捉された状態になり、有意に架橋することはない。

“感染”とは、対象に微生物、たとえば細菌、真菌、寄生生物、またはウイルスが侵入することを意味する。感染は、たとえば対象の身体内もしくは身体上に普通に存在する微生物の過度の増殖、または対象の身体内もしくは身体上に普通は存在しない微生物の増殖を含むことができる。望ましくないほど（たとえば発病するほど）過剰の微生物集団が対象の身体内もしくは身体上に存在する場合、あるいは微生物集団（単数または複数）の存在が細胞に損傷を与え、または対象の組織に病的症状を引き起こしている場合、その対象は微生物感染症に罹患している。

“感染因子”とは、感染症を引き起こす微生物を意味する。
用語“免疫原性”は、対象において免疫応答を誘発する化合物を表わす。望ましくは、免疫応答はＩｇＧ抗体の産生を伴なうＴ細胞依存性免疫応答である。

用語“微生物莢膜ポリマー”は、微生物の莢膜外被の中または上に存在するポリマーを表わす。望ましくは、微生物莢膜ポリマーは有機ポリマー、たとえば多糖類、ホスホ多糖類、Ｎ−アセチル置換されたアミノ糖を含む多糖類、スルホニル化された糖を含有する多糖類、他のスルフェート修飾された糖類、もしくはホスフェート修飾された糖類、ポリアルコール、ポリアミノ酸、テイコ酸(teichoic acid)、またはリポ多糖類のＯ側鎖である。

“モノマー”は、同様なモノマーと２以上の結合を形成して、“ポリマー”の一部である場合はしばしば反復モノマー部分構造をもつ鎖または一連の枝分かれした結合鎖を生成することができる、分子構造体を表わす。

“有機ポリマー”は、それぞれが炭素、酸素、水素もしくは窒素原子、またはホスフェートもしくはスルフェート部分から構成されるモノマーが共有結合したものから構成されるポリマーを表わす。望ましくは、有機ポリマーは多糖類、ホスホ多糖類、Ｎ−アセチル置換されたアミノ糖を含む多糖類、スルホニル化された糖を含有する多糖類、他のスルフェート修飾された糖類、もしくはホスフェート修飾された糖類、糖類、ポリアルコール、ポリアミノ酸、テイコ酸、またはリポ多糖類のＯ側鎖である。

“ポリアルコール”は、水素化された形態の炭水化物であって、カルボニル基が還元されて第一級または第二級ヒドロキシル基になったものを意味する。代表的なポリアルコールは下記のものである：ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、たとえばポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、これにはポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）およびポリプロピレングリコールが含まれる；ポリ−ビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリエチレン−ｃｏ−無水マレイン酸；ポリスチレン−ｃｏ−無水マレイン酸；デキストラン、これにはカルボキシメチル−デキストランが含まれる；セルロース、これにはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが含まれる；キトサン水解物；デンプン、たとえばヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプン；グリコーゲン；アガロースおよびその誘導体；グアーガム；プルラン；インスリン；キサンタンガム；カラゲニン；ペクチン；アルギン酸水解物；ソルビトール；下記のもののアルコール：グルコース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、グロース、キシロース、トレオース、ソルボース、フルクトース、グリセロール、マルトース、セロビオース、スクロース、アミロース、アミロペクチン；またはモノプロピレングリコール（ＭＰＧ）。

“ポリアミノ酸(poly amino acidまたはpolyamino acid)”は、少なくとも２つのアミノ酸がペプチド結合により連結したものを意味する。望ましくは、ポリアミノ酸は反復アミノ酸配列を含むペプチド、または同一アミノ酸の鎖（すなわちホモポリマー）である。

“ポリカチオン(polycationまたはpolycationic)”は、多数の正電荷を保有するいずれかの高分子イオンを表わす。望ましくは、ポリカチオンは遊離アミン基をもつ；たとえばポリアミノ酸であるポリ−Ｌ−リジン。遊離アミン基を含む他の代表的な望ましいポリカチオンには、下記のものが含まれる：天然ポリマー、これにはたとえばキトサン（β−（１−４）−連結した２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮ）および２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮＡｃ）のコポリマー）が含まれ、これはＧｌｃＮ残基上に遊離アミン基を含み、これが架橋してカチオンとして作用することができる；および遊離アミン基を含む市販の合成ポリマー、たとえば分枝ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミンＮ７（ＣＡＳ ２９３２０−３８−５）およびエチレンジアミノメチルポリスチレン（ＣＡＳ １７７９８７−９３−８）。

“ポリ−Ｌ−リジン”および“ＰＬＬ”とは、α−ポリ−Ｌ−リジン（アルファ−ポリ−Ｌ−リジン；αＰＬＬ）、ε−ポリ−Ｌ−リジン（イプシロン−ポリ−Ｌ−リジン；εＰＬＬ；ポリ［イミノ［（２Ｓ）−２−アミノ−１−オキソ−１，６−ヘキサンジイル］］）、またはその組合わせおよびコポリマーを意味する。ポリ−Ｌ−リジンのリジン残基は、カルボキシル基とアルファ（α−ＰＬＬ）またはイプシロン（ε−ＰＬＬ）アミン基のいずれかとの間のペプチド結合により連結している。望ましくは、ポリ−Ｌ−リジンはα−ポリ−Ｌ−リジンである。α−ポリ−Ｌ−リジンは化学合成され、種々の分子量、たとえば０．５〜３００ＫＤａで得ることができる。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、必須アミノ酸であるＬ−リジンの小型の天然ホモポリマーであり、細菌発酵により産生される；たとえば、ε−ポリ−Ｌ−リジンはストレプトマイセス・アルブラス(Streptomyces albulus)から単離でき、約４０００Ｄａの平均分子質量をもつ。

本発明に関して“タンパク質マトリックス”は、タンパク質分子の架橋により形成されたマルチマー構造体であり、同じタンパク質分子内の２つの部位の間に、または異なるタンパク質分子上の２つの部位の間に、連結または直接結合を形成している。本発明に関して“キャリヤータンパク質マトリックス”は、キャリヤータンパク質について行われた架橋反応により形成されたタンパク質マトリックスを表わし、その際、架橋は同じキャリヤータンパク質分子内の反応部位の間で（分子内ループまたはフォールド構造が生成する）、または異なるキャリヤータンパク質分子上の反応部位の間で（キャリヤータンパク質ポリマーが生成する）形成される。本明細書中で用いる用語“キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス”は、キャリヤータンパク質とポリカチオンの混合物中で実施される架橋反応により形成されたタンパク質マトリックスを表わし、その際、架橋は少なくともキャリヤータンパク質分子内または分子間で起き（キャリヤータンパク質マトリックスが生成し、それがポリカチオンをマトリックス内に捕捉する可能性がある）、あるいは架橋はキャリヤータンパク質分子内または分子間だけでなくポリカチオン分子内または分子間でも起きる（架橋したキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンモノマーを含むマトリックスが生成する）。タンパク質マトリックスを形成する際の架橋度は、架橋反応体の慎重な選択、およびモノマー成分上の架橋に用いられる反応部位の考慮、架橋反応に用いる架橋剤の量の制御、反応時間の制御、ならびに反応部位をブロックするかまたは架橋反応を停止させる試薬の使用によって制御できる。そのようなパラメーターの制御は、捕捉できる抗原の量、捕捉された抗原がタンパク質マトリックス／抗原複合体から解離できる速度、および形成されるタンパク質マトリックス粒子のサイズに影響を及ぼすであろう。これらの性質はすべて、本発明のタンパク質マトリックスワクチン組成物の免疫原性に影響を及ぼす。

用語“シッフ塩基を還元する”は、アゾメチンまたは式Ｒ_１Ｒ_２Ｃ＝Ｎ−Ｒ_３の化合物（式中のＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、一般に炭素原子を含有する化合物部分構造体である）を、シッフ塩基の二重結合を水素原子で飽和する還元剤に曝露することを表わす。化学的還元の方法は当業者に既知である。

本明細書中で抗体またはそのフラグメントに関して用いる用語“特異的に結合する”は、特定の抗原、たとえばタンパク質またはそのセグメントに対するある抗体またはそのフラグメントの親和性が、等量の他のいずれかの抗原に対するものと比較して高いことを意味する。抗体またはそのフラグメントは、望ましくは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの標準法を用いて測定して、それの抗原に対して、関連抗原を含めた等量の他のいずれかの抗原に対するより少なくとも２倍、５倍、１０倍、３０倍、または１００倍高い親和性をもつ。

“対象”とは、微生物が感染する可能性のある動物を意味する。望ましくは、対象は哺乳動物、たとえばヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマである。ヒト対象は、成人、小児、乳児、幼児、または青年期前の子供であってもよい。

“Ｔ細胞−非依存性抗原”は、ヘルパーＴリンパ球の協力作用なしで抗体を産生する抗原を表わす。Ｔ細胞−非依存性抗原は、Ｔリンパ球の協力作用なしでＢリンパ球を直接刺激することができる。代表的な望ましいＴ細胞−非依存性抗原には、莢膜抗原であるポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、アルギン酸（アルギネート）、デキストラン、多糖類（ＰＳ）、ポリアミノ酸、ポリアルコール、および核酸が含まれる。

用語“ワクチン”、“ワクチン組成物”、および“免疫原組成物”は、本明細書中で、目的とする抗原を含有するいずれかの組成物であって、脊椎動物対象に投与した際に対象においてその抗原に対する免疫応答を誘発する組成物を表わすために用いられる。本発明の目的は、防御免疫応答を誘発できる（すなわち、ワクチン接種された対象を、ワクチンに含有される抗原を自然に保有する病原体に対して保護することができる）ワクチンを提供することであるが、たとえば単回投与後の防御免疫化は本明細書中で用いる用語“ワクチン”または“ワクチン組成物”に固有の性質ではない。

本発明のタンパク質マトリックスワクチン組成物は、免疫応答を誘発することを意図した抗原とマトリックスを形成するために用いるキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンとの間の共有結合を必要としない。これは、コンジュゲートワクチン技術と比較してタンパク質マトリックスワクチン組成物の製造を有利に簡略化し、その結果、それらの製造経費を低減する。多糖（ＰＳ）−タンパク質コンジュゲートワクチンは、製造および開発途上地域での販売ができないほど経費がかかることが立証された。一般的なコンジュゲートワクチンは、各ワクチンに要求される著しく特殊化された化学操作ならびにＰＳ抗原およびキャリヤータンパク質の両方の製造および精製の経費のため、低価格で製造するのが困難である。

本発明によるワクチン組成物は、これまで難治性であった抗原に対する免疫を安全に誘発できるワクチンを求める要望に対処する。本明細書に記載するワクチン組成物は１価（免疫応答を誘発する単一の抗原をもつ）または多価（多重免疫応答を誘発する多数の抗原をもつ）であってよい。

他の用語の意味は、それらが出現する状況によって理解され、あるいは有機化学、薬理学、微生物学、タンパク質生化学、および免疫学の分野の専門家を含めた当業者が理解しているように解釈されるであろう。

本発明は、（１）１種類以上の目的とする抗原、（２）１種類以上のキャリヤータンパク質、および（３）１種類以上のポリカチオンを含む免疫原組成物であって、キャリヤータンパク質および／またはポリカチオンが架橋してタンパク質マトリックスを形成し、目的とする抗原がそのタンパク質マトリックスにより捕捉されている組成物に関する。そのような組成物は、抗原、キャリヤータンパク質およびポリカチオン成分を混合し、次いで架橋反応を開始してキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンを架橋させることによって、容易に調製できる。タンパク質マトリックスワクチン製造方法の別態様において、成分の添加順序を変更できるが、一般に、目的とする抗原を添加する前に架橋タンパク質マトリックスが形成されると、希望する捕捉は行なわれず、抗原は解離した状態のままである。好ましい態様においては、ポリカチオンおよび多糖抗原を一緒にインキュベートし、続いて架橋剤を添加し、続いてキャリヤー（マトリックス形成）タンパク質を添加する。ポリカチオン、たとえばα−ＰＬＬを含有する、本発明によるタンパク質マトリックスワクチン組成物は、タンパク質マトリックス中への抗原の捕捉を改善し、その結果、抗原単独またはポリカチオンを含有しないタンパク質マトリックスワクチン組成物と比較して免疫原性が向上する。

本発明は特に、ポリカチオンを含有するタンパク質莢膜マトリックスワクチン組成物、ならびにそのような組成物を調製および投与して、抗原、特にＴ細胞−非依存性抗原、または普通は弱い免疫応答を誘発する抗原、たとえば多糖類（ＰＳ）、ポリアルコール、ポリアミノ酸、および他の有機ポリマーに対する免疫をもたらす方法を特徴とする。本発明のワクチン組成物は、典型的なＰＳ−タンパク質コンジュゲートワクチンがもつ有効な免疫学的特性を備えているが、目的とする抗原、たとえばＰＳまたは莢膜有機ポリマーをキャリヤータンパク質／ポリカチオンにカップリングさせるために有意の共有原子結合が必要ないという点で、コンジュゲートワクチンとの望ましい相異がある。むしろ、目的とする抗原、たとえばＰＳまたは莢膜有機ポリマーは、キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス内に捕捉されている。たとえば、タンパク質マトリックスは、可溶性抗原、たとえばＰＳまたは莢膜有機ポリマーの存在下で、キャリヤータンパク質分子がそれ自体、他のキャリヤータンパク質分子、および／またはポリカチオンに、共有結合架橋することにより形成できる。互いに高度に架橋したキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンはマトリックスを形成し、それが抗原を捕獲（捕捉）し、抗原提示細胞によるその抗原の取込みを助成し、その結果、Ｂ細胞による抗体産生を刺激することができる。本明細書中で立証するように、マトリックス内への抗原捕捉レベルはポリカチオン、たとえばポリ−Ｌ−リジンの添加によって増大し、その結果、ＰＣＭＶ粒子の収率が改善され、これによって、抗原単独、またはポリカチオンを用いない抗原／タンパク質マトリックス複合体と比較して、ＰＣＭＶ組成物の免疫原性が増大する。

概念として、キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスは、抗原を内包した“メッシュ”の形で見ることができる；あるいは一連の“ストリング上ビーズ”の形で見ることができ、この形態では抗原が“ストリング”であり、タンパク質または架橋したタンパク質／ポリカチオンが“ビーズ”である。キャリヤータンパク質が抗原を取り囲んで抗原の周囲にリングを形成していれば、あるいは抗原を内部に絡ませた三次元メッシュを形成していれば、その抗原はキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス内に捕捉されている。抗原の捕捉によって望ましい量の抗原が抗原キャリヤーと会合した状態になり、抗原をキャリヤータンパク質に共有結合させる有意の架橋が起きることはない。十分な量の抗原、および／または捕捉によるキャリヤーとの会合の持続性によって、タンパク質マトリックスワクチンは抗原単独またはキャリヤータンパク質と混合しただけの抗原による免疫化と比較して増強した免疫原性を示すことができる。本発明によるタンパク質マトリックスワクチン組成物は、抗原がキャリヤーに共有結合した市販のコンジュゲートワクチンに匹敵する免疫原性を達成することが示された。

