BR112013029417B1

BR112013029417B1 - Composições de vacina de matriz proteica incluindo policátions e método de preparo das mesmas

Info

Publication number: BR112013029417B1
Application number: BR112013029417-5A
Authority: BR
Inventors: Kevin P. Killeen; Robert T. Cartee
Original assignee: Matrivax, Inc
Priority date: 2011-05-18
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2022-10-25
Also published as: KR20140045416A; US20140086989A1; MX2013013358A; ZA201309516B; MX349657B; AU2012255878B2; DK2709656T3; CA2836251C; JP6072777B2; JP2014513726A; KR101670340B1; US9724401B2; CN103747798B; EP2709656A1; AU2012255878A1; EP2709656B1; ES2728653T3; WO2012158701A1; BR112013029417A2; CN103747798A

Abstract

COMPOSIÇÕES DE VACINA DE MATRIZ PROTEICA INCLUINDO POLICÁTIONS. A presente invenção refere-se a composições imunogênicas con-tendo um ou mais antígenos de interesse, uma ou mais proteínas carreadoras, assim como um ou mais policátions, em que o antígeno de interesse é retido com a matriz proteica carreadora reticulada e um ou mais policátions, métodos de preparo de tais vacinas, e métodos para administração da vacina.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório US n° 61/487.663 depositado em 18 de maio de 2011, cujos conteúdos são aqui incorporados em sua totalidade.

Campo da Invenção

[0002] A invenção refere-se a composições imunogênicas, métodos de preparo de vacinas e métodos para administração da vacina. Especificamente, a invenção refere-se a vacinas de matriz proteica que caracterizam um antígeno de interesse retido em uma matriz proteica carreadora reticulada, em que poli-L-lisina ou outro(s) policátions(s) são utilizados na formação da matriz proteica de retenção de antígeno.

Antecedentes da Invenção

[0003] A vacinação contra infecções bacterianas é uma importante busca médica, que representa uma intervenção médica preventiva recomendada para praticamente todos os indivíduos. A concepção de vacinas para combater a infecção bacteriana ou a patogênese de infecção bacteriana muitas vezes tem como alvo proteínas bacterianas, como a toxina produzida por uma bactéria. Tal é o caso, por exemplo, em vacinas contra o antraz, difteria e tétano. Outra abordagem da vacina tem como alvo a cápsula externa de uma bactéria, no entanto, muitos dos antígenos compreendendo camada da cápsula de um agente patogênico bacteriano estimulam pouca ou nenhuma resposta imunitária de longo prazo, o que complica a sua utilização na criação de vacinas eficazes. Cápsulas formam a superfície externa de muitas bactérias e são tipicamente compostas de polímeros de compostos orgânicos, como carboidratos, aminoácidos ou álcoois. As cápsulas são quimicamente muito diversificadas. Para cápsulas à base de polissacarídeos, as unidades de açúcar podem estar ligadas entre si em várias configurações moleculares e podem ser ainda substituídas com fosfato, nitrogênio, sulfato e outras modificações químicas. As cápsulas podem ser um fator de virulência, inibindo micróbios de serem eficientemente fagocitados e mortos por macrófagos hospedeiros e leucócitos polimorfonucleares.

[0004] Os anticorpos contra cápsulas proporcionam uma potente defesa contra organismos encapsulados potentes mediando a fixação do complemento na superfície microbiana, o que pode resultar na lise ou opsonização bacterianas, absorção e morte por células imunológicas hospedeiras fagocíticas. Os anticorpos mais potentes contra cápsulas microbianas são anticorpos IgG. Antígenos capsulares são geralmente classificados como antígenos T-independentes visto que eles provocam respostas imunitárias que não envolvem a ajuda de células T e, por conseguinte, não provocam respostas duradouras de memória imunológica. No entanto, o acoplamento covalente de uma proteína a um antígeno capsular torna o antígeno capsular “T-dependente”, e tais antígenos T-dependentes então provocam uma resposta da célula B de memória à base de IgG mediada por célula T auxiliar, ou anamnésica.

[0005] Têm sido estudados vários métodos para tornar antígenos de vacina mais imunogênicos e idealmente T-dependentes. A maioria dos polissacarídeos de superfície bacteriana é imunogênica por si mesma e é capaz de desencadear uma resposta imunitária que irá reconhecer o antígeno de ocorrência natural na cápsula microbiana. No entanto, quando os polissacarídeos capsulares são usados como vacinas, eles geralmente não promovem a imunidade de longa duração, nem são muito eficazes na imunização de crianças com menos de 2 anos de idade. Tem sido demonstrado que a ligação covalente de um antígeno polissacarídeo a uma proteína carreadora pode aumentar significativamente a imunogenicidade do polissacarídeo e promover a resposta imune T-dependente desejada (ou memória imunológica) que leva à proteção do hospedeiro contra infeções subsequentes pelo microrganismo que carrega antígeno. Por exemplo, uma vacina pneumocócica não conjugada, tal como a Pneumovax® da Merck, é eficaz contra doenças pneumocócicas invasivas em indivíduos, mas é ineficaz (por exemplo, em crianças) em induzir a memória imunológica e a imunidade de proteção desejada que iria provocar uma imunidade de longa duração e evitar a necessidade de repetidas imunizações. Vacinas pneumocócicas conjugadas, como Prevnar® da Pfizer (Pfizer Inc., EUA), têm mostrado que são altamente imunogênicas, mesmo em crianças de 2 meses de idade, induzem imunidade T-dependente e são altamente eficazes.

[0006] No entanto, enquanto as vacinas conjugadas são imunologicamente promissoras, elas podem ser extremamente difíceis e complicadas (e caras) para fabricar, desencorajando significativamente sua distribuição àqueles que necessitam de vacinação em todo o mundo. Por exemplo, no caso da Prevnar®7, cada cepa de S. pneumoniae usada para proporcionar os sete antígenos polissacarídeos utilizados para conjugação é desenvolvida em um biorreator; as células são colhidas; o polissacarídeo é extraído, purificado, hidrolisado ao tamanho apropriado; os antígenos individuais são então conjugados a um carreador de proteína; o conjugado é novamente purificado, misturado com os 6 outros complexos adicionais de polissacarídeo-proteína (conjugados) que foram preparados de uma maneira similar; e a mistura de múltiplos conjugado é finalmente adjuvada com alúmen. Estima-se que existem mais de 200 etapas de GMP para a fabricação da vacina heptavalente Prevnar®.

[0007] Recentemente, as vacinas de matriz proteica têm sido propostas como uma alternativa para as vacinas conjugadas. Veja o pedido de patente US publicado n° US-2008-0095803 (Mekalanos, J.), publicado em 24 de abril de 2008; publicação do pedido de patente internacional n° WO 2008/021076 (Mekalanos, J.), publicada em 21 de fevereiro de 2008; e publicação do pedido de patente internacional n° WO 2011/031893 (Killeen, K., et. al.), publicada em 17 de março de 2011), aqui incorporados por referência. Em vez da conjugação covalente de um antígeno de interesse a um carreador, uma vacina de matriz proteica retém o antígeno em uma matriz proteica carreadora, preparada por reticulação da proteína carreadora na presença do antígeno desejado. É evitada a ligação covalente significativa do antígeno à proteína carreadora; em vez disso, o antígeno permanece associado com a matriz, tornando-se retido pelo carreador de proteína durante a formação da matriz (reação de reticulação). Demonstrou-se que tais vacinas de matriz proteica provocam uma maior imunogenicidade do que as vacinas preparadas utilizando apenas o antígeno; e as vacinas de matriz proteica podem também provocar o tipo de resposta imune (isto é, a indução da imunidade T-dependente) visto com vacinas conjugadas. A síntese de vacinas de matriz proteica não envolve reações de conjugação complicadas, e tipicamente requer menos etapas de processamento, o que torna as vacinas de matriz proteica, por sua vez, menos caras de fabricar do que uma vacina conjugada.

[0008] Embora as vacinas de matriz proteica proporcionem diversas vantagens, a titulação de anticorpos específicos para o antígeno provocada por vacinas de matriz proteica é muitas vezes menor do que a titulação provocada por uma vacina conjugada correspondente. O documento WO 2011/031893 ensina que a separação das vacinas de matriz proteica por cromatografia de exclusão de tamanho e seleção das frações que contêm partículas de matriz proteica de elevado peso molecular para imunização podem levar a titulações semelhantes àquelas induzidas por vacinas de polissacarídeos conjugados. No entanto, é um problema técnico persistente no campo a provisão de um meio para a produção de vacinas de matriz proteica de imunogenicidade aumentada, de modo a explorar a promessa científica e as vantagens de fabricação e custo desta tecnologia emergente. Existe uma necessidade continuada de vacinas de matriz proteica melhoradas com imunogenicidade ou potência intensificada.

Sumário da Invenção

[0009] Um avanço surpreendente na eficácia e rendimento de vacinas de matriz proteica tem sido alcançado com vacinas preparadas de acordo com a presente invenção, em que poli-L-lisina (PLL), ou outro policátion, é utilizada na formação da matriz proteica de retenção para um polissacarídeo ou outro antígeno. Assim, a qualidade e o rendimento de vacinas de matriz proteica têm sido melhorados não por modificação do(s) antígeno(s), mas por atenção à natureza e composição da matriz utilizada para reter o(s) antígeno(s).

[00010] Aqui descritas são novas vacinas de matriz proteica e métodos para melhorar a retenção de polissacarídeo com a matriz, utilizando policátions contendo amina primária.

[00011] Uma modalidade da invenção é uma composição imunogênica que compreende (1) um ou mais antígenos de interesse, (2) uma ou mais proteína carreadora, e (3) um ou mais policátions, em que a referida proteína carreadora e opcionalmente o referido policátion são reticulados para formar uma matriz proteica, e o referido antígeno de interesse é retido pela referida matriz proteica. Tais composições podem ser facilmente preparadas por mistura do antígeno, proteína carreadora e componentes de policátion, iniciando uma reação de reticulação para provocar a reticulação da proteína carreadora e / ou policátion. As composições de vacina de matriz proteica que incorporam um policátion, por exemplo, α-PLL, de acordo com a presente invenção, têm imunogenicidade aumentada em relação ao antígeno sozinho, em comparação com uma mistura de antígeno e carreador, e em comparação com uma composição de vacina de matriz proteica que não incorpora um policátion.

[00012] Em uma modalidade preferida, o um ou mais policátions da composição imunogênica é selecionado a partir do grupo que consiste em: poli- L-lisina, poli-L-arginina, poli-ornitina, espermidina, espermina, quitosana [um copolímero ligado a β-(1-4) de 2-amino-2-des0xi-β-D- glucano (GlcN) e 2-acetamido-2-des0xi-β-D-glucano (GlcNAc)], polietilenimina (PEI) ramificada, Poliamina N7 (CAS 29320-38-5) e Etilenodiaminometil poliestireno (CAS 177987-93-8). Em modalidades desejáveis, o dito policátion é poli-L-lisina (PLL).

[00013] Em modalidades adicionais desejáveis, a referida poli-L- lisina é alfa poli-L-lisina (α-PLL ; αPLL ou épsilon poli-L-lisina (ε-PLL; εPLL).

[00014] Em modalidades preferidas, a referida composição é constituída por partículas de matriz proteica com um tamanho de partícula médio superior a 50 nm de diâmetro. Tais composições podem ser facilmente preparadas por mistura do antígeno, proteína carreadora e componentes de policátion, iniciando uma reação de reticulação para provocar a reticulação da proteína carreadora e / ou policátion, seguida de processamento dos produtos da reação para eliminar espécies de peso molecular menor.

[00015] Uma modalidade da invenção é uma composição de vacina contendo um antígeno de interesse e uma matriz de policátion / proteína carreadora, em que o antígeno é retido com a matriz de policátion / proteína carreadora para formar um complexo. Em modalidades desejáveis da invenção, o complexo de matriz de policátion / proteína carreadora / antígeno tem um diâmetro de tamanho médio de partícula superior a 50 nm. Em modalidades mais desejáveis da invenção, o complexo tem um diâmetro de tamanho médio de partícula superior a 100 nm, superior a 150 nm, superior a 200 nm, superior a 500 nm, superior a 1000 nm, superior a 2000 nm, ou mesmo superior, por exemplo, aos limites da metodologia para separação das partículas de matriz proteica. Ainda em modalidades mais desejáveis da invenção, os complexos de matriz de policátion / proteína carreadora / antígeno da composição de vacina irá abranger um intervalo de tamanhos de partículas acima de 50 nm de diâmetro, tal como 50 - 2000 nm de diâmetro, ou seleções dentro desse intervalo, por exemplo, 100 - 200 nm, 200 - 400 nm, 250 - 500 nm, 120 - 1000 nm, 200 - 2000 nm, e outros intervalos de tamanho de partícula similares. Em ainda outras modalidades desejáveis da invenção, a composição inclui complexos com tamanhos de partículas de 50 - 150 nm de diâmetro.

[00016] Em modalidades adicionais desejáveis da presente invenção, a razão molar do antígeno para a proteína carreadora é entre 1 para 10 e 10 para 1.

[00017] Em modalidades preferidas, o percentual de policátion em peso na mistura reacional é de 0,005 a 0,10%, ou no intervalo de 0,05 mg / ml - 0,5 mg / ml.

[00018] Em modalidades adicionais desejáveis, a composição imunogênica inclui ainda dois ou mais antígenos de interesse, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou mais antígenos de interesse.

[00019] Em modalidades desejáveis da invenção, as composições de vacina de matriz proteica da invenção, quando administradas a um mamífero, provocam uma resposta imune dependente de células T no mamífero (ou seja, produzem memória imunológica no hospedeiro vacinado).

[00020] Em modalidades desejáveis da invenção, o referido antígeno de interesse é um polissacarídeo.

[00021] Em modalidades adicionais desejáveis da invenção, o polissacarídeo é selecionado a partir do grupo constituído por um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae, polissacarídeo de Francisella tularensis, polissacarídeo de Bacillus anthracis, polissacarídeo de Haemophilus influenzae, polissacarídeo de Salmonella Typhi, polissacarídeo de Citrobacter freundii, polissacarídeo de espécies de Salmonella, polissacarídeo de Shigella ou polissacarídeo de Neisseria meningitidis. O-antígenos de bactérias gram-negativas, parte de LPS (lipopolissacarídeo) que é única e muitas vezes um antígeno protetor para infecção bacteriana, são também antígenos adequados de interesse para utilização na presente invenção.

[00022] Em modalidades mais desejáveis da invenção, o referido polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae é selecionado a partir de um ou mais polissacarídeos do grupo que consiste em tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 e 46.

[00023] Em modalidades preferidas, a uma ou mais proteína carreadora é selecionada a partir do grupo que consiste em toxoide da difteria, por exemplo, o fragmento de proteína da toxina de difteria não tóxico CRM197, toxoide do tétano, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um seu mutante, subunidade da toxina B da cólera, fragmento C da toxina do tétano, flagelina bacteriana, pneumolisina, uma proteína da membrana externa de Neisseria menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina lábil ao calor de Escherichia coli, toxina semelhante a shiga, proteína LTB humana, listeriolisina O, um extrato de proteína de células bacterianas inteiras, o mutante inibidor negativo dominante (DNI) do antígeno protetor de Bacillus anthracis, ou beta-galactosidase de Escherichia coli.

[00024] Em modalidades desejáveis da invenção, a composição imunogênica compreende um antígeno de interesse retido em uma matriz de policátion / proteína carreadora e inclui ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00025] Em modalidades preferidas, a invenção apresenta outro método de produzir uma composição de vacina. Este método envolve (i) mistura de um ou mais antígenos de interesse, uma ou mais proteínas carreadoras e um ou mais policátions e (ii) adição de um agente de reticulação capaz de formar reticulações entre moléculas de proteína carreadora, entre diferentes sítios da mesma molécula de proteína carreadora, e / ou entre a molécula de proteína carreadora e o policátion, e (iii) iniciação de uma reação de reticulação. Em modalidades adicionais, o método de fabricação de uma vacina de acordo com a invenção também inclui outra etapa (iv) de seleção opcional dos complexos de produtos da reação de reticulação tendo um diâmetro de tamanho de partícula maior do que 50 nm. Em certos casos em que os grupos reativos do reagente de reticulação e os sítios reativos da proteína carreadora irão reagir sob contato, as etapas de mistura e de iniciação (ii) e (iii) irão ocorrer em simultâneo, ou podem ser consideradas uma etapa. Além disso, pode ser vantajoso arrefecer a reação de reticulação através da inclusão de uma etapa após a etapa de iniciação da reação de atenuar a reação de reticulação, por exemplo, por adição de um agente de arrefecimento ou de bloqueio adequado.

[00026] Em modalidades desejáveis da invenção, a invenção apresenta um método para provocar uma resposta imune em um mamífero a um antígeno de interesse, ou a vacinação de um indivíduo contra um agente infeccioso, o método compreendendo a administração ao mamífero ou indivíduo de uma composição imunogênica tal como aqui descrito. Em modalidades preferidas, o mamífero é um ser humano.

[00027] Em outras modalidades desejáveis da invenção, a presente invenção apresenta uma composição de vacina compreendendo duas ou mais composições imunogênicas aqui descritas.

[00028] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada, desenhos e reivindicações a seguir.

Breve Descrição dos Desenhos

[00029] A figura 1 é um gráfico que mostra a separação de reações de PCMV de Vi-CRM197, com e sem poli-L-lisina (PLL), por cromatografia de exclusão de tamanho. O polissacarídeo Vi sozinho, uma reação de PCMV de Vi-CRM197 que continha PLL, e uma Vi-CRM- PCMV que não continha PLL foram separados em uma coluna de 500 mL (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. A quantidade de polissacarídeo Vi nas frações foi determinada utilizando o teste Stains- all.

[00030] A figura 2 é um gráfico que mostra a separação de uma PCMV de Vi-CRM197-αPLL (150-300 kDa) por meio de cromatografia de exclusão de tamanho. A reação de PCMV foi separada em uma coluna de 150 ml (30 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-100. A quantidade de polissacarídeo Vi e proteína nas frações foi determinada utilizando o teste Stains-all e teste microBCA, respectivamente. Caixa sombreada indica frações que foram reunidas e utilizadas para imunização de camundongos no teste pré-clínico.

[00031] A figura 3 é um gráfico que mostra a separação de PCMV de Vi-CRM197-αPLL (150-300 kDa) por cromatografia de exclusão de tamanho. A reação PCMV foi separada em uma coluna de 500 ml (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. A quantidade de polissacarídeo Vi e proteína nas frações foi determinada utilizando o teste Stains-all e teste microBCA, respectivamente. As caixas sombreadas indicam frações que foram reunidas e utilizadas para imunização de camundongos no teste pré-clínico.

[00032] A figura 4 é um gráfico que mostra a separação de polissacarídeo pneumocócico 18C (PPS18C) e um PPS18C-CRM- αPLL(15-30 kDa)-PCMV por cromatografia de exclusão de tamanho. PPS18C e uma PPS18C-CRM-PLL-PCMV foram separadas em uma coluna de 500 mL (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. A quantidade de polissacarídeos nas frações foi determinada utilizando o teste de Antrona e a quantidade de proteína foi determinada utilizando o teste de proteína microBCA.

