KR101670340B1 - 폴리양이온을 포함하는 단백질 매트릭스 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 대상 항원, 하나 이상의 캐리어 단백질 및 하나 이상의 폴리양이온을 포함하며, 상기 대상 항원이 가교된 캐리어 단백질 매트릭스 및 하나 이상의 폴리양이온에 포획된, 면역원성 조성물, 백신의 제조 방법, 및 백신 투여 방법에 관한 것이다.

Description

폴리양이온을 포함하는 단백질 매트릭스 백신 조성물 {PROTEIN MATRIX VACCINE COMPOSITIONS INCLUDING POLYCATIONS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2011년 5월 18일자 미국 가출원 번호 61/487,663에 대한 우선권을 주장하며, 이 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 면역원성 조성물, 백신의 제조방법 및 백신의 투여 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 폴리-L-라이신 또는 그외 폴리양이온(들)이 항원을 포획하는 단백질 매트릭스 형성에 사용되어, 가교된 캐리어 단백질 매트릭스에 대상 항원이 포획되는 것을 특징으로 하는 단백질 매트릭스에 관한 것이다.

박테리아 감염에 대한 백신 접종은 중요한 의학적 목표로서, 사실상 모든 개체들에게 권고되는 예방을 위한 의학적 개입 방법이다. 박테리아 감염 또는 박테리아 감염으로 인한 발병을 퇴치하기 위한 백신의 설계는 대개 박테리아에서 생산되는 독소 등의 박테리아 단백질을 표적으로 한다. 이러한 경우로는, 예를 들어, 탄저균, 디프테리아 및 파상풍 백신이 해당된다. 다른 백신 접근법은 박테리아의 외부 캡슐 (outer capsule)을 표적으로 하는 것이지만, 박테리아 병인체의 캡슐 층을 포함하는 다수의 항원들은 장기 면역 반응을 거의 또는 전혀 자극하지 않아, 이를 효과적인 백신 제조에 사용하긴 어렵다. 캡슐은 많은 박테리아들에서 외부 표면을 구성하고 있으며, 전형적으로는, 탄수화물, 아미노산 또는 알코올 등의 유기 화합물로 이루어진 폴리머로 구성되어 있다. 캡슐은 화학적으로 매우 다양하다. 다당류계 캡슐의 경우, 당 단위가 다양한 분자 배위로 서로 연결될 수 있으며, 포스페이트, 질소, 설페이트 및 그외 화학적 변형기로 추가로 치환될 수 있다. 캡슐은, 미생물이 숙주 대식세포와 다형핵 백혈구에 의해 효과적으로 식균 및 사멸되지 않도록 저해하는, 병독성 인자일 수 있다.

캡슐에 대한 항체는 미생물 표면에 보체(complement)의 고정을 매개함으로써 캡슐로 싸인 유기체에 대항하는 강력한 방어를 제공하며, 그로 인해 식균성 숙주 면역 세포에 의한 용혈 또는 옵소닌화, 흡수 및 사멸이 이루어질 수 있다. 미생물 캡슐에 대한 가장 강력한 항체는 IgG 항체이다. 캡슐 항원은, 일반적으로 T 세포의 도움을 필요로 하지 않으며 그에 따라 장기 지속형 면역 기억 반응을 일으키지 않는 면역 반응을 유도하기 때문에, T-비의존형 항원으로 분류된다. 그러나, 캡슐 항원에 단백질을 공유 결합시키면, 캡슐 항원에 "T-의존성"이 부여되게 되어, 이러한 T-의존형 항원은 헬퍼 T 세포 매개의 (T_h-의존형) IgG계 기억 B 세포나 또는 면역기억 반응(anamnestic response)을 일으키게 된다.

백신 항원에 보다 강력한 면역원성을 부여하고, 이상적으로는 T-의존성이 되도록 하기 위한 다양한 방법들이 연구되고 있다. 대부분의 박테리아 표면 다당류들은 그 자체적으로도 면역원성이며, 미생물 캡슐내 천연 항원을 인지하는 면역 반응을 도출할 수 있다. 그렇지만, 캡슐 다당류만을 백신으로 사용하게 되면, 일반적으로 장기간 지속되는 면역이 형성되지 않을 뿐만 아니라 2세 미만 아이를 면역화하는데에도 거의 유효하지 않다. 다당류 항원이 캐리어 단백질과 공유 결합하게 되면 다당류의 면역원성이 크게 증가될 수 있으며, 항원을 보유한 미생물에 의한 후속적인 감염으로부터 숙주를 방어하는 바람직한 T-의존적인 면역 반응 (또는 면역 기억)을 조성할 수 있는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 비-접합형 (unconjugated) 폐렴 백신, 예를 들어, 머크 사의 Pneumovax^®는 개체에서 침습성 폐렴 질환에는 효과적이지만, 장기 면역성을 형성하여 반복적인 면역화가 불필요한, 면역학적 기억과 바람직한 예방학적 면역성을 도출하는데에는 (예, 유아에서는) 효과적이지 않다. 폐렴 접합체 백신, 예를 들어, 화이자의 Prevnar^® (Pfizer Inc., USA)는 생후 2달된 유아에서도 높은 면역원성을 나타내며, T-의존적인 면역성을 유도하며, 매우 효과적인 것으로, 입증되었다.

접합체 백신이 면역학적으로 유망하지만, 제조하기가 매우 어렵고 복잡할 (고비용일) 수 있어, 전세계적으로 백신 접종 수요에 맞게 유통시키는데 제약이 된다. 예를 들어, Prevnar^®7의 경우, 접합에 사용되는 7가지의 다당류 항원을 제공하기 위해 사용된 각각의 스트렙토코커스 뉴모니아 (S. pneumoniae)를 생물반응조에서 배양하고; 세포를 회수하고; 다당류를 추출 및 정제하고, 적정 크기로 가수분해하고; 개개 항원을 단백질 캐리어에 접합시키고; 이 접합체를 정제한 다음, 유사한 방식으로 준비한 다른 6종의 다당류-단백질 복합체 (접합체)와 혼합하고; 멀티-접합체 혼합물에 최종적으로 명반(alum)을 첨가하여 보강한다. 7가 Prevnar^® 백신의 제조에는 200 GMP 단계 이상이 존재하는 것으로 추정된다.

최근 들어, 단백질 매트릭스 백신이 접합체 백신의 대안으로서 제안되었다. 2008년 4월 24일자로 공개된 미국 특허 공개 번호 US-2008-0095803 (Mekalanos, J.); 2008년 2월 21일자로 공개된 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/021076 (Mekalanos, J.); 및 2011년 3월 17자로 공개된 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/031893 (Killeen, K., et. al.)을 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 단백질 매트릭스 백신은, 캐리어에 대상 항원을 공유 접합시키는 것이 아니라, 대상 항원의 존재 하에 캐리어 단백질을 가교함으로써 제조된 캐리어 단백질 매트릭스 안에 항원을 포획하는 것이다. 캐리어 단백질에 항원이 유의적으로 공유 결합되는 것이 방지되고; 오히려, 항원은 매트릭스가 형성되는 (가교 반응) 동안에 단백질 캐리어에 의해 포획됨으로써 매트릭스와 조합된 상대로 유지된다. 이러한 단백질 매트릭스 백신은 항원만을 이용하여 제조된 백신에 비해 훨씬 강력한 면역원성을 발휘하는 것으로 입증되었으며; 또한 단백질 매트릭스 백신이 접합체 백신에서 볼 수 있는 유형의 면역 반응 (예, T-의존형 면역 유도)을 달성할 수 있다. 단백질 매트릭스 백신의 합성에는 복잡한 접합 반응이 수반되지 않으며, 전형적으로 단백질 매트릭스 백신을 제조하는데 요구되는 가공 단계의 수가 감소되며, 그래서 접합체 백신 보다 제조 비용이 저렴하다.

단백질 매트릭스 백신은 몇가지 이점을 제공하지만, 단백질 매트릭스 백신에 의해 도출되는 항원-특이 항체의 역가는 대개 대응되는 접합체 백신에 의해 도출되는 역가 보다 낮다. WO 2011/031893에서는, 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질 매트릭스 백신의 분리, 및 면역화를 위한 고분자량 단백질 매트릭스 입자가 함유된 분획을 선별하는 것이, 접합된 다당류 백신에 의해 도출되는 역가와 비슷한 수준의 역가를 유도할 수 있음을 교시하였다. 그러나, 이러한 새로운 기법에 대한 과학적 전망과 제조 및 비용 이점을 활용하기 위해, 면역원성이 증가된 단백질 매트릭스 백신을 제조하기 위한 수단을 제공하는 것이, 본 기술분야에서 지속적으로 제기되고 있는 기술적인 문제로 남아 있다. 면역원성 또는 효능이 보강된 개선된 단백질 매트릭스 백신에 대한 필요성은 여전히 존재하고 있다.

단백질 매트릭스 백신의 효능과 수율에 있어 놀라운 진보는 본 발명에 따라 제조된 백신에서 달성되는데, 본 발명에서는 폴리-L-라이신 (PLL) 또는 그외 폴리양이온을 다당류 또는 그외 항원을 포획하기 위한 단백질 매트릭스 형성에 사용된다. 이에, 단백질 매트릭스 백신의 품질과 수율의 개선은 항원(들)의 변형에 의해서가 아니라, 항원(들)을 포획하기 위해 사용되는 매트릭스의 성질과 조성에 주목함으로써 이루어졌다.

본 발명은 새로운 단백질 매트릭스 백신과 폴리양이온을 포함하는 1차 아민을 사용함으로써 매트릭스를 이용한 다당류의 포획을 개선하는 방법을 기술한다.

본 발명의 일 구현예는, (1) 하나 이상의 대상 항원, (2) 하나 이상의 캐리어 단백질 및 (3) 하나 이상의 폴리양이온을 포함하며, 상기 캐리어 단백질, 및 선택적으로 상기 폴리양이온이 가교되어 단백질 매트릭스를 형성하며, 상기 대상 항원이 상기 단백질 매트릭스에 의해 포획된, 면역원성 조성물이다. 이러한 조성물은, 항원, 캐리어 단백질 및 폴리양이온 성분을 혼합하고, 가교 반응을 개시하여 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온의 가교를 야기함으로써, 쉽게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리양이온, 예컨대 α-PLL을 포함하는 단백질 매트릭스 백신 조성물은, 항원 단독에 비해, 항원 및 캐리어의 혼합물에 비해, 및 폴리양이온이 포함되지 않은 단백질 매트릭스 백신 조성물에 비해, 증가된 면역원성을 가진다.

바람직한 구현예에서, 면역원성 조성물에서 하나 이상의 폴리양이온은 폴리-L-라이신, 폴리-L-아르기닌, 폴리-오르니틴, 스페르미딘, 스페르민, 키토산 [2-아미노-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcN)과 2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcNAc)의 β-(1-4)-연결된 공중합체], 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아민 N7 (CAS 29320-38-5) 및 에틸렌다이아미노메틸 폴리스티렌 (CAS 177987-93-8)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리양이온은 폴리-L-라이신 (PLL)이다.

추가적으로 바람직한 구현예에서, 상기 폴리-L-라이신은 α 폴리-L-라이신 (α-PLL; αPLL) 또는 엡실론 폴리-L-라이신 (ε-PLL; εPLL)이다.

바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 평균 입자 크기가 직경 50 nm 이상의 단백질 매트릭스 입자로 구성된다. 이러한 조성물은 항원, 캐리어 단백질 및 폴리양이온 성분들을 혼합하고, 가교 반응을 개시하여 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온의 가교를 유발한 다음, 반응 생성물을 가공하여 저분자량 종들을 제거함으로써, 쉽게 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 대상 항원과 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스를 포함하며, 상기 항원이 상기 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스로 포획되어 복합체를 형성한, 백신 조성물이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항원/캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 복합체는 50 nm 이상의 평균 입자 직경을 가진다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 복합체는 평균 입자 크기가 직경 > 100 nm, > 150 nm, > 200 nm, > 500 nm, > 1000 nm, > 2000 nm이거나 또는 심지어 보다 큰, 예를 들어 단백질 매트릭스 입자들을 분리하는 방법적인 한계 크기까지이다.

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에서, 백신 조성물의 항원/캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 복합체는 입자 크기 범위가 직경 50 nm 이상, 예컨대 직경 50 - 2000 nm이거나, 또는 예를 들어 100 - 200 nm, 200 - 400 nm, 250 - 500 nm, 120 - 1000 nm, 200 - 2000 nm의 범위내에서 선택되는 수치 및 그외 이러한 입자 크기 범위일 것이다. 본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에서, 조성물은 직경이 50 - 150 nm인 입자 크기를 가지는 복합체를 포함한다.

본 발명의 부가적으로 바람직한 구현예에서, 항원 : 캐리어 단백질의 몰 비는 1 : 10 내지 10 : 1이다.

바람직한 구현예에서, 반응 혼합물에서 폴리양이온의 중량 %는 0.005 내지 0.10%, 또는 0.05 mg/ml - 0.5 mg/ml의 범위이다.

추가적인 바람직한 구현예에서, 면역원성 조성물은 대상 항원을 2개 이상, 예를 들어, 대상 항원을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 또는 그 이상으로 추가로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신 조성물은, 포유류에 투여되었을 때, 포유류에서 T 세포-의존적인 면역 반응을 도출한다 (즉, 백신 접종받은 숙주에서 면역 기억을 형성함).

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 대상 항원은 다당류이다.

본 발명의 추가적인 바람직한 구현예에서, 다당류는 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 다당류, 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 다당류, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 다당류, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 다당류, 살모넬라 티피 (Salmonella Typhi) 다당류, 시트로박터 프레운디이 (Citrobacter freundii) 다당류, 살모넬라 종의 다당류, 쉬겔라 (Shigella) 다당류 또는 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그람 음성 박테리아의 O-항원은, 박테리아 감염에 있어 독특하고 종종 방어 항원인 LPS(리포폴리사카라이드)의 일부로서, 또한 본 발명에 사용하기 적합한 대상 항원이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아 다당류는 캡슐형 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44, 및 46으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 다당류이다.

바람직한 구현예에서, 하나 이상의 캐리어 단백질은 디프테리아 톡소이드, 예를 들어 무독성의 디프테리아 독소 단백질 단편 CRM197, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 또는 이의 돌연변이, 콜레라 독소 B 서브유닛, 파상풍 독소 단편 C, 박테리아 플라젤린, 뉴모라이신 (pneumolysin), 네이세리아 메닝기티디스의 외막 단백질, 슈도모나스 에어루지노사 Hcp1 단백질, 대장균 (Escherichia coli) 이열성 내독소, 쉬가 유사 독소 (shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 리스테리오라이신 O(listeriolysin O), 박테리아 전체 세포의 단백질 추출물, 바실러스 안트라시스의 방어 항원의 우성 음성 저해제 (DNI) 돌연변이, 또는 대장균의 베타-갈락토시다제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 면역 조성물은 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스에 포획된 대상 항원을 포함하며, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 백신 조성물의 다른 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, (i) 하나 이상의 대상 항원, 하나 이상의 캐리어 단백질 및 하나 이상의 폴리양이온을 혼합하는 단계, (ii) 캐리어 단백질 분자들 간에, 동일한 캐리어 단백질 분자의 다른 부위들 간에, 및/또는 캐리어 단백질 분자와 폴리양이온 간에 가교를 형성할 수 있는 가교제를 첨가하는 단계, 및 (iii) 가교 반응을 개시하는 단계를 포함한다. 추가적인 구현예들에서, 본 발명에 따른 백신 제조 방법은, 또한, (iv) 직경이 50 nm 이상인 입자 크기를 가진 가교 반응 생성물 복합체를 선택적으로 선별하는 추가적인 단계를 포함할 것이다. 가교제의 반응성 기들과 캐리어 단백질의 반응성 부위가 접촉 반응하는 경우, 혼합 및 개시 단계 (ii)와 (iii)는 동시에 이루어지거나 또는 한 단계로 볼 수 있다. 부가적으로, 반응 개시 단계 이후에 가교 반응을 약화시키는 단계를 포함시킴으로써, 예를 들어 적절한 퀀칭제나 차단제를 첨가함으로써, 가교 반응을 중지시키는 것이 유익할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 포유류 또는 대상에게 본원에 기술된 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 물질에 대해 개체를 백신 접종하거나 대상 항원에 대해 포유류에서 면역 반응을 도출하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 포유류는 인간이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물을 2 이상 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 특징들과 이점은 아래 상세한 설명, 도면 및 청구항으로부터 명확해질 것이다.

도 1은 크기 배제 크로마토그래피에 의한, 폴리-L-라이신 (PLL) 첨가 Vi-CRM197 PCMV 반응물과 PLL 무첨가 Vi-CRM197 PCMV 반응물의 분리를 도시한 그래프이다. Vi 다당류 단독, PLL을 함유한 Vi-CRM197 PCMV 반응물 및 PLL 비-함유성 Vi-CRM-PCMV를 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 분획내 Vi 다당류의 함량을 스테인-올 분석(Stains-all assay)을 이용하여 결정하였다.
도 2는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 Vi-CRM197-αPLL (150-300 kDa) PCMV 분리를 도시한 그래프이다. PCMV 반응물을 150 mL (30 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-100 컬럼에서 분리하였다. 분획에서의 Vi 다당류와 단백질의 함량을 각각 스테인-올 분석과 microBCA 분석으로 측정하였다. 음영 표시된 박스는 전임상 실험에서 수집하여 마우스 면역화에 사용된 분획들을 표시한다.
도 3은 크기 배제 크로마토그래피에 의한 Vi-CRM197-αPLL (150-300 kDa) PCMV의 분리를 도시한 그래프이다. PCMV 반응물은 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 분획의 Vi 다당류와 단백질의 함량을 각각 스테인-올 분석과 microBCA 분석으로 측정하였다. 음영 표시된 박스는 전임상 실험에서 수집하여 마우스 면역화에 사용된 분획들을 표시한다.
도 4는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 폐렴 구균성 다당류 18C (PPS18C)와 PPS18C-CRM-αPLL(15-30 kDa)-PCMV의 분리를 도시한 그래프이다. PPS18C와 PPS18C-CRM-PLL-PCMV는 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 분획내 다당류의 양은 안트론 분석으로 측정하였고, 단백질의 양은 microBCA 단백질 분석으로 측정하였다.
도 5는 αPLL 양 증가에 따른 포획된 Vi의 양 증가를 도시한 그래프이다. 4 mg/mL Vi를 0.01% αPLL (150-300 kDa), 0.02% αPLL (150-300 kDa) 또는 0.04% αPLL (15-30 kDa)이 첨가된 PCMV 반응물에 첨가하였다. 글루타르알데하이드와 CRM197을 첨가한 후, 반응물을 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 크기 배제 컬럼으로 분리하였다. 분획들은 각각 스테인-올 분석과 microBCA 분석으로 다당류와 단백질을 분석하였다.
도 6은 크기 배제 크로마토그래피에 의한 배치형 3가 PPS (PPS4, PPS18C, PPS23F)-CRM197-εPLL PCMV의 분리를 도시한 그래프이다. 3종의 폐렴 구균성 다당류 (각각 1.3 mg/mL, PPS4, PPS18C 및 PPS23F)를 하나의 PCMV 반응물에 첨가하였다. 반응물은 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 컬럼 분획에 대해 총 다당류 및 단백질을 안트론 분석과 microBCA 분석을 각각 이용하여 분석하였다. 음영 표시된 박스는 전임상 면역원성 실험에서 마우스 면역화를 위해 모은 분획을 표시한다.
도 7은 크기 배제 크로마토그래피에 의한 배치형 13가(valent) PPS-CRM197-αPLL (150-300 kDa) PCMV의 분리를 도시한 그래프이다. Prevnar^® 13 접합체 백신에 존재하는 13가지의 폐렴 구균성 다당류들을 하나의 PCMV 반응물 (각 다당류 당 0.3 mg/mL)에 첨가하였다. 반응물은 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 컬럼 분획에 대해 총 다당류 및 단백질을 안트론 분석과 microBCA 분석을 각각 이용하여 분석하였다. 음영 표시된 박스는 전임상 면역원성 실험에서 마우스 면역화를 위해 모은 분획을 표시한다.
도 8은 크기 배제 크로마토그래피에 의한 배치형 3가 PPS (PPS4, PPS18C, PPS23F)-CRM197-αPLL (150-300 kDa) PCMV의 분리를 도시한 그래프이다. 3가지의 폐렴 구균성 다당류 (각각 1.3 mg/mL, PPS4, PPS18C및 PPS23F)를 하나의 PCMV 반응물에 첨가하였다. 반응물은 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 컬럼 분획에 대해 총 다당류 및 단백질을 안트론 분석과 microBCA 분석을 각각 이용하여 분석하였다. 음영 표시된 박스는 전임상 면역원성 실험에서 마우스 면역화를 위해 모은 분획을 표시한다.
도 9는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 배치형 23-가 PPS-CRM197-αPLL (150-300 kDa) PCMV의 분리를 도시한 그래프이다. 다당류 백신인 Pneumovax^®에 존재하는 23종의 다당류들을 하나의 PCMV 반응물에 첨가하였다 (각 다당류 당 0.17 mg/mL). 반응물은 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 컬럼 분획에 대해 총 다당류 및 단백질을 안트론 분석과 microBCA 분석을 각각 이용하여 분석하였다. 음영 표시된 박스는 전임상 면역원성 실험에서 마우스 면역화를 위해 모은 분획을 표시한다.

