CN110392690B - 肺炎球菌缀合物疫苗制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供肺炎球菌缀合物疫苗制剂，其包含表面活性剂体系，所述表面活性剂体系含有聚山梨醇酯20、或泊洛沙姆和多元醇的组合。

Description

肺炎球菌缀合物疫苗制剂

技术领域

本发明提供肺炎球菌缀合物疫苗制剂，其包含混合有聚山梨醇酯20、或泊洛沙姆和多元醇的组合表面活性剂体系。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是包裹细菌的一个例子，是世界范围内的严重疾病的重要原因。1997年，美国疾病控制和预防中心(CDC)估计，在美国每年有3000例肺炎球菌性脑膜炎、50,000例肺炎球菌菌血症、7,000,000例肺炎球菌性中耳炎、和500,000例肺炎球菌肺炎。参见美国疾病控制和预防中心，MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997,46(RR-8):1-13。此外，这些疾病的并发症可能是显著的，一些研究报告高达8％的死亡率和25％的肺炎球菌性脑膜炎的神经系统后遗症。参见Arditi et al.,1998,Pediatrics 102:1087-97。

许多年来获得批准的多价肺炎球菌多糖疫苗已被证明在预防成人、特别是老年人和高危人群中预防肺炎球菌疾病方面具有非常重要的价值。然而，婴幼儿对未缀合的肺炎球菌多糖的应答差。细菌多糖是T细胞非依赖性免疫原，在婴儿中引起弱应答或无应答。细菌多糖免疫原与载体蛋白的化学缀合将免疫应答转化为婴儿中的T细胞依赖性免疫应答。由于在其氨基酸序列中存在T细胞刺激表位，白喉类毒素(DTx，DT的化学解毒形式)和CRM₁₉₇已被描述为细菌多糖免疫原的载体蛋白。

肺炎球菌缀合物疫苗包含7种最常见的在当时引起婴幼儿侵袭性肺炎球菌疾病的孤立血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)，其在美国首次于2000年2月被批准。随着在美国普遍使用/>由于Prevnar/>中存在的血清型而引起的儿童侵袭性肺炎球菌疾病显著减少。参见美国疾病控制和预防中心，MMWR Morb Mortal Wkly Rep2005,54(36):893-7。但是，在世界的某些地区中/>血清型覆盖率有限，并且一些证据表明在美国存在某些新的血清型(例如19A等)。参见O'Brien et al.,2004,Am JEpidemiol 159:634-44；Whitney et al.,2003,N Engl J Med 348:1737-46；Kyaw etal.,2006,N Engl J Med 354:1455-63；Hicks et al.,2007,J Infect Dis 196:1346-54；Traore et al.,2009,Clin Infect Dis 48:S181-S189。

Prevnar是13价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。参见例如美国专利申请公开号US2006/0228380A1；Prymula et al.,2006,Lancet 367:740-48；和Kieninger et al.,Safety andImmunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate VaccineCompared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Seriesin Healthy Infants and Toddlers，发表于48^th Annual ICAAC/ISDA 46^th AnnualMeeting,Washington DC,October 25-28,2008。还参见Dagan et al.,1998,InfectImmun.66:2093-2098and Fattom,1999,Vaccine 17:126。

中国专利申请公开号CN101590224A描述了一种14价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其包括血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A，19F和23F。

美国专利号8,192,746描述了一种15价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其具有血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F，它们全部单独缀合于CRM₁₉₇多肽。

还描述了多种载体蛋白系统。参见例如美国专利申请公开号20100209450、20100074922、20090017059、20091010959和20090017072。

已经公开了包含肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物和表面活性剂的制剂，所述表面活性剂包括聚山梨醇酯80(PS-80)和泊洛沙姆188(P188)。分别参见美国专利号8,562,999和美国专利申请公开号US20130273098。

发明内容

本发明提供一种制剂，其包含：(i)一种或多种多糖-蛋白缀合物；(ii)pH值为5.0至7.5的pH缓冲盐水溶液；(iii)铝盐；以及(iv)表面活性剂体系，其选自a)聚山梨醇酯20、和(b)分子量为1100Da至17,400Da的泊洛沙姆与选自丙二醇(PG)和聚乙二醇(PEG)400中的多元醇。

在某些实施方案中，一种或多种多糖-蛋白缀合物在非质子溶剂、例如二甲基亚砜(DMSO)中制备。在该实施方案的某些方面中，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％或更多的缀合物(基于总蛋白)在非质子溶剂、诸如DMSO中制备。或者，10-100％、24％-100％或24-80％的缀合物(基于总蛋白)在非质子溶剂(例如DMSO)中制备。在这些实施方案的某些方面中，表面活性剂体系如上所述，是聚山梨醇酯20或泊洛沙姆/多元醇组合。

在某些实施方案中，表面活性剂体系包含泊洛沙姆，其分子量为1100Da至17,400Da、7,500Da至15,000Da、或7,500Da至10,000Da。泊洛沙姆可以是泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。在某些方面中，泊洛沙姆的终浓度为0.001％至5％w/v、0.025％至1％w/v。在一个具体方面中，多元醇是丙二醇，并且其终浓度为1％至20％w/v。在另一个具体方面中，多元醇是聚乙二醇400，并且终浓度为1％至20％w/v。在某些实施方案中，表面活性剂体系包含聚山梨醇酯20。在某些方面中，聚山梨醇酯20的终浓度为0.001％至10％w/v、或0.025％至2.5％w/v、或0.025％至0.1％w/v。在表面活性剂体系包含PS-20的某些方面中，制剂还包含选自丙二醇和聚乙二醇中的多元醇。聚乙二醇或丙二醇的终浓度可以为6％至20％w/v。在某些实施方案中，聚乙二醇是聚乙二醇400。

在某些实施方案中，pH缓冲盐水溶液可具有5.0至7.0的pH。缓冲剂可选自磷酸盐、琥珀酸盐、L-组氨酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸盐或柠檬酸盐。在一个方面中，缓冲液是终浓度为5mM至50mM的L-组氨酸、或终浓度为1mM至10mM的琥珀酸盐。在一个具体方面中，L-组氨酸的终浓度为20mM±2mM。pH缓冲盐水溶液中的盐可以是氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。在一个方面中，pH缓冲盐水溶液是氯化钠。盐水可以以20mM至170mM的浓度存在。

在某些实施方案中，多糖-蛋白缀合物包含一种或多种与载体蛋白缀合的肺炎球菌多糖。在某些方面中，载体蛋白选自CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFB C8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌LT(热不稳定肠毒素)、大肠杆菌ST(热稳定肠毒素)、来自铜绿假单胞菌的外毒素A及其组合。在一个具体方面中，一种或多种多糖-蛋白缀合物与CRM₁₉₇缀合。在某些方面中，在非水溶剂DMSO中使用还原胺化来制备一种或多种多糖蛋白缀合物。在该方面中，可以在DMSO中使用还原胺化来制备来自血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F的多糖蛋白缀合物，并且可以在水溶液中使用还原胺化来制备来自血清型1、3、4、5、9V、14、22F和33F的多糖蛋白缀合物。在某些方面中，每种剂量被配制成含有：4μg/mL或8μg/mL的每种糖，除了6B为8μg/mL或16μg/mL；和约64μg/mL或128μg/mL CRM₁₉₇载体蛋白。

本发明还涉及一种15价肺炎球菌缀合物制剂，其包含：缀合于CRM₁₉₇多肽的来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎链球菌多糖、20mM L-组氨酸、150mM NaCl、0.2％(w/v)PS-20和250μg/ml APA。在某些方面中，将制剂配制成剂型，其含有4μg/mL或8μg/mL每种糖，除了6B为8μg/mL或16μg/mL；和约64μg/mL或128μg/mLCRM₁₉₇载体蛋白。在某些方面中，在DMSO条件下制备来自血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F的多糖蛋白缀合物，并且在水性条件下制备来自血清型1、3、4、5、9V、14、22F和33F的多糖蛋白缀合物。

附图说明

图1A-D：非还原条件下DTFB工艺中间体的SDS-PAGE分析。A：显示的样品是：分子量标准物(左起第1道)；来自三次重复混合模式阴离子交换色谱运行的洗脱产物(MM AEX1、MMAEX2、MM AEX3，泳道2-4)；来自混合模式阴离子交换色谱的汇集的洗脱产物(MM AEX Pool，泳道5)；渗滤的渗余物(UF-DR，泳道6)；和，0.2微米过滤后的半成品中间体(FBI，泳道7)。SDS PAGE：NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶；5μg/泳道；SYPRO红宝石蛋白凝胶染色。B：还原条件下DTFB工艺中间体运行的SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶；泳道2、4、8、10：5μg/泳道；泳道6：2μg/泳道；SYPRO红宝石蛋白凝胶染色)。显示的样品是：Mark-12标准物(泳道1和12)；用于生成DTFB的纯化CRM₁₉₇(CRM₁₉₇，泳道2和10)；胰蛋白酶消化步骤之后的经蛋白酶解裂解的CRM₁₉₇，其被加载到混合模式阳离子交换色谱树脂上(MM CEX进料，泳道4)；来自混合模式阳离子交换色谱的产物(MM CEX产物，泳道6)；0.2微米过滤后的半成品中间体(DTFB-FBI，泳道8)。C：显示的样品是：分子量标记物(左边第1道)；混合模式阳离子交换色谱后的初始浓缩渗余物(ICR，泳道2)；渗滤的渗余物(UF-DR，泳道3)；渗滤后浓缩的渗余物(UF-OCR，泳道4)；用于产物回收的膜冲洗物(UF-W，泳道5)；最终合并的渗余物加冲洗物(UF-FR，第6道)；0.2微米过滤后的半成品中间体(FBI，泳道6)。SDS-PAGE：14％Tris-甘氨酸凝胶；8.3-8.4μg/泳道；GelCode蓝色蛋白凝胶染色。D：还原条件下DTFB工艺中间体运行的SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶；SYPRO红宝石蛋白凝胶染色)。显示的样品是：Mark-12标准物(泳道1和12)；胰蛋白酶消化步骤之后的经蛋白酶解裂解的CRM₁₉₇，其被加载到混合模式阳离子交换色谱树脂(MM CEX进料，泳道2)上；用于生成DTFB的纯化CRM₁₉₇(CRM₁₉₇，泳道3)；在柱加样期间的流过物(MM CEX流过物，泳道4)；加样后的柱洗涤物(MMCEX洗涤物，泳道5)；从混合模式阳离子交换色谱分步洗脱后收集的产物(MM CEX产物，泳道7；10倍稀释的MM CEX产物，泳道9)；和，从混合模式阳离子交换色谱分步洗脱后收集的后洗脱产物(后洗脱MM CEX产物，泳道11)。

图2：作为pH和氯化钠(NaCl)浓度的函数的100mM磷酸钾(KPi)中的DTFB蛋白浓度。将溶液在室温下保持过夜，然后离心。通过尺寸排阻色谱法用UV280吸光度检测法测定上清液。

图3：作为聚山梨醇酯20(PS-20)浓度的函数的磷酸钾(KPi)溶液中的DTFB蛋白浓度。溶液在室温下涡旋5分钟，然后离心。通过尺寸排阻色谱法用UV280吸光度检测法测定上清液。

图4：用与肺炎链球菌CRM₁₉₇或DTFB载体蛋白缀合并配制有磷酸铝佐剂(APA)的肺炎链球菌血清型3多糖免疫的小鼠的ELISA抗体滴度。用两个独立的血清型3-CRM₁₉₇缀合物批次(批次1和2)之一免疫小鼠。

图5：用与CRM₁₉₇或DTFB载体蛋白缀合并配制有磷酸铝佐剂(APA)的肺炎链球菌血清型3荚膜多糖免疫的小鼠的存活曲线。用两个独立的血清型3-CRM₁₉₇缀合物批次(批次1和2)之一免疫小鼠。作为对照，仅APA或盐水的制剂也包括在研究中。免疫后，小鼠随后用血清型3细菌进行腹膜内攻击。

图6：通过静态光散射(SLS)测量的实验室规模搅拌研究，以评估时间和搅拌对15价肺炎球菌多糖(PnPs)缀合物制剂的粒径分布的影响。在水溶液中使用还原胺化将所有15种肺炎球菌多糖血清型与CRM₁₉₇缀合。将缀合物配制在20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl和0.25mg/mL(w/v Al⁺³)APA中，用于搅拌研究。

图7：通过SLS测量的实验室规模搅拌研究，以评估时间和搅拌对15价肺炎球菌多糖缀合物制剂的粒径分布的影响。在水溶液中使用还原胺化将所有15种肺炎球菌多糖血清型与CRM₁₉₇缀合。将缀合物配制在具有0.08％w/v或0.24％w/v泊洛沙姆188(P188)的20mML-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl和0.25mg/mL(w/v Al⁺³)APA找那个，用于搅拌研究。