[00033] A figura 5 é um gráfico que mostra o aumento na quantidade de Vi retido com o aumento da quantidade αPLL. 4 mg / mL Vi foram adicionados a reações pCMV contendo 0,01% de αPLL (150-300 kDa); 0,02% de αPLL (150-300 kDa) ou 0,04% de αPLL (15-30 kDa). Depois da adição de glutaraldeído e CRM197, as reações foram separadas em uma coluna de exclusão de tamanho de 500 ml (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. As frações foram analisadas quanto a polissacarídeo e proteína utilizando o teste Stains-all e teste microBCA, respectivamente.

[00034] A figura 6 é um gráfico que mostra a separação de uma PCMV de PPS (PPS4, PPS18C, PPS23F)-CRM197-εPLL trivalente em lotes por cromatografia de exclusão de tamanho. Três polissacarídeos de pneumococos (1,3 mg / mL cada de PPS4, PPS18C e PPS23F) foram adicionados a uma única reação de PCMV. A reação foi separada em uma coluna de 500 mL (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. As frações da coluna foram analisadas quanto a polissacarídeo total e proteína utilizando os testes de Antrona e microBCA, respectivamente. A caixa sombreada indica as frações que foram agrupadas quanto à imunização de camundongos em um teste pré-clínico de imunogenicidade.

[00035] A figura 7 é um gráfico que mostra a separação de uma PCMV de PPS-CRM197-αPLL (150-300 kDa) 13-valente em lotes por cromatografia de exclusão de tamanho. Os 13 polissacarídeos pneumocócicos presentes na vacina conjugada Prevnar® foram adicionados a uma única reação de PCMV (0,3 mg / mL de cada polissacarídeo). A reação foi separada em uma coluna de 500 mL (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. As frações da coluna foram analisadas quanto a polissacarídeo total e proteína utilizando o teste Atrona e microBCA, respectivamente. A caixa sombreada indica as frações que foram agrupadas quanto à imunização de camundongos em um teste pré-clínico de imunogenicidade.

[00036] A figura 8 é um gráfico que mostra a separação de PCMV de PPS (PPS4, PPS18C, PPS23F)-CRM197-αPLL (150-300 kDa) trivalente em lotes por cromatografia de exclusão de tamanho. Três polissacarídeos de pneumococos (1,3 mg / mL cada de PPS4, PPS18C e PPS23F) foram adicionados a uma única reação de PCMV. A reação foi separada em uma coluna de 500 ml (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. As frações da coluna foram analisadas quanto a polissacarídeo total e proteína utilizando os testes de Antrona e microBCA, respectivamente. A caixa sombreada indica as frações que foram agrupadas quanto à imunização de camundongos em um teste pré- clínico de imunogenicidade.

[00037] A figura 9 é um gráfico que mostra a separação de uma PCMV de PPS-CRM197-αPLL(150-300 kDa) 23-valente em lotes por cromatografia de exclusão de tamanho. Os 23 polissacarídeos presentes na vacina Pneumovax® de apenas polissacarídeos foram adicionados a uma única reação de PCMV (0,17 mg / mL de cada polissacarídeo). A reação foi separada em uma coluna de 500 ml (90 cm x 2,6 cm) de Sephacryl S-1000. As frações da coluna foram analisadas quanto a polissacarídeo total e proteína utilizando os testes de Antrona e microBCA, respectivamente. A caixa sombreada indica as frações que foram agrupadas quanto à imunização de camundongos em um teste pré-clínico de imunogenicidade.

Descrição Detalhada da Invenção

[00038] Vacinas de matriz proteica, e em particular vacinas de matriz capsular proteica (pCMVS), estão descritas na publicação de patente US US- 2008-0095803 (Mekalanos, J.), publicada em 24 de abril de 2008; publicação de pedido de patente internacional n° WO 2008/021076 (Mekalanos, J.), publicada em 21 de fevereiro de 2008; e publicação pedido internacional de patente n° WO 2011/031893 (Killeen, K., et al.), publicado em 17 de março de 2011, todas aqui incorporadas em sua totalidade. Estas publicações ensinam que as vacinas de matriz proteica têm as potentes propriedades imunológicas de típicas vacinas conjugados PS-proteína, mas desejavelmente diferem de vacinas conjugadas pelo fato de que não ocorre nenhuma ligação covalente significativa para acoplar o antígeno de interesse à proteína carreadora. Assim, as vacinas de matriz proteica (complexos de matriz de proteína carreadora / antígeno) são distintas de vacinas conjugadas convencionais, em que o antígeno é covalentemente ligado a um carreador. Em uma vacina de matriz proteica, o antígeno de interesse, por exemplo, polissacarídeos, polímeros orgânicos capsulares ou outro antígeno, é retido dentro de uma matriz de proteína carreadora.

[00039] Quando um biopolímero capsular ou polissacarídeo de um agente patogênico é retido em uma matriz de proteína reticulada, tais vacinas são denominadas vacinas de matriz capsular proteica (PCMVs). Como descrito nos documentos WO 2008/021076 e US 2008-0095803, PCMVs foram produzidas incluindo aquelas à base de antígeno capsular T-independentes modelo, ácido poli-gama-D-glutâmico (PGA), assim como ácido algínico (alginato) e dextrano, e a proteína carreadora exemplar, mutante Inibidor Negativo Dominante (DNI). DNI é uma forma mutada de Antígeno Protetor (PA) de B. anthracis e foi produzido a partir de Escherichia coli pelo método de Benson, et al., Biochemistry, 37:3941-3948 (1998). Outras modalidades de PCMV, bem como as vantagens do fracionamento de tamanho das partículas de PCMV são descritas no documento WO 2011/031893.

[00040] A presente invenção refere-se às descobertas e observações feitas em relação ao aumento da imunogenicidade e produção das composições de vacina de matriz proteica através de uma melhor retenção do antígeno no interior da matriz proteica.

[00041] A fim de que a invenção possa ser mais claramente compreendida, as seguintes abreviaturas e termos são utilizados como definido abaixo.

[00042] Uma composição ou método aqui descrito como “compreendendo” um ou mais elementos ou etapas denominadas é abrangente, significando que os elementos ou etapas mencionadas são essenciais, mas outros elementos ou etapas podem ser adicionados dentro do escopo da composição ou método. Para evitar prolixidade, entende-se também que qualquer composição ou método descrito como “compreendendo” (ou que “compreende”) um ou mais elementos ou etapas denominadas também descreve a composição ou método correspondente mais limitado ou método “consistindo essencialmente em” (ou que “consiste essencialmente em”) os mesmos elementos ou etapas denominadas, significando que a composição ou método inclui os elementos ou etapas essenciais denominadas e pode também incluir elementos ou etapas adicionais que não afetam materialmente a(s) característica(s) básicas e novas da composição ou método. Também é entendido que qualquer composição ou método aqui descrito como “compreendendo” ou “consistindo essencialmente em” um ou mais elementos ou etapas também denominadas descreve a composição ou método correspondente, mais limitado, e restrito “consistindo em” (ou “consiste em”) os elementos ou etapas denominadas para a exclusão de qualquer outro elemento ou etapa não identificada. Em qualquer composição ou método aqui descrito, equivalentes conhecidos ou descritos de qualquer elemento ou etapa essencial denominada podem ser substituídos por outro elemento ou etapa. Também é entendido que um elemento ou etapa “selecionada a partir do grupo que consiste em” refere-se a um ou mais dos elementos ou etapas na lista que se segue, incluindo combinações de quaisquer dois ou mais dos elementos ou etapas indicadas.

[00043] O termo “administração”, tal como aqui utilizado em conjunto com uma composição de vacina, significa fornecer a composição de vacina a um indivíduo tal como um indivíduo humano em uma dose suficiente para induzir uma resposta imune no indivíduo, em que a resposta imune resulta na produção de anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno contido na composição de vacina (ou seja, cujo antígeno, em vacinas terapêuticas, corresponde a um marcador antigênico em um agente patogênico). Administrar desejavelmente inclui injeção intramuscular, injeção intradérmica, injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou transcutânea, inalação ou ingestão, como apropriado para a forma de dosagem e a natureza e atividade da composição de vacina a ser administrada. Administrar pode envolver uma administração única de uma vacina ou administração de uma vacina em doses múltiplas. Desejavelmente, uma segunda administração (“reforço”) é concebida para aumentar a produção de anticorpos em um indivíduo para prevenir a infecção por um agente infeccioso. A frequência e a quantidade de dosagem da vacina dependem da atividade específica da vacina e podem ser facilmente determinadas por experimentação de rotina.

[00044] O termo “reticulação” (cross-link) ou “reticulação” (crosslink) refere-se à formação de uma ligação covalente entre duas moléculas, macromoléculas ou combinação de moléculas, por exemplo, moléculas de proteína carreadora, ou entre dois sítios da mesma molécula, por exemplo, dois resíduos de aminoácidos da mesma proteína, ou entre moléculas de proteína carreadora e moléculas de policátion, quer diretamente, quando um ligante “de comprimento zero” é utilizado (criando uma ligação direta), ou pelo uso de uma molécula reticuladora bifuncional que forma uma ponte ou ligação molecular entre dois sítios reativos.Agentes de reticulação bifuncionais apresentam dois grupos funcionais, cada um capaz de formar uma ligação covalente com uma das duas moléculas distintas, ou entre dois grupos separados na mesma molécula (isto é, de modo a formar “loops” ou “dobras” dentro de uma molécula, tal como uma proteína carreadora). Ligantes exemplificativos incluem agentes de reticulação bifuncionais que são capazes de reticular duas moléculas de proteína carreadora e / ou duas moléculas de policátion e / ou uma molécula de proteína carreadora com uma molécula de policátion.

[00045] O termo “antígeno” tal como aqui utilizado refere-se a qualquer molécula ou combinação de moléculas que é especificamente ligada por um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

[00046] O termo “agente de reticulação bifuncional” ou “ligante bifuncional” como aqui utilizado significa um composto que tem dois grupos funcionais, cada um separadamente capaz de formar uma ligação covalente com grupos reativos em duas moléculas separadas, átomos, coleções de moléculas que se deseja unir. Ligantes bifuncionais exemplares são descritos, por exemplo, por G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996) e Dick e Beurret, “Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens” em Conjugate Vaccines (Cruse e Lewis, eds), Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989, vol.10, pp. 48-114). Desejavelmente, um ligante bifuncional é o glutaraldeído, bis[sulfosuccinimidil]suberato ou adipimidato de dimetila.

[00047] O termo “ligante” ou “agente de reticulação” tal como aqui utilizado refere-se a um composto capaz de formar uma ligação química covalente ou ponte que une duas ou mais moléculas, ou dois ou mais sítios na mesma molécula. Ligantes desejáveis incluem, por exemplo, glutaraldeído ou outros dialdeídos da fórmula OHC-R-CHO, onde R é uma porção alquileno divalente linear ou ramificada de 1 a 12 átomos de carbono, uma porção heteroalquila divalente linear ou ramificada de 1 a 12 átomos, uma porção alquenileno divalente linear ou ramificada de 2 a 12 átomos de carbono, uma porção alquinileno divalente linear ou ramificada de 2 a 12 átomos de carbono, um radical aromático divalente de 5 a 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 a 10 átomos, -(CH2CH2O)qCH2CH2- em que q é 1 a 4, ou uma ligação química direta que une dois grupos aldeído. Ligação pode ser direta sem o uso de uma molécula de ligação (ponte). Por exemplo, um grupo carboxila, por exemplo, na cadeia lateral de um resíduo Asp ou Glu em um grupo carboxila da proteína carreadora pode ser ligado diretamente a um grupo amino livre, por exemplo, na cadeia lateral de um resíduo Lys, utilizando química de carbodiimida ou enzimaticamente usando transglutamidases que catalisam a reticulação entre grupos amino livres e grupos carboxamida, por exemplo, de resíduos Gln.

[00048] O termo “reforçar” no contexto de provocar a produção de anticorpos refere-se à ativação de células B de memória que ocorre durante um segundo a exposição a um antígeno. Isto é também referido como uma “resposta de reforço” e é indicativo de uma resposta imune de memória “secundária” de longa duração, o que resulta na capacidade de longa duração para a produção de anticorpos.

[00049] O termo “proteína carreadora”, no contexto de uma composição de vacina, refere-se a uma proteína utilizada em uma composição de vacina que provoca uma resposta imune a si própria e / ou a um antígeno associado com ou complexado com tal proteína carreadora e policátion. Em uma composição de vacina de matriz proteica da presente invenção, um antígeno é retido dentro de uma matriz de proteínas carreadoras são reticuladas umas com as outras e / ou policátions, preferencialmente sem ligação covalente significativa de antígeno à matriz. Em uma composição de vacina conjugada, um antígeno é reagido com uma proteína carreadora, de modo que o antígeno e a proteína carreadora são covalentemente ligados um ao outro, pelo seu design. Desejavelmente, a proteína carreadora contém epitopos reconhecidos por uma célula T-auxiliar. Também abrangidos pela definição de uma “proteína carreadora” estão os peptídeos multiantigênicos (MAPs), que são peptídeos ramificados que possuem uma pluralidade de sítios reativos. Desejavelmente, o MAP inclui resíduos lisina (Lis). Proteínas carreadoras desejáveis exemplares incluem toxinas e toxoides (químicos ou genéticos), que podem ser mutados, por exemplo, para reduzir a reatogenicidade. Proteínas carreadoras adequadas incluem, por exemplo, a toxina da difteria ou um mutante não tóxico, por exemplo, o toxoide da difteria, a toxina do tétano ou um seu mutante não tóxico, por exemplo, o toxoide do tétano, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um seu mutante não tóxico, subunidade B da toxina da cólera, o fragmento C da toxina do tétano, flagelina bacteriana, pneumolisina, listeriolisina O (LLO e moléculas relacionadas), uma proteína da membrana externa de Neisseria menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina lábil ao calor de Escherichia coli, toxina semelhante a shiga, LTB proteína humana, um extrato de proteína de células bacterianas inteiras, o mutante inibidor negativo dominante (DNI) do Antígeno Protetor de Bacillus anthracis, ou beta-galactosidase de Escherichia coli, ou qualquer outra proteína que pode ser reticulada para formar uma matriz capaz de reter um antígeno de interesse.

[00050] O termo “retido”, tal como aqui utilizado em referência a um antígeno significa associação ou complexação de um antígeno com uma proteína carreadora e policátion, em particular, uma proteína carreadora reticulada opcionalmente também reticulada com uma molécula policatiônica para formar uma matriz que forma associação ou complexo com o antígeno, de tal modo que o antígeno permanece no complexo com a proteína carreadora e o policátion sob condições fisiológicas. Desejavelmente, o antígeno é retido em um complexo com proteínas carreadoras e policátion na ausência de ligação covalente significativa entre o antígeno e uma proteína carreadora / policátion. “Ausência de ligação covalente significativa”, tal como aqui utilizado, refere-se a não mais do que 50% do antígeno sendo ligados de forma covalente a uma proteína carreadora. Desejavelmente, não mais do que 40%, não mais do que 30%, não mais do que 20%, não mais do que 10% ou, desejavelmente, não mais do que 5% do antígeno é covalentemente ligado à proteína carreadora ou policátion em uma composição de vacina de matriz proteica. Como será apreciado a partir da descrição abaixo, o objetivo da concepção e produção de uma vacina de matriz proteica é para evitar a ligação química laboriosa do antígeno a um carreador, que é a principal característica das vacinas conjugadas. Em uma vacina de matriz proteica, o antígeno é associado com o carreador por retenção em uma matriz reticulada em vez de por conjugação ao carreador e, de fato, na medida do possível, a reticulação do antígeno a uma proteína carreadora, ou matriz de proteína carreadora / policátion é evitada. Em processos para a produção de vacinas de matriz proteica, o antígeno é incluído na mistura de componentes da matriz destinados a se tornarem reticulados, mas pelo design, o antígeno não participa na reação de reticulação ou, pelo menos, não participa em uma quantidade significativa de reticulação. Realizar a formação de uma matriz proteica na presença de antígenos, no entanto, leva o antígeno a se tornar retido em, sem reticulação significativa, a matriz de proteína carreadora (ou matriz de proteína carreadora / policátion em uma modalidade da presente invenção).

[00051] Por “infecção” deve ser entendida a invasão de um indivíduo por um micróbio, por exemplo, uma bactéria, fungo, parasita ou vírus. A infecção pode incluir, por exemplo, a multiplicação excessiva de micróbios que estão normalmente presentes em ou sobre o corpo de um indivíduo ou multiplicação de micróbios que não estão normalmente presentes em ou sobre um indivíduo. Um indivíduo sofre de uma infecção microbiana quando uma população microbiana indesejavelmente excessiva (por exemplo, patogênica) está presente em ou no corpo do indivíduo, ou quando a presença de uma população microbiana está danificando as células ou causando sintomas patológicos em um tecido do indivíduo.

[00052] Por “agente infeccioso”, entenda-se um micróbio que causa uma infecção.

[00053] O termo “imunogênico” refere-se a um composto que induz uma resposta imune em um indivíduo. Desejavelmente, uma resposta imune é uma resposta imune dependente de células T que envolve a produção de anticorpos IgG.

[00054] O termo “polímero capsular microbiano” refere-se a um polímero presente em ou sobre o revestimento capsular de um micróbio. Desejavelmente, um polímero capsular microbiano é um polímero orgânico, tal como um polissacarídeo, fosfopolissacarídeo, polissacarídeo com um amino açúcar com uma substituição N-acetila, polissacarídeo contendo um açúcar sulfonilado, outro açúcar modificado com sulfato ou açúcar modificado com fosfato, poliálcool, ácido poliamino, ácido teicoico ou uma cadeia lateral O de um lipopolissacarídeo.

[00055] “Monômero” refere-se a uma estrutura molecular capaz de formar duas ou mais ligações com monômeros semelhantes, muitas vezes produzindo uma corrente ou de uma série de cadeias conectadas, ramificadas, subestruturas monoméricas de repetição, quando parte de um “polímero”.

[00056] “Polímero orgânico” refere-se a um polímero composto de monômeros covalentemente ligados, cada um composto de átomos de carbono, oxigênio, hidrogênio ou nitrogênio ou porções fosfato ou sulfato. Desejavelmente, um polímero orgânico é um polissacarídeo, fosfopolissacarídeo, polissacarídeo com um amino açúcar com uma substituição N-acetila, polissacarídeo contendo um açúcar sulfonilado, outro açúcar modificado com sulfato, ou açúcar modificado com fosfato, açúcar, poliálcool, ácido poliamino, ácido teicoico e uma cadeia lateral O de lipopolissacarídeo.