望ましい態様において、キャリヤータンパク質および／またはポリカチオンの分子が共有結合により架橋する。たとえば、共有結合はリジン側鎖（たとえば、ポリ−Ｌ−リジン上の）の第一級アミノ基とアスパルテートまたはグルタメート側鎖（たとえば、キャリヤータンパク質上の）のカルボキシ基との間のペプチド結合を含むことができる。他の望ましい態様において、下記の架橋剤を用いて共有結合架橋を開始することができる；式ＯＨＣ−Ｒ−ＣＨＯの化合物：式中のＲは、炭素原子１〜１２個の線状または分枝した二価アルキレン、原子１〜１２個の線状または分枝した二価ヘテロアルキル、炭素原子２〜１２個の線状または分枝した二価アルケニレン、炭素原子２〜１２個の線状または分枝した二価アルキニレン、炭素原子５〜１０個の二価芳香族基、原子３〜１０個の環系、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｑＣＨ_２ＣＨ_２−（式中のｑは、１〜４、または２つのアルデヒド基を連結する直接化学結合である）である。好ましい態様において、共有結合は、架橋剤としてグルタルアルデヒド、あるいはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、もしくはビス−ビアゾ化ベンジジン(bis-biazotized benzidine)、スベリン酸ビス［スルホスクシンイミジル］、またはアジプイミド酸ジメチルを使用できる。タンパク質マトリックスワクチン組成物の形成に必要ではないが、たとえば抗原上に存在する可能性のあるブロックされていない反応基または末端のアミノ基もしくはカルボキシル基もしくはヒドロキシル基のため、架橋したキャリヤータンパク質マトリックスの形成に付随する程度に、目的とする抗原がキャリヤータンパク質に共有結合してもよい。一般に、キャリヤーへの抗原の共有結合はタンパク質マトリックスワクチンの形成に際して目的ではない。本発明の目的に関して、タンパク質マトリックスワクチンは、５０％を超える抗原がキャリヤータンパク質に共有結合してはいないワクチン組成物である。付随する抗原架橋の量は、抗原中の架橋反応に関与する可能性のある部位の割合を考慮することにより、すなわち使用する架橋剤（単数または複数）の反応基、使用する試薬（単数または複数）または他の反応体（たとえば、キャリヤータンパク質、ポリカチオン）の反応性基の量、および架橋反応を完了まで進行させるかどうか（たとえば、全部の架橋剤が反応中に消費されるかどうか）を考慮に入れることにより、化学量論的に計算できる。タンパク質マトリックスワクチン組成物中の架橋した抗原の量は、たとえばＰＣＭＶ組成物を炭水化物／リジン架橋について質量分析することによっても測定できる。

望ましい態様において、抗原とキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスは非共有結合により会合している。そのような非共有結合性の会合は、疎水性相互作用、イオン相互作用、ファン-デル-ワールス力、または水素結合を伴なうことができる；あるいは、マトリックスからの抗原の解離が阻止または遅延されるように、抗原が物理的または立体的にタンパク質マトリックス内に内包されてもよい。非共有結合性の会合には、抗原とタンパク質複合体を非共有結合により会合（捕捉）する物理幾何学的構成を含めることができる（すなわち、前記の“ストリング上ビーズ”のように）。

本発明のワクチン組成物は、多数の可能なリンカーのいずれかを用いて、多数の可能なキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンのいずれかを、いずれかの目的とする抗原の存在下で架橋させて製造できる。代表的な好ましいリンカー、キャリヤータンパク質、ポリカチオンおよび目的とする抗原について、本明細書中で述べる。

多糖類（ＰＳ）は、糖類(saccharide、sugar)のポリマーである。微生物莢膜に由来するＰＳは、莢膜を備えた細菌性病原体、たとえば髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、サルモネラ・チフィおよびＢ型インフルエンザ菌に対する防御免疫に関与する主要な抗原性成分である。微生物多糖類に基づくワクチンによる青年および成人の免疫化は疾患負荷を軽減するのに成功しているが、乳児および小児（すなわち、２４か月齢未満の子供）に防御免疫を付与するには有効性がより低いことが立証された。小児は成熟した適応免疫レパトアがまだ発達しておらず、そのような若いワクチン受容者では莢膜ＰＳのようなＴ細胞−非依存性抗原は免疫原性が低く、長期防御免疫応答(すなわち免疫記憶応答)をもたらさない。

Ｔ細胞−非依存性抗原、たとえば多糖類は、多糖類をタンパク質に化学的カップリングさせることによりＴ細胞依存性抗原に変換できる。“コンジュゲーション”として知られるこの処理は、多糖構造中の原子と“キャリヤー”タンパク質中に存在するアミノ酸の側鎖原子との共有結合の形成を伴なう。そのような“コンジュゲートワクチン”は、より効果的にＢ細胞成熟およびアイソタイプスイッチの誘導を促進し、適正な抗ＰＳ防御プロフィールを備えた、より高いレベルの抗体をもたらす。防御抗体はそれらの多糖抗原に対して高い親和性をもち、一般に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスのもの、すなわち補体結合およびオプソニン化エフェクターの活性を備えた持続性抗体である。

Ｔ細胞−非依存性抗原は一般に、持続性免疫、すなわちＩｇＧ抗体産生を刺激しない；しかし、より効力が低く、より結合性が弱く、より一過性であるＩｇＭ抗体の産生を刺激することができる。したがって、多糖抗原単独では一般にＩｇＧの追加免疫応答は発生しない。しかし、ＰＳ−タンパク質コンジュゲートで一次免疫化を行なうと、そのコンジュゲートによって誘導された記憶細胞が既にＩｇＧを産生するようにプログラミングされているので、多糖類は追加免疫応答を発生させる。実際に、ワクチン接種された動物またはヒトにおける追加免疫応答は、ＰＳを提示する微生物に曝露されたことによる防御応答を模倣すると考えられる；この長期記憶は、免疫化された対象にその免疫化後に長年にわたってワクチンが防御免疫を付与するように作動するためにきわめて重要である。したがって、ＰＳ−タンパク質コンジュゲートは、（１）それらがＰＳ抗原に対する高レベルのＩｇＧを誘導する能力、および（２）それらがＰＳ抗原に対する記憶免疫応答を誘導する能力について価値がある。多糖抗原は一般に単独ではこれらの特性を示さず、したがって抗原としては劣る。コンジュゲートワクチン合成の難しさおよびそれらの製造経費により、多糖抗原に対する防御免疫応答が求められている多くの細菌性疾患についてコンジュゲートワクチンの開発が遅れている。

他のＴ細胞−非依存性抗原には、アミノ酸ホモポリマー、たとえばポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、およびポリアルコールが含まれる。大部分のバイオポリマーはＴ細胞−非依存性抗原である。ポリマーは、それらの化学構造の反復性（したがってエピトープ）のためそれらを認識するＢ細胞上の免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体を架橋することができる。したがってポリマーは、多糖類が行なうのと同じ様式で、抗ポリマーＩｇＭの産生のためにＢ細胞を活性化することができる。たとえば、炭疽菌のアミノ酸ホモポリマーであるポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ）は莢膜ポリマーであり、免疫原性が弱く、同様にＴ細胞−非依存性抗原である。タンパク質キャリヤーにコンジュゲートしたＰＧＡから構成されるワクチンは免疫原性が高く、抗ＰＧＡ ＩｇＧ、およびＰＧＡに対する免疫記憶を誘導できる。このように、大部分のポリマーはプロセシングされてＭＨＣ−ＩＩ関連で提示されることができず、そのためＴ細胞の援助を動員できないので、それらの免疫原性に関してＰＳと同様に応答する。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれる他のクラスの受容体と相互作用する幾つかの天然ポリマーにおいて例外が見出された。ＴＬＲは、いったん活性化されると、宿主細胞によるサイトカイン類の産生を誘導し、適応免疫応答の変化を発生させることができる。あるＰＳはＴＬＲリガンドに共有結合し、あるいはそのようなリガンドと混在する。たとえば、リポ多糖類（ＬＰＳ）は免疫原性の高いＰＳであり、ＩｇＧおよび記憶応答を誘導する；ＬＰＳの脂質Ａ部分はＴＬＲリガンドであり、免疫学的特性に関与する可能性がある。

一般的なコンジュゲートワクチンは、ＰＳ抗原およびキャリヤータンパク質の両方の製造および精製ならびにそれぞれの多糖−タンパク質コンジュゲーションに伴なう特殊な化学操作の経費のため、低価格で製造するのが難しい。通常、コンジュゲーション化学操作を妥当なカップリング効率で実施できるためには、その前に両方ともかなり純粋である必要がある。一般に、各種ＰＳおよび選択したキャリヤータンパク質について、そのＰＳの化学操作に独自のカップリング化学を特別に開発しなければならない。このカップリング化学によりＰＳに官能基が導入され、これらが次いで一般にリジン残基のイプシロン−アミノ側鎖によりキャリヤータンパク質に連結することができる。そのようなカップリング基を導入するためのＰＳの化学修飾は、ＰＳ上のエピトープを破壊して新たなエピトープ（たとえば、リンカーまたは修飾された糖基に関連するもの）を導入する可能性があり、その重大性は慎重な免疫分析によってしか評価できない。さらに、一般的なＰＳ−タンパク質コンジュゲートワクチンについて、ＰＳのサイズ、タンパク質キャリヤー分子当たり結合するＰＳ分子の数、選択したキャリヤーの性質、および連結化学のタイプはすべて、コンジュゲートワクチンの免疫原性に影響を及ぼす可能性がある。したがって、たとえば９０＋の既知の血清型がそれぞれ異なるＰＳ構造をもつ肺炎球菌性疾患(Bentley et al., PLOS Genetics 2(3):e31 262-269, 2006)の場合、ひとつのコンジュゲーション方法がすべての血清型に適切というわけではない。再現性のある免疫学的特性をもつコンジュゲートワクチンを再現性をもって合成するには、ＰＳのサイズ、タンパク質キャリヤー分子当たり結合するＰＳ分子の数、選択するキャリヤーの性質、および連結化学のタイプの慎重な制御を伴なう。これにより、コンジュゲートワクチンの製造経費は著しく増加する。

抗生物質耐性の出現は、安全で有効なワクチンの開発の緊急性を強調している。特に開発途上国の人々にワクチンが広く使えるようにするために、ワクチンの製造は経費効率が高いことも要求される。１種以上の細菌の異なる血清型に由来する多数の多糖抗原に対する組合わせコンジュゲートワクチンを小児免疫化計画に組み込むことは、その高リスク集団におけるワクチン投与を簡単にするであろう。しかし、現在のコンジュゲートワクチン技術は経費効率が低く、したがって高価格であるため、組合わせコンジュゲートワクチンを開発途上地域に配布するのは実質的に不可能である。

望ましい態様において、本発明の免疫原ワクチン組成物は、１以上の細菌莢膜成分が架橋キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス内に捕捉された、タンパク質莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）である。目的とする抗原、たとえば細菌莢膜多糖類を加水分解してより小さなフラグメントにする必要がなく、かつ多数の抗原を同時にタンパク質マトリックス内に捕捉できるので、ＰＣＭＶはコンジュゲートより容易に製造できる。

本発明のワクチンを製造する方法は目的とする抗原、たとえば莢膜多糖類の化学的特性を何ら知る必要がないので、本方法は目的とする抗原およびキャリヤータンパク質の化学的特性と適合する架橋化学を開発する必要性に依存しない。若干の抗原が架橋剤と相互作用する可能性はあるが、目的とする抗原とキャリヤータンパク質の意図しない架橋はコンジュゲートと同様な免疫学的特性をもつと予想されるので、これがワクチンの有効性を損なうはずはない。しかし、本発明のワクチンにおいて、キャリヤータンパク質への目的とする抗原の架橋は、ワクチンが免疫学的に有効であるための必要条件ではない。これは一般的なコンジュゲートワクチンと著しく対照的である。本発明のワクチンは、望ましくは少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに１００％のキャリヤータンパク質が架橋しており、目的とする抗原の５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％より多量がキャリヤータンパク質に架橋することはない。望ましくは、目的とする抗原の１０％より多量がキャリヤータンパク質に架橋することはなく、少なくとも５０％のキャリヤータンパク質が架橋している。

本明細書に述べるように、ポリカチオンを含有するタンパク質マトリックスワクチン組成物は、抗原単独、単純な抗原／キャリヤー混合物からなる組成物と比較して、また本発明の教示によるポリカチオンを含有しない抗原／タンパク質マトリックスワクチン組成物と比較してすら、増大した抗原捕捉、およびそれに対応する、より高い免疫原性をもつ。本明細書中で述べるように、細菌の多糖莢膜は反復する糖類から構成され、多くの病原性細菌の莢膜は負に荷電している。負電荷は、電荷反発により、またはより大きなより阻害性の莢膜を提示することによって、宿主の免疫細胞によるファゴサイトーシスを阻止するのを補助できる。Weinger et al., PLosPathogens, 5: 1-9 (2009)。この同じ電荷反発がマトリックスタンパク質（単数または複数）についても起きて、多糖の捕捉が低くなる可能性がある。この負電荷に対抗するために、ポリカチオン、たとえばポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）をＰＣＭＶ反応物に添加することができる。たとえば、本明細書中で述べるように、０．０４％のα−ＰＬＬをＶｉ−ＣＲＭ１９７ ＰＣＭＶ反応物に添加すると、Ｖｉ多糖の捕捉が５％から＞２０％にまで増大した（図１）。

粒度を制御することによってタンパク質マトリックスワクチンの免疫原性を改善することができる。本発明の望ましい態様において、抗原／キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス複合体は直径５０ｎｍを超える平均粒度をもつ。希望するサイズの粒子をいずれか適切な手段で分画することができ、これにはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、続いてより大きなサイズの粒子のプール、そしてより小さいサイズの粒子および／または捕捉されていない多糖類の廃棄が含まれる。あるいは、より小さいサイズの粒子を除去する一方で希望するサイズの粒子を保持するように十分に選択された分子量カットオフをもつフィルターメンブレンの使用を採用できる。より低い分子量の分子種（たとえば、直径＜５０ｎｍの分子種）の排除、または少なくとも直径５０ｎｍより大きい粒度を含む組成物タンパク質マトリックス粒度の選択は、当技術分野で既知のいずれかの手段、たとえばクロマトグラフィーにより達成でき、それにはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィー、またはゲル透過クロマトグラフィーが含まれる。ゲル電気泳動法も使用できる。

本明細書に記載するワクチンの製造方法の結果として、目的とする抗原、たとえば莢膜ポリマーが過度に修飾されることはない。抗原は一般に同じ状態を維持し、可能性のある修飾は、たとえばポリマー鎖の末端に還元性の基を保有するＰＳ莢膜に関する還元性糖類の還元である。そのようなわずかな修飾が大部分の莢膜ＰＳの免疫原性に影響を及ぼす可能性はない；末端の糖類の量はポリマーの内部残基より１００〜１０，０００倍少ないからである。これと対照的に、一般的なコンジュゲートワクチンについては、通常は抗原、たとえば莢膜ポリマーに、キャリヤータンパク質の共有結合点として作用するリンカー基を導入する必要がある。たとえば、反応基をＰＳに導入すると莢膜エピトープが破壊されて新たなエピトープが生成する可能性があり、それらはホストの自己エピトープとそれらの免疫交差反応性が未知であるためワクチン製品には望ましくない場合がある。