图8A-B：注射器中15价肺炎球菌多糖缀合物制剂的实验室规模模拟运输和处理研究。在水溶液中使用还原胺化将所有15种肺炎球菌多糖血清型与CRM₁₉₇缀合。将缀合物配制在不含P188或含0.2％w/v P188的20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl和0.25mg/mL(w/vAl⁺³)APA中。显示出：在水平旋转24小时之前和之后的通过SLS测量的粒径分布(A)、以及水平旋转24小时后注射器的视觉评价(B)。

图9：具有20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl，0.25mg/mL(w/v Al⁺³)APA和0.2％w/v P188的两种15价肺炎球菌多糖缀合物制剂的粒径分布(表示为通过SLS测量的体积加权分布或D[4,3])。制剂PCV15_Aq包含肺炎球菌多糖-CRM₁₉₇缀合物，通过在水溶液中还原胺化而生成。制剂PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}使用15种肺炎球菌多糖缀合物的组合，一些通过在水溶液中还原胺化而生成，其他通过在非水溶液中还原胺化而生成；PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}的所有肺炎球菌多糖血清型与CRM₁₉₇缀合，除了血清型3(ST3)与DTFB缀合。将制剂填充到注射器中，并在SLS评估之前在4℃下水平搅动最多24小时。

图10A-B：含有P188(A)、PS-80(B)和PS-20(A,B)的PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂在搅拌并且在1.5mL HyPak注射器中水平旋转最多24小时后，通过SLS测量的D[4,3]值。

图11：来自用含有磷酸铝佐剂(APA)的15价肺炎球菌多糖缀合物制剂免疫的婴儿恒河猴(IRM)的肺炎球菌血清型3特异性IgG浓度。所有制剂都含有缀合于CRM₁₉₇或DTFB的肺炎链球菌血清型3荚膜多糖(ST3)。制剂PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}使用15种肺炎球菌多糖-CRM₁₉₇缀合物的组合，一些通过在水溶液中还原胺化而生成，其他通过在非水溶液中还原胺化而生成。PCV15制剂含有0.2％w/v P188或0.1％w/v PS-20，如图中标注。

图12：来自用配制有磷酸铝佐剂(APA)和0.2％w/v P188的两种15价肺炎球菌多糖缀合物疫苗免疫的婴儿恒河猴的血清型3OPA(OPK)滴度。该制剂含有缀合于CRM₁₉₇(PCV15_Aq)或DTFB(PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB})的肺炎链球菌血清型3荚膜多糖(ST3)。

图13：通过PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂在搅拌1小时和水平旋转24小时后的通过SLS测量的粒径分布。制剂含有0.2％w/v的泊洛沙姆188和不同浓度的丙二醇(PG)或聚乙二醇400(PEG₄₀₀)，如图中标注。

图14A-B：婴儿恒河猴中对PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂的免疫原性比较研究，所述制剂含有0.2％w/v P188和15％w/v PG或0.1％w/v PS-20，如在实施例12中所述。每组8只动物在T＝0(剂量1)、1个月(剂量2)和2个月(剂量3)的年龄时接受两种制剂中的任一种的肌内注射。在剂量1之前、和剂量1、2和3后2周收集血清。如实施例10中所述，测量来自免疫前、剂量1后、剂量2后、和剂量3后血清样品的血清型特异性IgG浓度(IgG GMC)。组套A显示血清型1、3、4、5、6A、6B、7F和9V的免疫原性结果。组套B显示血清型14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的免疫原性结果。

图15A-E：实施例13中描述的PCV_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂在搅拌并且在1.5mL HyPak注射器中水平旋转最多24小时后通过SLS测量的D[4,3]值，其具有在DMSO中制备的不同百分比的血清型(组套A：24％；组套B：50％；组套C：62％；组套D：79％；和组套E：100％)，含有0.05％w/v PS-80,0.05％w/v PS-20和0.2％w/v PS-20。

图16：新西兰白兔中的15价肺炎球菌缀合物制剂的免疫原性结果，所述制剂在20mM组氨酸pH 5.8、150mM NaCl、250μg/mL APA、0.2％w/v PS-20中，具有在DMSO中使用还原胺化而与CRM₁₉₇缀合的来自血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌多糖、和在水溶液中使用还原胺化而与CRM₁₉₇缀合的来自血清型1、3、4、5、9V、14、22F和33F的肺炎链球菌多糖，其被配制成含有4μg/mL的每种糖的剂型，除了6B为8μg/mL；和约64μg/mL的CRM₁₉₇载体蛋白。

具体实施方式

本发明部分基于以下发现：多价缀合物疫苗制剂中的特定表面活性剂可影响缀合物的稳定性及其聚集倾向，特别是当一种或多种缀合物在非质子溶剂、例如DMSO中制备时尤其如此。另外，一些表面活性剂需要添加多元醇以获得必要的稳定性。

如本文所用，“质子溶剂”是具有与氧(如在羟基中)或氮(在胺基中)结合的氢原子的溶剂。一般而言，任何含有易解离的H+的溶剂都称为质子溶剂。

如本文所用，“非质子溶剂”是指极性非质子溶剂。这样的溶剂缺乏酸性氢并且不能提供氢。极性非质子溶剂的实例包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)和六甲基磷酰胺(HMPA)。非水溶液或溶剂可与非质子溶剂互换使用。非质子溶剂可以存在一些水，例如最多1％、2％、5％、10％或20％。

如本文所用，术语“多糖”(Ps)意指包括通常用于免疫和细菌疫苗领域的任何抗原糖元素(或抗原单元)，包括但不限于“糖类”、“寡糖”、“多糖”、“脂糖”、“脂寡糖(LOS)”、“脂多糖(LPS)”、“糖基化物”、“糖缀合物”等。

如本文所用，术语“包含”当与本发明的免疫原性组合物一起使用时，是指包含任何其他组分(对于抗原混合物而言，受限于“由……组成”的语言)，例如佐剂和赋形剂。与多价多糖-蛋白缀合物混合物一起使用时，术语“由……组成”是指具有那些特定肺炎链球菌多糖蛋白缀合物而不具有来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的混合物。

如本文所定义，术语“沉淀”、“沉降”、“微粒形成”、“混浊”和“聚集”可互换使用，并且是指任何导致多糖-蛋白缀合物聚集的物理相互作用或化学反应。聚集过程(例如，蛋白聚集)可以由许多物理化学应激诱导，包括热、压力、pH、搅拌、剪切力、冻融、脱水、重金属、酚类化合物、硅油、变性剂等。

如本文所定义，本发明的“表面活性剂”是降低免疫原性组合物制剂的表面张力的任何分子或化合物。“表面活性剂体系”包括表面活性剂，但可以允许包含额外的赋形剂，例如增加表面活性剂效果的多元醇。

本发明的免疫原性组合物可以是含有一种或多种与一种或多种载体蛋白缀合的抗原的多价组合物。在本发明的某些实施方案中，抗原是来自包裹细菌的糖。在这种疫苗中，糖类由类似于某些类型细菌的表面的长链糖分子组成。包裹细菌包括但不限于肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和b型流感嗜血杆菌。抗原可以来自相同的生物体或可以来自不同的生物体。在本发明的其他实施方案中，抗原是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖。

在使用两种载体蛋白的实施方案中，未与第一载体蛋白缀合的每种荚膜多糖与相同的第二载体蛋白缀合(例如，每种荚膜多糖分子与单一载体蛋白缀合)。在另一个实施方案中，未与第一载体蛋白缀合的荚膜多糖与两种或更多种载体蛋白缀合(每种荚膜多糖分子与单一载体蛋白缀合)。在这样的实施方案中，相同血清型每种荚膜多糖典型地与相同的载体蛋白缀合。

白喉毒素是由白喉棒状杆菌分泌的外毒素，其是由通过二硫键连接并具有三个结构域的两个亚基(片段)组成的经典A-B毒素。片段A(DTFA)含有ADP-核糖催化C结构域，而片段B(DTFB)含有中心易位T结构域和羧基末端受体结合R结构域。DTFB是构成DT总氨基酸序列的约60％的无毒部分。参见例如Gill,D.M.and Dinius,L.L.,J.Biol.Chem.,246,1485-1491(1971),Gill,D.M.and Pappenheimer,Jr.,A.M.,J.Biol.Chem.,246,1492-1495(1971),Collier,R.J.and Kandel,J.,J.Biol.Chem.,246,1496-1503(1971)；和Drazin,R.,Kandel,J.,and Collier,R.J.,J.Biol.Chem.,246,1504-1510(1971)。

完整的白喉毒素氨基酸序列已被公开。参见Greenfield,L.,Bjorn,M.J.,Horn,G.,Fong,D.,Buck,G.A.,Collier,R.J.and Kaplan,D.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,6853-6857(1983)。具体地，DTFB包含DT的氨基酸残基194至535。

CRM₁₉₇载体蛋白是DT的突变形式，其通过片段A中在残基52处单个氨基酸取代而变为无毒。CRM₁₉₇和DT在片段B中共享完整的序列同源性。主要T细胞表位主要在DT氨基酸序列的B片段中被发现。参见Bixler et al.,Adv Exp Med Biol.(1989)251:175-80；Raju etal.,Eur.J.Immunol.(1995)25:3207-3214；Diethelm-Okita et al.,J Infect Dis(2000)181:1001-9；和，McCool et al.,Infect.and Immun.67(Sept.1999),p.4862–4869。

如本文所述的使用DTFB包括缺失ADP-核糖基化活性结构域的白喉毒素。使用DTFB还包括具有至少90％、95％或99％序列同一性的包括缺失、取代和添加的变体。一个变体的实例是半胱氨酸201的缺失或突变。DTFB(C8)意指缺失ADP-核糖基活化结构域的白喉毒素，并且半胱氨酸201被去除或突变。使用DTFB还包括覆盖DT的序列265-450的片段，其包括已公开的T细胞表位(参见Bixler et al.,Adv Exp Med Biol.(1989)251:175-80；Raju etal.,Eur.J.Immunol.(1995)25:3207-3214)。DTFB还包括单体、二聚体或低聚物的状态。使用DTFB还包括任何含有DTFB或片段的蛋白复合物(不包括全长DT或CRM₁₉₇₎)、杂合蛋白或缀合蛋白。使用DTFB还包括化学修饰的DTFB或片段(即聚乙二醇化、非天然氨基酸修饰)。

在某些实施方案中，DTFB由酶促消化和还原天然DT或突变体CRM₁₉₇，随后通过吸附色谱法纯化，从而生产。因此，设想可以类似地从全长天然或C201突变的DT或CRM₁₉₇、或从其中截短了A片段的变体来制备在DT C201残基处具有或不具有突变的纯化DTFB。具体而言已知的是，在色谱循环期间以Capto^TM Adhere和Capto^TM MMC销售的混合模式树脂和超过50mM的Tris浓度提供了纯化裂解的天然DTFB的特殊模式。

在某些实施方案中，DTFB的制备包括最高10mM的DTT。DTT防止由于残基位置201处的游离半胱氨酸而在DTFB单体之间形成二硫键所引起的二聚化。在这种情况下，镍未被添加到缀合反应混合物中。然而，缀合反应通过相同的方法进行。如果不使用DTT，则二聚化的DTFB可以在镍的存在下与Ps缀合，以通过螯合残留的抑制性氰化物来改善缀合的程度。

去除DTFB中游离半胱氨酸(DT C201的突变)被预期在混合模式树脂中给出相似的行为。去除游离半胱氨酸被预期会消除对DTT的需要，因为游离半胱氨酸之间形成二硫键的二聚化是不可行的。增加Tris缓冲液浓度和氯化钠洗脱缓冲液浓度已被证明改善从CaptoMMC色谱树脂中的DTFB蛋白的回收率。预期使用其他混合模式树脂可以实现DTFB纯化。

在某些实施方案中，DTFB在具有或不具有DT C201残基突变的情况下重组表达，随后通过本领域技术人员已知的各种技术纯化。

在本发明的一个具体实施方案中，CRM₁₉₇被用作载体蛋白。CRM₁₉₇是白喉毒素的无毒变体(即，类毒素)。在一个实施方案中，其从在酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培养基中生长的白喉棒杆菌菌株C7(β197)的培养物中分离。在另一个实施方案中，CRM₁₉₇根据美国专利号5,614,382中描述的方法重组制备。典型而言，CRM₁₉₇通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱的组合进行纯化。在一些实施方案中，使用Pfenex Expression Technology^TM(Pfenex Inc.，San Diego，CA)，在荧光假单胞菌中制备CRM₁₉₇。