[00057] “Poliálcool” significa uma forma hidrogenada de um carboidrato, em que um grupo carbonila foi reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário. São exemplos de poliálcoois um óxido de polialquileno (PAO), como polialquileno glicóis (PAG), incluindo polimetileno glicol, polietileno glicol (PEG), metoxipolietileno glicol (MPEG) e polipropileno glicol; álcool polivinílico (PVA); anidrido de polietileno - ácido comaleico; anidrido de poliestireno - ácido co-málico; dextranos, incluindo carboximetil-dextranos; celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxietilcelulose e hidroxipropilcelulose; hidrolisados de quitosana; amidos, como hidroxietil-amidos e hidroxipropil-amidos; glicogênio; agaroses e seus derivados; goma guar; pululana; insulina; goma xantana; carragenana; pectina; hidrolisados de ácido algínico; sorbitol; um álcool de glicose, manose, galactose, arabinose, gulose, xilose, treose, sorbose, frutose, glicerol, maltose celobiose, sacarose, amilose, amilopectina; ou mono propileno glicol (MPG).

[00058] “Ácido poli amino” ou “ácido poliamino” significa pelo menos dois aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. Desejavelmente, um ácido poliamino é um peptídeo contendo uma sequência de aminoácidos repetitivos ou uma cadeia do mesmo aminoácido (por exemplo, um homopolímero).

[00059] Um “policátion” ou “policatiônico” refere-se a qualquer íon macromolecular que transporta várias cargas positivas. Desejavelmente, um policátion possui grupos amina livres, por exemplo, o ácido poliamino poli-L-lisina. Outros policátions desejáveis exemplares que contêm grupos amina livres incluem polímeros naturais como quitosana (um copolímero ligado a β-(1-4) de 2-amino-2-desóxi- β-D-glucano (GlcN) e 2-acetamido-2-des0xi-β-D-glucano (GlcNAc)), que contém grupos amina livres em resíduos GlcN que podem ser reticulados e agir como o cátion, e polímeros sintéticos comercialmente disponíveis que contêm grupos amina livres como polietilenoimina ramificada (PEI), Poliamina N7 (CAS 29320-38-5) e Etilenodiaminometil poliestireno (CAS 177987-93-8).

[00060] Por “poli-L-lisina” e “PLL” deve ser entendido α-poli-L-lisina (alfa-poli-L-lisina; αPLL), ε-poli-L-lisina (épsilon-poli-L-lisina; εPLL; poli[imino[(2S)-2-amino-1-oxo-1,6-hexanodiila]]), ou suas combinações e copolímeros. Os resíduos lisina de poli-L-lisina estão ligados através de uma ligação peptídica entre o grupo carboxila e, ou o grupo amina alfa (α-PLL) ou épsilon (ε-PLL). Desejavelmente, a poli-L-lisina é α-poli- L-lisina. α-poli-L-lisina é sintetizada quimicamente e pode ser obtida em diversos pesos moleculares, por exemplo, 0,5 a 300 kDa. ε-poli-L-lisina é um pequeno homopolímero natural do aminoácido essencial L-lisina que é produzido pela fermentação bacteriana, por exemplo, ε-poli-L- lisina pode ser isolada de Streptomyces albulus, e tem uma massa molecular média de cerca de 4000 Da.

[00061] Uma “matriz proteica” no contexto da presente invenção é uma estrutura multimérica formada por reticulação de moléculas de proteínas, formando ligações ou ligações diretas entre dois sítios na mesma molécula de proteína ou entre dois sítios em diferentes moléculas de proteína. Uma “matriz de proteína carreadora” no contexto da presente invenção refere-se a uma matriz de proteína formada por uma reação de reticulação realizada com proteínas carreadoras, em que reticulações são formadas entre sítios reativos da mesma molécula de proteína carreadora (resultando em estruturas de loop intramolecular ou dobra) ou entre sítios reativos em diferentes moléculas de proteína carreadora (resultando em polímeros de proteína carreadora). O termo “matriz de proteína carreadora / policátion” como aqui utilizado refere- se a uma matriz de proteína formada por uma reação de reticulação realizada em uma mistura de proteínas carreadoras e policátions, em que a reticulação ocorre pelo menos dentro ou entre moléculas de proteína carreadora (resultando em uma matriz de proteína carreadora que pode aprisionar policátions na matriz), ou em que a reticulação ocorre não só dentro ou entre as moléculas de proteína carreadora, mas também dentro ou entre moléculas de policátion (resultando em uma matriz que compreende monômeros de proteína carreadora reticulada e / ou policátion). O grau de reticulação na formação de uma matriz de proteína pode ser controlado pela seleção judiciosa de reagentes de reticulação e considerando os sítios reativos disponíveis para reticulação dos componentes monoméricos, controlando a quantidade de agente de reticulação usado na reação de reticulação, controlando o tempo de reação e a utilização de reagentes para bloquear sítios reativos ou arrefecer a reação de reticulação. O controle de tais parâmetros irá afetar a quantidade de antígeno que pode ser retida, a taxa na qual o antígeno retido pode dissociar-se do complexo de proteína da matriz / antígeno, e o tamanho das partículas da matriz de proteína formadas. Todas estas qualidades afetam a imunogenicidade das composições de vacina de matriz proteica da presente invenção.

[00062] O termo “redução de uma base de Schiff” refere-se à exposição de azometina ou um composto da fórmula R1R2C = N-R3 (em que R1, R2 e R3 são subestruturas químicas, tipicamente contendo átomos de carbono) a um agente de redução que satura a ligação dupla da base de Schiff com átomos de hidrogênio. Métodos de redução química são conhecidos para aqueles versados na técnica.

[00063] O termo “liga especificamente”, tal como aqui utilizado em referência a um anticorpo ou um seu fragmento, significa um aumento da afinidade de um anticorpo ou fragmento de anticorpo quanto a um antígeno particular, por exemplo, uma proteína ou um seu segmento, em relação a uma quantidade igual de qualquer outro antígeno. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo tem desejavelmente uma afinidade quanto o seu antígeno que é pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 30 vezes ou 100 vezes maior do que quanto à mesma quantidade de qualquer outro antígeno, incluindo antígenos relacionados, tal como determinado através de métodos convencionais, como um teste imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).

[00064] Por “indivíduo”, deve ser entendido um animal que pode ser infectado por um micróbio. Desejavelmente, um indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano, macaco, cão, gato, rato, camundongo, vaca, ovelha, cabra ou cavalo. Um ser humano pode ser um ser humano adulto, criança, bebê, criança que está começando a andar (toddler) ou criança pré-púbere.

[00065] Um “antígeno independente de célula T” refere-se a um antígeno que resulta na geração de anticorpos sem a cooperação de linfócitos T auxiliares. O antígeno independente de células T pode estimular diretamente os linfócitos B sem a cooperação dos linfócitos T. Antígenos independentes de células T desejáveis exemplares incluem o ácido poli-gama-D-glutâmico do antígeno capsular (PGA), ácido algínico (alginato), dextrano, polissacarídeos (PS), ácidos poli amino, poliálcoois e ácidos nucleicos.

[00066] Os termos “vacina”, “composição de vacina” e “composição imunogênica” são aqui utilizados para se referir a qualquer composição contendo um antígeno de interesse que, quando administrado a um indivíduo vertebrado, provoca uma resposta imune no indivíduo ao dito antígeno. Embora seja um objetivo da invenção proporcionar vacinas capazes de provocar uma resposta imune protetora (ou seja, capazes de proteger um indivíduo vacinado contra um agente patogênico que naturalmente carrega o antígeno incluído na vacina), imunização de proteção, por exemplo, após uma administração única, não é uma qualidade que é inerente ao termo “vacina” ou “composição de vacina”, tal como aqui utilizado.

[00067] As composições de vacina de matriz proteica da presente invenção não necessitam de ligação covalente entre o antígeno que se destina a provocar uma resposta imune e a proteína carreadora e / ou policátion utilizado para formar a matriz. Isto simplifica vantajosamente a preparação de composições de vacinas de matriz proteica, reduzindo o custo de sua preparação em relação à tecnologia de vacina conjugada. Vacinas conjugadas de polissacarídeo (PS) - proteína têm se mostrado proibitivamente caras para produzir e vender no mundo em desenvolvimento. Vacinas conjugadas convencionais são difíceis de produzir de modo menos dispendioso devido à química altamente especializada necessária para cada vacina e os custos de produção e purificação de ambos antígeno PS e proteína carreadora.

[00068] As composições de vacina de acordo com a presente invenção abordam a necessidade de vacinas capazes de induzir com segurança imunidade contra antígenos previamente intratáveis. As composições de vacina, como aqui descritas, podem ser monovalentes (com um único antígeno para induzir uma resposta imune) ou polivalentes (com múltiplos antígenos para induzir uma resposta imune multiplex).

[00069] O significado de outros termos será entendido pelo contexto em que aparecem, ou tal como é entendido pelos profissionais especializados na técnica, incluindo os profissionais no campo da química orgânica, farmacologia, microbiologia, bioquímica de proteínas e imunologia.

[00070] A presente invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo (1) um ou mais antígenos de interesse, (2) uma ou mais proteínas carreadoras, e (3) um ou mais policátions, em que a referida proteína carreadora e / ou o referido policátion são reticulados para formar uma matriz proteica e o referido antígeno de interesse é retido pelo dito matriz proteica. Tais composições podem ser facilmente preparadas por mistura do antígeno, proteína carreadora e componentes de policátion, em seguida iniciando uma reação de reticulação para causar a reticulação da proteína carreadora e / ou policátion. Em modalidades alternativas do método de produção de vacinas de matriz proteica, a ordem de adição dos componentes pode ser variada, embora em geral, se uma matriz de proteína reticulada é formada antes da adição do antígeno de interesse, a retenção desejada não ocorre e o antígeno continua a ser um componente dissociado. Em modalidades preferidas, o policátion e o antígeno polissacarídeo são incubados em conjunto, seguidos pela adição do agente de reticulação, seguido pela adição da proteína carreadora (formadora de matriz). As composições de vacinas de matriz proteica que incorporam um policátion, por exemplo, α-PLL, de acordo com a presente invenção melhoram a retenção de antígenos na matriz proteica com um consequente aumento na imunogenicidade em comparação com o antígeno sozinho ou com composições de vacina de matriz proteica que não incorporam um policátion.

[00071] As presentes características da invenção, em particular, as composições de vacina de matriz capsular proteica que incorporam um policátion e métodos de fazer e administrar tais composições para proporcionar imunidade contra antígenos, particularmente antígenos independentes de células-T ou antígenos que normalmente provocam respostas imunes fracas, tais como, por exemplo, polissacarídeos (PS), poliálcoois, ácidos poli amino e outros polímeros orgânicos. As composições de vacina da invenção têm as propriedades imunológicas potentes de vacinas conjugadas PS - proteína típicas, mas desejavelmente diferem de vacinas conjugadas pelo fato de que nenhuma ligação atômica covalente significativa é necessária para acoplar o antígeno de interesse, por exemplo, PS ou polímero orgânico capsular, à proteína carreadora / policátion. Pelo contrário, o antígeno de interesse, por exemplo, PS ou polímeros orgânicos capsulares, é retido no interior da matriz de proteína carreadora / policátion. Por exemplo, uma matriz proteica pode ser formada por reticulação covalente de moléculas de proteína carreadora a si próprias, a outras moléculas de proteína carreadora e / ou ao policátion na presença do antígeno solúvel, por exemplo, PS ou polímeros orgânicos de capsulares. Proteínas carreadoras e / ou policátions que são altamente reticulados um com o outro podem formar uma matriz que pode capturar (reter) um antígeno e facilitar a captação desse antígeno pelas células que apresentam os antígenos, com o estímulo resultante da produção de anticorpos pelas células B. Tal como aqui demonstrado, o nível de retenção de antígeno no interior da matriz é aumentado pela adição de um policátion, por exemplo, poli-L-lisina, resultando em maiores rendimentos de partículas de PCMV e, por sua vez, resultando em um aumento da imunogenicidade das composições de PCMV comparativamente ao antígeno sozinho ou complexos de matriz de antígeno / proteína formados sem o uso de policátion.

[00072] Conceitualmente, a matriz de proteína carreadora / policátion pode ser visualizada na forma de uma “malha” que inclui o antígeno ou uma série de “esferas em uma corda” em que o antígeno é a “corda”, a proteína ou complexos de proteínas reticuladas / policátion são a “esfera” nesta analogia. O antígeno é retido no interior da matriz da proteína carreadora / policátion, se a proteína carreadora envolve o antígeno para formar um anel em torno do antígeno ou uma malha tridimensional, em que o antígeno é entrelaçado. A retenção de antígeno resulta numa quantidade desejada de antígeno se tornando associada com um carreador antigênico sem reticulação significativa ocorrendo para ligar o antígeno de forma covalente à proteína carreadora. Quantidade suficiente de antígeno e / ou a persistência da associação com o carreador através de retenção permite que as vacinas de matriz proteica exibam imunogenicidade aumentada em comparação com a imunização com o antígeno sozinho ou com antígeno simplesmente misturado com uma proteína carreadora. Mostrou-se que as composições de vacina matriz proteica de acordo com a presente invenção alcançam imunogenicidade comparável com vacinas conjugadas comercialmente disponíveis, em que o antígeno é ligado covalentemente a um carreador.

[00073] Em modalidades desejáveis, moléculas da proteína carreadora e / ou policátion são covalentemente reticuladas. Por exemplo, uma ligação covalente pode conter uma ligação peptídica entre o grupo amino primário de uma cadeia lateral de lisina (por exemplo, em poli-L-lisina) e um grupo carbóxi de uma cadeia lateral de aspartato ou glutamato (por exemplo, em uma proteína carreadora). Em outras modalidades desejáveis, reticulações covalentes podem ser iniciadas usando agentes de reticulação, como compostos da fórmula OHC-R-CHO, onde R é um alquileno divalente linear ou ramificado de 1 a 12 átomos de carbono, uma heteroalquila divalente linear ou ramificada de 1 a 12 átomos, um alquenileno divalente linear ou ramificado de 2 a 12 átomos de carbono, um alquinileno divalente linear ou ramificado de 2 a 12 átomos de carbono, um radical aromático divalente de 5 a 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 a 10 átomos, -(CH2CH2O)qCH2CH2- em que q é 1 a 4, ou uma ligação química direta ligando dois grupos aldeído. Em modalidades preferidas, a ligação covalente é formada utilizando glutaraldeído como um agente de reticulação ou, alternativamente, tais agentes como éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida ou benzidina bis- biazotida, bis[sulfossuccinimidil]suberato ou adipimidato de dimetila pode ser usado. Embora não seja necessário na formação de uma composição de vacina de matriz proteica, o antígeno de interesse pode ser ligado de forma covalente à proteína carreadora, por exemplo, em uma medida que é acidental à formação da matriz de proteína carreadora reticulada, por exemplo, devido a grupos reativos não bloqueados ou grupos terminais amino ou carboxila ou grupos hidroxila que podem existir no antígeno. Em geral, a ligação covalente de antígeno ao carreador não é um objetivo na formação de vacinas de matriz proteica. Para os propósitos da invenção, vacinas de matriz proteica são composições de vacina, em que não mais do que 50% do antígeno está ligado de forma covalente com a proteína carreadora. A quantidade de danos reticulação antígeno acidental pode ser calculada estequiometricamente considerando a proporção de sítios no antígeno que são capazes de participar em uma reação de reticulação, ou seja, levando em conta os grupos reativos do(s) reagente(s) de reticulação utilizado(s), a quantidade de reagente(s) e outros reagentes (por exemplo, proteína carreadora, policátion) utilizados, e se as reações de reticulação são permitidas até a conclusão (por exemplo, se a totalidade de um reagente de reticulação é consumida durante a reação). A quantidade de antígeno reticulado em uma composição de vacina de matriz proteica pode também ser medida, por exemplo, por análise de espectrometria de massa de uma composição de PCMV para reticulações de carboidrato / lisina.

[00074] Em modalidades desejáveis, o antígeno e a matriz de proteína carreadora / policátion são associados de forma não covalente. Tal associação não covalente pode envolver interação hidrofóbica, interação iônica, interação de van der Waals, ou ligação de hidrogênio; ou o antígeno pode ser fisicamente ou estericamente fechado no interior da matriz proteica, de tal modo que a dissociação de antígeno da matriz é impedida ou retardada. Associação não covalente pode incluir configurações físicas geométricas que associam de forma não covalente (retêm) antígeno com complexos de proteína (ou seja, como na analogia acima “esfera em uma corda”).

[00075] As composições de vacina da invenção podem ser preparadas usando qualquer um dos muitos ligantes possíveis para reticular qualquer um das muitas proteínas carreadoras e / ou policátions possíveis na presença de qualquer antígeno de interesse. Ligantes exemplares e preferenciais, proteínas carreadoras, policátions e antígenos de interesse são discutidos aqui.

[00076] Polissacarídeos (PS) são polímeros de sacarídeos (açúcares). PS derivado de cápsulas microbianas são os componentes antigênicos primários envolvidos na imunidade protetora contra agentes patogênicos bacterianos encapsulados, como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi e Haemophilus influenzae tipo B. A imunização de adolescentes e adultos com vacinas à base de polissacarídeos microbianos tem sido bem sucedida na redução da carga da doença, mas tem se mostrado menos eficaz no fornecimento de imunidade protetora a bebês e crianças jovens (ou seja, crianças com menos de 24 meses de idade). As crianças jovens ainda não desenvolveram um repertório imune adaptativo maduro e antígenos independentes de células T, como PS capsular, são pouco imunogênicos e não levam a respostas imunes de proteção a longo prazo (ou seja, uma resposta de memória imunológica) em tais receptores jovens da vacina.

[00077] Um antígeno independente de células T, como polissacarídeo, pode ser convertido em um antígeno dependente de células T, por acoplamento químico de polissacarídeo à proteína. Este processo, conhecido como “conjugação”, envolve a formação de ligações covalentes entre os átomos na estrutura do polissacarídeo e os átomos da cadeia lateral de aminoácidos presentes na proteína “carreadora”. Tais “vacinas conjugadas” promovem de forma mais eficiente a indução de maturação das células B e alteração de isotipo, levando a níveis muito mais elevados de anticorpo com o correto perfil de proteção anti-PS. Anticorpos protetores têm alta afinidade quanto a seus antígenos polissacarídeos e, normalmente, são da subclasse de imunoglobulina G (IgG), um anticorpo de longa duração com fixação de complemento e atividade efetora de opsonização.

[00078] Um antígeno independente de célula T em geral não estimula a imunidade duradoura, ou seja, a produção de anticorpos IgG, mas pode estimular a produção de ligação menos potentes, mais pobre, e mais temporária, anticorpos IgM. Como tal, antígenos polissacarídeos sozinhos tipicamente não produzem respostas de reforço de IgG. Contudo, os polissacarídeos não produzem respostas de reforço se a imunização primária é realizada com um conjugado PS - proteína, pois as células de memória induzidas pelo conjugado já foram programadas para produzir IgG. Com efeito, imagina-se que a resposta de reforço em animais ou seres humanos vacinados imita a resposta protetora devido à exposição a um micróbio que exibe o OS; esta memória de longo prazo é essencial para uma vacina trabalhar na provisão de imunidade protetora a indivíduos imunizados anos após a imunização. Assim, os conjugados PS -proteína são valorizados por (1) sua capacidade de induzir níveis elevados de IgG contra antígenos PS, e (2) sua capacidade de induzir respostas imunes contra antígenos PS. Antígenos polissacarídeos sozinhos normalmente não apresentam estas propriedades e, portanto, são antígenos inferiores. A dificuldade em sintetizar vacinas conjugadas e seu custo de produção diminuiu o desenvolvimento de vacinas conjugadas para muitas doenças bacterianas onde se espera uma resposta imune protetora a um antígeno polissacarídeo.