단백질 매트릭스 백신, 특히 단백질 캡슐 매트릭스 백신 (PCMV)은 2008년 4월 24일자로 공개된 미국 특허 공개공보 US-2008-0095803 (Mekalanos, J.), 2008년 2월 21일자로 공개된 국제 특허 출원 공개공보 WO 2008/021076 (Mekalanos, J.), 및 2011년 3월 17일자로 공개된 국제 특허 출원 공개 공보 WO 2011/031893 (Killeen, K., et. al.)에 기술되어 있으며, 이들 문헌들 모두 그 전체가 본원에 의해 본 명세서에 포함된다. 이들 공개문헌들은, 단백질 매트릭스 백신이 전형적인 PS-단백질 접합체 백신의 강력한 면역학적 특성을 가지지만, 바람직하게는, 대상 항원을 캐리어 단백질에 커플링시키기 위한 상당한 공유 결합이 형성되지 않는다는 점에서 접합체 백신과는 다르다는 것을, 교시하고 있다. 즉, 단백질 매트릭스 백신 (캐리어 단백질 매트릭스/항원 복합체)은 항원이 캐리어에 결합되는 기존의 접합체 백신과는 구분된다. 단백질 매트릭스 백신에서, 대상 항원, 예를 들어, 다당류, 캡슐 유기 폴리머 또는 기타 항원은 캐리어 단백질 매트릭스 내에 포획된다.

병원체의 캡슐 바이오폴리머 또는 다당류가 가교된 단백질 매트릭스에 포획된 경우, 이러한 백신을 단백질 캡슐 매트릭스 백신 (PCMV)이라고 한다. WO 2008/021076과 US 2008-0095803에 기술된 바와 같이, 모델 T-비의존형 캡슐 항원, 폴리-감마-D-글루탐산 (PGA) 뿐만 아니라 알긴산 (알기네이트) 및 덱스트란, 및 예시적인 캐리어 단백질, 우성 음성 저해제 돌연변이 (DN1)를 기재로 한 백신을 비롯하여, PCMV를 제조하였다. DN1은 바실러스 안트라시스의 방어 항원 (PA)이 돌연변이된 형태로서, Benson, et al., Biochemistry, 37:3941-3948 (1998)의 방법으로 대장균로부터 제조되었다. 그외 PCMV 구현예들과 PCMV 입자들의 크기-분획화의 이점은 WO 2011/031893에 기술되어 있다.

본 발명은 단백질 매트릭스 내 항원의 개선된 포획을 통해 단백질 매트릭스 백신 조성물의 면역원성과 수율이 강화된다는 발견과 관찰 결과에 관한 것이다.

본 발명이 보다 명확하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 아래 약어들과 용어들이 아래 정의된 바와 같이 사용된다.

하나 이상의 치징된 요소 또는 단계들을 "포함하는" 것으로 본원에 기술된 조성물 또는 방법은, 제한을 두는 것이 아니며, 지칭된 요소 또는 단백질이 필수적이긴 하지만, 다른 요소 또는 단계들이 조성물 또는 방법의 범위내에 부가될 수 있다는 것을 의미한다. 장황해지지 않도록 하기 위해, 하나 이상의 지칭된 요소 또는 단계를 "포함하는" (또는 "포함한다") 것으로 기술된 임의의 조성물 또는 방법은, 조성물 또는 방법이 지칭된 필수 요소 또는 단계를 포함하며 더불어 조성물 또는 방법의 기본적이고 새로운 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 부가적인 요소 또는 단계도 포함할 수 있음을 의미하는, 동일한 요소 또는 단계로 "필수적으로 구성된" (또는 "필수적으로 구성된다")에 대응되는, 보다 한정된 조성물 또는 방법도 기술한다. 또한, 하나 이상의 지칭된 요소 또는 단계를 "포함하는" 또는 "필수적으로 구성된" 것으로 본원에 기술된 모든 조성물 또는 방법은, 임의의 그외 지칭되지 않은 요소 또는 단계를 제외하는 지칭된 요소 또는 단계로 "구성된" (또는 "구성된다")에 대응되는, 보다 제한적인, 한정된(closed-ended) 조성물 또는 방법도 기술한다. 본원에 개시된 모든 조성물 또는 방법에서, 임의의 지칭된 필수 요소 또는 단계에 대한 공지되거나 개시된 등가체들은 이러한 요소 또는 단계를 치환할 수 있다. 또한, "로 이루어진 군으로부터 선택되는" 요소 또는 단계는 이후에 열거된 요소들 또는 단계들 중 하나 이상을 지칭하며, 열거된 임의의 2 이상의 요소 또는 단계들의 조합도 포함한다.

본원에서, 백신 조성물과 함께 사용되는 용어 "투여하는"은, 개체에서 면역 반응을 유도할 만큼 충분한 용량으로 인간 개체 등의 개체에게 백신 조성물을 제공하는 것을 의미하며, 이때, 면역 반응으로 백신 조성물에 함유된 항원 (예로, 치료학적 백신의 경우 항원은 병원체의 항원 마커에 해당됨)에 특이적으로 결합하는 항체들이 생성된다. 바람직한 투여로는, 투여되는 백신 조성물의 투여 형태, 특성 및 활성에 따라 적절하게, 근육내 주사, 진피내 주사, 정맥내 주사, 복막내 주사, 피하 또는 경피 주사, 흡입 또는 섭취를 포함한다. 투여는 백신의 1회 투여 또는 백신의 다회 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 감염성 물질에 의한 감염을 예방하기 위해 개체에서 항체 생산을 부스팅하도록 2차 ("부스터") 투여가 계획된다. 백신의 투여 빈도와 투여량은 백신의 구체적인 활성에 따라 결정되며, 일상적인 실험을 통해 쉽게 결정할 수 있다.

용어 "가교(cross-link)" 또는 "가교(crosslink)"는 2개의 분자들 간의, 마크로분자들 간의 또는 분자들의 조합에서의, 예컨대 캐리어 단백질 분자들 간의, 또는 동일 분자의 2가지 부위들 간의, 예컨대 동일 단백질의 2개의 아미노산 잔기들 간의, 또는 캐리어 단백질 분자와 폴리양이온 분자 간의, "0-길이의" 링커가 사용된 경우 (직접 결합 형성) 직접적으로, 또는 2가지의 반응 부위들 간에 분자 브릿지 또는 연결을 형성하는 2 관능성의 가교제 분자를 이용함으로써, 공유 결합을 형성하는 것을 의미한다. 2 관능성 가교제는, 각각이, 2개의 개별 분자들 중 하나와 공유 결합을 형성할 수 있거나 또는 (예로, 캐리어 단백질 등의 분자에서 "루프" 또는 "폴드"를 형성하기 위해) 동일 분자에서 2개의 개별 기들 간에 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기 2개를 나타낸다. 링커의 예로는 2개의 캐리어 단백질 분자들 간 및/또는 2개의 폴리양이온 분자들 간 및 캐리어 단백질 분자와 폴리양이온 분자 간에 가교를 형성할 수 있는, 2 관능성 가교제를 포함한다.

용어 "항원"은 본원에서 항체 또는 항체 단편에 의해 특이적으로 결합되는 모든 분자 또는 분자들의 조합을 지칭한다.

용어 "2 관능성 가교제" 또는 "2 관능성 링커"는 본원에서, 함께 연결하기 원하는 2개의 개별 분자, 원자 또는 분자들의 콜렉션에서 반응성 기들과 공유 결합을 각각 별도로 형성할 수 있는 관능기를 2개 가지는 화합물을 의미하다. 2 관능성 링커의 예는, 예를 들어, G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996) 및 Dick and Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," in Conjugate Vaccines (Cruse and Lewis, eds), Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, vol.10, pp. 48-114)에 기술되어 있다. 바람직하게는, 2 관능성 링커는 글루타르알데하이드, 비스[설포숙신이미딜]서베레이트 또는 디메틸 아디피미데이트이다.

용어 "링커" 또는 "가교제"는 본원에서 2 이상의 분자 또는 동일 분자내 2 이상의 부위들을 연결하는 공유 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 화합물을 지칭한다. 바람직한 링커로는, 예를 들어, 글루타르알데하이드 또는 식 OHC-R-CHO의 기타 다이알데하이드 화합물 (R은 탄소수 1-12의 선형 또는 분지형의 2가 알킬렌 모이어티, 탄소수 1-12의 선형 또는 분지형의 2가 헤테로알킬 모이어티, 탄소수 2-12의 선형 또는 분지형의 2가 알케닐렌 모이어티, 탄소수 2-12의 선형 또는 분지형의 2가 알키닐렌 모이어티, 탄소수 5-10의 2가 방향족 라디칼, 탄소수 3-10의 사이클릭 시스템, -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂- (q = 1 - 4), 또는 2개의 알데하이드 기를 연결하는 직접 화학 결함임)을 포함한다. 연결은 연결 (브릿징) 분자를 사용하지 않는 직접 연결일 수 있다. 예를 들어, 카르복시기, 예컨대 캐리어 단백질 Asp 또는 Glu 잔기의 측쇄의 카르복시기는 예컨대 Lys 잔기의 측쇄 상의 유리 아미노기에 카로보다이이미드 화학법을 이용하여 연결시키거나, 또는 예를 들어 Gln 잔기의 카르복스아미드 기와 유리 아미노기의 가교를 촉매하는 트랜스글루타미다제를 이용하여 효소학적으로 연결시킬 수 있다.

항체 생산 유도 측면에서 용어 "부스트"는 항원에 2차 노출 시 발생하는 기억 B-세포의 활성화를 지칭한다. 이는 또한 "부스터 반응"으로서 언급되기도 하며, 항체 생산 능력이 장기간 유지되게 하는 긴 수명의 "2차" 기억 면역 반응을 의미한다.

백신 조성물에서 용어 "캐리어 단백질"은 자신에 대해 및/또는 캐리어 단백질 및 폴리양이온과 조합되거나 복합체를 형성한 항원에 대해 면역 반응을 일으키는 백신 조성물에 사용되는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 단백질 매트릭스 백신 조성물에서, 항원은 캐리어 단백질이 서로 및/또는 폴리양이온과 가교된 매트릭스 내에, 바람직하게는 항체가 매트릭스에 유의하게 공유 결합되지 않으면서 포획된다. 접합체 백신 조성물에서, 항원은 캐리어 단백질과 반응하여, 항원과 캐리어 단백질은 고의적으로 서로 공유적으로 연결된다. 바람직하게는, 캐리어 단백질은 T-헬퍼 세포에 의해 인지되는 에피토프들을 포함한다. 또한 "캐리어 단백질"의 정의에는, 반응성 부위를 여러개 가진 분지형 펩타이드인 멀티-항원성 펩타이드(MAP)도 포함된다. 바람직하게는, MAP는 라이신 (Lys) 잔기를 포함한다. 바람직한 캐리어 단백질의 예로는, 독소와, 예를 들어, 반응원성을 낮추기 위해 돌연변이될 수 있는, 톡소이드 (화학적 또는 유전적)를 포함한다. 적합한 캐리어 단백질로는, 예를 들어, 디프테리아 독소 또는 이의 무독성 돌연변이, 예컨대, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 독소 또는 이의 무독성 돌연변이, 예컨대 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 에어루지노사의 외독소 A 또는 이의 무독성 돌연변이, 콜레라 독소 B 서브유닛, 파상풍 독소 단편 C, 박테리아플라젤린, 뉴모라이신, 리스테리오라이신 O (LLO 및 관련 분자들), 네이세리아 메닝기티디스의 외막 단맥질, 슈도모나스 에어루지노사의 Hcp1 단백질, 대장균의 이열성 장독소, 쉬가-유사 독소, 인간 LTB 단백질, 박테리아 전체 세포 유래 단백질 추출물, 바실러스 안트라시스 방어 항원에 대한 우성 음성 저해제 돌연변이 (DN1) 또는 대장균의 베타-갈락토시다제, 또는 대상 항원을 포획할 수 있는 매트릭스를 형성하기 위해 가교될 수 있는 모든 그외 단백질을 포함한다.

본원에서, 항원에 대한 용어 "포획된"은, 항원이, 캐리어 단백질 및 폴리양이온, 특히, 항원과 조합 또는 복합체를 형성하는 매트릭스를 형성하기 위해, 선택적으로 폴리양이온 분자와도 가교된 가교된 캐리어 단백질과 조합 또는 복합체를 형성하며, 항원이 생리 조건에서 캐리어 단백질 및 폴리양이온과 복합체 형태로 유지되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 항원은, 항원과 캐리어 단백질/폴리양이온 간의 유의한 공유 결합을 형성하지 않으면서, 캐리어 단백질 및 폴리양이온과 복합체 형태로 포획된다. "유의한 공유 결합을 형성하지 않으면서"는, 본원에서, 캐리어 단백질에 공유 결합된 항원이 50% 이하라는 의미이다. 바람직하게는, 항원은, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 또는 바람직하게는 5% 이하로, 단백질 매트릭스 백신 조성물에서, 캐리어 단백질 또는 폴리양이온과 공유 결합된다. 후술된 내용으로부터 명확해지는 바와 같이, 단백질 매트릭스 백신 설계 및 생산 목적은 항원을 접합체 백신의 가장 특징적인 캐리어에 힘들게 화학적으로 연결하는 것을 회피하고자 하는 것이다. 단백질 매트릭스 백신에서, 항원은 캐리어에 접합에 의해서가 아닌 가교된 매트릭스에 포획됨으로써 캐리어와 조합되며, 사실상 항원이 캐리어 단백질 또는 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스에 가교될 가능성이 방지되는 수준으로, 조합된다. 단백질 매트릭스 백신 제조 공정에서, 항원은 가교시킬 용도의 매트릭스 구성성분들로 구성된 혼합물에 함유되지만, 항원이 계획적으로 가교 반응에 참여하지 않거나 또는 적어도 유의한 수준의 가교 형성에 참여하지 않는다. 그러나, 항원의 존재 하에 단백질 매트릭스를 형성하는 공정을 수행하게 되면, 항원이 캐리어 단백질 매트릭스 (또는 본 발명의 일 구현예에서, 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스)와 유의하게 가교되지 않으면서, 내부에 포획되게 된다.

"감염"은 미생물, 예를 들어, 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스가 개체에 침입하는 것을 의미한다. 감염은, 예를 들어, 개체의 체내 또는 신체 상에 정상적으로는 존재하는 미생물의 과량 증가 (multiplication) 또는 개체 내부 또는 상에 정상적으로 존재하지 않는 미생물의 증가를 포함할 수 있다. 개체의 체내 또는 신체 상에 부적절하게 (예, 병원성) 과도한 미생물 집단이 존재하거나, 또는 미생물 집단(들)의 존재가 개체의 세포를 손상시키거나 조직에 병리학적 증상을 야기한다면, 개체는 미생물 감염을 앓고 있는 것이다.

감염성 물질"은 감염을 야기하는 미생물을 의미한다.

용어 "면역원성"은 개체에서 면역 반응을 일으키는 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 면역 반응은 IgG 항체 생성을 수반하는 T 세포 의존적인 면역 반응이다.

용어 "미생물 캡슐 폴리머"는 미생물의 캡슐 코팅 내에 또는 상에 존재하는 폴리머를 지칭한다. 바람직하게는, 미생물 캡슐 폴리머는 다당류, 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아미노 당을 함유하는 다당류, 설폰화된 당, 다른 설페이트-변형된 당 또는 포스페이트-변형된 당을 함유하는 다당류, 다가알코올, 폴리아미노산, 테이코산 또는 리포폴리사카라이드의 O 측쇄 등의 유기 폴리머이다.

"단량체"는 비슷한 단량체들과 2 이상의 결합을 형성할 수 있으며, 종종 "폴리머"의 일부일 경우, 단량체 하위 구조가 반복된 체인 또는 분지형의, 연결된 체인 시리즈를 형성할 수 있는, 분자 구조를 지칭한다.

"유기 폴리머"는 각가 탄소, 산소, 수소 또는 질소 원자나 포스페이트 또는 설페이트 모이어티로 구성된, 공유 결합된 단량체로 구성된 폴리머를 지칭한다. 바람직하게는, 유기 폴리머는 다당류, 인다당류, N-아세틸 치환된 아미노 당을 함유하는 다당류, 설폰화된 당, 다른 설페이트-변형된 당 또는 포스페이트-변형된 당을 함유하는 다당류, 당, 다가알코올, 폴리아미노산, 테이코산 또는 리포폴리사카라이드의 O 측쇄이다.

"다가알코올"은 카르보닐기가 1차 또는 2차 하이드록시기로 환원된 탄수화물의 수소화된 형태이다. 다가알코올의 예로는 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 예를 들어, 폴리메틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜을 비롯한 폴리알킬렌 글리콜 (PAG); 폴리-비닐 알코올 (PVA); 폴리에틸렌-co-말레산 무수물; 폴리스티렌-co-말산 무수물; 카르복시메틸-덱스트란을 비롯한 덱스트란; 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스 카르복시에틸셀룰로스 및 하이드록시프로필셀룰로스를 비롯한 셀룰로스; 키토산의 가수분해물; 하이드록시에틸-스타치 및 하이드록시 프로필-스타치 등의 스타치; 글리코겐; 아가로스 및 이의 유도체; 구아르 검; 풀룰란(pullulan); 인슐린; 잔탄 검; 카라기난; 펙틴; 알긴산 가수분해물; 소르비톨; 글루코스, 만노스, 갈락토스, 아라비노스, 굴로스, 자일로스, 트레오스, 소르보스, 프럭토스, 글리세롤, 말토스 셀로바이오스, 슈크로스, 아밀로스, 아밀로펙틴의 알코올; 또는 모노프로필렌 글리콜 (MPG)이 있다.

"폴리 아미노산" 또는 "폴리아미노산"은 펩타이드 결합으로 연결된 2 이상의 아미노산을 의미한다. 바람직하게는, 폴리아미노산 (예, 동형폴리머)은 동일 아미노산의 반복적인 아미노산 서열 또는 체인을 포함하는 펩타이드이다.

"폴리양이온" 또는 "폴리양이온성"은 복수의 양 전하를 띄는 임의의 마크로분자 이온을 지칭한다. 바람직하게는, 폴리양이온은 유리 아민기, 예컨대 폴리아미노산 폴리-L-라이신을 가진다. 유리 아민기를 포함하는 그외 바람직한 폴리양이온의 예로는, 가교될 수 있으며 양이온으로서 작용할 수 있는 GlcN 잔기의 유리 아민기를 포함하는, 키토산 (2-아미노-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcN)과 2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcNAc)의 β-(1-4)-연결된 공중합체) 등의 천연 폴리머와, 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아민 N7 (CAS 29320-38-5) 및 에틸렌다이아미노메틸 폴리스티렌 (CAS 177987-93-8) 등의 유리 아민기를 포함하는 시판 합성 폴리머를 포함한다.

"폴리-L-라이신" 및 "PLL"은 α-폴리-L-라이신 (α-폴리-L-라이신; αPLL), ε-폴리-L-라이신 (ε-폴리-L-라이신; εPLL; 폴리[이미노[(2S)-2-아미노-1-옥소-1,6-헥산디일]]), 또는 이들의 조합 및 공중합체를 의미한다. 폴리-L-라이신의 라이신 잔기는 카르복시기와 알파 (α-PLL) 또는 ε (ε-PLL) 아민 기 간의 펩타이드 결합을 통해 연결된다. 바람직하게는, 폴리-L-라이신은 α-폴리-L-라이신이다. α-폴리-L-라이신은 화학적으로 합성되며, 다양한 분자량, 예컨대, 0.5 내지 300 KDa으로 수득할 수 있다. ε-폴리-L-라이신은 박테리아 발효에 의해 생산되는 필수 아미노산 L-라이신으로 구성된 작은 천연 동형폴리머이며, 예를 들어, ε-폴리-L-라이신은 스트렙토마이세스 알불루스 (Streptomyces albulus)에서 분리할 수 있으며, 대략 4000 Da의 평균 분자량을 가진다.

