MX2013013358A

MX2013013358A - Composiciones de vacuna de matriz de proteína que incluyen policationes.

Info

Publication number: MX2013013358A
Application number: MX2013013358A
Authority: MX
Inventors: Kevin P Killeen; Robert T Cartee
Original assignee: Matrivax Inc
Priority date: 2011-05-18
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2014-07-09
Also published as: CA2836251A1; KR101670340B1; AU2012255878A1; KR20140045416A; CA2836251C; EP2709656B1; CN103747798B; US9724401B2; US20140086989A1; ZA201309516B; JP6072777B2; BR112013029417B1; ES2728653T3; EP2709656A4; AU2012255878B2; DK2709656T3; CN103747798A; BR112013029417A2; HK1197033A1; MX349657B

Abstract

La presente invención se relaciona con las composiciones inmunológicas que contienen uno o más antígenos de interés, una o más proteínas portadoras, y uno o más policationes, en donde el antígeno de interés se inmoviliza con la matriz de la proteína portadora entrecruzada y uno o más policaitones, método de fabricación de dichas vacunas y métodos de administración de la vacuna.

Description

COMPOSICIONES DE VACUNA DE MATRIZ DE PROTEÍNA QUE INCLUYEN POLICATIONES Referencia Cruzada con Solicitud Relacionada Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/487,663 presentada el 18 de mayo de 2011, cuyo contenido se incorpora en el presente en su totalidad.

Campo de la Invención La invención se relaciona con composiciones inmunogénicas , métodos para hacer vacunas, y métodos de administración de vacunas. Específicamente, la invención se relaciona con vacunas de matriz proteínica que presentan un antígeno de interés inmovilizado en una matriz de proteína portadora reticulada, en donde la poli-L-lisina u otro el policatión se utilizan en la formación de la matriz de proteína de antígeno inmovilizado.

Antecedentes de la invención La vacunación contra las infecciones bacterianas es un seguimiento médico importante, que representa una intervención médica preventiva recomendada para virtualmente cada individuo. El diseño de vacunas para combatir la infección bacteriana o la patogénesis de la infección bacteriana a menudo se dirige a las proteínas bacterianas, como la toxina producida por una bacteria. Tal es el caso, por ejemplo, en las vacunas contra el ántrax, la difteria y el tétanos. Otro enfoque de la vacuna se dirige a la cápsula externa de una bacteria, sin embargo muchos de los antígenos que comprenden la capa de la cápsula de un patógeno bacteriano estimular la respuesta inmune a largo plazo poca o ninguna, lo que complica su uso en la creación de vacunas eficaces . Las cápsulas representan la superficie exterior de muchas bacterias y por lo general se componen de polímeros de compuestos orgánicos, tales como hidratos de carbono, aminoácidos, o alcoholes. Las cápsulas son muy diversas químicamente. Para cápsulas basadas en polisacáridos las unidades de azúcar pueden ser unidas entre sí en diversas configuraciones moleculares y pueden estar además sustituidos con fosfato, nitrógeno, sulfato y otras modificaciones químicas. Las cápsulas pueden ser un factor de virulencia, mediante la inhibición de microbios de ser fagocitados y muertos por los macrófagos y leucocitos polimorfonucleares de acogida de manera eficiente.

Los antígenos en contra de las cápsulas proporcionan una defensa contra los organismos encapsulados mediante la mediación de la fijación de complemento en la superficie microbiana, la cual puede resultar en lisis bacteriana o opsonización, ingesta, y muerte por parte de las células anfitrionas inmunes fagocíticas. Los antígenos más potentes contra las cápsulas microbianas son los antígenos de igG. Los antígenos capsulares son generalmente clasificados como antígenos independientes-T ya que provocan respuestas inmunes que no involucran ayuda de células-T y por lo tanto no provocan respuestas inmunológicas de memoria de largo plazo. Sin embargo, el acoplamiento covalente de una proteína con un antígeno capsular rinde el antígeno capsular "dependiente de T" , y dichos antígenos dependientes de T por consiguiente provocan una respuesta ayudante mediada por célula T (dependiente de Th) célula B de memoria basada en igG o anamnésica .

Varios métodos de rendición de antígenos de la vacuna más inmunogénica y lo ideal es dependiente de T se han estudiado. La mayoría de los polisacáridos de superficie bacterianas son inmunogénicos por sí mismos y son capaces de provocar una respuesta inmune que reconozca el antígeno de origen natural en la cápsula microbiana. Sin embargo, cuando los polisacáridos capsulares solo se utilizan como vacunas, que generalmente no promueven la inmunidad de larga duración, ni son muy eficaces en la inmunización de niños menores de 2. Se ha demostrado que la unión covalente de un antígeno de polisacárido a una proteína portadora puede aumentar en gran medida la inmunogenicidad del polisacárido y promover la respuesta deseada T-dependiente inmune (o inmunidad de memoria) que conduce a la protección del huésped frente a infecciones posteriores por el microorganismo que lleva un antígeno. Por ejemplo, una vacuna neumocócica no conjugada, tal como de Merck Pneumovax®, es efectiva contra la enfermedad neumocócica invasiva en individuos, sin embargo, es ineficaz (por ejemplo, en los recién nacidos) en la obtención de la memoria inmunológica y la inmunidad protectora deseada que provocar inmunidad a largo plazo y evitar la necesidad de inmunizaciones repetidas . Vacunas neumocócicas conjugadas tales como Prevnar® de Pfizer (Pfizer Inc., E.U.), han demostrado ser altamente inmunogénica incluso en los lactantes de 2 meses de edad, inducir la inmunidad dependiente de T y para ser altamente efectiva .

Sin embargo, mientras que las vacunas conjugadas son prometedores inmunológicamente, que puede ser extremadamente difícil y complicado (y costoso) para la fabricación, lo que dificultaría enormemente su distribución a los necesitados de la vacunación en todo el mundo. Por ejemplo, en el caso de Prevnar® 7 , cada cepa de S. pneumoniae utiliza para proporcionar los siete antígenos polisacáridos utilizados para la conjugación se cultiva en un biorreactor; las células se recogen; polisacárido se extrae, purifica, hidroliza al tamaño apropiado; los antígenos individuales se conjugan a una proteína vehículo; el conjugado se volvió a purificar, mezclada con los otros 6 complejos de polisacárido-proteína adicionales (conjugados) que se prepararon de una manera similar; y la mezcla de múltiples conjugado se finalmente con adyuvante con alumbre. Se estima que hay más de 200 pasos de GMP en la fabricación de la vacuna heptavalente Prevnar®.

Recientemente, las vacunas de la matriz de proteínas han sido propuestos como una alternativa para conjugar vacunas. Ver, EE.UU. aplicación publicada no. US-2008 - 0095803 (Mekalanos, J.), publicado 24 de abril 2008 ; publicación de solicitud internacional de patente n. WO 2008 / 021076 (Mekalanos, J.), publicado el 21 de febrero de 2008 ; y la publicación solicitud de patente internacional no. WO 2011 / 031893 (Killeen, K. , et . Al.), Publicado el 17 de marzo de 2011 ) , que se incorpora en el presente como referencia. En lugar de conjugar covalentemente un antígeno de interés a un portador, una vacuna matriz de proteína inmoviliza el antígeno en una matriz de proteína de soporte, preparado por reticulación de la proteína portadora en presencia del antígeno deseado. Unión covalente significativa del antígeno a la proteína portadora se evita; más bien, el antígeno permanece asociado con la matriz por quedar inmovilizado por el portador de proteína durante la formación de la matriz (reacción de reticulación) . Tales vacunas matriz proteica se han demostrado para provocar una mayor inmunogenicidad que las vacunas preparadas usando el antígeno solo; y vacunas de la matriz de proteínas también pueden provocar el tipo de respuesta inmune (es decir, la inducción de la inmunidad dependiente de T) visto con vacunas conjugadas. Síntesis de vacunas de proteínas de la matriz no implica reacciones de conjugación complicados, y típicamente requiere menos etapas de procesamiento, lo que hace que las vacunas de la matriz de proteínas, a su vez, menos caro de fabricar que una vacuna conjugada.

Aunque las vacunas de la matriz de proteínas proporcionan varias ventajas, el título de los antígenos específicos de antígenos inducidos por las vacunas de la matriz de proteína es a menudo menor que el título provocados por una vacuna conjugada correspondiente. El documento WO 2011/031893 enseña que la separación de las vacunas de la matriz de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño y la selección de las fracciones que contienen partículas de alto peso molecular de la matriz de proteínas de peso para la inmunización puede conducir a títulos similares a los provocados por las vacunas de polisacáridos conjugados. Sin embargo, es un problema técnico persistente en el campo para proporcionar un medio para la producción de vacunas de la matriz de proteína de aumento de la inmunogenicidad, con el fin de explotar la promesa científica y la fabricación y ventajas de costos de esta tecnología emergente. Hay una necesidad continua de mejorar las vacunas de matriz de proteína que tiene una mayor inmunogenicidad o potencia.

Breve Descripción de la Invención Un sorprendente avance en la eficacia y el rendimiento de las vacunas de la matriz de proteínas se ha logrado con vacunas preparadas de acuerdo con la presente invención, en la que la poli-L-lisina (PLL) , u otro policatión, se utiliza en la formación de la matriz de proteína de inmovilización para un polisacárido u otro antígeno. Por lo tanto, la calidad y el rendimiento de las vacunas de proteínas de la matriz se han mejorado no por la modificación del antígeno (s) , pero por la atención a la naturaleza y composición de la matriz utilizada para inmovilizar el antígeno (s).

Se describen en el presente son nuevas vacunas y métodos para mejorar el inmovilización polisacárido con la matriz mediante el uso de amina primaria que contiene policationes de matriz de proteína.

Una modalidad de la invención es una composición inmunogénica que comprende (1) uno o más antígeno de interés, (2) una o más proteína portadora, y (3) uno o más policatión, en el que dicha proteína portadora y dicho policatión están opcionalmente reticulado para formar una matriz de proteína, y dicho antígeno de interés es inmovilizado por dicha matriz de proteína. Tales composiciones se pueden preparar fácilmente mezclando el antígeno, proteína transportadora, y los componentes policatión, iniciando una reacción de reticulación para causar la reticulación de la proteína portadora y/o policatión. Las composiciones de vacuna de la matriz de proteínas que incorporan un policatión, por ejemplo, oc-PLL, de acuerdo con la presente invención han aumentado la inmunogenicidad en comparación con el antígeno solo, en comparación con una mezcla de antígeno y el portador, y en comparación con una composición de vacuna matriz de proteína que no incorporen un policatión.

En una modalidad preferida, uno o más policationes de la composición inmunogénica se selecciona del grupo que consiste en: poli-L-lisina, poli-L-arginina, poli-ornitina, espermidina, espermina, quitosano [una ß-(1-copolímero 4) enlazada de 2-amino-2-desoxi-p-D-glucano (GlcN) y 2-acetamido-2-desoxi- -D-glucano (GlcNAc) ] , polietilenimina (PEI), poliamina N7 (ramificado CAS 29320-38-5) y Etilenediaminometil poliestireno (CAS 177987-93-8) . En modalidades deseables, dijo policatión es poli-L-lisina (PLL) .

En modalidades adicionales deseables dicho poli -L-lisina es alfa poli-L-lisina (PLL-a; aPLL) o épsilon poli-L-lisina ( e-PLL; EPLL) .

En modalidades preferidas, dicha composición se compone de partículas de la matriz de proteínas que tienen un tamaño medio de partícula mayor que 50 nm de diámetro. Tales composiciones se pueden preparar fácilmente mediante la mezcla de la proteína antígeno, portador, y los componentes policatión, iniciando una reacción de reticulación para causar la reticulación de la proteína y/o policatión portador, seguido por el procesamiento de los productos de reacción para eliminar de peso molecular más bajo especies.

Una modalidad de la invención es una composición de vacuna que contiene un antígeno de interés y una matriz de proteína portadora/policatión, donde el antígeno está inmovilizado con la matriz de proteína portadora/policatión para formar un complejo. En modalidades deseables de la invención, el complejo de matriz de proteína del antígeno/portador/policatión tiene un tamaño medio de partículas de diámetro superior a 50 nm. En modalidades más deseables de la invención, el complejo tiene un tamaño medio de partícula de diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 500 nm, mayor que 1000 nm, mayor de 2000 nm o incluso mayor, por ejemplo, a los límites de la metodología para la separación de las partículas de la matriz de proteínas. En modalidades todavía más deseables de la invención, los complejos de la matriz de proteína de antígeno/portador/policatión de la composición de vacuna se abarcar una gama de tamaños de partícula por encima de 50 nm de diámetro, tales como 50 a 2000 nm de diámetro, o selecciones dentro de ese rango, por ejemplo, , 100-200 nm, 200-400 nm, 250-500 nm, 120 a 1000 nm, 200 a 2000 nm, y otros rangos de tamaño de partícula tal. En modalidades todavía más deseables de la invención, la composición incluye complejos que tienen tamaños de partícula de 50 a 150 nm de diámetro.

En modalidades deseables adicionales de la invención, la relación molar de antígeno a la proteína portadora es entre 1 a 10 y 10 a 1.

En modalidades preferidas, el porcentaje de policatión en peso en la mezcla de reacción es de 0.005 al 0,10%, o en el intervalo de 0.05 mg/ml-0.5 mg/ml .

En modalidades adicionales deseables, la composición inmunogénica incluye además dos o más antígenos de interés, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o más antígenos de interés .

En modalidades deseables de la invención, las composiciones de vacuna de la matriz de proteínas de la invención, cuando se administra a un mamífero, provocan una respuesta inmune dependiente de células T en el mamífero (es decir, producir la memoria inmunológica en el huésped vacunado) .

En modalidades deseables de la invención, dicho antígeno de interés es un polisacárido .

En modalidades deseables adicionales de la invención, el polisacárido se selecciona entre el grupo que consiste en un polisacárido de Streptococcus pneumoniae, Francisella tularensis polisacárido, polisacárido de Bacillus anthracis, Haemophilus influenzae polisacárido, Salmonella Typhi polisacárido, Citrobacter freundii polisacárido, Salmonella especies polisacárido, Shigella polisacárido, o polisacárido de Neisseria meningitidis . 0-antígenos de las bacterias Gram negativas, parte de LPS ( lipopolisacárido) que es única ya menudo un antígeno protector para la infección bacteriana, son también antígenos adecuados de interés para su uso en la presente invención.

En modalidades más deseables de la invención, dicho Streptococcus pneumoniae polisacárido se selecciona de uno o más polisacárido del grupo que consiste de tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44, y 46.

En modalidades preferidas, la prote na de uno o más vehículo se selecciona del grupo que consiste de toxoide de la difteria, por ejemplo, la difteria no tóxica fragmento de proteína de la toxina CRM197, toxoide del tétanos, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa o un mutante de la misma, subunidad B de la toxina del cólera, el tétanos toxina fragmento C, flagelina bacteriana, neumolisina, una proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis , proteína Pseudomonas aeruginosa HCPl, el calor de Escherichia coli enterotoxina lábil, la toxina shiga -like, proteína LTB humana, listeriolisina O, un extracto de proteínas de las células bacterianas enteras, la dominante inhibidor negativo (DNI) mutante del antígeno protector de Bacillus anthracis, o Escherichia coli beta-galactosidasa .

En modalidades deseables de la invención, la composición inmunogénica comprende un antígeno de interés inmovilizado en una matriz de proteína portadora/policatión y además incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En modalidades preferidas, la invención presenta otro método de fabricación de una composición de vacuna. Este método implica (i) mezclar uno o más antígenos de interés , una o más proteínas portadoras , y uno o más policationes y (ii) la adición de un agente de reticulación capaz de formar enlaces cruzados entre las moléculas de proteína portadora, entre diferentes sitios de la misma molécula de proteína vehículo, y/o entre la molécula de proteína portadora y el policatión, y (iii) iniciar una reacción de reticulación. En modalidades adicionales, el método de fabricación de una vacuna de acuerdo con la invención también incluirá un paso más (iv) opcionalmente de la selección de los complejos de productos de reacción de reticulación que tienen un diámetro de tamaño de partícula mayor que 50 nm. En ciertos casos en los que los grupos reactivos del reactivo de reticulación y los sitios reactivos de la proteína portadora reaccionarán en contacto, los pasos de mezcla y de iniciación (ii) y (iii) se producirán simultáneamente o pueden ser considerados un paso. Adicionalmente, puede ser favorable para inactivar la reacción de reticulación mediante la inclusión de un paso después de la etapa de iniciación de reacción de la atenuación de la reacción de reticulación, por ejemplo, por adición de un enfriamiento apropiado o agente de bloqueo.

En modalidades deseables de la invención, la invención presenta un procedimiento para provocar una respuesta inmune en un mamífero a un antígeno de interés o vacunar a un sujeto contra un agente infeccioso, comprendiendo el método administrar al mamífero o someter una composición inmunogénica como se describe en el presente documento. En modalidades preferidas, el mamífero es un ser humano.

En otras modalidades deseables de la invención, la invención presenta una composición de vacuna que comprende dos o más composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es un gráfico que muestra la separación de las reacciones de Vi- CRM197 pCMV, con y sin poli-L-lisina (PLL) , por cromatografía de exclusión de tamaño. El polisacárido Vi solo, una reacción Vi- CRM197 PCMV que contenía PLL, y un Vi-CRM-PCMV que no contenía PLL se separaron en un 500 mi (90 cm x 2,6 cm) de Columna de Sephacryl de S- 1000. La cantidad de polisacárido Vi en las fracciones se determinó usando el ensayo de todas las manchas .

La figura 2 es un gráfico que muestra la separación de un Vi-CRMl97-aPLL (150-300 kDa) PCMV por cromatografía de exclusión de tamaño. La reacción PCMV se separó en un 150 mi (30 cm x 2.6 cm) de columna de Sephacryl de S- 100. La cantidad de polisacárido Vi y proteína en las fracciones se determinó utilizando el ensayo de manchas -todos y el ensayo de microBCA, respectivamente. El cuadro sombreado indica las facciones que se combinaron y se utiliza para la inmunización de los ratones en el ensayo preclínico.

La figura 3 es un gráfico que muestra la separación de Vi- CRMl97-aPLL (150-300 kDa) PCMV por cromatografía de exclusión de tamaño. La reacción PCMV se separó en un 500 mi (90 cm x 2,6 cm) de columna de Sephacryl S-1000. La cantidad de polisacárido Vi y proteína en las fracciones se determinó utilizando el ensayo de todas las manchas y el ensayo de microBCA, respectivamente. Las casillas sombreadas indican fracciones que se combinaron y se utiliza para la inmunización de los ratones en el ensayo preclínico.

La figura 4 es un gráfico que muestra la separación de 18C polisacárido de neumococo (PPS18C) y un PPSl8C-CRM-aPLL (15-30 kDa) -PCMV por cromatografía de exclusión de tamaño. PPS18C y un PPS18C-CRM-PLL-PCMV se separaron en un 500 mi (90 cm x 2,6 cm) de Columna de Sephacryl de S- 1000. La cantidad de polisacárido en las fracciones se determinó usando el ensayo de antrona y la cantidad de proteína se determina utilizando el ensayo de proteínas de microBCA.