[00079] Outros antígenos independentes de células T incluem homopolímeros de aminoácidos, como ácido poli-gama-D-glutâmico (PGA), e poliálcoois. A maioria dos biopolímeros são antígenos independentes de células T. Os polímeros podem reticular receptores da imunoglobulina (Ig) em células B que os reconhecem devido à natureza repetitiva de suas estruturas químicas (e, assim, os epitopos). Assim, os polímeros podem ativar as células B para a produção de IgM antipolímero da mesma maneira que os polissacarídeos fazem. Por exemplo, um homopolímero de aminoácido, ácido poli-gama-D- glutâmico (PGA) de Bacillus anthracis, é um polímero capsular que é pouco imunogênico e também um antígeno independente de células T. As vacinas compostas por PGA conjugado a carreadores de proteína são altamente imunogênicas, capazes de induzir IgG anti-PGA e memória imunológica a PGA. Assim, a maioria dos polímeros de responde como PS em termos de sua imunogenicidade porque eles não podem ser processados e apresentados no contexto de MHC-II e, assim, não podem recrutar células T auxiliares. Uma exceção é encontrada em alguns polímeros que ocorrem naturalmente que interagem com outra classe de receptores denominados receptores semelhantes a Toll (TLR). Uma vez ativados, TLRs podem induzir a produção de citocinas pelas células hospedeiras e produzir alterações na resposta imune adaptativa. Alguns PS estão covalentemente ligados a ligandos de TLR ou contaminados com tais ligandos. Por exemplo, lipopolissacarídeos (LPS) são PS que são altamente imunogênicos e induzem IgG e respostas de memória; a porção de lípido A de LPS é um ligando de TLR e pode ser responsável pelas propriedades imunológicas.

[00080] Vacinas conjugadas convencionais são difíceis de produzir de modo mais econômico devido aos custos de produção e purificação do antígeno PS e proteína carreadora e a química específica envolvida em cada conjugação de polissacarídeo - proteína. Normalmente, ambos precisam ser muito puros antes da química de conjugação poder ser realizada com uma eficiência de acoplamento razoável. Tipicamente, o acoplamento químico deve ser especificamente desenvolvido para vários OS, que é único para a química do PS e as proteínas carreadoras que foram selecionadas. Esta química de acoplamento apresenta grupos funcionais no PS que então podem ser ligados à proteína carreadora tipicamente através das cadeias laterais de amino épsilon de resíduos lisina. A modificação química de PS para introduzir tais grupos de acoplamento pode destruir epitopos no PS e introduzir novos epitopos (por exemplo, associados com o ligante ou grupos sacarídeos modificados), cujo significado só pode ser avaliado através da realização de análise imunológica cuidadosa. Além disso, para vacinas conjugadas de PS - proteína convencionais, o tamanho do PS, o número das moléculas de PS ligadas por molécula carreadora de proteína, a natureza do carreador selecionado e o tipo da química de ligação podem afetar a imunogenicidade da vacina conjugada. Como tal, por exemplo, no caso de doenças pneumocócicas onde cada um dos 90+ serótipos conhecidos tem uma estrutura de PS diferente (Bentley et al., PLOS Genetics 2 (3):e31 262-269, 2006), um único método de conjugação não é apropriado para todos os sorotipos. Sintetizar de modo reprodutível vacinas conjugadas com propriedades imunológicas reprodutíveis envolve o controle cuidadoso do tamanho do PS, o número de moléculas de PS ligadas por molécula de carreador de proteína, a natureza do carreador selecionado e o tipo de química da ligação. Esta, por sua vez, aumenta dramaticamente o custo de fabricação de vacinas conjugadas.

[00081] O aparecimento de resistência a antibióticos destaca a urgência para o desenvolvimento de vacinas eficazes e seguras. Produzir vacinas amplamente disponíveis, especialmente para aqueles países em desenvolvimento, requer que a fabricação de vacinas também seja eficaz em termos de custos. A incorporação de vacinas conjugadas combinadas contra muitos antígenos polissacarídeos de diferentes sorotipos de uma ou mais espécies de bactérias ao regime de imunização infantil simplificaria a administração da vacina nessa população de alto risco. No entanto, a tecnologia de vacina conjugada atual não é rentável e, portanto, as vacinas conjugadas de combinação são praticamente impossíveis de distribuição ao mundo em desenvolvimento por causa do alto custo.

[00082] Em modalidades desejáveis, as composições de vacinas imunogênicas da invenção são vacinas de matriz capsulares proteicas (PCMV), onde um ou mais componentes capsulares bacterianos são retidos em uma a matriz de proteína carreadora e / ou policátion reticulada. PCMVs podem ser produzidas mais facilmente do que os conjugados porque o antígeno de interesse, por exemplo, os polissacarídeos capsulares bacterianos, não precisa ser hidrolisado a fragmentos menores e vários antígenos podem ser retidos em uma matriz proteica simultaneamente.

[00083] Porque o método de fabricação de vacinas da invenção não necessita de qualquer conhecimento da química do antígeno de interesse, por exemplo, um polissacarídeo capsular, o método não depende da necessidade de desenvolver química de reticulação que seja compatível com a química do antígeno de interesse e a proteína carreadora. Embora seja possível que alguns antígenos possam interagir com o agente de reticulação, isto não deve prejudicar a eficácia da vacina, porque espera-se que a reticulação não desejada do antígeno de interesse e a proteína carreadora tenha propriedades imunogênicas semelhantes a conjugados. Nas vacinas da invenção, no entanto, a reticulação do antígeno de interesse à proteína carreadora não constitui um requisito para que a vacina seja imunologicamente eficaz. Isto está em nítido contraste com vacinas conjugadas convencionais. As vacinas da presente invenção têm desejavelmente pelo menos, por exemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou mesmo 100% das proteínas carreadoras reticuladas e não mais do que, por exemplo, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, ou 1% do antígeno de interesse reticulada à proteína carreadora. Desejavelmente, não mais do que 10% de antígenos são reticulados às proteínas carreadoras e pelo menos 50% das proteínas carreadoras são reticuladas.

[00084] Tal como aqui discutido, as composições de vacina de matriz proteica que incorporam um policátion aumentaram a retenção de antígeno e correspondente maior imunogenicidade em comparação a composições compostas pelo antígeno sozinho, misturas simples de antígeno / carreador, e mesmo composições de vacinas de matriz de antígeno / proteína que não incorporam um policátion em conformidade com os ensinamentos aqui contidos. Tal como aqui discutido, as cápsulas de polissacarídeos de bactérias são compostas de açúcares de repetição e, para muitas, cápsulas bacterianas patogênicas são carregadas negativamente. A carga negativa pode auxiliar na prevenção da fagocitose por células imunológicas do hospedeiro através de repulsa de carga ou apresentando uma cápsula mais inibitória maior. Weinger et al., PLosPathogens, 5: 1-9 (2009). Esta mesma repulsa de cargas também pode estar ocorrendo com a(s) proteína(s) da matriz, resultando em uma fraca retenção de polissacarídeo. Para neutralizar esta carga negativa, um policátion, por exemplo, poli-L-lisina (PLL), pode ser adicionado às reações de PCMV. Por exemplo, tal como aqui discutido, a adição de 0,04% de α-PLL à reação de PCMV de Vi-CRM197 aumentou a retenção de polissacarídeo Vi de 5% a > 20% ( Figura 1).

[00085] O controle do tamanho de partícula pode melhorar a imunogenicidade das vacinas de matriz proteica. Em modalidades desejáveis da invenção, o complexo de matriz de antígeno / proteína carreadora / policátion tem um diâmetro de tamanho de partícula médio superior a 50 nm. Partículas de tamanho desejado podem ser fraccionadas por quaisquer meios adequados, incluindo a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), seguido pelo agrupamento das partículas de maior tamanho e descartando as partículas de tamanho menor e / ou polissacarídeo não retido. Alternativamente, a utilização de membranas de filtro com cortes bem escolhidos de peso molecular pode ser usada para remover partículas de tamanho menor, ao mesmo tempo mantendo as partículas do tamanho desejado. A eliminação das espécies de peso molecular mais baixo (por exemplo, espécies de diâmetro < 50 nm) ou a seleção de tamanhos de partículas da matriz proteica da composição que incluem tamanhos de partículas superiores a pelo menos 50 nm de diâmetro, pode ser realizada por quaisquer meios conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia, incluindo cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia de filtração em gel, ou cromatografia de permeação em gel. Também podem ser utilizadas técnicas de eletroforese em gel.

[00086] Os Métodos de preparo de vacinas aqui descritos não resultam na modificação extensa do antígeno de interesse, por exemplo, um polímero capsular. O antígeno em geral permanece no mesmo estado, com uma possível modificação sendo, por exemplo, a redução de açúcares redutores para cápsulas de PS que transportam os tais grupos no final das cadeias poliméricas. Tais modificações menores não são propensas a afetar a imunogenicidade da maioria dos PS capsulares porque os açúcares finais são 100 - 10.000 vezes menos abundantes do que os resíduos internos no polímero. Em contraste, para vacinas conjugadas convencionais, é usualmente necessário introduzir grupos ligantes ao antígeno, por exemplo, um polímero capsular, que serve como o ponto de ligação covalente da proteína carreadora. Por exemplo, a introdução de grupos reativos em um PS pode resultar na destruição de epitopos capsulares e geração de novos epitopos que podem ser indesejáveis em um produto de vacina devido a sua desconhecida reatividade cruzada imunológica com autoepitopos hospedeiros.

[00087] Os métodos de preparo de vacinas aqui descritos são menos complexas do que a tecnologia de vacina conjugada porque sua química depende apenas da química de reticulação da proteína carreadora (por exemplo, DNI, subunidade B da toxina da cólera, toxoide da difteria, toxoide do tétano ou o Fragmento C ou beta-galactosidase de Escherichia coli) e / ou policátion (por exemplo, α-poli-L-lisina e ε-poli-L- lisina). Por exemplo, enquanto o polímero capsular afeta a taxa de reticulação quando misturado com DNI, ele não afeta o padrão ou grau de reticulação que é controlado mais pela proteína sendo utilizada, sua concentração e a concentração do agente de reticulação (por exemplo, glutaraldeído) adicionado. Estes parâmetros podem ser prontamente ajustados reduzindo assim o tempo e o esforço necessários para produzir a vacina, e com economia de custo.

[00088] Os métodos de produção de composições de PCMV aqui descritos podem ser usados com qualquer antígeno, por exemplo, um polímero capsular ou qualquer biopolímero com poucos, ou nenhum, grupos amino, e qualquer proteína carreadora e / ou policátion que pode ser reticulado, por exemplo, proteínas carreadoras não tendo epitopos críticos que podem ser destruídos mediante reticulação ou redução química. Proteínas carreadoras que podem ser usadas nos métodos aqui descritos desejavelmente têm pelo menos dois resíduos lisina ou outros resíduos que são desbloqueados e que podem ser reticulados por modificação química. O toxoide do tétano é uma possível proteína carreadora. Esta toxina se torna não tóxica por tratamento com formaldeído, um reagente que reage com grupos amino de proteínas. Outras proteínas carreadoras desejáveis incluem a subunidade B da toxina da cólera (disponível por SBL Vaccin AB), toxoide da difteria ou CRM197, toxoide do tétano ou Fragmento C (disponível por Sigma Aldrich), DNI, ou beta-galactosidase de Escherichia coli (disponível por Sigma Aldrich).

[00089] Vacinas conjugadas multivalentes atuais são feitas por síntese de vacinas conjugadas individuais primeiro, seguida por sua mistura para produzir uma vacina conjugada de “coquetel” (por exemplo, a vacina pneumocócica heptavalente da Wyeth, Prevnar®-7, vacina pneumocócica 10-valente da GlaxoSmithKline Synflorix® e vacina 13- valente da Pfizer Prevnar®-13). Os métodos da presente invenção de produção de vacinas podem ser usados para produzir vacinas multivalentes misturando antígenos quimicamente diferentes, por exemplo, polímeros orgânicos capsulares, antes da reticulação da proteína carreadora e / ou policátion, por exemplo, com glutaraldeído ou outro agente de reticulação, ou por mistura de vacinas específicas da invenção que foram sintetizadas separadamente. Esta flexibilidade proporciona vantagens significativas sobre os métodos convencionais de fabricação de vacinas multivalentes que devem reduzir consideravelmente o custo dos produtos.

[00090] As vacinas exemplificativas da invenção discutidas nos exemplos tiveram um desempenho comparável ao de vacinas conjugadas, apesar do fato dessas vacinas terem sido sintetizadas por um método que não está previsto para gerar quaisquer ligações covalentes entre moléculas de antígeno e a proteína carreadora. Glutaraldeído reage principalmente com cadeias laterais de aminoácidos de proteínas tipificadas pelo grupo épsilon-amino de resíduos lisina. Antígenos polissacarídeos são essencialmente não- reativos com glutaraldeído e outros reagentes funcionais de aldeído, porque eles contêm alguns grupos amino livres (quaisquer cadeias laterais de amino são normalmente acetiladas) para reagir com agentes de reticulação funcionais de glutaraldeído ou aldeído (por exemplo, OCH-R-CHO, discutido acima). Por conseguinte, tais antígenos são bem adequados para a formação de PCMV, em que menos de 50% do antígeno é reticulado diretamente a uma proteína carreadora. Como visto nos exemplos abaixo, as respostas imunes geradas pelo PCMVs, que se compararam favoravelmente a controles de conjugado, indicam que as moléculas de PS foram molecularmente retidas em uma matriz de reticulação de moléculas de proteína DNI.

[00091] De acordo com um modelo não limitativo, a retenção atua para distribuir a composição de vacina de matriz proteica a células B que ligam essas matrizes através de receptores de Ig que reconhecem o antígeno do polímero. Uma vez presas dentro destas células B, as matrizes são degradadas de forma semelhante a vacinas conjugadas convencionais, resultando em peptídeos derivados de proteínas carreadoras que são exibidas em moléculas de classe II de MHC das células B. Isto, por sua vez, recruta células T-auxiliares e conduz assim à expansão e maturação de tais células B para tornar células de "memória" e plasma produtoras de IgG específicas para o antígeno. Assim, de acordo com o modelo não limitativo, PCMVs funcionam como vacinas capsulares conjugadas a proteína imunologicamente, mas são distintas porque PCMVs não têm ligação covalente significativa entre a proteína carreadora e os polímeros capsulares.

[00092] As composições de vacina da invenção, incluindo PCMVs, podem ser usadas em combinação, por exemplo, em vacinas pediátricas. Além disso, as vacinas da invenção podem ser usadas para vacinar contra, por exemplo, infecção por pneumococos, infecção por estreptococos (grupos A e B), infecção por Haemophilus influenzae tipo B (“HiB”), infecção meningocócica (por exemplo, Neisseria meningitides), e podem ser usadas como vacinas de antígeno O de bactérias Gram-negativas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis (Thirumalapura et al., J. Med. Microbiol. 54:693695, 2005; Vinogradov e Perry, Carbohydr. Res. 339: 1643-1648; 2004; Vinogradov et al., Carbohydr. Res. 214:289-297, 1991), espécies Shigella, espécies Salmonella, espécies Acinetobacter, espécies Burkholderia e Escherichia coli.

[00093] As vacinas da invenção podem ser produzidas utilizando quaisquer ligantes, tais como, por exemplo, aqueles descritos aqui, para reticular qualquer proteína carreadora e / ou policátion, tal como, por exemplo, aqueles aqui descritos, na presença de um ou mais antígenos de interesse, tais como, por exemplo, os aqui descritos. Se um antígeno de interesse é usado, a vacina de matriz proteica da invenção é dita ser monovalente. Se mais do que um antígeno de interesse é usado, a vacina de matriz proteica da invenção é dita ser multivalente. Se um polímero capsular microbiano ou polissacarídeo é o antígeno de interesse, a vacina de matriz proteica da invenção é dita ser uma vacina de matriz capsular proteica (PCMV).

Ligantes

[00094] Os agentes de reticulação úteis para reticular proteínas carreadoras e / ou policátions são bem conhecidos na técnica e incluem glutaraldeído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, carbodiimida e benzidina bis-biazotizada.

[00095] Métodos e porções gerais para reticular diretamente proteínas carreadoras utilizando um ligante homobifuncional ou um heterobifuncional são descritos, por exemplo, por G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996) e Dick e Beurret, Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens, em Conjugate Vaccines (Cruse e Lewis, eds.) (Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger, 1989), vol.10, pp 48-114. Por exemplo, com uma proteína carreadora que possui número ‘n’ de porções lisina, existem, teoricamente, ‘n +1’ aminas primárias (incluindo a amina terminal) disponíveis para reação com o grupo carboxílico de agente de reticulação exemplar. Assim, utilizando este processo de conjugação direta, o produto está limitado a ter ‘n+1’ ligações amida formadas.

[00096] O ligante utilizado em modalidades desejáveis da presente invenção é, em sua forma mais simples, uma ligação que une duas proteínas carreadoras, uma ligação que une dois policátions, uma ligação que une dois sítios da mesma proteína carreadora ou policátion, ou uma ligação que liga proteínas carreadoras e policátions. O ligante pode ter uma estrutura molecular linear, cíclica ou ramificada, com grupos pendentes que se ligam de forma covalente a duas proteínas carreadoras e / ou policátions, (A) e (B). Qualquer dada proteína carreadora pode ser ligada a mais do que uma proteína carreadora e / ou a um policátion, de modo que é criada uma matriz de proteínas carreadoras / policátions interligados, e em que um antígeno de interesse pode ser retido.

[00097] O termo “grupo de ligação” refere-se à ligação covalente que resulta da combinação de porções reativas de ligante (L) com grupos funcionais de (A) ou (B). Exemplos de grupos de ligação incluem, sem limitação, éster, carbamato, tioéster, imina, dissulfureto, amida, éter, tioéter, sulfonamida, isoureia, isotioureia, imidoéster, amidina, fosforamidato, fosfodiéster, tioéter e hidrazona.

[00098] A ligação de (A) com (B) é conseguida por meios covalentes, que envolvem a formação ligação (grupo de ligação) com um ou mais grupos funcionais localizados em (A) e (B). Exemplos de grupos funcionais quimicamente reativos que podem ser utilizados para este fim incluem, sem limitação, amino, hidroxila, sulfidrila, carboxila, carbonila, tio-éteres, guanidinila, imidazolila e grupos fenólicos, os quais estão presentes em aminoácidos de ocorrência natural em muitas proteínas carreadoras.