本明細書に記載するワクチンの製造方法は、それの化学操作がキャリヤータンパク質（たとえば、ＤＮＩ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドもしくはフラグメントＣ、または大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼ）および／またはポリカチオン（たとえば、α−ポリ−Ｌ−リジンおよびε−ポリ−Ｌ−リジン）の架橋化学のみに依存するので、コンジュゲートワクチン技術より簡潔である。たとえば、莢膜ポリマーはＤＮＩと混合されると架橋速度に影響を及ぼすが、架橋のパターンまたは程度には影響を及ぼさない；それは、使用するタンパク質、それの濃度、および添加する架橋剤（たとえば、グルタルアルデヒド）の濃度によってより大きく支配される。これらのパラメーターは容易に調整でき、それによってワクチン製造に要求される時間および労力が低減し、経費が節約される。

本明細書に記載するＰＣＭＶ組成物の製造方法は、いずれかの抗原、たとえば莢膜ポリマーまたはいずれかのバイオポリマー（アミノ基を含むとしてもわずか）、ならびに架橋できるいずれかのキャリヤータンパク質および／またはポリカチオン、たとえば架橋または化学的還元に際して破壊される可能性のある重要なエピトープをもたないキャリヤータンパク質について使用できる。本明細書に記載する方法に使用できるキャリヤータンパク質は、望ましくは化学修飾によりブロックされておらず架橋できる少なくとも２つのリジン残基または他の残基をもつ。破傷風トキソイドは、使用できるキャリヤータンパク質のひとつである。この毒素はホルムアルデヒド、すなわちタンパク質のアミノ基と反応する試薬で処理することによって無毒性にされる。他の望ましいキャリヤータンパク質には、コレラ毒素Ｂサブユニット(SBL Vaccin ABから入手できる)、ジフテリアトキソイドもしくはＣＲＭ１９７、破傷風トキソイドもしくはフラグメントＣ(Sigma Aldrichから入手できる)、ＤＮＩ、または大腸菌由来のベータ−ガラクトシダーゼ(Sigma Aldrichから入手できる)が含まれる。

現在の多価コンジュゲートワクチンは、個々のコンジュゲートワクチンをまず合成し、続いてそれらを混合して“カクテル型”コンジュゲートワクチンを調製することにより製造される（たとえば、Wyeth７価肺炎球菌ワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）−７、GlaxoSmithKlineの１０価肺炎球菌ワクチンＳｙｎｆｌｏｒｉｘ（登録商標）、およびPfizerの１３価ワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）−１３）。本発明のワクチンの製造方法は、キャリヤータンパク質および／またはポリカチオンを、たとえばグルタルアルデヒドその他の架橋剤で架橋する前に、化学的に異なる抗原、たとえば莢膜有機ポリマーを一緒に混合することにより、あるいは個別に合成した本発明の個々のワクチンを混合することにより、多価ワクチンの製造に使用できる。この融通性は一般的な多価ワクチン製造方法に優る著しい利点をもたらし、製品の価格がかなり低くなるはずである。

実施例中に述べる代表的な本発明ワクチンは、これらのワクチンが抗原分子とキャリヤータンパク質の間に何らか共有結合を生成しないと推定される方法により合成されたという事実にもかかわらず、コンジュゲートワクチンに匹敵する性能を示した。グルタルアルデヒドは主に、リジン残基のイプシロンアミノ基により代表されるタンパク質アミノ側鎖と反応する。多糖抗原は本質的にグルタルアルデヒドおよび他のアルデヒド作用試薬とは非反応性である；それらは、グルタルアルデヒドまたはアルデヒド作用架橋剤（たとえば、前記で述べたＯＣＨ−Ｒ−ＣＨＯ）と反応する遊離アミノ基をほとんど含まないからである（アミノ側鎖はいずれも一般にアセチル化されている）。したがって、そのような抗原はＰＣＭＶ形成に好適であり、その際、キャリヤータンパク質に直接架橋する抗原は５０％未満である。後記の実施例にみられるように、コンジュゲート対照と比較して優れているＰＣＭＶにより発生する免疫応答は、ＤＮＩタンパク質分子の架橋マトリックス内にＰＳ分子が分子として捕捉されたことの指標となる。

限定ではないモデルによれば、捕捉はタンパク質マトリックスワクチン組成物をＢ細胞に送達する作用をもち、Ｂ細胞はポリマー抗原を認識するＩｇ受容体によりそのようなマトリックスを結合する。これらのＢ細胞内にいったん取り込まれると、マトリックスは一般的なコンジュゲートワクチンと同様な様式で分解し、その結果、キャリヤータンパク質由来のペプチドが生成し、それがＢ細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。次いでこれによりヘルパーＴ細胞が動員され、こうしてそのようなＢ細胞が増殖および成熟し、その抗原に対して特異的なＩｇＧを産生する形質細胞および“記憶”細胞になる。このように、限定ではないモデルによれば、ＰＣＭＶは免疫学的にはタンパク質コンジュゲート莢膜ワクチンと同様に作用するが、ＰＣＭＶはキャリヤータンパク質と莢膜ポリマーの間に有意の共有結合をもたないので、別個のものである。

ＰＣＭＶを含めて本発明のワクチン組成物は、たとえば小児用ワクチン中に併用できる。さらに、本発明のワクチンは、たとえば肺炎球菌感染症、連鎖球菌（グループＡおよびＢ）感染症、Ｂ型インフルエンザ菌（“ＨｉＢ”）感染症、髄膜炎菌（たとえば、Neisseria meningitides）感染症に対してワクチン接種するために使用でき、またグラム陰性細菌（たとえば、緑膿菌、フランシセラ・ツラレンシス(Thirumalapura et al., J. Med. Microbiol. 54:693-695, 2005; Vinogradov and Perry, Carbohydr. Res. 339:1643-1648, 2004; Vinogradov et al., Carbohydr. Res. 214:289-297, 1991)、赤痢菌属菌種、サルモネラ属菌種、アシネトバクター属(Acinetobacter)菌種、ブルクホルデリア属(Burkholderia)菌種、および大腸菌）に由来するＯ抗原ワクチンとして使用できる。

本発明のワクチンは、いずれかのキャリヤータンパク質および／またはポリカチオン（たとえば本明細書に記載するもの）を架橋するためのいずれかのリンカー（たとえば本明細書に記載するもの）を、１種類以上の目的とする抗原（たとえば本明細書に記載するもの）の存在下で用いて製造できる。１種類の目的とする抗原を用いる場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンを１価であると言う。１種類より多い目的とする抗原を用いる場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンを多価であると言う。微生物莢膜のポリマーまたは多糖類が目的とする抗原である場合、本発明のタンパク質マトリックスワクチンをタンパク質莢膜マトリックスワクチン（ＰＣＭＶ）と言う。

リンカー
キャリヤータンパク質および／またはポリカチオンを架橋するのに有用な架橋剤は当技術分野で周知であり、これにはグルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。

ホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカーを用いてキャリヤータンパク質を直接架橋するための一般的な方法および部分は、たとえばG. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996)、およびDick and Beurret, “Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens”, Conjugate Vaccines (Cruse and Lewis, eds.) (Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989), vol.10, pp. 48-114に記載されている。たとえば、‘ｎ’個のリジン部分をもつキャリヤータンパク質については、理論的に、代表的な架橋剤のカルボキシル基との反応に利用できる第一級アミン（末端アミンを含めて）が‘ｎ＋１’個ある。したがって、この直接結合法を用いると、生成物は形成された‘ｎ＋１’個のアミド結合をもつものに限定される。

本発明の望ましい態様に用いるリンカーは、それの最も簡単なものでは、２つのキャリヤータンパク質を連結する結合、２つのポリカチオンを連結する結合、同じキャリヤータンパク質もしくはポリカチオンの２つの部位を連結する結合、キャリヤータンパク質とポリカチオンを連結する結合である。リンカーは線状、環状または分枝した分子骨格をもつことができ、２つのキャリヤータンパク質および／またはポリカチオン、（Ａ）および（Ｂ）に共有結合する、ペンダント基を備えている。いずれか所要のキャリヤータンパク質を１より多いキャリヤータンパク質および／またはポリカチオンに連結させ、これにより相互結合したキャリヤータンパク質／ポリカチオンのマトリックスを形成させ、それに目的とする抗原を捕捉させることができる。

用語“連結基”は、リンカー（Ｌ）の反応性部分と（Ａ）または（Ｂ）の官能基とから生成する共有結合を表わす。連結基の例には、限定ではなく、エステル、カルバメート、チオエステル、イミン、ジスルフィド、アミド、エーテル、チオエーテル、スルホンアミド、イソウレア、イソチオウレア、イミドエステル、アミジン、ホスホルアミデート、ホスホジエステル、チオエーテル、およびヒドラゾンが含まれる。

（Ａ）と（Ｂ）の連結は共有結合手段で達成され、それは（Ａ）および（Ｂ）上にある１以上の官能基との結合（連結基）形成を伴なう。この目的に使用できる化学反応性官能基の例には、限定ではなく、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、チオエーテル、グアニジニル、イミダゾリル、およびフェノール基が含まれ、これらはすべて、多くのキャリヤータンパク質中の天然アミノ酸中に存在する。

したがって（Ａ）と（Ｂ）の共有結合は、（Ａ）および（Ｂ）中に存在するそのような官能基と反応できる反応性部分を含むリンカー（Ｌ）を用いて行なうことができる。この反応により生成するのは、（Ｌ）と（Ａ）、および（Ｌ）と（Ｂ）を連結する、新たに形成された結合を含む連結基である。たとえば、（Ａ）のヒドロキシル基が（Ｌ）のカルボン酸基またはその活性化誘導体と（あるいはその逆）反応し、その結果、エステル連結基を形成することができる。

スルフヒドリル基と反応できる部分の例には、タイプＸＣＨ_２ＣＯ−（ここで、Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩ）のα−ハロアセチル化合物が含まれ、これはスルフヒドリル基に対して格別な反応性を示すが、イミダゾリル、チオエーテル、フェノール、およびアミノ基を修飾するためにも使用できる；たとえば、Gurd, Methods Enzymol., 11:532 (1967)に記載。Ｎ−マレイミド誘導体もスルフヒドリル基に対して選択的であると考えられるが、特定の条件下ではさらにアミノ基へのカップリングに有用な可能性がある。アミノ基の変換によりチオール基を導入する２−イミノチオランなどの試薬(Traut et al., Biochemistry, 12:3266 (1973))は、ジスルフィド橋の形成により連結が起きればスルフヒドリル試薬として考慮できる。

アミノ基と反応できる反応性部分の例には、たとえばアルキル化剤およびアシル化剤が含まれる。代表的なアルキル化剤には下記のものが含まれる：
（ｉ）α−ハロアセチル化合物であって、反応性チオール基の不存在下でアミノ基に対して特異性を示す、タイプＸＣＨ_２ＣＯ−のもの（ここで、Ｘ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩ；たとえば、Wong (Biochemistry, 24:5337 (1979)に記載のもの）；
（ｉｉ）Ｎ−マレイミド誘導体であって、ミカエル(Michael)タイプの反応またはアシル化のいずれかで環カルボニル基への付加によりアミノ基と反応できるもの；たとえば、Smyth et al. (J. Am. Chem. Soc., 82:4600, 1960 and Biochem. J., 91:589 (1964))に記載のもの；
（ｉｉｉ）ハロゲン化アリール、たとえば反応性ニトロハロ芳香族化合物；
（ｉｖ）ハロゲン化アルキル、たとえばMcKenzie et al. (J. Protein Chem., 7:581 (1988))に記載のもの；
（ｖ）アミノ基とのシッフ塩基を形成できるアルデヒド類およびケトン類；形成された付加物は通常は還元によって安定化されて安定なアミドになる；
（ｖｉ）エポキシド誘導体、たとえばエピクロルヒドリンおよびビスオキシラン類；これらはアミノ基、スルフヒドリル基、またはフェノール性ヒドロキシル基と反応できる；
（ｖｉｉ）ｓ−トリアジン類の塩素含有誘導体；これらは、求核体、たとえばアミノ基、スルフヒドリル基、およびヒドロキシル基に対してきわめて反応性である；
（ｖｉｉｉ）上記に詳述したｓ−トリアジン化合物に基づくアジリジン類、たとえば Ross (J. Adv. Cancer Res., 2:1 (1954))に記載のもの；それらは、求核体、たとえばアミノ基と開環により反応する；
（ｉｘ）スクアリン酸(squaric acid)ジエチルエステル、たとえばTietze (Chem. Ber., 124:1215 (1991))に記載のもの；ならびに
（ｘ）α−ハロアルキルエーテル；それらは、エーテル酸素原子により起きる活性化のため普通のハロゲン化アルキルより反応性の大きいアルキル化剤である；たとえば、Benneche et al. (Eur. J. Med. Chem., 28:463 (1993))に記載のもの。

代表的なアミノ反応性アシル化剤には下記のものが含まれる：
（ｉ）イソシアネートおよびイソチオシアネート、特に芳香族誘導体であって、それぞれ安定なウレアおよびチオウレア誘導体を形成するもの；
（ｉｉ）スルホニルクロリド、たとえば、Herzig et al. (Biopolymers, 2:349 (1964))に記載のもの；
（ｉｉｉ）酸ハロゲン化物；
（ｉｖ）活性エステル、たとえばニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル；
（ｖ）酸無水物、たとえば混合酸無水物、対称性の酸無水物、またはＮ−カルボキシ酸無水物；
（ｖｉ）アミド結合形成に有用な他の試薬、たとえば、M. Bodansky (Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984)に記載のもの；
（ｖｉｉ）アシルアジド、たとえば予め形成されたヒドラジド誘導体から亜硝酸ナトリウムを用いてアジド基を生成させたもの、たとえば、Wetz et al. (Anal. Biochem., 58:347 (1974))に記載のもの；ならびに
（ｖｉｉｉ）イミドエステルであって、アミノ基と反応した際に安定なアミジン類を形成するもの、たとえば、Hunter and Ludwig (J. Am. Chem. Soc., 84:3491 (1962))に記載のもの。

アルデヒド類、たとえばグルタルアルデヒド、およびケトン類を、アミンと反応させてシッフ塩基を形成し、それを有利には還元アミノ化によって安定化することができる。アルコキシアミノ部分はケトン類およびアルデヒド類と容易に反応して安定なアルコキシアミンを形成する；たとえば、Webb et al. (Bioconjugate Chem., 1:96 (1990))に記載。

カルボキシル基と反応できる反応性部分の例には、ジアゾ化合物、たとえばジアゾアセテートエステル類およびジアゾアセトアミド類が含まれ、それらは高い特異性で反応してエステル基を生成する；たとえば、Herriot (Adv. Protein Chem., 3:169 (1947))に記載。Ｏ−アシルウレア形成により反応し、続いてアミド結合を形成するカルボン酸修飾試薬、たとえばカルボジイミド類も使用できる。