DTFB及其变体可用作抗原的载体蛋白，所述抗原包括蛋白(肽)和糖类。其他合适的载体蛋白包括另外的灭活细菌毒素，诸如DT(白喉类毒素)、TT(破伤风毒素)或TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如国际专利申请公开号WO 2004/083251中描述的)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白，诸如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌表面蛋白A(PspA；参见国际申请专利公开号WO 02/091998)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、来自A组或B组链球菌的C5a肽酶、或流感嗜血杆菌蛋白D；包括以某种方式解毒的层的肺炎球菌肺炎球菌溶血素(Kuo et al.,1995,Infect Immun 63；2706-13)，例如dPLY-GMBS(参见国际专利申请公开号WO 04/081515)或dPLY-甲醛；PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD，PhtE和Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(参见国际专利申请公开号WO 01/98334和WO 03/54007)。还可以将其他蛋白用作载体蛋白，诸如卵清蛋白、钥孔虫戚血兰素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)、PorB(来自脑膜炎奈瑟球菌)、PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如欧洲专利号EP 0 594 610B)或其免疫学功能性等价物、合成肽(参见欧洲专利号EP0378881和EP0427347)、热休克蛋白(参见国际专利申请公开号WO 93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白(参见国际专利申请公开号WO 98/58668和欧洲专利号EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(参见国际专利申请公开号WO 91/01146)；包含来自各种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人造蛋白(参见See Falugi et al.,2001,Eur J Immunol31:3816-3824)，诸如N19蛋白(参见Baraldoi et al.,2004,Infect Immun 72:4884-7)；铁摄取蛋白(参见国际专利申请公开号WO 01/72337)、艰难梭菌毒素A或B(参见国际专利公开号WO 00/61761)、和鞭毛蛋白(参见Ben-Yedidia et al.,1998,Immunol Lett 64:9)。

其他DT突变体可用作第二载体蛋白，诸如CRM₁₇₆、CRM₂₂₈、CRM₄₅(Uchida et al.,1973,J Biol Chem 218:3838-3844)、CRM₉、CRM₄₅、CRM₁₀₂、CRM₁₀₃和CRM₁₀₇；以及Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992中描述的其他突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser、和/或Ala158缺失或突变为Gly、和美国专利号4,709,017或美国专利号4,950,740中公开的其他突变；至少一个或多个Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534残基的突变、和美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673中公开的其他突变；或者，美国专利号5,843,711中公开的片段。这样的DT突变体也可用于制备DTFB变体，其中变体包含含有表位区域的B片段。

在一个实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含多糖-蛋白缀合物，所述多糖-蛋白缀合物包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌的血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D，7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F和38中的至少一种的荚膜多糖、以及药学上可接受的载体。在本发明的某些实施方案中，免疫原性组合物包含单独与CRM₁₉₇缀合的来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44种血清型的的荚膜多糖；基本上由上述组成；或由上述组成。在本发明的某些方面中，CRM₁₉₇是唯一使用的载体蛋白。

在某些实施方案中，上述免疫原性组合物任选地还包含与第二载体蛋白(其与第一载体蛋白相差至少一个氨基酸)缀合的来自一种另外的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，所述血清型选自1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F和38中的至少一种。优选地，来自特定血清型的糖不与多于一种载体蛋白缀合。

在本发明的某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含与第二载体蛋白缀合的来自至少一种另外的血清型的荚膜多糖。在这些实施方案中，免疫原性组合物包含单独与不是CRM₁₉₇的第二载体蛋白缀合的来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、42，43或44种血清型的的荚膜多糖；基本上由上述组成；或由上述组成。

在本发明的某些实施方案中，免疫组合物包含：来自N种血清型的荚膜多糖，其中N为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44；和，与第一蛋白载体(CRM₁₉₇)缀合的N种血清型中的每一种的荚膜多糖；基本上由上述组成；或由上述组成。在本发明的其他实施方案中，来自1、2、3……或N-1种血清型的荚膜多糖与第一蛋白载体缀合，并且来自N-1、N-2、N-3……1种血清型的荚膜多糖与不是CRM₁₉₇的第二蛋白载体缀合。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供了15价免疫原性组合物，其包含与CRM₁₉₇缀合的来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖；基本上由上述组成；或由上述组成。

来自肺炎链球菌的荚膜多糖可通过本领域技术人员已知的标准技术制备。例如，多糖可以从细菌中分离，并且可以通过已知方法(参见例如欧洲专利号EP497524和EP497525)、并且优选通过使用均化器完成的微流化或通过化学水解将尺寸调整为一定程度。在一个实施方案中，对应于每种多糖血清型的肺炎链球菌菌株在基于大豆的培养基中生长。然后通过包括离心、沉淀和超滤在内的标准步骤纯化单个多糖。参见例如美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。可以调整多糖的尺寸以降低粘度和/或改善后续缀合产物的过滤性。在本发明中，荚膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D，7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F和38中的一种或多种制备。

纯化的多糖被化学激活以引入能够与载体蛋白反应的官能团。一旦被激活，每个荚膜多糖分别与载体蛋白缀合以形成糖缀合物。多糖缀合物可通过已知的偶联技术制备。

在一个实施方案中，多糖的化学激活和随后与载体蛋白的缀合通过美国专利号4,365,170、4,673,574和4,902,506中描述的方法实现。简而言之，肺炎球菌多糖与基于高碘酸盐的氧化剂、诸如高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸反应，导致邻近羟基的无规氧化裂解，从而生成反应性醛基。

氧化的多糖与蛋白载体上的伯胺基团(主要是赖氨酸残基)的直接胺化缀合可以通过还原胺化来完成。例如，通过使激活的多糖和载体蛋白的混合物与还原剂、诸如氰基硼氢化钠在镍存在下反应来进行缀合。缀合反应可以在水溶液中或在有机溶剂、诸如DMSO中进行。参见例如US2015/0231270 A1、EP 0471 177 B1和US2011/0195086 A1。在缀合反应结束时，通过加入强还原剂、诸如硼氢化钠而使未反应的醛封端。

在一个实施方案中，在配制之前，将每种肺炎球菌荚膜多糖抗原从肺炎链球菌中单独纯化，激活以形成反应性醛，然后使用利用氰基硼氢化钠在镍存在下的还原胺化而共价缀合于第一载体蛋白或第二载体蛋白。镍与来自用于还原胺化的氰基硼氢化钠还原剂的残留的抑制性氰化物络合。

在某些实施方案中，缀合反应通过还原胺化实施，其中镍用于更高的缀合反应效率并有助于去除游离氰化物。过渡金属已知与氰化物形成稳定的络合物，并且已知改善利用氰基硼氢化钠的蛋白氨基和甲醛的还原性甲基化(Gidley et al.,1982,BiochemJ.203:331-334；Jentoft et al.,1980,Anal Biochem.106:186-190)。通过络合残留的抑制性氰化物，添加镍增加了蛋白在缀合过程中的消耗，并导致形成更大的、可能更具免疫原性的缀合物。

市售的氰基硼氢化钠试剂批次中的游离氰化物水平的变化可能导致不一致的缀合性能，导致变化的缀合物属性，包括分子量和多糖与蛋白的比率。向缀合反应中添加镍降低了游离氰化物的水平，从而提高了批次与批次之间缀合物一致性的程度。

在另一个实施方案中，缀合方法可以采用利用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)的多糖激活以形成氰酸酯。激活的糖可以直接与载体蛋白上的氨基偶联。

在另一个实施方案中，可以通过使氰酸酯与几种可用形式中的任何一种反应，将反应性同双官能团或异双官能团引入激活的多糖上。例如，胱胺或半胱胺可用于制备硫醇化多糖，其可经由在与马来酰亚胺激活的载体蛋白(例如使用GMBS)或卤代乙酰化载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺[例如乙基碘乙酰胺盐酸盐]或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸盐或SIAB、或SIA、或SBAP)反应后获得的硫醚连接而与载体缀合。在另一个实施方案中，氰酸酯与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)反应，并且使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学，将所得的氨基衍生的糖与载体蛋白上的游离羧基缀合。这样的缀合物描述于国际专利申请公开号WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094；以及Chu et al.,1983,Infect.Immunity 40:245-256。

其他合适的缀合方法使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S--NHS、EDC和TSTU。许多描述于国际专利申请公开号WO 98/42721中。缀合可以涉及羰基连接基团，其可以通过糖的游离羟基与CDI的反应形成(参见Bethell etal.,1979,J.Biol.Chem.254:2572-4；Hearn et al.,1981,J.Chromatogr.218:509-18)，然后与载体蛋白反应，从而形成氨基甲酸酯连接。该化学由下述组成：还原碳水化合物的异头末端以形成伯羟基，然后使伯羟基与CDI反应以形成氨基甲酸酯中间体，并随后与蛋白载体氨基偶联。反应可以要求任选的对糖上的其他伯羟基进行保护/脱保护。

缀合后，通过本领域技术人员公知的任何技术中的一种或多种来纯化多糖-蛋白缀合物，以去除过量的缀合试剂以及残留的游离蛋白和游离多糖，所述技术包括浓缩/渗滤操作、超滤、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤。参见例如美国专利号6,146,902。

在纯化单独的糖缀合物后，将它们复合以配制本发明的免疫原性组合物。这些肺炎球菌缀合物通过单独的方法制备，并大量配制成单一剂量制剂。

药物/疫苗组合物

本发明进一步提供组合物，其包括药物、免疫原性和疫苗组合物的组合物，所述组合物包含上述多糖血清型组合中的任一种、以及药学上可接受的载体和佐剂；基本上由上述组成；或由上述组成。在一个实施方案中，组合物包含：2至13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44种不同的多糖-蛋白缀合物、以及药学上可接受的载体和佐剂；基本上由上述组成；或由上述组成，其中每种缀合物含有与第一载体蛋白或第二载体蛋白缀合的不同的荚膜多糖，并且来自肺炎链球菌的血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D，7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F和38中的至少一种的荚膜多糖与选自CRM₁₉₇中的第一载体蛋白缀合，并且任选具有与第二载体蛋白(其与第一载体蛋白相差至少一个氨基酸)缀合的选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D，7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F、和38中的另外的肺炎链球菌血清型。

可以使用本领域公知的方法完成本发明的多糖-蛋白缀合物的配制。例如，可以用生理学上可接受的溶媒(vehicle)配制15种单独的肺炎球菌缀合物，以制备组合物。这样的溶媒的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和右旋糖溶液。

在另一个实施方案中，将疫苗组合物配制在具有氯化钠的L-组氨酸缓冲液中。

如本文所定义，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。免疫佐剂可以增强对单独给予时具有弱免疫原性的抗原的免疫应答，例如，诱导无或弱抗体滴度或细胞介导的免疫应答、增加对抗原的抗体滴度、和/或降低对于在个体中实现免疫应答而言有效的抗原剂量。因此，通常施用佐剂以增强免疫应答，并且是技术人员所公知的。用于增强组合物有效性的合适佐剂包括但不限于：

(1)铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；

(2)水包油乳液制剂(其具有或不具有其他的特异性免疫刺激剂、诸如胞壁酰肽(如下定义)或细菌细胞壁组分)，例如(a)MF59(国际专利申请公开号WO 90/14837)，其含有5％角鲨烯、0.5％吐温80、和0.5％Span 85(任选含有不同量的MTP-PE)，使用微流化器、诸如Model 110Y微流化器(Microfluidics,Newton,MA)，配制成亚微米颗粒；(b)SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，其微流化成亚微米乳液、或者涡旋以生成较大粒径的乳液；(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Corixa,Hamilton,MT)，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80、和描述于美国专利号4,912,094中的选自3-O-脱酰基单磷酸脂质A(MPL^TM)中的一种或多种细菌细胞壁组分、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和，(d)Montanide ISA；

(3)可以使用皂苷佐剂、诸如Quil A或STIMULON^TM QS-21(Antigenics，Framingham，MA)(参见例如美国专利号5,057,540)或由其产生的颗粒，例如ISCOM(由胆固醇、皂苷、磷脂、和两亲性蛋白形成的免疫刺激络合物)、和(具有与ISCOM基本相同的结构，但不含蛋白)；

(4)细菌脂多糖、合成脂质A类似物诸如氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)、或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得，并且描述于美国专利号6,113,918号；这样的AGP之一是2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]–b-D-吡喃葡萄糖苷，也称为529(以前称为RC529)，其配制成含水形式或稳定乳液；

(5)合成多核苷酸，诸如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；

(6)细胞因子，诸如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(如γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；和

(7)补体，诸如补体成分C3d的三聚体。

在另一个实施方案中，佐剂是2种、3种或更多种上述佐剂的混合物，例如。SBAS2(水包油乳液，还含有3-脱酰基单磷酰脂质A和QS21)。

胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、和N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。

在某些实施方案中，佐剂是铝盐。铝盐佐剂可以是明矾沉淀的疫苗或明矾吸附的疫苗。铝盐佐剂是本领域公知的，并且描述于例如Harlow,E.and D.Lane(1988；Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)、和Nicklas,W.(1992；Aluminum salts.Research in Immunology 143:489-493)。铝盐包括但不限于、水合氧化铝、氧化铝水合物、三水合氧化铝(ATH)、氢氧化铝、三水合铝、Superfos、/>铝(III)氢氧化物、羟基磷酸铝硫酸盐(磷酸铝佐剂(APA))、非晶氧化铝、三水合氧化铝或三羟基铝。