[00099] A ligação covalente de (A) com (B) pode, portanto, ser efetuada utilizando um ligante (L) que contém porções reativas capazes de reagir com tais grupos funcionais presentes em (A) e (B). O produto desta reação é um grupo de ligação que contém as ligações recém- formadas que unem (L) com (A) e (L) com (B). Por exemplo, um grupo hidroxila de (A) pode reagir com um grupo ácido carboxílico de (L), ou um seu derivado ativado, vide infra, resultando na formação de um grupo de ligação éster.

[000100] Exemplos de porções capazes de reagir com grupos sulfidrila incluem compostos α-haloacetila do tipo XCH2CO- (onde X = Br, Cl ou I), que mostram em particular a reatividade quanto a grupos sulfidrila, mas que também podem ser utilizados para modificar grupos imidazolila, tioéter, fenol e amino, como descrito, por exemplo, por Gurd, Methods Enzymol., 11:532 (1967). Derivados de N-maleimida também são considerados seletivos com relação a grupos sulfidrila, mas podem adicionalmente ser úteis no acoplamento a grupos amino sob certas condições. Reagentes como o 2-iminotiolano (Traut et al., Biochemistry, 12:3266 (1973)), que introduzem um grupo tiol mediante a conversão de um grupo amino, podem ser considerados como reagentes de sulfidrila se ocorre ligação através da formação de pontes de dissulfureto.

[000101] Exemplos de porções reativas capazes de reagir com grupos amino incluem, por exemplo, agentes de alquilação e acilação. Agentes de alquilação representativos incluem: (i) compostos α-haloacetila, que mostram especificidade quanto a grupos amino na ausência de grupos tiol reativos e são do tipo XCH2CO- (onde X = Cl, Br ou I, como descrito, por exemplo, por Wong (Biochemistry, 24:5337 (1979)); (ii) derivados de N-maleimida, que podem reagir com grupos amino através de uma reação do tipo Michael ou por meio de acilação por adição ao grupo carbonila do anel, tal como descrito por, por exemplo, Smyth et al. (J. Am. Chem. Soc., 82:4600, 1960 e Biochem. J., 91:589 (1964)); (iii) halogenetos de arila, tais como compostos de nitrohaloaromáticos reativos; (iv) halogenetos de alquila, tal como descrito por, por exemplo, McKenzie et al. (J. Protein Chem., 7:581 (1988)); (v) aldeídos e cetonas capazes de formação de base de Schiff com grupos amino, os adutos formados usualmente sendo estabilizados por meio de redução para se obter uma amida estável; (vi) derivados de epóxido, como epicloridrina e bisoxiranos, que podem reagir com grupos amino, sulfidrila ou fenólicos; (vii) derivados contendo cloro de s-triazinas, que são muito reativos com nucleófilos, tais como grupos amino, sulfidrila e hidroxila; (viii) aziridinas à base de compostos de s-triazina detalhados acima, tal como descrito por, por exemplo, Ross (J. Adv. Cancer Res., 2:1 (1954)), que reage com nucleófilos, tais como grupos amino por abertura de anel; (ix) ésteres de dietila do ácido esquárico como descritos por, por exemplo, Tietze (Chem. Ber., 124:1215 (1991)); e (x) éteres de α-haloalquila, os quais são agentes de alquilação mais reativos do que halogenetos de alquila normais por causa da ativação causada pelo átomo de oxigénio de éter, tal como descrito por, por exemplo, Benneche et al. (Eur. J. Med. Chem., 28:463 (1993)).

[000102] Agentes de acilação reativos com amino representativos incluem: (i) isocianatos e isotiocianatos, particularmente derivados aromáticos, que formam derivados de ureia e tioureia estáveis, respectivamente; (ii) cloretos de sulfonila, os quais foram descritos por, por exemplo, Herzig et al. (Biopolymers, 2:349 (1964)); (iii) halogenetos de ácido; (iv) ésteres ativos, tais como nitrofenilésters ou ésteres de N- hidroxissuccinimidila; (v) anidridos de ácido, tais como mistos, simétricos ou N- carboxianidridos; (vi) outros reagentes úteis para a formação de ligação amida, tal como descrito por, por exemplo, M. Bodansky (Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984); (vii) acilazidas, por exemplo, onde o grupo azida é gerado a partir de um derivado de hidrazida pré-formado utilizando nitrito de sódio, como descrito por, por exemplo, Wetz et al. (Anal. Biochem., 58:347 (1974)); e (viii) imidoésteres, que formam amidinas estáveis em reação com grupos amino, como descrito por, por exemplo, Hunter e Ludwig (J. Am. Chem. Soc., 84:3491 (1962)).

[000103] Os aldeídos, tal como, por exemplo, glutaraldeído, e cetonas podem ser reagidos com aminas para formar bases de Schiff, as quais podem ser vantajosamente estabilizadas através de aminação redutora. Porções alcoxilamino reagem prontamente com cetonas e aldeídos para produzir alcoxiaminas estáveis, como descrito, por exemplo, por Webb et al. (Bioconjugate Chem., 1:96 (1990)).

[000104] Exemplos de porções reativas capazes de reagir com grupos carboxila incluem compostos diazo, tais como ésteres de diazoacetato e diazoacetamidas, que reagem com alta especificidade para gerar grupos éster como descrito por, por exemplo, Herriot (Adv. Protein Chem., 3:169 (1947)). Reagentes modificadores de ácido carboxílico, tais como carbodiimidas, que reagem através de formação de O- acilureia seguida por formação de ligação amida, também podem ser empregados.

[000105] Os grupos funcionais em (A) e / ou (B) podem, se desejado, ser convertidos em outros grupos funcionais antes da reação, por exemplo, para conferir reatividade ou seletividade adicional. Exemplos de métodos úteis para esta finalidade incluem a conversão de aminas em ácidos carboxílicos usando reagentes como anidridos dicarboxílicos; a conversão de aminas a tióis utilizando reagentes como N-acetil- homocisteína tiolactona, anidrido S-acetilmercaptossuccínico, 2- iminotiolano ou derivados de succinimidila contendo tiol; conversão de tióis em ácidos carboxílicos utilizando reagentes como α-haloacetatos; conversão de tióis em aminas utilizando reagentes tais como etilenimina ou 2-bromoetilamina; conversão de ácidos carboxílicos em aminas utilizando reagentes como carbodiimidas seguida de diaminas; e conversão de álcoois em tióis utilizando reagentes como cloreto de tosila seguida por transesterificação com tioacetato de hidrólise no tiol com acetato de sódio.

[000106] Os chamados ligantes de comprimento zero, que envolvem ligação covalente direta de um grupo químico reativo de (A) com um grupo químico reativo de (B) sem introduzir material de ligação adicional, podem, se desejado, ser utilizados de acordo com a invenção. Exemplos incluem compostos em que (L) representa uma ligação química que une um átomo de oxigênio de (A) a uma porção carbonila ou tiocarbonila presente em (B), de tal modo que o grupo de ligação é um éster ou tioéster. Por exemplo, um grupo amino (A) pode ser ligado a um grupo carboxila (B) usando química de carbodiimida que produz A-L-B, onde L é uma ligação amida ou RC(:O) ligado a N-R, em que R é a cadeia de carbono derivada cadeias laterais de aminoácidos da mesma molécula de proteína ou duas moléculas de proteína diferentes. Mais comumente, no entanto, o ligante inclui duas ou mais porções reativas, como descrito acima, ligadas por um elemento separador. A presença de um espaçador permite que ligantes bifuncionais reajam com grupos funcionais específicos de (A) e (B), o que resulta em uma ligação covalente entre esses dois compostos. As porções reativas em um ligante (L) podem ser as mesmas (ligante homobifuncional) ou diferentes (ligante heterobifuncional ou, onde várias porções reativas diferentes estão presentes, ligante heteromultifunctional), fornecendo uma diversidade de reagentes potenciais que podem provocar ligação covalente entre (A) e (B).

[000107] Elementos espaçadores consistem tipicamente em cadeias que efetivamente separam (A) e (B) por uma alquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos de carbono, uma heteroalquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos, um alqueno linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um alquino linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 a 10 átomos ou -(CH2CH2O)NCH2CH2-, em que n é 1 a 4.

[000108] A natureza do material extrínseco introduzido pelo agente de ligação pode ter uma influência sobre a farmacocinética e / ou atividade do produto de vacina final. Assim, pode ser desejável a introdução de ligantes cliváveis, contendo braços espaçadores que são biodegradáveis ou quimicamente sensíveis ou que incorporam locais de clivagem enzimática.

[000109] Estes ligantes cliváveis, conforme descrito, por exemplo, na Publicação de PCT WO 92/17436 (aqui incorporada por referência), são facilmente biodegradados in vivo. Em alguns casos, os grupos de ligação são clivados na presença de esterases, mas são estáveis na ausência de tais enzimas. (A) e (B) podem, por conseguinte, com vantagem, ser ligados para permitir sua liberação lenta por enzimas ativas perto do sítio da doença.

[000110] Os ligantes podem formar grupos de ligação com grupos diéster, diamida ou dicarbamato biodegradáveis da fórmula: -(Z1)o-(Y1)u- (Z2)s-(R11)-(Z3)t-(Y2)v-(Z4)p-, em que cada um de Z1, Z2, Z3 e Z4 é independentemente selecionado a partir de O, S e NR12 (onde R12 é hidrogênio ou um grupo alquila); cada um de Y1 e Y2 é independentemente selecionado a partir de um grupo carbonila, tiocarbonila, sulfonila, fosforila ou grupo formador de ácido semelhante; o, p, s, t, u e v são cada um independentemente 0 ou 1; e R11 é uma alquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos de carbono, uma heteroalquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos, um alqueno linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um alquino linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um radical aromático de 5 a 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 a 10 átomos, - (CH2CH2O)qCH2CH2- em que q é 1 a 4, ou uma ligação química que une -(Z1)o-(Y1)u-(Z2)s-(Rii)-(Z3)t-(Y2)v-(Z4)p-.

[000111] Ligantes exemplares desejáveis (L) utilizados na presente invenção podem ser descritos por qualquer das fórmulas I - II: -C:0-Ri3-C:0- I -C:0-NH-Ri3-NH-C:0- II em que o ligante é covalentemente ligado a ambos um átomo de oxigênio (A) e um átomo de oxigênio de (B). Por conseguinte, o ligante (L) das fórmulas I - II estão ligados a proteínas carreadoras (A) e (B) através de grupos de ligação de dipiran, éster ou carbamato. Nestas formas de realização, R13 representa uma alquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos de carbono, uma heteroalquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos, um alqueno linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um alquino linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um radical aromático de 5 a 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 a 10 átomos, -(CH2CH2O)nCH2CH2-, em que n é 1 a 4, ou uma ligação química que une dois nitrogênios ou duas carbonilas.

[000112] Ligantes concebidos para formar ligações de hidrazona têm a fórmula química III: -(Y3)-(Z5)w-Ri4-C(:X4)-Ri5 III em que Z5 é selecionado a partir de O, S ou NR16; R16 é hidrogênio ou um grupo alquila; R15 é selecionado a partir de hidrogênio, um grupo alquila, ou uma heteroalquila ; Y3 é selecionado a partir de uma carbonila, tiocarbonila, sulfonila, fosforila ou um grupo formador de ácido semelhante covalentemente ligado a um átomo de oxigênio de (A); w é 0 ou 1; R14 é uma alquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos de carbono, uma heteroalquila linear ou ramificada de 1 a 10 átomos, um alqueno linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um alquino linear ou ramificado de 2 a 10 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 a 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 a 10 átomos, -(CH2CH2O)nCH2CH2-, em que n é 1 a 4 ou uma ligação química que une -(Y3)-(Z5)w- a e X4 é uma hidrazona resultante da reação de condensação de (B) contendo um grupo hidrazida e o precursor ao ligante II, em que X4 é o átomo de oxigênio de um grupo cetona ou aldeído.

Proteínas Carreadoras

[000113] Em geral, qualquer proteína carreadora que pode reter um antígeno sob condições fisiológicas pode ser utilizado na presente invenção. Desejavelmente, o antígeno é retido em um complexo com matriz reticulada da proteína carreadora e / ou policátion na ausência de ligação covalente significativa entre o antígeno e a matriz de proteína carreadora / policátion. Ausência de ligação covalente significativa refere-se a não mais do que 50% do antígeno sendo ligado de forma covalente a uma proteína carreadora e / ou policátion. Em modalidades desejáveis, não mais do que 40%, 30%, 10% ou 5% do antígeno está ligado de forma covalente a uma proteína carreadora e / ou policátion. O complexo antígeno / proteína carreadora / policátion pode conter outro composto, tal como alúmen.

[000114] Proteínas carreadoras utilizadas nas vacinas da presente invenção desejavelmente são proteínas que, por si só ou em combinação com um antígeno, provocam uma resposta imune em um indivíduo. Desejavelmente, a proteína carreadora contém vários epitopos restritos da classe MCH II reconhecidos por uma célula T auxiliar. Desejavelmente, os epitopos são capazes de induzir uma resposta de células Th em um indivíduo e induzem as células B a produzir anticorpos contra o antígeno de interesse e os micróbios dos quais o antígeno é derivado. Epitopos como utilizados na descrição desta invenção incluem qualquer determinante em um antígeno que é responsável por sua interação específica com uma molécula de anticorpo ou seu fragmento. Os determinantes epitópicos consistem usualmente em grupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Para ter propriedades imunogênicas, uma proteína ou polipeptídeo em geral é capaz de estimular as células Th. No entanto, uma proteína carreadora que carece de um epitopo reconhecido por uma célula Th também pode ser imunogênica.

[000115] Ao selecionar uma proteína carreadora que é conhecida por provocar uma resposta imune forte (ou seja, é altamente imunogênica) e conter epitopos de células T auxiliares “pan DR” ou de “faixa universal” ou “ampla” (veja, por exemplo, WO 2008/057529), uma população variada de indivíduos pode ser tratada por uma composição de vacina de matriz proteica aqui descrita. A proteína carreadora desejavelmente é suficientemente estranha para provocar uma resposta imune forte à vacina. Tipicamente, a proteína carreadora utilizada é uma molécula que é capaz de estimular a imunogenicidade ao antígeno de interesse. Em uma modalidade desejável, uma proteína carreadora é aquela que é inerentemente altamente imunogênica. Assim, é desejável uma proteína carreadora que tem um elevado grau de imunogenicidade e é capaz de maximizar a produção de anticorpos ao(s) antígeno(s) complexados com ela.

[000116] Várias proteínas carreadoras úteis na prática da invenção incluem, por exemplo, toxinas e toxoides (químicos ou genéticos), que podem ou não ser mutantes, como a toxina do antraz, PA e DNI (PharmAthene, Inc.), o toxoide da difteria (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) ou CRM197, toxina do tétano, toxoide do tétano (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.), fragmento Z da toxina do tétano, exotoxina A ou mutantes de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, flagelina bacteriana, pneumolisina, uma proteína da membrana externa de Neisseria meningitidis (cepa disponível a partir de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Va.)), a proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina lábil ao calor de Escherichia coli, toxina semelhante a shiga, proteína LTB humana, um extrato proteico a partir de células bacterianas inteiras e qualquer outra proteína que pode ser reticulada por um ligante. Desejavelmente, a proteína carreadora é a subunidade B da toxina da cólera (disponível a partir de SBL Vaccin AB), toxoide da difteria ou CRM197 (Connaught, Inc.), o toxoide do tétano ou Fragmento C (disponível por Sigma Aldrich), DNI, ou beta-galactosidase da E. coli (disponível por Sigma Aldrich). Outras proteínas carreadoras desejáveis incluem a albumina do soro bovino (BSA), P40 e riboflavina de frango. (Salvo indicação em contrário, as proteínas carreadoras exemplares encontram-se comercialmente disponíveis a partir de Sigma Aldrich.) Outras proteínas carreadoras exemplares são MAPs (peptídeos multiantigênicos), que são peptídeos ramificados. Ao utilizar um MAP, a densidade de reticulação é maximizada por causa dos múltiplos resíduos de aminoácidos ramificados. Um resíduo de aminoácido desejável para fins de reticulação, o qual pode ser utilizado para formar um MAP, é, mas não está limitado a, lisina, possuindo um grupo amino livre em sua cadeia lateral.

[000117] Ambas BSA e hemocianina de lapa californiana (KLH) têm sido utilizadas como carreadores no desenvolvimento de vacinas quando realizando experiências com animais. Proteínas carreadoras que têm sido utilizadas no preparo de vacinas terapêuticas incluem, mas não estão limitadas a, um número de toxinas de bactérias patogênicas e seus toxoides. Exemplos incluem toxinas da difteria e tétano e seus toxoides correspondentes medicamente aceitáveis. Outros candidatos são proteínas antigenicamente similares às toxinas bacterianas conhecidas como materiais de reticulação (CRMs). Proteínas carreadoras úteis na prática da invenção podem também incluir qualquer proteína não derivada de seres humanos e não presente em qualquer substância alimentar humana.

[000118] Em modalidades desejáveis da invenção, as proteínas que formam estruturas em forma de anel são utilizadas para a produção de PCMV. Tais proteínas incluem as proteínas Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, “subunidades B” não tóxicas da toxina da cólera, enterotoxina lábil ao calor de Escherichia coli e toxina semelhante a shiga. Tais complexos de proteínas em forma de anel podem formar estruturas em que as cadeias lineares de PS penetram no canal central destes complexos de proteínas em forma de anel. Após a reticulação da proteína, tais complexos são previstas como sendo particularmente estáveis. Dados estruturais das proteínas sugerem que estes canais centrais são grandes o suficiente para as cadeias de PS entrarem facilmente. Por exemplo, o canal central do anel hexamérico de Hcp1 é de 42 angstroms, que é suficientemente largo para acomodar facilmente várias cadeias polissacarídeas de 5,5 angstrons de largura (Mougous et al., Science, 312 (5779):1526-1530 (2006)). Alternativamente, os anéis proteicos podem ser montados em torno do polissacarídeo (por exemplo, a partir de subunidades de uma proteína carreadora monomérica que se monta naturalmente em anéis sob determinadas condições físico-químicas). Tais proteínas monoméricas que podem se montar em anéis são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, pneumolisina (Walker et al., Infect. Immun., 55(5):1184-1189 (1987); Kanclerski e Mollby, J. Clin. Microbiol., 25(2):222 - 225 (1987)), listeriolisina O (Kayal e Charbit, FEMS Microbiol. Rev., 30:514-529 (2006); Mengaud et al., Infect. Immun., 55(12):3225-3227 (1987)), DNI , PA antraz, Hcp1, subunidade B da toxina da cólera, subunidade B da toxina de Shiga, flagelina e numerosas moléculas relacionadas conhecidas na técnica e compostas por vários micro-organismos.