たとえば追加の反応性または選択性を付与するために、（Ａ）および／または（Ｂ）中の官能基を所望により反応前に他の官能基に変換してもよい。この目的に有用な方法の例には、下記のものが含まれる：ジカルボン酸無水物などの試薬を用いる、アミンからカルボン酸への変換；Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、２−イミノチオラン、またはチオール含有スクシンイミジル誘導体などの試薬を用いる、アミンからチオールへの変換；α−ハロアセテートなどの試薬を用いる、チオールからカルボン酸への変換；エチレンイミンまたは２−ブロモエチルアミンなどの試薬を用いる、チオールからアミンへの変換；カルボジイミドに続いてジアミンなどの試薬を用いる、カルボン酸からアミンへの変換；ならびにトシルクロリドなどの試薬を用い、続いてチオアセテートとのエステル交換および酢酸ナトリウムによるチオールへの加水分解を用いる、アルコールからチオールへの変換。

所望により、追加の連結物質を導入せずに（Ａ）の反応性化学基と（Ｂ）の反応性化学基の直接共有結合を伴なういわゆるゼロ長さのリンカーを、本発明に従って使用できる。例には、（Ｌ）が（Ａ）の酸素原子を（Ｂ）中に存在するカルボニルまたはチオカルボニル部分に連結する化学結合を表わす化合物が含まれ、したがってこの連結基はエステルまたはチオエステルである。たとえば、カルボジイミド化学を用いてアミノ基（Ａ）をカルボキシル基（Ｂ）に連結させて、Ａ−Ｌ−Ｂ（個々のＬはアミド結合である）、またはＮ−Ｒに連結したＲＣ（：Ｏ）（ここで、Ｒは、同じタンパク質分子または２つの異なるタンパク質分子のアミノ酸側鎖に由来する炭素鎖である）を得ることができる。しかし、最も一般的には、リンカーはスペーサー要素により結合した前記の２以上の反応性部分を含む。スペーサーの存在により、二官能性リンカーが（Ａ）および（Ｂ）内の特異的官能基と反応してこれら２つの化合物間に共有結合を生成することができる。リンカー（Ｌ）内の反応性部分は同一でもよく（ホモ二官能性リンカー）、異なってもよく（ヘテロ二官能性リンカー、または幾つかの異なる反応性部分が存在する場合はヘテロ多官能性リンカー）、これにより（Ａ）と（Ｂ）の間に共有結合をもたらす可能性のある試薬の多様性が得られる。

スペーサー要素は、一般に、炭素原子１〜１０個の線状もしくは分枝アルキル、原子１〜１０個の線状もしくは分枝ヘテロアルキル、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルケン、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルキン、炭素原子５〜１０個の芳香族残基、原子３〜１０個の環系、または−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２−（ここで、ｎは１〜４である）によって（Ａ）と（Ｂ）を効果的に隔離する鎖からなる。

連結剤により導入される外来性物質の性質は、最終的なワクチン製品の薬物動態および／または活性に対する負荷をもつ可能性がある。したがって、生分解性または化学的感受性であるかあるいは酵素開裂部位を取り込んだスペーサーアームを含む、開裂性リンカーを導入するのが望ましい可能性がある。

これらの開裂性リンカー、たとえばPCT公開WO 92/17436（本明細書に援用する）に記載のものは、インビボで容易に生分解する。ある場合には、連結基はエステラーゼの存在下で開裂するが、そのような酵素の不存在下では安定である。したがって、（Ａ）と（Ｂ）を疾患部位付近で酵素活性によってそれらが徐放できるように有利に連結できる。

リンカーは、下記式の生分解性ジエステル、ジアミド、またはジカルバメート基を含む連結基を形成することができる：−（Ｚ^１）_ｏ−（Ｙ^１）_ｕ−（Ｚ^２）_ｓ−（Ｒ_１１）−（Ｚ^３）_ｔ−（Ｙ^２）_ｖ−（Ｚ^４）_ｐ−：式中、Ｚ^１、Ｚ^２、Ｚ^３およびＺ^４は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、およびＮＲ_１２（ここで、Ｒ_１２は水素またはアルキル基である）から選択される；Ｙ^１およびＹ^２は、それぞれ独立してカルボニル、チオカルボニル、スルホニル、ホスホリル、またはこれらに類する酸形成基から選択される；ｏ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕおよびｖは、それぞれ独立して０または１である；Ｒ_１１は、炭素原子１〜１０個の線状もしくは分枝アルキル、原子１〜１０個の線状もしくは分枝ヘテロアルキル、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルケン、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルキン、炭素原子５〜１０個の芳香族残基、原子３〜１０個の環系、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｑＣＨ_２ＣＨ_２−（ここで、ｑは１〜４である）、または−（Ｚ^１）_ｏ−（Ｙ^１）_ｕ−（Ｚ^２）_ｓ−（Ｒ_１１）−（Ｚ^３）_ｔ−（Ｙ^２）_ｖ−（Ｚ^４）_ｐ−を連結する化学結合である。

本発明に用いる代表的な望ましいリンカー（Ｌ）は、式Ｉ〜ＩＩのいずれかにより記載できる：
−Ｃ：Ｏ−Ｒ_１３−Ｃ：Ｏ− Ｉ
−Ｃ：Ｏ−ＮＨ−Ｒ_１３−ＮＨ−Ｃ：Ｏ− ＩＩ
これらにおいて、リンカーは（Ａ）の酸素原子と（Ｂ）の酸素原子の両方に共有結合している。したがって、式Ｉ〜ＩＩのリンカー（Ｌ）は、キャリヤータンパク質（Ａ）および（Ｂ）にジピラン、エステル、またはカルバメート連結基により結合している。これらの態様において、Ｒ_１３は、炭素原子１〜１０個の線状もしくは分枝アルキル、原子１〜１０個の線状もしくは分枝ヘテロアルキル、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルケン、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルキン、炭素原子５〜１０個の芳香族残基、原子３〜１０個の環系、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２−（ここで、ｎは１〜４である）、または２つの窒素もしくは２つのカルボニルを連結する化学結合である。

ヒドラゾン連結を形成するためのリンカーは、化学式ＩＩＩをもつ：
−（Ｙ^３）−（Ｚ^５）_ｗ−Ｒ_１４−Ｃ（：Ｘ_４）−Ｒ_１５ ＩＩＩ
式中、Ｚ^５は、Ｏ、ＳまたはＮＲ_１６から選択される；Ｒ_１６は、水素またはアルキル基である；Ｒ_１５は、水素、アルキルまたはヘテロアルキルから選択される；Ｙ^３は、（Ａ）の酸素原子に共有結合しているカルボニル、チオカルボニル、スルホニル、ホスホリル、またはこれらに類する酸形成基から選択される；ｗは、０または１である；Ｒ_１４は、炭素原子１〜１０個の線状もしくは分枝アルキル、原子１〜１０個の線状もしくは分枝ヘテロアルキル、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルケン、炭素原子２〜１０個の線状もしくは分枝アルキン、炭素原子５〜１０個の芳香族残基、原子３〜１０個の環系、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２−（ここで、ｎは１〜４である）、または−（Ｙ^３）−（Ｚ^５）_ｗ−を連結する化学結合であり、Ｘ_４はヒドラゾンであり、ヒドラジド基を含む（Ｂ）とリンカーＩＩの前駆体（Ｘ_４はケトン基またはアルデヒド基の酸素原子である）との縮合反応から生じる。

キャリヤータンパク質
一般に、生理的条件下で抗原を捕捉できるいずれかのキャリヤータンパク質を本発明に使用できる。望ましくは、抗原は、キャリヤータンパク質および／またはポリカチオンの架橋マトリックスを含む複合体に、抗原とキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスとの間に有意の共有結合が存在しない状態で捕捉される。有意の共有結合が存在しないとは、５０％より多量の抗原がキャリヤータンパク質／ポリカチオンに共有結合してはいないことを表わす。望ましい態様において、４０％、３０％、１０％または５％より多量の抗原がキャリヤータンパク質／ポリカチオンに共有結合してはいない。抗原／キャリヤータンパク質／ポリカチオン複合体は、他の化合物、たとえばミョウバンを含んでいてもよい。

本発明のワクチンに用いるキャリヤータンパク質は、望ましくは単独で、または抗原との組合わせで、対象において免疫応答を誘発するタンパク質である。望ましくは、キャリヤータンパク質は、ヘルパーＴ細胞が認識する複数のＭＣＨクラスＩＩ−限定エピトープを含む。望ましくは、それらのエピトープは対象においてＴ_ｈ細胞応答を誘導することができ、Ｂ細胞を誘導して、目的とする抗原およびその抗原が由来する微生物に対する抗体を産生する。本発明について述べる際に用いるエピトープには、それと抗体分子またはフラグメントとの特異的な相互作用に関与する、抗原上のいずれかの決定基が含まれる。エピトープ決定基は、通常は化学的に活性な表面分子グループ、たとえばアミノ酸または糖側鎖からなり、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性をもつ。免疫原特性をもつためには、タンパク質またはポリペプチドは一般にＴ_ｈ細胞を刺激することができる。しかし、Ｔ_ｈ細胞が認識するエピトープを欠如するキャリヤータンパク質が免疫原性である可能性もある。

強い免疫応答を誘発し（すなわち、免疫原性が高い）、“万能”または“広域”または“汎ＤＲ”ヘルパーＴ細胞エピトープ(たとえば、WO 2008/057529を参照)を含むことが知られているキャリヤータンパク質を選択することにより、多様な対象集団を本明細書に記載するタンパク質マトリックスワクチン組成物で処置することができる。望ましくは、キャリヤータンパク質はワクチンに対する強い免疫応答を誘発するのに十分なほど外因性である。一般に、用いるキャリヤータンパク質は目的とする抗原に対する免疫原性を刺激できる分子である。望ましい態様において、キャリヤータンパク質は本質的に免疫原性が高いものである。したがって、高度の免疫原性をもち、それと複合体形成した抗原（単数または複数）に対する抗体産生を最大限にすることができるキャリヤータンパク質が望ましい。

本発明を実施するのに有用な種々のキャリヤータンパク質には、たとえば下記の毒素およびトキソイド（化学的または遺伝的）が含まれ、それらは変異体であってもよく、そうでなくてもよい：炭疽菌毒素、ＰＡおよびＤＮＩ(PharmAthene, Inc.)、ジフテリアトキソイド(Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.)、またはＣＲＭ１９７、破傷風毒素、破傷風トキソイド(Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.)、破傷風毒素フラグメントＺ、緑膿菌の外毒素Ａまたは外毒素Ａの変異体、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、髄膜炎菌の外膜タンパク質(ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, バージニア州マナッサス)から入手できる菌株)、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌易熱性エンテロトキシン、志賀毒素様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、細菌の全細胞からのタンパク質抽出物、およびリンカーにより架橋できる他のいずれかのタンパク質。望ましくは、キャリヤータンパク質はコレラ毒素Ｂサブユニット(SBL Vaccin ABから入手できる）、ジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ１９７(Connaught, Inc.)、破傷風トキソイドまたはフラグメントＣ、(Sigma Aldrichから入手できる)、ＤＮＩ、または大腸菌由来のベータ−ガラクトシダーゼ(Sigma Aldrichから入手できる)である。他の望ましいキャリヤータンパク質には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｐ４０、およびニワトリリボフラビンが含まれる。（別途指示しない限り、代表的キャリヤータンパク質はSigma Aldrichから市販されている。）他の代表的なキャリヤータンパク質はＭＡＰ(multi-antigenic peptide、多抗原性ペプチド)であり、それらは分枝ペプチドである。ＭＡＰの使用によって、多数の分枝アミノ酸残基のため架橋密度が最大限になる。架橋の目的に望ましいアミノ酸残基であって、ＭＡＰを形成するために使用できるものは、それの側鎖に遊離アミノ基をもつリジンであるが、これに限定されない。

ＢＳＡおよびキーホールリンペット（スカシガイ）(keyhole limpet)ヘモシニアン（ＫＬＨ）は両方とも、ワクチンの開発において動物で実験する際にキャリヤーとして一般に用いられている。療法用ワクチンの製造に用いられているキャリヤータンパク質には、病原性細菌の多数の毒素およびそれらのトキソイドが含まれるが、これらに限定されない。例には、ジフテリアおよび破傷風の毒素ならびにそれらに対応する医療用として許容できるトキソイドが含まれる。他の候補は、細菌毒素に抗原的に類似する交差反応物質（cross-reacting material）（ＣＲＭ）と呼ばれるタンパク質である。本発明を実施する際に有用なキャリヤータンパク質には、ヒトに由来するものではないタンパク質およびヒトのいかなる食物中にも存在しないタンパク質も含まれる。

本発明の望ましい態様において、環様構造体を形成するタンパク質がＰＣＭＶ製造に用いられる。そのようなタンパク質には、緑膿菌のＨｃｐ１タンパク質、コレラ毒素の無毒性“Ｂサブユニット”、大腸菌易熱性エンテロトキシン、志賀毒素様毒素が含まれる。そのような環様タンパク質マトリックスは、線状ＰＳ鎖がこれらの環状タンパク質複合体の中心チャネルを貫いた構造体を形成することができる。タンパク質の架橋後、そのような複合体は特に安定であると推定される。それらのタンパク質の構造データにより、これらの中心チャネルはＰＳ鎖が容易に侵入するのに十分なほど大きいことが示唆される。たとえば、Ｈｃｐ１ヘキサマー環の中心チャネルは４２オングストロームであり、これは幅５．５オングストロームの多糖鎖数個を容易に収容するのに十分なほど広い(Mougous et al., Science, 312(5779):1526-1530 (2006))。あるいは、タンパク質の環を多糖類の周りに構築することができる（たとえば、特定の物理化学的条件下で自然に環を構築するモノマー形キャリヤータンパク質のサブユニットから）。環を構築できるそのようなモノマータンパク質は当技術分野で既知であり、たとえばニューモリシン(Walker et al., Infect. Immun., 55(5):1184-1189 (1987); Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol., 25(2):222-225 (1987))、リステリオリシンＯ(Kayal and Charbit, FEMS Microbiol. Rev., 30:514-529 (2006); Mengaud et al., Infect. Immun., 55(12):3225-3227 (1987))、ＤＮＩ、炭疽菌ＰＡ、Ｈｃｐ１、コレラ毒素Ｂサブユニット、志賀毒素Ｂサブユニット、フラゲリン、および種々の微生物が産生する当技術分野で既知の多数の関連分子が含まれる。

他の望ましい態様において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをキャリヤータンパク質として用いる。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化は適応免疫応答の形成に重要であり、抗体応答、アイソタイプスイッチおよび免疫記憶の親和性成熟において役割を果たすことができる。ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)のフラゲリン（ＦＬＡ）はＴＬＲアゴニストである。ＦＬＡタンパク質は組換え大腸菌から精製され、有効なＴＬＲアクチベーターであることがＩＬ−６マクロファージ誘導アッセイにおいて示された。さらに、良好に保存された“ニューモリシン”と呼ばれる肺炎連鎖球菌タンパク質もＴＬＲ４を活性化し、さらに防御抗原であることが示された。したがって、このタンパク質も有効なマトリックスキャリヤータンパク質として使用できる。

さらに、外膜タンパク質(outer membrane protein)（ＯＭＰ）混合物（たとえば、髄膜炎菌のＯＭＰ）はＭｅｒｃｋにより製造されたＨＩＢコンジュゲートワクチンのキャリヤータンパク質として用いられており、肺炎連鎖球菌の細菌の全細胞からのタンパク質抽出物は少なくとも部分的に防御性であることが感染動物モデルにおいて示された。本発明の望ましい態様において、これらのタンパク質混合物をキャリヤータンパク質として使用できる。