APA是羟基磷酸铝的水悬浮液。APA通过以1:1的体积比共混氯化铝和磷酸钠来沉淀羟基磷酸铝，从而制备。在共混过程之后，用高剪切混合器将材料尺寸减少，以实现单分散的粒径分布。然后将产物对生理盐水渗滤，并蒸汽灭菌。

在某些实施方案中，市售可获得的Al(OH)₃(例如Denmark/Accurate Chemicaland Scientific Co.,Westbury,NY的或Superfos)被用于以50-200g蛋白/mg氢氧化铝来吸附蛋白。在另一个实施方案中，蛋白的吸附取决于蛋白的pI(等电点pH)和培养基的pH。具有较低pI的蛋白与具有较高pI的蛋白相比，更强地吸附至带正电荷的铝离子。铝盐可以建立在长达2-3周的时间内缓慢释放的Ag储库，其涉及巨噬细胞的非特异性激活和补体激活、和/或刺激先天免疫机制(可能通过刺激尿酸)。参见例如Lambrecht etal.,2009,Curr Opin Immunol 21:23。

典型地，将单价大量含水缀合物共混在一起并稀释。一旦稀释，该批料被无菌过滤。无菌添加磷酸铝佐剂以达到对于除6B之外的所有血清型的终浓度4μg/mL；血清型6B被稀释至目标8μg/mL，最终铝浓度为250μg/mL。将佐剂化的配制批料装入小瓶或注射器中。

在某些实施方案中，佐剂是含有CpG的核苷酸序列、例如含有CpG的寡核苷酸、特别是含有CpG的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在另一个实施方案中，佐剂是ODN 1826，其可以从Coley Pharmaceutical Group获得。

“含CpG的核苷酸”、“含CpG的寡核苷酸”、“CpG寡核苷酸”和类似术语是指长度为6-50个核苷酸的核苷酸分子，其含有未甲基化的CpG部分。参见例如Wang et al.,2003,Vaccine 21:4297。在另一个实施方式中，意图是任何其他本领域人员接受的术语定义。含有CpG的寡核苷酸包括使用任何合成的核苷间连接、修饰的碱和/或修饰的糖来修饰的寡核苷酸。

使用CpG寡核苷酸的方法是本领域公知的，并且描述于例如Sur et al.,1999,JImmunol.162:6284-93；Verthelyi,2006,Methods Mol Med.127:139-58；和，Yasuda etal.,2006,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:89-110。

给予/剂量

通过经由全身或粘膜途径给予疫苗，本发明的组合物和制剂可用于保护或治疗易感染、例如肺炎球菌感染的人。在一个实施方案中，本发明提供一种诱导对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，其包括向人给予免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种对人接种抗肺炎球菌感染的疫苗的方法，其包括向人给予免疫有效量的本发明免疫原性组合物的步骤。

通过标准研究可以确定特定疫苗的最佳组分含量，所述研究涉及在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方案中，用于人疫苗接种的剂量通过从动物研究外推至人类数据来确定。在另一个实施方案中，剂量根据经验确定。实施例中提供的婴儿恒河猴动物数据表明该疫苗具有免疫原性。

本发明组合物的“有效量”是指引发抗体所需的剂量，所述抗体在随后的攻击过程中显著降低微生物、例如肺炎链球菌的感染可能性或严重性。

本发明的方法可用于预防和/或减少由微生物、例如肺炎链球菌引起的主要临床综合征，包括侵袭性感染(脑膜炎、肺炎和菌血症)和非侵袭性感染(急性中耳炎和鼻窦炎)。

给予本发明的组合物可包括以下一种或多种：经由肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经由口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道的粘膜给药。在一个实施方案中，鼻内给药用于治疗肺炎或中耳炎(因为可以更有效地预防肺炎球菌的鼻咽携带，从而在其最早期阶段减弱感染)。

每种疫苗剂量中的缀合物的量被选择为诱导免疫保护应答而没有显著副作用的量。这样的量可以根据肺炎球菌血清型而变化。通常，对于基于多糖的缀合物，每个剂量将包含0.1至100μg的每种多糖，特别是0.1至10μg，更特别是1至5μg。例如，每个剂量可包括100、150、200、250、300、400、500或750ng、或1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90或100μg。

通过标准研究可以确定特定疫苗的最佳组分含量，所述研究涉及在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方案中，用于人疫苗接种的剂量通过从动物研究外推至人类数据来确定。在另一个实施方案中，剂量根据经验确定。

在一个实施方案中，铝盐的剂量为10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700μg、和/或1、1.2、1.5、2、3、5mg或更多。在又另一个实施方案中，上述铝盐的剂量是每μg重组蛋白。

在本发明的一个具体实施方案中，PCV15疫苗是单独与CRM₁₉₇缀合的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎球菌荚膜多糖的无菌液体制剂。在一个方面中，每种剂量被配制成含有：4μg/mL或8μg/mL的每种糖，除了6B为8μg/mL或16μg/mL；和，约64μg/mL或128μg/mL CRM₁₉₇载体蛋白。在一个方面中，配制每个0.5mL剂量以包含：2μg的每种糖，除了6B为4μg；约32μg CRM₁₉₇载体蛋白(例如32μg±5μg、±3μg、±2μg或±1μg)、0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；和，氯化钠和L-组氨酸缓冲液。氯化钠浓度约为150mM(例如150mM±25mM、±20mM、±15mM、±10mM或±5mM)，和约20mM(例如，20mM±5mM、±2.5mM、±2mM、±1mM或±0.5mM)L-组氨酸缓冲液。

根据本发明的任何方法并且在一个实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，人受试者是婴儿(小于1岁)、学步期幼儿(大约12至24个月)、或幼儿(大约2至5岁)。在其他实施方案中，人类受试者是老年患者(>65岁)。本发明的组合物也适用于年龄较大的儿童、青少年和成人(例如，年龄18至45岁或18至65岁)。

在本发明方法的一个实施方案中，本发明的组合物以单次接种形式给予。在另一个实施方案中，疫苗给予充分间隔开的两次、三次或四次、或更多次。例如，组合物可以以1、2、3、4、5或6个月或其任何组合的间隔给予。免疫日程可以遵循指定用于肺炎球菌疫苗的日程。例如，针对由肺炎链球菌引起的侵袭性疾病的婴儿和学步期幼儿的常规日程是2、4、6和12-15个月龄。因此，在另一个实施方案中，组合物以2个月、4个月，6个月和12-15个月龄时的4次给药系列给予。

本发明的组合物还可包括一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白。适合包含的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中指出的那些。

制剂

本发明的组合物可通过本领域技术人员已知的一种或多种方法给予受试者，例如肠胃外、经粘膜、透皮、肌肉内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、腹膜内，并相应地配制。

在一个实施方案中，本发明的组合物经由表皮注射、肌内注射、静脉内、动脉内、皮下注射、或呼吸道内粘膜注射液体制剂来给予。用于注射的液体制剂包括溶液等。

本发明的组合物可以配制成单剂量小瓶、多剂量小瓶或预填充注射器。

在另一个实施方案中，本发明的组合物口服给予，并因此配制成适于口服给药的形式，即配制为固体或液体制剂。固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、微丸剂等。液体口服制剂包括溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。

用于液体制剂的药学上可接受的载体是水性或非水性溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、其他海洋油、或来自牛奶或蛋的脂质。

药物组合物可以是等渗的、低渗的或高渗的。然而，当给予时，通常优选用于输注或注射的药物组合物基本上是等渗的。因此，为了储存，药物组合物可以优选是等渗的或高渗的。如果药物组合物是高渗的，则可以在给予前将其稀释成为等渗溶液。

等渗剂可以是离子等渗剂、诸如盐；或非离子等渗剂、诸如碳水化合物。离子等渗剂的实例包括但不限于NaCl，CaCl₂，KCl和MgCl₂。非离子等渗剂的实例包括但不限于甘露醇、山梨糖醇和甘油。

还优选至少一种药学上可接受的添加剂是缓冲剂。出于某些目的，例如当药物组合物用于输注或注射时，通常希望组合物包含缓冲剂，其能够将溶液缓冲至4至10、例如5至9、例如6至8的pH。

缓冲剂可以例如选自Tris、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、L-组氨酸，甘氨酸，琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲液。

此外，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时，缓冲剂可以进一步例如选自用于肠胃外使用的USP相容的缓冲剂。例如，缓冲剂可选自：一元酸，诸如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油和乳酸；二元酸，诸如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸；多元酸，诸如柠檬酸和磷酸；以及碱，诸如氨、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和Tris。

肠胃外溶媒(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包括氯化钠溶液、葡萄糖林格氏液、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和非挥发性油。静脉内溶媒包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于葡萄糖林格氏液的那些等。实例是无菌液体，诸如水和油，其添加或不添加表面活性剂和其他药学上可接受的佐剂。通常，特别是对于可注射溶液而言，水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液、二醇如丙二醇或聚乙二醇、聚山梨醇酯80(PS-80)、聚山梨醇酯20(PS-20)和泊洛沙姆188(P188)是优选的液体载体。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、其他海洋油、或来自牛奶或蛋的脂质。

本发明的制剂还可含有表面活性剂。优选的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是PS-20和PS-80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAX^TM商品名出售，诸如线性EO/PO嵌段共聚物；可以改变重复乙氧基(氧-1,2-乙二基)基团数的辛苯聚醇，与辛苯聚醇-9(Triton X-100、或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是特别感兴趣的；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物，诸如Tergitol^TM NP系列；衍生自月桂醇、十六烷醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(被称为Brij表面活性剂)，诸如三乙二醇单月桂醚(Brij 30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

可以使用表面活性剂的混合物，例如PS-80/Span 85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(PS-80)、和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的组合也是合适的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚9加聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

表面活性剂的优选量是：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如PS-80)0.01至1％w/v、特别是约0.1％w/v；辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇(如Triton X-100，或Triton系列中的其它洗涤剂)0.001至0.1％w/v、特别是0.005至0.02％w/v；聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1至20％w/v、优选0.1至10％w/v、特别是0.1至1％w/v或约0.5％w/v。

在某些实施方案中，组合物基本上由L-组氨酸(20mM)、盐水(150mM)和0.2％w/vPS-20组成，pH为5.8，具有250μg/mL的APA(磷酸铝佐剂)。PS-20的含量范围为0.005至0.3％w/v，制剂中存在PS-20，在模拟制造过程中和使用初级包装运输时控制聚集。该工艺由下述组成：将最多44种血清型的共混物在L-组氨酸、氯化钠和PS-20中合并，然后将该共混材料与APA和氯化钠合并，其含有或不含抗菌防腐剂。

如本文所证明的，可能需要针对不同的药物产品和药物物质来优化表面活性剂的选择。对于含有15种或更多种血清型的多价疫苗，优选PS-20和P188。用于制备缀合物的化学选择据信是影响制剂稳定性的重要因素。特别地，如下面举例说明的，在水性或DMSO溶剂中制备并在多价组合物中组合的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物在稳定性方面显示出显著的差异，这取决于用于制剂的特定表面活性剂体系。如上所述，特别是在非质子溶剂、诸如DMSO中制备一种或多种多糖-蛋白缀合物时，单独使用聚山梨醇酯20或使用泊洛沙姆188与多元醇组合观察到改善的稳定性。

本发明部分基于以下发现：在含有使用还原胺化制备的多糖-蛋白缀合物(其中一些在水性条件下制备，且其它在DMSO条件下制备)的制剂中使用聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188和多元醇的组合，有助于控制免疫原性组合物的制造和运输应激诱导的物理化学不稳定性，并提供出乎意料地优于其它表面活性剂和稳定剂的特性。特定洗涤剂如何保护生物治疗剂的确切机制知之甚少，无法事先预测。可能的稳定机制包括优先水合、优先排除、生物治疗剂与表面之间的气/液界面竞争、表面张力、和/或洗涤剂与生物治疗剂直接缀合以掩盖用作聚集起点的疏水区(hydrophobic patch)。本发明解决了本领域持续需要改善包含多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物的稳定性并抑制其微粒形成(例如聚集、沉淀)的需求。本发明的制剂据信在控制复合生物治疗剂的制造、运输和处理诱导的聚集方面提供与先前使用的表面活性剂(包括泊洛沙姆188和聚山梨醇酯80)相比的显著优势。

据信，多糖-蛋白缀合物中的蛋白组分在聚集中起重要作用。这在使用相同血清型组成但不同缀合溶剂的缀合物的药物产品的不同聚集现象中得到证实。用于制备多糖缀合物的非质子溶剂改变了蛋白的结构，并且在APA佐剂存在下可能显示出不同的聚集倾向。当使用两种或更多种载体蛋白时，可以计算重量百分比。