본 발명에서 "단백질 매트릭스"는 단백질 분자들이 가교되어, 동일 단백질 분자내 2가지 부위들 간의 또는 다른 단백질 분자들의 2가지 부위들 간에 연결 또는 직접 결합을 형성함으로써 형성된, 다량체 구조(multimeric structure)이다. 본 발명에서, "캐리어 단백질 매트릭스"는, 동일한 캐리어 단백질 분자에서 2가지의 반응성 부위들 사이에 (이로써 분자내 루프 또는 폴드 구조가 형성됨) 또는 다른 캐리어 단백질 분자들의 반응성 부위들 사이에 (이로써 캐리어 단백질 폴리머가 형성됨) 가교가 형성되는, 캐리어 단백질로 수행되는 가교 반응에 의해 형성된 단백질 매트릭스를 지칭한다. 용어 "캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스"는, 본원에서, 캐리어 단백질과 폴리양이온 혼합물 중에서 수행되는 가교 반응에 의해 형성된 단백질 매트릭스로, 가교는 적어도 캐리어 단백질 분자내에서 또는 캐리어 단백질 분자들 사이에 이루어지거나 (이로써 매트릭스에 폴리양이온을 포획할 수 있는 캐리어 단백질 매트릭스가 형성됨) 또는 가교는 캐리어 단백질 분자내에서 또는 캐리어 단백질 분자들 사이에서 뿐만 아니라 폴리양이온 분자내 또는 폴리양이온 분자들 사이에서도 형성된다 (이로써 가교된 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온 단량체를 포함하는 매트릭스가 형성됨). 단백질 매트릭스 형성시 가교 정도는, 가교 반응물에 대한 신중한 선택과, 단량체 성분 상의 가교에 이용가능한 반응성 부위, 가교 반응에 사용되는 가교제의 양 조절, 반응 시간 조절 및 반응성 부위를 차단하거나 가교 반응을 중단시키기 위한 시약의 사용을 고려함으로써, 조절할 수 있다. 이러한 매개변수들의 조절이 포획될 수 있는 항원의 양, 포획된 항원이 단백질 매트릭스/항원 복합체로부터 해리가능한 속도, 및 형성된 단백질 매트릭스의 입자 크기에 영향을 줄 것이다. 이들 특성들 모두 본 발명의 단백질 매트릭스 백신 조성물의 면역원성에 영향을 미친다.

용어 "쉬프 염기 환원"은, 아조메틴 또는 식 R₁R₂C=N-R₃ (R₁, R₂ 및 R₃는, 전형적으로, 탄소 원자를 포함하는, 화학적 하부 구조임)의 화합물을, 쉬프 염기의 이중 결합을 수소 원자로 포화하는 환원제에 노출시키는 것을 지칭한다. 화학적 환원 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다.

항체 또는 이의 단편에 대한 용어 "특이적으로 결합한다"는, 본원에서, 특정 항원, 예컨대 단백질 또는 이의 분절에 대한 친화성이, 임의의 다른 동량의 항원에 비해, 높은 것을 의미한다. 항체 또는 항체 단편은, 바람직하게는, 효소 연계 면역흡착 분석 (ELISA) 등의 표준 방법을 이용하여 측정된 바와 같이, 관련 항원 등의 임의의 다른 동량의 항원에 비해 적어도 2배, 5배, 10배, 30배 또는 100배 높은 친화성을 그것의 항원에 대해 가진다.

"개체"는 미생물에 감염될 수 있는 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 개체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 랫, 소, 양, 염소 또는 말 등의 포유류이다. 인간 개체는 성인, 어린이, 영아, 유아, 사춘기 이전 어린이일 수 있다.

"T 세포-비의존형 항원"은 T 헬퍼 림프구의 협력없이도 항체가 생성되는 항원을 지칭한다. T 세포-비의존형 항원은 T 세포 림프구의 협력없이 B 림프구를 직접 자극할 수 있다. 바람직한 T 세포-비의존형 항원의 예로는 캡슐 항원 폴리-감마-D-글루탐산 (PGA), 알긴산 (일기네이트), 덱스트란, 다당류 (PS), 폴리 아미노산, 다가알코올 및 핵산을 포함한다.

용어 "백신", "백신 조성물" 및 "면역원성 조성물"은, 본원에서, 척추 동물 개체에게 투여하였을 때, 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 불러일으키는 대상 항원을 포함하는 모든 조성물을 지칭한다. 본 발명의 목적이 방어 면역 반응을 도출할 수 있는 (예로, 백신에 포함된 항원을 천연적으로 보유하는 병원체로부터 백신 접종받은 개체를 보호할 수 있는) 백신을 제공하는 것이지만, 방어 면역화가, 예를 들어, 1회 투여한 이후의 본원 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"에 필수적인 특성은 아니다.

본 발명의 단백질 매트릭스 백신 조성물은 면역 반응을 발생시키고자 하는 항원과, 매트릭스 형성에 사용되는 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온 간에, 공유 연결을 필요로하지 않는다. 이는, 단백질 매트릭스 백신 조성물의 제조를 단순화하여, 접합체 백신 기술에 비해 제조 비용을 절감하는데 유익하다. 다당류 (PS)-단백질 접합체 백신은 개발 도상국에서 생산 및 판매하기 어려울 만큼 비싼 것으로 확인되었다. 기존 접합체 백신은, 각 백신에 요구되는 고도의 전문적인 화학적 방법과 PS 항원과 캐리어 단백질 둘다의 생산 및 정제 비용으로 인해, 저렴하게 제조하기 어렵다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 기존에 다루기 어려운 항원에 대해 안전하게 면역성을 유도할 수 있는 백신 요건을 충족시킨다. 본원에 기술된 백신 조성물은 (한가지 면역 반응을 유도하기 위해 항원 하나를 포함하는) 1가 또는 (다중 면역 반응을 유도하기 위해 복수의 항원을 포함하는) 다가일 수 있다.

그외 용어들의 의미는 이것이 표현된 문맥으로 또는 유기 화학, 약리학, 미생물학, 단백질 생화학 및 면역학 분야의 당업자들을 비롯하여 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이 이해될 것이다.

본 발명은, (1) 하나 이상의 대상 항원, (2) 하나 이상의 캐리어 단백질 및 (2) 하나 이상의 폴리양이온을 포함하며, 상기 캐리어 단백질 및/또는 상기 폴리양이온이 가교되어 단백질 매트릭스를 형성하며, 상기 대상 항원이 상기 단백질 매트릭스에 의해 포획된, 면역원성 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 항원, 캐리어 단백질 및 폴리양이온 성분들을 혼합한 다음, 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온의 가교를 유발하기 위해 가교 반응을 개시함으로써, 쉽게 제조할 수 있다. 단백질 매트릭스 백신 제조 방법의 대안적인 구현예에서, 구성 성분들의 첨가 순서는 다양할 수 있지만, 일반적으로 가교된 단백질 매트릭스가 대상 항원을 첨가하기 전에 형성한다면, 원하는 포획이 발생되지 않고 항원이 해리된 구성 성분으로 잔류한다. 바람직한 구현예에서, 폴리양이온과 다당류 항원을 함께 인큐베이션한 다음, 가교제를 첨가한 후, 캐리어 (매트릭스-형성) 단백질을 첨가한다. 본 발명에 따른, 폴리양이온, 예컨대, α-PLL이 첨가된 단백질 매트릭스 백신 조성물은 단백질 매트릭스로의 항원 포획을 개선시켜, 항원 단독에 비해 또는 폴리양이온이 첨가되지 않은 단백질 매트릭스 백신 조성물과 비교하여, 면역원성이 증가된다.

본 발명은, 특히, 폴리양이온을 포함하는 단백질 캡슐 매트릭스 백신 조성물, 이 조성물의 제조 방법, 및 항원, 특히 T 세포-비의존형 항원 또는 다당류(PS), 다가알코올, 폴리 아미노산 및 기타 유기 폴리머 등의 정상적으로 약학적 면역 반응을 야기하는 항원에 대한 면역원성을 제공하기 위한 조성물의 투여 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 전형적인 PS-단백질 접합체 백신의 강력한 면역학적 특성을 가지지만, 바람직하게는, 대상 항원, 예컨대 PS 또는 캡슐 유기 폴리머를 캐리어 단백질/폴리양이온에 커플링하는데 유의한 원자 공유 결합이 필요하지 않다는 점에서 접합체 백신과 상이하다. 오히려, 대상 항원, 예컨대 PS 또는 캡슐 유기 폴리머는 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 내에 포획된다. 예를 들어, 단백질 매트릭스는, 캐리어 단백질 분자가, 용해성 항원, 예컨대 PS 또는 캡슐 유기 폴리머의 존재 하에, 그 자신과, 다른 캐리어 단백질 분자와 및/또는 폴리양이온과 공유 가교함으로써, 형성될 수 있다. 상호 고도로 가교된 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온은, 항원을 포착(포획)할 수 있으며 항원 제시 세포에 의한 항원 흡수를 촉진시킬 수 있는 매트릭스를 형성할 수 있으며, 그 결과 B 세포에 의한 항체 생산을 자극하게 된다. 본원에 기술된 바와 같이, 매트릭스 내 항원의 포획 수준은 폴리양이온, 예컨대 폴리-L-라이신을 첨가함으로써 강화되어, PCMV 입자 수율이 증가되고, 폴리양이온을 사용하지 않고 형성시킨 항원/단백질 매트릭스 복합체 또는 항원 단독에 비해 PCMV 조성물의 면역원성이 강화된다.

개념상, 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스는 항원을 에워싼 "메쉬" 형태로, 또는 비유하자면 항원이 "실"이고 가교된 단백질/폴리양이온의 단백질 또는 복합체가 "구슬"인 일련의 실에 구슬이 꿰인 형태로 보일 수 있다. 항원은, 캐리어 단백질이 항원을 둘러싸 항원 주변으로 고리를 형성하거나 또는 항원이 내부에 엉켜 있는 3차원의 메쉬를 형성한다면, 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 내에 포획된다. 항원이 포획되면, 바람직한 양의 항원이 항원 캐리어와 조합되게 되며, 항원이 캐리어 단백질과 공유 결합될 만큼 유의한 가교는 형성되지 않는다. 충분한 양의 항원 및/또는 포획을 통한 캐리어와의 조합 지속성은, 단백질 매트릭스 백신은 항원 단독으로 또는 항원이 단순히 캐리어 단백질과 혼합된 형태로 면역화하였을 때와 비교하여, 강화된 면역원성을 구현가능하게 한다. 본 발명에 따른 단백질 매트릭스 백신 조성물은 항원이 캐리어에 공유 결합된 시판되는 접합체 백신에 상응하는 면역원성을 달성하는 것으로 입증되었다.

바람직한 구현예에서, 캐리어 단백질 분자 및/또는 폴리양이온 분자는 공유적으로 가교된다. 예를 들어, 공유 연결은 라이신 측쇄 (예, 폴리-L-라이신)의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타메이트 측쇄(예, 캐리어 단백질)의 카르복시기 간의 펩타이드 결합을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 공유 가교는 식 OHC-R-CHO의 화합물 (R은 탄소수 1-12의 선형 또는 분지형의 2가 알킬렌 모이어티, 탄소수 1-12의 선형 또는 분지형의 2가 헤테로알킬 모이어티, 탄소수 2-12의 선형 또는 분지형의 2가 알케닐렌 모이어티, 탄소수 2-12의 선형 또는 분지형의 2가 알키닐렌 모이어티, 탄소수 5-10의 2가 방향족 라디칼, 탄소수 3-10의 사이클릭 시스템, -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂- (q = 1 - 4), 또는 2개의 알데하이드 기를 연결하는 직접 화학 결함임) 등의 가교제를 이용하여 개시될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 공유 연결은 가교제로서 글루타르알데하이드를 이용하여 형성되거나, 또는 다른 예로 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 카르보다이이미드 또는 비스-바이아조트화된(azotized) 벤지딘, 비스[설포숙신이미딜]서베레이트, 또는 다이메틸 아디프이미데이트와 같은 물질이 사용될 수 있다. 단백질 매트릭스 백신 조성물의 제조시에는 필요하지 않더라도, 예컨대 항원 상에 존재할 수 있는 비-차단된 반응기, 말단 아미노기, 카르복시기 또는 하이드록시기로 인해, 가교된 캐리어 단백질 매트릭스의 형성시 부수적으로 발생하는 수준으로, 대상 항원이 캐리어 단백질에 공유적으로 결합할 수도 있다. 일반적으로, 항원과 캐리어의 공유 연결은 단백질 매트릭스 백신의 형성에 있어 목표한 바가 아니다. 본 발명의 목적에 따르면, 단백질 매트릭스 백신은 항원이 50% 이하로 캐리어 단백질에 공유적으로 연결된 백신 조성물이다. 부수적으로 발생되는 항원 가교 수준은 항원에서 가교 반응에 참여할 수 있는 부위의 수를 고려함으로써, 즉, 사용되는 가교 시약(들)의 반응기, 시약(들)의 양 및 그외 사용되는 반응물 (예, 캐리어 단백질, 폴리양이온)과 가교 반응이 완료 가능한 지 (예를 들어, 반응 중에 가교 시약이 모두 소모되는 지)를 고려함으로써, 화학양론적으로 계산할 수 있다. 또한, 단백질 매트릭스 백신 조성물내 가교된 항원의 양은, 예를 들어, 탄수화물/라이신 가교물에 대한 PCMV 조성을 질량 분광측정으로 분석함으로써, 측정할 수 있다.

바람직한 구현예들에서, 항원과 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스는 비-공유적으로 조합된다. 이러한 비-공유적 조합에는 소수성 상호작용, 이온 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 수소 결합이 수반될 수 있으며; 또는 항원은, 매트릭스로부터의 항원 해리가 방지 또는 지연되도록 단백질 매트릭스 내부에 물리적으로 또는 공간적 배치로 봉입될 수 있다. 비-공유적 조합은 항원을 단백질 복합체와 비-공유적으로 조합(포획)하는 물리적인 기하학적 형상 (physical geometric configuration) (즉, 상기 "실에 꿴 구슬" 비유에서와 같이)을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 임의의 대상 항원의 존재 하에 다수의 가능성 있는 캐리어 단백질들 중 임의의 것을 가교하기 위해 다수의 가능한 링커들 중 임의의 링커를 이용하여 제조할 수 있다. 링커, 캐리어 단백질, 폴리양이온 및 대상 항원에 대한 예시적이고 바람직한 것들은 본원에 논의되어 있다.

다당류(PS)는 사카라이드(당)로 구성된 폴리머이다. 미생물 캡슐 유래의 PS는 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) 및 B형 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae Type B) 등의 캡슐화된 박테리아 병원체에 대한 방어 면역에 관여하는 일차적인 항원 구성 성분이다. 미생물 다당류 기반의 백신을 이용한 청소년과 성인의 면역화로, 질병 부담을 줄이는데에는 성공하였지만, 유아와 어린 아이 (즉, 24개월 미만의 아이)에게 방어 면역을 제공하는데에는 덜 효과적인 것으로 입증되었다. 어린 아이에서는 아직까지 성숙한 후천적인 면역 레파토리가 발달되지 못해, 캡슐 PS와 같은 T 세포-비의존형 항원은 면역원성이 부족하여, 어린 백신 수여체에게서 장기간의 방어적인 면역 반응(즉, 면역학적 기억 반응)을 유도하지 못한다.

다당류와 같은 T 세포-비의존형 항원은 다당류에 단백질을 화학적으로 커플링시킴으로써 T 세포-의존형 항원으로 변환할 수 있다. "접합"이라고 하는 이러한 과정은, "캐리어" 단백질에 존재하는 아미노산의 측쇄 원자와 다당류 구조의 원자 간에 공유 결합을 형성하는 단계를 포함한다. 이러한 "접합체 백신"은 보다 효과적으로 B-세포의 성숙 유도와 이소형 스위칭을 촉진하여, 정확한 항-PS 방어 프로파일을 가진 항체가 훨씬 더 많이 만들어지게 한다. 방어 항체는 이의 다당류 항원에 대해 고친화성을 가지며, 전형적으로 보체 고정 (complement fixing) 및 옵소닌화 작동자 활성을 가진 면역글로불린 G (IgG) 서브클래스에 속하는 수명이 긴 항체이다.

T 세포-비의존형 항원은, 통상적으로, 영구적인 면역성, 즉 IgG 항체의 생산을 자극하진 않지만, 효능이 보다 약하고 결합성이 낮으며 보다 일시적인 IgM 항체의 생산을 자극할 수도 있다. 이와 같이, 다당류 항원은 전형적으로 단독으로는 IgG의 부스터 반응을 발생시키지 못한다. 그러나, 일차 면역화가 PS-단백질 접합체로 구현된다면, 이 접합체에 의해 유발되는 기억 세포는 이미 IgG를 생산하도록 프로그래밍된 상태이므로, 다당류는 부스터 반응을 발생시키진 않는다. 실제, 백신 접종받은 동물 또는 인간에서의 부스터 반응은 PS를 제시하는 미생물 노출에 기인한 방어 반응을 모방하는 것으로 생각되며; 백신에서는 이러한 장기간의 기억이 면역화된 개체에서 면역화된 후 수년간 방어 면역을 제공하도록 작동하는데 중요하다. 따라서, PS-단백질 접합체는, (1) PS 항원에 대하여 IgG를 고수준으로 유도하는 능력과, (2) PS 항원에 대해 기억 면역 반응을 유도하는 능력 면에서 가치가 있다. 다당류 항원 단독은, 전형적으로, 이러한 특성들을 나타내지 않으므로, 하급의 항원이다. 접합체 백신을 합성하기 어렵다는 점과 이의 생산 단가는, 다당류 항원에 대해 방어적인 면역 반응이 필요한 다수의 박테리아 질환에 대한 접합체 백신 개발을 지연시키는 걸림돌이 된다.

다른 T 세포-비의존형 항원으로는, 폴리-감마-D-글루탐산(PGA)과 같은 아미노산의 동형 폴리머와, 다가알코올이 있다. 대부분의 바이오폴리머는 T 세포-비의존형 항원이다. 폴리머는 이의 화학 구조체들의 반복 특성 (및 따라서 에피토프)으로 인해 폴리머를 인지하는 B 세포 상에서 면역글로불린 (Ig) 수용체들과 가교할 수 있다. 따라서, 폴리머는 항-폴리머 IgM을 생산하기 위해 다당류와 동일한 방식으로 B 세포를 활성화할 수 있다. 예를 들어, 바실러스 안트라시스의 아미노산 동형폴리머, 폴리-감마-D-글루탐산(PGA)은, 면역원성이 낮은 캡슐 폴리머이며, 또한 T 세포-비의존형 항원이다. 단백질 캐리어에 접합된 PGA로 구성된 백신은 면역원성이 높으며, 항-PGA IgG를 유도할 수 있고, PGA에 대한 면역학적 기억을 유발할 수 있다. 그래서, 대부분의 폴리머는, 가공되어 MHC-II를 통해 제시될 수 없고, 따라서 T 세포 도움을 동원할 수 없기 때문에, 이의 면역원성 측면은 PS처럼 반응한다. Toll-유사 수용체(TLR)로 지칭되는 다른 클래스의 수용체와 상호작용하는 천연적으로 생기는 일부 폴리머들에서는 예외도 있다. 일단 활성화되면, TLR이 숙주 세포에 의한 사이토카인의 생산을 유도할 수 있으며, 후천적인 면역 반응에 변화를 일으킬 수 있다. 일부 PS는 TLR 리간드에 공유적으로 접촉하거나, 이러한 리간드로 오염된다. 예를 들어, 리포폴리사카라이드(LPS)는, 면역원성이 높고 IgG 및 기억 반응을 유도하는 PS이며; LPS의 지질 A 모이어티는 TLR 리간드이며, 면역학적 특성을 담당할 수 있다.