La figura 5 es un gráfico que muestra el aumento de la cantidad de inmovilizado Vi al aumentar la cantidad aPLL. 4 mg/ml se añadió Vi a reacciones PCMV que contiene 0.01% aPLL (150-300 kDa), 0,02% OÍPLL (150-300 kDa), o 0.04% aPLL (15-30 kDa) . Después de la adición de glutaraldehído y CRM197, reacciones se separaron en un 500 mi (90 cm x 2.6 cm) de columna de exclusión por tamaño Sephacryl S-1000. Las fracciones se analizaron para polisacárido y proteína usando el ensayo de manchas y todos ensayo de microBCA, respectivamente .

La figura 6 es un gráfico que muestra la separación de un trivalente lotes PPS (PPS4, PPS18C , PPS23F) -CRMl97-sPLL PCMV por cromatografía de exclusión de tamaño. Tres polisacáridos de neumococo (1,3 mg/ml de cada uno de PPS4, PPS18C, y PPS23F) se añadieron a una reacción de PCMV sola. La reacción se separó en un 500 mi (90 cm x 2.6 cm) de columna Sephacryl de S- 1000. Se analizaron fracciones de la columna de polisacárido total y proteína usando el ensayo de antrona y de microBCA, respectivamente. El cuadro sombreado indica las fracciones que se agruparon para la inmunización de los ratones en un estudio preclxnico inmunogenicidad.

La figura 7 es un gráfico que muestra la separación de 13-valente PPS- CR l97-aPLL (150-300 kDa) PCMV reunido por cromatografía de exclusión de tamaño. Los 13 polisacáridos neumocócicos presentes en la vacuna Prevnar® 13 conjugado se añadieron a una reacción de PCMV sola (0.3 mg/ml de cada polisacárido) . La reacción se separó en un 500 mi (90 cm x 2,6 cm) de Columna de Sephacryl de S- 1000. Se analizaron fracciones de la columna de polisacárido total y proteína usando el ensayo de antrona y de microBCA, respectivamente. El cuadro sombreado indica las fracciones que se agruparon para la inmunización de los ratones en un estudio preclxnico inmunogenicidad.

La figura 8 es un gráfico que muestra la separación de un PPS trivalente reunido (PPS4, PPS18C, PPS23F) -CRMl97-aPLL (150-300 kDa) PCMV por cromatografía de exclusión de tamaño. Tres polisacáridos de neumococo (1,3 mg/ml de cada uno de PPS4, PPS18C, y PPS23F) se añadieron a una reacción de PCMV sola. La reacción se separó en un 500 mi (90 cm x 2,6 cm) de columna de Sephacryl S- 1000. Se analizaron fracciones de la columna de polisacárido total y proteína usando el ensayo de antrona y de microBCA, respectivamente. El cuadro sombreado indica las fracciones que se agruparon para la inmunización de los ratones en un estudio preclínico inmunogenicidad.

La figura 9 es un gráfico que muestra la separación de 23-valente PPS- CRMl97-aPLL (150-300 kDa) PCMV reunido por cromatografía de exclusión de tamaño. Los 23 polisacáridos presentes en el polisacárido única vacuna Pneumovax® se añadieron a una reacción de PCMV sola (0,17 mg/ml de cada polisacárido) . La reacción se separó en un 500 mi (90 cm x 2,6 cm) de Columna de Sephacryl de S- 1000. Se analizaron fracciones de la columna de polisacárido total y proteína usando el ensayo de antrona y de microBCA, respectivamente. El cuadro sombreado indica las fracciones que se agruparon para la inmunización de los ratones en un estudio preclínico DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las vacunas de matriz de proteína, y particularmente las vacunas de matriz capsular proteínica (PCMV), se describen en la publicación de patente de E.U. US-2008-0095803 (Mekalanos, J.), publicada el 24 de abril de 2008; la publicación de solicitud de patente internaconal WO/2008/021076 (Mekalanos, J.) , publicada el 21 de febrero de 2008; y la publicación de solicitud de patente internacional no. WO 2011/031893 (Killeen, K., et. al.), publicada el 17 de marzo de 2011, todas incorporadas en el presente en su totalidad. Estas publicaciones enseñan que las vacunas de matriz de proteína tienen las propiedades inmunológicas potentes de las típicas vacunas conjugadas de proteína PS pero difieren deseablemente de las vacunas conjugadas en que no se requiere enlace covalente significativo alguno para acoplar el antígeno de interés con la proteína portadora. Por lo tanto, las vacunas de matriz de proteína (matriz de proteína portadora/complejos de antígeno) se distinguen de vacunas conjugadas convencionales, en donde el antígeno se enlaza de manera covalente a un portador. En una vacuna de matriz de proteína, el antígeno de interés, por ejemplo polisacáridos , polímeros orgánicos capsulares u otros antígenos, está inmovilizado con una matriz de proteína portador .

Cuando un biopolímero capsular o polisacárido de un patógeno es inmovilizado en una matriz de proteína reticulada, dichas vacunas se denominan vacunas de matriz capsular proteínica (PCMV por sus siglas en inglés) . Como se describe en WO 2008/021076 y US 2008-0095803, las PCMV se produjeron incluyendo unas basadas en el modelo de antígeno capsular independiente de T, ácido poligama-D- glutámico (PGA) , así como ácido algínico (alginato) y dextrano, y la proteína portadora ejemplar, mutante Dominante Negativo Inhibidor (DNI) . El DNI es una forma mutada de Antígeno Protector (PA) de B. anthracis y se produjo a partir de Escherichia coli mediante el método de Benson, et al., Bioquímica, 37:3941-3948 (1988). Otras modalidades PCMV, así como los beneficios de el tamaño de fracción de las partículas PCMV, se describen en WO 2011/031893.

La presente invención se relaciona con descubrimientos y observaciones hechas con respecto a la mejora de la inmunogenicidad de las composiciones y rendimiento de vacuna de matriz de proteína a través de la inmovilización mejorada del antígeno dentro de la matriz de proteína.

Para que la invención puedas ser más claramente entendida, las siguientes abreviaturas y términos se usan como se define más adelante.

Una composición o método descrita en el presente como "que comprende" o "comprendiendo" uno o más elementos nombrados o pasos, es de criterio abierto, significando que los elementos nombrados o pasos son esenciales, pero que se pueden agregar otros elementos o pasos dentro del alcance de la composición o método. Para evitar la prolijidad, también se entiende que cualquier composición o método descrito como "que comprende" o "comprendiendo" uno o más elementos nombrados o pasos también describe la composición o método correspondiente, más limitado, "consistiendo esencialmente de" (o "que consiste esencialmente de") los mismos elementos nombrados o pasos, significando que la composición o método incluye los elementos esenciales nombrados o pasos y puede también incluir elementos adicionales o pasos que no afectan materialmente la(s) característica (s) básica (s) y novedosa (s) de la composición o método. También se entiende que cualquier composición o método en el presente descrito como "comprendiendo" o "consistiendo esencialmente de" uno o más elementos nombrados o pasos, también describe la composición o método correspondiente, más limitada, y cerrada "consistiendo de" (o "que consiste de") los elementos nombrados o pasos para la exclusión de cualquier otro elemento no nombrado o paso. En cualquier composición o método en el presente descrito, los equivalentes conocidos o descritos de cualquier elemento esencial nombrado o paso, pueden ser sustituidos por dicho elemento o paso. También se entiende que un elemento o paso "seleccionado del grupo que consiste de" se refiere a uno o más de los elementos o pasos en la siguiente lista, incluyendo combinaciones de cualquiera dos o más de los elementos listados o pasos.

El término "administrando" como se usa en el presente, junto con una composición de vacuna, significa proporcionar la composición de vacuna a un sujeto tal como un sujeto humano en una dosis suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto, caracterizado porque los resultados de la respuesta inmune en la producción de antígenos que enlazan específicamente un antígeno contenido en la composición de vacuna (ejemplo, cuyo antígeno, en vacunas terapéuticas, corresponde a un marcador antigénico en un patógeno) . La administración de manera deseable incluye la inyección intramuscular, inyección intradérmica, inyección intravenosa, inyección intraperitoneal , inyección subcutánea o transcutánea, inhalación o ingestión, según sea apropiado para la forma de dosis y la naturaleza y actividad de la composición de vacuna a ser administrada. La administración puede involucrar una sola administración de una vacuna o la administración de una vacuna en dosis múltiples. Deseablemente, una segunda administración ("acelerador") se diseña para acelerar la producción de antígenos en un sujeto para evitar la infección por un agente infeccioso. La frecuencia y cantidad de dosis de vacuna depende de la actividad específica de la vacuna, y puede ser fácilmente determinada por experimentación de rutina .

El término "reticulación" se refiere a la formación de un enlace covalente entre dos moléculas, macromoléculas o combinación de moléculas, ejemplo, moléculas de proteína portadora, o entre dos sitios de la misma molécula, ejemplo, dos residuos de amino ácidos de la misma proteína, o entre moléculas de proteína portadora y moléculas de polication, ya sea directamente, cuando se usa un vinculante de "longitud cero" (creando un enlace directo) , o mediante el uso de moléculas reticulantes bifuncionales que forman un puente o vínculo molecular entre dos sitios reactivos. Los reticuladores bifuncionales exhiben dos grupos funcionales, cada uno capaz de formar un enlace covalente con una de dos moléculas separadas o entre dos grupos separados en la misma molécula (ejemplo, para formar "curvas" o "duplicar" dentro de una molécula tal como una proteína portadora) . Los vinculantes ejemplares incluyen reticuladores bifuncionales que son capaces de reticular dos moléculas de proteínas portadoras y/o dos moléculas de polication y/o molécula de proteína de portador con una molécula de polication.

El término "antígeno" como se usa en el presente, se refiere a cualquier molécula o combinación de moléculas que está específicamente enlazada por un antígeno o fragmento de antígeno.

El término "reticulador bifuncional" o "vinculante bifuncional" como se usa en el presente, significa un compuesto que tiene dos grupos funcionales, cada uno separadamente capaz de formar un enlace covalente con grupos reactivos en dos moléculas separadas, átomos, o recolecciones de moléculas que se desea sean vinculadas . Los vinculantes bifuncionales ejemplares se describen, por ejemplo, por G.T. Hermanson, Técnicas de Biocon ugados (Impresiones Académica, 1996) , y Dick y Beurret, "Glicoconjugados de Antígenos de Carbohidrato Bacteriano" en Vacunas de Conjugado (Cruse and Lewis, eds . ) , Contrib. Microbiol. Inmuno1. Basel, Karger, 1989, vol . 10, pp. 48-114) . Deseablemente, un vinculante bifuncional es glutaraldehído, bis [sulfosuccinimidilo] suberato, o adipimidato de dimetilo.

El término "vinculante" o "reticulante" como se usa en el presente, se refiere a un compuesto capaz de formar una unión química covalente o puente que une dos o más moléculas o dos o más sitios en la misma molécula. Los vinculantes deseables incluyen, ejemplo, glutaraldehído u otros dialdehídos de la fórmula OHC-R-CHO, en donde R es un fracción de alquileno divalente lineal o ramificado de 1 a 12 átomos de carbono, una fracción heteroalquilo divalente lineal o ramificada de 1 a 12 átomos, una fracción de alquenileno divalente lineal o ramificada de 2 a 12 átomos de carbono, una fracción de alquinileno divalente lineal o ramificada de 2 a 12 átomos de carbono, un radical aromático divalente de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH20) 1CH2CH2 en el que q es 1 a 4, o una unión química directa vinculando dos grupos aldehido. La vinculación puede ser directa sin el uso de una molécula vinculante (de puente) . Por ejemplo, un grupo carboxilo, por ejemplo, al lado de la cadena de un residuo de Asp o Glu en un grupo carboxilico de proteína portadora, puede ser vinculado directamente a un grupo libre de amino, por ejemplo, en el lado de la cadena de un residuo de Lys , usando química de carbodiimida o enzimáticamente usando transglutamidasas que catalizan la reticulación entre grupos libres de amino y grupos de carboxamida, ejemplo, de residuos Gln.

El término "acelerar" en el contexto de provocar la producción de antígenos, se refiere a la activación de las células B de memoria que sucede durante una segunda exposición a un antígeno. Esto también es referido como "respuesta al acelerador" y es indicativo de respuesta inmune de memoria "secundaria" de largo plazo, resultando en la capacidad de larga vida para producir antígenos .

El término "proteína portadora" en el contexto de una composición de vacuna se refiere a una proteína usada en una composición de vacuna que produce una respuesta inmune para sí misma y/o para un antígeno asociado con o en complejo con dicha proteína portadora y policatión. En una composición de vacuna de matriz de proteína de la presente invención, un antigeno está inmovilizado dentro de una matriz de las proteínas portadoras se entrecruzan una con otra y/o policationes , preferentemente sin vínculo covalente relevante de antígeno a la matriz. En una composición de vacuna conjugada, un antígeno es reaccionado con una proteína portadora, para que el antígeno y la proteína portadora sean covalentemente unidos uno con otro, por diseño. Deseablemente, la proteína portadora contiene un epítope reconocido por una célula T ayudante. Asimismo, abarcada por la definición de una "proteína portadora" están los péptidos multi-antigénicos (MAPs) , que son péptidos ramificados que tienen una pluralidad de sitios reactivos. Deseablemente, un MAP incluye residuos de lisina (Lys) . Las proteínas portadoras ejemplares deseables incluyen toxinas y toxoides (químicos o genéticos), que pueden ser mutados , ejemplo, para reducir la reactogenicidad. Las proteínas portadoras apropiadas incluyen, ejemplo, toxina de difteria o un mutante no tóxico de la misma, por ejemplo toxoide de difteria, toxina del tétanos o un mutante no tóxico de la misma, por ejemplo toxoide tetánico, Pseudomonas aeruginosa exotoxina A o un mutante no tóxico de la misma, subunidad B de toxina del cólera, fragmento C de la toxina tetánica, flagelina bacteriana, neumolisina, listeriolisina O (LLO, y moléculas relacionadas), una proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis, Pseudomonas aeruginosa proteína Hcpl, enterotoxina lábil de calor Escherichia coli, toxina de tipo shiga, proteína humana LTB, un extracto proteínico de células bacterianas totales, el imitante inhibidor negativo dominante (DNI) del Antígeno Protector de Bacillus anthracis, o beta-galactosidasa de Escherichia coli, o cualquier otra proteína que pueda ser reticulada para formar una matriz capaz de inmovilizar un antígeno de interés .

El término "inmovilizado" como se usa en el presente con referencia a un antígeno, significa la asociación o complejo de un antígeno con una proteína portadora y polication, en particular una proteína portadora reticulada opcionalmente también entrecruzada con una molécula policationica para formar una matriz que forma la asociación o complejo con el antígeno, de tal forma que el antígeno permanece en el complejo con la proteína portadora y polication bajo condiciones fisiológicas. Deseablemente, el antígeno es inmovilizado en un complejo con proteínas portadoras en la ausencia de unión covalente relevante entre el antígeno y una proteína portadora/policatión . La ausencia de unión covalente significativa, como se usa en el presente, se refiere a no más de 50% del antígeno que está siendo covalentemente unido a una proteína portadora y polication. Deseablemente, no más del 40%, no más del 30%, no más del 20%, no más del 10%, o deseablemente no más del 5% del antígeno es covalentemente unido a una proteína portadora o policatión en una composición de vacuna de matriz de proteína. Como se apreciará a partir de la descripción a continuación, el objeto de diseño de vacunas matriz de proteína y la producción es para evitar la reticulación química laboriosa de antígeno a un portador que es la característica principal de las vacunas conjugadas. En una vacuna matriz de proteína del antígeno se asocia con el portador por inmovilización en una matriz reticulada en lugar de por la conjugación con el soporte, y de hecho a la medida de lo posible la reticulación del antígeno a una proteína portadora o matriz de proteína portadora/policatión se evita. En los procesos para la fabricación de vacunas de la matriz de proteína, el antígeno se incluye en la mezcla de componentes de la matriz destinados a ser reticulado, pero por el diseño del antígeno no participa en la reacción de reticulación o al menos no participa en una cantidad significativa de reticulación. Llevar a cabo la formación de la matriz de proteína en la presencia del antígeno, sin embargo, conduce a el antígeno quede inmovilizado en, sin significativa de reticulación a, la matriz de proteína portadora (o matriz de proteína portadora/policatión en una modalidad de esta invención) .

Por "infección" se entiende la invasión de un sujeto por un microbio, ejemplo, una bacteria, hongo, parásito o virus. La infección puede incluir, por ejemplo, la multiplicación excesiva de microbios que están normalmente presentes en o dentro del cuerpo de un sujeto o la multiplicación de microbios que están normalmente presentes en o dentro de un sujeto. Un sujeto está padeciendo una infección microbiana cuando una población microbiana excesiva indeseable (ejemplo, patogénica) está presente en o sobre el cuerpo del sujeto o cuando la presencia de una(s) población (es ) está(n) dañando las células o provocando síntomas patológicos en un tejido del suj eto .

Por "agente infeccioso" se entiende un microbio que provoca una infección.

El término "inmunogénico" se refiere a un compuesto que induce una respuesta inmune en un sujeto. Deseablemente, una respuesta inmune es una respuesta inmune dependiente de la célula t que involucra la producción de antígenos de igG.

El término "polímero capsular microbiano" se refiere a un polímero presente en o dentro del revestimiento de la cápsula de un microbio. Deseablemente, un polímero capsular microbiano es un polímero orgánico tal como un polisacárido, fosfopolisacárido , polisacárido con azúcar de amino con una sustitución de N-acetilo, polisacárido que contiene una azúcar sulfonilatada, otra azúcar modificada con sulfato, o azúcar modificada por fosfato, polialcohol, poliamino ácido, ácido teicoico, , o una cadena lateral O de un lipopolisacárido .

"Monómero" se refiere a una estructura molecular capaz de formar una o más uniones con monómeros similares, arrojando frecuentemente una cadena o una seria de cadenas ramificadas, conectadas de subestructuras repetitivas de monómero, cuando son parte de un "polímero".

"Polímero orgánico" se refiere a un polímero compuesto de monómeros covalentemente vinculado cada uno compuesto de átomos de carbono, oxigeno, hidrógeno o nitrógeno o fracciones de fosfato o sulfato. Deseablemente, un polímero orgánico es un polisacárido, fosfopolisacárido , polisacárido con una amino azúcar con una sustitución de N-acetilo, polisacárido que contiene una azúcar sulfonilatada, otra azúcar modificada de sulfato, o azúcar modificada de fosfato, azúcar, polialcohol, poliamino ácido, ácido teicoico, y una cadena lateral O de lipopolisacárido .