因此，在本发明的某些实施方案中，本发明提供了一种制剂，其包含：(i)一种或多种多糖-蛋白缀合物；(ii)pH值为5.0至7.5的pH缓冲盐水溶液；(ii)铝盐；以及(iv)表面活性剂体系，其选自(a)聚山梨醇酯20、和(b)分子量为1100Da至17,400Da的泊洛沙姆与选自丙二醇和聚乙二醇400中的多元醇。在该实施方案的某些方面中，在非质子溶剂、诸如DMSO中制备一种或多种多糖-蛋白缀合物。蛋白总质量的约10-100％、24％-100％或24-80％的范围可以在非质子溶剂、诸如DMSO中制备并缀合。

在某些实施方案中，所述表面活性剂体系包含聚山梨酯20(IUPAC名：聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯；PS-20)，其是市售的表面活性剂，通常被称为20。在某些实施方案中，本发明制剂中的聚山梨醇酯20的终浓度范围为0.001％至10％w/v、0.025％至2.5％w/v、或0.025％至0.3％w/v。包含聚山梨醇酯20的表面活性剂体系可进一步包含多元醇。多元醇可选自丙二醇和聚乙二醇。在某些方面中，聚乙二醇或丙二醇的终浓度为6％至20％w/v。在某些方面中，聚乙二醇是聚乙二醇400。

在某些实施方案中，表面活性剂体系包含分子量为1100Da至17,400Da的泊洛沙姆和选自丙二醇和聚乙二醇400中的多元醇。

泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其由侧翼为两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链组成。泊洛沙姆也被称为商品名因为聚合物嵌段的长度可以定制，因此存在许多不同的泊洛沙姆，其具有略微不同的性质。对于通用术语“泊洛沙姆”，这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后面跟三位数字，前两个数字x 100给出聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一个数字x 10给出聚氧乙烯含量百分比(例如，P407＝聚氧丙烯分子量为4,000g/mol、且聚氧乙烯含量为70％的泊洛沙姆)。对于/>商品名，这些共聚物的编码以字母开始，以在室温下定义其物理形式(L＝液体，P＝糊剂，F＝薄片(固体))，后面跟两位或三位数字。数字标记中的第一个数字(三位数字中为两个数字)乘以300表示疏水物的近似分子量；并且最后一个数字乘以10给出的聚氧乙烯百分比含量(例如，L61＝聚氧丙烯分子量为1,800g/mol、且聚氧乙烯含量为10％的/>)。参见美国专利号3,740,421。

泊洛沙姆的实例具有通式：

HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH

其中，a和b嵌段具有以下值：

如本文所用，分子量单位为道尔顿(Da)或g/mol。

对于制剂，泊洛沙姆通常具有1100Da至17,400Da、7,500Da至15,000Da、或7,500Da至10,000Da的分子量。泊洛沙姆可选自泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。本发明制剂中泊洛沙姆的终浓度为0.001至5％w/v、或0.025至1％w/v。包含泊洛沙姆的表面活性剂体系还必须包含多元醇。在某些方面中，多元醇是丙二醇并且终浓度为1至20％w/v。在某些方面中，多元醇是聚乙二醇400并且终浓度为1至20％w/v。

用于制剂的合适多元醇是聚合物多元醇，特别是聚醚二醇，包括但不限于丙二醇和聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚。丙二醇的单体分子量范围可以为～425至～2700。聚乙二醇和聚乙二醇单甲醚的分子量范围也可以为～200至～35000，包括但不限于PEG200、PEG300、PEG400、PEG1000 PEG MME 550、PEG MME 600、PEG MME 2000、PEG MME 3350、和PEG MME4000。另一种聚乙二醇是聚乙二醇400。本发明制剂中多元醇的终浓度可以是1至20％w/v或6至20％w/v。

该制剂还含有pH缓冲盐水溶液。缓冲剂可以例如选自Tris、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、L-组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)和三乙醇胺缓冲剂。缓冲剂能够将溶液缓冲至pH范围为4至10、5.2至7.5或5.8至7.0。在本发明的某些方面中，缓冲液选自磷酸盐、琥珀酸盐、L-组氨酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸盐或柠檬酸盐。特别是当药物制剂用于肠胃外使用时，缓冲剂可以进一步例如选自用于肠胃外使用的USP相容的缓冲剂。缓冲液的浓度范围为1mM至50mM、或5mM至50mM。在某些方面中，缓冲液是终浓度为5mM至50mM的L-组氨酸、或终浓度为1mM至10mM的琥珀酸盐。在某些方面中，L-组氨酸的终浓度为20mM±2mM。

虽然盐溶液(即含NaCl的溶液)是优选的，但适合于制剂的其它盐包括但不限于CaCl₂，KCl和MgCl₂及其组合。可以代替盐而使用非离子等渗剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇和甘油。合适的盐范围包括但不限于25mM至500mM、或40mM至170mM。在一个方面中，盐水是NaCl，任选以20mM至170mM的浓度存在。

在一个优选的实施方案中，制剂包含含有氯化钠的L-组氨酸缓冲液。

在本文所述制剂的某些实施方案中，多糖-蛋白缀合物包含一种或多种与载体蛋白缀合的肺炎球菌多糖。载体蛋白可选自CRM₁₉₇、白喉毒素片段B(DTFB)、DTFBC8、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、TT片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、来自铜绿假单胞菌的外毒素A、及其组合。在某些方面中，一种或多种多糖-蛋白缀合物与DTFB缀合。在一个方面中，使用水性化学制备所有多糖-蛋白缀合物。例如，多糖-蛋白缀合物制剂可以是15价肺炎球菌缀合物(15vPnC)制剂，其基本上由与CRM₁₉₇缀合多肽的来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎链球菌多糖组成。在另一方面中，使用DMSO化学制备一种或多种多糖蛋白缀合物。例如，多糖-蛋白缀合物制剂可以是15价肺炎球菌缀合物(15vPnC)制剂，其中使用DMSO化学和多糖蛋白制备来自血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F的多糖蛋白缀合物，并且使用水性化学制备来自血清型1、3、4、5、9V、14、22F和33F的缀合物。

在另一个实施方案中，药物组合物在控释系统中递送。例如，可以使用静脉内输注、透皮贴剂、脂质体或其他给予模式给予。在另一个实施方案中，使用聚合物材料；例如，在微球中或植入物中。

本发明的组合物还可包括一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白。适合包含的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO02/083855和WO 02/053761中指出的那些。

已经参考所附说明书和附图描述了本发明的各种实施例，应该理解，本发明不限于那些精确的实施例，并且本领域技术人员可以在其中实现各种变化和修改而不脱离所附权利要求书中限定的本发明的范围或精神。

以下实施例说明但不限制本发明。

实施例

实施例1：DTFB载体蛋白的制备

使用混合模式阴离子交换色谱用于制备DTFB

使用1:500摩尔比的胰蛋白酶与CRM₁₉₇在约22℃下，在50mM Tris、pH8.0中培养约1小时，将通过如前所述地在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化的CRM₁₉₇(参见国际专利申请公开号WO2012/173876A1)用重组胰蛋白酶消化。然后在约22℃下加入50mM Tris、pH8中的二硫苏糖醇(DTT)至5mM的终浓度30分钟，以还原蛋白酶解裂解的A和B片段之间的二硫键。

然后将消化反应加载到用50mM Tris、pH8平衡的混合模式阴离子交换色谱柱(Capto^TM Adhere，GE Healthcare)上。将柱用50mM Tris、pH8洗涤，并且将DTFB产物用在50mM Tris、pH8中0.45M至0.65M氯化钠的梯度洗脱。将产物浓缩并使用5kDa标称截留分子量(NMWCO)切向流超滤膜对10mM磷酸钾、pH8进行渗滤。将含有DTFB产物的渗余物进行0.2微米过滤并在2-8℃下储存。通过280nm下的吸光度确定产物浓度，并在非还原条件下通过SDS-PAGE评估纯度。

结果表明，混合模式阴离子交换色谱洗脱液含有相对纯的DTFB，主要以具有一小部分二聚体的单体形式存在。参见图1A。二聚体形成归因于DTFB单体之间形成二硫键。如以下部分所示，DTT已用于色谱和超滤步骤，以最小化二聚体形成的可能性。

使用混合模式阳离子交换色谱用于制备DTFB制备中的应用

由于存在DTFB二聚体，研究了另一种纯化方法。使用300mM Tris、pH 7.5，将通过如上所述地在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化的CRM₁₉₇稀释至约1mg/mL的蛋白浓度。使用约1:3250的胰蛋白酶与CRM₁₉₇摩尔比，将胰蛋白酶加入蛋白溶液中。将溶液在室温下温育约20小时。然后将300mM Tris、pH 7.5中的DTT加入直至10mM DTT的终浓度，以还原蛋白酶解裂解的CRM₁₉₇之间的分离A和B片段的二硫键。

约75分钟后，将还原的蛋白溶液加载到混合模式阳离子交换色谱柱(Capto^TM MMC，GE Healthcare)上。在加载蛋白溶液之前，将柱在2-8℃下用300mM Tris、10mM DTT、pH 7.5平衡。加载后，将柱用含有200mM氯化钠和10mM DTT的300mM Tris、pH7.5在2-8℃下洗涤，然后将产物在2-8℃下用300mM Tris、pH 8.5中的1M氯化钠洗脱。在使用5kDa NMWCO切向流超滤膜在2-8℃下浓缩之前，向批料中加入约0.002％w/v PS-20。浓缩后，向批料中加入另外的PS-20至浓度为0.02％w/v PS-20，并将该批料用100mM磷酸钾、10mM DTT、pH8渗滤。使用具有5kDa膜的切向流过滤来进一步浓缩批料。最终的渗余物经0.2微米过滤，并在缀合前冷冻储存或在2-8℃下储存。

在还原条件下通过SDS-PAGE分析DTFB样品(图1B和1C)。凝胶的光密度分析显示0.2微米过滤(FBI)后的半成品中间体具有>98％的纯度。

通过液相色谱-质谱法(LC-MS)分析图1C中所示的半成品中间体(FBI)以测量完整蛋白质量。用DTT还原后对样品进行LC-MS分析。来自主峰的原始数据的反卷积得到测量的质量为37,194.2Da。该质量测量与DTFB的理论质量37,194.4Da一致，确认了预期的氨基酸序列。

从胰蛋白酶、胞内蛋白酶Asp-INT和胞内蛋白酶Glu-C消化的组合获得肽图谱。在6M盐酸胍存在下，用碘乙酰胺对样品进行还原性烷基化，并在37℃下分别用每种酶消化约16-17小时。通过加入甲酸淬灭消化。将肽分离并通过LC-MS分析。使用通过单独消化鉴定的肽的组合，氨基酸序列覆盖率为约98％。所发现的肽与预测的DTFB序列一致。

使用另一种混合模式阳离子交换色谱法用于纯化DTFB

使用300mM Tris、pH 7.5，将通过如上所述地在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化的CRM₁₉₇，稀释至蛋白浓度为约5mg/mL。使用约1:3000的胰蛋白酶与CRM₁₉₇摩尔比，将胰蛋白酶加入蛋白溶液中。将溶液在约22℃下温育约15-20小时。然后将300mM Tris、pH7.5中的DTT加入直至终浓度≥10mM DTT，以还原蛋白酶解裂解的CRM₁₉₇之间的分离A和B片段的二硫键。

将还原的蛋白溶液以约25g蛋白/L树脂加载到混合模式阳离子交换色谱柱(Capto^TM MMC，GE Healthcare)上。在加载蛋白溶液之前，将柱在约22℃下用300mM Tris、10mM DTT、pH 7.5平衡。加载后，将柱用含有200mM氯化钠和10mM DTT的300mM Tris、pH7.5在约22℃下洗涤，然后将产物在22℃下用300mM Tris、pH 8.5中的1M氯化钠洗脱。来自混合模式阳离子交换色谱的DTFB产物可以使用5kDa NMWCO切向流超滤膜渗滤并浓缩，并如上所述地经0.2微米过滤。

在还原条件下通过SDS-PAGE分析来自混合模式阳离子交换过程的DTFB样品(图1D)。凝胶的光密度分析显示从混合模式阳离子交换柱洗脱的DTFB蛋白产物是高度纯化的。

缓冲液pH、离子强度和PS-20表面活性剂浓度对超滤过程中DTFB稳定性的影响

进行缓冲液pH、离子强度和PS-20表面活性剂研究，以解决在DTFB超滤步骤的开发过程中观察到的蛋白颗粒形成。将DTFB调节为含有0、200或500mM氯化钠的pH7、7.5或pH8的100mM磷酸钾。差示扫描量热法用于评估作为pH和氯化钠浓度的函数的DTFB溶液稳定性(熔融温度，Tm)。如表1所示，将pH从7增加到8使DTFB Tm增加约3℃。在所研究的pH值下，氯化钠在0至500mM氯化钠的范围内没有显著影响Tm。