기존의 접합체 백신은, PS 항원 및 캐리어 단백질 둘다의 제조 및 정제 단가와 각 다당류-단백질 접합체에 수반된 특수한 화학적 방법으로 인해, 저렴하게 제조하기 어렵다. 일반적으로, 이들 둘다 화학적으로 접합시키기 전에 고순도이어야만 합리적인 커플링 효율로 수행될 수 있다. 전형적으로, 다양한 PS에 대해, 선택된 PS와 캐리어 단백질의 화학적 특성에 고유한 화학적 커플링 반응을 특이적으로 개발하여야 한다. 이러한 화학적 커플링 반응에서는, 이후, 전형적으로 라이신 잔기의 엡실론 아미노 측쇄를 통해 캐리어 단백질과 연결될 수 있는 관능기를 PS에 도입한다. 이러한 커플링기를 도입하기 위한 PS의 화학적 변형은 PS 상의 에피토프를 파괴시킬 수 있으며, 세심한 면역학적 분석에 의해서만 유의성을 평가할 수 있는 (예, 링커 또는 변형된 사카라이드 기와 조합된) 새로운 에피토프를 도입할 수 있다. 아울러, 기존의 PS-단백질 접합체 백신의 경우, PS의 크기, 캐리어 단백질 분자 당 결합되는 PS 분자의 수, 선정된 캐리어의 특성 및 연결 반응의 타입 모두가 접합체 백신의 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 이처럼, 예를 들어, 90+개의 공지된 혈청형들이 각각 다른 PS 구조를 가지고 있는 폐렴 구균성 질환의 경우 (Bentley et al., PLOS Genetics 2(3):e31 262-269, 2006), 한가지 접합 방법이 모든 혈청형들에 적절한 것은 아니다. 재현가능한 면역학적 특성을 가진 접합체 백신을 재현가능한 방식으로 합성하는데에는, PS의 크기, 캐리어 단백질 분자 당 결합되는 PS 분자의 수, 선택된 캐리어의 특성 및 연결 반응의 타입의 세심한 조절이 수반된다. 그로 인해 접합체 백신의 제조 단가는 크게 증가한다.

항생제의 내성 출현은 안전하고 효과적인 백신 개발의 시급성을 강조한다. 광범위하게 이용가능한 백신, 특히 개발도상국에서 백신을 제조하기 위해서는, 백신 제조가 비용 측면에서 효율적이어야 한다. 한가지 이상의 박테리아 종들의 여러가지 혈청형으로부터 유래된 다수의 다당류 항원에 대한 접합체 조합 백신(combined conjugate vaccine)이 유아기 면역 요법에 통합되면 이러한 고위험군 집단에서의 백신 투여는 간단해질 것이다. 그러나, 현행 접합체 백신 기술은 비용적인 측면에서 효율적이지 않아, 접합체 조합 백신은 높은 비용으로 인해 개발도상국으로 전파되기 사실상 불가능하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 백신 조성물은, 하나 이상의 박테리아 캡슐 성분이 가교된 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온 매트릭스에 포획된, 단백질 캡슐 매트릭스 백신 (PCMV)이다. PCMV는, 대상 항원, 예를 들어, 박테리아 캡슐 다당류는 더 작은 단편으로 가수분해될 필요가 없고 복수의 항원이 단백질 매트릭스에 동시에 포획될 수 있으므로, 접합체 보다는 보다 쉽게 제조할 수 있다.

본 발명의 백신 제조 방법은 대상 항원, 예컨대, 캡슐 다당류에 대한 어떠한 화학적 지식을 요구하지 않으므로, 본 방법은 대상 항원과 캐리어 단백질의 화학적 특성과 함께 사용가능한 가교 화합물의 개발 필요성에 좌우되지 않는다. 일부 항원들이 가교제와 상호작용할 수도 있지만, 대상 항원과 캐리어 단백질의 의도하지 않은 가교 형성은 접합체와 비슷한 면역원성 특징을 가질 것으로 예상되므로, 백신의 효능을 떨어뜨리지 않을 것이다. 그러나, 본 발명의 백신에서, 대상 항원을 캐리어 단백질에 가교시키는 것은 백신을 유효하게 하기 위한 요건이 아니다. 이런 점이 기존의 접합체 백신과는 극명한 대조를 이룬다. 본 발명의 백신은, 바람직하게는, 가교된 캐리어 단백질을 적어도 예컨대, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 심지어 100%로, 그리고 캐리어 단백질에 가교된 대상 항원을 예컨대, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하로 포함한다. 바람직하게는, 항원은 10% 이하가 캐리어 단백질과 가교되며, 캐리어 단백질은 50% 이상이 가교된다.

본원에 논의된 바와 같이, 폴리양이온이 투입된 단백질 매트릭스 백신 조성물은, 항원 단독이나, 단순한 항원/캐리어 혼합물 또는 심지어 본원에 기술된 바에 따른 폴리양이온이 투입되지 않은 항원/단백질 매트릭스 백신 조성물에 비해, 항원 포획성이 높고, 대응되는 면역원성이 우수하다. 본원에 기술된 바와 같이, 박테리아의 다당류 캡슐은 반복되는 당으로 구성되어 있으며, 많은 병원성 박테리아의 경우 캡슐이 음 전하를 띈다. 음 전하는 전하 반발을 통해 또는 보다 큰 저해성 캡슐을 제시함으로써, 숙주 면역 세포에 의한 식균 작용을 방지하는데 도움이 될 수 있다. Weinger et al., PLosPathogens, 5: 1-9 (2009). 이러한 동일한 전하 반발 작용은 또한 매트릭스 단백질(들)과도 발생될 수 있으며, 이로써 다당류 포획성은 나빠진다. 이러한 음 전하를 상쇄하기 위해, 폴리양이온, 예컨대, 폴리-L-라이신 (PLL)을 PCMV 반응물에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, Vi-CRM197 PCMV 반응물에 0.04% α-PLL을 첨가하면 Vi 다당류 포획율이 5%에서 >20%로 증가한다 (도 1).

입자의 크기 조절이 단백질 매트릭스 백신의 면역원성을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 항원/캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 복합체는 평균 입자 크기가 직경 50 nm 이상이다. 바람직한 크기의 입자는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 비롯한 임의의 적정 수단을 통해 분획화할 수 있으며, 그런 후 크기가 더 큰 입자들은 모우고, 보다 작은 입자는 버릴 수 있다. 다른 예로, 잘 선택한 분자량 컷오프를 제공하는 필터 막을 이용하여, 크기가 더 작은 입자는 제거하고, 원하는 크기의 입자를 유지시킬 수 있다. 분자량이 더 작은 종 (예, 직경이 < 50 nm인 종)의 제거 또는 직경 50 nm 이상의 큰 입자 크기를 가지는 조성물의 단백질 매트릭스 입자 크기의 선택은, 당해 기술 분야에 임의의 공지된 수단에 의해, 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피(SEC), 겔 여과 크로마토그래피, 또는 겔-투과 크로마토그래피 등의 크로마토그래피로 달성할 수 있다. 겔 전기영동 기술도 사용될 수 있다.

본원에 기술된 백신의 제조 방법은 대상 항원, 예컨대 캡슐 폴리머의 광범위한 변형을 발생시키지 않는다. 항원은, 일반적으로, 가능한 변형이 적용된, 예를 들어 폴리머 체인의 말단에 그러한 기를 보유하는 PS 캡슐에 대한 환원성 당의 환원을 제외하고는 동일한 상태로 유지된다. 이러한 사소한 변형은, 말단 당이 폴리머의 내부 잔기들에서 보다는 100-10000배 정도 적기 때문에, 대부분의 캡슐 PS의 면역원성에는 영향을 미칠 가능성이 없다. 반면, 기존의 접합체 백신은, 일반적으로, 항원에, 예컨대 캡슐 폴리머에, 캐리어 단백질의 공유 결합 부위로서 제공되는 링커기의 도입이 필수적이다. 예를 들어, PS에 반응성기를 도입함으로써, 캡슐 에피토프는 파괴될 수 있으며, 숙주 자기-에피토프들과의 공지되지 않은 면역학적 교차-반응성으로 인해 백신 제품에 부적절할 수 있는 새로운 에피토프가 생길 수 있다.

본원에 기술된 백신의 제조 방법은, 백신의 화학적 특성이 오직 캐리어 단백질 (예, DNI, 콜레라 독소 B 서브유닛, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드 또는 단편 C 또는 대장균의 베타-갈락토시다제) 및/또는 폴리양이온 (예, α-폴리-L-라이신 및 ε-폴리-L-라이신)의 가교 화학적 특성에 의해서만 좌우되기 때문에, 접합체 백신 기술 보다 덜 복잡하다. 예를 들어, 캡슐 폴리머는 DNI와의 혼합시 가교율에 영향은 미치지만, 가교 패턴이나 정도에는 영향을 미치지 않으며, 이는 사용 중인 단백질, 이것의 농도 및 첨가된 가교제 (예, 글루타르알데하이드)의 농도에 의해 보다 더 좌우된다. 이러한 파라미터들은 쉽게 조정하여, 백신의 제조에 소요되는 시간과 노력을 단축시키고 비용을 절약할 수 있다.

본원에 기술된 PCMV 조성물의 제조 방법은 임의의 항원, 예컨대 캡슐 폴리머 또는 임의의 아미노기가 거의 없는 임의의 바이오폴리머를, 가교시킬 수 있는 임의의 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온, 예를 들어, 가교 연결 또는 화학적 환원시 파괴될 수 있는 주요 에피토프를 가지고 있지 않은 캐리어 단백질과 함께 사용할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있는 캐리어 단백질은, 바람직하게는, 라이신 잔기나 또는 화학적 변형에 의해 가교될 수 있으며 차단되지 않은 다른 잔기들을 2개 이상 포함한다. 파상풍 톡소이드가 가능성 있는 캐리어 단백질 중 하나이다. 이 독소는 단백질의 아미노기와 반응하는 시약인 포름알데하이드 처리에 의해 무독성으로 된다. 그외 바람직한 캐리어 단백질로는, 콜레라 독소 A 서브유닛 (SBL Vaccin AB), 디프테리아 톡소이드 또는 CRM197, 파상풍 톡소이드 또는 단편 C (Sigma Aldrich), DNI, 또는 대장균의 베타-갈락토시다제 (Sigma Aldrich)를 포함한다.

현행 다가 접합체 백신들은, 먼저 각 접합체 백신을 합성한 다음, 이들을 혼합하여 "칵테일" 접합체 백신(예, Wyeth 7가 폐렴 백신, Prevnar^®-7, GlaxoSmithKline의 10가 폐렴 백신 Synflorix^®, 및 Pfizer의 13가 백신 Prevnar^®-13)을 제조함으로써 만들어진다. 본 발명의 백신 제조 방법을 이용하여, 화학적으로 상이한 항원들, 예를 들어 캡슐 유기 폴리머들을 혼합한 다음, 예컨대 글루타르알데하이드 또는 그외 가교제를 이용하여 캐리어 단백질과 가교시킴으로써, 또는 각각 합성한 본 발명의 특정 백신들을 혼합함으로써, 다가 백신을 제조하는데에도 이용할 수 있다. 이러한 유연성은 기존의 다가 백신 제조 방법에 비해 상품 단가를 상당히 낮추는 상당한 이점을 제공한다.

실시예들에서 언급된 본 발명의 백신의 예들은, 이들 백신이, 항원 분자와 캐리어 단백질 간에 임의의 공유 결합을 형성할 것으로 예상되지 않는 방법에 의해 합성되었음에도 불구하고, 접합체 백신과 비교하여 수행하였다. 글루타르알데하이드는 라이신 잔기의 엡실론 아미노기로 대표되는 단백질의 아미노 측쇄와 주로 반응한다. 다당류 항원은, 글루타르알데하이드 또는 알데하이드-기능성 가교제 (예, 전술한 OCH-R-CHO)와 반응하기 위한 유리 아미노기 (임의의 아미노 측쇄는 일반적으로 아세틸화됨)를 거의 포함하지 않기 때문에, 글루타르알데하이드 및 그외 알데하이드-기능성 물질에 대해 본질적으로 무-반응성이다. 따라서, 이러한 항원은 항원이 단지 50% 미만으로 캐리어 단백질과 직접 가교되는 PCMV의 제조에 매우 적합하다. 아래 실시예들에서 보여지는 바와 같이, PCMV에 의해 형성되는 면역 반응들은 접합체 대조군에 비해 호의적인데, 이는 PS 분자가 DNI 단백질 분자의 가교된 매트릭스 내부에 분자로 포획되어 있음을 시사한다.

비제한적인 모델에 따르면, 포획은, 단백질 매트릭스 백신 조성물을, 폴리머 항원을 인지하는 Ig 수용체를 통해, 상기한 매트릭스에 결합하는 B 세포에로 전달하도록 작용한다. 일단 이들 B 세포 안으로 흡수되면, 매트릭스는 기존의 접합체 백신과 유사한 방식으로 분해되어, B 세포의 MHC 클래스 II 분자 상에 제시되는 캐리어 단백질-유래 펩타이드로 만들어진다. 그런 후, 이것은 T 헬퍼 세포를 동원하고, 따라서, 상기 B 세포의 증식 및 성숙화를 유도하여, IgG를 생산하는 플라스마(plasma)와 항원에 특이적인 기억 세포가 되게 한다. 따라서, 비제한적인 모델로서, PCMV는 면역학적으로는 단백질-접합체 캡슐 백신처럼 작용하지만, PCMV에는 캐리어 단백질과 캡슐 폴리머 간에 상당한 공유 결합이 결여되어 있기 때문에 명확하게 구분된다.

PCMV를 비롯한 본 발명의 백신 조성물은, 조합하여, 예컨대, 소아용 백신으로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 백신은, 예컨대 폐렴 구균 감염, 스트렙토코커스 (A 및 B 그룹) 감염, 헤모필러스 인플루엔자 B형 ("HiB") 감염, 수막 구균 (예, 네이세리아 메닝기티디스) 감염에 대한 백신 접종을 위해 사용될 수 있으며, 그람 음성 박테리아 (예, 슈도모나스 에어루지노사, 프란시셀라 툴라렌시스 (Thirumalapura et al., J. Med. Microbiol. 54:693-695, 2005; Vinogradov and Perry, Carbohydr. Res. 339:1643-1648, 2004; Vinogradov et al., Carbohydr. Res. 214:289-297, 1991), 쉬겔라 종들, 살모넬라 종, 액시네토박터 종, 버크홀데리아 종 및 대장균 으로부터 유래된 O 항원 백신으로 사용될 수 있다.

본 발명의 백신은, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 것 등의 임의의 링커를 이용하여, 임의의 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온을, 예컨대 본원에 기술된 것을, 하나 이상의 대상 항원, 예컨대 본원에 기술된 항원의 존재 하에, 가교시킬 수 있다. 대상 항원 1종이 사용되면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 1가로 지칭된다. 대상 항원이 2종 사용된 경우에는, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 다가로 지칭된다. 미생물 캡슐 폴리머 또는 다당류가 대상 항원인 경우에는, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 단백질 캡슐 매트릭스 백신(PCMV)으로 지칭된다.

링커

캐리어 단백질의 가교에 사용가능한 가교제들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 글루타르알데하이드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 카르보다이이미드 및 비스-바이아조티화된 벤지딘을 포함한다.

동형의 2가지 기능 (homobifunctional)을 가지고 있거나 또는 이형의 2가지 기능 (heterobifunctional linker)을 가지고 있는 링커를 이용하여, 캐리어 단백질들을 직접 가교하는 일반적인 방법들과 모이어티들은, 예컨대 G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996) 및 Dick and Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," in Conjugate Vaccines (Cruse and Lewis, eds), Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, vol.10, pp. 48-114)에 기술되어 있다. 예를 들어, 'n'개의 라이신 모이어티를 가진 캐리어 단백질을 이용하는 경우, 이론적으로, 예시적인 가교제의 카르복시기와의 반응에 이용가능한 1차 아민의 수는 'n+1' (말단 아민 포함)개 이다. 즉, 이러한 직접 접합 공정을 이용하면, 산물은 형성된 n+1개의 아미드 결합을 가지는 것으로 한정된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서 채택되는 링커는, 가장 단순하게는, 2개의 캐리어 단백질을 연결하는 결합, 2개의 폴리양이온을 연결하는 결합, 동일한 캐리어 단백질 또는 폴리양이온에서 2가지 부위를 연결하는 결합, 또는 단백질과 폴리양이온을 연결하는 결합이다. 링커는, 2개의 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온 (A) 및 (B)에 공유 결합하는 펜던트 기를 가진, 선형, 환형 또는 분지형의 분자 골격을 가질 수 있다. 임의의 소정의 캐리어 단백질은, 캐리어 단백질/폴리양이온이 서로 연결된 매트릭스가 형성되고 그 안에 대상 항원이 포획될 수 있도록, 2 이상의 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온과 연결될 수 있다.

용어 "연결기"는 링커(L)의 반응성 모이어티와 (A) 또는 (B)의 관능기의 조합으로 생기는 공유 결합을 지칭한다. 연결기의 예로는, 에스테르, 카바메이트, 티오에스테르, 이민, 다이설파이드, 아미드, 에테르, 티오에테르, 설폰아미드, 이소유레아, 이소티오유레아, 이미도에스테르, 아미딘, 포스포르아미데이트, 포스포다이에스테르, 티오에테르 및 하이드라존을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

(A)와 (B)의 연결은 (A) 및 (B) 상에 위치된 하나 이상의 관능기들과의 결합 (연결기) 형성을 포함하는, 공유적 수단에 의해, 달성된다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 화학적 반응성 관능기의 예로는, 아미노, 하이드록시, 설프하이드릴, 카르복시, 카르보닐, 티오에테르, 구아니디닐, 이미다졸릴 및 페놀성 기들을 포함하나, 이들로 한정되지 않으며, 이들 모두 다수의 캐리어 단백질의 천연 아미노산에 존재한다.

(A)와 (B)의 공유적 연결은, 따라서, (A) 및 (B)에 존재하는 이러한 관능기와 반응할 수 있는 반응성 모이어티를 포함하는 링커 (L)를 이용하여 구현될 수 있다. 이러한 반응의 산물은 (L)과 (A) 및 (L)과 (B)를 연결하는 새롭게 형성된 결합을 포함하는 연결기이다. 예컨대, (A)의 하이드록시기는 하기와 같이 (L)의 카르복시산 기나 이의 활성화된 유도체와 반응하여, 에스테르 연결기를 형성할 수 있다.

설프하이드릴기와 반응할 수 있는 모이어티의 예로는, 설프하이드릴기에 대해 특별한 반응성을 나타내지만, 이를 이용하여, 예컨대, Gurd, Methods Enzymol., 11:532 (1967)에 기술된 바와 같이, 이미다졸릴, 티오에테르, 페놀 및 아미노기를 변형시킬 수 있는, XCH₂CO- (X = Br, Cl, 또는 I) 타입의 α-할로아세틸 화합물이 있다. N-말레이미드 유도체 역시 설프하이드릴기에 대해 선택적인 것으로 간주되지만, 특정 조건에서 아미노기와의 커플링에 부가적으로 유용할 수도 있다. 아미노기의 변환을 통해 티올기를 도입하는 2-이미노티올란 등의 시약 (Traut et al., Biochemistry, 12:3266 (1973))은, 연결이 이황화 결합 형성을 통해 이루어진다면, 설프하이드릴 시약으로 볼 수 있다.

아미노기와 반응할 수 있는 반응성 모이어티의 예로는, 예컨대 알킬화제 및 아실화제가 있다. 대표적인 알킬화제로는 하기를 포함한다:

(i) 반응성 티오기의 부재시 아미노기에 대해 특이성을 나타내며, 타입 XCH₂CO- (X = Cl, Br 또는 D, 예컨대 Wong (Biochemistry, 24:5337, 1979)에 기술된 바와 같음)인, α-할로아세틸 화합물;

(ii) 예컨대 Smyth et al. (J. Am. Chem. Soc., 82:4600, 1960 및 Biochem. J., 91:589, 1964)에 기술된 바와 같이, 고리 카르보닐기에 부가하여, 마이클 타입의 반응이나 아실화를 통해 아미노기와 반응할 수 있는, N-말레이미드 유도체;

(iii) 반응성 니트로할로방향족 화합물 등의 아릴 할라이드;

(iv) 예컨대, McKenzie et al. (J. Protein Chem., 7:581, 1988)에 기술된 바와 같이, 알킬 할라이드;

(v) 아미노기와 시프 베이스(schiff's base)를 형성할 수 있는 알데하이드 및 케톤, 환원을 통해 일반적으로 안정화되어 안정적인 아미드를 형성하는 형성된 부가물;

(vi) 아미노, 설프하이드릴 및 페놀성 하이드록시기와 반응할 수 있는, 에피클로로하이드린 및 비스옥시란 등의 에폭사이드 유도체;

(vii) 아미노, 설프하이드릴 및 하이드록시기와 같은 친핵기에 대해 반응성이 높은, s-트리아진의 염소 함유성 유도체들;

(viii) 고리 개환에 의해 아미노기와 같은 친핵기와 반응하는, 예컨대 Ross (J. Adv. Cancer Res., 2:1, 1954)에 기술된 바와 같은, 상기에서 상세하게 기술된 s-트리아진 화합물을 기반으로 하는 아지리딘;

(ix) 예컨대, Tietze (Chem. Ber., 124:1215, 1991)에 기술된 바와 같은, 스쿠아르산 다이에틸 에스테르; 및

(x) 예컨대, Benneche et al. (Eur. J. Med. Chem., 28:463, 1993)에 기술된 바와 같이, 에테르 산소 원자에 의해 야기되는 활성화로 인해 노말 알킬 할라이드 보다 반응성이 높은 알킬화제인, α-할로알킬 에테르.