望ましい態様において、ワクチン組成物は、たとえば化学修飾によりブロックされておらず架橋できる少なくとも２つのリジン残基または他の残基をもつキャリヤータンパク質を用いて製造される。他の望ましい態様において、キャリヤータンパク質はマルチマー（たとえば、少なくとも５つのサブユニットを含むもの）である。

他の態様において、ＤＮＩをキャリヤータンパク質として用いる；それは無毒性であり、使用前にそれをより毒性の低いものにする必要がないからである。さらに、目的とする抗原に対して誘発される防御免疫応答のほかに、ＤＮＩは炭疽菌に対する防御免疫応答も誘発できるので、ＤＮＩの使用は望ましい。また、ＤＮＩは内部ジスルフィド結合をもたない。そのような結合は、ボロヒドリド還元を受けやすく、それによりタンパク質が変性して、炭疽菌毒素中和抗体を誘発するエピトープを喪失する可能性がある。

目的とする抗原
本発明のワクチン組成物、ならびにそのようなワクチンを製造および投与する方法は、目的とするいかなる抗原にも使用でき、特にそれ自体の免疫原性が強くない抗原について使用するのに有利である。これには、たとえば多数の多糖類、ポリアルコールまたはポリアミノ酸抗原が含まれる。望ましくは、目的とする抗原は、ワクチン製造方法に用いる化学反応により破壊される可能性、たとえばボロヒドリド還元による抗原ジスルフィド結合の分解により変性する可能性がある一次基を保有しない。代表的な目的とする抗原には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：有機ポリマー、たとえば多糖類（たとえば、少なくとも１８個の残基をもつ多糖類）、ホスホ多糖類、Ｎ−アセチル置換をもつアミノ糖を含む多糖類、スルホニル化糖を含む多糖類、他のスルフェート修飾糖類、またはホスフェート修飾糖類、ポリアルコール、ポリアミノ酸、テイコ酸、リポ多糖類のＯ多糖類。代表的な目的とする抗原には、莢膜有機ポリマーも含まれ、それには微生物、たとえば細菌、真菌、寄生生物、またはウイルスが合成し、次いでそのような微生物源から標準法を用いて精製したものが含まれる。代表的な目的とする抗原には、下記から精製したものを含む莢膜有機ポリマーが含まれる：細菌性生物、たとえばバチルス属菌種（炭疽菌を含む）(Wang and Lucas, Infect. Immun., 72(9):5460-5463 (2004))、肺炎連鎖球菌(Bentley et al., PLoS Genet., 2(3):e31 (2006); Kolkman et al., J. Biochemistry, 123:937-945 (1998); and Kong et al., J. Med. Microbiol., 54:351-356 (2005))、赤痢菌属(Zhao et al., Carbohydr. Res., 342(9):1275-1279 (2007))、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ・チフィ、化膿連鎖球菌( Streptococcus pyogenes)、大腸菌(Zhao et al., Carbohydr. Res., 342(9):1275-1279 (2007))、および緑膿菌、ならびに真菌性生物、たとえばクリプトコックス属(Cryptococcus)およびカンジダ属(Candida)、ならびに他の微生物(たとえば、Ovodov, Biochemistry (Mosc.), 71(9):937-954 (2006); Lee et al., Adv. Exp. Med. Biol., 491:453-471 (2001); およびLee, Mol. Immunol., 24(10):1005-1019 (1987)を参照)。代表的な目的とする抗原には、自然界には存在せず、したがって生物由来ではないポリマーも含まれる。

具体的な肺炎連鎖球菌抗原には、下記のものが含まれる：莢膜多糖タイプ1 (たとえば、1-gまたは1-q), 2 (たとえば、2-g, 2-q,または2-41A), 3 (たとえば、3-g, 3-q, 3-c,または3-nz), 4, 5 (たとえば、5-q, 5-c, 5-qap,または5-g), 6A (たとえば、6A-g, 6A-cl, 6A-c2, 6A-n, 6A-qap, 6A-6B-g, 6A-6B-q,または6A-6B-s), 6B (たとえば、6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B-q,または6A-6B-s), 7F (たとえば、7F-7A), 7A (たとえば、7A-cnまたは7F-7A), 7B (たとえば、7B-40), 7C (たとえば、7C-19C-24B), 8 (たとえば、8-gまたは8-s), 9A (たとえば、9A-9V), 9L, 9N, 9V (たとえば、9A-9V), 9Vおよび14, 10F (たとえば、10F-q, 10F-ca,または10F-10C), 10A (たとえば、10A-17Aまたは10A-23F), 10B (たとえば、10B-10C), 11F, 11A (たとえば、11A-nzまたは11A-11D-18F), 11B (たとえば、11B-11C), 11C (たとえば、11B-11C.または11C-cn), 11D (たとえば、11A-11D-18F), 12F (たとえば、12F-qまたは12F-12A-12B), 12A (たとえば、12A-cn, 12A-46,または12F-12A-12B), 12B (たとえば、12F-12A-12B), 13 (たとえば、13-20), 14 (たとえば、14-g, 14-q, 14-v,または14-c), 15F (たとえば、15F-cn1または15F-cn2), 15A (たとえば、15A-ca1, 15A-ca2,または15A-chw), 15B (たとえば、15B-c, 15B-15C, 15B-15C-22F-22A), 15C (たとえば、15C-ca, 15C-q1, 15C-q2, 15C-q3, 15C-s, 15B-15C,または15B-15C-22F-22A), 16F (たとえば、16F-qまたは16F-nz), 16A, 17F (たとえば、17F-nおよび17F-35B-35C-42), 17A (たとえば、17A-caまたは10A-17A), 18F (たとえば、18F-ca, 18F-w,または11A-11D-18F), 18A (たとえば、18A-nzまたは18A-q), 18B (たとえば、18B-18C), 18C (たとえば、18B-18C), 19F (たとえば、19F-g1, 19F-g2, 19F-g3, 19F-q, 19F-n,または19F-c), 19A (たとえば、19A-g, 19A-,または19A-ca), 19B, 19C (たとえば、19C-cn1, 19C-cn2,または7C-19C-24B), (たとえば、13-20), 21 (たとえば、21-caまたは21-cn), 22F (たとえば、15B-15C-22F-22A), 23F (たとえば、23F-c, 10A-23F,または23F-23A), 23B (たとえば、23B-cまたは23B-q), 24F (たとえば、24F-cn1, 24F-cn2,または24F-cn3), 24A, 24B (たとえば、7C-19C-24B), 25F (たとえば、25F-38), 25A, 27, 28F (たとえば、28F-28Aまたは28F-cn), 28A (たとえば、28F-28A), 29 (たとえば、29-caまたは29-q), 31, 32F (たとえば、32F-32A), 32A (たとえば、32A-cnまたは32F-32A), 33F (たとえば、33F-g, 33F-q, 33F-chw, 33F-33B,または33F-33A-35A), 33A (たとえば、33F-33A-35A), 33B (たとえば、33B-q, 33B-s,または33F-33B), 33D, 34 (たとえば、34-caまたは34s), 35F (たとえば、35F-47F), 35A (たとえば、33F-33A-35A), 35B (たとえば、17F-35B-35C-42), 36, 37 (たとえば、37-gまたは37-ca), 38 (たとえば、25F-38), 39 (たとえば、39-cn1または39-cn2), 40 (たとえば、7B-40), 41F (たとえば、41F-cnまたは41F-s), 41A (たとえば、2-41A), 42 (たとえば、17B-35B-35C-42), 43, 44, 45, 46 (たとえば、46-sまたは12A-46), 47F (たとえば、35F-47F), 47A, 48 (たとえば、48-cn1または48-cn2),またはGenBank寄託番号AF532714またはAF532715。

特に、下記のものから選択される肺炎連鎖球菌多糖類が挙げられる：莢膜多糖タイプ3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44, または46。

ポリカチオン
望ましくは、遊離第一級、第二級または第三級アミン基のいずれかの形の反復する正電荷をもついずれかのポリカチオンを、本発明に使用できる。代表的なポリカチオンには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ポリ−Ｌ−リジン、キトサン［２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮ）と２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ−（１−４）−連結コポリマー］、ポリアルギニン、および遊離アミン基を含む市販の合成ポリマー、たとえば分枝ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミンＮ７（ＣＡＳ ２９３２０−３８−５）、およびエチレンジアミノメチルポリスチレン（ＣＡＳ １７７９８７−９３−８）。

望ましい態様において、ポリ−Ｌ−リジンはα−ポリ−Ｌ−リジン（アルファ−ポリ−Ｌ−リジン）またはε−ポリ−Ｌ−リジン（イプシロン−ポリ−Ｌ−リジン）である。ポリ−Ｌ−リジンのリジン残基は、カルボキシル基とアルファ（α−ＰＬＬ）またはイプシロン（ε−ＰＬＬ）アミン基との間のペプチド結合により連結している。望ましくは、ポリ−Ｌ−リジンはα−ポリ−Ｌ−リジンである。α−ポリ−Ｌ−リジンは化学合成され、多様な分子量、たとえば０．５〜３００ＫＤａで得ることができる。ε−ポリ−Ｌ−リジンは必須アミノ酸Ｌ−リジンの小型の天然ホモポリマーであり、細菌発酵により産生される；たとえば、ε−ポリ−Ｌ−リジンはストレプトマイセス・アルブラスから単離でき、約４０００Ｄａの平均分子質量をもつ。

ポリカチオンはマトリックスワクチンの形成プロセスで２つの機能を果たすと考えられる：１）負に荷電した抗原ポリマーに対する対イオンとして作用する、および２）第一級アミン含有ポリカチオン、およびアミン基と反応する架橋剤の場合、他のポリカチオン分子またはキャリヤータンパク質分子との架橋を形成することにより、マトリックスの形成を補助する。ポリカチオンのこれらの特性は両方とも、タンパク質マトリックス内への抗原の捕捉を改善し、これによりＰＣＭＶ粒子形成の収率を改善できる。これは図１にみることができ、その場合、マトリックス内に捕捉された多糖類の量は、αＰＬＬの添加で５％から５０％を超えるまでに改善された。

コンジュゲートワクチンの形成も抗原とキャリヤータンパク質の間の電荷反発によって負の影響を受ける可能性があるので、ポリカチオンの使用はコンジュゲーション効率も高める可能性がある。多くのコンジュゲーション化学操作は、キャリヤータンパク質の第一級アミン基（たとえば、リジン残基）を介してキャリヤータンパク質にポリマーを連結させることを伴なうので、第一級アミンを含まないポリカチオン、たとえばポリアルギニンの使用は、ポリマー抗原がポリカチオンにコンジュゲートするのを避けるために有益であろう。しかし、第一級アミンを含むポリカチオンを用いてマトリックスワクチンの製造を補助することもでき、その場合は多糖類を意図的にマトリックスに共有結合（架橋）させる。抗原捕捉およびマトリックス形成を改善するのに必要なポリカチオンの量、サイズおよびタイプは、ポリマー抗原の組成、負電荷の程度、サイズ、アミン（または他の反応基）の官能性、および二次もしくは三次構造に依存する可能性がある。さらに、１種類より多いポリマー抗原をマトリックスワクチン反応に添加する場合（多価ワクチン）、ポリマー間の相互作用が、捕捉を改善するのに最良であるポリカチオンに影響を及ぼす可能性がある。これは、後記の実施例５、６、８および９に示す３価、１３価、および２３価ＰＰＳ−ＰＣＭＶ実験でみることができる。４０００Ｄａの平均分子質量をもつε−ＰＬＬを３価ＰＣＭＶ反応に用いた場合、ＰＰＳ４、ＰＰＳ１８ＣおよびＰＰＳ２３Ｆの多糖類捕捉は中程度であり、多糖類単独と比較して多糖抗原の免疫原性は改善されたが、それらはコンジュゲートワクチンでみられたレベルに達しなかった。しかし、ε−ＰＬＬを１３価ＰＰＳ−ＰＣＭＶに用いた場合、ＰＰＳ４およびＰＰＳ１８Ｃの免疫原性は３価ＰＰＳ−ＰＣＭＶと比較してそれぞれ３．４倍および１０７倍改善された；これは、１３価ＰＰＳ反応における他の多糖類との相互作用のためこれら２種類の多糖類の捕捉がε−ＰＬＬによって改善されたことを示唆する。３価反応にα−ＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）を用いると、ＰＰＳ４の免疫原性はさらにいっそう改善され、１３価ＰＰＳ ＰＣＭＶによって誘発されたものより１３２倍高いＧＭＴが誘発された。しかし、２３価ＰＰＳ−ＰＣＭＶの製造にα−ＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）を用いると、ＰＰＳ４捕捉がより少なくなったように思われる；このＰＣＭＶにおけるＰＰＳ４についてのＧＭＴは、３価ＰＰＳ／α−ＰＬＬ ＰＣＭＶより２６５０倍低かったからである；これは、２３価反応における他の多糖類はα−ＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）によるＰＰＳ４捕捉に負の影響を及ぼす可能性があることを示唆する。それぞれ個々または一群の多糖類または他の抗原を捕捉するために用いるポリカチオン成分の最適な量、サイズ（分子量）および組成の決定は、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定してポリカチオンが多糖抗原（単数または複数）をより高い分子量にシフトさせる能力を試験することによって経験的に決定できる。抗原がタンパク質マトリックスに捕捉されて会合するのに伴なう、抗原とより大きなサイズの粒子との会合を示唆するこのシフトは、本明細書に提供する後記に述べる幾つかの図面にみることができる。

ワクチン組成物
ＰＣＭＶを含めて本発明のワクチン組成物は、たとえば小児用ワクチン中に併用できる。さらに、本発明のワクチン組成物は、たとえば肺炎球菌感染症、Ｂ型インフルエンザ菌（“ＨｉＢ”）感染症、連鎖球菌（グループＡおよびＢ）感染症、髄膜炎菌（たとえば、Neisseria meningitides）感染症に対してワクチン接種するために使用でき、またグラム陰性細菌（たとえば、緑膿菌、フランシセラ・ツラレンシス、赤痢菌属菌種、サルモネラ属腸内血清型、アシネトバクター属菌種、ブルクホルデリア属菌種、および大腸菌）に由来するＯ抗原のワクチンとして使用できる。

このワクチン配合物は、望ましくは少なくとも１種類のキャリヤータンパク質、１種類以上の目的とする抗原、少なくとも１種類のポリカチオン、および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤（たとえば、リン酸アルミニウム、塩化ナトリウム、無菌水）を含有する。ワクチン組成物は、配合物の免疫原性を増強するためのアジュバント系、たとえば水中油系、ミョウバン、もしくは当技術分野で既知である他の系、または医薬的に許容できる他の賦形剤を含有することもできる。対象に投与した後に徐々に抗原を放出させるために、生理的条件下で不溶性である抗原／キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス複合体が望ましい。そのような複合体は、望ましくは医薬的に許容できる賦形剤を含有する懸濁液で送達される。しかし、抗原／キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス複合体は生理的条件下で可溶性であってもよい。