[000119] Em outra modalidade desejável, agonistas do receptor semelhante a Toll (TLR) são utilizados como proteínas carreadoras. A ativação do receptor semelhante a Toll (TLR) é importante na formação da resposta imune adaptativa e pode desempenhar um papel na maturação por afinidade da resposta de anticorpos, alteração de isotipo e memória imunológica. Flagelina (FLA) de Vibrio cholerae é um agonista de TLR. A proteína FLA foi purificada por Escherichia coli recombinante e mostrou ser um potente ativador de TLR em um teste de indução de macrófagos de IL-6. Além disso, também se mostrou que uma proteína de Streptococcus pneumoniae bem conservada chamada “Pneumolisina” ativa TLR4 e, além disso, é um antígeno protetor. Assim, esta proteína também pode ser utilizada como uma proteína carreadora de matriz proteica.

[000120] Além disso, misturas de proteína da membrana externa (OMP) (por exemplo, as OMPs de Neisseria meningitidis) são utilizadas como a proteína carreadora para a vacina conjugada HIB produzida pela Merck e extratos proteicos de células bacterianas inteiras de Streptococcus pneumoniae se mostraram pelo menos parcialmente protetores em modelos de infecção em animais. Em modalidades desejáveis da invenção, estas misturas de proteínas podem ser utilizadas como proteínas carreadoras.

[000121] Em uma modalidade desejável, a composição de vacina é feita usando uma proteína carreadora que tem, por exemplo, pelo menos dois resíduos lisina ou outros resíduos que são desbloqueados, e que podem ser reticulados por modificação química. Em outras modalidades desejáveis, a proteína carreadora é um multímero (por exemplo, aquele que contém pelo menos cinco subunidades).

[000122] Em outra modalidade, DNI é usado como a proteína carreadora porque é não tóxico, não deixando qualquer necessidade de torná-lo menos tóxico antes da sua utilização. Além disso, o uso de DNI é desejável porque DNI também pode induzir uma resposta imune protetora a B. anthracis, além da resposta imune protetora induzida para o antígeno de interesse. Além disso, DNI não tem ligações dissulfureto internas. Tais ligações são susceptíveis de redução de boro-hidreto, o que pode desnaturar a proteína e resultar em perda de epitopos que induzem anticorpos neutralizantes da toxina do antraz.

Antígenos de Interesse

[000123] As composições de vacina da invenção e métodos de produzir e administrar tais vacinas podem ser utilizados para qualquer antígeno de interesse e são especialmente vantajosos para uso com os antígenos que não são por si só fortemente imunogênicos. Isto inclui, por exemplo, um grande número de antígenos de polissacarídeos, poliálcool, ou ácido poli amino. Desejavelmente, o antígeno de interesse não carrega grupos primários que podem ser destruídos pelas reações químicas empregadas pelo método de fabricação de vacinas, por exemplo, a desnaturação de um antígeno causada pela destruição das ligações dissulfureto de antígeno por redução com borohidreto. Exemplos de antígenos de interesse incluem, mas não estão limitados a polímeros orgânicos, como polissacarídeos (por exemplo, polissacáridos com pelo menos 18 resíduos), fosfopolissacarídeos, polissacarídeos com amino açúcares com substituições de N-acetila, polissacarídeos que contêm açúcares sulfonilados, outros açúcares modificados com sulfato ou açúcares modificados com fosfato, poliálcoois, ácidos poli amino, ácidos teicoicos, polissacarídeos O de lipopolissacarídeos. Exemplos de antígenos de interesse também incluem polímeros orgânicos capsulares incluindo aqueles sintetizados por micróbios, por exemplo, bactérias, fungos, parasitas e vírus e, em seguida, purificados a partir de uma tal fonte biológica utilizando métodos convencionais. Exemplos de antígenos de interesse incluem polímeros orgânicos capsulares microbianos incluindo aqueles purificados a partir de organismos bacterianos como espécies de Bacillus (incluindo B. anthracis) (Wang e Lucas, Infect. Immun., 72(9):5460-5463 (2004)), Streptococcus pneumoniae (Bentley et al., PLoS Genet., 2(3):e31 (2006); Kolkman et al., J. Biochemistry, 123:937945 (1998); e Kong et al., J. Med. Microbiol., 54:351-356 (2005)), Shigella (Zhao et al., Carbohydr. Res., 342(9):1275-1279 (2007)), Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli (Zhao et al., Carbohydr. Res., 342(9):1275-1279 (2007)) e Pseudomonas aeruginosa e organismos fúngicos como Cryptococcus e Candida, bem como muitos outros micro-organismos (veja, por exemplo, Ovodov, Biochemistry (Mosc.), 71(9):937-954 (2006); Lee et al., Adv. Exp. Med. Biol., 491:453-471 (2001); e Lee, Mol. Immunol., 24(10):1005-1019 (1987)). Exemplos de antígenos de interesse também incluem polímeros que não ocorrem na natureza e são, assim, de origem não biológica.

[000124] Antígenos de Streptococcus pneumoniae particulares incluem polissacarídeo capsular do tipo 1 (por exemplo, 1-g ou 1-q), 2 (por exemplo, 2-g, 2-q ou 2-41A), 3 (por exemplo, 3-g, 3-q, 3-c ou 3-nz), 4, 5 (por exemplo, 5-q, 5-c, 5-qaq ou 5-g), 6A (por exemplo, 6A-g, 6A- cl, 6A-c2, 6A-n, 6A-qaq, 6A-6B-g, 6A-6B-q ou 6A-6B-s), 6B (por exemplo, 6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B-q ou 6A-6B-s), 7F (por exemplo, 7F-7A), 7A (por exemplo, 7A-cn ou 7F-7A), 7B (por exemplo, 7B-40), 7C (por exemplo, 7C-19C-24B), 8 (por exemplo, 8-g ou 8-s), 9A (por exemplo, 9A-9V), 9L, 9N, 9V (por exemplo, 9A-9V), 9V and 14, 10F (por exemplo, 10F-q, 10F-ca, ou 10F-10C), 10A (por exemplo, 10A-17A ou 10A-23F), 10B (por exemplo, 10B-10C), 11F, 11A (por exemplo, 11A-nz ou 11A- 11D-18F), 11B (por exemplo, 11B-11C), 11C (por exemplo, 11B-11C. ou 11C-cn), 11D (por exemplo, 11A-11D-18F), 12F (por exemplo, 12F- q ou 12F-12A-12B), 12A (por exemplo, 12A-cn, 12A-46, ou 12F-12A- 12B), 12B (por exemplo, 12F-12A-12B), 13 (por exemplo, 13-20), 14 (por exemplo, 14-g, 14-q, 14-v, ou 14-c), 15F (por exemplo, 15F-cn1 ou 15F-cn2), 15A (por exemplo, 15A-ca1, 15A-ca2, ou 15A-chw), 15B (por exemplo, 15B-c, 15B-15C, 15B-15C-22F-22A), 15C (por exemplo, 15C- ca, 15C-q1, 15C-q2, 15C-q3, 15C-s, 15B-15C, ou 15B-15C-22F-22A), 16F (por exemplo, 16F-q ou 16F-nz), 16A, 17F (por exemplo, 17F-n and 17F-35B-35C-42), 17A (por exemplo, 17A-ca ou 10A-17A), 18F (por exemplo, 18F-ca, 18F-w, ou 11A-11D-18F), 18A (por exemplo, 18A-nz ou 18A-q), 18B (por exemplo, 18B-18C), 18C (por exemplo, 18B-18C), 19F (por exemplo, 19F-g1, 19F-g2, 19F-g3, 19F-q, 19F-n, ou 19F-c), 19A (por exemplo, 19A-g, 19A-, ou 19A-ca), 19B, 19C (por exemplo, 19C-cn1, 19C-cn2, ou 7C-19C-24B), (por exemplo, 13-20), 21 (por exemplo, 21-ca ou 21-cn), 22F (por exemplo, 15B-15C-22F-22A), 23F (por exemplo, 23F-c, 10A-23F, ou 23F-23A), 23B (por exemplo, 23B-c ou 23B-q), 24F (por exemplo, 24F-cn1, 24F-cn2, ou 24F-cn3), 24A, 24B (por exemplo, 7C-19C-24B), 25F (por exemplo, 25F-38), 25A, 27, 28F (por exemplo, 28F-28A ou 28F-cn), 28A (por exemplo, 28F-28A), 29 (por exemplo, 29-ca ou 29-q), 31, 32F (por exemplo, 32F-32A), 32A (por exemplo, 32A-cn ou 32F-32A), 33F (por exemplo, 33F-g, 33F-q, 33F- chw, 33F-33B, ou 33F-33A-35A), 33A (por exemplo, 33F-33A-35A), 33B (por exemplo, 33B-q, 33B-s, ou 33F-33B), 33D, 34 (por exemplo, 34-ca ou 34s), 35F (por exemplo, 35F-47F), 35A (por exemplo, 33F-33A-35A), 35B (por exemplo, 17F-35B-35C-42), 36, 37 (por exemplo, 37-g ou 37- ca), 38 (por exemplo, 25F-38), 39 (por exemplo, 39-cn1 ou 39-cn2), 40 (por exemplo, 7B-40), 41F (por exemplo, 41F-cn ou 41F-s), 41A (por exemplo, 2-41A), 42 (por exemplo, 17B-35B-35C-42), 43, 44, 45, 46 (por exemplo, 46-s ou 12A-46), 47F (por exemplo, 35F-47F), 47A, 48 (por exemplo, 48-cn1 ou 48-cn2), ou Número de Acesso ao GenBank AF532714 ou AF532715.

[000125] Menção particular é feita de polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em capsular tipo 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 ou 46.

Policátions

[000126] Desejavelmente, qualquer policátion que possui uma carga positiva repetitiva na forma de um grupo amina primário, secundário ou terciário livre pode ser usado na presente invenção. Policátions exemplares incluem, mas não estão limitados a poli-L-lisina, quitosana [copolímero ligado a β-(1-4) de 2-amino-2-des0xi-β-D-glucano (GlcN) e 2-acetamido-2-des0xi-β-D-glucano (GlcNAc)], poli arginina e polímeros sintéticos disponíveis comercialmente que contêm grupos amina livres como polietilenimina ramificada (PEI), Poliamina N7 (CAS 29320-38-5) e Etilenodiaminometil poliestireno (CAS 177987-93-8).

[000127] Em modalidades desejáveis, a poli-L-lisina é α-poli-L-lisina (alfa-poli-L-lisina) ou ε-poli-L-lisina (épsilon-poli-L-lisina). Os resíduos de lisina de poli-L-lisina são ligados através de uma ligação peptídica entre o grupo carboxila e ou o grupo amina de alfa (α-PLL) ou épsilon (ε-PLL). Desejavelmente, a poli-L-lisina é α-poli-L-lisina. α-Poli-L-lisina é sintetizada quimicamente e pode ser obtida em diversos pesos moleculares, por exemplo, 0,5 a 300 kDa. ε-poli-L-lisina é um homopolímero natural pequeno do aminoácido essencial L-lisina que é produzido por fermentação bacteriana, por exemplo, ε-poli-L-lisina pode ser isolada a partir de Streptomyces albulus, e tem uma massa molecular média de cerca de 4000 Da.

[000128] Acredita-se que os policátions realizam duas funções no processo de formação de uma vacina de matriz: 1) atuando como um contraíon para polímeros de antígeno carregados negativamente e 2) no caso de amina primária contendo policátions e agentes de reticulação que reagem com grupos amina, auxiliando na formação da matriz pela formação de reticulações com outras moléculas de policátion ou moléculas de proteína carreadora. Ambas estas propriedades de policátions irão permitir a retenção melhorada de antígenos na matriz proteica, melhorando assim o rendimento da formação de partículas de PCMV. Isto pode ser observado na Figura 1, onde a quantidade de polissacarídeos retidos na matriz aumentou de 5% a mais do que 50% com a adição de αPLL.

[000129] Uma vez que a formação de vacinas conjugadas também pode ser negativamente influenciada pela repulsa de cargas entre o antígeno e a proteína carreadora, o uso de um policátion pode também melhorar a eficiência da conjugação. Uma vez que muitas químicas de conjugação envolvem a ligação do polímero à proteína carreadora por meio de grupos amina primários da proteína carreadora (por exemplo, resíduos lisina), o uso de uma amina não primária contendo policátion, tal como poliarginina, pode ser benéfico para evitar a conjugação do antígeno de polímero ao policátion. No entanto, a amina primária contendo policátions também pode ser usada para ajudar a fazer uma vacina de matriz onde os polissacarídeos são intencionalmente ligados covalentemente ligados (reticulados) à matriz. A quantidade, tamanho e tipo do policátion necessário para melhorar a retenção de antígeno e a formação de matriz podem depender da composição, grau de carga negativa, tamanho, funcionalidade amina (ou outro grupo reativo), e a estrutura secundária ou terciária do antígeno polimérico. Além disso, se mais do que um antígeno polimérico é adicionado à reação de vacina de matriz (vacina multivalente), as interações entre polímeros pode influenciar o policátion, que é melhor em melhorar a retenção. Isto pode ser observado com as experiências de PPS-PCMV trivalente, 13-alente e 23-valente apresentadas nos Exemplos 5, 6, 8 e 9. Quando ε-PLL, que tem um peso molecular médio de 4000 Da, foi utilizada nas reações de PCMV trivalente, a retenção de polissacarídeo de PPS4, PPS18C e PPS23F foi modesta e, embora melhorando a imunogenicidade dos antígenos de polissacarídeos em comparação com o polissacarídeo sozinho, eles não se igualaram ao nível observado com a vacina conjugada. No entanto, quando ε-PLL foi usada para fazer a PPS-PCMV 13-valente, a imunogenicidade de PPS4 e PPS18C melhorou 3,4 vezes e 107 vezes, respectivamente, em comparação com a PPS-PCMV trivalente, sugerindo que a retenção desses dois polissacarídeos foi melhorada por ε-PLL devido às interações com os outros polissacarídeos na reação de PPS 13-valente. A utilização de α-PLL (150-300 kDa) nas reações trivalentes melhorou a imunogenicidade de PPS4 ainda mais, provocando um GMT que foi 132 vezes maior do que aquele induzido pela PCMV de PPS 13-valente. No entanto, o uso de α- PLL (150-300 kDa) na produção da PPS-PCMV 23-valente pareceu resultar em menos retenção de PPS4, visto que o GMT para PPS4 nesta PCMV foi 2650 vezes menor do que a PCMV PPS / α-PLL trivalente, sugerindo que os outros polissacarídeos na reação de 23-valente podem ter um impacto negativo sobre a retenção de PPS4 com α-PLL (150-300 kDa). A determinação da quantidade ideal, tamanho (peso molecular) e composição do componente de policátion usado para reter cada um ou um grupo de polissacarídeos ou outros antígenos pode ser determinada empiricamente através da análise da capacidade do policátion para fazer com que o(s) antígeno(s) de polissacarídeo se desloque para um peso molecular mais elevado, tal como determinado por cromatografia de exclusão de tamanho. Esta mudança, indicando a associação dos antígenos com partículas de maiores dimensões na medida em que o antígeno é retido e associado com uma matriz proteica, pode ser observada em várias das figuras aqui apresentadas e discutidas abaixo.

Composições de Vacina

[000130] As composições de vacina da invenção, incluindo PCMVS, podem ser usadas em combinação, por exemplo, em vacinas pediátricas. Além disso, as composições de vacina da invenção podem ser usadas para vacinar contra, por exemplo, infecção por pneumococos, infecção por Haemophilus influenzae tipo B (“HiB”), infecção por Streptococcus (grupos A e B), infecção meningocócica (por exemplo, Neisseria meningitidis), e podem ser utilizadas como vacinas de antígeno O e capsular contra bactérias Gram-negativas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis, espécies de Shigella, Salmonella enterica serovars, espécies de Acinetobacter, espécies de Burkholderia e Escherichia coli).

[000131] A formulação de vacina inclui desejavelmente pelo menos uma proteína carreadora, um ou mais antígenos de interesse, pelo menos um policátion e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fosfato de alumínio, cloreto de sódio, água estéril). Uma composição de vacina pode também incluir um sistema adjuvante para aumentar a imunogenicidade da formulação, como um sistema óleo em água, alúmen ou outros sistemas conhecidos na técnica ou outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Um complexo de matriz de antígeno / proteína carreadora / policátion que é insolúvel em condições fisiológicas é desejável para liberar lentamente o antígeno após administração a um indivíduo. Tal complexo desejavelmente é liberado em uma suspensão contendo excipientes farmaceuticamente aceitáveis. No entanto, o complexo de matriz de antígeno / proteína carreadora / policátion podem também ser solúvel em condições fisiológicas.

[000132] Tipicamente, a composição de vacina de matriz proteica é em um volume de cerca de 0,5 ml para injeção subcutânea; 0,5 ml para injeção intramuscular; 0,1 ml para injeção intradérmica ou 0,002 - 0,02 ml para administração por via percutânea. Uma dose de 0,5 ml da composição de vacina de matriz proteica pode conter cerca de 2-500 μg do antígeno retido com aproximadamente 2-500 μg da matriz de proteína carreadora / policátion. Em uma modalidade desejável, em uma dose de 0,5 ml, cerca de 10 μg do antígeno são retidos com aproximadamente 10 μg da matriz de proteína carreadora / policátion. A razão molar de antígeno para proteína carreadora / policátion é desejavelmente entre 1 a 10 (por exemplo, 1 parte de antígeno para 2 partes de carreador / policátion ou 1 parte de antígeno para 3 partes de carreador / policátion, etc., até 1 parte de antígeno para 10 partes de carreador / policátion) e 10 para 1 (por exemplo, 10 partes de antígeno para 1 parte de carreador / policátion ou 9 partes de antígeno para 1 parte de carreador / policátion, etc.). Em uma modalidade desejável, o razão molar de antígeno para carreador / policátion é de 1 para 1. Em alternativa, a razão em peso seco de antígeno para proteína carreadora / policátion é desejavelmente entre 1 para 10 e 10 para 1 (por exemplo, 1 para 1 em peso seco).

[000133] Uma vez que o complexo de matriz de antígeno / proteína carreadora / policátion pode ser degradado no estômago, a composição de vacina é desejavelmente administrada parentericamente (por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal ou intradérmica). Embora seja desejável a liberação por um meio que penetre fisicamente a camada dérmica (por exemplo, uma agulha, pistola de ar ou abrasão), as composições de vacina da invenção podem também ser administradas por absorção transdérmica.

[000134] Em particular, as composições de vacina da invenção podem ser administradas a um indivíduo, por exemplo, por injeção intramuscular, injeção intradérmica ou imunização transcutânea com adjuvantes imunológicos adequados. As composições de vacina da invenção podem ser administradas uma ou mais vezes, muitas vezes incluindo uma segunda administração concebida para estimular a produção de anticorpos em um indivíduo, para prevenir a infecção por um agente infeccioso correspondente ao(s) antígeno(s) incluído na vacina. A frequência e a quantidade de dosagem da vacina para obter a resposta imune desejada ou grau de imunidade dependem da atividade específica da vacina e pode ser facilmente determinada por experimentação de rotina. Por exemplo, para uma criança, um cronograma de vacina pode ser de três doses de 0,5 ml cada, em intervalos de cerca de quatro a oito semanas (começando aos dois meses de idade), seguidas de uma quarta dose de 0,5 ml em aproximadamente doze a quinze meses de idade. Uma quinta dose entre quatro e seis anos de idade pode ser desejável para algumas vacinas.