대표적인 아미노-반응성 아실화제로는, 하기를 포함한다:

(i) 안정적인 유레아 및 티오유레아 유도체를 각각 형성하는, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트, 특히 방향족 유도체들;

(ii) 예컨대, Herzig et al. (Biopolymers, 2:349, 1964)에 기술된 바와 같은, 설포닐 클로라이드;

(iii) 산 할라이드;

(iv) 니트로페닐에스테르 또는 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 등의 활성 에스테르;

(v) 혼성, 대칭적인, 또는 N-카르복시안하이드라이드 등의 산 무수화물;

(vi) 예컨대, M. Bodansky (Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984)에 기술된 바와 같이, 아미드 결합 형성을 위한 그외 사용가능한 시약들;

(vii) 예를 들어, Wetz et al. (Anal. Biochem., 58:347, 1974)에 기술된 바와 같이, 소듐 나이트라이트를 이용하여 기형성된 하이드라지드 유도체로부터 아지드기가 형성되는, 아실아지드; 및

(viii) 예를 들어, Hunter and Ludwig (J. Am. Chem. Soc., 84:3491, 1962)에 기술된 바와 같이, 아미노기와의 반응으로 안정적인 아미딘을 형성하는, 이미도에스테르.

예를 들어, 글루타르알데하이드와 같은 알데하이드, 및 케톤은, 아민과 반응하여 시프 베이스를 형성할 수 있으며, 시프 베이스는 유리하게는 환원성 아민화를 통해 안정화될 수 있다. 알콕실아미노 모이어티는 케톤 및 알데하이드와 쉽게 반응하여, 예컨대 Webb et al. (Bioconjugate Chem., 1:96 (1990))에 기술된 바와 같이, 안정적인 알콕시아민을 형성한다.

카르복시기와 반응할 수 있는 반응성 모이어티의 예로는, 예컨대 Herriot (Adv. Protein Chem., 3:169 (1947))에 기술된 바와 같이, 높은 특이성으로 반응하여 에스테르기를 형성하는, 다이아조아세테이트 에스테르 및 다이아조아세트아미드 등의 다이아조 화합물을 포함한다. O-아실유레아를 형성한 다음 아미드 결합을 형성하는, 카르보다이이미드와 같은 카르복시산 변형제도 사용할 수 있다.

(A) 및/또는 (B)에서 관능기는, 필요에 따라, 예를 들어, 추가적인 반응성 또는 선택성을 부여하기 위해, 반응 전에 다른 관능기로 변환시킬 수 있다. 이러한 목적으로 이용가능한 방법의 예로는, 다이카르복실 무수화물 등의 시약을 이용한 아민의 카르복시산으로의 변환; N-아세틸호모시스테인 티올락톤, S-아세틸머캅토숙신 무수화물, 2-이미노티올란 또는 티올-함유 숙신이미딜 유도체 등의 시약을 이용한, 아민의 티올로의 변환; α-할로아세테이트 등의 시약을 이용한 티올의 카르복시산으로의 변환; 에틸렌이민 또는 2-브로모에틸아민 등의 시약을 이용한 티올의 아민으로의 변환; 카르보다이이미드 등의 시약을 이용한 카르복시산에서 아민으로, 다시 다이아민으로의 변환; 토실 클로라이드와 같은 시약을 이용한 알코올의 티올로의 변환, 그런 후 티오아세테이트를 이용한 트랜스에스테르화, 및 소듐 아세테이트를 이용한 티올로의 가수분해를 포함한다.

(A)의 반응성 화학기를 (B)의 반응성 화학기와 추가적인 연결 물질을 도입하지 않고 직접 공유 연결하는 것을 포함하는, 이른바 제로-길이의 링커도, 필요에 따라, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 그 예로는, 연결기가 에스테르 또는 티오에스테르이도록, L이 (A)의 산소 원자를 (B)에 존재하는 카르보닐 또는 티오카르보닐 모이어티와 연결하는 화학 결합인, 화합물을 포함한다. 예를 들어, 카르보다이이미드 반응을 이용하여 아미노기 (A)를 카르복시기 (B)에 연결함으로써, L이 아미드 결합 또는 N-R에 연결된 RC(:O)이고; R이 동일한 또는 2개의 상이한 단백질 분자들의 아미노 측쇄들로부터 유래된 탄소 쇄인 A-L-B(임)를 수득할 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로는, 링커는 스페이서 요소에 의해 연결된 전술한 바와 같은 2 이상의 반응성 모이어티를 포함한다. 스페이서의 존재는 2가지 기능을 가진 링커가 (A) 및 (B)의 특정 관능기와 반응할 수 있게 함으로써여, 이들 2종의 화합물들 간에 공유 결합이 이루어진다. 링커 (L)에서 반응성 모이어티들은 동일(동형의 2가지 기능성의 링커) 또는 상이(이형의 2가지 기능성의 링커, 또는 수개의 비슷하지 않은 반응성 모이어티들이 존재하는 경우, 이형의 다중 기능성 링커)하여, (A)와 (B) 간의 공유적 부착을 형성할 수 있는 다양한 잠재적인 시약들을 제공할 수 있다.

스페이서 요소들은, 전형적으로, 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 3-10원의 사이클릭 시스템 또는 -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂- (n =1 - 4)에 의해, (A)와 (B)를 효과적으로 분리시키는, 체인들로 구성된다.

연결성 물질이 도입된 물질의 외적 성질은 최종적인 백신 산물의 약물 동력학적 특성 및/또는 활성과 관련있을 수 있다. 따라서, 생분해성이거나 화학적으로 민감하거나 또는 효소적 절단부가 부가된 스페이서를 포함하는, 절단성 링커를 도입하는 것이 바람직할 수 있다.

예를 들어, PCT 공개 공보 WO 92/17436 (원용에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이, 이들 절단성 링커는 생체내에서 쉽게 생분해된다. 일부 경우에, 연결기들은 에스테라제의 존재 시에 절단되지만, 이 효소가 없는 조건에서는 안정적이다. (A) 및 (B)는 따라서 병소 근처에서 효소 활성에 의해 이의 느리게 방출되는 방식으로 연결되는 것이 바람직할 수 있다.

링커는 생분해성 다이에스테르, 다이아미드 또는 식 -(Z¹)_o-(Y¹)_u-(Z²)_s-(R₁₁)-(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p-의 다이카바메이트기와 연결기를 형성할 수 있으며, 상기 식에서, 각각의 Z¹, Z², Z³ 및 Z⁴는 독립적으로 O, S 및 NR₁₂ (R₁₂ = 수소 또는 알킬기)로부터 선택되며; 각각의 Y¹ 및 Y²는 독립적으로 카르보닐, 티오카르보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 유사한 산-형성기로부터 선택되며; o, p, s, t, u 및 v는 각각 독립적으로 0 또는 1이고; R₁₁은 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 3-10원의 사이클릭 시스템, -(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂- (q = 1 - 4), 또는 -(Z¹)_o-(Y¹)_u-(Z²)_s-(R₁₁)-(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p-를 연결하는 화학 결합이다.

본 발명에 사용되는 예시적인 바람직한 링커 (L)는 식 I-II 중 임의의 식으로 표시될 수 있다:

-C:O-R₁₃-C:O- I

-C:O-NH-R₁₃-NH-C:O- II

상기 식에서, 링커는 산소 원자(A) 및 (B)의 산소 원자 둘다에 공유적으로 결합한다. 즉, 식 I-II의 링커 (L)는 다이피란, 에스테르 또는 카바메이트 연결기를 통해 캐리어 단백질 (A) 및 (B)에 부착된다. 이러한 구현예에서, R₁₃은 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 3-10원의 사이클릭 시스템, -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂- (n = 1 - 4), 또는 2개의 질소 또는 2개의 카르보닐을 연결하는 화학 결합이다.

하이드라존 연결을 형성하도록 고안된 링커는 화학식 III을 가진다:

-(Y³)-(Z⁵)_w-R₁₄-C(:X₄)-R₁₅ III

상기 식에서, Z⁵는 O, S 또는 NR₁₆으로부터 선택되고; R₁₆은 수소 또는 알킬기이고; R₁₅은 수소, 알킬 또는 헤테로알킬로부터 선택되고; Y³는 카르보닐, 티오카르보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 (A)의 산소 원자에 공유적으로 결합된 유사 산-형성기로부터 선택되고; w는 0 또는 1이고; R₁₄은 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분지형의 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분지형의 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 3-10원의 사이클릭 시스템, -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂- (n = 1 - 4), 또는 -(Y³)-(Z⁵)_w-를 연결하는 화학 결합이고; X₄는, 하이드라지드기를 포함하는 (B) 및 전구체가, X₄가 케톤 또는 알데하이드기의 산소 원자인 링커 II로 축합되는 반응을 야기하는, 하이드라존이다.

캐리어 단백질

일반적으로, 생리학적 조건에서 항원을 포획할 수 있는 임의의 캐리어 단백질이 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은, 항원과 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 간에 유의한 공유 결합이 형성되는 않는 조건에서 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온의 가교된 복합체 내에 포획된다. 유의한 공유 결합의 부재는, 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온에 공유 결합된 항원이 50% 미만임을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 항원의 40% 미만, 30% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만이 공유적으로 캐리어 단백질 및/또는 폴리양이온에 결합한다. 항원/캐리어 단백질/폴리양이온 복합체는 Alum과 같은 다른 화합물을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 백신에 사용되는 캐리어 단백질은, 단독으로 또는 항원과 조합하여, 개체에서 면역 반응을 발생시키는 단백질이다. 바람직하게는, 캐리어 단백질은 헬퍼 T 세포에 의해 인지되는 MCH 클래스 II-제한의 복수의 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 에피토프는 개체에서 T_h 세포 반응을 유도할 수 있으며, 대상 항원과 그 항원이 유래된 미생물에 대해 항체를 생산하도록 B 세포를 유도할 수 있다. 이러한 본 발명을 기술하는데 사용되는 에피토프는, 항체 분자 또는 이의 단편과의 특이적인 상호작용을 담당하는 임의의 결정기를 항원 상에 포함한다. 에피토프의 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄 등의 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑으로 구성되며, 특이적인 3차원 구조 특징과 특이적인 전하 특징을 가진다. 면역 특성을 구비하기 위해, 단백질 또는 폴리펩타이드는 일반적으로 T_h 세포를 자극할 수 있다. 그러나, T_h 세포에 의해 인지되는 에피토프가 결여된 캐리어 단백질 역시 면역원성일 수 있다.

강력한 면역 반응 (즉, 고도의 면역원성임)을 발생시키며 "보편적인" 또는 "광범위한" 또는 "pan DR" 헬퍼 T 세포 에피토프 (예로, WO 2008/057529 참조함)를 포함하는 것으로 공지된 캐리어 단백질을 선택함으로써, 다양한 개체 집단에 본원에 기술된 단백질 매트릭스 백신 조성물을 처리할 수 있다. 바람직하게는, 캐리어 단백질은 백신에 반응하여 강력한 면역 반응을 도출할 정도로 충분히 이질적이다. 전형적으로, 사용되는 캐리어 단백질은 대상 항원에 대한 면역원성을 자극할 수 있는 분자이다. 바람직한 구현예에서, 캐리어 단백질은 선천적으로 고도로 면역원성인 것이다. 따라서, 면역원성 수준이 높고 이것과 복합체를 형성한 항원(들)에 대해 항체 생산을 극대화할 수 있는, 캐리어 단백질이, 바람직하다.

본 발명의 실시에 사용가능한 다양한 캐리어 단백질은, 예로, 돌연변이되거나 되지 않을 수 있는, 독소 및 톡소이드(화학적 또는 유전적), 예컨대 탄저병 독소, PA 및 DNI (PharmAthene, Inc.), 디프테리아 톡소이드 (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) 또는 CRM197, 파상풍 독소, 파상풍 톡소이드 (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.), 파상풍 독소 단편 Z, 슈도모나스 에어루지노사의 외독소 A 또는 외독소 A의 돌연변이, 박테리아 플라젤린, 뉴모라이신(pneumolysin), 네이세리아 메닝기티디스(ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, Va.)로부터 입수가능한 균주)의 외막 단백질, 슈도모나스 에어루지노사의 Hcp1 단백질, 대장균의 이열성 장독소, 시가-유사 독소, 인간 LTB 단백질, 박테리아 전체 세포 유래의 단백질 추출물, 및 링커에 의해 가교될 수 있는 임의의 다른 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 캐리어 단백질은 콜레라 독소 B 서브유닛(SBL Vaccin AB), 디프테리아 톡소이드 또는 CRM197 (Connaught, Inc.), 파상풍 톡소이드 또는 단편 C (Sigma Aldrich), DNI, 또는 대장균 (E. coli)의 베타-갈락토시다제 (Sigma Aldrich)이다. 다른 바람직한 캐리어 단백질로는, 소 혈청 알부민 (BSA), P40 및 닭의 리보플라빈을 포함한다. (다르게 언급한 경우가 아닌 한, 예시적인 캐리어 단백질은 Sigma Aldrich에서 상업적으로 구입가능함). 다른 예시적인 캐리어 단백질은 분지형 펩타이드인 MAP (다중 항원성 펩타이드)이다. MAP를 이용하면, 복수의 분지형 아미노산 잔기들로 인해, 가교 밀도 (crosslinking density)가 극대화된다. MAP를 만들기 위해 사용할 수 있는, 가교 목적에 바람직한 아미노산 잔기는, 측쇄에 유리 아미노기를 가지고 있는 라이신이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

BSA 및 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH: keyhole limpet hemocyanin) 둘다 백신 개발에서 동물 실험시 캐리어로서 일반적으로 사용되고 있다. 치료 백신의 제조에 사용되어 온 캐리어 단백질로는, 다수의 병원성 박테리아 독소 및 이의 톡소이드가 있으나, 이로 한정되지 않는다. 그 예로는, 디프테리아 독소, 파상풍 독소 및 이의 의학적으로 허용가능한 대응되는 톡소이드를 포함한다. 그외 후보물질로는 교차 반응성 물질 (CRM)로 언급되는 박테리아 독소와 항원적으로 유사한 단백질이 있다. 본 발명의 실무에 이용가능한 캐리어 단백질은 또한 인간으로부터 유래되지 않으며 임의의 인간 식품 물질에 존재하지 않는 임의의 단백질을 포함할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 고리-유사 구조를 형성하는 단백질이 PCMV 제조에 사용된다. 이러한 단백질은 슈도모나스 에어루지노사의 Hcp1 단백질, 콜레라 독소의 무독성 "B 서브유닛", 대장균의 이열성 장독소, 시가-유사 독소를 포함한다. 이러한 고리-유사 단백질 복합체들은, 선형 PS 체인들이 이들 고리-형상의 단백질 복합체의 중심 채널을 통과하는, "실에 꿰인 구슬"을 형성할 수 있다. 단백질의 가교 후, 이들 복합체는 특히 안정적일 것으로 예측된다. 단백질의 구조 분석 데이타를 통해, 이들 중심 채널이 PS 체인이 쉽게 들어갈 만큼 충분히 큰 것으로 시사된다. 예를 들어, Hcp1 헥사머 고리의 중심 채널은 폭 5.5 Å의 다당류 체인 수개를 용이하게 수용할 만큼 충분히 넓은, 42 Å이다 (Mougous et al., Science, 312(5779):1526-1530 (2006)). 다른 예로, 단백질 고리는 PS를 둘러싸게 조합될 수 있다 (예, 특정 물리 화학적 조건에서 자연적으로 고리로 조합되는 단량체 캐리어 단백질의 서브유닛들로부터). 고리로 조합될 수 있는 이러한 단량체 단백질은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예로 뉴모라이신 (Walker et al., Infect. Immun., 55(5):1184-1189 (1987); Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol., 25(2):222-225 (1987)), 리스테리오라이신 O (Kayal and Charbit, FEMS Microbiol. Rev., 30:514-529 (2006); Mengaud et al., Infect. Immun., 55(12):3225-3227 (1987)), DNI, 탄저병 PA, Hcp1, 콜레라 독소 B 서브유닛, 시가 독소 B 서브유닛, 플라젤린 및 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 다양한 미생물에 의해 만들어지는 다수의 관련 분자들이 있다.

다른 바람직한 구현예에서, Toll-유사 수용체 (TLR) 작용제가 캐리어 단백질로 사용된다. Toll-유사 수용체 (TLR)의 활성화는 후천적인 면역 반응을 전개하는데 중요하며, 항체 반응의 친화성 성숙화, 이소형 스위칭 및 면역 기억에 역할을 담당할 수 있다. 비브리오 콜레라의 플라젤린 (FLA)은 TLR 작용제이다. 재조합 대장균으로부터 FLA 단백질을 정제하였고, IL-6 대식세포 유도 분석에서 강력한 TLR 활성자인 것으로 확인되었다. 또한, "뉴모라이신"으로 지칭되는 잘 보존된 스트렙토코커스 뉴모니아 단백질도 TLR4를 활성화시키는 것으로 확인되었고, 추가적으로 방어 항원이다. 따라서, 이 단백질 역시 단백질 매트릭스 캐리어 단백질로서 사용될 수 있다.

아울러, 외막 단백질 (OMP) 혼합물 (예, 네이세리아 메닝기티디스의 OMP)은 Merck 사에서 생산하는 HIB 접합체 백신의 캐리어 단백질로서 사용되며, 스트렙토코커스 뉴모니아 박테리아 전체 세포의 단백질 추출물은 동물 감염 모델에서 일정 부분 이상 방어적인 것으로 확인되었다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 이들 단백질 혼합물들은 캐리어 단백질로서 사용될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 백신 조성물은, 예를 들어, 2 이상의 라이신 잔기 또는 차단되지 않은 다른 잔기를 가지고 있으며, 화학적 변형에 의해 가교될 수 있는, 캐리어 단백질을 이용하여 제조한다. 다른 바람직한 구현예에서, 캐리어 단백질은 다량체 (예, 5개 이상의 서브유닛 함유)이다.

다른 구현예에서, DNI는 무독성이므로 사용 전 독성을 낮출 필요가 없어, 캐리어 단백질로서 사용된다. 아울러, DNI 역시 대상 항원에 대해 유도되는 방어적인 면역 반응 외에도, 바실러스 안트라시스에 대해서도 방어적 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에, DNI를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, DNI는 내부에 이황화 결합을 가지지 않는다. 이 결합은 보로하이드라이드 환원에 취약하여, 단백질을 변성시키로, 탄저균 독소에 대한 중화 항체를 유도하는 에피토프의 소실을 유발할 수 있다.