"Polialcohol" significa una forma hidrogenada de un carbohidrato en donde un grupo carbonilo ha sido reducido a un grupo hidroxilo primario o secundario. Los polialcoholes ejemplares son un óxido polialquileno (PAO) , tal como glicoles polialquilenos (PAG) , incluyendo polimetilenglicol , polietilenglicol (PEG) , metoxipolietilenglicol (MPEG), y polipropilenglicol ; alcohol polivinílico (PVA) ; anhídrido de ácido polietilen-co-maleico; anhídrido de ácido poliestireno-co-málico; dextranos incluyendo dextranos de carboximetilo; celulosas, incluyendo metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa carboxietilcelulosa, e hidroxipropilcelulosa; hidrolisatos de quitosano; almidones tales como almidones de hidroxietilo y almidones de hidroxipropilo; glicogen; agarosas y sus derivados; goma guar; pululana; insulina; goma xantana; carragenana; pectina; hidrolisatos de ácido algínico; sorbitol; un alcohol de glucosa, mañosa, galactosa, arabinosa, gulosa, xilosa, treosa, sorbosa, fructosa, glicerol, celobiosa de maltosa, sucrosa, amilasa, amilopectina; o mono propilenglicol (MPG) .

"Poli amino ácido" o "poliamino ácido" significa al menos dos amino ácidos vinculados por una unión péptida. Deseablemente, un poli amino ácido es un péptido que contiene una secuencia repetitiva de amino ácidos o una cadena del mismo amino áoxido (ejemplo, un homopolímero) .

Un "polication" o "policatiónico" se refiere a cualquier ion macromolecular que lleva múltiples cargas positivas. Deseablemente, un polication posee grupos amino libres, por ejemplo, el ácido poliamino poli-L-lisina . Otros policationes deseables ejemplares que contienen grupos amina libres incluyen polímeros naturales como el quitosano (un copolímero) vinculado-ß- (1-4 de 2-amino-2-desoxi-^-D-glucano (GlcN) y 2-acetamido-2-desoxi-p -D-glucano (GlcNAc) ) , que contiene grupos amino libres de los residuos GlcN que pueden ser reticulados y actuar como el catión y polímeros sintéticos disponibles en el mercado que contienen grupos amino libres tales como polietilenimina ramificada (PEI), Poliamina N7 (CAS 29320-38-5) y Etilenediaminometil poliestireno (CAS 177987-93-8) .

Por "poli-L-lisina" y " PLL " se entiende- a poli-L-lisina (alfa-poli-L-lisina; aPLL) , e -poli-L-lisina (épsilon-poli-L-lisina; ePLL; poli [imino [ (2S) -2-amino-l-oxo-1,6- hexanodiilo] ] ) , o combinaciones y copolímeros de los mismos. Los residuos de lisina de poli-L-lisina están vinculados a través de un enlace peptídico entre el grupo carboxilo y, o bien la alfa (a-PLL) o épsilon ( e -PLL) grupo amina. Deseablemente, la poli-L-lisina se a-poli-L-lisina. a-poli-L-lisina se sintetiza químicamente y se puede obtener en varios pesos moleculares, por ejemplo, 0,5 a 300 kDa . e -poli-L-lisina es pequeño homopolímero natural del amino ácido L-lisina esencial que es producido por la fermentación bacteriana, por ejemplo, e-poli-L-lisina puede ser aislado a partir de Streptomyces albulus, y tiene una masa molecular media de aproximadamente 4000 Da.

Una "matriz de proteína" en el contexto de la presente invención es una estructura multimérica formado por reticulación de las moléculas de proteína, la formación de uniones o enlaces directos entre dos sitios en la misma molécula de proteína o entre dos sitios en diferentes moléculas de proteína. Una " matriz de proteína portadora " en el contexto de la presente invención se refiere a una matriz proteica formada por una reacción de reticulación se realiza con proteínas portadoras, en el que los enlaces cruzados se forman entre los sitios reactivos en la misma molécula de proteína portadora (resultantes en bucle intramolecular o retirarse estructuras) o entre sitios reactivos en diferentes moléculas de proteína portadora (que resulta en polímeros de la proteína portadora) . El término " matriz de proteína portadora/policatión " tal como se utiliza en el presente se refiere a una matriz proteica formada por una reacción de reticulación llevada a cabo en una mezcla de proteínas portadoras y policationes, en el que la reticulación se produce al menos dentro de o entre las moléculas de proteína portadora (resultante en una matriz de proteína vehículo que puede inmovilizar policationes en la matriz), o en el que la reticulación se produce no sólo dentro de o entre las moléculas de proteína portadora sino también dentro de o entre las moléculas de polication (que resulta en una matriz que comprende proteína portadora reticulado y/o monómeros polication) . El grado de reticulación en la formación de una matriz de proteína puede controlarse mediante la selección juiciosa de los reactivos de reticulación y la consideración de los sitios reactivos disponibles para la reticulación de los componentes monoméricos , que controlan la cantidad de agente de reticulación utilizado en la cruz-reacción de reticulación, controlando el tiempo de reacción, y el uso de reactivos para bloquear los sitios reactivos o apagar la reacción de reticulación. El control de tales parámetros afectará a la cantidad de antígeno que puede ser inmovilizado, la velocidad a la que inmovilizado antígeno puede disociarse de la matriz de complejo proteína/antígeno , y el tamaño de las partículas de la matriz de proteínas formadas. Todas estas cualidades afectan a la inmunogenicidad de las composiciones de vacuna de la matriz de proteínas de la presente invención.

El término "reducción de una base de Schiff" se refiere a la exposición de azometina o un compuesto de la fórmula R1R2C = N-R3 (en la que Rl, R2 , y R3 son subestructuras químicas, que contiene típicamente átomos de carbono) a un agente reductor que satura el doble enlace de la base de Schiff con átomos de hidrógeno. Los métodos de reducción química son conocidos para los técnicos en la materi .

El término "une específicamente" como se usa en el presente, con referencia a un antígeno o a un fragmento del mismo, significa una afinidad incrementada de un antígeno o un fragmento de antígeno para un antígeno en particular, ejemplo, una proteína o segmento de la misma, relativa a una cantidad igual de cualquier otro antígeno. Un antígeno o fragmento de antígeno deseablemente tiene una afinidad para su antígeno que es de al menos de 2 veces, 5 veces, 10 veces, 30 veces o 100 veces más grande que para una cantidad igual de cualquier otro antígeno, incluyendo los antígenos relacionados, como se determinó usando métodos estándares tales como un ensayo inmunosorbente vinculado de enzimas (ELISA) .

Por "sujeto" se entiende un animal que puede ser infectado por un microbio. Deseablemente, un sujeto es un mamífero tal como un humano, mono, perro, gato, ratón, rata, vaca, oveja, cabra o caballo. Un sujeto humano puede ser un humano adulto, niño, infante, menor o pre-puberto .

Un "antígeno independiente de célula T" se refiere a un antígeno que resulta en la generación de antígenos sin la cooperación de linfocitos T ayudantes. El antígeno independiente de célula T puede estimular directamente los linfocitos B sin la cooperación de linfocitos T. Los antígenos independientes de célula T ejemplares deseables incluyen ácido antígeno de ácido glutámico poli-gama-D capsular (PGA) , ácido algínico (alginato) , dextrano, polisacáridos (PS) , poli amino ácidos, polialcoholes y ácidos nucleicos.

Los términos "vacuna", "composición de vacuna", y "composición inmunogénica" se utilizan en el presente para referirse a cualquier composición que contiene un antígeno de interés que, cuando se administra a un sujeto vertebrado provoca una respuesta inmune en el sujeto a dicho antígeno. Aunque es un objetivo de la invención es proporcionar vacunas capaces de provocar una respuesta inmunitaria protectora (es decir, capaz de proteger a un sujeto vacunado contra un patógeno que lleva de forma natural el antígeno incluido en la vacuna) , la inmunización protectora, por ejemplo, después de una sola administración, no es una cualidad que es inherente en el término "vacuna" o "composición de vacuna", como se usa en el presente documento.

Las composiciones de vacuna de matriz de proteína de la presente invención no requieren vinculación covalente entre el antígeno que pretende provocar una respuesta inmune y la proteína portadora/policatión usada para formar la matriz. Esto simplifica favorablemente la preparación de composiciones de vacuna de matriz de proteína, reduciendo el costo de su preparación en comparación con la tecnología de vacunas conjugadas. Las vacunas conjugadas de proteína de polisacárido (PS) han probado ser prohibitivamente caras para producirse y venderse en el mundo en desarrollo. Las vacunas conjugadas convencionales son difíciles de producir de manera barata debido a la alta química especializada requerida para cada vacuna y los costos de producción y purificación tanto del antígeno PS y la proteína portadora.

Las composiciones de vacuna de acuerdo con la presente invención se enfocan a una necesidad de vacunas que pueden inducir de manera segura la inmunidad en contra de antígenos previamente intratables. Las composiciones de vacunas como se describen en el presente, pueden ser monovalentes (que tienen un solo antígeno para inducir una respuesta inmune) o multivalente (que tiene antígeno A Ts múltiples para inducir respuestas inmunes múltiples) .

El significado de otros términos será entendido por el contexto en el que aparecen o como se entienden por los técnicos en la materia, incluyendo practicantes en los campos de química orgánica, farmacología, microbiología, bioquímica proteínica, e inmunología.

La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende (1) uno o más antígeno de interés, (2) una o más proteína portadora, y (3) uno o más policatión, en el que dicha proteína portadora y/o dicho policatión son reticulado para formar una matriz de proteína, y dicho antígeno de interés es inmovilizado por dicha matriz de proteína. Tales composiciones se pueden preparar fácilmente mezclando el antígeno, proteína transportadora, y los componentes polication, a continuación, iniciar una reacción de reticulación para causar la reticulación de la proteína, portadora y/o polication. En modalidades alternativas del método de producción de la vacuna matriz de proteína, el orden de adición de los componentes se puede variar, aunque generalmente si una matriz proteica reticulada se forma antes de la adición del antígeno de interés, el inmovilización deseada no tiene lugar y el antígeno sigue siendo un componente disociado. En modalidades preferidas, el polication y el antígeno polisacárido se incuban juntos, seguido de la adición del agente de reticulación, seguido de la adición de la proteína transportadora ( formador de matriz) . Las composiciones de vacuna de la matriz de proteínas que incorporan un polication, por ejemplo, a-PLL, de acuerdo con la presente invención mejorar el inmovilización de antígenos en la matriz de proteína con un aumento resultante en la inmunogenicidad en comparación con el antígeno solo o para composiciones de vacuna de la matriz de proteínas que no incorporen un polication.

La presente invención presenta, en particular, composiciones de vacunas de matriz capsular proteínica que incorporan un policatión y los métodos para hacer y administrar dichas composiciones para proporcionar inmunidad en contra de antígenos, particularmente antígenos independientes de célula T o antígenos que normalmente producen respuestas inmunes débiles, tales como, ejemplo, polisacáridos (PS) , polialcoholes , poliaminoácidos , y otros polímeros orgánicos. Las composiciones de vacuna de la invención tienen las propiedades inmunológicas potentes de las vacunas típicas conjugadas de PS-proteína pero difieren deseablemente de las vacunas conjugadas en que no se requiere ninguna unión atómica covalente relevante para acoplar el antígeno de interés, ejemplo, polímero de PS u orgánico capsular, a la proteína portadora/policatión . En su lugar, el antígeno de interés, ejemplo, polímeros de PS u orgánicos, está inmovilizado dentro de la matriz de proteína portadora/policatión. Por ejemplo, una matriz de proteína puede estar formada mediante moléculas de proteína portadora reticulante covalente con ellas mismas, a otras moléculas de proteína portadora y/o el policatión en la presencia de un antígeno soluble, ejemplo, polímeros PS u orgánicos capsulares. Las proteínas portadoras y/o policationes que están altamente reticuladas unas con otras pueden formar una matriz que puede capturar (inmovilizar) un antígeno y facilitar la ingesta de dicho antígeno mediante el antígeno que presenta células con la estimulación resultante y la producción de antígenos en células B. Como se demuestra en el presente, el nivel de inmovilización del antígeno dentro de la matriz se mejora por la adición de un policatión, por ejemplo, poli-L-lisina, resultante en rendimientos mejorados de partículas PCMV y a su vez resultar en inmunogenicidad mejorada de las composiciones PCMV comparadas con el antígeno solo o complejos de matriz de antígeno/proteína formados sin el uso de policatión.

Conceptualmente, la matriz de proteína portadora/policatión puede visualizarse en la forma de una "malla" que encierra el antígeno o una serie de "perlas en cadena" en donde el antígeno es la "cadena", la proteína o complejos de proteínas reticuladas /policatión es la "perla" en esta analogía. El antígeno es inmovilizado dentro de la proteína portadora si la matriz proteína portadora/policatión rodea el antígeno para formar un anillo alrededor del antígeno o una malla tridimensional en la que el antígeno es enredado. El inmovilización de los resultados de antígeno en una cantidad deseable de antígeno quedar asociado con un portador antigénico sin entrecruzamiento significativo que ocurra a unirse al antígeno de forma covalente a la proteína portadora. Cantidad suficiente de antígeno y/o la persistencia de la asociación con el portador a través de inmovilización permite vacunas de proteínas de la matriz para exhibir mayor inmunogenicidad en comparación con la inmunización con el antígeno solo o con antígeno simplemente mezclada con una proteína portadora. Composiciones de vacuna de la matriz de proteínas de acuerdo con la presente invención se han mostrado para lograr inmunogenicidad comparable a las vacunas conjugadas disponibles comercialmente, en la que el antígeno está covalentemente unido a un vehículo.

En modalidades deseables, las moléculas de la proteína portadora y/o policatión son covalentemente reticulados. Por ejemplo, un enlace covalente puede contener un enlace peptídico entre un grupo amino primario de una cadena lateral de lisina (por ejemplo, en poli -L-lisina) y un grupo carboxi de un aspartato o glutamato cadena lateral (por ejemplo, en una proteína portadora) . En otras modalidades deseables, covalentes enlaces cruzados se pueden iniciar usando agentes de reticulación tales como compuestos de la fórmula OHC-R-CHO, donde R es un alquileno divalente lineal o ramificado de 1 a 12 átomos de carbono, lineal o ramificado heteroalquilo divalente de 1 a 12 átomos, un alquenileno divalente lineal o ramificada de 2 a 12 átomos de carbono, lineal o ramificado alquinileno divalente de 2 a 12 átomos de carbono, un radical aromático divalente de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos ,- (CH2CH2O) qCH2CH2-en la que q es 1 a 4, o un enlace químico directo que une dos grupos aldehido. En modalidades preferidas, se forma el enlace covalente usando glutaraldehído como agente de reticulación, agentes o alternativamente, tales como éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida, o bis- biazotized bencidina, bis [sulfosuccinimidil ] suberato, o dimetil adipimidato puede ser utilizado. Aunque no es necesario en la formación de una composición de vacuna de proteína de la matriz, el antígeno de interés puede unirse covalentemente a la proteína portadora, por ejemplo, en una medida que es incidental a la formación de la matriz de proteína portadora de reticulado, por ejemplo, debido a grupos reactivos bloqueados o amino o carboxilo terminales o grupos hidroxilo que pueden existir en el antígeno. En general, el enlace covalente del antígeno a la portadora no es un objeto en la formación de las vacunas de proteínas de la matriz. Para los fines de la invención, las vacunas de la matriz de proteína son composiciones de vacuna que no más del 50% del antígeno se une covalentemente a la proteína portadora. La cantidad de antígeno de reticulación incidentales se puede calcular estequiométricamente por teniendo en cuenta la proporción de los sitios en el antígeno que son capaces de participar en una reacción de reticulación, es decir, teniendo en cuenta los grupos reactivos del reactivo de reticulación (s) utilizado, la cantidad de reactivo (s) y otros reactivos (por ejemplo, proteína portadora, policatión) usado, y si las reacciones de reticulación se les permite ir hasta su finalización (por ejemplo, la totalidad de un reactivo de reticulación se consume durante la reacción) . La cantidad de antígeno reticulado en una composición de vacuna matriz de proteína también se puede medir, por ejemplo, por análisis de espectrometría de masas de una composición PCMV para reticulaciones de carbohidratos / lisina .

En modalidades deseables, el antígeno y la matriz de proteína portadora/policatión son asociado no covalentemente . Tal asociación no covalente puede implicar interacción hidrófoba, interacción iónica, interacción de van der Waals, o de hidrógeno; o el antígeno puede ser físicamente o estéricamente cerrado dentro de la matriz de proteína, tal que la disociación del antígeno de la matriz se evita o se retarda. Asociación no covalente puede incluir configuraciones geométricas físicas que se asocian no covalentemente antígeno (encierre) con complejos de proteínas (es decir, como en el " grano en una cadena" analogía anterior) .

Las composiciones de vacuna de la invención se pueden preparar usando cualquiera de las muchas posibles enlazadores para reticular cualquiera de muchas proteínas y/o policationes portadoras posibles en la presencia de cualquier antígeno de interés. Adaptadores ejemplares y preferidas, las proteínas transportadoras, policationes y antígenos de interés se analizan en el presente.

Los polisacáridos (PS) son polímeros de sacáridos (azúcares) . PS derivan de cápsulas microbianas son los componentes antigénicos primarios implicados en la inmunidad protectora contra patógenos bacterianos encapsulados tales como Neisseria meningitidis , Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi, y Haemophilus influenzae tipo B. Inmunización de los adolescentes y los adultos con vacunas basadas en polisacáridos microbianos ha tenido éxito en la reducción de la carga de morbilidad, pero ha demostrado ser menos efectivo en proporcionar inmunidad protectora para los bebés y niños pequeños (es decir, niños menores de 24 meses de edad) . Los niños pequeños todavía no han desarrollado un repertorio inmune adaptativo maduro y antígenos de células T independientes, tales como PS capsular son poco inmunogénicas y no dar lugar a respuestas a largo plazo de protección inmune (es decir, una respuesta de memoria inmunológica) en tales receptores de la vacuna jóvenes.

El antígeno A T de células independiente, como polisacárido se puede convertir a un antígeno dependiente de células T por el acoplamiento químico de polisacárido a la proteína. Este proceso, conocido como " conjugación ", implica la formación de enlaces covalentes entre los átomos en la estructura del polisacárido y los átomos de la cadena lateral de los aminoácidos presentes en la proteína "portadora". Tales "vacunas conjugadas" promover de manera más eficiente la inducción de la maduración de las células B y el cambio de isotipo, lo que lleva a niveles mucho más altos de antígenos con el perfil de protección anti- PS correcta. Los antígenos protectores tienen alta afinidad por sus antígenos polisacáridos , y típicamente son de la subclase de inmunoglobulina G (IgG), un antígeno de larga duración con fijación del complemento y la actividad efectora opsonización.

El antígeno A t de células independiente generalmente no estimular la inmunidad duradera, es decir, la producción de antígenos IgG, pero puede estimular la producción de menos potente, más pobre antígenos IgM de unión, y más temporal,. Como tal, los antígenos de polisacáridos por sí solos no producen típicamente respuestas de refuerzo de IgG. Sin embargo, los polisacáridos producen respuestas de refuerzo si la inmunización primaria se realiza con un conjugado de proteína-PS, porque las células de memoria inducidos por el conjugado ya han sido programados para producir IgG. De hecho, se cree que la respuesta de refuerzo en los animales vacunados o seres humanos para imitar la respuesta de protección debido a la exposición a un microbio que muestra el PS; esta memoria a largo plazo es fundamental para una vacuna para trabajar en la prestación de inmunidad protectora frente a los sujetos inmunizados años después de su inmunización. Por lo tanto, los conjugados PS-proteína son valorados por (1) su capacidad para inducir altos niveles de IgG frente a antígenos PS, y (2) su capacidad para inducir respuestas inmunes contra antígenos de memoria PS . Los antígenos polisacáridos solos normalmente no muestran estas propiedades y por lo tanto son antígenos inferiores. La dificultad en la síntesis de las vacunas conjugadas y su costo de producción se ha ralentizado el desarrollo de vacunas conjugadas para muchas enfermedades bacterianas donde se busca una respuesta inmune protectora frente a un antígeno polisacárido .