一般に、タンパク質マトリックスワクチン組成物は、皮下注射には約０．５ｍｌ、筋肉内注射には約０．５ｍｌ、皮内注射には約０．１ｍｌ、または経皮投与には約０．００２〜０．０２ｍｌの体積である。０．５ｍｌ用量のタンパク質マトリックスワクチン組成物は、約２〜５００μｇのキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスで捕捉された約２〜５００μｇの抗原を含有することができる。望ましい態様において、０．５ｍｌ用量中に、約１０μｇの抗原が約１０μｇのキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスで捕捉されている。抗原：キャリヤータンパク質／ポリカチオンのモル比は、望ましくは１：１０（たとえば、１部の抗原：２部のキャリヤー／ポリカチオン、または１部の抗原：３部のキャリヤー／ポリカチオンなど、最大で１部の抗原：１０部のキャリヤー／ポリカチオン）〜１０：１（たとえば、１０部の抗原：１部のキャリヤー／ポリカチオン、または９部の抗原：１部のキャリヤー／ポリカチオンなど）である。望ましい態様において、抗原：キャリヤー／ポリカチオンのモル比は１：１である。あるいは、抗原：キャリヤータンパク質／ポリカチオンの乾燥重量比は、１：１０〜１０：１（たとえば、乾燥重量で１：１）である。

抗原／キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス複合体は胃内で分解される可能性があるので、このワクチン組成物は望ましくは非経口投与される（たとえば、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、または皮内注射による）。皮膚層を物理的に貫通する手段（たとえば、針、エアガン、または摩擦）により送達するのが望ましいが、本発明のワクチン組成物は経皮吸収により投与することもできる。

特に、本発明のワクチン組成物は、たとえば適宜な免疫アジュバントと共に筋肉内注射、皮内注射、または経皮免疫化により対象に投与することができる。本発明のワクチン組成物は、そのワクチンに含有される抗原（単数または複数）に対応する感染因子の感染を予防するために、１回以上投与することができ、これにはしばしば対象における追加免疫抗体の産生を計画した２回目の投与が含まれる。希望する免疫応答または免疫レベルを得るためのワクチン投与の頻度および量は、そのワクチンの個々の活性に依存し、ルーチン実験によって容易に決定できる。たとえば乳児について、ワクチン計画は０．５ｍｌずつを約４〜８週間隔で３回（２か月齢で開始）、続いて約１２〜１４か月齢で０．５ｍｌの４回目の投与であってもよい。あるワクチンについては、４〜６歳で５回目の投与が望ましい場合がある。

１回目を投与する年齢は一般に２か月齢であるが、６週齢の幼い乳児にワクチンを投与することもできる。成人については、長期防御を付与するために０．５ｍｌずつを２〜８週間隔で２または３回で通常は十分である。追加免疫投与は、予め免疫化した成人および１１歳を超えた子供に、望ましくは１０年毎に行なわれる。

本発明のワクチン組成物は、１回分または多数回分の容器、たとえば密封したアンプルおよびバイアルに入れて提供でき、凍結乾燥(freeze-dried、lyophilized)状態で保存でき、使用直前に無菌液体キャリヤーを添加しさえすればよい。本発明のワクチンは、医薬的に許容できるビヒクル、たとえば水酸化アルミニウムゲル、アジュバント製剤、または塩類溶液中に配合し、次いで適宜な免疫アジュバントと共にたとえば筋肉内注射、皮内注射、または経皮免疫化により投与することができる。

本発明には、本明細書に記載するワクチン（ＰＣＭＶ）を含むキットも含まれる。本発明のキットは、キットを本明細書に記載するワクチン接種方法に使用するための指示も含むことができる。

免疫化計画の有効性は、免疫化した対象において抗体価を測定するための標準法を用いて判定できる。一般に、約１μｇ／ｍｌの平均抗体価（望ましくはＩｇＧ力価）が長期防御の指標であるとみなされる。

本発明は、キャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックスで捕捉された目的とする抗原を含むワクチン組成物、そのようなワクチン組成物を製造する方法、およびワクチンを投与する方法を提供する。ＰＣＭＶ形成効率、したがってワクチンとしてのそれらの経費効率は、ポリカチオン、たとえばポリ−Ｌ−リジンをタンパク質マトリックスに添加することによって改善されることが見出された。さらにポリカチオンは、ポリマー抗原をキャリヤータンパク質に共有結合させる一般的なコンジュゲートワクチンを製造するためのコンジュゲーション反応の効率改善にも有益であり、したがってより経費効率の良いコンジュゲートワクチンを製造できる。手短に言えば、本明細書に教示するように、ポリカチオンを含有するタンパク質マトリックスワクチン組成物は、抗原単独またはポリカチオンを含まないキャリヤータンパク質マトリックス内に捕捉された抗原を含む組成物と比較して、増大した免疫原性をもつ。ポリカチオンを含有するタンパク質マトリックスワクチン組成物におけるこの改善された免疫原性は、ポリカチオンを含まない同じ用量のワクチンと比較して、タンパク質／ポリカチオンマトリックスにおける多糖抗原の捕捉が改善され、ワクチン投与に際してより高いレベルの抗原が得られるためであると考えられる。本明細書中に述べるように、細菌の多糖莢膜は反復糖類から構成され、多くの病原性細菌についてこれらの莢膜は正味負電荷を保有する。莢膜のこの負電荷はマトリックスタンパク質に反発し、その結果、多糖抗原捕捉が低い可能性がある。この負電荷に対抗するために、ポリカチオン、たとえばポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）をＰＣＭＶ反応物に添加することができる。さらに、第一級アミンを含むポリカチオン、たとえばＰＬＬは、他のＰＬＬ分子またはキャリヤータンパク質分子との間に架橋を形成することによりマトリックス形成を補助することもできる。

以下の実施例はタンパク質マトリックスワクチンの形成に際してポリカチオンを使用する態様を示すが、ポリカチオンの有益な使用は、一般的なコンジュゲートワクチンの製造にも同様に利用できる。

本発明を以下において特定の例、態様および図面に関して記載するが、その目的は本発明の範囲を限定することではなく、本発明を説明することである。以下の実施例を限定とみなすべきではない。

実施例１：Ｖｉ−ＣＲＭ１９７−ＰＬＬ ＰＣＭＶ
ポリカチオンをマトリックスワクチン組成物に添加する効果を、抗原としてのサルモネラ・エンテリカ血清型チフィ(Salmonella enterica serovar Typhi)由来の莢膜Ｖｉ多糖を用い、キャリヤータンパク質としての無毒性ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７（Matrivax Research and Development Corporationで製造, 米国マサチュセッツ州ボストン)、およびポリカチオンとしてのα−ポリ−Ｌ−リジン（Sigma-Aldrich，ミズーリ州セントルイス）を用いて調べた。

Ｖｉは、Ｃ−３において可変Ｏ−アセチル化された（α１−４）−Ｄ−ＧａｌＡＮＡｃから構成される、陰イオン性の高いホモポリマーである。腸チフス熱について現在承認されているワクチンのひとつはＴｙｐｈｉｍＶｉ（登録商標）(Sanofi Pasteur SA)であり、それはコンジュゲートしていないＶｉ多糖を抗原として含有する。Ｖｉ抗原を送達して免疫応答を誘発するためにタンパク質マトリックスワクチンを効果的に使用できるかどうかを調べる初期試験において、抗原として４ｍｇ／ｍＬのＶｉおよびマトリックス形成キャリヤータンパク質として４ｍｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７を含む反応物中でＰＣＭＶを調製した。グルタルアルデヒドを架橋剤として添加することによりマトリックス形成を開始した。４℃で２４時間、定常的に揺動しながらインキュベートした後、反応物を２．６×１０ｃｍのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ２Ｂカラムで分離し、高分子量画分を採集し、アジュバントとしてミョウバンを添加し、マウスの免疫化に用いた。反応に伴なってより高い分子量へシフトしたＶｉの量を用いて、＜５％のＶｉがＰＣＭＶ反応に際してタンパク質マトリックスに捕捉されたと推定された。このＰＣＭＶ組成物に関する抗Ｖｉ抗体価は多糖類単独（対照）より約３倍高かったが、現在市販されているＶｉ多糖ワクチンＴｙｐｈｉｍＶｉ（登録商標）が誘発するものよりなお低かった。これに対し、Ｖｉコンジュゲートワクチン、たとえばＶｉ−ＣＲＭ１９７は、多糖単独より４０〜１００倍高い力価を誘発したと文献中に示されている。たとえば、Rondini et al., 2011, Clinical and Vaccine Immunology, 18: 460-468; Cui et al., 2010, Clinical and Vaccine Immunology, 17: 73-79; An et al. 2011 Vaccine 44: 7618-7623; Micoli et al., 2011, Vaccine, 29:712-720を参照。

コンジュゲートワクチンと比較してＶｉ ＰＣＭＶ粒子の免疫原性が劣るのは、おそらくＣＲＭ１９７マトリックスにおけるＶｉの捕捉が劣ること、捕捉されていない（遊離）ＶｉからのＰＣＭＶ粒子の分離が劣ること、または両方によるものであろう。

Ｖｉの陰イオン性が高いため、鍵となる架橋工程でＶｉがＣＲＭ１９７に反発し、ＰＣＭＶ粒子内への効率的な捕捉を妨げると仮定した。
最初に、電荷反発を減らすためにＰＣＭＶへの塩類の添加を調べた；しかし、架橋に伴なって不溶性沈殿が生成した。

ＰＣＭＶプロセスに対するポリカチオンの効果を調べた：初回免疫化実験のためにポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を用いて２種類のＰＣＭＶを調製し、各ＰＣＭＶ反応物は４ｍｇ／ｍｌのＶｉ、４ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７、および０．０１％のα−ポリ−Ｌ−リジン（１５０〜３００ｋＤａ）を含有していた。Ｖｉおよびα−ポリ−Ｌ−リジン（α−ＰＬＬ）を室温で１５分間、連続的に揺動しながらインキュベートした後、架橋剤として０．２５％のグルタルアルデヒドおよびキャリヤータンパク質としてＣＲＭ１９７を添加した。０．０１ｍｇ／ｍＬのサルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム(Salmonella enterica serovar Typhimurium)由来のフラゲリン（Ｆｌｇ）を一方の反応混合物にアジュバント作用添加剤として添加した。室温でさらに１０分間、連続的に揺動しながらインキュベーションを継続した後、定常的に揺動しながら４℃に２４時間置いた。ＰＣＭＶ反応物の分離を２．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００で行なった。反応生成物をカラムで分離した後、タンパク質および多糖のレベルを、それぞれｍｉｃｒｏＢＣＡ(Pierce Chemical)およびＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ(Sigma Chemical)アッセイキットを用いて測定した。約２０％のＶｉがより高い高分子量へシフトしてタンパク質のピークと共に溶出し、これはＶｉがキャリヤータンパク質／ポリカチオンマトリックス内に捕捉されたことを示唆した（図２）。これらの高分子量画分を採集してプールし（参照：図２、ボックスで囲んだ画分）、ミョウバンアジュバントを添加し、免疫化に用いた。

５匹のＢａｌＢＣマウス(Jackson Laboratories)のグループを、ＰＣＭＶ、Matrivax Ｖｉ単独、またはＴｙｐｈｉｍＶｉ（登録商標）腸チフスＶｉ多糖ワクチン(Sanofi Pasteur SA)の形の１０μｇのＶｉにより、３回の隔週間隔で免疫化した。マウスをそれらの最終免疫化の３週間後にと殺し、Ｖｉ特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。上記の免疫化からのエンドポイント幾何平均力価(geometric mean titer)（ＧＭＴ）を表１に示す。

これらの結果から、α−ＰＬＬを反応物中に用いることにより、ＰＣＭＶはＶｉ多糖単独についてみられたものより４０倍高い抗Ｖｉ抗体価を誘発したことが分かる（表１）。さらに、少量のフラゲリンをα−ＰＬＬ含有ＰＣＭＶに含有させると、Ｖｉ多糖単独での免疫化より３００倍大きいＧＭＴ、およびフラゲリンを含まないＰＣＭＶより７．５倍大きいＧＭＴをもつ、よりいっそう高い抗Ｖｉ抗体価が得られた。フラゲリンの存在はＰＬＬにより捕捉されたＶｉの量に影響を及ぼさなかった（データは示していない）。

興味深いことに、同様にポリカチオンであってＰＬＬと同程度の正電荷を含むけれども反復する第一級アミンを含まないポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ）は、Ｖｉ捕捉を改善しなかった（データは示していない）；これは、ＰＬＬが、Ｖｉの負電荷に対する対抗と、他のＰＬＬ分子およびＣＲＭ１９７への架橋によるマトリックス形成の補助との両方を行なったことを示す。

実施例２：Ｖｉ−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ ＰＣＭＶの分離の改善
ＰＣＭＶ粒子から低分子量の分子種（捕捉されなかったコンジュゲートしていない抗原ポリマーであると推定される）をより良好に排除するために、より長い（９０ｃｍ）サイズ排除カラムを用いた。詳細には、４ｍｇ／ｍｌのＶｉ、４ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７および０．０１％のα−ポリ−Ｌ−リジン（１５０〜３００ＫＤａ）を含有するＰＣＭＶ架橋反応混合物を調製した。ＶｉおよびαＰＬＬを室温で１５分間、連続的に揺動しながらインキュベートした後、０．２５％のグルタルアルデヒドおよびＣＲＭ１９７を添加した。室温でさらに１０分間、連続的に揺動しながらインキュベーションを継続し、続いて定常的に揺動しながら４℃で２４時間インキュベートした。反応生成物をＳＥＣカラムで分離した後、タンパク質および多糖のレベルを、それぞれｍｉｃｒｏＢＣＡおよびｓｔａｉｎｓ−ａｌｌアッセイを用いて測定した。ＰＣＭＶ粒子のサイズまたは分子量がそれらの免疫原性に影響を及ぼすかどうかを判定するために、ＳＥＣカラムからの３つの異なる溶離時点からの画分をプールし、免疫化に用いた。プール選択を図３に示す。プール１とプール２はカラムからのそれらの溶離に有意差がなかったが、プール３はプール１および２より低い分子量をもち、捕捉されていないＶｉをより多量に含有する疑いがあった。

５匹のマウスのグループを、被験組成物からの１０μｇのＶｉにより、３回の隔週注射で免疫化した。マウスをそれらの最終免疫化の３週間後にと殺し、Ｖｉ特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。上記の免疫化からのエンドポイントＧＭＴを比較した（表２）。

ＰＬＬとサイズ分離改善によって、Ｖｉ単独より４８５倍〜１４００倍高く、ＴｙｐｈｉｍＶｉ（登録商標）腸チフスワクチンより２２倍高い抗Ｖｉ抗体価を誘発する、Ｖｉ−ＣＲＭ１９７ ＰＣＭＶを調製することができた（表２；プール１および２）。

プール３からのＰＣＭＶについてのＧＭＴはＶｉ単独より４４倍高く、市販のＴｙｐｈｉｍＶｉ（登録商標）腸チフスワクチンより１．３倍高かったが、それはプール１および２によって誘発されたものより低かった。これは、ＰＣＭＶの分子量がより低いこと、および／またはより多量の捕捉されていない、すなわち“遊離”Ｖｉが存在することによるものと思われる。