대상 항원

본 발명의 백신 조성물 및 이러한 백신의 제조 및 투여 방법은, 임의의 대상 항원에 대해 사용될 수 있으며, 단독만으로는 강력한 면역원성이 아닌 항원들을 이용하는데 특히 유용하다. 이러한 것으로는, 예를 들어, 대다수의 다당류, 다가알코올 또는 폴리 아미노산 항원이 있다. 바람직하게는, 대상 항원은, 백신 제조 방법에 채택되는 화학적 반응에 의해, 예컨대 보로하이드라이드 환원에 의한 항원의 이황화 결합 파괴로 인한 항원의 변성에 의해 파괴될 수 있는, 주요 기(primary group)들은 보유하지 않는다. 대상 항원의 예로는, 유기 폴리머, 예컨대 다당류 (18개 이상의 잔기를 가진 다당류), 포스포폴리사카라이드, N-아세틸 치환이 있는 아미노 당이 부가된 다당류, 설폰화된 당을 함유한 다당류, 그외 설페이트-변형된 당 또는 포스페이트-변형된 당, 다가알코올, 폴리 아미노산, 테이코산 또는 리포폴리사카라이드의 O 다당류가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 대상 항원의 예로는, 미생물, 예컨대 박테리아, 진균, 기생 동물 및 바이러스에 의해 합성한 다음 표준적인 방법을 이용하여 상기한 생물학적 자원으로부터 정제된 것을 비롯하여, 캡슐 유기 폴리머를 포함한다. 대상 항원의 예로는, 바실러스 종 (바실러스 안트라시스 포함) (Wang and Lucas, Infect. Immun., 72(9):5460-5463 (2004)), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Bentley et al., PLoS Genet., 2(3):e31 (2006); Kolkman et al., J. Biochemistry, 123:937-945 (1998); 및 Kong et al., J. Med. Microbiol., 54:351-356 (2005)), 쉬겔라 (Zhao et al., Carbohydr. Res., 342(9):1275-1279 (2007)), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 스트렙토코커스 피로게네스 (Streptococcus pyogenes), 대장균 (Escherichia coli) (Zhao et al., Carbohydr. Res., 342(9):1275-1279 (2007)), 및 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)와 같은 박테리아 유기체, 및 크립토코커스 (Cryptococcus) 및 칸디다 (Candida) 등의 진균 유기체, 뿐만 아니라 그외 다수의 미생물들 (예, Ovodov, Biochemistry (Mosc.), 71(9):937-954 (2006); Lee et al., Adv. Exp. Med. Biol., 491:453-471 (2001); Lee, Mol. Immunol., 24(10):1005-1019 (1987))로부터 정제된 것들을 비롯하여, 미생물 캡슐의 유기 폴리머를 포함한다. 또한, 대상 항원의 예로는, 천연적으로 생성되지 않아 오리진에 비-생물적인 폴리머도 포함한다.

구체적인 스트렙토코커스 뉴모니아 항원으로는 다당류 캡슐형 1 (예, 1-g 또는 1-q), 2 (예, 2-g, 2-q, 또는 2-41A), 3 (예, 3-g, 3-q, 3-c, 또는 3-nz), 4, 5 (예, 5-q, 5-c, 5-qap, 또는 5-g), 6A (예, 6A-g, 6A-cl, 6A-c2, 6A-n, 6A-qap, 6A-6B-g, 6A-6B-q, 또는 6A-6B-s), 6B (예, 6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B-q, 또는 6A-6B-s), 7F (예, 7F-7A), 7A (예, 7A-cn 또는 7F-7A), 7B (예, 7B-40), 7C (예, 7C-19C-24B), 8 (예, 8-g 또는 8-s), 9A (예, 9A-9V), 9L, 9N, 9V (예, 9A-9V), 9V 및 14, 10F (예, 10F-q, 10F-ca, 또는 10F-10C), 10A (예, 10A-17A 또는 10A-23F), 10B (예, 10B-10C), 11F, 11A (예, 11A-nz 또는 11A-11D-18F), 11B (예, 11B-11C), 11C (예, 11B-11C. 또는 11C-cn), 11D (예, 11A-11D-18F), 12F (예, 12F-q 또는 12F-12A-12B), 12A (예, 12A-cn, 12A-46, 또는 12F-12A-12B), 12B (예, 12F-12A-12B), 13 (예, 13-20), 14 (예, 14-g, 14-q, 14-v, 또는 14-c), 15F (예, 15F-cn1 또는 15F-cn2), 15A (예, 15A-ca1, 15A-ca2, 또는 15A-chw), 15B (예, 15B-c, 15B-15C, 15B-15C-22F-22A), 15C (예, 15C-ca, 15C-q1, 15C-q2, 15C-q3, 15C-s, 15B-15C, 또는 15B-15C-22F-22A), 16F (예, 16F-q 또는 16F-nz), 16A, 17F (예, 17F-n and 17F-35B-35C-42), 17A (예, 17A-ca 또는 10A-17A), 18F (예, 18F-ca, 18F-w, 또는 11A-11D-18F), 18A (예, 18A-nz 또는 18A-q), 18B (예, 18B-18C), 18C (예, 18B-18C), 19F (예, 19F-g1, 19F-g2, 19F-g3, 19F-q, 19F-n, 또는 19F-c), 19A (예, 19A-g, 19A-, 또는 19A-ca), 19B, 19C (예, 19C-cn1, 19C-cn2, 또는 7C-19C-24B), (예, 13-20), 21 (예, 21-ca 또는 21-cn), 22F (예, 15B-15C-22F-22A), 23F (예, 23F-c, 10A-23F, 또는 23F-23A), 23B (예, 23B-c 또는 23B-q), 24F (예, 24F-cn1, 24F-cn2, 또는 24F-cn3), 24A, 24B (예, 7C-19C-24B), 25F (예, 25F-38), 25A, 27, 28F (예, 28F-28A 또는 28F-cn), 28A (예, 28F-28A), 29 (예, 29-ca 또는 29-q), 31, 32F (예, 32F-32A), 32A (예, 32A-cn 또는 32F-32A), 33F (예, 33F-g, 33F-q, 33F-chw, 33F-33B, 또는 33F-33A-35A), 33A (예, 33F-33A-35A), 33B (예, 33B-q, 33B-s, 또는 33F-33B), 33D, 34 (예, 34-ca 또는 34s), 35F (예, 35F-47F), 35A (예, 33F-33A-35A), 35B (예, 17F-35B-35C-42), 36, 37 (예, 37-g 또는 37-ca), 38 (예, 25F-38), 39 (예, 39-cn1 또는 39-cn2), 40 (예, 7B-40), 41F (예, 41F-cn 또는 41F-s), 41A (예, 2-41A), 42 (예, 17B-35B-35C-42), 43, 44, 45, 46 (예, 46-s 또는 12A-46), 47F (예, 35F-47F), 47A, 48 (예, 48-cn1 또는 48-cn2), 또는 유전자은행 등재번호 AF532714 또는 AF532715를 포함한다.

캡슐형 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44, 또는 46로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니아 다당류를 특히 참조한다.

폴리양이온

바람직하게는, 본 발명에 유리형의 1차, 2차 또는 3차 아민기 형태로 반복적인 양성 전하를 가진 임의의 폴리양이온을 사용할 수 있다. 폴리양이온의 예로는, 비제한적인 예로서, 폴리-L-라이신, 키토산 [2-아미노-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcN)과 2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcNAc)이 β-(1-4)-연결된 공중합체], 폴리 아르기닌 및 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아민 N7 (CAS 29320-38-5) 및 에틸렌다이아미노메틸 폴리스티렌 (CAS 177987-93-8) 등과 같이 유리 아민기들을 포함하는 시판 합성 폴리머를 포함한다.

바람직한 구현예들에서, 폴리-L-라이신은 α-폴리-L-라이신 (alpha-폴리-L-라이신) 또는 ε-폴리-L-라이신 (epsilon-폴리-L-라이신)이다. 폴리-L-라이신의 라이신 잔기는 카르복시기와 알파 (α-PLL) 아민 기나 엡실론 (ε-PLL) 아민 기 간의 펩타이드 결합으로 연결된다. 바람직하게는, 폴리-L-라이신은 α-폴리-L-라이신이다. α-폴리-L-라이신은 화학적으로 합성하며, 다양한 분자량, 예를 들어 0.5 내지 300 KDa으로 수득할 수 있다. ε-폴리-L-라이신은 박테리아 발효에 의해 제조되는 필수 아미노산 L-라이신으로 구성된 소형 천연 동형폴리머이며, 예를 들어, ε-폴리-L-라이신은 스트렙토마이세스 알불루스 (Streptomyces albulus)로부터 분리할 수 있으며, 대략 4000 Da의 평균 분자량을 갖는다.

폴리양이온은 매트릭스 백신 제조 공정에서 2가지 기능을 수행하는 것으로 여겨진다: 1) 음으로 하전된 항원 폴리머에 대한 반대 이온으로서 작용함, 2) 1차 아민이 함유된 폴리양이온과 아민기와 반응하는 가교제를 사용하는 경우, 다른 폴리양이온 분자들 또는 캐리어 단백질 분자들과 가교를 형성함으로써 매트릭스 형성에 일조함. 이러한 폴리양이온의 특성들 모두 단백질 매트릭스에 항원의 포획을 개선시킴으로써, PCMV 입자 형성 수율을 개선시켜 줄 것이다. 이는, 매트릭스에 포획되는 다당류의 양이 αPLL 첨가시 5%에서 50% 이상으로 개선된 도 1에서 확인할 수 있다.

또한, 접합체 백신의 형성에 항원과 캐리어 단백질 간의 전하 반발력이 부정적으로 작용할 수 있으므로, 폴리양이온을 사용하여 접합 효율을 또한 개선시킬 수 있었다. 다수의 화학적 접합 방법들이 폴리머를 캐리어 단백질의 1차 아민기 (예, 라이신 잔기)를 통해 캐리어 단백질과 연결하는 단계를 포함하고 있어, 폴리 아르기닌 등의 1차 아민 비-함유성 폴리양이온을 이용하는 것이, 폴리머 항원이 폴리양이온에 접합되는 것을 방지하는데 유익할 수 있다. 그러나, 1차 아민을 함유한 폴리양이온도, 다당류를 의도적으로 매트릭스에 공유 결합 (가교)시키는, 매트릭스 백신을 제조하는데 일조하기 위해, 사용될 수 있다. 항원 포획과 매트릭스 형성을 개선시키기 위해 필요한 양, 크기 및 타입은, 조성물, 음 전하 수준, 크리, 아민 (또는 그외 반응성 기)의 관능성(functionality) 및 폴리머 항원의 2차 또는 3차 구조에 의존할 수 있다. 아울러, 2종 이상의 폴리머 항원이 매트릭스 백신 반응에 부가되는 경우 (다가 백신), 폴리머들 간의 상호작용이 포획 개선을 위해 최상인 폴리양이온에 영향을 미칠 수 있다. 이는 아래 실시예 5, 6, 8 및 9에 나타낸 3가, 13가 및 23가 PPS-PCMV 실험들에서 볼 수 있다. 평균 분자량이 4000 Da인 ε-PLL를 3가 PCMV 반응물에 사용하였을 때, PPS4, PPS18C 및 PPS23F의 다당류 포획은 보통 수준이었으며, 다당류 단독에 비해 다당류 항원의 면역원성이 개선되었음에도 불구하고 접합체 백신에서 관찰되는 수준에 부합되지 않았다. 그러나, ε-PLL을 13-가 PPS-PCMV 제조에 사용하였을 때에는, PPS4 및 PPS18C의 면역원성이 3가 PPS-PCMV와 비교하여 각각 3.4배 및 107배 향상되었는데, 이는, 13-가 PPS 반응물에서의 다른 다당류들과의 상호작용으로 인해 이들 2종의 다당류의 포획이 ε-PLL에 의해 개선되었다는 것을 시사한다. 3가 반응물에 α-PLL (150-300 kDa)을 사용하면 PPS4의 면역원성이 보다 더 개선되어, 13-가 PPS PCMV에 비해 132배 높은 GMT를 유도하였다. 그러나, α-PLL (150-300 kDa)을 23-가 PPS-PCMV 제조에 사용하면, 이 PCMV의 PPS4에 대한 GMT는 3가 PPS/α-PLL PCMV에 비해 2650배 높아, PPS4 포획이 낮은 것으로 보였는데, 이는, 23가 반응물내 다른 다당류들이 α-PLL (150-300 kDa)을 이용한 PPS4 포획에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사해준다. 각 개개 또는 그룹의 다당류 또는 그외 항원을 포획하기 위해 사용되는 폴리양이온 성분의 최적량, 크기 (분자량) 및 조성 결정은, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이, 다당류 항원(들)을 더 큰 분자량으로 전환시키는 폴리양이온의 능력을 조사함으로써, 실험을 통해 측정할 수 있다. 이러한 전환은, 항원이 더 큰 크기의 입자 항원으로 조합되는 것을 의미하는 것으로, 본원에 제시되고 아래에 기술된 몇몇 도면들에서 관찰할 수 있다.

백신 조성물

PCMV 등의 본 발명의 백신 조성물은 조합하여, 예컨대, 소아용 백신으로 사용할 수 있다. 아울러, 본 발명의 백신 조성물은, 예컨대 폐렴 구균 감염, 헤모필러스 인플루엔자 B형 ("HiB") 감염, 스트렙토코커스 (A 및 B 그룹) 감염, 수막 구균 (예, 네이세리아 메닝기티디스) 감염에 대한 백신화를 위해 사용될 수 있으며, 그람 음성 박테리아 (예, 슈도모나스 에어루지노사, 프란시셀라 툴라렌시스, 쉬겔라 종, 살모넬라 장 혈청종 (Salmonella enteric serovar), 액시네토박터 종, 버크홀데리아 종 및 대장균)에 대한 캡슐 및 O 항원 백신으로서 사용될 수 있다.

백신 제형은, 바람직하게는, 하나 이상의 캐리어 단백질, 하나 이상의 대상 항원, 하나 이상의 폴리양이온 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 (예, 알루미늄 포스페이트, 소듐 클로라이드, 멸균수)를 포함한다. 또한, 백신 조성물은 수중유 시스템 (oil in water system), 알럼 (alum) 및 당해 기술 분야에 공지된 다른 시스템 또는 그외 약제학적으로 허용가능한 부형제 등의, 제형의 면역원성을 강화하기 위한 보강제 시스템을 포함할 수도 있다. 생리학적 조건에서 불용성인 항원/캐리어/폴리양이온 매트릭스 복합체는 개체에 투여된 후 항원을 서서히 방출하는 것이 바람직하다. 이러한 복합체는, 바람직하게는, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 현탁물 형태로 전달된다. 그러나, 항원/캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 복합체는 또한 생리학적 조건에서 가용성일 수도 있다.

전형적으로, 단백질 매트릭스 백신은, 피하 주사의 경우 약 0.5 ml, 근육내 주사의 경우 0.5 ml, 진피내 주사의 경우 0.1 ml, 또는 피하 투여의 경우 0.002 - 0.02 ml의 부피이다. 단백질 매트릭스 백신 조성물의 용량 0.5 ml에는, 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 약 2 - 500 ㎍으로 포획된 항원 약 2 - 500 ㎍이 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 용량 0.5 ml에는, 항원 약 10 ㎍이 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 약 10 ㎍에 포획된다. 항원 대 캐리어 단백질/폴리양이온의 몰비는 바람직하게는 1 : 10 (예, 항원 1 파트 : 캐리어/폴리양이온 2 파트, 또는 항원 1 파트 : 캐리어/폴리양이온 3 파트 등, 최대 항원 1 파트 : 캐리어/폴리양이온 10 파트) 내지 10 : 1 (예, 항원 10 파트 : 캐리어/폴리양이온 1 파트, 또는 항원 9 파트 : 캐리어/폴리양이온 1 파트 등)이다. 바람직한 구현예에서, 항원 : 캐리어/폴리양이온의 몰비는 1 : 1이다. 다른 예에서, 항원 : 캐리어/폴리양이온의 건조 중량비는 바람직하게는 1 : 10 내지 10 : 1 (예, 1 : 1 건조 중량)이다.

펩타이드 또는 접합체는 위에서 분해될 수 있기 때문에, 백신은 바람직하게는 비경구 (예, 피하, 근육내, 정맥내, 복막내 또는 진피내 주사)로 투여된다. 진피층을 물리적으로 통과시키는 방식에 의한 전달이 (예, 바늘, 공기총 또는 침식) 바람직하지만, 본 발명의 백신 조성물은 경피 흡수로도 투여할 수 있다.

특히, 본 발명의 백신은, 개체에게 적정 면역 보강제와 함께, 예컨대, 근육내 주사, 진피내 주사 또는 경피적 면역화에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 1회 이상 투여할 수 있으며, 대부분 백신에 포함된 항원에 해당되는 감염성 물질에 의한 감염을 예방하기 위해, 개체에서 항원의 생산을 부스팅하도록 설계된 2차 투여를 포함한다. 바람직한 면역 반응 또는 면역 수준을 달성하기 위한 백신의 투여 횟수와 투여량은 백신의 비활성에 따라 결정되며, 일상적인 실험을 통해 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 유아의 경우, 백신 스케줄은 약 4주 내지 8주 간격으로 각각 0.5 ml 씩 3번 (생후 2개월에 개시) 투여한 다음, 약 12개월 내지 15개월에 0.5 ml로 4차 투여를 실시할 수 있다. 일부 백신의 경우, 4살 내지 6살에 5차 투여를 실시하는 것이 바람직할 수 있다.

1차 투여 연령은 일반적으로 생후 2개월이지만, 백신은 6주째의 어린 유아에게도 투여할 수 있다. 성인의 경우, 일반적으로 2-8주 간격으로 2회 이상 0.5 ml을 투여하는 것이 장기간의 예방을 제공하는데 충분하다. 부스터 투여는 바람직하게는 기존에 면역화된 성인과 11살 이상의 어린이에게 10년 마다 제공된다.

본 발명의 백신 조성물은 단위-투여(unit-dose) 또는 다중-투여(multi-dose) 용기내로, 예컨대 밀봉된 앰플 및 바이얼내로 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체만 첨가하면 되는 냉동-건조된 (동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 본 발명의 백신은 약리학적으로 허용가능한 비히클, 예컨대 alum 하이드록사이드 겔, 보강체 조제물 또는 염수 중에서 제형화한 다음, 예컨대 적정 면역 보강제와 함께 근육내 주사, 진피내 주사 또는 경피 면역화를 통해 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 본원에 기술된 백신 (예, PCMV)을 포함하는 키트를 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 본원에 기술된 키트의 이용에 관한 설명서를 포함할 수 있다.

면역화 스케줄의 효과는 면역화된 개체에서 항체 역가를 측정하는 표준 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 일반적으로, 평균 항체 역가 (바람직하게는 IgG 역가) 약 1 ㎍/ml이 장기간의 예방을 나타내는 것으로 간주된다.

본 발명은 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스로 포획한 항원을 포함하는 백신 조성물, 상기한 백신 조성물의 제조 방법 및 백신 투여 방법을 제공한다. PCMV 형성 효율과 백신으로서의 이의 비용 효과가 단백질 매트릭스에 폴리양이온, 예컨대 폴리-L-라이신을 첨가함으로써 개선된다는 것을 확인하였다. 아울러, 폴리양이온은, 폴리머 항원이 캐리어 단백질과 공유 결합하는 기존의 접합체 백신의 제조하는 경우에 비해 접합 반응의 효율을 개선시키는데 유익할 수 있으며, 따라서, 비용 효과가 보다 우수한 접합체 백신을 제조할 수 있다. 간략하게는, 본원에 교시된 바와 같이, 폴리양이온을 포함하는 단백질 매트릭스 백신 조성물은 항원만을 포함하는 조성물 또는 폴리양이온이 포함되지 않은 캐리어 단백질 매트릭스에 포획된 항원으로 구성된 조성물에 비해, 증가된 면역원성을 가진다. 폴리양이온을 포함하는 단백질 매트릭스 백신 조성물의 면역원성 증가는, 단백질/폴리양이온 매트릭스에 의한 다당류 항원의 포획성이 개선되어, 백신 용량내 항원의 양이 폴리양이온이 포함되지 않은 동량의 백신에 비해 더 많기 때문인 것으로 보인다. 본원에 논의된 바와 같이, 박테리아의 다당류 캡슐은 반복성 당류들로 구성되며, 다수의 병원성 박테리아들은 이들 캡슐이 순 음 전하를 띈다. 캡슐의 음 전하는 매트릭스 단백질을 밀어내, 다당류 항원의 포획성이 나쁠 수 있다. 이러한 음 전하를 상쇄시키기 위해, PCMV 반응물에 폴리양이온, 예컨대, 폴리-L-라이신 (PLL)을 첨가할 수 있다. 아울러, PLL과 같은 1차 아민을 함유한 폴리양이온도, 다른 PLL 분자들간의 또는 캐리어 단백질 분자들 간의 가교를 형성함으로써 매트릭스 형성에 일조할 수 있다.

아래 실시예들에서는 단백질 매트릭스 백신 제조에 폴리양이온을 이용하는 구현예들을 기술하고 있지만, 폴리양이온의 유용한 용도는 물론 기존 접합체 백신 제조에서도 마찬가지로 적용될 수 있다.