Otros antígenos de células T independiente incluyen homopolímeros de aminoácidos, tales como-D-glutámico poli-gamma- ácido (PGA) , y polialcoholes . La mayoría de los biopolímeros son antígenos de células T independientes. Los polímeros pueden reticularse de inmunoglobulina (Ig), los receptores en las células B que los reconocen debido a la naturaleza repetitiva de sus estructuras químicas (y por lo tanto epítopos) . Por lo tanto los polímeros pueden activar las células B para la producción de antígenos anti-IgM de polímero de la misma manera que los polisacáridos hacen. Por ejemplo, un homopolímero de aminoácidos , -D-glutámico poli-gamma- ácido (PGA) de Bacillus anthracis, es un polímero capsular que es poco inmunogénico y también un antígeno de células T independiente. Las vacunas compuestas de PGA conjugado a proteínas transportadoras son altamente inmunogénicas , capaz de inducir anti- IgG PGA, y la memoria inmunológica al PGA. Por lo tanto, la mayoría de los polímeros responden como PS en términos de su inmunogenicidad debido a que no pueden ser procesados y se muestran en el contexto de MHC-II y por lo tanto no pueden reclutar ayuda de células T. Una excepción se encuentra en algunos polímeros naturales que interactúan con otra clase de receptores de tipo Toll denominados receptores ( LRs ) . Una vez activado, los TLR puede inducir la producción de citoquinas por las células huésped y producir cambios en la respuesta inmune adaptativa. Algunos PS se une covalentemente a ligandos de TLR o contaminado con estos ligandos. Por ejemplo, lipopolisacáridos (LPS) son PS que son altamente inmunogénicas e inducir IgG y respuestas de memoria; en el resto lipídico de LPS es un ligando de TLR y puede ser responsable de las propiedades inmunologicas .

Las vacunas conjugadas convencionales son difíciles de producir a bajo precio porque los costos de producción y purificación de tanto el antígeno PS y proteína portadora y la química específica implicada en cada conjugación de polisacárido-proteína . Por lo general, ambos tienen que ser absolutamente puro delante de química de conjugación se puede realizar con una eficiencia de acoplamiento razonable. Típicamente, la química de acoplamiento debe ser desarrollado específicamente para diversos PS que es único para la química de la PS y las proteínas portadoras que han sido seleccionados. Esta química de acoplamiento presenta grupos funcionales en la PS que puede ser vinculada a la proteína portadora típicamente a través de las cadenas laterales de amino épsilon de residuos de lisina. La modificación química de PS introducir tales grupos de acoplamiento puede destruir epítopos en el PS e introducir nuevos epítopos (por ejemplo, asociados con el enlazador o grupos sacáridos modificados) , cuyo significado sólo puede ser evaluado mediante la modalidad de análisis inmunológico cuidado. Además, para las vacunas conjugadas de proteína-PS convencionales, el tamaño de la PS, el número de moléculas de PS unidos por molécula portadora de proteína, la naturaleza del portador seleccionado, y el tipo de la química de unión puede afectar a todo inmunogenicidad de la vacuna conjugada. Como tal, por ejemplo, en el caso de la enfermedad neumocócica en donde cada uno de los 90 serotipos + conocido tiene una estructura diferente PS (Bentley et al, PLoS Genetics 2 (3):. E31 262-269, 2006), un método de conjugación sola no es apropiado para todos los serotipos . La síntesis de las vacunas conjugadas de forma reproducible con propiedades inmunológicas reproducibles implica un cuidadoso control del tamaño de la PS, el número de moléculas de PS unidos por molécula portadora de proteína, la naturaleza del portador seleccionado, y el tipo de la química de ligamiento. Esto, a su vez, aumenta drásticamente el costo de fabricación de las vacunas conjugadas.

La aparición de resistencia a los antibióticos pone de relieve la urgencia para el desarrollo de vacunas seguras y eficaces. Haciendo vacunas ampliamente disponibles, especialmente para los de los países en vías de desarrollo, exige que la fabricación de vacunas también sea rentable. La incorporación de las vacunas conjugadas combinadas contra muchos antígenos polisacáridos de diferentes serotipos de una o más especies bacterianas en el régimen de vacunación infantil podría simplificar la administración de la vacuna en esa población de alto riesgo. Sin embargo, la tecnología de la vacuna conjugada actual no es rentable y, por tanto, las vacunas conjugadas de combinación son prácticamente imposibles de entregar a los países en desarrollo debido al alto costo.

En modalidades deseables, las composiciones de vacunas inmunogénicas de la invención son proteínas de matriz vacunas capsulares (pC V) donde uno o más componentes capsulares bacterianos están inmovilizados en una proteína portadora reticulado y/o matriz de polication. PCMV se pueden producir con mayor facilidad que los conjugados que debido a que el antígeno de interés, por ejemplo, los polisacáridos de la cápsula bacteriana, no necesitan ser hidrolizados a fragmentos más pequeños y múltiples antígenos pueden ser inmovilizados en una matriz de proteínas simultáneamente.

Debido a que el método de fabricación de vacunas de la invención no requiere ningún conocimiento de la química del antígeno de interés, por ejemplo, un polisacárido capsular, el método no depende de la necesidad de desarrollar la química de reticulación que es compatible con la química de los el antígeno de interés y la proteína portadora. Si bien es posible que algunos antígenos pueden interactuar con el agente de reticulación, esto no debería restar valor a la eficacia de la vacuna, ya que se esperaría que la involuntaria entrecruzamiento del antígeno de interés y la proteína transportadora que tienen propiedades inmunogénicas similares a conjugados. En las vacunas de la invención, sin embargo, la reticulación del antígeno de interés a la proteína portadora no es un requisito para que la vacuna sea inmunológicamente efectiva. Esto está en marcado contraste con las vacunas conjugadas convencionales. Las vacunas de la invención tienen deseablemente al menos, por ejemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o incluso 100% de las proteínas portadoras reticulado y no más de, por ejemplo, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, o 1% del antígeno de interés entrecruzado con la proteína transportadora. Deseablemente, no más de 10% de los antígenos están reticulados a las proteínas portadoras y al menos 50% de proteínas transportadoras son reticulados.

Como se analiza en el presente documento, las composiciones de vacuna de la matriz de proteínas que incorporan un polication han aumentado inmovilización antígeno y la correspondiente mayor inmunogenicidad en comparación con composiciones compuestas por el antígeno solo, mezclas antígeno/portador simples y composiciones de vacuna de la matriz incluso antígeno/proteína que no incorporen un polication de conformidad con las enseñanzas de este documento. Como se discute en el presente, cápsulas de polisacáridos de bacterias se componen de repetir azúcares y para muchas cápsulas bacterianas patógenas están cargadas negativamente. La carga negativa puede ayudar en la prevención de la fagocitosis por células inmunes anfitrión a través de repulsión de carga o mediante la presentación de una cápsula más inhibidora más grande..

Weinger et al, PLosPathogens , 5: 1-9 (2009). Esta misma repulsión de carga también puede estar ocurriendo con la proteína (s) matriz, resultando en pobres inmovilización polisacárido . Para contrarrestar esta carga negativa un policatión, por ejemplo, poli-L-lisina (PLL) , se puede añadir a pCMV reacciones. Por ejemplo, como se discute en el presente documento, la adición de 0,04% a-PLL para la reacción PCMV Vi- CRM197 aumentó polisacárido Vi inmovilización de 5% a > 20% (Figura 1).

El control de tamaño de partícula puede mejorar la inmunogenicidad de las vacunas de proteínas de la matriz. En modalidades deseables de la invención, el complejo de matriz de proteína del antígeno/portador/policatión tiene un tamaño medio de partículas de diámetro superior a 50 nm. Partículas de tamaño deseado pueden fraccionarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , seguido por la puesta en común de las partículas de mayor tamaño y descartando las partículas de menor tamaño y/o polisacárido no inmovilizado. Alternativamente, el uso de membranas de filtro con puntos de corte bien elegidos de peso molecular podría ser utilizado para eliminar las partículas de menor tamaño al tiempo que conserva las partículas del tamaño deseado. La eliminación de las especies de menor peso molecular (por ejemplo, < 50 nm de diámetro de especies) o la selección de tamaños de partículas de la matriz de proteínas de la composición que incluye tamaños de partículas mayor que al menos 50 nm de diámetro se puede lograr por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, cromatografía, incluyendo la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) , cromatografía de filtración en gel , o cromatografía de permeación en gel . Técnicas de electroforesis en gel también se podrían utilizar .

Los métodos de fabricación de las vacunas descritas en el presente documento no dan lugar a la modificación extensa del antígeno de interés, por ejemplo, un polímero capsular. El antígeno generalmente permanece en el mismo estado con una posible modificación ser, por ejemplo, la reducción de azúcares reductores para las cápsulas de PS que llevan tales grupos al final de las cadenas poliméricas. Tales modificaciones menores son poco probable que afecte la inmunogenicidad de PS más capsular porque los azúcares finales son 100-10.000 veces menos abundante que los residuos internos en el polímero. En contraste, para las vacunas conjugadas convencionales, por lo general es necesario introducir grupos de unión en el antígeno, por ejemplo, un polímero capsular, que sirven como el punto de unión covalente de la proteína portadora. Por ejemplo, la introducción de grupos reactivos en un PS puede resultar en la destrucción de epítopos capsulares y generación de nuevos epítopos que pueden ser indeseables en un producto de vacuna a causa de su desconocido reactividad cruzada inmunológica con el anfitrión auto- epítopos.

Los métodos de fabricación de las vacunas descritas en el presente son menos complejos que la tecnología de la vacuna conjugada debido a su química sólo depende de la química de reticulación de la proteína portadora (por ejemplo, DNI, B de la toxina del cólera subunidad, toxoide diftérico, toxoide tetánico o Fragmento C, o de Escherichia coli beta-galactosidasa) y/o policatión (por ejemplo, poli-a-L-lisina y e-poli-L-lisina) . Por ejemplo, mientras que el polímero capsular afecta a la velocidad de reticulación cuando se mezcla con DNI, que no afecta el patrón o la extensión de la reticulación que se rige más por la proteína que se está utilizado, su concentración, y la concentración de la agente reticulante (por ejemplo, glutaraldehído) agregó. Estos parámetros se pueden ajustar fácilmente, reduciendo así el tiempo y el esfuerzo requerido para hacer la vacuna, y el ahorro de gastos .

Los métodos de preparación de composiciones pCMV descritos en el presente documento se pueden usar con cualquier antígeno, por ejemplo, un polímero capsular o cualquier biopolímero con pocos o ningún grupo amino, y cualquier proteina portadora y/o policatión que puede ser reticulado, por ejemplo, proteínas portadoras no tener crítico epítopos que pueden ser destruidas sobre la reticulación o química de reducción. Las proteínas transportadoras que se pueden utilizar en los métodos descritos en el presente documento tienen deseablemente al menos 2 residuos de lisina u otros residuos que se desbloqueen y que puede ser reticulado mediante modificación química. El toxoide tetánico es una posible proteína portadora. Esta toxina se hace no tóxica por tratamiento con formaldehído , un reactivo que reacciona con grupos amino de proteínas . Otras proteínas portadoras deseables incluyen la subunidad B de la toxina del cólera (disponible de SBL Vaccin AB) , toxoide de la difteria o CRM197, toxoide tetánico o Fragmento C (disponible de Sigma Aldrich), DNI, o beta-galactosidasa de Escherichia coli (disponible de Sigma Aldrich) .

Las vacunas conjugadas multivalentes actuales se hacen por la síntesis de vacunas conjugadas individuales primero, seguido de su mezcla para producir una vacuna "cóctel " conjugado (por ejemplo, la vacuna neumocócica hepta-valente de Wyeth, Prevnar® -7, vacuna pneumocccal 10-valente de GlaxoSmithKline Synflorix®, y la vacuna 13 -valente de Pfizer Prevnar® -13). Los métodos de la presente de invención de hacer vacunas pueden ser usados para hacer vacunas multivalentes mezclando químicamente diferentes antígenos, por ejemplo, polímeros orgánicos capsulares, juntos antes de la reticulación de la proteína portadora y/o policatión, por ejemplo, con glutaraldehído u otro agente de reticulación, o mediante la mezcla específica vacunas de la invención que fueron sintetizados por separado. Esta flexibilidad ofrece ventajas significativas sobre los métodos convencionales de fabricación de vacunas multivalentes que debería reducir considerablemente el costo de los bienes.

Las vacunas ejemplares de la invención se discute en los ejemplos a cabo de forma comparable a las vacunas conjugadas a pesar del hecho de que estas vacunas se sintetizaron por un método que no se predijo para generar cualquier enlaces covalentes entre moléculas de antígeno y la proteína portadora. El glutaraldehído reacciona principalmente con cadenas laterales amino de proteínas tipificadas por el grupo amino épsilon de residuos de lisina. Antígenos polisacáridos son esencialmente no reactivos con glutaraldehído y otros reactivos de aldehido-funcional, ya que contienen unos grupos amino libre (en cualquier cadenas laterales de aminoácidos son típicamente acetilados) para reaccionar con glutaraldehído o agentes de reticulación de aldehido-funcional (por ejemplo, OCH-R-CHO, discutido supra) . Por lo tanto tales antígenos son muy adecuadas para la formación de PC V, donde menos de 50% de antígeno está reticulado directamente a una proteína portadora. Como se ve en los ejemplos siguientes, las respuestas inmunes generadas por PCMV, que compararon favorablemente a conjugar los controles, indican que las moléculas de PS fueron inmovilizados molecularmente dentro de una matriz reticulada de moléculas de proteína DNI .

De acuerdo con un modelo no limitativo, el inmovilización actúa para entregar la composición de vacuna matriz de proteína a las células B que se unen tales matrices a través de receptores de Ig que reconocen el antígeno de polímero. Una vez tomado en el interior de estas células B, las matrices se degradan de una manera similar a las vacunas conjugadas convencionales, dando como resultado péptidos derivados de la proteína de transporte que se muestran en las moléculas de MHC de clase II de las células B. Esto a su vez recluta células T auxiliares y por lo tanto conduce a la expansión y la maduración de dichas células B para convertirse en la producción de igG de plasma y células "memoria" específico para el antígeno. Por lo tanto, de acuerdo con el modelo no limitativo PCMV funcionan como vacunas capsulares-conjugado de proteína inmunológicamente pero son distintas, porque carecen de PCMV significativa unión covalente entre la proteína portadora y los polímeros capsulares.

Las composiciones de vacuna de la invención, incluyendo PCMV, pueden ser utilizados en combinación, por ejemplo, en las vacunas pediátricas. Además, las vacunas de la invención pueden usarse para vacunar contra, por ejemplo, la infección neumocócica, estreptococos (grupos A y B) la infección, Haemophilus influenzae tipo B (" Hib ") la infección, la infección meningocócica (por ejemplo, Neisseria meningitidis ) , y se pueden utilizar como vacunas de antígeno 0 de las bacterias Gram negativas (por e emplo, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis (Thirumalapura et al, J. Med. Microbiol 54:693-695, 2005; Vinogradov y Perry, Carbohydr Res. 339: 1643-1648, 2004;... Vinogradov y col, Carbohydr Res. 214:289-297, 1991), las especies de Shigella, especies de Salmonella, especies de Acinetobacter, especies de Burkholderia, y Escherichia coli .

Las vacunas de la invención se pueden fabricar utilizando cualquier enlazadores, tales como, por ejemplo, los descritos en el presente documento, para reticular cualquier proteína y/o polication portador, tal como, por ejemplo, los descritos en el presente documento, en la presencia de uno o más antígenos de interés, tales como, por ejemplo, los descritos en el presente documento. Si se utiliza un antígeno de interés, se dice que la vacuna contra la matriz de proteína de la invención para ser monovalente. Si se utiliza más de un antígeno de interés, se dice que. la vacuna contra la matriz de proteína de la invención para ser multivalente . Si un polímero capsular microbiana o polisacárido es el antígeno de interés, se dice que la vacuna contra la matriz de proteína de la invención para ser una vacuna matriz capsular proteína (PCMV) .

Vinculantes Los agentes vinculantes útiles para reticular las proteínas portadoras y/o policationes son bien conocidos en la materia e incluyen glutaraldehído , ester de m-maleimidobenzoilo-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y benzidina bis-biazotizada .

Los métodos generales y las fracciones para reticular directamente las proteínas portadoras, usando un vinculante homobifuncional o heterobifuncional se describen, por ejemplo, por G.T. Hermanson, Técnicas de Bioconjugado (Impresiones Académicas, 1996), y Dick y Beurret, "Glicoconjugados de Antígenos de Carbohidrato Bacterianos", en Vacunas de Con ugados (Cruse and Lewis, eds), Contrib. Microbial . Immunol . Basel, Karger, 1989, vol . 10, pp 48-114). Por ejemplo, con una proteína portadora que posee n números de fracciones de lisina, existen, teoréticamente, n+1 aminas primarias (incluyendo la amina terminal) disponible para su reacción con un grupo carbox lico de reticulante ejemplar. Por lo tanto, el uso de este procedimiento de conjugación directa, el producto está limitado a tener formadas uniones de n+1 amida.

El vinculante empleado en modalidades deseadas de la presente invención es, en su forma más simple, una unión que conecta dos proteínas portadoras, un enlace que conecta dos policationes , un enlace que conecta dos sitios de la misma proteína portadora o policatión, o un enlace que conecta proteínas portadoras y policationes. El vinculante puede tener un esqueleto molecular lineal, cíclico o ramificado, con grupos colgantes que se unen covalentemente a dos proteínas portadoras/policationes , (A) y (B) . Cualquier proteína portadora dada puede estar vinculada a más de una proteína portadora/policatión, de tal forma que una matriz de proteínas portadoras/policatión interconectadas se crea, en la que un antígeno de interés puede ser inmovilizado.

El término "grupo de vinculación" se refiere a la unión covalente que resulta de la combinación de fracciones reactivas del vinculante (L) con grupos funcionales de (A) o (B) . Ejemplos de grupos de vinculación incluyen, sin limitación, ester, carbamato, tioéster, imina, disulfuro, amida, éter, tioéter, sulfonamida, isourea, isotiourea, imidoester, amidina, fosforamidato , fosfodiéster , tioéter e hidrazona .

La vinculación de (A) con (B) se logra mediante medios covalentes, involucrando la formación por unión (grupo de vinculación) con uno o más grupos funcionales localizados en (A) y (B) . Los ejemplos de grupos funcionales reactivos que pueden ser usados para este fin incluyen, sin limitación, grupos amino, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilo, carbonilo, tioéteres, guanidinilo, imidazolilo, y fenólicos, los cuales están presentes en los amino ácidos de ocurrencia natural en muchas proteínas portadoras .