表1：通过差示扫描量热法测量的作为缓冲液pH和氯化钠浓度的函数的DTFB溶液稳定性。

在另一项研究中，将纯化的DTFB在含有0、150、500和1000mM氯化钠的100mM磷酸钾中调节至pH6.0、pH7.0和pH8.5。将溶液在室温下保持过夜，然后离心以去除沉淀的蛋白。通过尺寸排阻色谱法用UV280吸光度检测来测定上清液的蛋白浓度(图2)。本研究中的上清液蛋白浓度在0和150mM氯化钠下不受溶液pH的影响。然而，在较高的氯化钠浓度(500和1000mM)下，结果显示上清液蛋白浓度显著降低，表明DTFB稳定性随着缓冲液pH从pH7.0或8.5降低至6.0而降低。

通过在50和100mM磷酸钾、pH8溶液中和50mM磷酸钾、150mM氯化钠、pH8中的DTFB溶液中，加入增加量的PS-20，从而研究PS-20浓度对DTFB稳定性的影响。将溶液涡旋5分钟，然后离心。通过尺寸排阻色谱法用UV280吸光度检测来测定上清液的蛋白浓度(图3)。在不含PS-20的样品中观察到显著的涡旋诱导的蛋白损失。在含有≥0.01％w/v PS-20的样品中，DTFB回收率显著提高。

实施例2：肺炎链球菌荚膜多糖的制备

培养肺炎球菌的方法是本领域公知的。参见例如Chase,1967,Methods ofImmunology and Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法也是本领域公知的。参见例如欧洲专利号EP0497524。肺炎球菌亚型的分离物可由美国模式培养物集存库(Manassas，VA)获得。细菌被鉴定为包裹的、非运动的、革兰氏阳性的、柳叶刀状的双球菌，其在血琼脂上是α-溶血的。可以使用特定抗血清，在Quelling反应的基础上区分亚型。参见例如美国专利号5,847,112。

代表每种感兴趣的肺炎链球菌血清型的细胞库以冷冻小瓶形式从默克培养物集存库(Rahway，NJ)获得。将解冻的种子培养物转移至种子发酵罐中，所述种子发酵罐含有适于肺炎链球菌的预先灭菌的生长培养基。培养物在温度和pH受控的种子发酵罐中生长。将种子发酵罐的整个容积转移到含有预先灭菌的生长培养基的生产发酵罐中。生产发酵是该过程的最终细胞生长阶段。温度、pH和搅拌速率受控。

通过添加灭活剂终止发酵过程。灭活后，将批料转移至灭活罐中，其中将其保持在受控的温度和搅拌下。使用离心和过滤的组合来去除细胞碎片。将该批料超滤并渗滤。然后将该批料进行基于溶剂的分馏，去除杂质并回收多糖。

实施例3：在水溶液中使用还原胺化将多糖与DTFB载体蛋白缀合

制备用于小鼠免疫原性研究的血清型3-DTFB(ST3-DTFB)缀合物将如实施例2中所述那样获得的纯化的血清型3多糖溶解在水中。使用探针超声仪，在将样品在冰中冷却的情况下，将Ps尺寸减少至平均分子量约200kDa。将经超声处理的样品经0.2微米过滤，并在2-8℃下储存。通过对30kDa NMWCO切向流过滤膜的渗滤，浓缩多糖溶液。

使用偏高碘酸钠氧化来制备多糖，用于缀合(参见Anderson et al.,1986,J.Immunol.137:1181-1186；和美国专利申请公开号US20110195086)。将100mM偏高碘酸钠溶液加入到50mM乙酸钠中的多糖溶液中。将样品在19-25℃下避光混合14-18小时。加入乙二醇(100:1摩尔，相对于多糖重复单元过量)，并在19-25℃下另外混合16-18小时，以淬灭残留的偏高碘酸钠并停止氧化反应。将所得溶液对10倍体积的水进行渗滤。将氧化的多糖溶液以等分试样形式在-70℃下储存。

将高碘酸盐氧化的多糖与如实施例1中所述那样制备的DTFB(使用混合模式阴离子交换色谱法)以0.6:1的多糖与蛋白质量比混合。分别加入磷酸钾、pH 6.4和氯化镍直至终浓度为145mM和2.2mM。然后加入氰基硼氢化钠直至约1-2摩尔当量。反应避光并在2-8℃下进行120小时。

然后将混合物对2次更换的25mM磷酸钾缓冲液、pH 6.4、0.3M氯化钠在2-8℃下透析总共14-18小时。通过短暂离心而去除不溶性物质，并通过尺寸排阻色谱(SEC)抛光缀合物，以减少游离多糖和蛋白。将SEC抛光的缀合物经30kD NMWCO离心浓缩器浓缩。

用于婴儿恒河猴免疫原性研究的血清型3-DTFB缀合物的制备

将纯化的血清型3肺炎球菌荚膜多糖粉末溶于水中，经0.45微米过滤。将批料均质化以减少Ps的分子量，并经0.22微米过滤。在缀合之前减少肺炎链球菌多糖的尺寸先前已被描述为用于生成更具特异性、可再现性和可控的物理特性的多糖的手段(Marburg等1997年美国专利5,623,057)。如Marburg等人所述，已知减少多糖尺寸会增加溶解度和过滤性，并降低多分散性和粘度，由此提高缀合一致性和缀合容易性。先前已经描述了使用均质化而减少来自肺炎链球菌的血清型19F多糖的多糖尺寸(Lander et al.,2000,Biotechnol.Prog.2000,16,80-85)。然后浓缩经尺寸减少的多糖，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜对水渗滤。

然后加入50mM乙酸钠，并通过加入100mM偏高碘酸钠溶液而开始多糖激活，从而在多糖上形成反应性醛。将批料在约22℃下温育约12小时。将该批料使用10kDa NMWCO切向流超滤膜，在≤8℃下对10mM磷酸钾、pH 6.4渗滤，并浓缩富含产物的渗余物。

将激活的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾、pH 7.0共混。将纯化的DTFB经0.2微米过滤，然后与缓冲液调节的多糖溶液以多糖与蛋白质量比为1.3:1合并。然后将溶液经0.2微米过滤。使用100mM氯化镍储备溶液，将氯化镍加入到批料中直至终浓度为约2mM。然后加入氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。使批料在约10℃下反应约120小时，以最大化多糖和蛋白的消耗量。

在缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，经1.2微米过滤，并使用100kDa NMWCO切向流超滤膜，在2-8℃下对100mM磷酸钾、pH7.0渗滤。然后将在渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过加入1.2M碳酸氢钠、pH9.4调节pH。加入硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后加入1.5M磷酸钾、pH6.0。

然后将该批料浓缩，并使用300kDa NMWCO切向流超滤膜，在2-8℃下对150mM氯化钠、pH7.0中的10mM L-组氨酸渗滤。将渗余物经0.2微米过滤，并用另外的150mM氯化钠、pH7.0中的10mM L-组氨酸调节至多糖浓度为1.0g/L。将批料分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。

实施例4：在水溶液中使用还原胺化将血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F与CRM₁₉₇缀合

使用常规工艺流程将不同血清型多糖单独与纯化的CRM₁₉₇载体蛋白缀合。将多糖溶解，减少尺寸，化学激活并通过超滤进行缓冲液交换。然后在反应混合物中，利用NiCl₂(2mM)将纯化的CRM₁₉₇与激活的多糖缀合，并在最终经0.2微米过滤之前，通过超滤纯化得到的缀合物。将每个步骤中的几个工艺参数(例如pH、温度、浓度和时间)控制为下述部分中的血清型特异性值。

多糖尺寸减少和氧化

将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解于水中，除血清型19A外的所有血清型均经0.45微米过滤。将血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F、22F、23F和33F均质化，以减少多糖的分子量。在≥90℃下通过均质化或酸水解，减少血清型18C的尺寸。血清型19A由于其相对低的起始尺寸而不进行尺寸减少。将均质化压力和通过均化器的通过次数控制为血清型特异性目标(150-1000巴；4-7次通过)，以获得血清型特异性分子量。将尺寸减少的多糖经0.2微米过滤，然后浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜对水渗滤。将5kDa NMWCO膜用于酸水解的血清型18C。

然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至血清型特异性温度(4-22℃)和pH(4-5)，以使由于激活而引起的多糖尺寸减少最小化。对于所有血清型(血清型4除外)，通过添加100mM偏高碘酸钠溶液而开始多糖激活。加入的偏高碘酸钠的量是血清型特异性的，范围为每摩尔多糖重复单元约0.1至0.5摩尔的偏高碘酸钠。偏高碘酸钠的血清型特异性电荷要达到多糖激活的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛)。对于血清型4，在加入偏高碘酸钠之前，将批料在约50℃和pH 4.1下温育，以使多糖部分脱酮。

对于所有血清型，除血清型5和7F外，将激活产物使用10kDaNMWCO切向流超滤膜，对10mM磷酸钾、pH6.4渗滤。将5kDa NMWCO膜用于酸水解的血清型18C。将血清型5和7F对10mM乙酸钠渗滤。所有血清型的超滤均在2-8℃下进行。

多糖与CRM₁₉₇缀合

根据血清型，将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾、pH 6.0或pH 7.0混合。所选择的缓冲液pH用于改善缀合反应期间的激活多糖的稳定性。通过如前所述地在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM₁₉₇(参见国际专利申请公开号WO2012/173876A1)经0.2微米过滤，并根据血清型，以多糖与CRM₁₉₇质量比为0.4-1.0w/w而与缓冲多糖溶液合并。选择质量比以控制缀合物中的多糖与CRM₁₉₇比。根据血清型，多糖和磷酸盐浓度是血清型特异性的，分别为3.6至10.0g/L和100至150mM。选择血清型特异性多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液经0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液，加入氯化镍至约2mM。加入氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行血清型特异性持续时间(72至120小时)，以最大化多糖和蛋白的消耗。

使用多糖和蛋白浓度分别为约12.0g/L和6.0g/L，将酸水解的血清型18C在37℃下在约pH8的100mM磷酸钾中与氰基硼氢化钠缀合。

用硼氢化钠还原

在缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并经1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜，将所有血清型(血清型5除外)在2-8℃下对100mM磷酸钾、pH7.0渗滤。然后将在渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过加入1.2M碳酸氢钠、pH9.4来调节pH。加入硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后加入1.5M磷酸钾、pH6.0。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜，将血清型5对300mM磷酸钾渗滤。

最终过滤和产物储存

然后将批料浓缩，并使用300kDa NMWCO切向流超滤膜在4℃下对150mM氯化钠、pH7.0中的10mM L-组氨酸渗滤。渗余物批料经0.2微米过滤。

将血清型19F在22℃下温育约7天，使用100kDa NMWCO切向流超滤膜在4℃下对150mM氯化钠、pH7.0中的10mM L-组氨酸渗滤，并经0.2微米过滤。

将该批料用另外的150mM氯化钠、pH7.0中的10mM L-组氨酸调节至多糖浓度为1.0g/L。将批料分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。

实施例5：在二甲基亚砜中使用还原胺化将血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F缀合至CRM₁₉₇的方法

使用常规工艺流程将不同血清型多糖单独与纯化的CRM₁₉₇载体蛋白缀合。将多糖溶解，调整尺寸至目标分子量，化学激活并通过超滤进行缓冲液交换。将激活的多糖和纯化的CRM₁₉₇各自冻干，并复溶在二甲基亚砜(DMSO)中。然后将复溶的多糖和CRM₁₉₇溶液合并，并如下所述进行缀合。在最终的0.2微米过滤之前，通过超滤纯化得到的缀合物。将每个步骤中的几个工艺参数(例如pH、温度、浓度和时间)控制为下述部分中的血清型特异性值。

多糖尺寸减少和氧化

将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解于水中，除血清型19A外的所有血清型均经0.45微米过滤。将除血清型18C和19A外的所有血清型均质化，以减少多糖的分子量。将均质化压力和通过均化器的通过次数控制为血清型特异性目标(150-1000巴；4-7次通过)。在≥90℃下，通过酸水解而减少血清型18C尺寸。血清型19A不进行尺寸减小。

将尺寸减少的多糖经0.2微米过滤，然后浓缩并使用10kDaNMWCO切向流超滤膜对水渗滤。将5kDa NMWCO膜用于血清型18C。

然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至血清型特异性温度(4-22℃)和pH(4-5)。通过添加偏高碘酸钠溶液而开始多糖激活。加入的偏高碘酸钠的量是血清型特异性的，范围为每摩尔多糖重复单元约0.1至0.5摩尔的偏高碘酸钠。

对于所有血清型，将激活产物使用10kDa NMWCO切向流超滤膜，对10mM磷酸钾、pH6.4渗滤。将5kDa NMWCO膜用于血清型18C。所有血清型的超滤均在2-8℃下进行。

多糖与CRM₁₉₇缀合

将通过如前所述地在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化的CRM₁₉₇(参见国际专利申请公开号WO2012/173876A1)使用5kDa NMWCO切向流超滤膜，对2mM磷酸盐、pH7缓冲液渗滤，并且经0.2微米过滤。

用水和蔗糖将氧化的多糖溶液配制为用于冻干的制剂。用水、磷酸盐缓冲液和蔗糖将蛋白溶液配置为用于冻干的制剂。蔗糖浓度范围为1至5％，以在冻干后在DMSO中实现最佳复溶。