実施例３：ＰＰＳ１８Ｃ−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ ＰＣＭＶ
α−ＰＬＬを用いてＶｉ捕捉が改善されたので、次いで、より低く負に荷電した肺炎球菌多糖ＰＰＳ１８Ｃの捕捉をα−ＰＬＬが改善するかどうかを調べた。糖残基それぞれが負に荷電しているＶｉと異なり、ＰＰＳ１８Ｃは５つの糖残基毎に１つの負電荷をもつにすぎない。しかし、０．０４％のα−ＰＬＬ（１５〜３０ｋＤａ）をＰＣＭＶ反応物に含有させると、ＳＥＣで分離した際、３５％の多糖がより低い分子量からより高い分子量の画分へシフトした（図４）。ＰＣＭＶ反応物中に存在する大部分のＣＲＭ１９７タンパク質が、同様に、より高い分子量の画分へ共局在化した。ＰＣＭＶ粒子を抗ＣＲＭ１９７抗体によりＥＬＩＳＡプレートに結合させて血清型特異的抗血清で多糖を検出する捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、高分子量画分中に存在する多糖はＰＣＭＶ粒子に捕捉されていることが示された（データは示していない）。

実施例４−ＰＬＬの増加はＰＣＭＶ中のＶｉ捕捉を増加させる
０．０１％および０．０２％のαＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）および０．０４％のαＰＬＬ（１５〜３０ｋＤａ）、４ｍｇ／ｍＬのＶｉ、ならびに４ｍｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７を用いて、ＰＣＭＶ架橋反応を実施した。反応物を５００ｍＬ（９０ｃｍ×２．６ｃｍ）Ｓｅｐｈａｒｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離し、画分をタンパク質および多糖についてそれぞれｍｉｃｒｏＢＣＡおよびＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌアッセイを用いて分析した（図５）。ＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）濃度を０．０１％から０．０２％に増大させると、捕捉されたＶｉの量が１５％から２１％にまで増加した。このＶｉ捕捉の増加はＰＣＭＶの免疫原性に影響を及ぼさず、両方の濃度のＰＬＬを用いて合成したＰＣＭＶが、Ｖｉ単独より１４〜２０倍高く、ＴｙｐｈｉｍＶｉ（登録商標）腸チフスワクチンより２〜３倍高い抗Ｖｉ抗体価を誘発した（データは示していない）。より少量の０．０４％のα−ＰＬＬ（１５〜３０ｋＤａ）を用いた場合、捕捉されたＶｉの量は６４％にまで増加した。より低い分子量のＰＬＬによる捕捉の増加は、Ｖｉ単独を超えるＰＣＭＶの免疫原性改善をもたらさなかった（データは示していない）。本発明者らは、高濃度の低い分子量のα−ＰＬＬ（１５〜３０ｋＤａ）はＶｉエピトープを遮蔽する可能性がある（データは示していない）という仮説を立てた。

実施例５：３価ＰＣＭＶ
ＰＣＭＶに対するポリカチオンの有益な効果を多価ＰＣＭＶに利用できるかどうかを調べるために、肺炎球菌多糖抗原ＰＰＳ１８Ｃ、ＰＰＳ４およびＰＰＳ２３Ｆを含有する３価肺炎球菌ワクチンを調製した。下記に従ってＰＣＭＶを調製した：ＰＣＭＶ反応混合物は、５ｍｇ／ｍｌの総多糖類（それぞれ約１．７ｍｇ／ｍｌのＰＰＳ１８Ｃ、ＰＰＳ４、およびＰＰＳ２３Ｆ）、１ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７、および０．０４％のε−ポリ−Ｌ−リジン（４ｋＤａ，Bainafo Bioengineering Co. Ltd., Zhengzhou, PRC)を含有していた。多糖類およびε−ポリ−Ｌ−リジンを室温で１５分間、連続的に揺動しながらインキュベートした後、架橋剤としての０．２５％のグルタルアルデヒドおよびマトリックスタンパク質としてのＣＲＭ１９７を添加した。室温でさらに１０分間、連続的に揺動しながらインキュベーションを継続した後、定常的に揺動しながら４℃に２４時間置いた。ＰＰＳ１８Ｃ／ＰＰＳ４／ＰＰＳ２３−ＣＲＭ１９７−εＰＬＬ ＰＣＭＶの分離を２．６×９０ｃｍ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで行なった。画分を、多糖類についてＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイにより、タンパク質についてＭｉｃｒｏＢＣＡにより、ＰＣＭＶ粒子中のそれぞれの多糖の捕捉について捕捉ＥＬＩＳＡにより、分析した（図５を参照）。Ａｎｔｈｒｏｎｅアッセイは、濃硫酸中での加水分解に続いてヘキソースを検出するための比色アッセイである。Trevelyan, et al., 1952, “Determination of Yeast Carbohydrates with the Anthrone Reagent”, Nature, 170(4328): 626-627。強い陽性の捕捉ＥＬＩＳＡがＰＰＳ４についてみられた（データは示していない）；しかし、ＰＰＳ１８Ｃおよび２３Ｆについては弱い信号がみられた。捕捉ＥＬＩＳＡで陽性であった高分子量多糖を含有する画分をプールし（参照：図６、ボックスで囲んだ画分）、ミョウバンアジュバントを添加し、免疫化に用いた。

１０匹のマウスのグループを、前記にＶｉ−ＰＣＭＶについて述べたものと同じ投与計画を用いて免疫化した。３価バッチ型ＰＣＭＶについて、１回量はそれぞれ２μｇのＰＳ、すなわち６μｇの総多糖類を含有していた。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチン（１回量当たりそれぞれのＰＳを２．２μｇ、ただし６Ｂについては４μｇを含有；合計３０．８μｇのＰＰＳ）を、ＰＣＭＶ誘導抗体応答との比較のために陽性対照として１グループのマウスに投与した。１グループのマウスを抗原単独で、すなわち１３価のＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３中にみられる１３種類のコンジュゲートしていない多糖抗原で同様に免疫化した：１回量当たりそれぞれの多糖２μｇ、合計２６μｇの総多糖類。１グループのナイーブ（ワクチン非接種）マウスも陰性対照グループとして含めた。

３回目の免疫化後、約２．５週目（４７日目）に、すべてのマウスを安楽死させ、心臓穿刺により血液を採集した。免疫血清をＰＰＳ特異的ＥＬＩＳＡにより、ＰＰＳ４、ＰＰＳ１８ＣおよびＰＰＳ２３を認識する抗原特異的ＩｇＧ抗体応答につき分析した。免疫化した動物に由来する個々の血清からの力価から、抗ＰＰＳ ＩｇＧ幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を計算した。結果を下記の表３に示す。

表３にみられるように、ε−ＰＬＬを含有するバッチ型ＰＣＭＶは、多糖類単独より１７９倍高い抗ＰＰＳ４ ＧＭＴ、多糖類単独より２９倍高い抗ＰＰＳ１８Ｃ ＧＭＴ、多糖類単独より５３倍高い抗ＰＰＳ２３Ｆ ＧＭＴを誘発した。これらのＧＭＴは、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチンのＧＭＴより、ＰＰＳ４、ＰＰＳ１８Ｃ、およびＰＰＳ２３Ｆについてそれぞれ３７倍低く、８．３倍低く、２．８倍低かった。このバッチ型３価ＰＣＭＶから誘発された力価はＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチンにより誘発されたものほど高くなかったが、それらは抗原類単独の使用に優る、またＰＬＬなしでＤＮＩをマトリックスタンパク質として用いて調製した従来の肺炎球菌多糖類ＰＣＭＶに優る、著しい改善を示した。この試験は、ＰＣＭＶ形成に際して１価ワクチンと同様に多価ワクチンの免疫原性の改善のためにポリカチオン添加を利用できることを立証する。さらに、一般的なコンジュゲートワクチンの製造と比較したＰＣＭＶ技術を用いる多価ワクチン製造の容易さは、明らかに有利である。

実施例６：バッチ型１３価肺炎球菌多糖類ＰＣＭＶ
ＰＣＭＶマトリックス形成反応混合物へのポリカチオン添加の有益な効果をさらに調べるために、現在Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチンに含まれる肺炎球菌多糖抗原、すなわちＰＰＳ１、ＰＰＳ３、ＰＰＳ４、ＰＰＳ５、ＰＰＳ６Ａ、ＰＰＳ６Ｂ、ＰＰＳ７Ｆ、ＰＰＳ９Ｖ、ＰＰＳ１４、ＰＰＳ１８Ｃ、ＰＰＳ１９Ａ、ＰＰＳ１９ＦおよびＰＰＳ２３Ｆを含有する１３価肺炎球菌ワクチンを調製し、試験した。

ＰＣＭＶを下記に従って調製した：ＰＣＭＶ反応混合物は、４ｍｇ／ｍｌの総多糖類（約０．３ｍｇ／ｍｌずつのそれぞれの多糖抗原）、４ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７、および０．４ｍｇ／ｍｌのε−ポリ−Ｌ−リジン（４ｋＤａ，Bainafo Bioengineering Co. Ltd., Zhengzhou, PRC)を含有していた。多糖類およびε−ポリ−Ｌ−リジンを室温で１５分間、連続的に揺動しながらインキュベートした後、架橋剤としての０．２５％のグルタルアルデヒドおよびマトリックスタンパク質としてのＣＲＭ１９７を添加した。室温でさらに１０分間、連続的に揺動しながらインキュベーションを継続した後、定常的に揺動しながら４℃に２４時間置いた。ＰＰＳ−ＣＲＭ１９７−εＰＬＬ ＰＣＭＶの分離を２．６×９０ｃｍ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで行なった。画分を、多糖類についてＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイにより、タンパク質についてＭｉｃｒｏＢＣＡにより、ＰＣＭＶ粒子中のそれぞれの多糖の捕捉について捕捉ＥＬＩＳＡにより、分析した。捕捉ＥＬＩＳＡで陽性であった高分子量多糖類を含有する画分をプールし（参照：図７、ボックスで囲んだ画分）、ミョウバンアジュバントを添加し、免疫化に用いた。

１０匹のマウスのグループを、前記に述べた投与計画を用いて０、１４および２８日目に免疫化した。１３価バッチ型ＰＣＭＶについて、１回量はそれぞれ４μｇの総多糖類を含有していた。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチン（１回量当たりそれぞれの多糖を２．２μｇ、ただし６Ｂについては４μｇを含有；合計３０．８μｇのＰＰＳ）を、ＰＣＭＶ誘導抗体応答との比較のために陽性対照として１グループのマウスに投与した。１グループのマウスを抗原単独で、すなわち１３価のＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３中にみられる１３種類のコンジュゲートしていない多糖抗原で同様に免疫化した：１回量当たり２μｇのそれぞれの多糖、２６μｇの総多糖類。１グループのナイーブ（ワクチン非接種）マウスも陰性対照グループとして含めた。

３回目の免疫化後、約２．５週目（４７日目）に、すべてのマウスを安楽死させ、心臓穿刺により血液を採集した。免疫血清をＰＰＳ特異的ＥＬＩＳＡにより、１０種類のＰＰＳ抗原に対する抗原特異的ＩｇＧ抗体応答につき分析した。免疫化した動物に由来する個々の血清からの力価から、抗ＰＰＳ ＩｇＧ幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を計算した。結果を下記の表４に示す。

バッチ型ＰＣＭＶ配合物で免疫化したマウスに由来する血清からのエンドポイントＩｇＧ ＧＭＴは、ＰＰＳ単独で免疫化したマウスからのＧＭＴより著しく高かった（ＰＰＳ単独より８倍から３，０００倍を超える範囲に及ぶ）。表４のデータから、ε−ＰＬＬを含有するバッチ型１３価ＰＣＭＶは、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）−１３（２または４μｇの各ＰＰＳ）による免疫化によって達成されたＧＭＴに匹敵するＩｇＧ ＧＭＴを、被験ＰＰＳ抗原に応じて実質的にそれより少量のＰＰＳ抗原を用いて（Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３中の２μｇ／４μｇのＰＰＳに対比して、ＰＣＭＶ中の約０．３μｇのＰＰＳ）誘導したことが分かる。

上記の表３および表４からの免疫学的データから、ε−ＰＬＬを含有する３価および１３価ＰＣＭＶはＰＬＬまたは他のポリカチオンを含有しない従来のＰＣＭＶよりはるかに強力な抗体免疫応答を示すことが明らかである。取り込まれていない多糖抗原（単数または複数）およびマトリックスタンパク質モノマーを、たとえばより長いサイズのカラムで除去した、より高い反応体レベルおよびサイズ画分のＰＣＭＶを用いた再配合は、抗原特異的免疫応答を抗原単独より改善した。また、ポリカチオンポリマーであるα−ＰＬＬおよび／またはε−ＰＬＬを含有させると、ＣＲＭ−１９７−ＰＣＭＶマトリックス内へのＰＳの捕捉効率が増大し、α−ＰＬＬおよびε−ＰＬＬを含有しないＤＮＩ−ＰＣＭＶ配合物と比較して３〜１２５倍強力な免疫応答が誘発される（実施例７を参照）。前記の各表から分かるように、ＰＬＬ配合ＰＣＭＶにより誘導された抗原特異的抗体応答は、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチンによって達成された抗ＰＰＳ抗原免疫応答の大きさより時には低いか、それに匹敵するか、またはそれより卓越している；しかし、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチン中の２μｇまたは４μｇの各ＰＰＳ抗原と比較してＰＰＳ（１３）−ＣＲＭ１９７−εＰＬＬ ＰＣＭＶが０．３μｇのそれぞれの多糖抗原を含有することに注目すると、ＰＣＭＶが独特の有効な免疫原組成物を提供し、また１つの反応工程で効率的に製造される組成物（Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３ワクチンの製造に必要な個別のコンジュゲーション反応の多重性と比較して）であることが認められる。

実施例７：カクテル型およびバッチ型バンドル化１３価ＰＰＳ−ＤＮＩ ＰＣＭＶ
炭疽菌由来の防御抗原（ＤＮＩ）の無毒性変異形をキャリヤータンパク質として用いて、一連のＰＣＭＶを調製した。それぞれが異なる肺炎球菌多糖抗原（ＰＰＳ）を含有する１３種類の別個のＰＰＳ／ＤＮＩタンパク質マトリックスワクチンを、前記と同じ架橋反応法に従って０．２５％のグルタルアルデヒドを用いて合成した。これらのＰＣＭＶを、次いで２．６×１５ｃｍ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ２Ｂカラムでサイズ分離した。さらに、４種類の多糖抗原を同じＰＣＭＶ反応物中に含有するＰＣＭＶ架橋反応（バッチ型抗原）を実施して、多価ＰＣＭＶを得た。これらの多価ＰＣＭＶは下記の抗原“バンドル(bundle)”を含有していた:
・バンドル１：ＰＰＳ３，ＰＰＳ１８Ｃ，ＰＰＳ１９Ｆ，ＰＰＳ２３Ｆ
・バンドル２：ＰＰＳ４，ＰＰＳ６Ａ，ＰＰＳ６Ｂ，ＰＰＳ１４
・バンドル３：ＰＰＳ５，ＰＰＳ７Ｆ，ＰＰＳ９Ｖ，ＰＰＳ１９Ａ
ＰＰＳ１をバンドル化ＰＣＭ反応物に含有させなかったのは、それがグルタルアルデヒドの存在下でキャリヤータンパク質に共有架橋する可能性のある第一級アミンをその反復構造中に含むからである。次いでこれらのバッチ型抗原ＰＣＭＶを１価ＰＣＭＶと同様な方法でＳＥＣにより分離した。１３の個別のワクチン組成物を混和して１３価カクテル型ＰＰＳ−ＤＮＩ−ＰＣＭＶを調製した。３種類のバッチ型抗原ＰＣＭＶを、個別ＰＰＳ１−ＤＮＩ ＰＣＭＶを含めて同様に混和して、バッチ型バンドル化１３価ＰＣＭＶを調製した。次いで１０匹のマウスのグループを、１価ＰＣＭＶのカクテルまたはバッチ型抗原ＰＣＭＶのカクテルのいずれかを用いて免疫化した。カクテル型１価ＰＣＭＶについては、マウスに２．２μｇまたは６μｇのそれぞれの多糖を投与した。しかし、バッチ型バンドルについては、わずか０．５μｇのそれぞれの多糖を１回量で送達した；ただし、ＰＰＳ１は２．２μｇを送達した。対照として、マウスのグループを１３種類の多糖類単独またはコンジュゲートワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３で免疫化した。１回量のＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）は、２μｇのそれぞれの多糖を含有していた；ただし、ＰＰＳ６Ｂは４μｇである。下記の表５は、カクテル型ＰＣＭＶおよびバッチ型バンドル化ＰＣＭＶで免疫化したマウスからの抗ＰＰＳ抗体価のまとめを示す。