La vinculación covalente de (A) con (B) puede, por lo tanto, ser efectuada usando un vinculante (L) que contiene fracciones reactivas capaces de reaccionar con dichos grupos funcionales presentes en (A) y (B) . El producto de esta reacción es un grupo de vinculación que contiene las uniones nuevas formadas que vinculan (L) con (A) y (L) con (B) . Por ejemplo, un grupo hidroxilo de (A) puede reaccionar con un grupo ácido carboxílico de (L) , o su derivado activado, vide infra, resultando en la formación de un grupo de vinculación de ester.

Los ejemplos de fracciones capaces de reaccionar con grupos sulfhidrilos incluyen compuestos de a-haloacetilo del tipo XCH2C0- (en donde X = Br, Cl o I) , que muestran reactividad particular para los grupos sulfhidrilos , pero que también pueden ser usados para modificar grupos de imidazolilo, tioéter, fenol y amino, como se describe por, por ejemplo, Gurd, Métodos Enzimol . , 11:532, 1967. Los derivados de N-maleimida también se consideran selectivos hacia los grupos de sulfhidrilo, pero pueden ser adicionalmente útiles en el acoplamiento de grupos amino bajo ciertas condiciones. Los reactivos tales como 2-iminotiolano (Traut et al., Bioquímica, 12:3266, 1973), que introducen un grupo tiolo mediante la conversión de un grupo amino, pueden considerarse como reactivos de sulfhidrilo si la vinculación sucede a través de la formación de puentes de disulfuro.

Los ejemplos de fracciones reactivas capaces de reaccionar con grupos amino incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes y acilantes. Los agentes alquilantes representativos incluyen: (i) compuestos de a-haloacetilo, que muestran especificidad hacia los grupos amino en la ausencia de grupos de tiolo reactivos y son del tipo de XCH2CO (en donde X = Cl, Br o D, como se describió por, por ejemplo, Wong (Bioquímica, 24:5337, 1979)); (ii) derivados de N-maleimida, que pueden reaccionar con grupos amino ya sea mediante una reacción de tipo Michael o mediante acilación por adición al grupo de anillo carbonilo como se describió por, por ejemplo, Smyth et al. (J. Am. Quím. Soc, 82:4600, 1960 y Bioquím. J. , 91:589, 1964); (iii) hálidos arilos tales como compuestos nitroariloaromáticos reactivos; (iv) hálidos alquilo, como se describió por, por ejemplo, McKenzy et al., (J". Proteína Quím., 91:589, 1964); (v) aldehidos y cetonas capaces de la formación base de Schiff con grupos amino, los aductos formados generalmente siendo estabilizados mediante reducción para arrojar una amida estable; (vi) derivados de epóxido tales como epiclorohidrina y bisoxiranos, que pueden reaccionar con grupos amino, sulfhidrilo o fenólicos hidroxilo; (vii) derivados que contienen cloro de s-triazinas, que son muy reactivos hacia los nucleófilos tale como grupos amino, sulfhidrilo e hidroxilo; (viii) aziridinas con base en compuestos de s-triazina detallados anteriormente como se describió por, por ejemplo, Ross (J. Adv. Cáncer Res., 2:1, 1954), que reacciona con nucleófilos tales como grupos amino mediante apertura anular; (ix) esteres dietilo ácidos escuáricos como lo describió, por ejemplo, Tietza {Quím. Ber. , 124:1215, 1991); y (x) éteres a-haloalquilo, que son agentes alquilantes más reactivos que los hálidos alquilos normales, debido a la activación provocada por el átomo de oxígeno éter, como lo describió, por ejemplo, Benneche et al. (Eur. J. Med. Quím. , 28 : 463, 1993) .

Los agentes acilantes amino-reactivos representativos incluyen: (i) isocianatos e isotiocianatos , particularmente derivados aromáticos, que forman derivados de urea y tiourea estables, respectivamente; (ii) cloruros de sulfonilo, que han sido descritos por, por ejemplo, Herzig et al. (Biopolímeros, 2:349, 1964). (iii) hálidos ácidos; (iv) esteres activos tales como nitrofeniloesteres o esteres N-hidroxisuccinimidilo ; (v) anhídridos ácidos tales como nitrofeniloesteres o esteres N-hidroxisuccinimidilo ; (vi) otros reactivos útiles para la formación de unión de amidas como lo describe, por ejemplo, M. Bodansky (Principios de Síntesis de Péptido, Springer-Verlag, 1984) ; (vii) acilazidas, ejemplo, caracterizado porque el grupo de azida se genera de un derivado de hidrazida preformado usando nitrito sódico, como lo describió, por ejemplo, Wetz et al., {Anal. Bioquím. , 58:347, 1974); y (viii) imidoesteres , que forman amidinas estables con la reacción con los grupos de amino como lo describió, por ejemplo, Hunter y Ludwig (J. Am. Quím. Soc, 84: 3491, 1962) .

Los aldehidos tales como, ejemplo, glutaraldeh do y cetonas, pueden ser reaccionados con aminos para formar bases de Schiff, que pueden ser favorablemente estabilizadas mediante aminación reductiva. Las fracciones de alcoxilamino fácilmente reaccionan con cetonas y aldehidos para producir alcoxiaminas estables como lo describió, por ejemplo, Webb et al. {Bioconjugado Quím. , 1:96, 1990).

Los ejemplos de fracciones reactivas capaces de reaccionar con grupos carboxilo incluyen compuestos de diazo tales como esteres de diazoacetato y diazoacetamidas , que reaccionan con alta especificidad para generar grupos esteres como lo describió, por ejemplo, Herriot (Adv. Proteína Quím., 3:169, 1947). Los reactivos modificantes de ácido carboxílico tales como carbodiimidas , que reaccionan mediante la formación de O-acilurea seguida por formación de unión de amida, también pueden ser usadas.

Los grupos funcionales en (A) y/o (B) pueden, si se desea, ser convertidos a otros grupos funcionales antes de la reacción, por ejemplo, para conferir reactividad adicional o selectividad. Los ejemplos de métodos útiles para este fin incluyen la conversión de aminas a ácidos carboxilicos usando reactivos tales como anhídridos dicarbocíclicos ; la conversión de aminas a tiolos usando reactivos tales como tiolactona de N-acetilhomocisteína, anhídrido S-acetilmercaptosuccínico, 2-iminotiolano o derivados de succinimidilo que contienen tiolo; conversión de tiolos a ácidos carboxilicos usando reactivos tales como alfa-haloacetatos ; conversión de tiolos a aminas usando reactivos tales como etilenimina o 2-bromoetilamina; conversión de ácidos carboxilicos a aminas usando reactivos tales como carbodiimidas seguida por diaminas; y conversión de alcoholes a tioles usando reactivos tales como cloruro de tosilo seguido por la transesterificación con tioacetato e hidrólisis al tiolo con acetato sódico.

Los denominados vinculantes de longitud cero, involucrando la unión covalente directa de un grupo químico reactivo de (A) con un grupo químico reactivo de (B) sin introducir material vinculante adicional pueden, si lo desean, ser usados de acuerdo con la invención. Los e emplos incluyen compuestos en los que (L) representa una unión química que vincula un átomo de oxígeno de (A) a una fracción de carbonilo o tiocarbonilo presente en (B) , de forma tal que el grupo vinculante es un ester o tioéster.

Por ejemplo, un grupo amino (A) puede ser vinculado a un grupo carboxilo (B) usando química de carbodiimida arrojando A-L-B, caracterizado porque L es una unión de amida o RC(:0) vinculada a N-RR en donde R es la cadena de carbono derivada de las cadenas laterales de amino ácido de la misma o dos moléculas proteínicas diferentes. Más comúnmente, sin embargo, el vinculante incluye dos o más fracciones reactivas, como se describe arriba, conectadas por un elemento espaciador. La presencia de un espaciador permite que os vinculantes bifuncionales reacciones con grupos funcionales específicos dentro de (A) y (B) , resultando en un vínculo covalente entre estos dos compuestos. Las fracciones reactivas en un vinculante (L) pueden ser las mismas (vinculante homobi funcional ) o diferentes (vinculante heterobifuncional , o, caracterizado porque están presentes diversas fracciones reactivas disímiles, vinculante heteromultifuncional ) , proporcionando una diversidad de reactivos potenciales que pueden provocar fijación covalente entre (A) y (B) .

Los elementos espaciadores típicamente consisten de cadenas que separan efectivamente (A) y (B) mediante un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, o - (CH2CH20) nCH2CH2- , caracterizado porque n es 1 a 4.

La naturaleza de material extrínseco introducida por el agente vinculante puede tener una repercusión sobre la farmacocinética y/o actividad del producto de vacuna final. Por lo tanto, puede ser deseable introducir vinculantes clivables, que contienen brazos espaciadores que son biodegradables o químicamente sensibles o que incorporan sitios de clivaje enzimático.

Estos vinculantes clivables, como se describe, por ejemplo, en la Publicación de PCT WO 92/17436 (incorporada en el presente mediante referencia) , son fácilmente biodegradados in vivo. En algunos casos, los grupos de vinculación son clivados en la presencia de esterasas, pero son estables en la ausencia de dichas enzimas. (A) y (B) pueden, por lo tanto, ser favorablemente vinculados para permitir su lenta liberación por las enzimas activas cerca del sitio de la enfermedad.

Los vinculantes pueden formar grupos de vinculación con grupos de diéster biodegradable, diamida, o dicarbamato de la fórmula: - (Z1)0- (Y1)u- (Z2) s- (R11) - (Z3) t-(Y2)V-(Z4)P- en donde cada uno de Z1, Z2, Z3 y Z4 es independientemente seleccionado de O, S y NRi2 (en donde Ri2 es hidrógeno o un grupo alquilo) ; cada uno de Y1 y Y2 es independientemente seleccionado de un grupo carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o grupo de formación ácida similar; o, p, s, t u y v son cada uno independientemente 0 ó 1; y Rn es un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH20) qCH2CH2- en donde 1 es 1 a 4, o una unión química que vincula - (Z1) 0- (Y1)u- ( Z2) s- (Rn) - (Z3) t- (Y2)v-(Z4)p-.

Los vinculantes deseables ejemplares (L) usados en la presente invención, pueden ser descritos por cualquiera de las fórmulas I-II: -C:0-Ri3-C:0- I -C:0-NH-Ri3-NH-C:0 II en donde el vinculante está covalentemente fijado tanto a un átomo de oxígeno (A) como a un átomo de oxígeno de (B) . De conformidad, el vinculante (L) de las fórmulas I-II está fijado a proteínas portadoras (A) y (B) mediante grupos de vinculación de dipirano, ester o carbamato. En estas modalidades, Ri3 representa un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH20) nCH2CH2- en donde n es 1 a 4 , o una unión química que vincula dos nitrógenos o dos carbonilos.

Los vinculantes diseñados para formar vínculos de hidrazona tienen la fórmula química III: - (Y3) - (Z5)w-R14-C( :X4) -Ri5 III en donde Z5 se selecciona de 0, S o NRi6; Ri6 es hidrógeno o grupo alquilo; Ri5 se selecciona de hidrógeno, un alquilo, o un heteroalquilo; Y3 se selecciona de un grupo carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o un grupo de formación de ácido similar covalentemente unido a un átomo de oxígeno de (A); w es 0 ó 1; Ri4 es un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, un heteroalquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos, un alqueno lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un alquino lineal o ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, un residuo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, un sistema cíclico de 3 a 10 átomos, -(CH2CH20) nCH2CH2- , en el que n es 1 a 4, o un vinculante de unión química -(Y3)-(Z5)W- a, y X4 es una hidrazona resultante de la reacción de condensación de (B) conteniendo un grupo de hidrazida y el precursor al vinculante II, en el que X4 es el átomo de oxígeno de un grupo de cetona o aldehido .

Proteínas portadoras En general, cualquier proteína portadora que puede inmovilizar un antígeno bajo condiciones fisiológicas puede ser usada en la presente invención. Deseablemente, el antígeno es inmovilizado en un complejo con matriz vinculada de proteína portadora y/o polication vinculada en la ausencia de unión covalente significativa entre el antígeno y la matriz de proteína portadora/policatión . La ausencia de unión covalente significativa, se refiere a no más de un 50% del antígeno que está siendo covalentemente unido a una proteína portadora/policatión. En modalidades deseables, no más de un 40%, 30%, 10% ó 5% del antígeno está covalentemente unido a una proteína portadora. El antígeno/ complejo proteínico puede contener otro compuesto, tal como alumbre.

Las proteínas portadoras usadas en las vacunas de la invención deseablemente son proteínas que, ya sea solas o en combinación con un antígeno, provocan una respuesta inmune en un sujeto. Deseablemente, la proteína portadora contiene múltiples epítopes restringidos de MCH clase II, reconocidos por una célula T ayudante. Deseablemente, los epítopes son capaces de inducir una respuesta de célula Th en un sujeto, e inducir a las celular B a que produzcan antígenos contra el antígeno de interés y los microbios de los cuales se deriva el antígeno. Los epítopes usados como se describe en esta invención, incluyen cualquier determinante sobre un antígeno que es responsable de su interacción específica con una molécula de antígeno o su fragmento. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupaciones de superficie activas químicamente de moléculas tales como amino ácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Para tener propiedades inmunogénicas , una proteína o polipéptido generalmente es capaz de estimular las células T. Sin embargo, una proteína portadora que carece de un epítope reconocida por una célula T, puede ser también inmunogénica.

Al seleccionar una proteína portadora que se conoce por provocar una respuesta inmune fuerte (ejemplo, es altamente inmunogénica) , y para contener epítopes de célula ayudante T "universal" o "rango amplio" o "DR pan" (véase por ejemplo WO 2008/057529), una población diversa de sujetos puede ser tratada mediante una composición de vacuna de matriz de proteína en el presente descrita. La proteína portadora deseablemente es suficientemente foránea para provocar una fuerte respuesta inmune a la vacuna. Típicamente, la proteína portadora usada es una molécula que es capaz de estimular inmunogenicidad al antígeno de interés. En una modalidad deseable, una proteína portadora es una que es inherentemente altamente inmunogénica . Por lo tanto, una proteína portadora que tiene un alto grado de inmunogenicidad y es capaz de maximizar la producción de antígenos al (los) antígeno (s) que puede (n) hacer complejo con la misma, es deseable.

Varias proteínas portadoras útiles en la práctica de la invención incluirán, ejemplo, toxinas y toxoides (químicos o genéticos) , que pueden ser o no mutantes, tales como la toxina del ántrax, PA y DNI ( PharmAthene , Inc.), toxoide de difteria (Massachusetts State Biological LAbs; Serum Institute of India, Ltd.) o CRM197, toxina del tétanos, toxoide tetánico (Massachusetts State Biological LAbs; Serum Institute of India, Ltd.), fragmento Z de toxina de tétanos, exotoxina A o mutantes de la exotoxina A del Pseudomonas aeruginosa, flagelina bacteriana, neumolisina, una proteína de membrana externa de Neisseria meningitidis (cepa disponible del ATCC (Colección de Cultivo Tipo Americano, Manassas, Va.)), proteína Hcpl de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, toxina tipo shiga, proteína humana LTB, un extracto proteínico de células bacterianas totales, y cualquier otra proteína que pueda ser reticulada por un vinculante. Deseablemente, la proteína portadora es la subunidad B de la toxina del cólera (disponible de SBL Vaccin AB) , toxoide de difteria o CRM197 (Connaught, Inc.), toxoide tetánico o Fragmento C (disponible de Sigma Aldrich) , DNI o bet-galactosidasa del E. Coli (disponible de Sigma Aldrich) . Otras proteínas portadoras deseables incluyen albúmina de suero bovino (BSA) , P40, y riboflavina de pollo. (A menos que se indique lo contrario, las proteínas portadoras ejemplares están comercialmente disponibles de Sigma Aldrich) . Otras proteínas portadoras ejemplares son los MAPs (péptidos multi-antigénicos) , que son péptidos ramificados. Mediante el uso de un MAP, la densidad reticulante se maximiza debido a los múltiples residuos de amino ácidos ramificados. Un residuo de amino ácido deseable para fines de reticulación, que pueden ser usados para formar un MAP, es, pero no está limitado a, lisina, que tiene un grupo libre de amino ácidos en su cadena lateral .

Tanto el BSA como la hemocianina de lapa clave (KLH) han sido comúnmente usados como transportadores en el desarrollo de vacunas al experimentar con animales. Las proteínas portadoras que han sido usadas en la preparación de vacunas terapéuticas incluyen, pero no están limitadas a, un número de toxinas de bacterias patogénicas y sus toxoides . Los ejemplos incluyen toxinas de difteria y de tétanos, y sus toxoides correspondientes médicamente aceptables . Otros candidatos son proteínas antigénicamente similares a las toxinas bacterianas referidas como materiales de reacción cruzada (CRMs por sus siglas en inglés) . Las proteínas portadoras útiles en la práctica de la invención también pueden incluir cualquier proteína no derivada de humanos y que no está presente en cualquier sustancia de alimento humano.

En modalidades deseadas de la invención, las proteínas que forman estructuras de tipo anular se usan para la producción de PCMV. Dichas proteínas incluyen la proteína Hcpl de Pseudomonas aeruginosa, las "subunidades B" no tóxicas de la toxina del cólera, la enterotoxina lábil al calor del Escherichia coli, y la toxina tipo shiga. Dichos complejos proteínicos de tipo anular pueden formar "estructuras" en donde las cadenas de PS lineales penetran el canal central de estos complejos proteínicos con forma anular. Después de la reticulación proteínica, dichos complejos se prevé que serán particularmente estables. Los datos estructurales de las proteínas sugieren que estos canales centrales son lo suficientemente grandes para que las cadenas de PS ingresen fácilmente. Por ejemplo, el canal central del anillo Hcpl hexamérico es de 42 Angstroms, lo cual es suficientemente amplio para acomodar fácilmente diversas cadenas de polisacáridos de 5.5 Angstroms de ancho (Mougous et al., Ciencia, 312 (5579) : 1526-1530 (2006)). Alternativamente, los anillos proteínicos pueden ser ensamblados alrededor del polisacárido (ejemplo, de subunidades de una proteína portadora monomérica que se ensambla de manera natural a anillos bajo condiciones químicas físicas particulares) . Dichas proteínas monoméricas que se pueden ensamblar en anillos se conocen en la materia e incluyen, por ejemplo, la pneumolisina (Walker et al., Invect . Immun. , 55(5):1184-1189 (1987); Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol., 25 (2) :222-225 (1987)), listeriolisina O (Kayal y Charbit, FEMS Microbiol. Rev., 30:514-529 (2006); Mengaud et al., Infect. Immun., 55 ( 12 ): 3225-3227 (1987)), DNI , ántrax PA, Hcpl, subunidad B de toxina de cólera, la subunidad B de toxina de shiga, y numerosas moléculas relacionadas conocidas en la materia y hechas por varios microorganismos .