将配制的多糖和CRM₁₉₇溶液分别冻干。将冻干的多糖和CRM₁₉₇材料复溶在DMSO中，并使用T形混合器合并。加入氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并且缀合进行血清型特异性持续时间(1至48小时)，以达到目标缀合物尺寸。

用硼氢化钠还原

在缀合反应后加入硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。将批料在约4℃下稀释到150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下对150mM氯化钠渗滤。

最终过滤和产物储存

然后将各批料浓缩，并使用300kDa NMWCO切向流超滤膜在4℃下对150mM氯化钠、pH7.0中的10mM L-组氨酸渗滤。渗余物批料经0.2微米过滤。

将血清型19F温育约5天，使用300kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下对150mM氯化钠、pH 7.0中的10mM L-组氨酸渗滤，并经0.2微米过滤。

将该批料用另外的150mM氯化钠、pH7.0中的10mM L-组氨酸稀释，并分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。

实施例6：使用ST3-DTFB单价缀合物制剂的小鼠免疫原性研究在小鼠模型中评估ST3-DTFB与ST3-CRM₁₉₇相比的免疫原性。对于每100μl为0.08μg多糖和5μg铝的剂量，用于给予小鼠的佐剂化制剂通过混合24μL无菌过滤的缀合物(在盐水中1:10，0.1258mg DTFB或CRM₁₉₇缀合的多糖/mL)与62μL的APA和3.664ml无菌盐水而制备。将配制的疫苗在2-8℃下储存在单独的硼硅酸盐加塞的小瓶中，以支持个体免疫。

在6-8周龄雌性Balb/C小鼠中评价ST3-DTFB(n＝10/组)。将小鼠通过使用如实施例3和4中描述那样制备的独特ST3-DTFB和ST3-CRM₁₉₇缀合物制剂而制造的ST3-DTFB/APA和两个ST3-CRM₁₉₇/APA批次来免疫。在第0、14和28天腹膜内给予0.1ml体积，ST3 PnPs浓度为0.08μg/给药，含5μg APA。在研究开始前(pre)和第39天、给药3后(PD3)收集血清，并在ST3WHO ELISA[按标准化的世界卫生组织组织(WHO)方案]以及蛋白载体ELISA(CRM₁₉₇和DTFB)中进行测试。在第49天，用肺炎链球菌血清型3(207CFU/0.5ml)腹膜内攻击小鼠。

WHO ELISA结果(图4)显示，用ST3-DTFB/APA和ST3-CRM₁₉₇/APA两者免疫的小鼠具有相似的PD3 PnPs 3滴度。用ST3-DTFB/APA和ST3-CRM197/APA免疫的小鼠对血清型3攻击具有≥90％的保护，其相对于阴性对照盐水和APA免疫小鼠显著更高(图5)。

实施例7：具有不同表面活性剂和稳定剂的15价肺炎球菌缀合物疫苗的制剂

将如上所述地制备的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物用于配制具有血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的15价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV15)。制剂使用在水溶液(实施例4)或DMSO(实施例5)中通过还原胺化而生成的肺炎球菌多糖-CRM₁₉₇缀合物来制备。按照实施例3制备ST3-DTFB缀合物。基于批料体积和半成品多糖浓度，计算获得单独血清型的最终目标浓度所需的半成品缀合物体积。将15种缀合物与选自氯化钠、L-组氨酸、pH 5.8缓冲液和PS-20，PS-80或P188中的赋形剂组合。

在与含有或不含丙二醇(PG)和聚乙二醇400(PEG₄₀₀)的半成品磷酸铝佐剂(APA)共混期间和之后，将无菌配制的半成品温和地混合。在各种制剂中研究了两种浓度的缀合物和APA。一种含有8μg/mL血清型6B多糖、4μg/mL所有其他血清型的多糖、和250μg/mL APA。另一种含有16μg/mL血清型6B多糖、8μg/mL所有其他血清型的多糖、和500μg/mL APA。将所配制的疫苗在2-8℃下储存。

实施例8：赋形剂对含有在水溶液中通过还原胺化生成的缀合物的肺炎球菌缀合物疫苗制剂稳定性的影响

如实施例7中所述那样制备的15价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV15)的稳定性对于各种赋形剂条件，在搅拌、再循环和旋转搅拌研究之后评价，以模拟可能发生的制造和运输应激。用20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM氯化钠和实施例7中列出的两种浓度的缀合物和APA中的任一种来制备PCV15。由于不同缀合物和APA浓度下的两种制剂之间的结果非常相似，因此在该实施例中仅显示含有较低浓度的缀合物和APA的PCV15制剂的结果。对于搅拌研究，使用玻璃容器中的磁力搅拌棒将PCV15制剂混合。对于再循环和剪切研究，PCV15制剂在管道回路中再循环。对于旋转研究，制备PCV15基础制剂(L-组氨酸、pH 5.8和氯化钠)，并如实施例7和表2中所述添加表面活性剂或稳定剂。搅动研究设计为使用旋转侧搅动，在4℃下最多24小时。视觉评估用于评价制剂。通过容器的光束路径允许检测微粒。进一步，使用静态光散射(SLS)评价制造、运输和处理应激对粒径分布的影响。基于悬浮液的药物产品的静态光散射允许更灵敏地检测聚集，如粒径分布所示。PCV15药物产品的单分散(单峰)粒径分布表明非聚集的药物产品。然而，多分散的混合模式粒径分布表明聚集。

PCV15在搅拌研究中的稳定性

如上文所述，使用实验室规模的混合实验设置(烧杯和磁力搅拌棒)，对利用如实施例4中所述地在水性条件下使用还原胺化而与CRM₁₉₇缀合的肺炎球菌多糖药物物质的PCV15制剂(称为PCV15_Aq)进行筛选。PCV15_Aq含有在水性条件下使用还原胺化而与与CRM₁₉₇缀合的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的多糖。使用烧杯和磁力搅拌棒，在100mL实验室规模的批量制备中制备20mM L-组氨酸、150mMNaCl中的含有APA的PCV15。在不存在表面活性剂的情况下，PCV15_Aq制剂易受制造(搅拌)诱导的损伤，在用于确保疫苗的药物产品的均质性的搅拌过程中引起疫苗药物产品的聚集。

在各种赋形剂的筛选研究过程中，发现一类非离子三嵌段共聚物提供稳健的稳定性。选择泊洛沙姆188(P188)来控制聚集，并提供稳健且稳定的疫苗药物制剂制剂。PCV15_Aq制剂用20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl、APA，并且在无P188、0.08％w/v P188或0.24％w/v P188的情况下制备。使用静态光散射评估使用磁力搅拌棒的恒定搅拌下的时间影响(图6-7)。使用Malvern Mastesizer 2000评估粒径分布。运行5μm NIST粒径标准，并产生预期的粒径分布。对于所有制剂(使用和不使用泊洛沙姆188)，在向APA添加缀合物后，观察到单分散直方图谱(T＝0小时搅拌)。在短至7小时(T＝7小时搅拌)的连续混合中，不含P188的制剂导致出现增加的粒径分布和聚集(图6)。然而，在最多24小时(T＝24小时搅拌)的连续混合后，含有P188的制剂在任意浓度下均没有出现增加的粒径分布和聚集(图7)。

PCV15在水平搅动研究中的稳定性

如实施例7中所述那样在100mL实验室规模的批量制备中制备20mM L-组氨酸、pH5.8、150mM NaCl和APA中、并且含有或不含0.2％w/v P188的另外的PCV15_Aq制剂。为了模拟运输和处理并且评价对疫苗药物产品的稳定性的影响，利用水平搅动研究。该研究通过与容器密闭系统(注射器或小瓶)中的表面相互作用以及将制剂暴露于最终容器组分和空气界面，从而代表了PCV15_Aq的直接搅动。将0.64mL分配到注射器中并加塞。将这些注射器在2-8℃下水平旋转24小时，并使用SLS评价粒径分布(图8A)。还进行了视觉评估(图8B)。不存在P188并经受模拟运输和处理应激的PCV15_Aq制剂导致容器密闭系统、诸如注射器中药物产品的粒径分布增加、以及可见的凝聚和聚集迹象。含有P188的PCV15制剂未显示粒径分布的增加或可见的凝聚和聚集迹象。

实施例9：赋形剂对稳定含有在水溶液和DMSO溶液中通过还原胺化生成的缀合物的肺炎球菌缀合物疫苗制剂的影响

使用实验室规模的模拟运输研究来评价20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl中含有APA的多种15价(PCV15)制剂，以确保稳健的可制造和商业上可行的疫苗药物产品制剂。制剂PCV15_Aq含有在水溶液中通过还原胺化生成的肺炎球菌多糖-CRM₁₉₇缀合物。制剂PCV15_Aq/Non-Aq含有：使用DMSO中的还原胺化制备在血清型6A、6B、7F、19A、19F和23F缀合物、和使用水溶液中在还原胺化制备的血清型1、3、4、5、9V、14、18C、22F和33F缀合物，其中所有多糖与CRM₁₉₇缀合。制剂PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}类似于PCV15_Αq/Non-Αq，除了血清型3缀合于蛋白DTFB而非CRM₁₉₇。由于实施例7中列出的不同缀合物和APA浓度下的两种制剂之间的结果非常相似，因此在该实施例中仅显示含有较低浓度的缀合物和APA的PCV15制剂的结果，除非另有说明。Prevnar 用作多价制剂的另一个例子，以测试PS-80在不同的肺炎球菌缀合物疫苗产品中的适合性。其含有与CRM₁₉₇载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F多糖、聚山梨醇酯80、琥珀酸盐缓冲液和磷酸铝佐剂。使用DMSO或在水性条件下使用还原胺化来制备缀合物。

为了评价对疫苗制剂的稳定性的影响，利用水平搅动研究。该研究通过与容器密闭系统(注射器或小瓶)中的表面相互作用以及将制剂暴露于最终容器组分和空气界面，从而代表了制剂的直接搅动。将制剂以0.64mL填充量分配到注射器中并加塞。将这些注射器在2-8℃下水平旋转最多8小时。使用静态光散射(SLS)评价水平搅动下的时间对粒径分布的影响。使用Malvern Mastesizer 2000评估粒径和分布。运行5μm NIST粒径标准，并产生预期的粒径分布。如图9所示，P188尽管是PCV15_Aq制剂的稳健的稳定剂，但对于控制PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂的聚集而言不是有效的稳定剂。在含有P188的PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂中，注意到了粒径分布的增加和可见的凝聚和聚集迹象。

由于出人意料地发现P188不能为含有在DMSO中通过还原胺化生成的缀合物的PCV15制剂提供稳健的稳定性，因此筛选了另外的稳定剂和赋形剂。将PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂(具有APA，在20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl和各种稳定剂中)分配到注射器中，并使用水平搅动进行筛选。使用视觉评估，评价恒定水平旋转下的时间影响(表2)。

表2：含有64μg PnPs/mL和250μg/mL APA，且不含表面活性剂、含有P188，含有PS-80、或含有PS-20的PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂在搅拌1小时后以及最多24小时注射器中水平旋转后的视觉观察。扇形(fanning)是指药物产品制剂在容器密闭系统(例如注射器或小瓶)的表面上沉积，并且表明制剂的表面沉淀。

PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂的视觉评估表明在较高的P188和PS-20浓度下没有聚集迹象(表2)。然而，使用SLS进行更高分辨率的研究，用于评估含有P188(0.05％w/v至1.0％w/v)或PS-20(0.005％w/v-0.1％w/v)的PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂的亚可见粒径分布。将这些制剂在1.5mL HyPak注射器(Becton-Dickinson)中水平旋转最多24小时。通过SLS测量的D[4,3]值示于图10A-B中。D[4,3]结果显示较高浓度的PS-20显著改善了制剂的物理化学稳定性，而P188在所有浓度下均无效。如图10B所示，Prevnar 水平搅动最多24小时显示D[4,3]值增加，并且颗粒的证据表明该制剂未能充分避免模拟运输诱导的聚集，与我们在我们的制剂中使用PS-80的经验类似。

基于我们使用PS-20和PS-80的数据，对于含有在非质子溶剂中生产的一种或多种缀合物的其他肺炎球菌多糖-蛋白缀合物，预期存在稳定性的改善。

实施例10：使用PCV15中配制的ST3-DTFB缀合物的婴儿恒河猴(IRM)免疫原性研究

使用如实施例1中所述地(混合模式阳离子交换色谱法)制备的DTFB，用于如实施例3中所述地制备ST3-DTFB缀合物。如实施例7中那样制备PCV15制剂。对IRM(婴儿恒河猴，n＝8/组)，如下述表3所述，在第0天、第28天和第56天用100μL疫苗进行肌肉内免疫(臂1-4)。血清在研究开始前(pre)和第14天、第28天、第42天、第56天和第70天收集。对IRM每天两次由训练有素的动物护理人员观察是否有任何疾病或痛苦的迹象。疫苗制剂在IRM中被认为是安全的并且耐受良好，因为没有注意到疫苗相关的不良事件。