両方のＰＣＭＶ“カクテル”が、多糖抗原単独により誘発されるものを超える多糖抗原特異的力価を誘発したが、それらはＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３コンジュゲートワクチン(Pfizer Inc., USA)により誘発された力価より２〜２００倍低かった。これらの結果は、バッチ型抗原ＰＣＭＶのバンドル化が、ほとんどすべての抗原について、カクテル型１価ＰＣＭＶによる免疫化との比較においてはより高い抗体価をもたらしたことを示す。Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３と比較してＰＣＭＶカクテルの免疫応答が低かったのは、１回量当たりの多糖類送達量によるものではなく、多糖類の捕捉および遊離多糖類からのＰＣＭＶの分離が低かったことによるものであると思われる。

実施例８：３価バッチ型ＰＰＳ−ＣＲＭ１９７−αＰＬＬ ＰＣＭＶおよびフラゲリン添加
ＰＰＳ４、１８Ｃおよび２３Ｆ肺炎球菌多糖抗原、およびマトリックス形成キャリヤータンパク質としてのＣＲＭ１９７、およびポリ−Ｌ−リジンを含有する３価ＰＣＭＶを、フラゲリンを添加して、または添加せずに調製した。ＰＣＭＶは下記に従って調製された：ＰＣＭＶ反応混合物は、４ｍｇ／ｍｌの総多糖類（１．３３ｍｇ／ｍｌのそれぞれの多糖）、４ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７、および０．０１％のαＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）を含有していた。多糖類およびαＰＬＬを室温で連続的に揺動しながら１５分間インキュベートした後、０．２５％のグルタルアルデヒドを添加した。１つのＰＣＭＶ反応混合物には、グルタルアルデヒドと共に０．００１ｍｇ／ｍＬのサルモネラ・チフィムリウム由来フラゲリン(InvivoGen, 米国カリフォルニア州サンディエゴ)も添加した。室温で連続的に揺動しながらさらに３０分間、インキュベーションを継続した。ＰＣＭＶ反応生成物を２．６×９０ｃｍ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離し、高分子量画分を採集してプールした（参照：図８、ボックスで囲んだ画分）。反応物をカラムで分離した後、タンパク質および多糖類のレベルをそれぞれｍｉｃｒｏＢＣＡおよびＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイにより測定した。

１０匹のマウスのグループを、フラゲリンを含まないバッチ型抗原ＰＣＭＶ、またはフラゲリンを含むバッチ型抗原ＰＣＭＶのいずれかをマウスの免疫化に用いて、前記の各実施例に従って免疫化した。陽性または陰性対照は前記の各実施例に従った。結果を表６に示す。

フラゲリンを含まないＰＣＭＶにおいて、抗ＰＰＳ４およびＰＰＳ１８抗体価は、同等な用量でそれぞれ、多糖単独より５９，０００倍および３０５５倍高く、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３より１１倍および２２倍高かった（表７を参照）。ＰＰＳ２３Ｆの力価は、多糖単独よりわずかに高く、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）が誘発したものより低かった；これは、低レベルのＰＰＳ２３ＦがＰＣＭＶ粒子に捕捉されたにすぎないことを示唆する。これらのデータを従来の３価ＰＰＳ−ＣＲＭ１９７−εＰＬＬ ＰＣＭＶのデータ（実施例５を参照）と比較すると、下記のことが指摘される：より高い分子量のαＰＬＬをポリカチオンとして用いるとＰＣＭＶマトリックス内の抗原捕捉が改善される；また、タンパク質マトリックスに共捕捉される抗原の慎重な選択、たとえばマトリックス形成反応生成物の低分子量成分サイズ排除による非免疫原種の排除、アジュバント作用要素、たとえばフラゲリンの慎重な使用、ならびに捕捉される抗原の量および１回量当たり送達可能な量の慎重な制御によって、現在市販されているコンジュゲートワクチン製品に匹敵し、さらにはそれに優る免疫原性をもつＰＣＭＶワクチン組成物が得られる。

実施例９：２３価ＰＰＳ−ＣＲＭ１９７ ＰＣＭＶ
α−ＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）を３価ＰＰＳ−ＰＣＭＶに用いることにより多糖類捕捉および免疫原性の改善がみられたので、市販ワクチンＰｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）からの２３種類の多糖類を用いて２３価ＰＰＳ−ＰＣＭＶを調製した。Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）からの２３種類の多糖類を脱塩して４ｍｇ／ｍＬ（０．１７ｍｇ／ｍＬのそれぞれの多糖）に濃縮した後、それらを０．０１％のα−ＰＬＬ（１５０〜３００ｋＤａ）と共に室温で１５分間、定常的に揺動しながらインキュベートした。０．２５％のグルタルアルデヒドを４ｍｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７と共に添加し、室温でさらに１０分間、定常的に揺動しながらインキュベーションを継続した後、定常的に揺動しながら４℃で２４時間インキュベートした。ＰＣＭＶ反応物を２．６ｃｍ×９０ｃｍ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムで分離し、画分中の総多糖類およびタンパク質の量をそれぞれＡｎｔｈｒｏｎｅアッセイおよびｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイにより測定した（図９）。図９にボックスで指示した高分子量画分をプールして免疫化に用いた。

１０匹のマウスのグループを、前記の各実施例に従って免疫化した。陽性または陰性対照は前記の各実施例に従った。結果を表７に示す。

２３価ＰＰＳ−ＰＣＭＶは、ＰＰＳ１、ＰＰＳ１４およびＰＰＳ１８Ｃに対して、コンジュゲートワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３が誘発したものより７７倍、４．９倍および１３４倍高いＧＭＴを誘発し、一方、ＰＰＳ３およびＰＰＳ１９Ｆに対するＧＭＴはＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３が誘発したものと同等であった。本発明による２３価ＰＣＭＶにおいては、１回当たりそれぞれの多糖をわずか０．２６μｇ送達したが、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３は１回当たりそれぞれの多糖を２．２μｇを含有する（ただし、ＰＰＢ６Ｂは４μｇ）；これは、２３価ＰＣＭＶが幾つかの多糖類についてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３より７倍低い用量でより高い力価を誘発できたことを示す。この免疫原性実験で試験した他の多糖類についてのＧＭＴはＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）１３が誘発したものより低かったが、それらはなお多糖類単独より一般に高かった。

本発明の態様
態様１
（１）１種類以上の目的とする抗原、（２）１種類以上のキャリヤータンパク質、および（３）１種類以上のポリカチオンを含む免疫原組成物であって、キャリヤータンパク質および場合によりポリカチオンが架橋してタンパク質マトリックスを形成し、目的とする抗原がそのタンパク質マトリックスにより捕捉されている組成物。
態様２
ポリカチオンが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、分枝ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、スペルミジン、スペルミン、キトサン［２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮ）と２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ−（１−４）−連結コポリマー］、ポリアミンＮ７（ＣＡＳ ２９３２０−３８−５）、およびエチレンジアミノメチルポリスチレン（ＣＡＳ １７７９８７−９３−８）からなる群から選択される、態様１に記載の組成物。
態様３
ポリカチオンがポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）である、態様２に記載の組成物。
態様４
ポリ−Ｌ−リジンがα−ポリ−Ｌ−リジン（α−ＰＬＬ）またはε−ポリ−Ｌ−リジン（ε−ＰＬＬ）である、態様３に記載の組成物。
態様５
ポリ−Ｌ−リジンがα−ポリ−Ｌ−リジン（α−ＰＬＬ）である、態様４に記載の組成物。
態様６
組成物が、直径５０ｎｍより大きい平均粒度を有するタンパク質マトリックス粒子を含む、態様１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
態様７
組成物が、直径１００〜２０００ｎｍより大きい平均粒度を有するタンパク質マトリックス粒子を含む、態様６に記載の組成物。
態様８
抗原：キャリヤータンパク質のモル比が１：１０〜１０：１である、前記態様のいずれか１項に記載の組成物。
態様９
反応混合物に対するポリカチオンのパーセントが０．００５〜０．１０％である、前記態様のいずれか１項に記載の組成物。
態様１０
目的とする抗原が２種類以上の抗原を含む、前記態様のいずれか１項に記載の組成物。
態様１１
目的とする抗原が多糖類である、前記態様のいずれか１項に記載の組成物。
態様１２
多糖類が、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の多糖類、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)の多糖類、炭疽菌(Bacillus anthracis)の多糖類、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)の多糖類、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)の多糖類、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)の多糖類、サルモネラ属(Salmonella)菌種の多糖類、赤痢菌属(Shigella)の多糖類、または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)の多糖類からなる群から選択される、態様１１に記載の組成物。
態様１３
肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の多糖類が、莢膜タイプ３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６からなる群から選択される、態様１２に記載の組成物。
態様１４
１種類以上のキャリヤータンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、髄膜炎菌(Neisseria menningitidis)の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌(Escherichia coli)易熱性エンテロトキシン、志賀毒素様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、リステリオリシンＯ、細菌の全細胞からのタンパク質抽出物、炭疽菌(Bacillus anthracis)の防御抗原の優性ネガティブインヒビター（ＤＮＩ）変異体、または大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、前記態様のいずれか１項に記載の組成物。
態様１５
（ｉ）目的とする抗原をキャリヤータンパク質およびポリカチオンと混合して混合物を形成し、（ｉｉ）キャリヤータンパク質およびポリカチオンを架橋させて、目的とする抗原を捕捉するキャリヤータンパク質マトリックスを形成することを含む、免疫原組成物の調製方法。
態様１６
哺乳動物において目的とする抗原に対して免疫応答を誘発する方法であって、その哺乳動物に態様１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原組成物を投与することを含む方法。
態様１７
哺乳動物がヒトである、態様１６に記載の方法。
態様１８
態様１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原組成物を２種類以上含むワクチン組成物。
態様１９
対象に感染因子に対するワクチンを接種する方法であって、態様１〜１４のいずれか１項に記載の組成物を、免疫応答を誘発するのに十分な量で対象に投与することを含む方法。
本明細書において引用または参照したすべての特許、特許出願、公開特許出願、および他の刊行物を、それぞれの独立した特許、特許出願、公開特許出願、および他の刊行物をを具体的かつ個々に本明細書に援用すると指示したと同様に本明細書に援用する。

Claims (18)

1. （１）１種類以上の目的とする抗原、（２）１種類以上のキャリヤータンパク質、および（３）反復する第１級アミンを含有するポリカチオン１種類以上を含む免疫原組成物であって、キャリヤータンパク質およびポリカチオンが架橋してタンパク質マトリックスを形成し、目的とする抗原が、そのタンパク質マトリックスへの有意の共有結合が存在しない状態でそのタンパク質マトリックスにより捕捉されており、前記免疫原組成物が、抗原単独、及びポリカチオンを含有しないタンパク質マトリックスワクチン組成物と比較して高い免疫原性を有する組成物。
2. ポリカチオンが、ポリ−Ｌ−リジン、分枝ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、スペルミジン、スペルミン、キトサン［２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮ）と２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ−（１−４）−連結コポリマー］、ポリアミンＮ７（ＣＡＳ ２９３２０−３８−５）、およびエチレンジアミノメチルポリスチレン（ＣＡＳ １７７９８７−９３−８）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. ポリカチオンがポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）である、請求項２に記載の組成物。
4. ポリ−Ｌ−リジンがα−ポリ−Ｌ−リジン（α−ＰＬＬ）またはε−ポリ−Ｌ−リジン（ε−ＰＬＬ）である、請求項３に記載の組成物。
5. ポリ−Ｌ−リジンがα−ポリ−Ｌ−リジン（α−ＰＬＬ）である、請求項４に記載の組成物。
6. 組成物が、直径５０ｎｍより大きい平均粒度を有するタンパク質マトリックス粒子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 組成物が、直径１００〜２０００ｎｍより大きい平均粒度を有するタンパク質マトリックス粒子を含む、請求項６に記載の組成物。
8. 抗原：キャリヤータンパク質のモル比が１：１０〜１０：１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 反応混合物中のポリカチオンの重量パーセントが０．００５〜０．１０％である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 目的とする抗原が２種類以上の抗原を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 目的とする抗原が多糖類である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 多糖類が、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の多糖類、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)の多糖類、炭疽菌(Bacillus anthracis)の多糖類、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)の多糖類、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)の多糖類、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)の多糖類、サルモネラ属(Salmonella)菌種の多糖類、赤痢菌属(Shigella)の多糖類、または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)の多糖類からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の多糖類が、莢膜タイプ３、４、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｆ、１７、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、２５Ａ、２５Ｆ、３３Ｆ、３５、３７、３８、４４、または４６からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
14. １種類以上のキャリヤータンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素Ａもしくはその変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素フラグメントＣ、細菌性フラゲリン、ニューモリシン、髄膜炎菌(Neisseria menningitidis)の外膜タンパク質、緑膿菌Ｈｃｐ１タンパク質、大腸菌(Escherichia coli)易熱性エンテロトキシン、志賀毒素様毒素、ヒトＬＴＢタンパク質、リステリオリシンＯ、細菌の全細胞からのタンパク質抽出物、炭疽菌(Bacillus anthracis)の防御抗原の優性ネガティブインヒビター（ＤＮＩ）変異体、または大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. （ｉ）目的とする抗原をキャリヤータンパク質およびポリカチオンと混合して混合物を形成し、（ｉｉ）キャリヤータンパク質およびポリカチオンを架橋させてタンパク質マトリックスを形成することを含み、目的とする抗原が、そのタンパク質マトリックスへの有意の共有結合が存在しない状態でそのタンパク質マトリックスにより捕捉されている、免疫原組成物の調製方法。
16. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原組成物であって、哺乳動物において目的とする抗原に対して免疫応答を誘発するための組成物。
17. 哺乳動物がヒトである、請求項１６に記載の組成物。
18. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原組成物を２種類以上含む免疫原組成物。

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