En otra modalidad deseable, los agonistas de receptores tipo Toll (TLR) se usan como proteínas portadoras. La activación de receptor tipo Toll (TLR) es importante para dar forma a la respuesta inmune adaptativa y puede jugar un papel en la maduración de afinidad de la respuesta de antígeno, cambio de isotipo, y memoria inmunológica . La flagelina (FLA) de Vibrio cholerae es un agonista de TLr. La proteína de FLA han sido purificados de Escherichia coli recombinante y muestran ser un activador de TLR potente en un ensayo de inducción de macrófagos IL-6. En adición, una proteína de Streptococcus pneumoniae bien conservada llamada "neumolisina" , también ha demostrado activar el TLR4 y, adicionalmente, es un antígeno protector. Por lo tanto, esta proteína también puede ser usada como una proteína portadora de matriz de proteína .

Además, las mezclas de proteína de membrana externa (OMP por sus siglas en inglés) (ejemplo, las OMP de Neisseria meningitidis) se usan como la proteína portadora para la vacuna conjugada de HIB producida por Merck, y los extractos proteínicos de las células bacterianas completas de Streptococcal pneumoniae han demostrado ser al menos parcialmente protectoras en modelos de infección animal . En modalidades deseables de la invención, estas mezclas proteínicas pueden ser usadas como proteínas portadoras .

En una modalidad deseable, la composición de vacunas se hace usando una proteína portadora que tiene, ejemplo, al menos dos residuos de lisina u otros residuos que están desbloqueados y que pueden ser reticulados mediante modificación química. En otras modalidades deseables, la proteína portadora es un multímero (ejemplo, una que contiene al menos 5 subunidades) .

En otra modalidad, el DNI se usa como la proteína portadora debido a que no es tóxico, y no deja necesidad alguna para volverlo menos tóxico antes de su uso. Más aún, el uso del DNI es deseable debido a que el DNI también puede inducir una respuesta inmune protectora al B. anthracis, además de la respuesta inmune protectora provocada al antígeno de interés. También, el DNI no tiene uniones de disulfuro internas. Dichas uniones son susceptibles a la reducción de borohidruro, lo que podría desnaturalizar la proteína y resultar en la pérdida de epítopes que inducen el antígeno neutralizante de la toxina del ántrax.

Antígenos de Interés Las composiciones de vacuna de la invención y los métodos para hacer y administrar dichas vacunas pueden usarse para cualquier antígeno de interés y es especialmente favorable para uso con antígenos los cuales no son por sí mismos inmunogénicos fuertemente. Esto incluye, por ejemplo, un gran número de polisacárido , polialcohol, o poli amino ácido. Deseablemente, el antígeno de interés no transporta grupos primarios que puedan ser destruidos por las reacciones químicas empleadas por el método de fabricación de vacunas, ejemplo, la desnaturalización de un antígeno causada por la destrucción de uniones de disulfuro de antígeno mediante lar educción de borohidruro. Los antígenos ejemplares de interés incluyen, pero no están limitados a polímeros orgánicos, tales como polisacáridos (ejemplo, polisacáridos que tienen al menos 18 residuos), fosfopolisacáridos , polisacáridos con amino azúcares con sustituciones de N-acetilo, polisacáridos que contienen azúcares sulfonilatadas , otros azúcares modificados con sulfato, o azúcares modificados con fosfato, polialcoholes , poli amino ácidos, ácidos teicoicos, cadenas laterales o polisacáridos de lipopolisacáridos . Los antígenos ejemplares de interés también incluyen polímeros orgánicos capsulares incluyendo aquellos sintetizados por microbios, ejemplo, bacteria, hongos, parásitos, y virus, y después purificados para formar dicha fuente biológica usando métodos estándares . Antígenos ejemplares de interés incluyen polímeros orgánicos capsulares microbianos incluyendo aquellos purificados de organismos bacterianos tales como las especies Bacillus (incluyendo el B. anthtracis) (Wang and Lucas, Infect. Immun. , 72 ( 9 ): 5460-5463 (2004)), Streptococcus pneumoniae (Bentley et al., PLoS Genet . , 2(3):e31 (2006); Kolkman et al., J. Bichemistry, 123:937-945 (1998); y Kong et al., J. Med. Microbiol . , 54:351-356 (2005)), Shigella (Zhao et al., Carbohidr. Res., 342 (9) : 1275-1279 (2007)), Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis , Staphylococcus aureus, Salmonella typhi , Streptococcus pyogenes, Escherichia coli (Zhao et al., Carbohidr. Res., 342 ( 9 ): 1275-1279 (2007)), y Pseudomonas aeruginosa, y organismos de hongos tales como Cryptococcus y Candida, así como muchos otros microorganismos (ver, ejemplo, Ovodov, Bioquímica (Mosc), 71 (9 ): 937-954 (2006); Lee et al., Adv. Exp. Med. Biol., 491:453-471 (2001); y Lee, Mol. Immunol., 24 (10 ): 1005-1019 (1987)). Los antígenos ejemplares de interés también incluyen polímeros que no son de ocurrencia natural y por lo tanto no tienen origen no biológico.

Los antígenos particulares de Streptococcus pneumoniae incluyen polisacárido capsular tipo 1 (ejemplo, 1-g o 1-q) , 2 (ejemplo, 2-g, 2-q, o 2-41A) , 3 (ejemplo, 3-g, 3-q, 3-c, o 3-nz) , 4, 5 (ejemplo, 5-q, 5-c, 5-qap, o 5-g) , 6A (ejemplo, 6A-g, 6A-cl, 6A-c2, 6A-n, 6A-qap, 6A-6B-g, 6A-6B-q, o 6A-6B-S) , 6B (ejemplo, 6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B-q, o 6A-6B-s), 7F (ejemplo, 7F-7A) , 7A (ejemplo, 7A-cn o 7F-7A) , 7B (ejemplo, 7B-40), 7C (ejemplo, 7C-19C-24B) , 8 (ejemplo, 8-g o 8-s), 9A (ejemplo, 9A-9V) , 9L, 9N, 9V (ejemplo, 9A-9V) , 9V y 14, 10F (ejemplo, lOF-q, lOF-ca, o 10F-10C) , 10A (ejemplo, 10A-17A o 10A-23F) , 10B (ejemplo, 10B-10C) , 11F, 11A (ejemplo, llA-nz o 11A-11D-18F) , 11B (ejemplo, 11B-11C), 11C (ejemplo, 11B-11C. o HC-cn) , 11D (ejemplo, 11A-11D-18F) , 12F (ejemplo, 12F-q o 12F-12A-12B) , 12A (ejemplo, 12A-cn, 12A-46, o 12F-12A-12B) , 12B (ejemplo, 12F-12A-12B) , 13 (ejemplo, 13-20) , 14 (ejemplo, 14-g, 14-q, 14-v, o 14-c) , 15F (ejemplo, 15F-cnl o 15F-cn2), 15A (ejemplo, 15A-cal, 15A-ca2, o 15A-chw) , 15B (ejemplo, 15B-C, 15B-15C, 15B-15C-22F-22A) , 15C (ejemplo, 15C-ca, 15C-ql, 15C-q2, 15C-q3, 15C-S, 15B-15C, o 15B-15C-22F-22A) , 16F (ejemplo, 16F-q o 16F-nz) , 16A, 17F (ejemplo, 17F-n y 17F-35B-35C-42), 17A (ejemplo, 17A-ca o 10A-17A) , 18F (ejemplo, 18F-ca, 18F-w, o 11A-11D-18F) , 18A (ejemplo, 18A-nz o 18A-q) , 18B (ejemplo, 18B-18C) , 18C (ejemplo, 18B-18C) , 19F (ejemplo, 19F-gl, 19F-g2, 19F-g3, 19F-q, 19F-n, o 19F-c) , 19A (ejemplo, 19A-g, 19A-, o 19A-ca) , 19B, 19C (ejemplo, 19C-cnl, 19C-cn2, o 7C-19C-24B) , (ejemplo, 13-20), 21 (ejemplo, 21-ca o 21-cn) , 22F (ejemplo, 15B-15C-22F-22A) , 23F (ejemplo, 23F-C, 10A-23F, o 23F-23A) , 23B (ejemplo, 23B-C o 23B-q) , 24F (ejemplo, 24F-cnl, 24F-cn2, o 24F-cn3), 24A, 24B (ejemplo, 7C-19C-24B) , 25F (ejemplo, 25F-38), 25A, 27, 28F (ejemplo, 28F-28A o 28F-cn) , 28A (ejemplo, 28F-28A) , 29 (ejemplo, 29-ca o 29-q) , 31, 32F (ejemplo, 32F-32A) , 32A (ejemplo, 32A-cn o 32F-32A) , 33F (ejemplo, 33F-g, 33F-q, 33F-chw, 33F-33B, o 33F-33A-35A) , 33A (ejemplo, 33F-33A-35A) , 33B (ejemplo, 33B-q, 33B-S, o 33F-33B) , 33D, 34 (ejemplo, 34-ca o 34s) , 35F (ejemplo, 35F-47F) , 35A (ejemplo, 33F-33A-35A) , 35B (ejemplo, 17F-35B-35C-42 ) , 36, 37 (ejemplo, 37-g o 37-ca) , 38 (ejemplo, 25F-38) , 39 (ejemplo, 39-cnl o 39-cn2), 40 (ejemplo, 7B-40), 41F (ejemplo, 4lF-cn o 4lF-s), 41A (ejemplo, 2-41A) , 42 (ejemplo, 17B-35B-35C-42 ) , 43, 44, 45, 46 (ejemplo, 46-s o 12A-46) , 47F (ejemplo, 35F-47F) , 47A, 48 (ejemplo, 48-cnl o 48-cn2), o Número de Acceso a GenBank AF532714 o AF532715.

Se hace mención particular a los polisacáridos de Streptococcus pneumoniae seleccionados del grupo que consiste del tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44, o 46.

Policatíones Deseablemente, cualquier polication que posee una carga positiva repetitiva en la forma de una primaria libre, grupo amina secundaria o terciaria puede ser utilizado en la presente invención. Policationes de ejemplo incluyen, pero no se limitan a poli-L-lisina, quitosano [copolimero de ß- (1-4) -ligado de 2-amino-2-desoxi^-D-glucano (GlcN) y 2-acetamido-2-desoxi- -D-glucano (GlcNAc) ] , arginina y poli disponibles comercialmente polímeros sintéticos que contienen grupos amina libres, tales como polietilenimina ramificada (PEI) , poliamina N7 (CAS 29320-38-5) y Etilenediaminometil poliestireno (CAS 177987-93 -8) .

En modalidades deseables, la poli-L-lisina se a-poli-L-lisina (poli-alfa -L-lisina) ?-e poli-L-lisina (épsilon-poli-L-lisina) . Los residuos de lisina de poli-L-lisina están vinculados a través de un enlace peptídico entre el grupo carboxilo y, o bien la alfa (a-PLL) o épsilon (e-PLL) grupo amina. Deseablemente, la poli-L-lisina se oc-poli-L-lisina. oc-poli-L-lisina se sintetiza químicamente y se puede obtener en varios pesos moleculares, por ejemplo, 0,5 a 300 kDa . e-poli-L-lisina es pequeño homopolímero natural del amino ácido L-lisina esencial que es producido por la fermentación bacteriana, por ejemplo, e-poli-L-lisina puede ser aislado a partir de Streptomyces albulus, y tiene una masa molecular media de aproximadamente 4000 Da.

Los policationes se cree que realizar dos funciones en el proceso de formación de una vacuna contra la matriz: 1) que actúa como un contraión cargado negativamente a polímeros de antígeno y 2) en el caso de la amina primaria que contiene policationes y agentes de reticulación que reaccionan con grupos amina, ayudando en la formación de la matriz mediante la formación de enlaces cruzados con otras moléculas de policatión o moléculas de proteína portadora. Ambas de estas propiedades de policationes permitirá mejorar el inmovilización de antígenos en la matriz de proteína mejorando así el rendimiento de la formación de partículas PCMV. Esto se puede observar en la Figura 1, donde la cantidad de polisacáridos inmovilizado en la matriz mejoró de 5% a más del 50% con la adición de a PLL.

Ya que la formación de las vacunas conjugadas también puede verse afectada negativamente por la repulsión de cargas entre el antígeno y la proteína portadora, el uso de un policatión también podría mejorar la eficiencia de la conjugación. Dado que muchas composiciones químicas de conjugación implican que une el polímero a la proteína portadora a través de grupos de amina primaria de la proteína portadora (por ejemplo, residuos de lisina) , utilizando una amina no primaria que contiene policatión tal como arginina poli puede ser de beneficio para evitar la conjugación del antígeno polímero a la policatión. Sin embargo, amina primaria que contiene policationes también podría ser utilizado para ayudar en la fabricación de una vacuna contra la matriz en la que los polisacáridos son intencionalmente unidos covalentemente (reticulado) a la matriz. La cantidad, el tamaño, y el tipo de la policatión sea necesario para mejorar el inmovilización de antígenos y la formación de matriz podrían depender de la composición, grado de carga negativa, el tamaño, amina (u otro grupo reactivo) funcionalidad, y la estructura secundaria o terciaria del antígeno polimérico. Además, si más de un antígeno polimérico se añade a la reacción a la vacuna de la matriz (vacuna multivalente) , las interacciones entre los polímeros podrían influir en el policatión que es el mejor en la mejora de inmovilización. Esto se puede observar con la trivalente, 13-valente, y 23-valentes experimentos PPS- pCMV presentados en los Ejemplos 5, 6, 8, y 9 a continuación. Cuando se utilizó e-PLL, que tiene un peso molecular medio de 4.000 Da, en las reacciones de pCMV trivalente, polisacárido inmovilización de PPS4 , PPS18C, y PPS23F fue modesto y aunque la mejora de la inmunogenicidad de los antígenos de polisacáridos en comparación con el polisacárido solo, se hizo no coincide con el nivel observado con la vacuna conjugada. Sin embargo, cuando e-PLL se utiliza en la fabricación de la 13-valente PPS- PCMV la inmunogenicidad de PPS4 y PPS18C mejoraron 3,4 veces y 107 veces, respectivamente, en comparación con la trivalente PPS- PCMV, lo que sugiere que el inmovilización de estos dos polisacáridos se mejorado por e-PLL debido a las interacciones con los otros - polisacáridos en la reacción del PPS 13-valente. El uso de oc-PLL (150-300 kDa) en las reacciones trivalentes mejora la inmunogenicidad de PPS4 aún más, provocando un GMT que era 132 veces mayor que la provocada por la 13-valente PPS PCMV. Sin embargo, el uso de a -PLL (150-300 kDa) en la toma de la 23 -valente PPS- PCMV pareció resultar en un menor inmovilización PPS4, ya que el GMT para PPS4 en este PCMV era 2.650 veces menor que la trivalente PPS/oc-PLL PCMV, lo que sugiere que los otros polisacáridos en la reacción de 23 serotipos pueden tener un impacto negativo en el inmovilización de PPS4 con a -PLL (150-300 kDa) . La determinación de la cantidad óptima, el tamaño (peso molecular) , y la composición del componente de polication utilizado para inmovilizar a cada individuo o grupo de polisacáridos u otros antígenos pueden ser determinadas empíricamente mediante el examen de la capacidad del polication para hacer que el antígeno (s) polisacárido para cambiar a un peso molecular más alto, determinado por cromatografía de exclusión de tamaño. Este cambio, que indica la asociación de los antígenos con partículas de mayor tamaño como el antígeno está inmovilizado y se asocia con una proteína de la matriz, se puede observar en varias de las cifras presentadas en el presente documento y discutido a continuación.

Composiciones de Vacuna Las composiciones de vacuna de la invención, incluyendo los PCMV, pueden ser usadas en combinación, por ejemplo, en vacunas pediátricas. En adición, las composiciones de vacuna de la invención pueden ser usadas para vacunar contra, por ejemplo, la infección por Pneumococcus, infección por Haemophilus influenzae tipo B ("HiB"), infección por Streptococcus (grupos A y B) , infección por meningococo (ejemplo, Neisseria meningitides) , y puede ser usada como vacunas capsulares y de antígeno 0 contra bacterias negativas a Gram (ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis, especies Shigella, serovariedad entérica de Salmonella, especies Acinetobacter, especies Burkholderia, y Escherichia coli) .

La formación de vacunas deseablemente incluye al menos una proteína portadora, uno o más antígenos de interés, al menos un policatión, y un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable (ejemplo, fosfato de aluminio, cloruro de sodio, agua estéril). Una composición de vacuna también puede incluir un sistema adyuvante para mejorar la inmunogenicidad de la formulación, tal como aceite en un sistema de agua, alum u otros sistemas conocidos en la materia u otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Un complejo de matriz de antígeno/portador/proteína/poliatión transportador/que es insoluble bajo condiciones fisiológicas, es deseable para liberar lentamente el antígeno después de su administración a un sujeto. Dicho complejo es deseablemente administrado en una suspensión que contiene excipientes farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, el complejo de matriz de antígeno/portador/proteína/policatión también puede ser soluble bajo condiciones fisiológicas.

Típicamente, la composición de vacuna de proteína de la matriz se encuentra en un volumen de aproximadamente 0,5 mi para inyección subcutánea, 0,5 mi para la inyección intramuscular, 0,1 mi para la inyección intradérmica, o 0.002 a 0,02 mi para la administración percutánea. Una dosis de 0,5 mi de la composición de vacuna de proteína de la matriz puede contener aproximadamente 2-500 µ g de antígeno inmovilizado con aproximadamente 2-500 µ g de la matriz de proteína portadora/policatión . En una modalidad deseable, en una dosis de 0,5 mi, aproximadamente 10 µ g de antígeno son inmovilizados con aproximadamente 10 µ g de la matriz de proteína portadora/policatión. La relación molar de antígeno a la proteína portadora/policatión es deseablemente entre 1 a 10 (por ejemplo, 1 parte de antígeno a 2 partes portadora/policatión o 1 parte antígeno a 3 partes de soporte/policatión, etc., hasta 1 parte a 10 partes antígeno portador/policatión) y de 10 a 1 (por ejemplo, antígeno de 10 partes a 1 parte de soporte/policatión o 9 partes de antígeno a 1 parte portadora/policatión, etc.). En una modalidad deseable, la relación molar de antígeno a portador/policatión es de 1 a 1. Alternativamente, la relación en peso seco de antígeno a la proteína portadora/policatión es deseablemente entre 1 a 10 y 10 a 1 (por ejemplo, 1 a 1 por peso seco) .

Debido a que el complejo de matriz antígeno/proteína portadora/policatión pueden ser degradados en el estómago, la composición de vacuna es deseablemente administrada por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o intradérmica) . Mientras que la administración por un medio que penetra físicamente la capa dérmica es deseable (ejemplo, una aguja o abrasión), las composiciones de vacunas de la invención también pueden ser administradas mediante absorción transdérmica .