본 발명은 구체적인 실시예, 구현예 및 도면을 들어 아래에 기술되지만, 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명의 범위를 한정하지 않는다. 아래 실시예들은 한정되는 것으로 이해되지 않아야 한다.

실시예 1: Vi-CRM197-αPLL PCMV

매트릭스 백신 조성물에 폴리양이온의 첨가 효과는, 살모넬라 에네리카 혈청형 티피의 Vi 다당류 캡슐을 항원으로, 무독성의 디프테리아 독소 CRM197 (Matrivax Research and Development Corporation, Boston, MA, USA)을 캐리어 단백질로, α-폴리-L-라이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 폴리양이온으로 사용하여, 조사하였다.

Vi는 C-3에서 가변적으로 O-아세틸화된 (α1-4)-D-GalANAc로 구성된 강한 음이온성의 동형폴리머이다. 현재 승인된 장티푸스 백신들 중 한가지는 TyphimVi^® (Sanofi Pasteur SA)으로, 이 백신에는 항원으로서 비-접합된 Vi 다당류가 함유되어 있다. 단백질 매트릭스 백신이 Vi 항원을 전달하여 면역 반응을 일으키도록 성공적으로 사용될 수 있는지를 테스트하기 위한 처음 실험들에서, 항원으로서 4 mg/mL Vi와 매트릭스-형성용 캐리어 단백질로서 4 mg/mL CRM197을 포함하는 반응물 형태로 PCMV를 준비하였다. 매트릭스 형성은 가교제로서 글루타르알데하이드를 첨가하여 개시하였다. 일정하게 흔들면서 4℃에서 24시간 인큐베이션한 다음, 반응물을 2.6 x 10 cm 세파로스 CL2B 컬럼에설 분리하여 고분자량 분획에서 수집한 다음, 알럼을 첨가하여, 마우스를 면역화하는데 사용하였다. 반응 후 고분자량으로 전환된 Vi의 양을 이용한 결과, PCMV 반응물내 VI <5%가 단백질 매트릭스에 포획된 것으로 추산되었다. PCMV 조성물에 대한 항-Vi 항체 역가는 다당류 단독 (대조군)의 대략 3배 높았지만, 시판되는 Vi 다당류 백신인 TyphimVi^®에 의해 유발되는 역가 보다는 낮았다. 이와는 대조적으로, Vi 접합체 백신, 예를 들어 Vi-CRM197은 다당류 단독 보다 40-100배 높은 역가를 유발하는 것으로 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, Rondini et al., 2011, Clinical and Vaccine Immunology, 18: 460-468; Cui et al., 2010, Clinical and Vaccine Immunology, 17: 73-79; An et al. 2011 Vaccine 44: 7618-7623 Micoli et al., 2011, Vaccine, 29:712-720을 참조한다.

Vi PCMV 입자의 접합체 백신 대비 낮은 면역원성은 CRM197 매트릭스 내 Vi 포획성이 낮거나, 포획되지 않은 (유리형) Vi로부터 PCMV 입자를 분리하는 것이 미흡하거나 또는 이들 둘다가 원인일 수 있는 것으로 생각되었다.

Vi의 강한 음이온성 성질로 인해, Vi가 중요한 가교 단계에서 CRM197을 밀어내어 PCMV 입자로의 효과적인 포획을 방해하는 것이라고 가정하였다.

먼저, PCMV에 염을 첨가하여 전하 반발성 감소를 조사하였지만, 가교 후 불용성의 침전물이 형성되었다.

PCMV 공정에서 폴리양이온의 효과를 조사하였다: 폴리-L-라이신 (PLL)을 이용한 1차 면역화 실험을 위해, 각각 4 mg/ml Vi, 4 mg/ml CRM197 및 0.01% α-폴리-L-라이신 (150-300 kDa)이 포함된 PCMV 2종을 준비하였다. Vi와 α-폴리-L-라이신 (α-PLL)을 실온에서 계속적으로 흔들면서 15분간 인큐베이션한 다음, 가교제로서 0.25% 글루타르알데하이드와 캐리어 단백질로서 CRM197을 첨가하였다. 살모넬라 엔테리카 혈청형 티리무리움의 플라젤린 (Flg) 0.01 mg/mL을 보강성 첨가제로서 반응 혼합물 하나에 첨가하였다. 다시, 계속 흔들면서 실온에서 10분간 더 인큐베이션한 다음, 일정하게 흔들면서 4℃에서 24시간 두었다. PCMV 반응물들을 2.6 x 30 cm 세파크릴S-1000 컬럼에서 분리하였다. 컬럼에서 반응 생성물들을 분리한 다음, 단백질과 다당류의 수준을 각각 microBCA (Pierce Chemical)와 Stains-All (Sigma Chemical) 분석 키트를 이용하여 측정하였다. Vi는 대략 20%가 고분자량으로 전환되어 단백질 피크와 함께 용리되었는데, 이는, Vi가 캐리어 단백질/폴리양이온 매트릭스 내에 포획되었음을 시사한다 (도 2). 이들 고분자량의 분획들을 모아 합치고 (도 2, 박스친 분획들), 알럼을 첨가하여, 면역화에 사용하였다.

BalBC 마우스 (Jackson Laboratories) 5마리로 구성된 그룹들을, PCMV 형태의 Vi 10 ㎍, Matrivax Vi 단독 또는 TyphimVi^® 장티푸스 Vi 다당류 백신 (Sanofi Pasteur SA)으로, 2주 간격으로 3번 면역화하였다. 최종 면역화한 지 3주 후에 마우스를 희생시키고, ELISA 분석으로 Vi-특이 항체 수준을 측정하였다. 상기 면역화로 인한 엔드포인트 기하 평균 역가 (endpoint geometric mean titer) (GMT)를 표 1에 나타낸다.

표 1. αPLL을 첨가하여 제조한 Vi-CRM197 PCMV의 면역원성

그룹 (㎍ Vi 용량)	항-Vi IgG GMT
10 ㎍ Vi-CRM197-αPLL PCMV + Alum	65,302
10 ㎍ Vi-CRM197-αPLL-Flg PCMV + Alum	492,092
Vi	1,600
Typhim Vi®	5572

이들 결과들로부터, 반응물에 α-PLL을 사용함으로써, PCMV가 Vi 다당류 단독에서와 비교하여 40배 높은 항-Vi 항체 역가를 유발한다는 것을 알 수 있다 (표 1). 아울러, α-PLL-함유성 PCMV에 플라젤린의 소량 투입이 Vi 다당류 단독으로 면역화한 경우와 비교하여 300배 이상, 그리고 플라젤린 무첨가 PCMV에 비해 7.5배 높은 GMT로 매우 높은 항-Vi 항체 역가를 유도하였다. 플라젤린의 존재는 PLL에 의한 Vi 포획량에 영향을 미치지 않았다 (데이타 미기재).

흥미로운 점은, 폴리양이온이며 PLL과 동일한 수준의 양 전하를 포함하고 있지만 반복되는 1차 아민이 없는 폴리-L-아르기닌 (PLA)은, Vi 포획을 향상시키지 않았는데 (데이타 미기재), 이는 PLL이 Vi의 음 전하를 상쇄시킬 뿐만 아니라 다른 PLL 분자들과 CRM197에 가교함으로써 매트릭스를 형성하는데 일조한다는 것을 의미한다.

실시예 2: Vi-CRM197-αPLL PCMV의 분리 개선

PCMV 입자들에서 (포착되지 않고, 접합되지 않은 항원 폴리머로 추정되는) 저분자량 종들의 제거율을 높이기 위해, 보다 긴 (90 cm) 크기 배제 컬럼을 사용하였다. 구체적으로, 4 mg/ml Vi, 4 mg/ml CRM197 및 0.01% α-폴리-L-라이신 (150-300 KDa)을 포함하는 PCMV 가교 반응 혼합물을 준비하였다. Vi와 αPLL을 계속 교반하면서 실온에서 15분 인큐베이션한 다음 0.25% 글루타르알데하이드와 CRM197을 첨가하였다. 계속 교반하면서 실온에서 다시 10분간 인큐베이션한 다음, 일정하게 교반하면서 4℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 반응 생성물을 SEC 컬럼에서 분리한 다음, 단백질과 다당류 수준을 각각 microBCA와 stains-all 분석으로 측정하였다. PCMV 입자의 크기 또는 분자량이 이의 면역원성에 영향을 미치는 지를 보기 위해, SEC 컬럼에서 3가지의 다른 용리 시점에서 수득한 분획들을 수집하여, 면역화에 사용하였다. 모은 분획의 선택은 도 3에 나타나 있다. 1번 풀과 2번 풀은 컬럼에서의 용리에 유의한 차이가 없지만, 3번 풀은 1번과 2번 풀 보다 저분자량인 것으로 추정되며, 포획되지 않은 Vi가 더 많이 함유된 것으로 추정되었다.

마우스 5마리로 구성된 그룹들을, Vi 10 ㎍으로 2주 간격으로 3번 면역화하였다. 최종 면역화한 지 3주 후에 마우스를 희생시키고, ELISA 분석으로 Vi-특히 항체의 수준을 측정하였다. 상기한 면역화에 따른 엔드포인트 GMT들을 비교하였다 (표 2).

PLL의 조합과 개선된 크기 분리를 통해, Vi 단독에 비해 485배 내지 1400배 높고, TyphimVi^® 장티푸스 백신 보다는 22배 높은 항-Vi 항체 역가를 나타내는 Vi-CRM197 PCMV를 제조할 수 있었다 (표 2; 풀 1 및 2).

표 2. Vi-CRM197-αPLL PCMV의 여러가지 크리 분획들의 면역원성

그룹 (㎍ Vi 용량)	항-Vi IgG GMT
10 ㎍ Vi-CRM197-αPLL PCMV (pool 1) + alum	11,652
10 ㎍ Vi-CRM197-αPLL PCMV (pool 2) + alum	33,779
10 ㎍ Vi-CRM197-αPLL PCMV (pool 3) + alum	1,063
10 ㎍ Vi 단독	24
나이브 (Naive)	5

3번 풀 PCMV의 GMT는 Vi 단독에 비해 44배 높고 시판 TyphimVi^® 장티푸스 백신 보다 1.3배 높았지만, 1번 풀과 2번 풀에 의해 도출되는 역가 보다는 낮았다. 이는, PCMV의 저분자량 및/또는 포획되지 않거나 또는 "유리형" Vi의 다량 존재가 원인인 것으로 보인다.

실시예 3: PPS18C-CRM197-αPLL PCMV

다음으로, α-PLL을 이용한 Vi 포획 개선으로, α-PLL이 거의 음 전하를 띄지 않는 폐렴 구균성 다당류 PPS18C의 포획성을 개선시키는 지를 조사하였다. 모든 당 잔기들이 음 전하를 띄는 Vi와는 다르게, PPS18C는 당 잔기 5개 당 겨우 음 전하 하나를 가지고 있다. 그러나, PCMV 반응물에 0.04% α-PLL (15-30 kDa)을 첨가하면, 다당류의 35%가 SEC로 분리시 저분자량에서 고분자량 분획으로 전환된 것으로 나타났다 (도 4). PCMV 반응물에 존재하는 대부분의 CRM197은 고분자량 분획에 함께 존재하였다. 고분자량 분획에 존재하는 다당류는, PCMV 입자가 항-CRM197 항체를 통해 ELISA 플레이트에 결합되어 있고 혈청형 특이 항혈청을 다당류를 검출하는, 캡쳐 ELISA 분석을 이용한 결과, PCMV 입자에 포획된 것으로 확인되었다 (데이타 미기재).

실시예 4 - PLL 증가는 PLCM의 Vi 포획을 높인다.

αPLL (150-300 kDa) 0.01% 및 0.02%, 0.04 % αPLL (15-30 kDa), 4 mg/mL Vi 및 4 mg/mL CRM197을 이용하여 PCMV 가교 반응을 수행하였다. 반응물을 500 mL (90 cm x 2.6 cm) 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하고, 분획들을 각각 microBCA와 Stains-all 분석으로 단백질과 다당류를 분석하였다 (도 5). PLL (150-300 kDa) 농도가 0.01%에서 0.02%로 증가됨에 따라, 포획되는 Vi의 양도 15%에서 21%로 증가하였다. Vi의 포획 증가는 PCMV의 면역원성에 아무런 영향을 미치지 않았으며, 2가지 농도의 PLL을 이용하여 합성한 PCMV들은 Vi 단독에 비해 14배 내지 20배 높고, TyphimVi^® 장티푸스 백신 보다 2배 내지 3배 높은 항-Vi 항체 역가를 유발하였다 (데이타 미기재). 소형 α-PLL (15-30 kDa)을 0.04%로 이용하였을 때에는, Vi 포획량이 64%로 증가하였다. 저분자량의 PLL을 이용하는 경우의 포획 증가는 Vi 단독에 비해 PCMV의 면역원성을 개선시키는 것으로 나타나지 않았다 (데이타 미기재). 이에, 저분자량 α-PLL (15-30 kDa)의 고농도가 Vi 에피토프를 차폐할 수 있을 것으로 가정하였다 (데이타 미기재).

실시예 5: 3가 PCMV

폴리양이온이 PCMV에 유익하게 작용하는 효과가 다가 PCMV에서도 적용될 수 있는 지를 확인하기 위해, 폐렴 구균성 다당류 항원 PPS18C, PPS4 및 PPS23F가 혼용된 3가 폐렴 백신을 준비하였다. 총 다당류 5 mg/ml (PPS18C, PPS4 및 PPS23F 각각 대략 1.7 mg/ml 씩), 1 mg/ml CRM197 및 0.04% ε-폴리-L-라이신 (4 kDa, Bainafo Bioengineering Co. Ltd., Zhengzhou, PRC)을 포함하는 PCMV 반응 혼합물을 준비하였다. 다당류와 ε-폴리-L-라이신은 계속 교반하면서 실온에서 15분간 인큐베이션하고, 가교제로서 0.25% 글루타르알데하이드와 매트릭스 단백질로서 CRM197을 첨가하였다. 실온에서 계속 교반하면서 다시 10분간 인큐베이션한 다음, 계속 교반하면서 4℃에서 24시간 두었다. 2.6 x 90 cm 세파크릴 S-1000 컬럼에서 PPS18C/PPS4/PPS23-CRM197-εPLL PCMV를 분리하였다. 분획들은 안트론 분석(anthrone assay)으로 다당류를, MicroBCA로 단백질을, 그리고 캡처 ELISA를 이용하여 PCMV 입자내 각 다당류의 포획을 분석하였다 (도 5). 안트론 분석은 진한 황산에서 가수분해한 후 헥소스를 검출하는 비색 부석이다. Trevelyan, et al., 1952, "Determination of Yeast Carbohydrates with the Anthrone Reagent", Nature, 170(4328): 626-627. 강력한 파지티브 캡처 ELISA가 PPS4에서 관찰되었지만 (데이타 미기재); PPS18C와 23F에서는 약한 신호가 관찰되었다. 캡처 ELISA에 양성인 고분자량 다당류가 함유된 분획들 (도 6, 박스 친 분획들)을 모아, 알럼을 첨가하여, 면역화에 사용하였다.

그룹들의 마우스 10마리들을 상기 Vi-PCMV에 대해 기술된 동일한 투약 용법으로 면역화하였다. 3가 배치형 PCMV의 경우, 각 투여량에는 각 PS 2 ㎍ 또는 총 다당류 6 ㎍이 포함되었다. (PPS 총 30.8 ㎍에서 4 ㎍인 6B를 제외하고는, 투여량 당 각각의 PS가 2.2 ㎍으로 포함된) Prevnar^®13 접합체 백신을 PCMV-유발성 항체 반응과 비교하기 위한 양성 대조군으로써 마우스 그룹에 투여하였다. 또한, 마우스 그룹에 항원만, 즉, 13-가 Prevnar^®13에서 확인되는 13차 다당류 항원을 투여량 당 각 다당류 2 ㎍인 총 다당류 26 ㎍으로 면역화하였다. 나이브 (백신 접종하지 않은) 마우스 그룹도 음성 대조군으로 포함시켰다.

3차 면역화 후 약 2.5주 (47일)째에, 마우스 모두 안락사시키고, 심장 천공으로 채혈하였다. 면역 혈청을 PPS-특이 ELISA에 의해 PPS4, PPS18C 및 PPS23을 인지하는 항원-특이 IgG 항체 반응을 분석하였다. 항-PPS IgG 기하 평균 항체 역가 (GMT)를 면역화한 동물의 개체 혈청의 역가로부터 계산하였다. 결과는 아래 표 3에 나타낸다.

표 3. 3가 PPS18C/PPS4/PPS23-CRM197-εPLL PCMV 항체 역가

그룹 (용량 당 총 PPS ㎍)	항-PPS4 IgG GMT	항-PPS18C IgG GMT	항-PPS23F IgG GMT
6 ㎍ 배치형 3가 PPS-CRM197-εPLL PCMV + alum	1974	905	905
13 PPS (다당류 단독) 26 ㎍	11	31	17
Prevnar®13	73517	7563	2560
나이브	11	10	10

표 3에서 알 수 있는 바와 같이, ε-PLL를 함유한 배치형 PCMV는 다당류 단독 보다 179배 높은 항-PPS4 GMT, 다당류 단독에 비해 29배 높은 항-PPS18C GMT, 및 다당류 단독에 비해 53배 높은 항-PPS23F GMT를 유발하였다. 이들 GMT는 PPS4, PPS18C및 PPS23F 각각에 대해 Prevnar^®13 접합체 백신의 GMT 보다 37배, 8.3배 및 2.8배 낮았다. 배치형 3가 PCMV로부터 유발된 역가는 Prevnar^®13 접합체 백신에 의해 유발되는 역가만큼 높진 않았지만, 항원 단독을 사용하는 경우와 매트릭스 단백질로서 DNI를 사용하고 PLL을 첨가하지 않고 제조한 기존의 폐렴 구균성 다당류 PCMV 보다 놀라운 향상을 나타내었다. 이러한 실험은, 다가 백신과 1가 백신의 면역원성을 개선시키기 위해 PCMV 포메이션에 폴리양이온을 첨가 사용할 수 있는 가능성을 입증해준다. 아울러, 기존의 접합체 백신 제조와 비교하여, PCMV 기법을 이용한 다가 백신 제조의 용이성도 확실히 유익하다.

실시예 6: 배치형 13-가 폐렴 구균성 다당류 PCMV

Prevnar^®13 접합체 백신에 현재 포함된 폐렴 구균성 다당류 항원들, 즉 PPS1, PPS3, PPS4, PPS5, PPS6A, PPS6B, PPS7F, PPS9V, PPS14, PPS18C, PPS19A, PPS19F 및 PPS23F을 통합한 13-가 폐렴 백신을 준비하고, PCMV 매트릭스 형성용 반응 혼합물에 폴리양이온 첨가에 따른 유리한 효과들을 테스트하였다.

PCMV는 다음과 같이 준비하였다: 4 mg/ml 총 다당류 (각 다당류 항원 각각 대략 0.3 mg/ml), 4 mg/ml CRM197 및 0.4 mg/ml ε-폴리-L-라이신 (4 kDa, Bainafo Bioengineering Co. Ltd., Zhengzhou, PRC)을 함유한 PCMV 반응 혼합물. 다당류와 ε-폴리-L-라이신을 실온에서 계속 교반하면서 15분간 인큐베이션한 다음, 가교제로서 0.25% 글루타르알데하이드와 매트릭스 단백질로서 CRM197을 첨가하였다. 계속 교반하면서 실온에서 다시 10분간 계속 인큐베이션한 다음, 계속 교반하면서 4℃에서 24시간 두었다. PPS-CRM197-εPLL PCMV를 2.6 x 90 cm 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하였다. 분획들은, 안트론 분석으로 다당류를, MicroBCA로 단백질을, 캡처 ELISA로 PCMV 입자내 각 다당류 포획을 분석하였다. 캡처 ELISA에서 양성인 고분자량 다당류를 함유한 분획들을 수집하여 (도 7, 박스 친 분획들), 알럼을 첨가하여, 면역화에 사용하였다.