表3：婴儿恒河猴研究制剂

使用单价缀合物，用单一PnPs血清型3WHO ELISA完成实施例6中描述的小鼠研究，以评价IgG应答。为了评估15价疫苗中的血清型特异性IgG应答，基于Marchese等人描述的人类测定，使用MSD技术(MSD是MesoScale Discovery的商标，其为MesoScaleDiagnostics,LLC.,Gaithersburg,MD,U.S.A.的部门)，开发了多重化电化学发光(ECL)测定用于恒河猴血清，其利用在电化学刺激时发光的SULFO-TAG^TM标签。在测试婴儿猴样品时使用人抗体试剂和标准品。婴儿恒河猴结果表示为使用分配给人参考标准品(007sp)的血清型特异性IgG浓度从标准曲线读取的几何平均浓度。

血清型3给药3后(PD3)IgG应答(图11)未显示免疫组之间的任何统计学差异。在使用肺炎链球菌血清型3的OPA测定(图12)中评估的功能性抗体未显示免疫组之间的任何统计学差异。

实施例11：PCV15制剂的优化

由于实施例7中列出的不同缀合物和APA浓度下的两种制剂之间的结果非常相似，因此在该实施例中仅显示含有较低浓度的缀合物和APA的PCV15制剂的结果，除非另有说明。

在PCV15配制工艺中使用再循环管线，以将疫苗药物产品供应到注射器和小瓶灌装机。常规填充期间的再循环赋予生物治疗药物产品额外的剪切和应激，因此是用于评价的重要加工步骤。进行研究以评价再循环对PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}和含有0.2％w/v P188和0.1％w/v PS-20的制剂的影响(在20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl中，具有64μg/mL总多糖和250μg/mLAPA)。使用蠕动泵将制剂从进料容器通过管道以180mL/min的流速再循环24小时。使用磁力搅拌棒连续混合进料容器，并定期取样进行目视观察。

含有P188的制剂显示出结块或可见聚集的外观(表4)，而含有PS-20的制剂未显示出可见聚集的迹象。

表4：含有0.2％w/v P188或0.1％w/v PS-20的PCV15制剂在连续混合和再循环24小时期间的视觉评估

无＝没有聚合；有＝在再循环瓶中观察到聚集

使用PCV15_Aq/Non-Aq进行另一个再循环研究，并且PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂含有最多500μg/mL(w/v Al⁺³)APA和P188或PS-20。在恒定混合下再循环24小时后，将制剂分配到注射器中并水平搅动最多24小时。观察所述制剂，并且在表5中示出注射器的视觉评估的总结。这些结果表明，PS-20提供了对于在常规制造、运输和处理期间可能发生的物理不稳定性或聚集的稳健解决方案。尽管P188成功稳定了PCV15_Aq制剂，但P188无法为该PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂提供足够的稳定性曲线(图7-9)。

表5：在混合和再循环24小时后、以及在1.5mL HyPak注射器中水平旋转最多24小时后，含有0.1％w/v PS-20或0.2％w/v P188的PCV15制剂的视觉评估

对PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂进行另一个研究，由此在DMSO中使用还原胺化制备ST18C(PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq})。PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq}制剂在20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM NaCl中制备，含有64μg/mL总多糖、250μg/mLAPA和0.2％w/v PS-20。PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq}制剂在恒定混合下再循环最多6小时后，将制剂分配到注射器中并水平搅动最多24小时。观察所述制剂，并且在表6中示出注射器的视觉评估的总结。这些结果表明，PS-20为包含下述PCV15制剂的制剂提供了对于在常规制造、运输和处理期间可能发生的物理不稳定性或聚集的稳健解决方案，所述PCV15制剂在20mM L-组氨酸、pH5.8、150mM NaCl中制备，含有250μg/mLAPA和0.2％w/v PS-20，并含有在DMSO中使用还原胺化制备的肺炎球菌多糖血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F缀合物、和在水溶液中使用还原胺化制备的血清型1、3、4、5、9V、14、22F和33F缀合物，其中所有多糖与CRM₁₉₇缀合。

表6：在混合和再循环24小时后、以及在1.5mL HyPak注射器中水平旋转最多24小时后，含有0.2％w/v PS-20的PCV15制剂的视觉评估

如图10和表4-5所示，单独的P188在防止基于悬浮液的PCV15制剂的聚集方面提供了最小的益处，所述制剂由在DMSO和/或ST3-DTFB缀合物中使用还原胺化生成的缀合物组成。用含有0.2％w/v P188和PEG₄₀₀(PEG)或丙二醇(PG)稳定剂的制剂进行另一个混合和水平旋转研究。如实施例7中所述，以500mL规模制备PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂。将PEG₄₀₀或PG加入到APA中，然后加入缀合物。PEG₄₀₀或PG终浓度在含有64μg PnPs/mL、250μg/mLAPA和0.2％w/v P188的制剂中，在0％w/v至15％w/v之间。将制剂与磁力搅拌棒连续混合1小时，并分配到注射器中。注射器被水平搅动最多24小时。定期取样制剂用于视觉评估和利用SLS的粒径分布测量。注射器的视觉评估结果显示在表7-8中。粒径分布结果示于图13。当单独添加时，P188不控制制剂中的聚集。令人惊讶的是，当与P188组合时，PEG₄₀₀或PG提供足够的稳定性。

表7：在混合1小时后、以及在1.5mL HyPak注射器中水平旋转最多24小时后，含有0.2％w/v P188和各种PEG₄₀₀浓度的PCV15制剂的视觉评估

表8：在混合1小时后、以及在1.5mL HyPak注射器中水平旋转最多24小时后，含有0.2％w/v P188和各种PG浓度的PCV15制剂的视觉评估

实施例12：肺炎球菌缀合物疫苗的稳定制剂的免疫原性

评估了含有PCV15的制剂对婴儿恒河猴免疫原性的影响，该制剂已被优化以控制制造和运输诱导的不稳定性。对每组8只动物肌内注射0.1mL的如实施例11中所述的PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}制剂，其含有64μg PnPs/mL、20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM氯化钠、250μg/mL APA、0.2％w/v P188、15％w/v PG或0.1％w/v PS-20。在T＝0(给药1)、1个月(给药2)和2个月(给药3)的年龄给予注射。在给药1之前、和给药1、2和3后2周收集血清。如在上述实施例10中所述地，测定来自免疫前、给药1后、给药2后和给药3后血清样品的血清IgG水平。图14中显示的结果表明，含有PS-20、或P188和PG的组合的PCV15制剂是免疫原性的。

实施例13：聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80对使用在质子(水)和非质子(DMSO)溶液中通过还原胺化生成的不同缀合物的混合物制备的稳定肺炎球菌缀合物疫苗药物产品的影响

在上述实施例中用PCV15制剂观察到的有希望的结果保证了探索在DMSO相对于水溶液条件中制备的糖缀合物中的蛋白水平比例的下限和上限。具有不同比例的糖缀合物的多种多价PCV制剂含有在水溶液中或在DMSO中通过还原胺化生成的肺炎球菌多糖-CRM₁₉₇缀合物。将每种制剂标准化为蛋白的量，并且在20mM L-组氨酸、pH5.8、150mM NaCl中含有64μg/mL(w/v Ps)的总多糖(Ps)浓度和250μg/mL APA。向每种制剂中加入PS-80或PS-20以实现终浓度为PS-80(0.05％w/v)、PS-20(0.05％w/v)或PS-20(0.2％w/v)。将制剂分配到BDHyPAK预填充注射器中，并使用实验室规模的模拟运输研究进行评价，以确保稳健的可制造和商业上可行的疫苗药物产品制剂。

为了获得使用DMSO制备的糖缀合物的所需百分比范围，制备以下制剂，其中所有多糖使用还原胺化与CRM₁₉₇缀合：

制剂PCV_24％含有在DMSO中制备的血清型6A、6B和23F缀合物，以及在水溶液中制备的血清型1、3、4、5、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和33F缀合物。该制剂中的总蛋白为56μg/mL，其中13μg/mL或～24％的总蛋白由CRM₁₉₇组成，其在DMSO中使用还原胺化与多糖缀合。

制剂PCV_50％含有在DMSO中制备的血清型6A、6B、7F、19A、19F和23F缀合物，以及在水溶液中制备的血清型1、3、4、5、9V、14、18C、22F、和33F缀合物。该制剂中的总蛋白为62μg/mL，其中31μg/mL或50％的总蛋白由CRM₁₉₇组成，其在DMSO中使用还原胺化与多糖缀合。

制剂PCV_62％含有在DMSO中制备的血清型6A、6B、7F、19A、19F和23F缀合物，以及在水溶液中制备的血清型1、5、9V、14、18C、22F和33F缀合物。该制剂中的总蛋白为61μg/mL，其中38μg/mL或～62％的总蛋白由CRM₁₉₇组成，其在DMSO中使用还原胺化与多糖缀合。

制剂PCV_79％含有在DMSO中制备的血清型6A、6B、7F、19A、19F和23F缀合物，以及在水溶液中制备的血清型1、5，18C和33F缀合物。该制剂中的总蛋白为63μg/mL，其中50μg/mL或～79％的总蛋白由CRM₁₉₇组成，其在DMSO中使用还原胺化与多糖缀合。

制剂PCV_100％含有在DMSO中使用还原胺化制备的血清型6A、6B、7F、19A、19F和23F缀合物。该制剂中的总蛋白为65μg/mL，其中65μg/mL或100％的总蛋白由CRM₁₉₇组成，其在DMSO中使用还原胺化与多糖缀合。

利用水平搅动研究来评价在DMSO中与多糖缀合的蛋白与总蛋白的比率对产物稳定性的影响。该研究通过与容器密闭系统(注射器或小瓶)中的表面相互作用以及将制剂暴露于最终容器组分和空气界面，从而代表了制剂的直接搅动。将制剂以0.64mL填充分配到注射器中并加塞。将这些注射器在2-8℃下水平旋转最多24小时。使用静态光散射(SLS)评价水平搅动下的时间对粒径分布的影响。使用Malvern Mastesizer 2000评估粒径和分布。运行5μmNIST粒径标准，并产生预期的粒径分布。如图15A-E所示，PS-80不是用于控制所有含PCV药物产品(PCV_24％至PCV_100％)的聚集的有效稳定剂。对含有PS-80的所有制剂，均观察到粒径分布中的增加和凝聚(出现颗粒)和聚集的明显迹象。

令人惊讶的是，在与PS-80使用的浓度可比的浓度下，PS-20提供了在所测试的DMSO缀合物百分比范围内的改善的稳定性曲线。在所测试的DMSO缀合物百分比范围内，与0.05％PS-20相比，添加PS-20以在制剂缓冲液中实现0.2％PS-20的浓度得到了优异的稳定性。

实施例14：新西兰白兔中肺炎球菌缀合物疫苗的稳定制剂的免疫原性

评估了含PCV15的制剂对新西兰白兔免疫原性的影响，该制剂已被优化以控制制造和运输诱导的不稳定性。每组8只动物肌内注射0.1mL的含有64mg PnPs/mL、20mM L-组氨酸、pH 5.8、150mM氯化钠，250μg/mLAPA和0.2％w/v PS-20的PCV15_Aq/Non-Aq制剂，如实施例11中所述。在第0天和第14天进行注射。在第0天和第14天在接种疫苗之前、以及第28天收集血清。来自免疫前、给药1后、给药2后血清样品的血清IgG水平通过ECL分析确定。

图16中显示的结果表明，被配制成含有4μg/mL每种糖(除了6B为8μg/mL)、以及约64μg/mL的CRM₁₉₇载体蛋白的剂型的15价肺炎球菌缀合物制剂是免疫原性的，所述15价肺炎球菌缀合物制剂在20mM组氨酸pH 5.8、150mM NaCl、250μg/mL APA、0.2％w/v PS-20中，具有：在DMSO中使用还原胺化与CRM₁₉₇缀合的来自血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌多糖，和在水溶液中使用还原胺化与CRM₁₉₇缀合的来自血清型1、3、4、5、9V、14、22F和33F的肺炎链球菌多糖。

Claims (1)

1.一种制剂，其包含：15价肺炎球菌缀合物组合物，所述组合物基本上由与CRM₁₉₇载体蛋白缀合的来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎链球菌多糖组成；20mM组氨酸pH 5.8；150mM NaCl；250μg/mL磷酸铝佐剂；和0.2％w/v聚山梨醇酯20；

其被配制成剂型，所述剂型含有：4μg/mL每种多糖，除了6B为8μg/mL；和约64μg/mL的CRM₁₉₇载体蛋白；

其中，来自血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F的多糖蛋白缀合物在DMSO条件下制备，并且来自血清型1、3、4、5、9V、14、22F和33F的多糖蛋白缀合物在水性条件下制备。