[000135] Embora seja de dois meses a idade em que a primeira dose é em geral administrada, a vacina pode ser administrada a crianças a partir de 6 semanas de idade. Para os adultos, duas ou mais doses de 0,5 ml administradas em intervalos de 2-8 semanas geralmente são suficientes para fornecer proteção a longo prazo. Uma dose de reforço é desejavelmente dada a cada dez anos a adultos previamente imunizados e crianças acima de 11 anos de idade.

[000136] As composições de vacina da presente invenção podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos vedados e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada), requerendo apenas a adição do carreador líquido estéril imediatamente antes da utilização. As vacinas da invenção podem ser formuladas em veículos farmacologicamente aceitáveis, por exemplo, gel de hidróxido de alumínio, preparo de adjuvante ou solução salina e, em seguida, administradas, por exemplo, por injeção intramuscular, injeção intradérmica ou imunização transcutânea com adjuvantes imunes adequados.

[000137] A invenção também inclui kits que incluem uma vacina descrita acima (por exemplo, uma PCMV). Os kits da invenção podem também incluir instruções para utilizar os kits em métodos de vacinação aqui descritos.

[000138] A eficácia do calendário de imunização pode ser determinada usando métodos padrão para a medição da titulação de anticorpos no indivíduo imunizado. Em geral, titulações de anticorpos médias (desejavelmente titulações de IgG) de cerca de 1 μg / ml são consideradas indicativas de proteção a longo prazo .

[000139] A invenção fornece composições de vacina contendo um antígeno de interesse retido com uma matriz de proteína carreadora / policátion, métodos de produção de tais composições de vacina, e métodos de administração da vacina. Descobriu-se que a eficiência da formação de PCMV e, portanto, a sua eficácia de custo como vacinas, é melhorada pela adição de um policátion, por exemplo, poli-L-lisina, à matriz proteica. Além disso, policátions podem também ser benéficos para melhorar a eficácia das reações de conjugação para a produção de vacinas conjugadas convencionais, em que o antígeno de polímero é ligado de modo covalente com a proteína carreadora, fazendo, assim, uma vacina conjugada mais custo eficaz. Resumidamente, tal como é aqui ensinado, as composições de vacina de matriz proteica que incorporam um policátion têm uma imunogenicidade aumentada em relação a composições constituídas de antígeno sozinho ou antígeno retido em uma matriz de proteína carreadora que não contenha policátion. Acredita-se que a imunogenicidade melhorada em composições de vacina de matriz proteica contendo policátion seja devido a uma melhor retenção do antígeno polissacarídeo na matriz de proteína / policátion, permitindo um maior nível de antígeno em uma dose de vacina em comparação com a mesma dose de uma vacina que fez não contém policátion. Tal como aqui discutido, as cápsulas de polissacarídeos de bactérias são compostas de açúcares de repetição e, para muitas bactérias patogênicas, estas cápsulas têm uma carga líquida negativa. A carga negativa da cápsula pode ser repelente à proteína da matriz, resultando em uma fraca retenção de antígeno polissacarídeo. Para neutralizar esta carga negativa, um policátion, por exemplo, poli-L-lisina (PLL), pode ser adicionado a reações de PCMV. Em adição, amina primária contendo policátions como PLL também pode ajudar na formação da matriz através da formação de reticulações entre outras moléculas de PLL ou moléculas de proteína carreadora.

[000140] Embora os exemplos abaixo ilustrem modalidades que utilizam policátions na formação de vacinas de matriz proteica, a utilização benéfica de policátions pode ser utilizada de forma semelhante também na produção de vacinas conjugadas convencionais.

[000141] A invenção é descrita abaixo com referência a exemplos específicos, modalidades e figuras, cuja finalidade é ilustrar a invenção, e não limitar seu âmbito. Os seguintes exemplos não devem ser interpretados como limitantes.

Exemplo 1: PCMV de Vi-CRM197-αPLL

[000142] O efeito da adição de policátions em composições de vacina de matriz foi investigado usando cápsula de polissacarídeo Vi de Salmonella enterica Serovar Typhi como um antígeno, usando uma toxina CRM197 da difteria não-tóxica como uma proteína carreadora (preparada em Matrivax Research and Development Corporation, Boston, MA, EUA), e α-poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como o policátion.

[000143] Vi é um homopolímero altamente aniônico composto de (α1- 4)-D-GalANAc variavelmente O-acetilado em C-3. Uma das atuais vacinas aprovadas para a febre tifoide é TyphimVi® (Sanofi Pasteur SA), que contém polissacarídeo Vi não conjugado como antígeno. Em estudos iniciais para testar se as vacinas de matriz proteica podem ser utilizadas com sucesso para liberar antígeno Vi e induzir uma resposta imune, PCMVS foram preparadas em reações contendo 4 mg / mL de Vi como o antígeno e 4 mg / mL de CRM197 como a proteína carreadora formadora de matriz. A formação da matriz foi iniciada pela adição de glutaraldeído como o agente de reticulação. Após incubação durante 24 horas a 4 °C com agitação constante, a reação foi separada em uma coluna de 2,6 x 10 cm de Sepharose CL2B e frações de elevado peso molecular foram coletadas, com o adjuvante alúmen, e utilizadas para imunizar camundongos. Utilizando a quantidade de Vi que deslocou para um peso molecular mais elevado mediante reação, foi estimado que < 5% do Vi na reação de PCMV foi retido na matriz proteica. Titulações de anticorpos anti-Vi para as composições de PCMV foram aproximadamente 3 vezes mais elevadas do que o polissacarídeo sozinho (controle), mas foram inferiores àquelas provocadas pela vacina de polissacarídeo Vi corrente comercial TyphimVi®. Em contraste, mostrou-se na literatura que vacinas conjugadas de Vi, por exemplo, Vi-CRM197, provocam titulações que foram 40-100 vezes maiores do que o polissacarídeo sozinho. Veja, por exemplo, Rondini et al., 2011, Clinical and Vaccine Immunology, 18: 460-468; Cui et al., 2010, Clinical and Vaccine Immunology, 17:73-79; An et al. 2011 Vaccine 44:7618-7623 Micoli et al., 2011, Vaccine, 29:712-720.

[000144] A fraca imunogenicidade de partículas de PCMV de Vi em comparação com as vacinas conjugadas foi pensada como sendo potencialmente devido a uma má retenção do Vi na matriz CRM197, má separação de partículas de pCMV de Vi não-retido (livre) ou ambas.

[000145] Devido à elevada natureza aniônica de Vi, foi levantada a hipótese de que Vi é repelente a CRM197 durante a etapa chave de reticulação e interfere com a retenção eficaz em partículas de PCMV.

[000146] Inicialmente, investigou-se se a adição de sal à PCMV reduz a repulsa de carga, no entanto, formou-se um precipitado insolúvel após a reticulação.

[000147] O efeito de um policátion foi investigado no processo de PCMV: Duas PCMVS foram preparadas para a primeira experiência de imunização utilizando poli-L-lisina (PLL), cada reação de PCMV continha 4 mg / ml de Vi, 4 mg / ml de CRM197 e 0,01% de α-poli-L- lisina (150-300 kDa). Vi e α-poli-L-lisina (α-PLL) foram incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes da adição de 0,25% de glutaraldeído como agente de reticulação e CRM197 como a proteína carreadora. 0,01 mg / mL de flagelina (Flg) de Salmonella enterica serovar Typhimurium foi adicionado a uma das misturas de reação como um aditivo adjuvante. A incubação foi continuada durante mais 10 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes de ser colocada a 4°C durante 24 horas com agitação constante. A separação das reações de PCMV foi realizada em uma coluna de 2,6 cm x 30 cm de Sephacryl S-1000. Após a separação dos produtos da reação na coluna, os níveis de proteínas e polissacarídeos foram determinados usando kits de teste microBCA (Pierce Chemical ) e Stains-All (Sigma Chemical), respectivamente. Aproximadamente 20% do Vi foi alterado para um peso molecular mais elevado e co-eluído com o pico de proteína, sugerindo que o Vi foi retido na matriz da proteína carreadora / policátion (Figura 2). Estas frações de elevado peso molecular foram recolhidas e agrupadas (veja, Figura 2, frações em caixas), adjuvadas com alúmen, e utilizadas para imunização.

[000148] Grupos de cinco camundongos BalBC (Jackson Laboratories) foram imunizados com 10 μg de Vi na forma de PCMV, Vi Matrivax sozinho ou vacina de polissacarídeo Vi tifoide TyphimVi® (Sanofi Pasteur SA) em 3 intervalos quinzenais. Os camundongos foram sacrificados três semanas após sua última imunização e o nível de anticorpos específicos de Vi determinado por testes ELISA. Médias geométricas das titulações finais (GMTs) das imunizações acima são apresentadas na Tabela 1. Tabela 1. Imunogenicidade de PCMVs de Vi-CRM197 feitas com αPLL

[000149] A partir destes resultados, pode ser visto que usando α-PLL em reações, as PCMVs provocaram titulações de anticorpos anti-VI que foram 40 vezes maiores que as observadas com o polissacarídeo Vi sozinho (Tabela 1). Além disso, a incorporação de pequenas quantidades de flagelina na PCMV contendo α-PLL levou a titulações ainda mais elevadas de anticorpos anti-Vi com ums GMT que foi 300 vezes maior do que a imunização com o polissacarídeo Vi sozinho e 7,5 vezes maior do que a PCMV sem flagelina. A presença da flagelina não afetou a quantidade de Vi retido por PLL (dados não mostrados).

[000150] Interessantemente, a poli-L-arginina (PLA, que também é um policátion e contém o mesmo grau de carga positiva como PLL, mas que não contém a aminas primárias de repetição, não melhorou a retenção de Vi (dados não mostrados), indicando que a PLL foi neutralizante da carga negativa do VI, bem como auxiliar na formação de matriz por reticulação a outras moléculas de PLL e CRM197.

Exemplo 2: Separação Melhorada de PCMVs de Vi-CRM197-αPLL

[000151] A fim de melhor eliminar as espécies de baixo peso molecular (que se supõe não retidas, polímero de antígeno não conjugado) das partículas de PCMV, foi utilizada uma coluna de exclusão de tamanho mais longo (90 cm). Especificamente, foi preparada uma mistura de reação de reticulação de PCMV contendo 4 mg / ml de Vi, 4 mg / ml de CRM 197 e 0,01% de α-poli-L-lisina (150-300 kDa). Vi e αPLL foram incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes da adição de 0,25% de glutaraldeído e CRM197. A incubação foi continuada durante 10 minutos adicionais à temperatura ambiente com agitação contínua, seguida por incubação durante 24 horas a 4°C com agitação constante. Após a separação do produto de reação na coluna SEC, os níveis de proteínas e polissacarídeos foram determinados usando microBCA e teste Stains- All, respectivamente. Para determinar se o tamanho ou peso molecular das partículas de PCMV afetam sua imunogenicidade, frações de 3 pontos de eluição diferentes da coluna SEC foram agrupadas e utilizadas para imunização. As seleções agrupadas estão ilustradas na Figura 3. Grupo 1 e Grupo 2 não diferem significativamente na sua eluição a partir a coluna, no entanto, o grupo 3 foi suspeito de ter um peso molecular inferior aos grupos 1 e 2 e conter mais Vi não retido.

[000152] Grupos de cinco camundongos foram imunizados com 10 μg de Vi das composições em questão por meio de 3 injeções quinzenais. Os camundongos foram sacrificados três semanas após sua última imunização e o nível de anticorpos específicos de Vi determinado por testes ELISA. As GMTs finais das imunizações acima foram comparadas (Tabela 2).

[000153] A combinação de PLL e melhor separação por tamanho permitiu fazer uma PCMVs de Vi - CRM197 que provocou titulações de anticorpos anti-Vi que foram 485 vezes a 1400 vezes maiores do que Vi isoladamente e 22 vezes maiores do que a vacina contra febre tifoide TyphimVi® (Tabela 2; grupos 1 e 2). Tabela 2. Imunogenicidade de frações de diferentes tamanhos de uma PCMV de Vi-CRM197-αPLL

[000154] Embora a GMT para PCMV do grupo 3 tenha sido 44 vezes mais elevada do que Vi isoladamente e 1,3 vezes mais elevada do que a vacina contra febre tifoide TyphimVi® comercial, ela foi menor do que aquelas provocadas pelos grupos 1 e 2. Isto é provavelmente devido ao peso molecular inferior das PCMVs e / ou a presença de maiores quantidades de Vi não retido, ou “livre”.

Exemplo 3: PCMV de PPS18C-CRM197-αPLL

[000155] Com a melhoria na retenção de Vi usando α-PLL, a seguir testou-se se α-PLL melhora a retenção do polissacarídeo pneumocócico menos carregado negativamente PPS18C. Ao contrário do Vi, onde cada resíduo de açúcar é carregado negativamente, PPS18C tem apenas uma única carga negativa para cada 5 resíduos de açúcar. No entanto, a inclusão de 0,04% de α-PLL (15-30 kDa) nas reações de PCMV resultou em uma alteração de 35% do polissacárido de um peso molecular mais baixo para uma fração de peso molecular mais elevado, quando separados por SEC (Figura 4). A maior parte da CRM197 presente na reação de PCMV também se colocalizou nas frações de elevado peso molecular. O polissacarídeo presente nas frações de elevado peso molecular foi mostrado como sendo capturado em uma partícula de PCMV usando um teste de ELISA de captura, onde as partículas de PCMV estão ligadas à placa de ELISA por meio de anticorpos anti-CRM197 e o polissacarídeo detectado utilizando antissoros específicos de sorotipo (dados não mostrados).

Exemplo 4: Aumento da PLL Aumenta a Retenção de Vi em PCMV

[000156] As reações de reticulação de PCMV foram realizadas utilizando 0,01% e 0,02% de αPLL (150-300 kDa) e 0,04% de αPLL (1530 kDa), 4 mg / mL de Vi e 4 mg / mL de CRM197. As reações foram separadas em uma coluna de 500 mL (90 cm x 2,6 cm) Sephacryl S- 1000 e as frações analisadas quanto a proteína e polissacarídeo usando teste microBCA e Stains-all, respectivamente (Figura 5). Aumentando a concentração de PLL (150-300 kDa) de 0,01% a 0,02%, a quantidade de Vi retido aumentou de 15% para 21%. O aumento da retenção de Vi não teve nenhum efeito sobre a imunogenicidade da PCMV com PCMVs sintetizadas utilizando ambas as concentrações de PLL que provocam titulações de anticorpos anti-Vi que foram 14 a 20 vezes mais elevadas do que Vi isoladamente e 2 a 3 vezes mais elevadas do que a vacina contra a febre tifoide TyphimVi® (dados não mostrados). Quando 0,04% de uma α-PLL menor (15-30 kDa) foi utilizado, a quantidade de Vi retido aumentou para 64%. O aumento da retenção com a PLL de peso molecular mais baixo não resultou em melhor imunogenicidade da PCMV em relação ao Vi sozinho (dados não mostrados). Levantou-se a hipótese de que a maior concentração da α-PLL de peso molecular mais baixo (15-30 kDa) pode estar mascarando epitopos de Vi (dados não mostrados).

Exemplo 5: PCMV Trivalente

[000157] Para investigar se os efeitos benéficos de um policátion para uma PCMV poderiam ser usados em PCMVs multivalentes, foi preparada uma vacina pneumocócica trivalente incorporando antígenos polissacarídeos pneumocócicos PPS18C, PPS4 e PPS23F. A PCMV foi preparada como se segue: a mistura de reação de PCMV continha 5 mg / ml de polissacarídeo total (cerca de 1,7 mg / ml cada de PPS18C, PPS4 e PPS23F), 1 mg / ml de CRM197 e 0,04% de ε-poli-L-lisina (4 kDa, Bainafo Bioengineering Co. Ltd., Zhengzhou, PRC). Polissacarídeo e ε-poli-L-lisina foram incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes da adição de 0,25% de glutaraldeído como agente de reticulação e CRM197 como a proteína matriz. A incubação foi continuada durante mais 10 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes de ser colocada a 4 °C durante 24 horas com agitação constante. A separação da PCMV de PPS18C/PPS4/PPS23-CRM197-εPLL foi realizada em uma coluna Sephacryl S-1000 de 2,6 x 90 cm. As frações foram analisadas quanto a polissacarídeo utilizando o teste de antrona, quanto à proteína por MicroBCA, e quanto à retenção de cada polissacarídeo em partículas de PCMV, utilizando um ELISA de captura (veja Figura 5). O teste de antrona é um teste colorimétrico para a detecção de hexoses após hidrólise em ácido sulfúrico concentrado. Trevelyan, et al., 1952, “Determination of Yeast Carbohydrates with the Anthrone Reagent”, Nature, 170(4328): 626-627. Um forte ELISA de captura positivo foi observado para PPS4 (dados não mostrados), no entanto, fracos sinais foram observados com PPS18C e 23F. Frações contendo polissacárido de alto peso molecular que foram positivas no ELISA de captura foram reunidas (veja, Figura 6, frações em caixas), adjuvadas com alúmem e utilizadas para vacinação.

[000158] Grupos de 10 camundongos foram imunizados usando o mesmo regime de medicação como acima descrito para Vi-PCMVs. Para as PCMVs trivalentes em batelada, cada dose continha 2 μg cada de PS ou 6 μg de polissacarídeos totais. A vacina conjugada Prevnar®13 (que contém 2,2 μg de cada PS por dose, exceto para 6B, que está a 4 μg para um total de 30,8 μg de PPS) foi administrada a um grupo de camundongos como um controle positivo para comparação com as respostas de anticorpo induzidas por PCMV. Um grupo de camundongos foi também imunizado com os antígenos apenas, isto é, os treze antígenos polissacarídeos não conjugados encontrados na Prevnar®13 13-valente, a 2 μg de cada polissacarídeo para um total de 26 μg de polissacarídeo total por dose. Um grupo de camundongos naturais (não vacinados) também foi incluído como grupo controle negativo.