그룹들의 마우스 10마리들을 0일, 14일 및 28일째에 앞서 기술된 투약 용법으로 면역화하였다. 13-가 배치형 PCMV의 경우, 각 투여량에는 총 다당류 4 ㎍이 포함되었다. PPS 총 30.8 ㎍으로 4 ㎍인 6B를 제외하고는, 투여량 당 각 다당류 2.2 ㎍이 포함된 Prevnar^®13 접합체 백신을, PCMV-유발성 항체 반응과 비교하기 위한 양성 대조군으로서, 마우스 그룹에 투여하였다. 또한, 마우스 그룹은, 항원 단독으로, 즉, 13-가 Prevnar^®13에서 확인되는 13차 비-접합된 다당류 항원들로, 투여량 당 각 다당류 2 ㎍인 총 다당류 총 26 ㎍으로 면역화하였다. (백신 접종하지 않은) 나이브 그룹도 음성 대조군으로서 포함시켰다.

2차 면역화 후 약 2.5주 (47일)째에, 마우스 모두 안락사시키고, 심장 천공으로 채혈하였다. 면역 혈청을 PPS-특이 ELISA에 의해 10종의 PPS 항원에 대한 항원-특이 IgG 항체 반응을 분석하였다. 항-PPS IgG 기하 평균 항체 역가 (GMT)를 면역화한 동물의 개체 혈청의 역가로부터 계산하였다. 결과는 아래 표 4에 나타낸다.

표 4: 13-가 PPS-CRM197-εPLL PCMV 항체 역가

그룹 (투여량 당 총 ㎍)	항-PPS1 IgG GMT	항-PPS3 IgG GMT	항-PPS4 IgG GMT	항-PPS6B IgG GMT	항-PPS9V IgG GMT	항-PPS1 IgG GMT	항-PPS18C IgG GMT	항-PPS19A IgG GMT	항-PPS19F IgG GMT	항-PPS23F IgG GMT
4 ㎍ 배치형 13-가 (PPS-CRM197-εPLL) PCMV + Alum (~0.3 ㎍/PPS)	121	5820	6686	557	1667	512000	97006	3200	222861	139
26 ㎍의 칵테일, 13종 PPS 단독	15	17	11	48	20	4935	31	86	226	17
30.8 ㎍ Prevnar® 13 백신 (~2 ㎍/PPS)	7760	11143	73517	970	134352	388023	7563	44110	33863	2560
나이브	10	17	11	14	26	10	10	17	10	10

배치형 PCMV 제형으로 면역화한 마우스의 혈청으로부터 구한 엔드포인트 IgG GMT는 PPS 단독으로 면역화한 마우스의 GMT 보다 현저하게 높았다 (PPS 단독 보다 8배에서 3,000배 이상 높은 범위임). 표 4의 데이타로부터, ε-PLL을 함유한 배치형 13-가 PCMV가, 상당히 소량의 PPS 항원을 이용하여, 조사한 PPS 항원에 따라, Prevnar^®-13 (각 PPS 2 또는 4 ㎍)으로 면역화하여 수득한 GMT에 상응하는 IgG GMT를 유도하였다 (PCMV 중의 ~0.3 ㎍/PPS vs. Prevnar^®13 중의 2 ㎍/4 ㎍ PPS).

상기 표 3 및 표 4의 면역학적 데이타들로부터, ε-PLL을 함유한 3-가 및 13-가 PCMV가 PLL 또는 다른 폴리양이온을 함유하지 않은 기존의 PCMV에 비해 훨씬 더 강력한 항체 면역 반응을 나타낸다는 것이 명확해진다. 예를 들어, 우수한 반응물 수준과 더 긴 크기의 컬럼에서 비-병합된 다당류 항원(들)과 매트릭스 단백질 단량체를 제거하기 위한 PCMV의 크기-분획화의 재구성으로, 항원 단독에 비해 높은 항원-특이적인 면역 반응을 개선시켰다. 또한, 폴리양이온성 폴리머인 α-PLL 및/또는 ε-PLL의 함유는 PS의 CRM-197-PCMV 매트릭스에의 포획 효율을 높이고, α-PLL 및 ε-PLL을 포함하지 않는 DNI-PCMV 제형 보다 3배 내지 125배의 보다 강력한 면역 반응을 발생시킨다 (실시예 7 참조). 상기 표들에서 알 수 있는 바와 같이, PLL-제형화된 PCMV에 의해 유도되는 항원-특이 항체 반응은 Prevnar^®13 접합체 백신에 의해 달성되는 항-PPS 항원 면역 반응의 정도 보다 때로는 낮거나, 비슷하거나 또는 높지만, Prevnar^®13 접합체 백신이 각 PPS 항원을 2 ㎍ 또는 4 ㎍으로 포함하는 것에 비해 PPS(13)-CRM197-εPLL PCMV가 투여량 당 각 다당류 항원을 0.3 ㎍으로 포함한다는 점에 유념하면, PCMV가 독특한 효과적인 면역 조성물을 제공하며 (Prevnar^®13 백신을 제조하기 위해 여러번의 개개 접합 반응이 필요한 것과 비교하여) 한 단계 반응으로 효율적으로 제조되는 것으로 이해된다.

실시예 7: 칵테일형(Cocktailed) 및 배치형 번들(Bundled) 13-가 PPS-DNI PCMV

캐리어 단백질로서 바실러스 안트라시스의 방어 항원 (DNI)의 무독성 돌연변이 형태를 이용하여 일련의 PCMV들을 제작하였다. 다른 폐렴 구균성 다당류 항원 (PPS)를 각각 포함하는 13종의 개개 PPS/DNI 단백질 매트릭스 백신을, 전술한 바와 같이 0.25% 글루타르알데하이드를 이용하여 동일한 가교 반응 공정에 따라 합성하였다. 그런 후, PCMV를 2.6 x 15 cm의 세파로스 CL2B에서 크기 분리하였다. 아울러, 동일한 PCMV 반응물 (배치형 항원)에 4종의 다당류 항원을 함유한 PCMV 가교 반응을 수행하여, 다가 PCMV를 수득하였다. 다가 PCMV는 다음과 같은 항원 "번들"을 포함한다:

- 번들 1: PPS3, PPS18C, PPS19F, PPS23F

- 번들 2: PPS4, PPS6A, PPS6B, PPS14

- 번들 3: PPS5, PPS7F, PPS9V, PPS19A

PPS1은 글루타르알데하이드의 존재 하에 캐리어 단백질에 공유 결합할 수 있는 1차 아민을 반복 구조에 포함하기 때문에, PPS1은 번들 PCMV 반응물에 포함시키지 않았다. 그런 후, 배치형-항원 PCMV를 1가 PCMV에서와 동일한 방식으로 SEC로 분리하였다. 13종의 개별 백신 조성물들을 혼합하여, 13-가 칵테일형 PPS-DNI-PCMV를 제작하였다. 또한 개개 PPS1-DNI PCMV를 포함하는 3종의 배치형-항원 PCMV를 혼합하여, 배치형 번들 13-가 PCMV를 제작하였다. 그런 후, 그룹들의 마우스 10마리을, 1가 PCMV들의 칵테일형 또는 배치형-항원 PCMV들의 칵테일형으로 면역화하였다. 1가 PCMV 칵테일형의 경우, 마우스에 각 다당류를 2.2 ㎍ 또는 6 ㎍으로 제공하였다. 배치형 번들의 경우에는, 각 다당류를 0.5 ㎍으로만 각 투여량시 사용하여 전달하였고, 단 PPS1은 2.2 ㎍을 전달하였다. 대조군으로서, 그룹 마우스들은 13종의 다당류 단독 또는 접합체 백신 Prevnar^®13으로 면역화하였다. Prevnar^®의 각 투여량에는 PPS6B 4 ㎍을 제외하고는 각 다당류를 2 ㎍으로 포함하였다. 아래 표 5는 칵테일형과 배치형 번들 PCMV로 면역화한 마우스의 항-PPS 항체 역가를 요약 개시한다.

표 5. 칵테일형 13-가 PCMV 유래 항-PPS 항체 역가

PCMV "칵테일" 둘다 다당류 항원 단독에 의해 발생되는 역가 보다 높은 수준의 다당류 항원-특이 역가를 발생시켰지만, 이는 Prevnar^®13 접합체 백신 (Pfizer Inc., USA)에 의해 발생되는 역가 보다 2배 내지 200배 낮았다. 이러한 결과는, 배치형-항원 PCMV의 번들링이 1가 PCMV들의 칵테일형으로 면역화하는 것에 비해 거의 모든 항원에 대해 높은 항체 역가를 유도한다는 것을 보여준다. Prevnar^®13 대비 PCMV 칵테일의 면역 반응 감소는 투여량 당 전달되는 다당류의 양이 원인이기 보다는 다당류의 낮은 포획성과 유리형 다당류로부터 PCMV의 분리 불량이 원인임에 틀림없어 보였다.

실시예 8: 3가 배치형 PPS-CRM197-αPLL PCMV 및 플라젤린 첨가

PPS4, 18C 및 23F 폐렴 구균성 다당류 항원, 매트릭스 형성용 캐리어 단백질로서 CRM197 및 폴리-L-라이신을 포함하는 3가 PCMV를 제조하였으며, 플라젤린을 첨가하지 않았다. PCMV를 다음과 같이 준비하였다: PCMV 반응 혼합물에는, 총 다당류 4 mg/ml (각 다당류 1.33 mg/ml), 4 mg/ml CRM197 및 0.01% αPLL (150-300 kDa)이 포함됨. 다당류들과 αPLL을 계속 교반하면서 실온에서 15분 인큐베이션한 다음 0.25% 글루타르알데하이드를 첨가하였다. 글루타르알데하이드를 첨가한 PCMV 반응 혼합물들 중 하나에는 살모넬라 티피무리움의 플라젤린을 0.001 mg/mL (InvivoGen, San Diego, CA, USA)로 첨가하였다. 계속 교반하면서 실온에서 다시 30분간 인큐베이션하였다. PCMV 반응 생성물을 2.6 x 90 cm 세파크릴 S-1000 컬럼에서 분리하고, 고분자량 분획들을 수집하여 모았다 (도 8, 박스 친 분획들). 컬럼에서 반응물을 분리한 다음, 단백질과 다당류를 각각 microBCA 및 안트론 분석으로 측정하였다.

그룹들의 마우스 10마리를, 플라젤린 무첨가한 배치형-항원 PCMV 또는 플라젤린 첨가한 배치형-항원 PCMV 중 하나를 이전 실시예에서와 같이 이용하여 면역화하였고, 마우스를 면역화하는데 사용하였다. 이전 실시예들에서와 같이 양성 대조군과 음성 대조군도 포함시켰다. 결과는 표 6에 나타낸다.

표 6. 번들 3가 PPS-CRM197 PCMV의 항-PPS 항체 역가

그룹 (투여량 당 총 PPS ㎍, 또는 각각의 PPS ~2 ㎍)	항-PPS4 IgG GMT	항-PPS18C IgG GMT	항-PPS23F IgG GMT
6 ㎍ 배치형 3가(PPS-CRM197-αPLL) PCMV + alum	885,124	76,392	260
6 ㎍ 배치형 3가(PPS-CRM197-αPLL-플라젤린) PCMV + alum	1,406,158	97,942	61
46 ㎍, Pneumovax® (다당류 단독)	15	25	19
30.8 ㎍ Prevnar®13	80,305	3,448	1,194
나이브	15	10	13

플라젤린 비함유 PCMV의 경우, 동일한 투여량 수준에서, 항-PPS4 및 PPS18 항체 역가는 각각 다당류 단독의 59,000배 및 3055배였으며, Prevnar^®13의 11배 및 22배였다 (표 7). PPS23F에 대한 역가는 다당류 단독 보다 약간 높고, Prevnar®에 의한 역가 보다는 낮았는데, 이는 PCMV 입자에 PPS23F가 소량으로 포획되었음을 의미한다. 이들 데이타를 이전의 3가 PPS-CRM197-εPLL PCMV 데이타 (실시예 5)와 비교한 바, 폴리양이온으로서 고분자량 αPLL의 사용이 PCMV 매트릭스내 항원의 포획을 개선시키고, 단백질 매트릭스에 공동-포획시키는 항원에 대한 현명한 선택, 예컨대 매트릭스-형성 반응 생성물의 저분자량 성분의 크기 배제에 의한, 비-면역원성 종들의 제거, 보강 물질, 예컨대 플라젤린의 현명한 사용, 및 항원 포획량과 투여량 당 전달가능한 양에 대한 신중한 조절이 오늘날 시판되는 접합체 백신 제품에 상응하며 심지어 우수한 면역원성을 가지는 PCMV 백신 조성물을 제공해준다는 것을 시사해준다.

실시예 9: 23-가 PPS-CRM197 PCMV

3가 PPS-PCMV에 α-PLL (150-300 kDa)를 사용함으로써 관찰되는 다당류 포획 및 면역원성의 개선과 관련하여, 시판 백신 Pneumovax^®의 23종의 다당류를 이용하여 23-가 PPS-PCMV를 제조하였다. Pneumovax^®로부터 23종의 다당류를 탈염하고 4 mg/mL (각 다당류 0.17 mg/mL)로 농축한 후, 이를 계속 교반하면서 실온에서 15분간 0.01% α-PLL (150-300 kDa)와 함께 인큐베이션하였다. 여기에0.25% 글루타르알데하이드를 4 mg/mL CRM197와 함께 첨가하여, 계속 교반하면서 실온에서 10분간 인큐베이션한 다음, 4℃에서 24시간 동안 계속 교반하면서 인큐베이션하였다. PCMV 반응물을 2.6 cm x 90 cm 세파크릴S-1000 컬럼에서 분리하고, 분획내 총 다당류와 단백질의 양을 각각 안트론 분석과 microBCA 분석으로 측정하였다 (도 9). 도 9에 박스 표시된 고분자량 분획들을 모아, 면역화에 사용하였다.

그룹들의 마우스 10마리를 상기 실시예에서와 같이 면역화하였다. 상기 실시예에서와 같이 양성 대조군과 음성 대조군을 포함시켰다. 결과는 표 7에 나타낸다.

표 7. 23-가 PPS-CRM197-αPLL (150-300 kDa) PCMV의 항-PPS GMT

그룹 (총 PPS ㎍, 또는 각 PPS ~0.26 ㎍)	항-PPS1 IgG GMT	항-PPS3 IgG GMT	항-PPS4 IgG GMT	항-PPS6B IgG GMT	항-PPS9V IgG GMT
6 ㎍ 배치형 23가 (PPS-CRM197-α-PLL) PCMV + Alum	1,731,183	106,649	334	735	59,714
6 ㎍, Pneumovax ® (다당류 단독)	145	215	19	149	32
30.8 ㎍ Prevnar ® 13 (각 PPS ~2 ㎍)	22,286	146,269	80,305	4,159	362,039
나이브	11	13	15	13	10
그룹 (총 PPS ㎍, 또는 각 PPS ~0.26 ㎍)	항-PPS14 IgG GMT	항-PPS18C IgG GMT	항-PPS19A IgG GMT	항-PPS19F IgG GMT	항-PPS23F IgG GMT
6 ㎍ 배치형 23가 (PPS-CRM197-α-PLL) PCMV + Alum	1,891,038	463,425	1,372	2,492	53
6 ㎍, Pneumovax ® (다당류 단독)	1,030	70	26	61	70
30.8 ㎍ Prevnar ® 13 (각 PPS ~2 ㎍)	383,957	3,448	24,251	3,378	1,194
나이브	17	10	17	16	13

23-가 PPS-PCMV는 PPS1, PPS14 및 PPS18C에 대한 GMT를 접합체 백신 Prevnar^®13에 의한 GMT 보다 각각 77배, 4.9배 및 134배 높게 유도한 반면, PPS3 및 PPS19F의 GMT는 Prevnar^®13와 비슷하였다. 본 발명에 따른 23-가 PCMV는, 각 투여량 당 각각의 다당류가 0.26 ㎍만 전달되는데 반해, Prevnar^®13은 각 투여량 당 각각의 다당류를 2.2 ㎍으로 포함하고 있어 (단, PPB6B는 4 ㎍임), 23-가 PCMV가 수종의 다당류들에 대해 7배 낮은 투여량으로 인해 Prevnar^®13 보다 높은 역가를 발생시킬 수 있다는 것을 의미한다. 본 면역원성 실험에서 테스트한 다른 다당류들의 GMT는 Prevnar^®13에 의해 발생되는 결과 보다는 낮았지만, 다당류 단독에 비해서는 여전히 일반적으로 높았다.

본원에 인용되거나 참조된 모든 특허, 특허 출원, 특허 출원 공개공보 및 그외 간행물들은 이들 각각의 특허, 특허 출원, 특허 출원 공개공보 또는 간행물이 원용에 의해 본 명세서에 구체적이고 개별적으로 포함되는 것으로 언급된 바와 동일한 범위로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

Claims (19)

1. (1) 하나 이상의 대상 항원, (2) 하나 이상의 캐리어 단백질, 및 (3) 하나 이상의 폴리양이온을 포함하는 면역원성 조성물로서,
   상기 폴리양이온은 반복되는 1차 아민을 함유하며,
   상기 캐리어 단백질 및 상기 폴리양이온은 가교되어 단백질 매트릭스를 형성하며,
   상기 대상 항원은 상기 단백질 매트릭스에 포획(entrapping)되고,
   상기 면역원성 조성물은 상기 항원 단독과 비교하여, 및 상기 폴리양이온을 포함하지 않는 단백질 매트릭스 백신 조성물과 비교하여 증가된 면역원성을 갖는 것인, 면역원성 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 폴리양이온이 폴리-L-라이신, 분지형 폴리에틸렌이민 (PEI), 스페르미딘, 스페르민, 키토산 [2-아미노-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcN)과 2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루칸 (GlcNAc)의 β-(1-4)-연결된 공중합체], 폴리아민 N7 (CAS 29320-38-5) 및 에틸렌다이아미노메틸 폴리스티렌 (CAS 177987-93-8)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 폴리양이온이 폴리-L-라이신 (PLL)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 폴리-L-라이신이 α-폴리-L-라이신 (α-PLL) 또는 ε-폴리-L-라이신 (ε-PLL)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 폴리-L-라이신이 α-폴리-L-라이신 (α-PLL)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
   상기 조성물이 평균 입자 직경이 50 nm 이상인 단백질 매트릭스 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 조성물이 평균 입자 직경이 100 nm - 2000 nm의 단백질 매트릭스 입자로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 항원 : 상기 캐리어 단백질의 몰 비가 1 : 10 - 10 : 1인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
9. 제1항에 있어서,
   반응 혼합물내 상기 폴리양이온의 비율이 0.005 - 0.10%인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
10. 제1항에 있어서,
    상기 대상 항원이 2종 이상의 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
11. 제1항에 있어서,
    상기 대상 항원이 다당류인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
12. 제11항에 있어서,
    상기 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 다당류, 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 다당류, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 다당류, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 다당류, 살모넬라 티피 (Salmonella Typhi) 다당류, 시트로박터 프레운디이 (Citrobacter freundii) 다당류, 살모넬라 종의 다당류, 쉬겔라 (Shigella) 다당류 또는 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    상기 스트렙토코커스 뉴모니아 다당류가 캡슐형 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
14. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 캐리어 단백질이 디프테리아 톡소이드, CRM197, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 또는 이의 돌연변이, 콜레라 독소 B 서브유닛, 파상풍 독소 단편 C, 박테리아 플라젤린, 뉴모라이신 (pneumolysin), 네이세리아 메닝기티디스의 외막 단백질, 슈도모나스 에어루지노사 Hcp1 단백질, 대장균 (Escherichia coli)의 이열성 내독소, 쉬가 유사 독소 (shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 리스테리오라이신 O (listeriolysin O), 박테리아 전체 세포의 단백질 추출물, 바실러스 안트라시스의 방어 항원의 우성 음성 저해제 (dominant negative inhibitor) (DNI) 돌연변이, 또는 대장균의 베타-갈락토시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
15. 면역원성 조성물의 제조 방법으로서,
    (i) 대상 항원을 캐리어 단백질, 및 반복되는 1차 아민을 함유하는 폴리양이온과 혼합하여, 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 캐리어 단백질과 상기 폴리양이온을 가교하여, 상기 대상 항원이 포획된 캐리어 단백질 매트릭스를 제조하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조 방법.
16. 제1항의 조성물을 포함하는, 포유류에서 대상 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위한 의약.
17. 제16항에 있어서, 상기 포유류가 인간인 것을 특징으로 하는 의약.
18. 제1항에 따른 면역원성 조성물을 2 이상 포함하는, 백신 조성물.
19. 제1항의 조성물을 포함하는, 감염성 물질에 대항하여 개체를 백신 접종(vaccinating)하기 위한 의약.

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