En particular, las composiciones de vacunas de la invención pueden ser administradas a un sujeto, ejemplo, mediante inyección intramuscular, inyección intradérmica, o inmunización con los adyuvantes inmunes apropiados. Las composiciones de vacunas de la invención pueden ser administradas, una o más veces, frecuentemente incluyendo una segunda administración diseñada para acelerar la producción de antígenos en un sujeto para evitar la infección por un agente infeccioso correspondiente al antígeno incluido en la vacuna. La frecuencia y cantidad de la dosis de la vacuna para obtener la respuesta inmune deseada o el nivel de inmunidad, depende de la actividad específica de la vacuna, y puede ser fácilmente determinada por la experimentación de rutina. Por ejemplo, para un infante, un calendario de vacunación puede ser tres dosis de 0.5 mi cada una con intervalos de aproximadamente cuatro a ocho semanas (iniciando a los dos meses de edad) seguida por una cuarta dosis de 0.5 mi a aproximadamente doce a quince meses de edad. Una quinta dosis entre los cuatro y seis años de edad puede ser deseable para algunas vacunas .

Mientras que la edad a la que la primera dosis se administra generalmente es a los dos meses, una vacuna puede ser administrada a infantes tan jóvenes como 6 semanas de edad. Para los adultos, dos o más dosis de 0.5 mi dadas en intervalos de 2 a 8 semanas, generalmente son suficientes para proporcionar protección a largo plazo. Una dosis aceleradora es dada deseablemente cada diez años a los adultos previamente inmunizados y los niños de más de once años de edad.

Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden presentarse en contenedores de unidad de dosis o multi dosis, por ejemplo, ampolletas y frascos sellados pueden ser almacenados en una condición de congelado seco (liofilizado) que requiere únicamente la adición del transportador estéril de líquido inmediatamente antes del uso. Las vacunas de la invención pueden ser formuladas en vehículos farmacológicamente aceptables, ejemplo, gel de hidróxido de alumbre, preparación adyuvante, o salina, y después administrada, ejemplo, mediante inyección intramuscular, inyección intradérmica, o inmunización transcutánea con los adyuvantes inmunes apropiados.

La invención también incluye juegos que incluyen una vacuna en el presente descrita (ejemplo, una PCMV) . Los juegos de la invención también pueden incluir instrucciones para el uso de los juegos en los métodos de vacunación en el presente descritos.

La eficacia del calendario de inmunización puede determinarse usando métodos estándar para la medición de la concentración de antígenos en el sujeto inmunizado. En general, las concentraciones medias de antígenos (deseablemente concentraciones de IgG) de aproximadamente 1 ug/ml se consideran indicativas de protección a largo plazo .

La invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un antígeno de interés inmovilizado con una matriz de proteína portadora/policatión, métodos de fabricación de tales composiciones de vacuna, y métodos de administración de la vacuna. Se ha descubierto que la eficiencia de la formación de PCMV y por lo tanto, su rentabilidad como vacunas, se mejora por la adición de un policatión, por ejemplo, poli-L-lisina, a la matriz de proteína. Además, los policationes también pueden ser beneficiosos en la mejora de la eficiencia de las reacciones de conjugación para la producción de vacunas conjugadas convencionales, donde el antígeno de polímero se une covalentemente a la proteína portadora, con lo que una vacuna conjugada rentable más. Brevemente, tal como se enseña en la presente memoria, composiciones de vacuna matriz de proteína que incorporan un polication han aumentado la inmunogenicidad en comparación con composiciones que comprende antígeno A T solo o antígeno inmovilizado en una matriz de proteína portadora que no contiene polication. La inmunogenicidad mejorada en composiciones de vacuna de la matriz de proteínas que contienen polication se cree que es debido a la mejora de inmovilización del antígeno polisacárido en la matriz de proteína/policatión, lo que permite un mayor nivel de antígeno en una dosis de vacuna en comparación con la misma dosis de una vacuna que hizo no contener polication. Como se discute en el presente, cápsulas de polisacáridos de bacterias se componen de repetir azúcares y para muchas bacterias patógenas estas cápsulas tienen una carga negativa neta. La carga negativa de la cápsula puede ser repeliendo la proteína de la matriz, lo que resulta en pobres polisacárido antígeno inmovilización. Para contrarrestar esta carga negativa un polication, por ejemplo, poli-L-lisina (PLL) , se puede añadir a pCMV reacciones . En amina primaria de adición que contiene policationes como PLL, también puede ayudar en la formación de la matriz mediante la formación de enlaces cruzados entre otras moléculas de PLL o moléculas de proteína portadora .

Mientras que los ejemplos a continuación representan modalidades que utilizan policationes en la formación de las vacunas de proteínas de la matriz, el uso beneficioso de policationes se puede utilizar de manera similar en la producción de vacunas conjugadas convencionales también.

La invención se describe a continuación por referencia a ejemplos específicos, modalidades y figuras, cuyo propósito es ilustrar la invención y no para limitar su ámbito de aplicación. Los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplo 1: Vi- CRM197-CC PLL PCMV El efecto de la adición de policationes en composiciones de vacuna de la matriz se investigó usando la cápsula de polisacárido Vi de Salmonella entérica serovariedad Typhi como un antígeno, utilizando un difteria no tóxica de la toxina CRM197 como una proteína portadora (preparado en Matrivax Investigación y Desarrollo Corporation, Boston, MA, E.U.), y-oc poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) como el policatión.

Vi es un homopolímero altamente aniónico compuesto de (al-4) -D-GalANAc variable acetilada -O en C-3. Una de las vacunas aprobadas actualmente para la fiebre tifoidea es TyphimVi® (Sanofi Pasteur SA) , la cual contiene no conjugada de polisacárido Vi como antígeno . En los estudios iniciales para poner a prueba si las vacunas de la matriz de proteínas con éxito podrían ser utilizados para entregar antígeno Vi y provocar una respuesta inmune, PCMV se prepararon en reacciones que contienen 4 mg/ml de VI como el antígeno y 4 mg/ml CRM197 como la proteína portadora formador de matriz. Formación de la matriz se inició mediante la adición de glutaraldehído como agente de reticulación. Después de la incubación durante 24 horas a 4o C con balanceo constante, la reacción se separó en una columna de 2,6 cm x 10 de Sepharose CL2B y se recogieron fracciones de alto peso molecular, con adyuvante de alumbre, y se utiliza para inmunizar ratones. Uso de la cantidad de Vi que se desplazó a un peso molecular más alto siguiente reacción se estimó que < 5% de la VI en la reacción PCMV fue inmovilizado en la matriz de proteína. Los títulos de antígenos anti-Vi para las composiciones PCMV fueron aproximadamente 3 veces mayor que el polisacárido solo (control) , sin embargo, fueron inferiores a los provocados por la vacuna de polisacárido Vi corriente comercial TyphimVi®. En contraste, las vacunas conjugadas Vi, por ejemplo, Vi- CRM197, se ha demostrado en la literatura para obtener títulos que eran 40-100 veces más alto que el polisacárido solo. Véase, por ejemplo, Rondini et al, 2011, Clínica y Vacunas Inmunología, 18:. 460-468;. Cui et al, 2010, Clínica y Vacunas Inmunología, 17: 73-79; An et al. 2011 Vacuna 44: 7.618-7.623 Micoli et al., 2011, Vacuna, 29:712-720. La escasa inmunogenicidad de partículas Vi pCMV en comparación con las vacunas conjugadas se cree que es potencialmente debido a la mala inmovilización de la VI en la matriz de CRM197, una mala separación de las partículas de pCMV no inmovilizado (libre) Vi, o ambos.

Debido a la alta naturaleza aniónica de Vi, se planteó la hipótesis de que Vi se repeliendo el CRM197 durante la etapa de reticulación clave e interfiriendo con inmovilización eficiente en partículas pCMV.

Inicialmente, la adición de sal a la PCMV fue investigado para reducir la repulsión de la carga; Sin embargo, un precipitado insoluble formado después de la reticulación.

El efecto de un policatión se investigó en el proceso de PCMV: Dos PCMV se prepararon para la primera experimento de inmunización utilizando poli-L-lisina (PLL) , cada reacción PCMV contenía 4 mg/ml de Vi , 4 mg/ml de CRM 197 y 0,01% -poli-L-lisina (150-300 kDa) . Vi y a-poli-L-lisina (oc-PLL) se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con balanceo continuo antes de la adición de 0,25% de glutaraldehído como agente de reticulación y CRM197 como la proteína portadora. 0,01 mg/ml flagelina (FLG) de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium se añadió a una de las mezclas de reacción como un aditivo adyuvar . Se continuó la incubación durante otros 10 minutos a temperatura ambiente con balanceo continua antes de ser colocado a 4°C durante 24 horas con agitación constante. La separación de las reacciones pCMV se llevó a cabo en una columna Sephacryl S-1000 2,6 x 30 cm. Después de la separación de los productos de reacción en la columna, los niveles de proteína y polisacárido se determinaron utilizando de microBCA (Pierce Chemical) y manchas -Todo (Sigma Chemical) kits de ensayo, respectivamente. Aproximadamente el 20% de la Vi se desplazó a un peso molecular más alto y co-eluyó con el pico de la proteína, lo que sugiere que la VI fue inmovilizado dentro de la matriz de proteína portadora/policatión (Figura 2) . Estas fracciones de alto peso molecular se recogieron y se combinaron (ver, Figura 2, fracciones en caja), alumbre con adyuvante, y utilizado para la inmunización.

Los grupos de cinco ratones BalbC (Laboratorios Jackson) se inmunizaron con 10 g de VI en forma de PCMV, solo Matrivax Vi, o TyphimVi® vacuna contra la fiebre tifoidea de polisacárido Vi (Sanofi Pasteur SA) en 3 intervalos bisemanales. Los ratones se sacrificaron 3 semanas después de su última inmunización y el nivel de antígenos Vi- específicos determinados por ensayos de ELISA. Los títulos medios geométricos de punto final (MGT) de las vacunas anteriores se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Inmunogenicidad de i- CRM197 PCMV hecho con ocPLL A partir de estos resultados se puede observar que mediante el uso de oc-PLL en las reacciones, los PCMV suscitó anti-Vi títulos de antígenos que fueron 40 veces mayores que los observados con polisacárido Vi solo (Tabla 1,). Además, la incorporación de pequeñas cantidades de flagelina en el PCMV oc-PLL que contienen llevó a incluso más altos títulos de antígenos anti-Vi con un GMT que fue 300 veces mayor que la inmunización con el polisacárido Vi solo y 7,5 veces mayor que el PCMV sin flagelina. La presencia de la flagelina no afectó a la cantidad de Vi inmovilizado por el PLL (datos no mostrados) .

Curiosamente, poli-L-arginina (PLA) , que es también un policatión y contiene el mismo grado de carga positiva como PLL, pero que no contiene la repetición de aminas primarias, no mejoró Vi inmovilización (datos no presentados) , lo que indica que PLL fue tanto contrarrestar la carga negativa del Vi, así como ayudar en la formación de la matriz por reticulación a otras moléculas PLL y CRM197.

Ejemplo 2: Mejora de la separación de Vi- CRMl97-otPLL PCMV Con el fin de eliminar mejor las especies de bajo peso molecular (que se supone no inmovilizado, polímero antígeno no conjugado) de las partículas de pCMV, se utilizó la columna de exclusión de tamaño de un más largo (90 cm) . Específicamente, se preparó una mezcla de reacción PCMV de reticulación que contiene 4 mg/ml de Vi, 4 mg/ml de CRM 197 y 0,01% a-poli-L-lisina (150-300 kDa) . Vi y PLL se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con balanceo continuo antes de la adición de 0,25% de glutaraldehído y CRM197. Se continuó la incubación durante otros 10 minutos a temperatura ambiente con balanceo continua seguido de incubación durante 24 horas a 4o C con balanceo constante. Después de la separación del producto de reacción en los niveles de la columna SEC, proteínas y polisacáridos se determinaron utilizando el ensayo de microBCA y manchas-todos , respectivamente. Para determinar si el tamaño o el peso molecular de las partículas de pCMV afectan a su inmunogenicidad, fracciones de 3 puntos diferentes de elución de la columna de la SEC se reunieron y se utilizaron para la inmunización. Las selecciones de la piscina se ilustran en la Figura 3. Grupo 1 y Grupo 2 no difieren significativamente en su elución de la columna, sin embargo, piscina 3 se sospecha que tienen un peso molecular inferior a las piscinas 1 y 2 y para contener más no inmovilizado Vi.

Los grupos de cinco ratones fueron inmunizados con 10 g de Vi partir de las composiciones sujeto a través de 3 inyecciones cada dos semanas . Los ratones se sacrificaron 3 semanas después de su última inmunización y el nivel de antígenos Vi- específicos determinados por ensayos de ELISA. Se compararon los GMT de punto final de las inmunizaciones anteriores (Tabla 2).

La combinación de PLL y la mejora de la separación por tamaño nos permitió hacer un PCMV Vi- CRM197 que provocó anti-Vi los títulos de antígenos que eran 485 veces a 1400 veces mayor que Vi solo y 22 veces más alta que la vacuna contra la fiebre tifoidea (Tabla TyphimVi® 2; piscina 1 y 2 ) .

Tabla 2. Inmunogenicidad de las diferentes fracciones de tamaño de un Vi-CRMl97-a PLL PCMV Aunque el GMT para PCMV de la piscina 3 fue 44 veces superior a solas y 1,3 veces mayor que los TyphimVi comerciales® vacuna de fiebre tifoidea Vi, que era inferior a los provocados por la piscina 1 y 2. Esto es probablemente debido al menor peso molecular de los PCMV y/o la presencia de una mayor cantidad de Vi no inmovilizado, o "libre",.

Ejemplo 3: PPS18C-CRMl97-g PLL PCMV Con la mejora en Vi inmovilización utilizando -PLL, próximo a prueba si OÍ -PLL mejoraría inmovilización del neumococo PPS18C cargada menos negativamente polisacárido . A diferencia de Vi, donde cada resto de azúcar está cargado negativamente, PPS18C tiene sólo una única carga negativa por cada 5 residuos de azúcar. Sin embargo, la inclusión de 0,04% OÍ-PLL (15-30 kDa) en las reacciones de pCMV resultó en un cambio de 35% del polisacárido a partir de un peso molecular inferior a una fracción de mayor peso molecular cuando están separados por SEC (Figura 4) . La mayoría de la CRM197 presente en la reacción PCMV también co-localizada con las fracciones de alto peso molecular. El polisacárido presente en las fracciones de alto peso molecular ha demostrado ser capturado en una partícula PCMV mediante el uso de un ensayo ELISA de captura, donde las partículas de pCMV están unidos a la placa ELISA a través de antígenos anti-CRMl97 y el polisacárido detectada utilizando antisueros específicos de serotipo (datos no se muestra) .

Ejemplo 4-Inmovilización de Vi de aumentos de PLL mejorados en PCMV.

Las reacciones de reticulación pCMV se realizaron con 0,01% y 0,02% de OÍPLL (150-300 kDa) y 0,04% «PLL (15-30 kDa), 4 mg/ml Vi y 4 mg/ml de CRM197. Las reacciones se separaron en un 500 mi (90 cm x 2,6 cm) Sepharcryl S-1000 de columna y las fracciones se analizó la proteína y polisacárido utilizando de microBCA y manchas-todos de ensayo, respectivamente (Figura 5) . Al aumentar PLL (150-300 kDa) concentración de 0,01% a 0,02% de la cantidad de inmovilizado Vi aumentó de 15% a 21%. El aumento de inmovilización VI tenía ningún efecto sobre la inmunogenicidad de la PCMV con PCMV sintetizados utilizando ambas concentraciones de PLL provocar anti-Vi títulos de antígenos que fueron 14-a 20 veces más alta que solo y 2 VI-3 veces más alta que TyphimVi® vacuna contra la fiebre tifoidea (datos no mostrados) . Cuando se utilizó 0,04% de un a -PLL menor (15-30 kDa) el importe de inmovilizado Vi aumentado a 64%. El aumento de inmovilización con el peso molecular más bajo de PLL no dio lugar a la mejora de la inmunogenicidad de la PCMV sobre solo el Vi (datos no mostrados) . Hemos planteado la hipótesis de que la concentración más alta de peso molecular más bajo a-PLL (15-30 kDa) se puede enmascarar epítopos VI (datos no presentados) .

Ejemplo 5; PCMV Trivalente Para investigar si los efectos beneficiosos de un policatión a un PCMV podrían utilizarse en PCMV multivalentes , una vacuna neumocócica trivalente que incorpora antígenos de polisacárido de neumococo PPS18C, PPS4, y PPS23F se preparó. El PCMV se preparó como sigue: La mezcla de reacción PCMV contenía 5 mg/ml de polisacárido total de (más o menos 1,7 mg/ml de cada uno de PPS18C, PPS4, y PPS23F) , 1 mg/ml de CRM 197 y 0,04% e-poli-L-lisina (4 kDa, Bainafo Bioingeniería Co. Ltd., Zhengzhou, China). Polisacárido y e-poli-L-lisina se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente con balanceo continuo antes de la adición de 0,25% de glutaraldehído como agente de reticulación y CRM197 como la proteína de la matriz. Se continuó la incubación durante otros 10 minutos a temperatura ambiente con balanceo continua antes de ser colocado a 4o C durante 24 horas con agitación constante. La separación de la PPS18C/PPS4/PPS23-CRM197- e PLL PCMV se llevó a cabo en una columna de Sephacryl 2,6 x 90 cm de S-1000. Las fracciones se analizaron para polisacárido utilizando el ensayo de antrona, para la proteína por MicroBCA, y para el inmovilización de cada polisacárido en las partículas de pCMV mediante el uso de un ELISA de captura (ver Figura 5) . El ensayo es un ensayo de antrona coloromético para la detección de hexosas después de la hidrólisis en ácido sulfúrico concentrado. Trevelyan, et al, 1952, "Determinación de hidratos de carbono de la levadura con la antrona Reactivo", Nature, 170 (4328) : 626-627. Un fuerte de captura positiva de ELISA se observó para PPS4 (datos no mostrados) ; Sin embargo, las señales débiles se observaron con PPS18C y 23F. Las fracciones que contienen polisacárido de alto peso molecular que fueron positivos en el ELISA de captura se agruparon (ver, Figura 6, fracciones en caja), alumbre como adyuvante, y se utilizaron para las inmunizaciones.

Los Grupos de 10 ratones se inmunizaron usando el mismo régimen de dosificación como se describe anteriormente para Vi- PCMV. Para los PCMV trivalentes lotes, cada dosis contenía 2 µ g cada polisacárido total de PS o 6 µ g. Prevnar® 13 vacuna conjugada (que contiene 2.2 µ g de cada PS por dosis excepto para 6B, que es al 4 µ g para un total de 30,8 µ g de PPS) se administró a un grupo de ratones como control positivo para la comparación con la las respuestas de antígenos inducidas por PCMV. Un grupo de ratones también se inmunizó con los antígenos por sí solos, es decir, los trece antígenos polisacáridos no conjugados que se encuentran en la 13-valente Prevnar® 13, a 2 µ g de cada polisacárido para un total de 26 µ g de polisacárido total por dosis. Un grupo de ratones ingenuos (no vacunados) también fue incluido como un grupo de control negativo .