[000159] Em cerca de 2,5 semanas (dia 47) após a terceira imunização, todos os camundongos foram sacrificados e o sangue recolhido por punção cardíaca. Os soros imunes foram analisados por ELISA específicos de PPS para respostas de anticorpos IgG específicos para antígeno que reconhecem PPS4, PPS18C e PPS23. Médias geométricas das titulações de anticorpo IgG anti-PPS (GMT) foram calculadas a partir das titulações de soros individuais de animais imunizados. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo. Tabela 3. Titulações de Anticorpos de PCMV Trivalente de PPS18C/PPS4/PPS23-CRM197-εPLL

[000160] Como pode ser visto na Tabela 3, a PCMV em batelada contendo ε-PLL provocou uma GMT anti-PPS4 que foi 179 vezes maior do que polissacarídeos apenas, uma GMT anti-PPS18C que foi 29 vezes maior do que o polissacarídeo sozinho e uma GMT anti-PPS23F que foi 53 vezes maior do que o polissacarídeo sozinho. Estas GMTs foram 37 vezes mais baixas, 8,3 vezes mais baixas e 2,8 vezes mais baixas do que a GMT da vacina conjugada Prevnar®13 para PPS4, PPS18C e PPS23F, respectivamente. Embora as titulações provocadas pela PCMV trivalente em batelada não tenham sido tão elevadas como aquelas induzidas pela vacina conjugada Prevnar®13, elas representaram uma melhora acentuada sobre o uso do antígeno sozinho e sobre PCMVs polissacarídeas pneumocócicas anteriores feitas sem PLL e usando DNI como a proteína da matriz. Este estudo demonstra a viabilidade de utilização da adição de policátion na formação de PCMV para melhorar a imunogenicidade de vacinas polivalentes, bem como as vacinas monovalentes. Além disso, é claramente vantajosa a facilidade de produção de vacina multivalente usando tecnologia PCMV em comparação com a produção de vacina conjugada convencional.

Exemplo 6: PCMV Polissacarídea Pneumocócica 13-valente em Batelada

[000161] Uma vacina pneumocócica 13-valente incorporando os antígenos polissacarídeos pneumocócicos atualmente incluídos na vacina conjugada Prevnar®13, ou seja, PPS1, PPS3, PPS4, PPS5, PPS6A, PPS6B, PPS7F, PPS9V, PPS14, PPS18C, PPS19A, PPS19F e PPS23F, foi preparada e testada para investigar ainda mais os efeitos benéficos da adição de policátion a misturas de reação formadoras de matriz de PCMV.

[000162] A PCMV foi preparada como a seguir: uma mistura de reação de PCMV continha 4 mg / ml de polissacarídeos totais (aproximadamente 0,3 mg / ml cada de cada antígeno polissacarídeo), 4 mg / ml de CRM197 e 0,4 mg / ml de ε-poli-L-lisina (4 kDa, Bainafo Bioengineering Co. Ltd., Zhengzhou, PRC). O polissacarídeo e ε-poli-L- lisina foram incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes da adição de 0,25% de glutaraldeído como agente de reticulação e CRM197 como proteína da matriz. A incubação foi continuada durante mais 10 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes de ser colocada a 4 °C durante 24 horas com agitação constante. A separação da PCMV de PPS-CRM197-εPLL foi realizada em uma coluna de 2,6 x 90 cm Sephacryl S-1000. As frações foram analisadas quanto a polissacarídeo utilizando o teste de antrona, quanto a proteína por MicroBCA e quanto à retenção de cada polissacarídeo em partículas de pCMV por ELISA de captura. As frações contendo polissacárido de alto peso molecular que foram positivas no ELISA de captura foram reunidas (veja, Figura 7, frações em caixas), adjuvadas com alúmem e utilizadas para imunizações.

[000163] Grupos de 10 camundongos foram imunizados usando o regime de medicação anteriormente descrito nos dias 0, 14 e 28. Para a PCMV em batelada 13-valente, cada dose continha 4 μg de polissacarídeos totais. A vacina conjugada Prevnar®13, que contém 2,2 μg de cada polissacarídeo por dose, exceto para 6B, que está a 4 μg para um total de 30,8 μg de PPS, foi administrada a um grupo de camundongos como um controle positivo para comparação com as respostas de anticorpos induzidas por PCMV. Um grupo de camundongos também foi imunizado com os antígenos apenas, isto é, os treze antígenos polissacarídeos não conjugados encontrados na Prevnar®13 13-valente, a 2 μg de cada polissacarídeo para um total de 26 μg de polissacarídeo total por dose. Um grupo de camundongos naturais (não vacinados) também foi incluído como um grupo de controle negativo.

[000164] Em cerca de 2,5 semanas (dia 47) após a terceira imunização, todos os camundongos foram sacrificados e o sangue recolhido por punção cardíaca. Os soros imunes foram analisados por ELISA específico doe PPS quanto a respostas de anticorpos IgG específicas para o antígeno para dez dos antígenos de PPS. Médias geométricas das titulações de anticorpo IgG anti-PPS (GMT) foram calculadas a partir das titulações de soros individuais de animais imunizados. Os resultados estão mostrados na Tabela 4.

[000165] GMT de IgG final de soros de camundongos imunizados com formulações de PCMV em batelada foi muito superior à GMT de camundongos imunizados com PPS apenas (variando de 8 vezes a cerca de 3.000 vezes mais elevada do que PPS apenas). A partir dos dados da Tabela 4, pode ser visto que a PCMV 13-valente em batelada contendo ε-PLL induziu GMT de IgG comparável à GMT obtida por imunização com Prevnar®-13 (2 ou 4 μg de cada PPS), dependendo do antígeno PPS examinado, usando substancialmente menos antígeno PPS (~ 0,3 μg / PPS em PCMV versus 2 μg / 4 μg de PPS em Prevnar®13).

[000166] A partir dos dados imunológicos da Tabela 3 e Tabela 4 acima, fica evidente que as PCMVs tri- e 13-valente contendo ε-PLL demonstram respostas imunes de anticorpos muito mais fortes do que as PCMVs anteriores que não contêm PLL ou outro policátion. Reformulação com níveis mais elevados de reagentes e fracionamento do tamanho das PCMVs para remover antígeno(s) polissacarídeo(s) não incorporados e monômero de proteína da matriz, por exemplo, em uma coluna de maior dimensionamento, aumentou a resposta imune específica para o antígeno em relação ao antígeno apenas. Além disso, a inclusão de polímeros policatiônicos α-PLL e / ou ε-PLL aumenta a eficácia de retenção de PS na matriz CRM-197-PCMV e provoca uma resposta imune 3 a 125 vezes mais forte em comparação com formulações DNI-PCMV que não incluíram α-PLL e ε-PLL (veja exemplo 7). Como pode ser visto a partir das tabelas acima, a resposta de anticorpo específico para o antígeno induzida por PCMVs formuladas com PLL é algumas vezes menor, comparável ou superior à magnitude das respostas imunes de antígeno anti-PPS obtidas pela vacina conjugada Prevnar®13; entretanto, quando se observa que as PCMVs PPS(13)-CRM197-εPLL contêm 0,3 μg de cada antígeno polissacarídeo por dose em comparação com 2 μg ou 4 μg de cada antígeno PPS na vacina conjugada Prevnar®13, é apreciado que as PCMVs proporcionam uma composição imunogênica excepcionalmente eficiente e que também é feito de forma eficiente em apenas uma etapa de reação (em comparação com a multiplicidade de reações de conjugação separadas necessárias para a fabricação da vacina Prevnar®13).

Exemplo 7: Coquetel de PCMVs de PPS-DNI 13-valente com Agregados em Bateladas

[000167] Uma série de PCMVs foi feita utilizando uma forma mutante não tóxica do antígeno protetor de B. anthracis (DNI) como a proteína carreadora. Treze vacinas de matriz proteica de PPS / DNI separadas foram sintetizadas, cada uma contendo um antígeno polissacarídeo pneumocócico diferente (PPS), seguindo o mesmo procedimento de reação de reticulação com 0,25% de glutaraldeído como descrito acima. As PCMVs foram então separadas por tamanho em uma coluna de 2,6 x 15 cm de Sepharose CL2B. Além disso, as reações de reticulação de PCMV foram realizadas, que continham quatro antígenos polissacarídeos na mesma reação de PCMV (antígenos em batelada), para se obter PCMVs multivalentes. As PCMVs polivalentes continham os seguintes “agregados” de antígenos: • Agregado 1: PPS3, PPS18C, PPS19F, PPS23F • Agregado 2: PPS4, PPS6A, PPS6B, PPS14 • Agregado 3: PPS5, PPS7F, PPS9V, PPS19A

[000168] PPS1 não foi incluído nas reações de PCMV com agregados porque contém uma amina primária em sua estrutura de repetição que pode ser covalentemente reticulada à proteína carreadora na presença de glutaraldeído. As PCMVs com agregados de antígenos foram então separadas por SEC, do mesmo modo como as PCMVs monovalentes. As treze composições de vacina separadas foram preparadas em coquetel para fazer o coquetel de PPS-DNI-PCMV 13-valente. As três PCMVs com agregados de antígenos incluindo a PCMV PPS1-DNI individual também foram preparadas em coquetel para fazer uma PCMV 13-valente com agregado em batelada. Grupos de 10 camundongos foram imunizados utilizando ou o coquetel de PCMVs monovalentes ou o coquetel de PCMVs de antígenos em batelada. Para as PCMVs monovalentes em coquetel, os camundongos receberam ou 2,2 μg ou 6 μg de cada polissacarídeo. Para os agregados em bateladas, no entanto, de apenas 0,5 μg de cada polissacarídeo foi liberado em cada dose, exceto para PPS1, em que 2,2 μg foram liberados. Como controles, os grupos de camundongos foram imunizados com os 13 polissacarídeos sozinhos ou a vacina conjugada Prevnar®13. Cada dose de Prevnar® continha 2 μg de cada polissacarídeo, exceto PPS6B que está a 4 μg. A Tabela 5 a seguir apresenta um resumo das titulações de anticorpos anti-PPS de camundongos imunizados com as pCMVS em coquetel e com agregados em coquetel. Tabela 5. Titulações de Anticorpo Anti-PPS de Coquetel de PCMVs 13- valentes

(Tabela 5, continuação)

[000169] Ambos os “coquetéis” de PCMV provocaram titulações específicas para o antígeno de polissacarídeos que foram acima daquelas provocadas pelos antígenos polissacarídeos apenas, no entanto, elas foram 2 a 200 vezes menores do que as titulações provocadas pela vacina conjugada Prevnar®13 (Pfizer Inc., EUA). Os resultados mostram que a agregação de PCMVs de antígenos em batelada levou a maiores titulações de anticorpos para quase todos os antígenos em comparação à imunização com os coquetéis de PCMVs monovalentes. A resposta imune diminuída dos coquetéis de PCMVs em comparação com Prevnar®13 foi provavelmente devido a uma má retenção de polissacarídeos e separação das PCMVs do polissacarídeo livre, e não à quantidade de polissacarídeo liberada por dose.

Exemplo 8: PCMV de PPS-CRM197-αPLL trivalente em Bateladas e Adição de Flagelina

[000170] Uma PCMV trivalente contendo antígenos polissacarídeos pneumocócicos PPS4, 18C e 23F e CRM197 como uma proteína carreadora formadora de matriz e poli-L-lisina foi produzida com e sem flagelina. As PCMVs foram preparadas conforme a seguir: a mistura de reação de PCMV continha 4 mg / ml de polissacarídeos totais (1,33 mg / ml de cada polissacarídeo), 4 mg / ml de CRM197 e 0,01% de αPLL (150-300 kDa). Os polissacarídeos e αPLL foram incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua antes da adição de 0,25% de glutaraldeído. 0,001 mg / mL de flagelina de Salmonella Typhimurium (InvivoGen, San Diego, CA, EUA) também foi adicionado à mistura de reação de PCMV com o glutaraldeído. A incubação foi continuada durante mais 30 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua. Os produtos de reação de PCMV foram separados em uma coluna de 2,6 x 90 cm de Sephacryl S-1000 e as frações de elevado peso molecular foram recolhidas e agrupadas (veja, Figura 8, frações em caixas). Após a separação de reação na coluna, os níveis de proteínas e polissacarídeos foram determinados usando os testes de antrona e microBCA, respectivamente.

[000171] Grupos de 10 camundongos foram imunizados como em exemplos anteriores utilizando ou PCMV de antígenos em bateladas sem flagelina ou a PCMV de antígenos em bateladas com flagelina e utilizados para imunizar os camundongos. Os controles positivos e negativos foram como nos exemplos anteriores. Os resultados são apresentados na Tabela 6. Tabela 6. Titulações de Anticorpos Anti-PPS de PCMVs de PPS- CRM197 Trivalentes com Agregados

[000172] Na PCMV que não continha flagelina, as titulações deanticorpos anti-PPS4 e PPS18 foram 59.000 vezes e 3055 vezes mais elevadas do que o polissacarídeo sozinho e 11 vezes e 22 vezes mais elevadas do que a Prevnar®13, respectivamente, em uma dose comparável (veja, Tabela 7). As titulações para PPS23F foram ligeiramente maiores do que polissacarídeo sozinho e menores do que as provocadas por Prevnar®, sugerindo que apenas baixos níveis de PPS23F foram retidos na partícula de PCMV. Estes dados em comparação com os dados da PCMV trivalente PPS-CRM197- εPLL anteriores (veja Exemplo 5) indicam que o uso do peso molecular mais elevado αPLL como o policátion levou a uma melhor retenção de antígeno na matriz de PCMV e que a seleção sensata de antígenos para serem co-retidos na matriz proteica, a eliminação das espécies não imunogênicas por, por exemplo, exclusão por tamanho de componentes de baixo peso molecular do produto da reação de formação de matriz, a utilização sensata dos elementos adjuvantes, por exemplo, flagelina, e o controle sensato da quantidade de antígeno retido e que pode ser liberada por dose fornecem composições de vacina PCMV de imunogenicidade comparável e até mesmo superior à dos produtos comerciais de vacina conjugada hoje comercializados.

Exemplo 9: PCMVs PPS-CRM197 23-valente

[000173] Com o aumento na retenção de polissacarídeo e imunogenicidade observada usando α-PLL (150-300 kDa) no PPS- PCMV trivalente, uma PPS-PCMV 23-valente foi produzida utilizando os 23 polissacarídeos da vacina comercial Pneumovax®. Após a dessalinização e concentração dos 23 polissacarídeos da Pneumovax® a 4 mg / mL (0,17 mg / mL de cada polissacarídeo), eles foram incubados com 0,01% de α-PLL (150-300 kDa) durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação constante. 0,25% de glutaraldeído foi adicionado juntamente com 4 mg / mL de CRM197 e a incubação continuou durante 10 minutos à temperatura ambiente com agitação constante, antes de ser incubado durante 24 horas a 4°C com agitação constante. A reação de PCMV foi separada em uma coluna de 2,6 cm x 90 cm de Sephacryl S-1000 e a quantidade de polissacarídeo total e proteína em frações determinadas utilizando os testes de antrona e microBCA, respectivamente (Figura 9). As frações de elevado peso molecular indicadas pela caixa na Figura 9 foram agrupadas e utilizadas para imunização.

[000174] Grupos de 10 camundongos foram imunizados como nos exemplos anteriores. Os controles positivos e negativos foram como nos exemplos anteriores. Os resultados são apresentados na Tabela 7. Tabela 7. GMTs anti-PPS a partir de PCMV PPS-CRM197-αPLL 23- valente (150-300 kDa)

(Tabela 7, Continuação)

[000175] A PPS-PCMV 23-valente provocou GMTs para PPS1, PPS14 e PPS18C que foram 77 vezes, 4,9 vezes e 134 vezes mais elevadas do que aquelas provocadas pela vacina conjugada Prevnar®13, enquanto as GMTs para PPS3 e PPS19F foram equivalentes àquelas induzidas por Prevnar®13. Na PCMV 23-valente de acordo com a presente invenção, apenas 0,26 μg de cada polissacarídeo foi liberado por dose, enquanto cada dose de Prevnar®13 contém 2,2 μg de cada polissacarídeo (exceto PPB6B que está a 4 μg), indicando que a PCMV 23-valente foi capaz de provocar titulações mais elevadas do que Prevnar®13 para vários polissacarídeos a uma dose 7 vezes menor. Embora as GMTs para os outros polissacarídeos testados nesta experiência de imunogenicidade tenham sido inferiores aquelas obtidas por Prevnar®13, eles ainda foram em geral mais elevadas do que o polissacarídeo sozinho.

[000176] Todas as patentes, pedidos de patente, publicações de pedidos de patentes e outras publicações citadas ou referidas são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada patente, pedido de patente, publicação de pedido de patente independente ou publicação fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.

Claims

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende (1) um ou mais antígenos de interesse, (2) uma ou mais proteínas carreadoras, e (3) um ou mais policátions, em que o referido policátion é selecionado a partir do grupo que consiste em: poli-L-lisina, poli-L-arginina, polietilenimina ramificada (PEI), espermidina, espermina, copo-límero [β-(1-4)-ligado de quitosana de 2-amino-2- des0xi-β-D-glucano (GlcN) e 2-acetamido-2-des0xi-β-D-glucano (GlcNAc)], Poliamina N7 (CAS 29320-38-5) e Etilenodiaminometil poliestireno (CAS 177987-93-8), em que a referida proteína carreadora e o referido policátion são reticulados para formar uma matriz proteica, e em que o referido antígeno de interesse é aprisionado pela referida matriz proteica.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido policátion é poli-L-lisina (PLL).

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida poli-L-lisina é α-poli-L-lisina (α- PLL) ou ε-poli-L-lisina (ε-PLL).

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a referida poli-L-lisina é α-poli-L-lisina (α- PLL).

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que a referida composição é constituída por partículas de matriz proteica possuindo um tamanho de partícula médio superior a 50 nm de diâmetro.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende partículas de matriz proteica possuindo um diâmetro de tamanho de partícula médio superior a 100 nm - 2000 nm.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a razão molar do antígeno para a proteína carreadora é entre 1 para 10 e 10 para 1.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o percentual de policátion por mistura reacional é de 0,005 a 0,10%.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno de interesse compreende dois ou mais antígenos.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno de interesse é um polissacarídeo.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o polissacarídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae, polissacarídeo de Francisella tularensis, polissacarídeo de Bacillus anthracis, polissacarídeo de Haemophilus influenzae, polissacarídeo de Salmonella typhi, polissacarídeo de Citrobacter freundii, polissacarídeo de espécies de Salmonella, polissacarídeo de Shigella ou polissacarídeo de Neisseria meningitidis.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o referido polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae é selecionado a partir do grupo que consiste em tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 ou 46.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais proteínas carreadoras são selecionadas a partir do grupo que consiste em toxoide diftérico, CRM197, toxoide do tétano, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um seu mutante, subunidade B da toxina da cólera, fragmento C da toxina do tétano, flagelina bacteriana, pneumolisina, uma proteína da membrana externa de Neisseria menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina lábil ao calor de Escherichia coli, toxina semelhante a shiga, proteína LTB humana, listeriolisina O, um extrato de proteína de células bacterianas inteiras, o mutante inibidor negativo dominante (DNI) do antígeno protetor de Bacillus anthracis ou beta-galactosidase de Escherichia coli.

14. Método de preparo de uma composição imunogênica, caracterizado pelo fato de que compreende (i) mistura de um antígeno de interesse com uma proteína carreadora e um policátion para formar uma mistura e (ii) reticulação da referida proteína carreadora e policátion para formar uma matriz proteica carreadora de encapsulamento do referido antígeno de interesse.

15. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende duas ou mais composições imunogênicas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1-13.