En alrededor de 2,5 semanas (47 días) después de la tercera inmunización, los ratones fueron sacrificados y se recogieron sangre por punción cardiaca. El suero inmune se analizaron por ELISA PPS- específicos para respuestas de antígenos IgG específicos de antígenos que reconocen PPS4, PPS18C y PPS23. Anti- PPS títulos de antígenos IgG medios geométricos (GMT) se calcularon a partir de los títulos de sueros individuales de los animales inmunizados. Resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Títulos de antígenos Trivalente PPS18C/PPS4/PPS23- CRM197- e PLL PCMV Como se puede ver en la Tabla 3 , el PCMV por lotes que contiene e -PLL provocó un anti-PPS4 GMT que era 179 veces mayor que polisacárido solo, un GMT anti- PPS18C que era 29 veces mayor que polisacárido solo, y un anti- PPS23F GMT que era 53 veces más alto que el polisacárido solo. Estos GMT fueron 37 veces más baja, 8.3 veces menor, y 2,8 veces inferior a la media geométrica de la vacuna Prevenar® 13 conjugado para PPS4, PPS18C y PPS23F, respectivamente. Aunque los títulos provocados por la PCMV trivalente reunidos no fueron tan altas como las provocadas por la vacuna Prevenar® 13 conjugado, que representaban una mejora dramática en el uso de antígeno solo y otra anteriores PCM de polisacáridos de neumococo hechas sin PLL y el uso de DNI como la matriz proteína. Este estudio demuestra la viabilidad de usar Además policatión en la formación de PCMV para mejorar la inmunogenicidad de las vacunas multivalentes , así como vacunas monovalentes. Además, la facilidad de producción de la vacuna multivalente utilizando la tecnología de pCMV de la forma en comparación con la producción de vacunas de conjugado convencional es claramente favorable.

Ejemplo 6; 13 -valente polisacárido neumocócica PCMV separado Una vacuna antineumocócica 13 -valente incorporando los antígenos polisacáridos de neumococo incluidos actualmente en Prevnar vacuna conjugada 13, es decir, PPSl, PPS3 , PPS4, PPS5, PPS6A, PPS6B, PPS7F, PPS9V, PPS14, PPS18C, PPS19A, PPS19F y PPS23F, se preparó® y probado para investigar más a fondo los efectos beneficiosos de la adición de policatión a las mezclas de reacción que forman la matriz pCMV.

El PCMV se preparó como sigue: una mezcla de reacción PCMV contenía 4 mg/ml de polisacárido total de (más o menos 0,3 mg/ml de cada uno de cada antígeno polisacárido), 4 mg/ml de CRM 197 y 0,4 mg/ml e-poli-L-lisina (4 kDa, Bainafo Bioingeniería Co . Ltd., Zhengzhou, China) . El polisacárido y e-poli-L-lisina se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con balanceo continuo antes de la adición de 0,25% de glutaraldehído como agente de reticulación y CRM197 como la proteína de la matriz. Se continuó la incubación durante otros 10 minutos a temperatura ambiente con balanceo continua antes de ser colocado a 4o C durante 24 horas con agitación constante. La separación de la PPS- CRMl97-e PLL PCMV se llevó a cabo en una columna de Sephacryl 2,6 x 90 cm de S- 1000. Las fracciones se analizaron para polisacárido utilizando el ensayo de antrona, para la proteína por MicroBCA, y para el inmovilización de cada polisacárido en las partículas de pCMV por ELISA de captura. Las fracciones que contienen polisacárido de alto peso molecular que fueron positivos en el ELISA de captura se agruparon (ver, Figura 7, fracciones en caja) , alumbre como adyuvante, y se utilizaron para las inmunizaciones .

Los Grupos de 10 ratones se inmunizaron utilizando el régimen de dosificación descrito anteriormente en el día 0, 14, y 28. Para la 13-valente lotes PCMV, cada dosis contenían 4 µ g de polisacárido total. Prevnar® 13 vacuna conjugada, que contiene 2.2 µg de cada polisacárido por dosis, excepto para 6B, que es al 4 g para un total de 30.8 g de PPS, se administró a un grupo de ratones como control positivo para la comparación con las respuestas de antígenos inducidas por PCMV. Un grupo de ratones también se inmunizó con los antígenos por sí solos, es decir, los trece antígenos polisacáridos no conjugados que se encuentran en la 13-valente Prevnar® 13, a 2 g de cada polisacárido para un total de 26 µg de polisacárido total por dosis. Un grupo de ratones ingenuos (no vacunados) también fue incluido como un grupo de control negativo.

En alrededor de 2.5 semanas (47 días) después de la tercera inmunización, los ratones fueron sacrificados y se recogieron sangre por punción cardiaca. El suero inmune se analizaron por PPS- ELISA específico para respuestas de antígenos de IgG específicos de antígeno a diez de los antígenos de PPS. Anti- PPS títulos de antígenos IgG medios geométricos (GMT) se calcularon a partir de los títulos de sueros individuales de los animales inmunizados. Resultados se muestran en la Tabla .

Títulos de antígeno 13-valente PPS- CRMl97-e PLL El punto final de IgG GMT de sueros de ratones inmunizados con formulaciones de pCMV por lotes fue dramáticamente más alta que GMT de ratones inmunizados con solo PPS (que van desde 8 veces a más de 3000 veces más alta que solo PPS) . A partir de los datos de la Tabla 4 se puede observar que el PCMV 13-valente por lotes que contiene e-PLL inducida IgG GMT comparable a la GMT fue alcanzada por inmunización con Prevnar® -13 (2 o 4 µ g de cada PPS) , dependiendo de la PPS antígeno examinado, utilizando considerablemente menor antígeno PPS (~ 0,3 µ g/PPS en PCMV vs 2 µ g/µ g 4 PPS en Prevenar® 13) .

A partir de los datos inmunologicos de la Tabla 3 y la Tabla 4 anterior, es claro que los PCMV tri- y 13-valentes que contienen e-PLL demuestran respuestas inmunes mucho más robusto de antígenos que PCMV anteriores que no contienen PLL u otro policatión. Reformulación con niveles más altos de reactivos y fraccionamiento por tamaños de los PCMV para eliminar el antígeno no incorporada polisacárido (s) y monómero de proteína de la matriz, por ejemplo, en una columna de dimensionamiento más largo, la mejora de la respuesta inmune específica de antígeno por encima de antígeno solo. Además, la inclusión de polímeros policatiónicos a-PLL y/o e -PLL aumenta la eficacia de captura de PS en la matriz de CRM -197- PCMV y provoca un 3 -a la respuesta inmune 125 veces más robusto en comparación con las formulaciones DNI- PCMV que no lo hicieron incluir oc-PLL y e-PLL (véase el ejemplo 7). Como puede verse a partir de las tablas anteriores, la respuesta de antígenos específica de antígeno inducida por las PCMV formuladas-PLL es a veces inferior, comparable, o superior a la magnitud de las respuestas inmunes antígeno anti- PPS obtenidos por Prevnar® vacuna conjugada 13; Sin embargo, cuando se observa que PCMV el PPS ( 13 ) -CRM197-8 PLL contienen 0,3 µ g de cada antígeno polisacárido por dosis en comparación con el 2 µ g o 4 µ g de cada antígeno PPS en Prevnar® vacuna de conjugado 13, se aprecia que los PCMV proporcionan una composición inmunogénica de forma única eficiente y uno que también se hace de manera eficiente en una etapa de reacción (en comparación con la multiplicidad de reacciones de conjugación específicas que sean necesarias para la fabricación de la vacuna Prevnar® 13) .

Ejemplo 7; 13 -valente PPS- DNI PCMV combinado y separados empaquetados Se realizó una serie de PCMV usando una forma mutante no tóxica de antígeno protector de B. anthracis (DNI), ya que la proteína portadora. Trece vacunas de matriz/proteína DNI PPS separadas fueron sintetizados, cada uno que contiene un antígeno polisacárido de neumococo diferente (PPS) siguiendo el mismo procedimiento de reacción de reticulación con glutaraldehído al 0,25% como se describió anteriormente. Los PCMV fueron entonces separados en un tamaño cm de columna de Sepharose CL2B 2,6 x 15. Además, se realizaron reacciones de reticulación pCMV que contenía cuatro antígenos polisacáridos en la misma reacción PCMV (antígenos por lotes), para producir PCMV muítivalentes . Los PCMV multivalentes contenían los siguientes "paquetes" de antígenos: • Paquete 1: PPS3 , PPS18C, PPS19F, PPS23F • Paquete 2: PPS4, PPS6A, PPS6B, PPS14 • Paquete 3: PPS5, PPS7F, PPS9V, PPS19A PPSl no se incluyó en las reacciones pCMV paquetes, ya que contiene una amina primaria en su estructura repetitiva que puede ser reticulado de forma covalente a la proteína portadora en presencia de glutaraldehído . Los PCMV-antígeno reunidos se separaron a continuación por SEC en la misma manera que los PCMV monovalentes. Las trece composiciones de vacuna separadas fueron combinados para hacer el 13 -valente combinado PPS-DNI- PCMV. Los tres PCMV antígeno lotes incluyendo el individuo PPS1-DNI PCMV también fueron combinados hacer un paquete PCMV 13 -valente lotes. Grupos de 10 ratones se inmunizaron utilizando el cóctel de PCMV monovalentes o el cóctel de PCMV-por lotes de antígeno. Para los PCMV monovalentes combinados, los ratones se les administró 2,2 mg o 6 mg de cada polisacárido . Para los haces por lotes, sin embargo, sólo 0,5 g de cada polisacárido fue entregado en cada dosis excepto para PPSl, donde fue entregado 2,2 g. Como controles, grupos de ratones fueron inmunizados con los 13 polisacáridos por sí solos o la vacuna conjugada Prevnar® 13. Cada dosis de Prevenar® contiene 2 g de cada polisacárido excepto PPS6B que está a 4 mg. Tabla 5 a continuación se presenta un resumen de los títulos de antígenos anti- PPS de ratones inmunizados con los PCMV paquetes combinados y por lotes .

Tabla 5. Títulos de antígenos Anti- PPS de 13-valente PCMV combinado (Tabla 5, continuación) Tanto de los "cócteles" PCMV suscitó polisacáridos títulos de antígenos específicos que fueron superiores a los provocados por los antígenos polisacáridos solos, sin embargo, que eran 2-a 200 veces menor que los títulos provocados por la vacuna Prevenar® 13 conjugado (Pfizer Inc., EE.UU.). Los resultados muestran que la agrupación de PCMV-por lotes de antígeno condujo a mayores títulos de antígenos para casi todos los antígenos en comparación con la inmunización con los PCMV monovalentes combinados. La disminución de la respuesta inmune de los cócteles pCMV en comparación con Prevnar® 13 era probablemente debido a la mala inmovilización de polisacárido y la separación de los PCMV desde el polisacárido libre, en lugar de a la cantidad de polisacárido entregado por dosis.

Ejemplo 8: PPS- CRMl97-aPLL PCMV Trivalente separado y Flagelina añadida Un PCMV trivalente que contiene PPS4, 18C, 23F y antígenos polisacáridos de neumococo y CRM197 como una proteína portadora formador de matriz y poli -L-lisina se realizó con y sin la flagelina. Los PCMV se prepararon como sigue: la mezcla de reacción PCMV contenía 4 mg/ml de polisacárido total de (1,33 mg/ml de cada polisacárido), 4 mg/ml de CRM 197 y 0,01% aPLL (150-300 kDa) . Los polisacáridos y aPLL se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con balanceo continuo antes de la adición de 0,25% de glutaraldehído . 0,001 mg/ml de flagelina de Salmonella typhimurium (InvivoGen, San Diego, CA, EE.UU.) también se añadieron a una PCMV mezcla de reacción con el glutaraldehído. Se continuó la incubación durante otros 30 minutos a temperatura ambiente con balanceo continua. Los productos de reacción pCMV se separaron en una columna Sephacryl S-1000 2,6 x 90 cm, y las fracciones de alto peso molecular se recogieron y se agruparon (ver, Figura 8, fracciones en caja). Después de la separación de la reacción en la columna, los niveles de proteína y polisacárido se determinaron utilizando de microBCA y antroensayo, respectivamente.

Los grupos de 10 ratones se inmunizaron como en los ejemplos anteriores utilizando ya sea el reunidos-antígeno PCMV sin flagelina o el pCMV- antígeno por lotes con flagelina y utilizado para inmunizar ratones. Los controles positivos y negativos fueron como en los ejemplos anteriores. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. títulos de antígenos Anti- PPS de trivalente incluido PPS- CR 197 PCMV En el PCMV que no contenía flagelina, los títulos de antígenos anti- PPS4 y PPS18 eran 59.000 veces y 3.055 veces superior a polisacárido solo y 11 veces y 22 veces mayor que Prevnar® 13, respectivamente, a una dosis comparable (véase la Tabla 7) . Los títulos a PPS23F fueron marginalmente más alta que polisacárido solo y menos de los provocados por Prevnar® lo que sugiere que sólo los bajos niveles de PPS23F fueron inmovilizados en la partícula PCMV. Estos datos comparan con los datos trivalente PPS-CRM197-sPLL pCMV anteriores (véase el Ejemplo 5) indican que el uso del peso molecular más alto a PLL como el policatión dio lugar a la mejora de inmovilización de antígeno en la matriz PCMV y que la selección juiciosa de los antígenos a los BE- co inmovilizado en la matriz de proteína, la eliminación de las especies no inmunogénicos , por ejemplo, por exclusión de tamaño de los componentes de bajo peso molecular de la matriz producto-formación de la reacción, el uso juicioso de elementos de potenciar con adyuvante, por ejemplo, la flagelina, y el control sensato de la cantidad de antígeno inmovilizado y entregable por dosis proporciona composiciones de vacuna pCMV de inmunogenicidad comparables e incluso superiores a los productos comerciales de vacunas de conjugado comercializados en la actualidad.

Ejemplo 9; 23-Valente PPS- CRM197 PCMV Con la mejora en la trampa de polisacárido y la inmunogenicidad observada con a -PLL (150-300 kDa) en el Trivalente PPS- PCMV, un 23 -valente PPS- PCMV se hizo con los 23 polisacáridos de la vacuna comercial Pneumovax®. Después de la desalación y concentración de los 23 polisacáridos de Pneumovax® a 4 mg/ml (0,17 mg/ml de cada polisacárido) , que se incubaron con 0,01% oc-PLL (150-300 kDa) durante 15 minutos a temperatura ambiente con balanceo constante. 0,25% de glutaraldehído se añadió junto con 4 mg/ml de CRM 197 y la incubación continuó durante 10 minutos a temperatura ambiente con balanceo constante antes de ser incubados durante 24 horas a 4o C con balanceo constante. La reacción PCMV se separó en un 2,6 cm x 90 cm de columna de Sephacryl S-1000 y la cantidad de polisacárido total y proteínas en las fracciones se determina usando el ensayo de antrona y el ensayo de microBCA, respectivamente (Figura 9). Las fracciones de alto peso molecular indicados por la caja en la Figura 9 se reunieron y se utilizaron para las inmunizaciones.

Los grupos de 10 ratones se inmunizaron como en los ejemplos anteriores. Los controles positivos y negativos fueron como en los ejemplos anteriores. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Anti-PPS GMT de 23-Valente PPS-CRMl97-aPLL (150-300 kDa) PCMV (Tabla 7, Continuación) El 23-valente PPS-PCMV suscitó GMT para PPSl, PPS14 y PPS18C que eran 77 veces, 4.9 veces, y 134 veces mayores que los provocados por la vacuna conjugada Prevenar® 13, mientras que el GMT para PPS3 y PPS19F eran equivalentes a la provocada por Prevnar® 13. En el PCMV 23- valente de acuerdo con esta invención, sólo 0.26 g de cada polisacárido fue entregado por dosis, mientras que cada dosis de Prevnar® 13 contiene 2.2 g de cada polisacárido (excepto PPB6B que es al 4 g) , lo que indica la 23-valente PCMV fue capaz de obtener títulos más altos que Prevnar® 13 durante varios polisacáridos a una dosis 7 veces menor. Aunque los GMT para los otros polisacáridos ensayados en este experimento fueron menos inmunogenicidad que los provocados por Prevnar® 13 todavía eran generalmente más alto que el polisacárido solo.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende (1) uno o más antígenos de interés, (2) una o más proteínas portadoras, y (3) uno o más policationes , en donde dicha proteína portadora y opcionalmente dicho polication se reticuladan para formar una matriz de proteína y dicho antígeno de interés está inmovilizado por dicha matriz de proteína.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polication se selecciona del grupo que consiste de: poli-L-lisina, poli-L-arginina, polietilenimina ramificada (PEI), espermidina, espermina, quitosán [ß- (1-4) -copolímero cruzado de 2-amino-2-detoxi-S-D-glucan (GlcN) y 2-acetamido-detoxi-fé-D-glucan (GlcNAc)], Poliamina N7 (CAS 29320-38-5) y Etilenediaminometil poliestireno (CAS 177987-93-8) .

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque dicho polication es poli-L-lisina (PLL) .

4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque poli-L-lisina es a-poli-L-lisina ( -PLL) o e-poli-L-lisina (8--PLL) .

5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque dicha poli-L-lisina es a-poli-L-lisina (a-PLL) .

6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque dicha composición se comprende de partículas de matriz de proteína que tienen un tamaño de partícula promedio mayor que 50 nm de diámetro.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque dicha composición comprende partículas de matriz de proteína que tienen un diámetro de tamaño de partícula promedio mayor a 100 nm-2000 nm.

8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la relación molar de antígeno a la proteína portadora es entre 1 a 10 a 1.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el porcentaje de policatión por mezcla de reacción es de 0.005 a 0.10%.

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho antígeno de interés comprende dos o más antígenos .

11. La composición de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho antígeno de interés es un polisacarido.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de Streptococcus pneumoniae polisacárido, Francisella tularensis polisacárido, Bacillus antracis polisacárido, Hemophilus influenzae polisacárido, Salmonella typhi polisacárido, Cirobacter freundii polisacárido, Salmonella species polisacárido, Shiella polisacárido, o Neisseia meningitidis polisacárido.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque dicho Streptococcus pneumoniae polisacárido se selecciona del grupo que consiste de tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 o 46.

14. La composición de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque una o más proteínas portadoras se seleccionan del grupo que consiste de difteria toxoide, CRM197, tetanus toxoide, Pseudomonas aeruginosa exotonina A o un mutante del mismo, subunidad de toxina B de cólera, fragmento C de toxina tetanus, flagelina bacteriana, neumolisina, una proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis , proteína Pseudomonas aeruginosa Hep 1, enterotoxina lábil al calor Escherichia coli, toxina tipo shiga, proteína LTB humana, listeriolisina 0, un extracto de proteína de células bacterianas totales, el mutante inhibidor negativo dominante (DNI) del antígeno protector de Bacillus anthracis o beta-galactosidasa Escherichia coli.

15. Un método para hacer una composición inmunogénica que comprende (i) mezclar un antígeno de interés con una proteína portadora para formar una mezcla y (ii) reticular dicha proteína portadora y polication para formar una matriz de proteína portadora que inmovilice dicho antígeno de interés .

16. Un método para producir una respuesta inmune en un mamífero para un antígeno de interés, dicho método que comprende administrar a dicho mamífero una composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque dicho mamímero es un humano .

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque dos o más composiciones inmunogénicas de conformidad con cualquiera de las reivindicaicones 1-14.

19. Un método para vacunar un sujeto contra un agente infeccioso, dicho método que comprende administrar una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 a un sujeto en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune.