JP2020509002A - 肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ポリソルベート２０またはポロクサマーとポリオールの組合せを組み込んだ界面活性剤系を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤を提供する。【選択図】図６

Description

本発明は、ポリソルベート２０またはポロクサマーとポリオールの組合せを組み込んだ界面活性剤系を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤を提供する。
カプセル化された細菌の一例であるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界中で深刻な疾患の重大な原因である。１９９７年に、疾病管理センター（ＣＤＣ）は、米国で毎年３，０００症例の肺炎球菌性髄膜炎、５０，０００症例の肺炎球菌性菌血症、７，０００，０００症例の肺炎球菌性中耳炎、および５００，０００症例の肺炎球菌性肺炎があると推定した。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７，４６（ＲＲ−８）：ｌ−１３を参照されたい。さらに、これらの疾患の合併症は、いくつかの研究が肺炎球菌性髄膜炎での最大８％の死亡率および２５％の神経学的後遺症を報告しており、重大であり得る。Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７−９７を参照されたい。
長年認可されている多価肺炎球菌ポリサッカライドワクチンは、成人、特に高齢者および高リスクの人々における肺炎球菌疾患の予防に非常に貴重であることが証明されている。しかしながら、乳児および幼児は、コンジュゲートされていない肺炎球菌ポリサッカライドへの反応が乏しい。細菌性ポリサッカライドは、Ｔ細胞非依存性の免疫原であり、乳児において弱い応答を誘発するか、または誘発しない。担体タンパク質への細菌性ポリサッカライド免疫原の化学的コンジュゲーションは、乳児において免疫応答をＴ細胞依存性のものに転換する。ジフテリアトキソイド（ＤＴｘ、ＤＴの化学的に解毒されたバージョン）およびＣＲＭ１９７は、それらのアミノ酸配列におけるＴ細胞刺激エピトープの存在により、細菌性ポリサッカライド免疫原のための担体タンパク質として記載されている。
当時幼児および乳児に侵襲性肺炎球菌疾患を引き起こす７つの最も頻繁に単離された血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）を含有する肺炎球菌コンジュゲートワクチンであるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）が２０００年２月に米国で初めて認可された。米国におけるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）の普遍的な使用に続いて、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）に存在する血清型のおかげで、小児における侵襲性肺炎球菌疾患が著しく減少している。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５，５４（３６）：８９３−７を参照されたい。しかしながら、世界のある領域におけるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）での血清型有効範囲における限界、および米国におけるある新たに出現した血清型のいくつかの証拠がある（例えば１９Ａ他）。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４−４４、Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７−４６、Ｋｙａｗ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５−６３、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６−５４、Ｔｒａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１−Ｓ１８９を参照されたい。
Ｐｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆを含む１３価肺炎球菌ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲートワクチンである。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０Ａ１号、Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０−４８、およびＫｉｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４−Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ４８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５−２８，２００８を参照されたい。Ｄａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６６：２０９３−２０９８ ａｎｄ Ｆａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２６も参照されたい。
中国特許出願公開第１０１５９０２２４Ａ号は、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１４価肺炎球菌ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲートワクチンを記載している。
米国特許第８，１９２，７４６号は、全て個々にＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆを有する１５価肺炎球菌ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲートワクチンを記載している。
複数の担体タンパク質系も記載されている。例えば、米国特許出願公開第２０１００２０９４５０号、第２０１０００７４９２２号、第２００９００１７０５９号、第２００９００１０９５９号および第２００９００１７０７２号を参照されたい。
ストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体ならびにポリソルベート８０（ＰＳ−８０）およびポロクサマー１８８（Ｐ１８８）を含む界面活性剤を含む製剤が開示されている。それぞれ、米国特許第８，５６２，９９９号および米国特許出願公開第２０１３０２７３０９８号を参照されたい。
米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０Ａ１号 中国特許出願公開第１０１５９０２２４Ａ号 米国特許第８，１９２，７４６号 米国特許出願公開第２０１００２０９４５０号 米国特許出願公開第２０１０００７４９２２号 米国特許出願公開第２００９００１７０５９号 米国特許出願公開第２００９００１０９５９号 米国特許出願公開第２００９００１７０７２号 米国特許第８，５６２，９９９号 米国特許出願公開第２０１３０２７３０９８号
Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７，４６（ＲＲ−８）：ｌ−１３ Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７−９７ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５，５４（３６）：８９３−７ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４−４４ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７−４６ Ｋｙａｗ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５−６３ Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６−５４ Ｔｒａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１−Ｓ１８９ Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０−４８ Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４−Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ４８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５−２８，２００８ Ｄａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６６：２０９３−２０９８ ａｎｄ Ｆａｔｔｏｍ，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２６
本発明は、（ｉ）１つまたは複数のポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体と、（ｉｉ）５．０〜７．５の範囲のｐＨを有するｐＨ緩衝食塩水と、（ｉｉｉ）アルミニウム塩と、（ｉｖ）ａ）ポリソルベート２０および（ｂ）１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａの範囲の分子量を有するポロクサマーならびにプロピレングリコール（ＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００から選択されるポリオールから選択される界面活性剤系とを含む製剤を提供する。
ある実施形態では、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の１つまたは複数は、非プロトン溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で作製される。この実施形態のある態様では、（総タンパク質ベースで）１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上のコンジュゲート体がＤＭＳＯなどの非プロトン溶媒中で調製される。代わりに、（総タンパク質ベースで）１０〜１００％、２４％〜１００％、または２４〜８０％のコンジュゲート体が非プロトン溶媒、例えばＤＭＳＯ中で調製される。これらの実施形態のある態様では、界面活性剤系は、上記のポリソルベート２０またはポロクサマー／ポリオール組合せである。
ある実施形態では、界面活性剤系は、１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａ、７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａ、または７，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポロクサマーを含む。ポロクサマーは、ポロクサマー１８８またはポロクサマー４０７とすることができる。ある態様では、ポロクサマーの最終濃度は、０．００１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％、０．０２５ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％である。特定の態様では、ポリオールは、プロピレングリコールであり、１ｗ／ｖ％〜２０ｗ／ｖ％の最終濃度である。別の特定の態様では、ポリオールは、ポリエチレングリコール４００であり、１ｗ／ｖ％〜２０ｗ／ｖ％の最終濃度である。ある実施形態では、界面活性剤系は、ポリソルベート２０を含む。ある態様では、ポリソルベート２０の最終濃度は、０．００１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％、または０．０２５ｗ／ｖ％〜２．５ｗ／ｖ％、または０．０２５ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％の範囲にある。界面活性剤系がＰＳ−２０を含むある態様では、製剤は、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールから選択されるポリオールをさらに含む。ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールは、６ｗ／ｖ％〜２０ｗ／ｖ％の最終濃度とすることができる。ある実施形態では、ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール４００である。
ある実施形態では、ｐＨ緩衝食塩水は、５．０〜７．０の範囲のｐＨを有し得る。緩衝剤は、リン酸塩、コハク酸塩、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩、またはクエン酸塩からなる群から選択され得る。一態様では、緩衝剤は、５ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度のＬ−ヒスチジン、または１ｍＭ〜１０ｍＭの最終濃度のコハク酸塩である。特定の態様では、Ｌ−ヒスチジンは、２０ｍＭ±２ｍＭの最終濃度である。ｐＨ緩衝食塩水中の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組合せとすることができる。一態様では、ｐＨ緩衝食塩水は、塩化ナトリウムである。食塩水は、２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在し得る。
ある実施形態では、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、担体タンパク質にコンジュゲートされた１つまたは複数の肺炎球菌ポリサッカライドを含む。ある態様では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ（熱不安定性エンテロトキシン）、エシェリキア・コリＳＴ（熱安定性エンテロトキシン）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの外毒素Ａ、およびその組合せから選択される。ある特定の態様では、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の１つまたは複数は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。ある態様では、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の１つまたは複数は、非水溶媒ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用して調製される。この態様では、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用して調製され得、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、水溶液中での還元的アミノ化を使用して調製され得る。ある態様では、各用量は、８μｇ／ｍＬまたは１６μｇ／ｍＬの６Ｂを除き、４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬの各サッカライド、および約６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７担体タンパク質を含有するように製剤化される。
本発明は、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ由来のストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドと、２０ｍＭのＬ−ヒスチジンと、１５０ｍＭのＮａＣｌと、０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ−２０と、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡとを含む１５価肺炎球菌コンジュゲート製剤にも向けられている。ある態様では、製剤は、８μｇ／ｍＬまたは１６μｇ／ｍＬの６Ｂを除き、４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬの各サッカライドと、約６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７担体タンパク質とを含有する剤形として製剤化される。ある態様では、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、ＤＭＳＯ条件下で調製され、および血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、水性条件を使用して調製される。
非還元条件下でのＤＴＦＢプロセス中間体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ａ：示されている試料は、以下の通りである：分子量標準（左からレーン１）、３回反復マルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィー走行からの溶離剤生成物（ＭＭ ＡＥＸ１、ＭＭ ＡＥＸ２、ＭＭ ＡＥＸ３、レーン２〜４）、マルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィー走行からのプールされた溶離剤生成物（ＭＭ ＡＥＸプール、レーン５）、ダイアフィルターされたリテンテート（ＵＦ−ＤＲ、レーン６）、０．２ミクロンろ過後の最終バルク中間体（ＦＢＩ、レーン７）。ＳＤＳ ＰＡＧＥ：ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ビス−トリスゲル、５μｇ／レーン、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色。 非還元条件下でのＤＴＦＢプロセス中間体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｂ：還元条件下でのＤＴＦＢプロセス中間体走行のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ビス−トリスゲル、レーン２、４、８、１０：５μｇ／レーン、レーン６：２μｇ／レーン、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色）。示されている試料は、以下の通りである：Ｍａｒｋ−１２標準（レーン１および１２）、ＤＴＦＢを産出するために使用される精製ＣＲＭ１９７（ＣＲＭ１９７、レーン２および１０）、マルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂にロードされた、トリプシン消化ステップに続いてタンパク分解性に切断されたＣＲＭ１９７（ＭＭ ＣＥＸフィード、レーン４）、マルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーからの生成物（ＭＭ ＣＥＸ生成物、レーン６）、および０．２ミクロンろ過後の最終バルク中間体（ＤＴＦＢ−ＦＢＩ、レーン８）。 非還元条件下でのＤＴＦＢプロセス中間体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｃ：示された試料は、以下の通りである：分子量マーカー（左からレーン１）、マルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーに続く初期濃縮リテンテート（ＩＣＲ、レーン２）、ダイアフィルターされたリテンテート（ＵＦ−ＤＲ、レーン３）、ダイアフィルトレーション後の濃縮リテンテート（ＵＦ−ＯＣＲ、レーン４）、生成物回収のための膜フラッシュ（ＵＦ−Ｗ、レーン５）、最終的なプールされたリテンテートおよびフラッシュ（ＵＦ−ＦＲ、レーン６）、および０．２ミクロンろ過後の最終バルク中間体（ＦＢＩ、レーン６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：１４％トリス−グリシンゲル、８．３〜８．４μｇ／レーン、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅタンパク質ゲル染色。 非還元条件下でのＤＴＦＢプロセス中間体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｄ：還元条件下でのＤＴＦＢプロセス中間体走行のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ビス−トリスゲル、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色）。示された試料は、以下の通りである：Ｍａｒｋ−１２標準（レーン１および１２）、マルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂にロードされた、トリプシン消化ステップに続いてタンパク分解性に切断されたＣＲＭ１９７（ＭＭ ＣＥＸフィード、レーン２）、ＤＴＦＢを産出するために使用される精製ＣＲＭ１９７（ＣＲＭ１９７、レーン３）、カラムローディング中のフロースルー（ＭＭ ＣＥＸフロースルー、レーン４）、ロード後のカラムの洗浄（ＭＭ ＣＥＸ洗浄、レーン５）、マルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーからの溶出ステップ後に収集された生成物（ＭＭ ＣＥＸ生成物、レーン７、１０倍希釈ＭＭ ＣＥＸ生成物、レーン９）、およびマルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーからの溶出ステップ後に収集された後期溶出生成物（後期溶出ＭＭ ＣＥＸ生成物、レーン１１）。 ｐＨおよび塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度の関数としての１００ｍＭのリン酸カリウム（ＫＰｉ）中のＤＴＦＢタンパク質濃度を示す図である。溶液を室温で終夜保持し、次いで遠心分離した。上清をＵＶ２８０吸光度検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりアッセイした。 ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）濃度の関数としてのリン酸カリウム（ＫＰｉ）溶液中のＤＴＦＢタンパク質濃度を示す図である。溶液を室温で５分間ボルテックスし、次いで遠心分離した。上清をＵＶ２８０吸光度検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりアッセイした。 ＣＲＭ１９７またはＤＴＦＢ担体タンパク質のいずれかにコンジュゲートしており、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を用いて製剤化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３ポリサッカライドで免疫されたマウスに関するＥＬＩＳＡ抗体価を示す図である。マウスを２つの独立した血清型３−ＣＲＭ１９７コンジュゲートロット（ロット１および２）の１つで免疫した。 ＣＲＭ１９７またはＤＴＦＢ担体タンパク質のいずれかにコンジュゲートしており、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を用いて製剤化されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３莢膜ポリサッカライドで免疫されたマウスに関する生存曲線を示す図である。マウスを２つの独立した血清型３−ＣＲＭ１９７コンジュゲートロット（ロット１および２）の１つで免疫した。ＡＰＡまたは食塩水のみの製剤も対照として試験に含んだ。免疫化に続いて、マウスにその後血清型３細菌を腹腔内投与した。 静的光散乱（ＳＬＳ）によって測定される１５価肺炎球菌ポリサッカライド（ＰｎＰｓ）コンジュゲート製剤の粒径分布に及ぼす時間および撹拌の影響を評価するための実験室規模の撹拌研究を示す図である。１５の肺炎球菌ポリサッカライド血清型全てを水溶液中での還元的アミノ化を使用して、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした。コンジュゲート体を、撹拌研究のために２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ａｌ＋３）のＡＰＡ中で製剤化した。 ＳＬＳによって測定される１５価肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲート製剤の粒径分布に及ぼす時間および撹拌の影響を評価するための実験室規模の撹拌研究を示す図である。１５の肺炎球菌ポリサッカライド血清型全てを水溶液中での還元的アミノ化を使用して、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした。コンジュゲート体を、撹拌研究のために０．０８ｗ／ｖ％または０．２４ｗ／ｖ％ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）と共に２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ａｌ＋３）のＡＰＡ中で製剤化した。 シリンジ中の１５価肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲート製剤の実験室規模の模擬輸送およびハンドリング研究を示す図である。１５の肺炎球菌ポリサッカライド血清型全てを水溶液中での還元的アミノ化を使用して、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした。コンジュゲート体を、Ｐ１８８なしで、または０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８と共に２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ａｌ＋３）のＡＰＡ中で製剤化した。２４時間の水平回転の前または後にＳＬＳによって測定される粒径分布（Ａ）および２４時間の水平回転の後のシリンジの目視評価（Ｂ）を示す。 シリンジ中の１５価肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲート製剤の実験室規模の模擬輸送およびハンドリング研究を示す図である。１５の肺炎球菌ポリサッカライド血清型全てを水溶液中での還元的アミノ化を使用して、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした。コンジュゲート体を、Ｐ１８８なしで、または０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８と共に２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ａｌ＋３）のＡＰＡ中で製剤化した。２４時間の水平回転の前または後にＳＬＳによって測定される粒径分布（Ａ）および２４時間の水平回転の後のシリンジの目視評価（Ｂ）を示す。 ２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ａｌ＋３）のＡＰＡ、および０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８を有する２つの１５価肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲート製剤の粒径分布（ＳＬＳによって測定される体積加重分布またはＤ［４，３］として表される）を示す図である。製剤ＰＣＶ１５Ａｑは、水溶液中での還元的アミノ化によって産出された肺炎球菌ポリサッカライド−ＣＲＭ１９７コンジュゲート体から構成されていた。製剤ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢには、１５の肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲート体の組合せを使用し、そのいくつかは、水溶液中での還元的アミノ化によって産出されたものであり、他のものは、非水溶液中での還元的アミノ化によって産出されたものである。ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢの全ての肺炎球菌ポリサッカライド血清型は、ＤＴＦＢにコンジュゲートされた血清型３（ＳＴ３）を除き、ＣＲＭ１９７コンジュゲートされていた。製剤をシリンジに充填し、ＳＬＳ評価の前に４°Ｃで最大２４時間水平に撹拌した。 撹拌および１．５ｍＬのＨｙＰａｋシリンジ中での最大２４時間の水平回転後のＰ１８８（Ａ）、ＰＳ−８０（Ｂ）、およびＰＳ−２０（Ａ、Ｂ）を含有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤のＳＬＳによって測定されるＤ［４，３］値を示す図である。 撹拌および１．５ｍＬのＨｙＰａｋシリンジ中での最大２４時間の水平回転後のＰ１８８（Ａ）、ＰＳ−８０（Ｂ）、およびＰＳ−２０（Ａ、Ｂ）を含有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤のＳＬＳによって測定されるＤ［４，３］値を示す図である。 リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を有する１５価肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲート製剤で免疫した子アカゲザル（ＩＲＭ）からの肺炎球菌血清型３特異的ＩｇＧ濃度を示す図である。全ての製剤は、ＣＲＭ１９７またはＤＴＦＢにコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３莢膜ポリサッカライド（ＳＴ３）を含有した。製剤ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑには、１５の肺炎球菌ポリサッカライド−ＣＲＭ１９７コンジュゲート体の組合せを使用し、そのいくつかは、水溶液中での還元的アミノ化によって産出されたものであり、他のものは、非水溶液中での還元的アミノ化によって産出されたものである。ＰＣＶ１５製剤は、図に示されるように、０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８または０．１ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有した。 リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）および０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８で製剤化された２つの１５価肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲートワクチンで免疫した子アカゲザルの血清型３ＯＰＡ（ＯＰＫ）力価を示す図である。製剤は、ＣＲＭ１９７（ＰＣＶ１５Ａｇ）またはＤＴＦＢ（ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ）にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３莢膜ポリサッカライド（ＳＴ３）を含有した。 １時間の撹拌および最大２４時間の水平回転後のＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤のＳＬＳによって測定される粒径分布を示す図である。製剤は、図に示されるように、０．２ｗ／ｖ％のポロクサマー１８８および様々な濃度のプロピレングリコール（ＰＧ）またはポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含有した。 実施例１２に記載したように、１５ｗ／ｖ％のＰＧを有する０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８または０．１ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−ＡＱ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤に関する子アカゲザルにおける免疫原性比較試験を示す図である。グループあたり８匹の動物に、年齢Ｔ＝０（用量１）、１ヶ月（用量２）および２ヶ月（用量３）で２つの製剤のいずれかを筋肉内注射した。血清を、用量１の前および用量１、２、および３後２週間で収集した。免疫前、用量１後、用量２後、および用量３後の血清試料からの血清型特異的ＩｇＧ濃度（ＩｇＧ ＧＭＣ）を実施例１０に記載したように測定した。パネルＡは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、および９Ｖに関する免疫原性結果を示す。パネルＢは、血清型１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆに関する免疫原性結果を示す。 実施例１２に記載したように、１５ｗ／ｖ％のＰＧを有する０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８または０．１ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−ＡＱ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤に関する子アカゲザルにおける免疫原性比較試験を示す図である。グループあたり８匹の動物に、年齢Ｔ＝０（用量１）、１ヶ月（用量２）および２ヶ月（用量３）で２つの製剤のいずれかを筋肉内注射した。血清を、用量１の前および用量１、２、および３後２週間で収集した。免疫前、用量１後、用量２後、および用量３後の血清試料からの血清型特異的ＩｇＧ濃度（ＩｇＧ ＧＭＣ）を実施例１０に記載したように測定した。パネルＡは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、および９Ｖに関する免疫原性結果を示す。パネルＢは、血清型１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆに関する免疫原性結果を示す。 撹拌および１．５ｍＬのＨｙＰａｋシリンジ中での最大２４時間の水平回転後の０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−８０、０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−２０および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＤＭＳＯ中で作製された血清型の異なるパーセンテージ（パネルＡ：２４％、パネルＢ：５０％、パネルＣ：６２％、パネルＤ：７９％、およびパネルＥ：１００％）を有する、実施例１３に記載したＰＣＶＡｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ製剤のＳＬＳによって測定されるＤ［４，３］値を示す図である。 撹拌および１．５ｍＬのＨｙＰａｋシリンジ中での最大２４時間の水平回転後の０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−８０、０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−２０および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＤＭＳＯ中で作製された血清型の異なるパーセンテージ（パネルＡ：２４％、パネルＢ：５０％、パネルＣ：６２％、パネルＤ：７９％、およびパネルＥ：１００％）を有する、実施例１３に記載したＰＣＶＡｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ製剤のＳＬＳによって測定されるＤ［４，３］値を示す図である。 撹拌および１．５ｍＬのＨｙＰａｋシリンジ中での最大２４時間の水平回転後の０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−８０、０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−２０および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＤＭＳＯ中で作製された血清型の異なるパーセンテージ（パネルＡ：２４％、パネルＢ：５０％、パネルＣ：６２％、パネルＤ：７９％、およびパネルＥ：１００％）を有する、実施例１３に記載したＰＣＶＡｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ製剤のＳＬＳによって測定されるＤ［４，３］値を示す図である。 撹拌および１．５ｍＬのＨｙＰａｋシリンジ中での最大２４時間の水平回転後の０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−８０、０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−２０および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＤＭＳＯ中で作製された血清型の異なるパーセンテージ（パネルＡ：２４％、パネルＢ：５０％、パネルＣ：６２％、パネルＤ：７９％、およびパネルＥ：１００％）を有する、実施例１３に記載したＰＣＶＡｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ製剤のＳＬＳによって測定されるＤ［４，３］値を示す図である。 撹拌および１．５ｍＬのＨｙＰａｋシリンジ中での最大２４時間の水平回転後の０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−８０、０．０５ｗ／ｖ％のＰＳ−２０および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＤＭＳＯ中で作製された血清型の異なるパーセンテージ（パネルＡ：２４％、パネルＢ：５０％、パネルＣ：６２％、パネルＤ：７９％、およびパネルＥ：１００％）を有する、実施例１３に記載したＰＣＶＡｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ製剤のＳＬＳによって測定されるＤ［４，３］値を示す図である。 ８μｇ／ｍＬの６Ｂを除き、４μｇ／ｍＬの各サッカライドと、約６４μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７担体タンパク質とを含有する剤形として製剤化された、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドおよび水溶液中での還元的アミノ化を使用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆからのストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドを有する、２０ｍＭのヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ、０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０中の１５価肺炎球菌コンジュゲート製剤に関するニュージーランド白ウサギにおける免疫原性結果を示す図である。
本発明は、多価コンジュゲートワクチン製剤における特定の界面活性剤が、特に、１つまたは複数のコンジュゲート体がＤＭＳＯなどの非プロトン溶媒中で作製される場合、コンジュゲート体の安定性およびそれらが凝集する傾向に影響し得るという発見に部分的に基づく。加えて、いくつかの界面活性剤は、必要な安定性を得るためにポリオールの添加を必要とする。
本明細書で使用される場合、「プロトン溶媒」は、酸素（ヒドロキシル基におけるように）または窒素（アミン基におけるように）に結合した水素原子を有する溶媒である。一般的には、不安定なＨ＋を含有する任意の溶媒は、プロトン溶媒と称される。
本明細書で使用される場合、「非プロトン溶媒」は、極性非プロトン溶媒を表す。そのような溶媒は、酸性水素を欠き、水素を供与することができない。極性非プロトン溶媒の例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）を含むが、これらに限定されない。非水溶液または溶媒は、非プロトン溶媒と互換的に使用される。非プロトン溶媒は、例えば、最大１％、２％、５％、１０％または２０％存在するいくらかの水を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ポリサッカライド」（Ｐｓ）という用語は、「サッカライド」、「オリゴ糖」、「ポリサッカライド」、「リポ糖」、「リポオリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「複合糖質」などを含むが、これらに限定されない、免疫学的および細菌ワクチン技術分野において一般的に使用される任意の抗原性サッカライドエレメント（または抗原性単位）を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、本発明の免疫原性組成物と共に使用される場合の「含む」という用語は、（抗原混合物に関する「からなる」文言の制限を受ける）アジュバントおよび賦形剤などの任意の他の成分の包含を表す。多価ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート混合物と共に使用される場合の「からなる」という用語は、それらの特定のストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体を有し、異なる血清型からの他のストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体を有さない混合物を表す。
本明細書で定義される場合、「沈殿」、「沈殿物」、「微粒子形成」、「曇り」、および「凝集」という用語は、互換的に使用され得、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の集塊をもたらす任意の物理的相互作用または化学反応を表すことを意味する。凝集のプロセス（例えば、タンパク質凝集）は、熱、圧力、ｐＨ、撹拌、剪断力、凍結融解、脱水、重金属、フェノール化合物、シリコンオイル、変性剤などを含めた多数の物理化学的ストレスによって引き起こされ得る。
本明細書で定義される場合、本発明の「界面活性剤」は、免疫原性組成物製剤の表面張力を低下させる任意の分子または化合物である。「界面活性剤系」は、界面活性剤を含むが、界面活性剤の効果を高めるポリオールなどの追加の賦形剤の包含を可能にし得る。
本発明の免疫原性組成物は、１つまたは複数の担体タンパク質にコンジュゲートされた１つまたは複数の抗原を含有する多価組成物とすることができる。本発明のある実施形態では、抗原は、カプセル化された細菌からのサッカライドである。そのようなワクチンでは、サッカライドは、ある種の細菌の表面に似た糖分子の長鎖からなる。カプセル化された細菌は、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、およびヘモフィルス・インフルエンザｂ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ）を含むが、これらに限定されない。抗原は、同じ生物からのものでも異なる生物からのものでもよい。本発明の他の実施形態では、抗原は、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜ポリサッカライドである。
２つの担体タンパク質が使用される実施形態では、第１の担体タンパク質にコンジュゲートしていない各莢膜ポリサッカライドは、同じ第２の担体タンパク質にコンジュゲートされている（例えば、各莢膜ポリサッカライド分子が単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている。別の実施形態では、第１の担体タンパク質にコンジュゲートしていない莢膜ポリサッカライドは、２つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートされている（各莢膜ポリサッカライド分子が単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている）。そのような実施形態では、同じ血清型の各莢膜ポリサッカライドは、同じ担体タンパク質に典型的にコンジュゲートされている。
コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって分泌される外毒素であるジフテリア毒素は、ジスルフィド架橋によって連結され、３つのドメインを有する２つのサブユニット（フラグメント）からなる古典的なＡ−Ｂ毒素である。フラグメントＡ（ＤＴＦＡ）は、ＡＤＰ−リボース触媒Ｃドメインを含有し、一方、フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）は、中央転座Ｔドメインおよびカルボキシ末端受容体結合Ｒドメインを含有する。ＤＴＦＢは、ＤＴの全アミノ酸配列の約６０％を構成する非毒性部分である。例えば、Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｄｉｎｉｕｓ，Ｌ．Ｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１４８５−１４９１（１９７１）、Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ｊｒ．，ＡＭ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１４９２−１４９５（１９７１）、Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｋａｎｄｅｌ，Ｊ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１４９６−１５０３（１９７１）、およびＤｒａｚｉｎ，Ｒ．，Ｋａｎｄｅｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１５０４−１５１０（１９７１）を参照されたい。
ジフテリア毒素の完成されたアミノ酸配列は、公開されている。Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｌ．，Ｂｊｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．，Ｆｏｎｇ，Ｄ．，Ｂｕｃｋ，Ｇ．Ａ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ，Ｄ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，６８５３−６８５７（１９８３）を参照されたい。具体的には、ＤＴＦＢは、ＤＴのアミノ酸残基１９４〜５３５を含む。
ＣＲＭ１９７担体タンパク質は、残基５２でのフラグメントＡ中の単一アミノ酸置換によって非毒性にされたＤＴの変異型である。ＣＲＭ１９７およびＤＴは、フラグメントＢにおける完全な配列相同性を共有する。主要なＴ細胞エピトープは、ＤＴアミノ酸配列のＢフラグメントで主に見出された。Ｂｉｘｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．（１９８９）２５１：１７５−８０、Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５：３２０７−３２１４、Ｄｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（２０００）１８１：１００１−９、およびＭｃＣｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．６７（Ｓｅｐｔ．１９９９），ｐ．４８６２−４８６９を参照されたい。
本明細書に記載のＤＴＦＢの使用は、ＡＤＰ−リボシル化活性ドメインのジフテリア毒素欠失を含む。ＤＴＦＢの使用は、欠失、置換および付加を含む少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するバリアントも含む。バリアントの例は、システイン２０１の欠失または変異である。ＤＴＦＢ（Ｃ８）は、ＡＤＰ−リボシル化活性化ドメインが欠失され、システイン２０１が除去または変異されているジフテリア毒素を意味する。ＤＴＦＢの使用は、ＤＴの配列２６５〜４５０を網羅するフラグメントも含み、これは、公開されたＴ細胞エピトープを含む（Ｂｉｘｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．（１９８９）２５１：１７５−８０、Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５：３２０７−３２１４を参照されたい）。ＤＴＦＢは、単量体、二量体、またはオリゴマーの状態も含む。ＤＴＦＢの使用は、ＤＴＦＢもしくはフラグメントを含有する任意のタンパク質コンジュゲート体（全長ＤＴまたはＣＲＭ１９７を除く）、ハイブリッドタンパク質、またはコンジュゲートタンパク質も含む。ＤＴＦＢの使用は、化学的に修飾されたＤＴＦＢまたはフラグメント（すなわち、ペグ化、非天然アミノ酸修飾）も含む。
ある実施形態では、ＤＴＦＢは、吸着クロマトグラフィーによるその後の精製を伴う、天然ＤＴまたは変異型ＣＲＭ１９７の酵素的消化および還元から作製される。したがって、ＤＴ Ｃ２０１残基での変異の有無にかかわらず、精製ＤＴＦＢは、全長天然もしくはＣ２０１変異ＤＴまたはＣＲＭ１９７から、またはＡフラグメントが切断されたそのバリアントから同様に調製され得ると考えられる。Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅおよびＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣとして市販されているマルチモーダル樹脂ならびにクロマトグラフィーサイクル中に５０ｍＭを超えるトリス濃度は、切断された天然型ＤＴＦＢを精製する優れたモードを提供することが特に知られている。
ある実施形態では、ＤＴＦＢの調製物は、最大１０ｍＭのＤＴＴを含む。ＤＴＴは、残基位置２０１での遊離システインによるＤＴＦＢ単量体間のジスルフィド結合形成によって引き起こされる二量体化を防ぐ。そのような場合、ニッケルは、コンジュゲーション反応混合物に添加されない。しかしながら、コンジュゲーション反応は、その他の点では同じ方法によって進行する。ＤＴＴが使用されない場合、二量化ＤＴＦＢは、ニッケルの存在下でＰｓにコンジュゲートされて、残留阻害性シアン化物を封鎖することによってコンジュゲーションの程度を改善することができる。
ＤＴＦＢ中の遊離システインの除去（ＤＴ Ｃ２０１の変異）は、マルチモーダル樹脂において同様の挙動を与えると予想される。遊離システイン間のジスルフィド結合形成による二量化は、実現可能ではないので、遊離システインの除去は、ＤＴＴの必要性を排除すると予想される。トリス緩衝液濃度および塩化ナトリウム溶出緩衝液濃度を増加させると、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣクロマトグラフィー樹脂からのＤＴＦＢタンパク質の回収率が改善することが実証されている。ＤＴＦＢ精製は、他のマルチモーダル樹脂を使用して達成され得ることが予想される。
ある実施形態では、ＤＴＦＢは、ＤＴ Ｃ２０１残基の変異の有無にかかわらず、組換え的に発現され、続いて当業者に既知の様々な技術によって精製される。
本発明の特定の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、担体タンパク質として使用される。ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素の非毒性バリアント（すなわち、トキソイド）である。一実施形態では、それは、カザミノ酸および酵母抽出物ベースの培地で増殖させたコリネバクテリウム・ジフセリエＣ７株（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載されている方法に従って組換え的に調製される。典型的に、ＣＲＭ１９７は、限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿法、およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せを通して精製される。いくつかの実施形態では、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において調製される。
ＤＴＦＢおよびそのバリアントは、タンパク質（ペプチド）およびサッカライドを含めた抗原のための担体タンパク質として使用され得る。他の適切な担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開第２００４／０８３２５１号に記載された）、エシェリキア・コリＬＴ、エシェリキア・コリＳＴ、およびシュードモナス・エルジノーサからの外毒素Ａなどの追加の不活性化細菌毒素を含む。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）などの細菌外膜タンパク質、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面プロテインＡ（ＰｓｐＡ、国際出願特許公開番号国際公開第０２／０９１９９８号を参照されたい）、肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）、グループＡまたはグループＢ連鎖球菌からのＣ５ａペプチダーゼ、またはヘモフィルス・インフルエンザプロテインＤ、何らかの様式で解毒されたｐｌｙ、例えばｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際特許出願公開第０４／０８１５１５号を参照されたい）またはｄＰＬＹ−ｆｏｒｍｏｌを含めた肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６−１３）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えばＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物を含めたＰｈｔＸ（国際特許出願公開第０１／９８３３４号および国際公開第０３／５４００７号を参照されたい）も使用され得る。卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（ナイセリア・メニンギティディスからの）、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザタンパク質Ｄ、例えば、欧州特許第０５９４６１０Ｂ号を参照されたい）、または合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号および欧州特許第０４２７３４７号を参照されたい）のその免疫学的に機能的な同等物、熱ショックタンパク質（国際特許出願公開第９３／１７７１２号および国際公開第９４／０３２０８号を参照されたい）、百日咳タンパク質（国際特許出願公開第９８／５８６６８号および欧州特許番号欧州特許第０４７１１７７号を参照されたい）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子またはホルモン（国際特許出願公開第９１／０１１４６号を参照されたい）、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４−７を参照されたい）などの様々な病原体由来抗原（Ｆａｌｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６−３８２４を参照されたい）からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、鉄取り込みタンパク質（国際特許出願公開第０１／７２３３７号を参照されたい）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（国際特許公開番号国際公開第００／６１７６１号を参照されたい）、およびフラジェリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９を参照されたい）などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用され得る。
ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８−３８４４）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、およびＣＲＭ１０７ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓ ａｎｄ Ｙｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９９２に記載された他の変異、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒへのＧｌｕ−１４８のおよび／またはＧｌｙへのＡｌａ １５８の欠失または変異、および米国特許第４，７０９，０１７号または米国特許４，９５０，７４０に開示されている他の変異、少なくとも１つまたは複数の残基Ｌｙｓ ５１６、Ｌｙｓ ５２６、Ｐｈｅ ５３０および／またはＬｙｓ ５３４の変異、米国特許第５，９１７，０１７号または米国特許第６，４５５，６７３号に開示された他の突然変異、または米国特許第５，８４３，７１１号に開示されたフラグメントなどの他のＤＴ変異体が第２の担体タンパク質として使用され得る。そのようなＤＴ変異体は、エピトープ領域を含むＢフラグメントを含むＤＴＦＢバリアントを作製するためにも使用され得る。
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の担体タンパク質にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８の少なくとも１つからの莢膜ポリサッカライドを含むポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体と、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物を提供する。本発明のある実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７に個々にコンジュゲートされた２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４血清型からの莢膜ポリサッカライドを含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなる。本発明のある態様では、ＣＲＭ１９７は、使用される唯一の担体タンパク質である。
ある実施形態では、上記の免疫原性組成物は、第２の担体タンパク質（第１の担体タンパク質とは少なくとも１つのアミノ酸が異なる）にコンジュゲートされた１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８の少なくとも１つから選択される１つの追加のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型からの莢膜ポリサッカライドをさらに含んでもよい。好ましくは、特定の血清型からのサッカライドは、複数の担体タンパク質にコンジュゲートしていない。
本発明のある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、第２の担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１つの追加の血清型からの莢膜ポリサッカライドをさらに含む。これらの実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７ではない第２の担体タンパク質に個々にコンジュゲートされた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４血清型からの莢膜ポリサッカライドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。
本発明のある実施形態では、免疫原性組成物は、Ｎ血清型からの莢膜ポリサッカライドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなり、ここで、Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４であり、Ｎ血清型のそれぞれからの莢膜ポリサッカライドは、ＣＲＭ１９７である第１のタンパク質担体にコンジュゲートされている。本発明の他の実施形態では、１、２、３．．．またはＮ−１血清型からの莢膜ポリサッカライドは、第１のタンパク質担体にコンジュゲートしており、Ｎ−１、Ｎ−２、Ｎ−３．．．１血清型からの莢膜ポリサッカライドは、ＣＲＭ１９７とは異なる第２のタンパク質担体にコンジュゲートされている。
本発明の特定の一実施形態では、本発明は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆからの莢膜ポリサッカライドを含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる１５価免疫原性組成物を提供する。
ストレプトコッカス・ニューモニエからの莢膜ポリサッカライドは、当業者に既知の標準的な技術によって調製され得る。例えば、ポリサッカライドは、細菌から単離され得、既知の方法によって、好ましくはホモジナイザーを使用して達成されるマイクロ流動化によって、または化学的加水分解によって、ある程度までサイズ調整され得る（例えば、欧州特許第４９７５２４号および第４９７５２５号を参照されたい）。一実施形態では、各ポリサッカライド血清型に対応するストレプトコッカス・ニューモニエ株は、大豆ベースの培地中で増殖される。次に個々のポリサッカライドは、遠心分離、沈殿、および限外ろ過を含めた標準的なステップを通して精製される。例えば、米国特許出願公開２００８／０２８６８３８および米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。ポリサッカライドは、粘度を低下させるために、および／またはその後のコンジュゲートされた生成物のろ過性を改善するために、サイズ調整され得る。本発明では、莢膜ポリサッカライドは、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８の１つまたは複数から調製される。
精製ポリサッカライドは、化学的に活性化されて、担体タンパク質と反応することができる官能基を導入する。一旦活性化されると、各莢膜ポリサッカライドは、別々に担体タンパク質にコンジュゲートされて複合糖質を形成する。ポリサッカライドコンジュゲート体は、既知のカップリング技術によって調製され得る。
一実施形態では、ポリサッカライドの化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、第４，６７３，５７４号、および第４，９０２，５０６号に記載されている手段によって達成される。簡単に言うと、肺炎球菌ポリサッカライドは、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸などの過ヨウ素酸塩ベースの酸化剤と反応させられて、隣接するヒドロキシル基のランダムな酸化的切断をもたらし、反応性アルデヒド基を産出する。
タンパク質担体上の第１級アミン基（主にリジン残基）への酸化ポリサッカライドの直接的アミノ化カップリングは、還元的アミノ化によって達成することができる。例えば、コンジュゲーションは、ニッケルの存在下で活性化ポリサッカライドと担体タンパク質との混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と反応させることによって行われる。コンジュゲーション反応は、水溶液中またはＤＭＳＯなどの有機溶媒中で行われ得る。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２３１２７０Ａ１号、欧州特許第０４７１１７７Ｂ１号、および米国特許出願公開第２０１１／０１９５０８６Ａ１号を参照されたい。コンジュゲーション反応の終りに、未反応のアルデヒドは、水素化ホウ素ナトリウムなどの強力な還元剤の添加によってキャッピングされる。
一実施形態では、製剤化の前に、各肺炎球菌莢膜ポリサッカライド抗原は、ストレプトコッカス・ニューモニエから個々に精製され、活性化されて、反応性アルデヒドを形成し、次いでニッケルの存在下でシアノボロイドライドナトリウムでの還元的アミノ化を使用して第１または第２の担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされる。ニッケルは、還元的アミノ化に使用されるシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤からの残留阻害性シアン化物とキレート環を形成する。
ある実施形態では、コンジュゲーション反応は、還元的アミノ化によって行われ、ここで、ニッケルは、より大きいコンジュゲーション反応効率のために、および遊離シアン化物除去を助けるために使用される。遷移金属は、シアン化物と安定な錯体を形成することが知られており、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでのタンパク質アミノ基およびホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている（Ｇｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２０３：３３１−３３４、Ｊｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：１８６−１９０）。残留阻害性シアン化物をキレート化することによって、ニッケルの添加は、コンジュゲーション中のタンパク質の消費量を増加させ、より大きく、潜在的により免疫原性のコンジュゲート体の形成をもたらす。
市販のシアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロット中の遊離シアン化物レベルの変動は、一貫性のないコンジュゲーション性能をもたらし、その結果、分子質量およびポリサッカライド対タンパク質比を含めた可変コンジュゲート特質がもたらされる可能性がある。コンジュゲーション反応へのニッケルの添加は、遊離シアン化物のレベルを減少させ、したがって、ロット間コンジュゲート一貫性の程度を改善する。
別の実施形態では、コンジュゲーション方法は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）でのポリサッカライドの活性化を用いてシアン酸エステルを形成し得る。活性化サッカライドは、担体タンパク質上のアミノ基に直接結合され得る。
別の実施形態では、反応性ホモ二官能基またはヘテロ二官能基は、シアン酸エステルをいくつかの利用可能なモダリティーのいずれかと反応させることによって、活性化ポリサッカライド上に導入され得る。例えば、シスタミンまたはシステアミンを使用して、マレイミド活性化担体タンパク質（例えばＧＭＢＳを使用して）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド（例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ）またはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを使用して）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体に結合できるチオール化ポリサッカライドを調製し得る。別の実施形態では、シアン酸エステルは、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）と反応させられ、生じたアミノ誘導体化サッカライドは、カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を使用して担体タンパク質上の遊離カルボキシ基にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲート体は、国際特許出願公開第９３／１５７６０号、国際公開第９５／０８３４８号および国際公開第９６／２９０９４号、ならびにＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５−２５６に記載されている。
他の適したコンジュゲーション方法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、およびＴＳＴＵを使用する。多くは、国際特許出願公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、サッカライドの遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２−４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９−１８を参照されたい）、それに続くカルバメート結合を形成するための担体タンパク質との反応によって形成され得るカルボニルリンカーを伴い得る。この化学反応は、一級ヒドロキシル基を形成するための炭水化物のアノマー末端の還元、それに続くカルバメート中間体を形成するためのＣＤＩと一級ヒドロキシルとの反応、およびタンパク質担体アミノ基へのその後のカップリングからなる。反応は、サッカライド上の他の一級ヒドロキシル基の任意選択の保護／脱保護を必要とし得る。
コンジュゲーションに続いて、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、限外ろ過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層ろ過を含めた当業者に既知の任意の技術の１つまたは複数によって、過剰のコンジュゲーション試薬ならびに残留遊離タンパク質および遊離ポリサッカライドを除去するために精製される。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号を参照されたい。
個々の複合糖質が精製された後、それらは、本発明の免疫原性組成物を製剤化するために配合される。これらの肺炎球菌コンジュゲート体は、別々の方法によって調製され、単回投与製剤にバルク製剤化される。
医薬／ワクチン組成物
本発明は、薬学的に許容される担体およびアジュバントを有する上記のポリサッカライド血清型組合せのいずれかを含む、本質的にそれからなる、または代わりにそれからなる、医薬、免疫原性、およびワクチン組成物を含めた組成物をさらに提供する。一実施形態では、組成物は、２〜１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４の異なるポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体を含む、それからなる、または代わりにそれからなり、ここで、ここで、コンジュゲート体のそれぞれは、第１の担体タンパク質または第２の担体タンパク質にコンジュゲートされた異なる莢膜ポリサッカライドを含有し、ここで、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８の少なくとも１つからの莢膜ポリサッカライドは、ＣＲＭ１９７から選択される第１の担体タンパク質にコンジュゲートしており、薬学的に許容される担体およびアジュバントと共に、第２の担体タンパク質（第１の担体タンパク質とは少なくとも１つのアミノ酸が異なる）にコンジュゲートされた血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８から選択される追加のストレプトコッカス・ニューモニエ血清型を有していてもよい。
本発明のポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の製剤は、当技術分野において認識されている方法を使用して達成され得る。例えば、１５の個々の肺炎球菌コンジュゲート体を生理学的に許容されるビヒクルと共に製剤化して、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例は、水、緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液を含むが、これらに限定されない。
別の実施形態では、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを有するＬ−ヒスチジン緩衝液中で製剤化される。
本明細書で定義される場合、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与された場合、例えば、ないかまたは弱い抗体価または細胞媒介免疫応答を誘導する免疫原性が弱い抗原に対する免疫応答を増強し、抗原に対する抗体価を高め、かつ／または個人の免疫反応を達成するのに効果的な抗原の用量を下げ得る。したがって、アジュバントは、しばしば免疫応答をブーストするために与えられ、当業者によく知られている。組成物の有効性を増強するための適切なアジュバントは、
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）、
（２）例えば、（ａ）Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを使用したサブミクロン粒子に製剤化された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有していてもよい）を含むＭＦ５９（国際特許出願公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）サブミクロンのエマルションにマイクロ流動化されるか、またはより大きな粒子サイズのエマルションを産出するためにボルテックスされた、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号に記載された３−Ｏ−脱アシル化モノリン脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、および（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡなどの水中油型エマルション製剤（ムラミルペプチド（以下に定義される）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤の有無にかかわらず）、
（３）Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）などのサポニンアジュバント（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号を参照されたい）が使用され得るか、またはＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質、および両親媒性タンパク質の組合せにより形成される免疫刺激複合体）およびＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが、タンパク質は有さない）などのそこから産出される粒子、
（４）細菌性リポポリサッカライド、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されているアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）などの合成脂質Ａ類縁体、またはその誘導体または類縁体；そのようなＡＧＰの１つは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは、５２９としても知られており（以前はＲＣ５２９として知られていた）、水性形態または安定なエマルションとして製剤化される、
（５）（１つまたは複数の）ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）、
（６）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）などのサイトカイン、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２など、および
（７）補体成分Ｃ３ｄの三量体などの補体
を含むが、これらに限定されない。
別の実施形態では、アジュバントは、上記のアジュバントの２、３またはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１も含有する水中油型エマルション）である。
ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含むが、これらに限定されない。
ある実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンとすることができる。アルミニウム塩アジュバントは、当技術分野においてよく知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９−４９３）に記載されている。アルミニウム塩は、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ（登録商標）、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、非晶質アルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムを含むが、これらに限定されない。
ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを１：１の体積比でブレンドして、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることによって製造される。ブレンディングプロセスの後、材料を高剪断ミキサーでサイズ減少させて、単分散粒径分布を達成する。次いで生成物を生理食塩水に対してダイアフィルターし、蒸気滅菌する。
ある実施形態では、市販のＡｌ（ＯＨ）３（例えば、Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）またはＳｕｐｅｒｆｏｓ）が５０〜２００ｇタンパク質／ｍｇ水酸化アルミニウムの比でタンパク質を吸着するために使用される。タンパク質の吸着は、別の実施形態では、タンパク質のｐＩ（等電点ｐＨ）および培地のｐＨに依存する。より低いｐＩを有するタンパク質は、より高いｐＩを有するタンパク質よりも強く正電荷を帯びたアルミニウムイオンに吸着する。アルミニウム塩は、２〜３週間にわたってゆっくりと放出されるＡｇの貯蔵所を確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、かつ／または（おそらく尿酸の刺激を通して）自然免疫機構を刺激し得る。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照されたい。
一価バルク水性コンジュゲート体は、典型的に一緒にブレンドされ、希釈される。一旦希釈されたら、バッチが滅菌ろ過される。リン酸アルミニウムアジュバントが、８μｇ／ｍＬを目標とするように希釈される６Ｂを除く全ての血清型について４μｇ／ｍＬの最終濃度、および２５０μｇ／ｍＬの最終アルミニウム濃度を目標とするように無菌的に添加される。アジュバント配合製剤化バッチがバイアルまたはシリンジに充填されることになる。
ある実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。別の実施形態では、アジュバントは、ＯＤＮ １８２６であり、これは、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから取得され得る。
「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」、および類似の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含有する長さ６〜５０ヌクレオチドのヌクレオチド分子を表す。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４２９７を参照されたい。別の実施形態では、この用語の任意の他の技術的に受け入れられる定義が意図されている。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、任意の合成ヌクレオシド間結合、修飾塩基および／または修飾糖を使用した修飾オリゴヌクレオチドを含む。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、Ｓｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４−９３、Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９−５８、およびＹａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：８９−１１０に記載されている。
投与／投与量
本発明の組成物および製剤は、全身経路または粘膜経路を介してワクチンを投与することによって、感染症、例えば肺炎球菌感染症にかかりやすいヒトを保護または治療するために使用することができる。一実施形態では、本発明は、免疫学的に有効量の本発明の免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜ポリサッカライドコンジュゲート体に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、免疫学的に有効量の本発明の免疫原性組成物をヒトに投与するステップを含む、肺炎球菌感染症に対してヒトにワクチン接種する方法を提供する。
特定のワクチンに関する成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確かめることができる。例えば、別の実施形態では、ヒトワクチン接種に関する投与量は、動物実験からヒトデータへの外挿によって決定される。別の実施形態では、投与量は、経験的に決定される。実施例において提供される子アカゲザル動物データは、ワクチンが免疫原性であることを実証する。
本発明の組成物の「有効量」は、その後の負荷の間に、微生物、例えばストレプトコッカス・ニューモニエの感染性の可能性または重症度を著しく減少させる抗体を誘発するのに必要な用量を表す。
本発明の方法は、侵襲性感染症（髄膜炎、肺炎、および菌血症）と非侵襲性感染症（急性中耳炎、および副鼻腔炎）の両方を含めた、微生物、例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエによって引き起こされる原発臨床症候群の予防および／または軽減のために使用され得る。
本発明の組成物の投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介した、または口腔／消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与を介した注射の１つまたは複数を含み得る。一実施形態では、鼻腔内投与は、肺炎または中耳炎の治療のために使用される（肺炎球菌の鼻咽頭保菌がより効果的に予防され得るので、その最も初期の段階で感染を減弱する）。
各ワクチン用量中のコンジュゲート体の量は、著しい有害作用なく免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は、肺炎球菌血清型に依存して変動し得る。一般的に、ポリサッカライドベースのコンジュゲート体に関して、各用量は、０．１〜１００μｇ、特に０．１〜１０μｇ、とりわけ１〜５μｇの各ポリサッカライドを含むことになる。例えば、各用量は、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、または７５０μｇまたは１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｇを含み得る。
特定のワクチンに関する成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確かめることができる。例えば、別の実施形態では、ヒトワクチン接種に関する投与量は、動物実験からヒトデータへの外挿によって決定される。別の実施形態では、投与量は、経験的に決定される。
一実施形態では、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００、または７００μｇ、または１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ以上である。さらに別の実施形態では、上記のアルミニウム塩の用量は、組換えタンパク質の１μｇあたりである。
本発明の特定の実施形態では、ＰＣＶ１５ワクチンは、個々にＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの肺炎球菌莢膜ポリサッカライドの無菌液体製剤である。一態様では、各用量は、８μｇ／ｍＬまたは１６μｇ／ｍＬの６Ｂを除き、４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬの各サッカライド、および約６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７担体タンパク質を含有するように製剤化される。一態様では、各０．５ｍＬ用量は、４μｇの６Ｂを除き、２μｇの各サッカライド、約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質（例えば、３２μｇ±５μｇ、±３μｇ、±２μｇ、または±１μｇ）、０．１２５ｍｇの元素アルミニウム（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント、塩化ナトリウム、およびＬ−ヒスチジン緩衝液を含むように製剤化される。塩化ナトリウム濃度は、約１５０ｍＭ（例えば、１５０ｍＭ±２５ｍＭ、±２０ｍＭ、±１５ｍＭ、±１０ｍＭ、または±５ｍＭ）であり、約２０ｍＭ（例えば、２０ｍＭ±５ｍＭ、±２．５ｍＭ、±２ｍＭ、±１ｍＭ、または±０．５ｍＭ）のＬ−ヒスチジン緩衝液である。
本発明の方法のいずれかによれば、一実施形態では、対象は、ヒトである。ある実施形態では、ヒト対象は、乳児（１歳未満）、トドラー（約１２〜２４ヶ月）、または幼児（約２〜５歳）である。他の実施形態では、ヒト対象は、高齢患者（＞６５歳）である。本発明の組成物は、年長児、青年および成人（例えば、１８〜４５歳または１８〜６５歳）での使用にも適している。
本発明の方法の一実施形態では、本発明の組成物は、単回接種として投与される。別の実施形態では、ワクチンは、十分に間隔をあけて、２回、３回または４回以上投与される。例えば、組成物は、１、２、３、４、５、または６ヶ月の間隔、またはその任意の組合せで投与され得る。免疫化スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に指定されたものに従い得る。例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエによって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児およびトドラーに関する通例のスケジュールは、２、４、６および１２〜１５月齢である。したがって、別の実施形態では、組成物は、２、４、６、および１２〜１５ヶ月齢での４用量シリーズとして投与される。
本発明の組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエからの１つまたは複数のタンパク質も含み得る。包含に適したストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質の例は、国際特許出願公開第０２／０８３８５５号および国際公開第０２／０５３７６１号において同定されているものを含む。
製剤
本発明の組成物は、非経口的に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮膚内に、鼻腔内に、皮下に、腹腔内になどの当業者に既知の１つまたは複数の方法によって対象に投与され、それに従って製剤化され得る。
一実施形態では、本発明の組成物は、液体調製物の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射、または呼吸器内粘膜注射を介して投与される。注射用の液体製剤は、溶液などを含む。
本発明の組成物は、単回用量バイアル、複数回用量バイアルとして、またはプレフィルドシリンジとして製剤化され得る。
別の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与され、したがって経口投与に適した形態で、すなわち固体または液体調製物として製剤化される。固体経口製剤は、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などを含む。液体経口製剤は、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、油剤などを含む。
液体製剤に関する薬学的に許容される担体は、水溶液または非水溶液、懸濁液、エマルションまたは油である。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒質を含めた、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション、または懸濁液を含む。油の例は、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、他の魚油、または乳もしくは卵からの脂質である。
医薬組成物は、等張性、低張性または高張性とすることができる。しかしながら、注入または注射のための医薬組成物は、それが投与される場合に本質的に等張性であることがしばしば好ましい。したがって、保存のために、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性とすることができる。医薬組成物が保存のために高張性である場合、それは、投与前に等張液になるように希釈され得る。
等張剤は、塩などのイオン性等張剤または炭水化物などの非イオン性等張剤とすることができる。イオン性等張剤の例は、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２を含むが、これらに限定されない。非イオン性等張剤の例は、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含むが、これらに限定されない。
少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤が緩衝剤であることもまた好ましい。いくつかの目的のために、例えば、医薬組成物が注入または注射用である場合、組成物が緩衝剤を含むことがしばしば望ましく、この緩衝剤は、溶液を５〜９、例えば、６〜８などの４〜１０の範囲のｐＨに緩衝することができる。
緩衝剤は、例えば、トリス、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、およびトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択され得る。
緩衝剤は、例えば、特に、医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためのＵＳＰ適合緩衝剤からさらに選択され得る。例えば、緩衝剤は、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン、および乳酸などの一塩基酸、アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸などの二塩基酸、クエン酸およびリン酸などの多塩基酸、アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、およびトリスなどの塩基からなる群から選択され得る。
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液および不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補液、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補液などを含む。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加の有無にかかわらず、水および油などの無菌液である。一般に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、ポリソルベート８０（ＰＳ−８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）、およびポロクサマー１８８（Ｐ１８８）は、特に注射液に好ましい液体担体である。油の例は、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、他の魚油、または乳もしくは卵からの脂質である。
本発明の製剤は、界面活性剤も含有し得る。好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（通常Ｔｗｅｅｎと称される）、特にＰＳ−２０およびＰＳ−８０；直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどのＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名の下で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；オクトキシノール、これは、繰返しエトキシ（オキシ−１、２−エタンジイル）基の数が変動し得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはトリオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）などのラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル；ならびに三オレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）およびモノラウリン酸ソルビタンなどのソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られている）を含むが、これらに限定されない。
界面活性剤の混合物、例えば、ＰＳ−８０／スパン８５混合物が使用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ−８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などのオクトキシノールとの組合せも適している。別の有用な組合せは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
界面活性剤の好ましい量は、以下の通りである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＰＳ−８０など）０．０１〜１ｗ／ｖ％、特に、約０．１ｗ／ｖ％、オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他のディタージェントなど）０．００１〜０．１ｗ／ｖ％、特に０．００５〜０．０２ｗ／ｖ％、ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１〜１０ｗ／ｖ％、特に０．１〜１ｗ／ｖ％または約０．５ｗ／ｖ％。
ある実施形態では、組成物は、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）と共にｐＨ５．８のＬ−ヒスチジン（２０ｍＭ）、食塩水（１５０ｍＭ）および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０から本質的になる。ＰＳ−２０は、模擬製造中および一次包装を使用した輸送における凝集を制御する製剤中にＰＳ−２０が存在する場合、０．００５〜０．３ｗ／ｖ％にわたり得る。プロセスは、Ｌ−リスチジン、塩化ナトリウム、およびＰＳ−２０中の最大４４の血清型のブレンドを組み合わせること、次いでこのブレンドされた材料を抗菌性保存剤の有無にかかわらずＡＰＡおよび塩化ナトリウムと組み合わせることからなる。
本明細書で実証されているように、界面活性剤の選択は、異なる薬物製品および原体に関して最適化される必要があり得る。１５以上の血清型を含有する多価ワクチンに関して、ＰＳ−２０およびＰ１８８が好ましい。コンジュゲート体を調製するために使用される化学的性質の選択は、製剤の安定化に影響を与える重要な要因であると考えられている。特に、以下に例示されるように、水性またはＤＭＳＯ溶媒中で調製され、多価組成物中で組み合わされた肺炎球菌ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、製剤に使用される特定の界面活性剤系に依存して安定性において著しい差を示す。記載したように、特に１つまたは複数のポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体がＤＭＳＯなどの非プロトン溶媒中で調製された場合、ポリソルベート２０単独またはポリオールと組み合わせたポロクサマー１８８で改善された安定性が観察された。
本発明は、その一部は水性条件下で調製され、その他はＤＭＳＯ条件下で調製された還元的アミノ化を使用して調製されたポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体を含有する製剤におけるポリソルベート２０またはポロクサマー１８８とポリオールの組合せの使用が、免疫原性組成物の製造および輸送ストレス誘発物理化学的不安定性の制御を助け、他の界面活性剤や安定剤よりも予想外に優れた特性を提供するという発見に部分的に基づく。特定のディタージェントがどのようにバイオ治療薬を保護するかの正確な機構は、よくわかっておらず、先験的に予測され得ない。可能な安定化機構は、優先的水和、優先的排除、バイオ治療薬と表面間の空気／液体界面の競合、表面張力、および／または凝集の種として働く疎水性パッチをマスクするためのバイオ治療薬とのディタージェントの直接会合を含む。本発明は、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体を含む免疫原性組成物の安定性を改善し、微粒子形成（例えば、凝集、沈殿）を抑制するための当技術分野における継続的な必要性に取り組む。本発明の製剤は、ポロクサマー１８８およびポリソルベート８０を含めた以前に使用されていた界面活性剤に対して、複雑なバイオ治療薬の製造、輸送およびハンドリング誘発凝集を制御するのに著しい利点を提供すると考えられている。
ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体中のタンパク質成分が凝集に重要な役割を果たすと考えられている。これは、同じ血清型組成であるが異なるコンジュゲーション溶媒のコンジュゲート体を使用した薬物製品の異なる凝集現象において実証されている。ポリサッカライドコンジュゲート体の調製に使用される非プロトン溶媒は、タンパク質の構造を変え、ＡＰＡアジュバントの存在下で凝集する異なる傾向を示し得る。２つ以上の担体タンパク質が使用される場合、重量パーセンテージが計算され得る。
したがって、本発明のある実施形態では、本発明は、（ｉ）１つまたは複数のポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体と、（ｉｉ）５．０〜７．５の範囲のｐＨを有するｐＨ緩衝食塩水と、（ｉｉ）アルミニウム塩と、（ｉｖ）ａ）ポリソルベート２０および（ｂ）１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａの範囲の分子量を有するポロクサマーならびにプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール４００から選択されるポリオールから選択される界面活性剤系とを含む製剤を提供する。本実施形態のある態様では、１つまたは複数のポリサッカライドタンパク質コンジュゲート体は、ＤＭＳＯなどの非プロトン溶媒中で調製される。タンパク質の全質量の約１０〜１００％、２４％〜１００％、または２４〜８０％の範囲がＤＭＳＯなどの非プロトン溶媒中で調製され、コンジュゲートされ得る。
ある実施形態では、界面活性剤系は、一般にＴｗｅｅｎ（登録商標）２０と称される市販の界面活性剤であるポリソルベート２０（ＩＵＰＡＣ名：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート；ＰＳ−２０）を含む。ある実施形態では、本発明の製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、０．００１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％、０．０２５ｗ／ｖ％〜２．５ｗ／ｖ％、または０．０２５ｗ／ｖ％〜０．３ｗ／ｖ％の範囲にある。ポリソルベート２０を含む界面活性剤系は、ポリオールをさらに含み得る。ポリオールは、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールから選択され得る。ある態様では、ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールは、６ｗ／ｖ％〜２０ｗ／ｖ％の最終濃度である。ある態様では、ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール４００である。
ある実施形態では、界面活性剤系は、１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａの範囲の分子量を有するポロクサマーと、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール４００から選択されるポリオールとを含む。
ポロクサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接したポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロクサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）としても知られている。ポリマーブロックの長さは、カスタマイズされ得るので、わずかに異なる特性を有する多くの異なるポロクサマーが存在する。総称「ポロクサマー」に関して、これらのコポリマーは、一般に文字「Ｐ」（ポロクサマーに関する）の後に３桁の数字が続く名前が付けられ、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を示し、最後の桁×１０は、ポリオキシエチレン含有率を示す（例えば、Ｐ４０７＝４，０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および７０％ポリオキシエチレン含有量を有するポロクサマー）。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の商品名に関して、これらのコポリマーの符号化は、室温でのその物理的形態を定義するための文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、その後２または３桁が続く。数値表示の最初の桁（３桁の数字の２桁）に３００を掛けたものは、疎水性物質のおおよその分子量を示し、最後の桁×１０は、ポリオキシエチレン含有率を示す（例えば、Ｌ６１＝１，８００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および１０％ポリオキシエチレン含有量を有するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））。米国特許第３，７４０，４２１号を参照されたい。
ポロクサマーの例は、以下の一般式を有する：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ、式中、ａブロックおよびｂブロックは、以下の値を有する。
Figure 2020509002
本明細書で使用される場合、分子量単位は、ダルトン（Ｄａ）またはｇ／ｍｏｌである。
製剤に関して、ポロクサマーは、１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａ、７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａ、または７，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲の分子量を一般に有する。ポロクサマーは、ポロクサマー１８８またはポロクサマー４０７から選択され得る。本発明の製剤中のポロクサマーの最終濃度は、０．００１〜５ｗ／ｖ％、または０．０２５〜１ｗ／ｖ％である。ポロクサマーを含む界面活性剤系は、さらにポリオールを含まなければならない。ある態様では、ポリオールは、プロピレングリコールであり、１〜２０ｗ／ｖ％の最終濃度である。ある態様では、ポリオールは、ポリエチレングリコール４００であり、１〜２０ｗ／ｖ％の最終濃度である。
製剤に適したポリオールは、高分子ポリオール、特に、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを含むが、これらに限定されないポリエーテルジオールである。プロピレングリコールは、約４２５から約２７００の単量体の分子量の範囲で入手可能である。ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルも、約２００〜約３５０００にわたる分子量の範囲で入手可能であり、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧＭＭＥ５５０、ＰＥＧＭＭＥ６００、ＰＥＧＭＭＥ２０００、ＰＥＧＭＭＥ３３５０、およびＰＥＧＭＭＥ４０００を含むが、これらに限定されない。別のポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール４００である。本発明の製剤中のポリオールの最終濃度は、１〜２０ｗ／ｖ％または６〜２０ｗ／ｖ％とすることができる。
製剤は、ｐＨ緩衝食塩水も含有する。緩衝剤は、例えば、トリス、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、およびトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択され得る。緩衝剤は、４〜１０、５．２〜７．５、または５．８〜７．０の範囲のｐＨに溶液を緩衝することができる。本発明のある態様では、緩衝剤は、リン酸塩、コハク酸塩、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩、またはクエン酸塩からなる群から選択される。緩衝剤は、例えば、特に、医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためのＵＳＰ適合緩衝剤からさらに選択され得る。緩衝剤の濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭまたは５ｍＭ〜５０ｍＭにわたることになる。ある態様では、緩衝剤は、５ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度のＬ−ヒスチジン、または１ｍＭ〜１０ｍＭの最終濃度のコハク酸塩である。ある態様では、Ｌ−ヒスチジンは、２０ｍＭ±２ｍＭの最終濃度である。
食塩水（すなわち、ＮａＣｌを含有する溶液）が好ましいが、製剤に適した他の塩は、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２、ならびにその組合せを含むが、これらに限定されない。スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含むが、これらに限定されない非イオン性等張剤が塩の代わりに使用され得る。適した塩の範囲は、２５ｍＭ〜５００ｍＭまたは４０ｍＭ〜１７０ｍＭを含むが、これらに限定されない。一態様では、食塩水は、ＮａＣｌであり、２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在してもよい。
好ましい実施形態では、製剤は、塩化ナトリウムを有するＬ−ヒスチジン緩衝液を含む。
本明細書に記載の製剤のある実施形態では、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、担体タンパク質にコンジュゲートされた１つまたは複数の肺炎球菌ポリサッカライドを含む。担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、エシェリキア・コリＬＴ、エシェリキア・コリＳＴ、シュードモナス・エルジノーサからの外毒素Ａ、およびその組合せから選択され得る。ある態様では、１つまたは複数のポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、ＤＴＦＢにコンジュゲートされている。一態様では、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の全ては、水性化学反応を使用して調製される。例として、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート製剤は、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆからのストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドから本質的になる１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤とすることができる。別の態様では、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の１つまたは複数は、ＤＭＳＯ化学反応を使用して調製される。例として、ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート製剤は、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体がＤＭＳＯ化学反応を使用して調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体が水性化学反応を使用して調製される１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤とすることができる。
別の実施形態では、医薬組成物は、徐放系で送達される。例えば、薬剤は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を使用して投与され得る。別の実施形態では、例えば、ミクロスフェア中または移植片における高分子材料が使用される。
本発明の組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエからの１つまたは複数のタンパク質も含み得る。包含に適したストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質の例は、国際特許出願公開第０２／０８３８５５号および国際公開第０２／０５３７６１号において同定されているものを含む。
添付の説明および図面を参照して本発明の様々な実施形態を説明したが、本発明は、それらの正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更および修正がそこに行われ得ることを理解されたい。
以下の実施例は、本発明を例証するが、限定するものではない。
［実施例］
実施例１:ＤＴＦＢ担体タンパク質の調製
ＤＴＦＢ調製のためのマルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィーの使用
以前記載されたように（国際特許出願公開第２０１２／１７３８７６Ａ１号を参照されたい）シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）における発現により得られた精製されたＣＲＭ１９７を５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中で約２２℃で約１時間、１：５００のモル比のチロシン対ＣＲＭ１９７を使用して組換えトリプシンで消化した。次いで、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８中のジチオトリトール（ＤＴＴ）を約２２℃で３０分間５ｍＭの最終濃度まで添加して、タンパク分解性に切断されたＣＲＭ１９７のＡおよびＢフラグメント間のジスルフィド結合を還元した。
次いで、消化反応物を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８で平衡化したマルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを５０ｍＭのトリス、ｐＨ８で洗浄し、ＤＴＦＢ生成物を５０ｍＭのトリス、ｐＨ８中の０．４５Ｍ〜０．６５Ｍの塩化ナトリウムの勾配で溶出した。生成物を、５ｋＤａの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）接線流限外ろ過膜を使用して、濃縮し、１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８に対してダイアフィルターした。ＤＴＦＢ生成物を含有するリテンテートを０．２ミクロンろ過し、２〜８℃で保存した。生成物濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって決定し、純度を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
結果は、マルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィー溶離剤が少量の二量体を有し、単量体として主に存在する比較的純粋なＤＴＦＢを含有したことを示している。図１Ａを参照されたい。二量体形成は、ＤＴＦＢ単量体間のジスルフィド結合形成に起因した。以下の節に例示されるように、ＤＴＴは、二量体形成の可能性を最小限にするためにクロマトグラフィーおよび限外ろ過ステップにおいて使用されてきた。
ＤＴＦＢ調製のためのマルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーの使用
ＤＴＦＢ二量体の存在のために、代替の精製方法を調査した。上記のようにシュードモナス・フルオレセンスでの発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を３００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５を使用して約１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈した。トリプシンを約１：３２５０のトリプシン対ＣＲＭ１９７モル比を使用してタンパク質溶液に添加した。溶液を室温で約２０時間インキュベートした。次いで、３００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５中のＤＴＴを１０ｍＭのＤＴＴの最終濃度まで添加して、タンパク分解性に切断されたＣＲＭ１９７間のジスルフィド結合を還元し、ＡフラグメントとＢフラグメントとを分離した。
約７５分後、還元タンパク質溶液をマルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを、タンパク質溶液をロードする前に、３００ｍＭのトリス、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５で２〜８℃で平衡化した。ローディング後、カラムを２００ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのＤＴＴを含有する３００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５で２〜８℃で洗浄し、次いで生成物を３００ｍＭのトリス、ｐＨ８．５中の１Ｍの塩化ナトリウムで２〜８℃で溶出した。約０．００２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を５ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して２〜８℃で濃縮する前に、バッチに添加した。濃縮後、追加のＰＳ−２０を０．０２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０の濃度までバッチに添加し、バッチを１００ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８に対してダイアフィルターした。バッチを、５ｋＤａ膜を用いた接線流ろ過を使用してさらに濃縮した。最終リテンテートを０．２ミクロンろ過し、コンジュゲーション前に凍結または２〜８℃で保存した。
ＤＴＦＢ試料を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１Ｂおよび１Ｃ）。ゲルの濃度分析は、０．２ミクロンろ過後の最終バルク中間体（ＦＢＩ）が＞９８％の純度を有することを示す。
図１Ｃに示される最終バルク中間体（ＦＢＩ）を質量分析を用いた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）によって分析して、無傷のタンパク質質量を測定した。ＬＣ−ＭＳ分析をＤＴＴでの還元後の試料について行った。メインピークからの生データのデコンボリューションは、３７，１９４．２Ｄａの測定質量をもたらした。この質量測定は、ＤＴＦＢに関する３７，１９４．４Ｄａの理論的質量と一致し、予想されるアミノ酸配列を確認した。
ペプチドマップをトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、およびエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ消化の組合せから得た。試料を６Ｍグアニジン−ＨＣｌの存在下でのヨードアセトアミドでの還元的アルキル化に供し、別々に各酵素で３７℃で約１６〜１７時間、消化した。消化をギ酸の添加によってクエンチした。ペプチドを分離し、ＬＣ−ＭＳによって分析した。別々の消化によって同定されたペプチドの組合せを使用して、アミノ酸配列のカバー度は、約９８％であった。見出されたペプチドは、予測されたＤＴＦＢ配列と一致していた。
ＤＴＦＢ精製のための代替のマルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィープロセス
上記のようにシュードモナス・フルオレセンスにおける発現により得られた精製ＣＲＭ１９７を、３００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５を使用して約５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈した。トリプシンを約１：３０００のトリプシン対ＣＲＭ１９７モル比を使用してタンパク質溶液に添加した。溶液を約２２℃で約１５〜２０時間インキュベートした。次いで、３００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５中のＤＴＴを≧１０ｍＭのＤＴＴの最終濃度まで添加して、タンパク分解性に切断されたＣＲＭ１９７間のジスルフィド結合を還元し、ＡフラグメントとＢフラグメントとを分離した。
還元タンパク質溶液を樹脂１Ｌあたり約２５ｇのタンパク質でマルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを、タンパク質溶液をロードする前に、３００ｍＭのトリス、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５で約２２℃で平衡化した。ローディング後、カラムを２００ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのＤＴＴを含有する３００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５で約２２℃で洗浄し、次いで生成物を３００ｍＭのトリス、ｐＨ８．５中の１Ｍ塩化ナトリウムで２２℃で溶出した。マルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィーからのＤＴＦＢ生成物は、５ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用してダイアフィルターし、濃縮することができ、上記のように０．２ミクロンろ過することができる。
マルチモーダル陽イオン交換プロセスからのＤＴＦＢ試料を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１Ｄ）。ゲルの濃度分析は、マルチモーダル陽イオン交換カラムから溶出したＤＴＦＢタンパク質産物が高度に精製されていることを示す。
限外ろ過中のＤＴＦＢ安定性に及ぼす緩衝液ｐＨ、イオン強度、およびＰＳ−２０界面活性剤濃度の効果
緩衝液ｐＨ、イオン強度およびＰＳ−２０界面活性剤の研究を行って、ＤＴＦＢ限外ろ過ステップの開発中に観察されたタンパク質粒子形成に取り組んだ。ＤＴＦＢを０、２００、または５００ｍＭの塩化ナトリウムを用いてｐＨ７、７．５、またはｐＨ８で１００ｍＭのリン酸カリウムに調整した。示差走査熱量測定を使用して、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の関数としてのＤＴＦＢ溶液の安定性（融解温度、Ｔｍ）を評価した。表１に示すように、ｐＨを７から８に増加させると、ＤＴＦＢ Ｔｍが約３℃上昇した。０〜５００ｍＭの塩化ナトリウムの範囲の塩化ナトリウムは、調査したｐＨ値でＴｍに著しい影響を与えなかった。
Figure 2020509002
別個の研究では、精製ＤＴＦＢを０、１５０、５００、および１０００ｍＭの塩化ナトリウムを用いて１００ｍＭのリン酸カリウム中でｐＨ６．０、ｐＨ７．０、およびｐＨ８．５に調整した。溶液を室温で終夜保持し、次いで遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去した。上清を、ＵＶ２８０吸光度検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質濃度に関してアッセイした（図２）。この研究における上清タンパク質濃度は、０および１５０ｍＭの塩化ナトリウムでの溶液ｐＨによって影響されなかった。しかしながら、より高い塩化ナトリウム濃度（５００および１０００ｍＭ）では、結果は、緩衝液ｐＨがｐＨ７．０または８．５から６．０に低下するにつれて、上清タンパク質濃度の明白な低下を示し、これは、ＤＴＦＢ安定性の低下を示す。
ＤＴＦＢ安定性に及ぼすＰＳ−２０濃度の効果を、５０および１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ８溶液中ならびに５０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８中のＤＴＦＢ溶液に漸増量のＰＳ−２０を添加することによって研究した。溶液を５分間ボルテックスし、次いで遠心分離した。上清を、ＵＶ２８０吸光度検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質濃度に関してアッセイした（図３）。著しいボルテックス誘発タンパク質喪失がＰＳ−２０を含まない試料において観察された。ＤＴＦＢの回収率は、≧０．０１ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有する試料で著しく改善された。
実施例２:ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜ポリサッカライドの調製
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野で既知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：５２を参照されたい。肺炎球菌莢膜ポリサッカライドを調製する方法もまた当該分野で既知である。例えば、欧州特許第０４９７５２４号を参照されたい。肺炎球菌サブタイプの分離株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である。細菌は、血液寒天上でアルファ溶血性である被包性、非運動性、グラム陽性、ランセット型双球菌として同定されている。サブタイプは、特定の抗血清を使用して、クエリング反応に基づいて区別され得る。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照されたい。
興味のあるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型のそれぞれを表す細胞バンクを凍結バイアル中でＭｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）から入手した。融解した種培養物を、ストレプトコッカス・ニューモニエに適切な予め滅菌された増殖培地を含有する種発酵槽に移した。培養物を、温度およびｐＨ制御しながら種発酵槽中で増殖させた。種発酵槽の全容量を、予め滅菌した増殖培地を含む生産発酵槽に移した。作製発酵は、プロセスの最終細胞増殖段階であった。温度、ｐＨ、および撹拌速度を制御した。
発酵プロセスを不活性化剤の添加を通して終結させた。不活性化後、バッチを不活性化タンクに移し、そこで制御された温度および撹拌で保持した。細胞片を遠心分離とろ過の組合せを使用して除去した。バッチを限外ろ過かつダイアフィルターした。次いでバッチを、不純物を除去し、ポリサッカライドを回収する溶媒ベースの分画に供した。
実施例３:水溶液中での還元的アミノ化を使用したＤＴＦＢ担体タンパク質へのポリサッカライドのコンジュゲーション
マウス免疫原性研究のための血清型３−ＤＴＦＢ（ＳＴ３−ＤＴＦＢ）コンジュゲート体の調製
実施例２に記載したように得られた精製血清型３ポリサッカライドを水に溶解した。約２００ｋＤａの平均分子量までのＰｓサイズの減少を、試料を氷中で冷却しながらプローブ超音波処理器を使用して行った。超音波処理した試料を０．２ミクロンろ過し、２〜８℃で保存した。ポリサッカライド溶液を３０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流ろ過膜に対するダイアフィルトレーションによって濃縮した。
ポリサッカライドを、メタ過ヨウ素酸ナトリウム酸化を使用して、コンジュゲーション用に調製した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１１８１−１１８６および米国特許出願公開第２０１１０１９５０８６号を参照されたい）。１００ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を５０ｍＭの酢酸ナトリウム中のポリサッカライド溶液に添加した。試料を、光から保護して１９〜２５℃で１４〜１８時間混合した。エチレングリコール（ポリサッカライド繰返し単位に対して１００：１モル過剰）を添加し、１９〜２５℃でさらに１６〜１８時間混合して、残留メタ過ヨウ素酸ナトリウムをクエンチし、酸化反応を停止した。生じた溶液を１０容量の水に対してダイアフィルターした。酸化ポリサッカライド溶液を−７０℃でアリコートで保存した。
過ヨウ素酸酸化ポリサッカライドを、０．６：１のポリサッカライド対タンパク質質量比で、（マルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して）実施例１に記載したように調製したＤＴＦＢと混合した。リン酸カリウム、ｐＨ６．４および塩化ニッケルを、それぞれ１４５ｍＭおよび２．２ｍＭの最終濃度まで添加した。次いで、約１〜２モル当量までのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応を光から保護し、２〜８℃で１２０時間にわたって行った。
次いで、混合物を、２〜８℃で合計１４〜１８時間、２回交換した２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．４、０．３Ｍの塩化ナトリウムに対して透析した。不溶性物質を短時間の遠心分離によって除去し、コンジュゲート体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって磨いて、遊離ポリサッカライドおよびタンパク質を減少させた。ＳＥＣで磨いたコンジュゲート体を３０ｋＤのＮＭＷＣＯ遠心濃縮機で濃縮した。
子アカゲザル免疫原性研究のための血清型３−ＤＴＦＢ複合体の調製
精製血清型３肺炎球菌莢膜ポリサッカライド粉末を水に溶解し、０．４５ミクロンろ過した。バッチをホモジナイズして、Ｐｓの分子質量を減少させ、０．２２ミクロンろ過した。コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドのサイズ減少は、より特異的で再現性があり管理しやすい物理的性質を有するポリサッカライドを産出するための手段として以前に記載されている（Ｍａｒｂｕｒｇら、１９９７、米国特許第５，６２３，０５７号）。Ｍａｒｂｕｒｇらによって記載されているように、ポリサッカライドサイズ減少は、溶解性およびろ過性を増加させ、かつ多分散性および粘度を減少させ、それによってコンジュゲーション一貫性およびコンジュゲーションの容易さを改善することが知られている。ホモジナイゼーションを使用したストレプトコッカス・ニューモニエからの血清型１９Ｆポリサッカライドのポリサッカライドサイズの減少は、以前に記載されている（Ｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｒｏｇ．２０００，１６，８０−８５）。次いで、サイズ減少ポリサッカライドを濃縮し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して水に対してダイアフィルターした。
次いで、５０ｍＭの酢酸ナトリウムを添加し、ポリサッカライド上に反応性アルデヒドを形成するための１００ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加でポリサッカライド活性化を開始した。バッチを約２２℃で約１２時間インキュベートした。バッチを、≦８℃で１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルターし、生成物に富むリテンテートを濃縮した。
活性化ポリサッカライド溶液を水および１．５Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．０とブレンドした。精製ＤＴＦＢを０．２ミクロンろ過し、次いで、１．３：１のポリサッカライド対タンパク質質量比で緩衝液調整ポリサッカライド溶液と組み合わせた。次いで、溶液を０．２ミクロンろ過した。塩化ニッケルを、１００ｍＭの塩化ニッケルストック溶液を使用して、バッチに最終濃度約２ｍＭまで添加した。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり２モル）を添加した。バッチを約１０℃で約１２０時間反応させて、ポリサッカライドおよびタンパク質の消費を最大にした。
コンジュゲーション反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌのポリサッカライド濃度まで希釈し、２〜８℃に冷却し、１．２ミクロンろ過し、１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、２〜８℃で１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０に対してダイアフィルターした。次いで、リテンテート中で回収されたバッチを約２．０ｇポリサッカライド／Ｌまで希釈し、１．２Ｍの重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．４の添加によりｐＨ調整した。水素化ホウ素ナトリウム（ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり１モル）を添加した。１．５Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ６．０を追って添加した。
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、２〜８℃で１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンに対してダイアフィルターした。リテンテートを０．２ミクロンろ過し、追加の１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンを用いて１．０ｇ／Ｌのポリサッカライド濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、≦−６０℃で凍結した。
実施例４:水溶液中での還元的アミノ化を使用したＣＲＭ１９７への血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆのコンジュゲーション
異なる血清型ポリサッカライドを、共通のプロセスフローを使用して精製ＣＲＭ１９７担体タンパク質に個々にコンジュゲートした。ポリサッカライドを溶解し、サイズを減少させ、化学的に活性化し、限外ろ過により緩衝液交換した。次いで、精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物中のＮｉＣｌ２（２ｍＭ）を利用して活性化ポリサッカライドにコンジュゲートし、生じたコンジュゲート体を最終０．２ミクロンろ過の前に限外ろ過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度、および時間などの各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを以下の節において血清型特異的な値に制御した。
ポリサッカライドサイズ減少および酸化
精製肺炎球菌莢膜ポリサッカライド粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．４５ミクロンろ過した。血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆをホモジナイズして、ポリサッカライドの分子質量を減少させた。血清型１８Ｃを≧９０℃でのホモジナイゼーションまたは酸加水分解のいずれかによってサイズ減少した。血清型１９Ａは、その比較的低い開始サイズのためにサイズが縮小されなかった。ホモジナイゼーション圧力およびホモジナイザーを通過する回数を血清型特異的目標（１５０〜１０００ｂａｒ；４〜７回通過）に制御して、血清型特異的分子質量を達成した。サイズ減少ポリサッカライドを０．２ミクロンろ過し、次いで、濃縮し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して水に対してダイアフィルターした。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を酸加水分解血清型１８Ｃに使用した。
次いで、ポリサッカライド溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液を用いて血清型特異的温度（４〜２２℃）およびｐＨ（４〜５）に調整して、活性化によるポリサッカライドサイズの減少を最小化した。全ての血清型（血清型４を除く）に関して、ポリサッカライド活性化を１００ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり、ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり約０．１〜０．５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムにわたった。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、目標レベルのポリサッカライド活性化を達成するためのものであった（ポリサッカライド繰返し単位１モルあたりのアルデヒドのモル数）。血清型４に関して、メタ過ヨウ素酸ナトリウム添加前に、バッチを約５０℃かつｐＨ４．１でインキュベートして、ポリサッカライドを部分的に脱ケタール化した。
血清型５および７Ｆを除く全ての血清型に関して、活性化生成物を、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルターした。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を酸加水分解血清型１８Ｃに使用した。血清型５および７Ｆを１０ｍＭの酢酸ナトリウムに対してダイアフィルターした。全ての血清型に関する限外ろ過を２〜８℃で行った。
ＣＲＭ１９７へのポリサッカライドコンジュゲーション
酸化ポリサッカライド溶液を血清型に応じて、水および１．５Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ６．０またはｐＨ７．０と混合した。選択された緩衝液ｐＨは、コンジュゲーション反応中の活性化ポリサッカライドの安定性を改善するためのものであった。以前記載されたように（国際特許出願公開第２０１２／１７３８７６Ａ１号を参照されたい）シュードモナス・フルオレセンス中での発現を通して得られた精製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロンろ過し、血清型に応じて０．４〜１．０ｗ／ｗにわたるポリサッカライド対ＣＲＭ１９７質量比で緩衝ポリサッカライド溶液と組み合わせた。質量比を生じたコンジュゲート中のポリサッカライド対ＣＲＭ１９７比を制御するように選択した。ポリサッカライドおよびリン酸濃度は、血清型特異的であり、血清型に応じてそれぞれ３．６〜１０．０ｇ／Ｌおよび１００〜１５０ｍＭにわたった。血清型特異的ポリサッカライド濃度を生じたコンジュゲート体のサイズを制御するように選択した。次いで、溶液を０．２ミクロンろ過した。塩化ニッケルを１００ｍＭの塩化ニッケル溶液を使用して約２ｍＭまで添加した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり２モル）を添加した。コンジュゲーションを血清型特異的な期間（７２〜１２０時間）進行させて、ポリサッカライドおよびタンパク質の消費を最大にした。
酸加水分解血清型１８Ｃを、それぞれ約１２．０ｇ／Ｌおよび約６．０ｇ／Ｌのポリサッカライドおよびタンパク質濃度を使用して、シアノ水素化ホウ素ナトリウムと約ｐＨ８の１００ｍＭのリン酸カリウム中で３７℃でコンジュゲートした。
水素化ホウ素ナトリウムでの還元
コンジュゲーション反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌのポリサッカライド濃度まで希釈し、２〜８℃まで冷却し、１．２ミクロンろ過した。全ての血清型（血清型５を除く）を、１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、２〜８℃で１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０に対してダイアフィルターした。次いで、リテンテート中で回収されたバッチを約２．０ｇポリサッカライド／Ｌまで希釈し、１．２Ｍの重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．４の添加によりｐＨ調整した。水素化ホウ素ナトリウム（ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり１モル）を添加した。１．５Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ６．０を追って添加した。血清型５を、１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、３００ｍＭのリン酸カリウムに対してダイアフィルターした。
最終ろ過および生成物保存
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、４℃で１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンに対してダイアフィルターした。リテンテートバッチを０．２ミクロンろ過した。
血清型１９Ｆを２２℃で約７日間インキュベートし、１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、４℃で１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンに対してダイアフィルターし、０．２ミクロンろ過した。
バッチを追加の１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンを用いて１．０ｇ／Ｌのポリサッカライド濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、≦−６０℃で凍結した。
実施例５:ジメチルスルホキシド中での還元的アミノ化を使用したＣＲＭ１９７への血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆのコンジュゲーションのための方法
異なる血清型ポリサッカライドを、共通のプロセスフローを使用して精製ＣＲＭ１９７担体タンパク質に個々にコンジュゲートした。ポリサッカライドを溶解し、サイズを目標分子質量まで減少させ、化学的に活性化し、限外ろ過により緩衝液交換した。活性化ポリサッカライドおよび精製ＣＲＭ１９７を個々に凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解した。次いで、再溶解したポリサッカライドおよびＣＲＭ１９７溶液を下記のように組み合わせ、コンジュゲートした。生じたコンジュゲートを、最終的な０．２ミクロンろ過の前に、限外ろ過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度、および時間などの各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを以下の節において血清型特異的な値に制御した。
ポリサッカライドサイズ減少および酸化
精製肺炎球菌莢膜ポリサッカライド粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．４５ミクロンろ過した。血清型１８Ｃおよび１９Ａを除く全ての血清型をホモジナイズして、ポリサッカライドの分子質量を減少させた。ホモジナイゼーション圧力およびホモジナイザーを通過する回数を血清型特異的目標（１５０〜１０００ｂａｒ；４〜７回通過）に制御した。血清型１８Ｃを≧９０℃での酸加水分解によってサイズ減少した。血清型１９Ａは、サイズ減少しなかった。
サイズ減少ポリサッカライドを０．２ミクロンろ過し、次いで、濃縮し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して水に対してダイアフィルターした。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を血清型１８Ｃに使用した。
次いで、ポリサッカライド溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液を用いて血清型特異的温度（４〜２２℃）およびｐＨ（４〜５）に調整した。ポリサッカライド活性化をメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり、ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり約０．１〜０．５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムにわたった。
全ての血清型に関して、活性化生成物を、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルターした。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を血清型１８Ｃに使用した。全ての血清型に関する限外ろ過を２〜８℃で行った。
ＣＲＭ１９７へのポリサッカライドコンジュゲーション
以前記載されたように（国際特許出願公開第２０１２／１７３８７６Ａ１号を参照されたい）シュードモナス・フルオレセンス中での発現を通して得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して２ｍＭのリン酸、ｐＨ７緩衝液に対してダイアフィルターし、０．２ミクロンろ過した。
酸化ポリサッカライド溶液を凍結乾燥に備えて水およびスクロースと製剤化した。タンパク質溶液を凍結乾燥に備えて水、リン酸緩衝液、およびスクロースと製剤化した。スクロース濃度は、１〜５％にわたり、凍結乾燥後にＤＭＳＯ中で最適な再溶解を達成した。
製剤化ポリサッカライドおよびＣＲＭ１９７溶液を個々に凍結乾燥した。凍結乾燥ポリサッカライドおよびＣＲＭ１９７材料をＤＭＳＯに再溶解し、ティーミキサーを使用して混合した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり１モル）を添加し、コンジュゲーションを血清型特異的な期間（１〜４８時間）進行させて、目標のコンジュゲートサイズを達成した。
水素化ホウ素ナトリウムでの還元
水素化ホウ素ナトリウム（ポリサッカライド繰返し単位１モルあたり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加した。バッチを約４℃で１５０ｍＭの塩化ナトリウム中に希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加して、ｐＨを中和した。次いで、バッチを濃縮し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、１５０ｍＭの塩化ナトリウムに対して約４℃でダイアフィルターした。
最終ろ過および生成物保存
次いで、各バッチを濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、４℃で１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンに対してダイアフィルターした。リテンテートバッチを０．２ミクロンろ過した。
血清型１９Ｆを約５日間インキュベートし、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外ろ過膜を使用して、約４℃で１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンに対してダイアフィルターし、０．２ミクロンろ過した。
バッチを追加の１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の１０ｍＭのＬ−ヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、≦−６０℃で凍結した。
実施例６:ＳＴ３−ＤＴＦＢ一価コンジュゲート製剤を使用したマウス免疫原性研究
ＳＴ３−ＣＲＭ１９７と比較したＳＴ３−ＤＴＦＢの免疫原性をマウスモデルにおいて評価した。マウスに投与するためのアジュバント製剤を、１００μＬあたり０．０８μｇのポリサッカライドと５μｇのアルミニウムの用量に関して、２４μＬの滅菌ろ過したコンジュゲート体（食塩水中１：１０−１ｍＬあたり０．１２５８ｍｇのＤＴＦＢまたはＣＲＭ１９７コンジュゲートポリサッカライド）と６２μＬのＡＰＡ、および３．６６４ｍＬの滅菌食塩水を混合することによって調製した。製剤化されたワクチンを２〜８℃で個々のホウケイ酸栓付きバイアル中に保存して、個々の免疫化を支持した。
ＳＴ３−ＤＴＦＢを６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて評価した（ｎ＝１０／群）。マウスを実施例３および４に記載したように調製した独自のＳＴ３−ＤＴＦＢおよびＳＴ３−ＣＲＭ１９７コンジュゲート調製物を使用して作製したＳＴ３−ＤＴＦＢ／ＡＰＡおよび２つのＳＴ３−ＣＲＭ１９７／ＡＰＡロットで免疫化した。ＳＴ３ ＰｎＰｓ濃度は、０、１４および２８日目に腹腔内投与された、５μｇのＡＰＡを有する０．１ｍｌ容量中の１用量あたり０．０８μｇであった。血清を研究開始前（プレ）および３９日目、用量後３（ＰＤ３）に収集し、ＳＴ３ ＷＨＯ ＥＬＩＳＡ［標準化された世界保健機関（ＷＨＯ）プロトコルに従って］およびタンパク質担体ＥＬＩＳＡ（ＣＲＭ１９７およびＤＴＦＢ）において試験した。マウスに４９日目にストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３（２０７ＣＦＵ／０．５ｍｌ）を腹腔内投与した。
ＷＨＯ ＥＬＩＳＡ結果（図４）は、ＳＴ３−ＤＴＦＢ／ＡＰＡとＳＴ３−ＣＲＭ１９７／ＡＰＡの両方で免疫したマウスが同様のＰＤ３ ＰｎＰｓ ３力価を有したことを示した。ＳＴ３−ＤＴＦＢ／ＡＰＡおよびＳＴ３−ＣＲＭ１９７／ＡＰＡで免疫したマウスは、血清型３負荷に対して≧９０％の保護を有し、これは、陰性対照食塩水およびＡＰＡ免疫マウスと比較して著しく高かった（図５）。
実施例７:異なる界面活性剤および安定剤を有する１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤
上記のように調製した肺炎球菌ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体を、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆを有する１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１５）の製剤に使用した。製剤を、水溶液中（実施例４）またはＤＭＳＯ中（実施例５）の還元的アミノ化によって産出された肺炎球菌ポリサッカライド−ＣＲＭ１９７コンジュゲート体を使用して調製した。ＳＴ３−ＤＴＦＢコンジュゲート体を実施例３に従って調製した。個々の血清型の目標最終濃度を得るのに必要なバルクコンジュゲート体の必要用量をバッチ容量およびバルクポリサッカライド濃度に基づいて計算した。１５のコンジュゲート体を、ＰＳ−２０、ＰＳ−８０、またはＰ１８８と共に塩化ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ５．８緩衝液から選択される賦形剤と組み合わせた。
無菌製剤化バルクを、プロピレングリコール（ＰＧ）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を有するまたは有さないバルクリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）とのそのブレンド中およびブレンド後に穏やかに混合した。２つの濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡを様々な製剤において研究した。１つは、８μｇ／ｍＬの血清型６Ｂポリサッカライドを含有し、他の全ての血清型に関して４μｇ／ｍＬのポリサッカライド、および２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡを含有した。もう１つは、１６μｇ／ｍＬの血清型６Ｂポリサッカライド、他の全ての血清型に関して８μｇ／ｍＬのポリサッカライド、および５００μｇ／ｍＬのＡＰＡを含有した。製剤化されたワクチンを２〜８℃で保存した。
実施例８:水溶液中での還元的アミノ化によって産出されたコンジュゲート体を含有する肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤の安定性に及ぼす賦形剤の影響
実施例７に記載したように調製した１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１５）の安定性を撹拌、再循環および回転撹拌研究の後に様々な賦形剤条件に関して評価して、起こり得る製造および輸送のストレスを模擬実験した。ＰＣＶ１５を、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ならびに実施例７に列挙した２つの濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡのいずれか一方を用いて調製した。結果は、異なる濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡでの２つの製剤間で非常に類似していたので、より低い濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡを含有するＰＣＶ１５製剤に関する結果のみを本実施例において示した。撹拌研究に関して、ＰＣＶ１５製剤をガラス容器中で電磁撹拌子を使用して混合した。再循環および剪断試験に関して、ＰＣＶ１５製剤をチューブループ内で再循環させた。回転試験に関して、実施例７および表２に概説したようにＰＣＶ１５ベース製剤（Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、および塩化ナトリウム）を調製し、界面活性剤または安定剤を添加した。撹拌研究を、４℃で最大２４時間の回転側面撹拌を使用して設計した。目視評価を使用して、製剤を評価した。容器を通過する光線の経路は、微粒子の検出を可能にした。さらに、粒径分布に及ぼす製造および輸送およびハンドリングストレスの影響を静的光散乱（ＳＬＳ）を使用して評価した。懸濁液ベースの薬物製品の静的光散乱は、粒径分布によって示されるように、凝集のより高感度の検出を可能にする。ＰＣＶ１５薬物製品の単分散（単峰性）粒径分布は、非凝集薬物製品を示している。しかしながら、多分散多峰性粒径分布は、凝集を示している。
撹拌研究におけるＰＣＶ１５の安定性
実施例４に記載したように、水性条件下での還元的アミノ化を使用してＣＲＭ１９７（ＰＣＶ１５Ａｑと称される）にコンジュゲートした肺炎球菌ポリサッカライド原体を利用するＰＣＶ１５製剤を、上記の実験室規模の混合実験装置（ビーカーおよび電磁撹拌子）を使用してスクリーニングした。ＰＣＶ１５Ａｑは、水性条件下での還元的アミノ化を使用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆからのポリサッカライドを含有する。ＡＰＡを有する２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＰＣＶ１５を、ビーカーおよび電磁撹拌子を使用して１００ｍＬの実験室規模のバッチ調製において調製した。界面活性剤の非存在下では、ＰＣＶ１５Ａｑ製剤は、製造（撹拌）誘発損傷を受けやすく、これは、ワクチン薬物製品の均一性を保証するための撹拌中にワクチン薬物製品の凝集をもたらす。
非イオン性トリブロックコポリマーのクラスは、様々な賦形剤のスクリーニング研究中に頑強な安定性を提供することが見出された。ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）を選択して、凝集を制御し、頑強かつ安定なワクチン薬物製品製剤を提供した。ＰＣＶ１５Ａｑ製剤を、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ＡＰＡ、およびＰ１８８なしか、０．０８ｗ／ｖ％のＰ１８８、または０．２４ｗ／ｖ％のＰ１８８のいずれかを用いて調製した。電磁撹拌子を使用した一定撹拌下での時間の影響を静的光散乱を使用して評価した（図６〜７）。粒径分布をＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｓｉｚｅｒ ２０００を使用して評価した。５μｍのＮＩＳＴ粒径標準を実行し、予想される粒径分布を作製した。全ての製剤（ポロクサマー１８８を有するまたは有さない）に関して、ＡＰＡへのコンジュゲート体の添加後に単分散ヒストグラムプロファイルが観察された（Ｔ＝０時間撹拌）。わずか７時間（Ｔ＝７時間撹拌）の連続混合で、Ｐ１８８を有さない製剤は、増大した粒径分布および凝集の出現をもたらした（図６）。しかしながら、いずれかの濃度でＰ１８８を含有する製剤は、最大２４時間の連続的な混合の際に増加した粒径または凝集の出現を示さなかった（Ｔ＝２４時間の撹拌）（図７）。
水平撹拌研究におけるＰＣＶ１５の安定性
２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、およびＡＰＡ中の、０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８を有するまたは有さない追加のＰＣＶ１５Ａｑ製剤を、実施例７に記載したように１００ｍＬの実験室規模のバッチ調製において調製した。輸送およびハンドリングを模擬実験し、ワクチン薬物製品の安定性への影響を評価するために、水平撹拌試験を利用した。この研究は、容器閉鎖系（シリンジまたはバイアル）における表面との相互作用、および最終的な容器構成要素および空気界面への製剤の曝露を通したＰＣＶ１５Ａｑ製剤の直接撹拌を表す。０．６４ｍＬをシリンジに分注し、栓をした。これらのシリンジを２〜８℃で２４時間水平回転させ、ＳＬＳを使用して粒径分布に関して評価した（図８Ａ）。目視評価も行った（図８Ｂ）。模擬輸送およびハンドリングストレスに供されたＰ１８８の非存在下のＰＣＶ１５Ａｑ製剤は、薬物製品の粒径分布の増加ならびにシリンジなどの容器閉鎖系での集塊および凝集の可視の兆候をもたらす。Ｐ１８８を有するＰＣＶ１５製剤は、粒径分布の増加または集塊および凝集の視覚的兆候を示さなかった。
実施例９:水溶液およびＤＭＳＯ溶液中での還元的アミノ化によって産出されたコンジュゲート体の混合物を使用して調製された肺炎球菌コンジュゲートワクチン薬物製品の安定化に及ぼす賦形剤の影響
２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＡＰＡを有する複数の１５価（ＰＣＶ１５）製剤を実験室規模の模擬輸送研究を使用して評価して、頑強な製造可能で商業的に実行可能なワクチン薬物製品製剤を保証した。製剤ＰＣＶ１５Ａｑは、水溶液中での還元的アミノ化によって産出された肺炎球菌ポリサッカライド−ＣＲＭ１９７コンジュゲート体を含有した。製剤ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑは、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用して調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆコンジュゲート体、ならびに水溶液中での還元的アミノ化を使用して調製された血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、および３３Ｆコンジュゲート体を含有し、ここで、全てのポリサッカライドは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされていた。製剤ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ｓＴ３−ｏＴＦＢは、血清型３がＣＲＭ１９７ではなくＤＴＦＢタンパク質にコンジュゲートされていることを除いて、ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑと同様であった。結果は、実施例７に列挙した異なる濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡでの２つの製剤間で非常に類似していたので、特に明記しない限り、より低い濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡを含有するＰＣＶ１５製剤に関する結果のみを本実施例において示した。Ｐｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）を多価製剤の別の例として使用して、異なる肺炎球菌コンジュゲートワクチン製品におけるＰＳ−８０の適合性を試験した。それは、ＣＲＭ１９７担体タンパク質にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆポリサッカライド、ポリソルベート８０、コハク酸塩緩衝液およびリン酸アルミニウムアジュバントを含有する。コンジュゲート体を、ＤＭＳＯを使用するかまたは水性条件下での還元的アミノ化を使用して調製する。
ワクチン製剤の安定性への影響を評価するために、水平撹拌研究を利用した。この研究は、容器閉鎖系（シリンジまたはバイアル）における表面との相互作用、および最終的な容器構成要素および空気界面への製剤の曝露を通した製剤の直接撹拌を表す。製剤をシリンジに０．６４ｍＬ充填として分注し、栓をした。これらのシリンジを２〜８℃で最大８時間水平回転した。水平撹拌下での時間の影響を、静的光散乱（ＳＬＳ）を使用して粒径分布について評価した。粒径および分布をＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｓｉｚｅｒ ２０００を使用して評価した。５μｍのＮＩＳＴ粒径標準を実行し、予想される粒径分布を作製した。図９に示されるように、Ｐ１８８は、ＰＣＶ１５Ａｑ製剤に関する頑強な安定剤であるにもかかわらず、ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤に関する凝集を制御するための効果的な安定剤ではなかった。粒径分布の増加、ならびに集塊および凝集の可視の兆候が、Ｐ１８８を有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ｓＴ３−ｏＴＦＢ製剤において注目された。
Ｐ１８８が、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって産出されたコンジュゲート体を含有するＰＣＶ１５製剤に頑強な安定性を提供しなかったという驚くべき発見により、追加の安定剤および賦形剤をスクリーニングした。ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＡＰＡおよび様々な安定剤を有する）をシリンジに分注し、水平撹拌を使用してスクリーニングした。一定水平回転下での時間の影響を目視評価を使用して評価した（表２）。
Figure 2020509002
ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤の目視評価は、より高いＰ１８８およびＰＳ−２０濃度で凝集の兆候を示さなかった（表２）。しかしながら、Ｐ１８８（０．０５ｗ／ｖ％〜１．０ｗ／ｖ％）またはＰＳ−２０（０．００５ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％）を含有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤の肉眼不可視粒径分布を評価するためのより高解像度の研究を、ＳＬＳを使用して行った。これらの製剤を１．５ｍＬ ＨｙＰａｋシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において最大２４時間水平回転した。ＳＬＳによって測定されたＤ［４，３］値を図１０Ａ−Ｂに示す。Ｄ［４，３］の結果は、より高い濃度のＰＳ−２０が製剤の物理化学的安定性を著しく改善したが、全ての濃度でのＰ１８８は、効果的ではなかったことを示している。図１０Ｂに示されるように、最大２４時間の間のＰｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）の水平撹拌は、Ｄ［４，３］値の増加を示し、微粒子の証拠は、製剤が模擬輸送誘発凝集に対して十分に保護されず、ＰＳ−８０を本発明者らの製剤に使用した本発明者ら独自の経験に類似していたことを示す。
ＰＳ−２０およびＰＳ−８０を用いた本発明者らのデータに基づき、非プロトン溶媒中で作製された１つまたは複数のコンジュゲート体を含有する他の肺炎球菌ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体で安定性の改善が期待される。
実施例１０:ＰＣＶ１５中に製剤化されたＳＴ３−ＤＴＦＢコンジュゲート体を使用した子アカゲザル（ＩＲＭ）免疫原性研究
実施例１に記載されたように調製されたＤＴＦＢ（マルチモーダル陽イオン交換クロマトグラフィー）を使用して、実施例３に記載したようにＳＴ３−ＤＴＦＢコンジュゲート体を調製した。ＰＣＶ１５製剤を実施例７におけるように調製した。ＩＲＭ（子アカゲザル、ｎ＝８／群）を０、２８および５６日目に、以下の表３に記載するように、１００μＬワクチンで筋肉内（腕１〜４）免疫した。血清を研究開始前（プレ）ならびに１４、２８、４２、５６および７０日目に収集した。ＩＲＭを、病気または苦痛のあらゆる兆候について訓練を受けた動物管理スタッフが１日２回観察した。ＩＲＭにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全かつ忍容性が高いと見なされた。
Figure 2020509002
実施例６に記載したマウス研究を単一のＰｎＰｓ血清型３を有する一価コンジュゲート体を使用して完了し、ＩｇＧ応答を評価するためにＷＨＯ ＥＬＩＳＡを完了した。１５価ワクチンにおける血清型特異的ＩｇＧ応答を評価するために、多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを、電気化学的刺激により光を発するＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ラベルを使用するＭＳＤ技術（ＭＳＤは、米国メリーランド州ゲイサーズバーグのＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ．の一部門であるＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの商標である）を使用して、Ｍａｒｃｈｅｓｅらによって記載されたヒトアッセイに基づいて、アカゲザル血清で使用するために開発した。ヒト抗体試薬および標準を、子サル試料を試験する場合に使用した。子アカゲザルの結果を、ヒト参照標準（００７ｓｐ）に割り当てられた血清型特異的ＩｇＧ濃度を使用して、標準曲線から読み取った幾何平均濃度として表した。
血清型３の用量後３（ＰＤ３）ＩｇＧ応答（図１１）は、免疫化群間でいかなる統計的差異も示さなかった。ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３を使用したＯＰＡアッセイにおいて評価した機能的抗体（図１２）は、免疫化群間でいかなる統計的差異も示さなかった。
実施例１１:ＰＣＶ１５製剤の最適化
結果は、実施例７に列挙した異なる濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡでの２つの製剤間で非常に類似していたので、特に明記しない限り、より低い濃度のコンジュゲート体およびＡＰＡを含有するＰＣＶ１５製剤に関する結果のみを本実施例において示した。
再循環ラインをＰＣＶ１５製剤プロセスにおいて使用して、ワクチン薬物製品をシリンジおよびバイアル充填機に供給する。通例の充填中の再循環は、バイオ治療薬物製品にさらなる剪断力およびストレスを与え、したがって、評価するための重要なプロセシングステップである。研究を行って、０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８および０．１ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢおよび製剤（６４μｇ／ｍＬの全ポリサッカライドおよび２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡを有する２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中）に及ぼす再循環の影響を評価した。製剤を、ぜん動ポンプを使用して１８０ｍＬ／分の流速で供給容器から管を通して２４時間再循環させた。供給容器を電磁撹拌子を使用して連続的に混合し、試料を目視観察のために定期的に採取した。Ｐ１８８を含有する製剤は、集塊または視覚的凝集の出現を示した（表４）が、ＰＳ−２０を含有する製剤は、可視の凝集の兆候を示さなかった。
Figure 2020509002
追加の再循環試験を、最大５００μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ａｌ＋３）のＡＰＡおよびＰ１８８またはＰＳ−２０を有するＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−ＡｑおよびＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤を使用して行った。絶えず混合しながらの２４時間の再循環後、製剤をシリンジに分注し、最大２４時間水平撹拌した。製剤を検査し、シリンジに関する目視評価の要約を表５に示す。これらの結果は、ＰＳ−２０が通例の製造および輸送およびハンドリング中に発生し得る物理的不安定性または凝集に対する確固とした解決策を提供することを示している。Ｐ１８８は、ＰＣＶ１５Ａｑ製剤の安定化における成功（図７〜９）にもかかわらず、このＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤に十分な安定性プロファイルを提供することができなかった。
Figure 2020509002
追加の研究を、それによってＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用してＳＴ１８Ｃを調製したＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤に関して行った（ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ／ＳＴ１８Ｃ−Ｎｏｎ−Ａｑ）。ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ／ＳＴ１８Ｃ−Ｎｏｎ−Ａｑ製剤を、６４μｇ／ｍＬの全ポリサッカライド、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ、および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を有する２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で調製した。ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ／ＳＴ１８Ｃ−Ｎｏｎ−Ａｑ製剤を絶えず混合しながら最大６時間再循環させた後、製剤をシリンジに分注し、最大２４時間水平撹拌した。製剤を検査し、シリンジに関する目視評価の要約を表６に示す。これらの結果は、ＰＳ−２０が、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡおよび０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を有する２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で調製され、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用して調製された肺炎球菌ポリサッカライド血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆコンジュゲート体と、水溶液中での還元的アミノ化を使用して調製された血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆコンジュゲート体を含有し、ここで、全てのポリサッカライドがＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている、ＰＣＶ１５製剤を含む製剤について、通例の製造、輸送、およびハンドリング中に発生し得る物理的な不安定性または凝集に対する確固とした解決策を提供することを示している。
Figure 2020509002
図１０および表４〜５に示されるように、Ｐ１８８単独は、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用して産出されたコンジュゲート体および／またはＳＴ３−ＤＴＦＢコンジュゲート体からなる懸濁液ベースのＰＣＶ１５製剤の凝集を防止することにおいて最小限の利益を提供した。追加の混合および水平回転研究を、０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８およびＰＥＧ４００（ＰＥＧ）またはプロピレングリコール（ＰＧ）安定剤を含有する製剤を用いて行った。ＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤を、実施例７に記載したように、５００ｍＬ規模で調製した。ＰＥＧ４００またはＰＧをＡＰＡに添加し、次いでコンジュゲート体を添加した。６４μｇのＰｎＰｓ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ、および０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８を含有する製剤中のＰＥＧ４００またはＰＧの最終濃度は、０ｗ／ｖ％〜１５ｗ／ｖ％の間であった。製剤を電磁撹拌子を用いて１時間連続的に混合し、シリンジに分注した。シリンジを最大２４時間水平撹拌した。製剤を目視評価およびＳＬＳによる粒径分布測定のために定期的にサンプリングした。シリンジの目視評価の結果を表７〜８に示す。粒径分布の結果を図１３に示す。単独で添加した場合、Ｐ１８８は、製剤中の凝集を制御しなかった。驚くべきことに、ＰＥＧ４００またはＰＧは、Ｐ１８８と組み合わせた場合、十分な安定性を提供した。
Figure 2020509002
Figure 2020509002
実施例１２:肺炎球菌コンジュゲートワクチンの安定化製剤の免疫原性
子アカゲザルの免疫原性に及ぼす製造および輸送誘発不安定性を制御するために最適化されたＰＣＶ１５含有製剤の影響を評価した。１群あたり８匹の動物に、実施例１１に記載したように、６４μｇのＰｎＰｓ／ｍＬ、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ、および０．２ｗ／ｖ％のＰ１８８、１５ｗ／ｖ％のＰＧ、または０．１ｗ／ｖ％のＰＳ−２０のいずれかを含有する０．１ｍＬのＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ／ＳＴ３−ＤＴＦＢ製剤を筋肉内注射した。注射をＴ＝０（用量１）、１ヶ月（用量２）、および２ヶ月（用量３）の年齢で行った。血清を、用量１の前および用量１、２、および３後２週間で収集した。免疫前、用量１後、用量２後、および用量３後の血清試料からの血清ＩｇＧレベルを実施例１０に記載したように決定した。図１４に示す結果は、ＰＳ−２０またはＰ１８８とＰＧの組合せのいずれかを有するＰＣＶ１５製剤が免疫原性であったことを示している。
実施例１３:プロトン性（水）溶液および非プロトン性（ＤＭＳＯ）溶液中での還元的アミノ化によって産出されたコンジュゲート体の異なる混合物を使用して調製された肺炎球菌コンジュゲートワクチン薬物製品の安定化に及ぼすポリソルベート２０およびポリソルベート８０の影響
上記の実施例におけるＰＣＶ１５製剤で見られた有望な結果は、ＤＭＳＯ中で作製された複合糖質中のタンパク質レベル対水性条件で作製された複合糖質中のタンパク質レベルの比の下限および上限の探求を保証した。異なる比の複合糖質を有する複数の多価ＰＣＶ製剤は、水溶液中またはＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって産出された肺炎球菌ポリサッカライド−ＣＲＭ１９７コンジュゲート体を含有した。各製剤はタンパク質の量に対して正規化され、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡを有する６４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ Ｐｓ）の全ポリサッカライド（Ｐｓ）濃度を含有した。ＰＳ−８０またはＰＳ−２０を各製剤に添加して、ＰＳ−８０（０．０５ｗ／ｖ％）またはＰＳ−２０（０．０５ｗ／ｖ％）またはＰＳ−２０（０．２ｗ／ｖ％）のいずれかの最終濃度を達成した。製剤をＢＤ ＨｙＰＡＫプレフィルドシリンジに分注し、実験室規模の模擬輸送研究を使用して評価して、頑強な製造可能で商業的に実行可能なワクチン薬物製品製剤を保証した。
ＤＭＳＯを使用して調製された複合糖質の所望の範囲のパーセンテージを達成するために、全てのポリサッカライドが還元的アミノ化を使用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている以下の製剤を調製した。
製剤ＰＣＶ２４％は、ＤＭＳＯ中で調製された血清型６Ａ、６Ｂ、および２３Ｆコンジュゲート体、および水溶液中で調製された血清型１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、および３３Ｆコンジュゲート体を含有した。この製剤中の総タンパク質は、５６μｇ／ｍＬであり、１３μｇ／ｍＬ、または約２４％の総タンパク質がＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用してポリサッカライドにコンジュゲートされたＣＲＭ１９７からなった。
製剤ＰＣＶ５０％は、ＤＭＳＯ中で調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆコンジュゲート体、および水溶液中で調製された血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、および３３Ｆコンジュゲート体を含有した。この製剤中の総タンパク質は、６２μｇ／ｍＬであり、３１μｇ／ｍＬ、または５０％の総タンパク質がＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用してポリサッカライドにコンジュゲートされたＣＲＭ１９７からなった。
製剤ＰＣＶ６２％は、ＤＭＳＯ中で調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆコンジュゲート体、および水溶液中で調製された血清型１、５、９Ｖ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、および３３Ｆコンジュゲート体を含有した。この製剤中の総タンパク質は、６１μｇ／ｍＬであり、３８μｇ／ｍＬ、または約６２％の総タンパク質がＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用してポリサッカライドにコンジュゲートされたＣＲＭ１９７からなった。
製剤ＰＣＶ７９％は、ＤＭＳＯ中で調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆコンジュゲート体、および水溶液中で調製された血清型１、５、１８Ｃ、および３３Ｆコンジュゲート体を含有した。この製剤中の総タンパク質は、６３μｇ／ｍＬであり、５０μｇ／ｍＬ、または約７９％の総タンパク質がＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用してポリサッカライドにコンジュゲートされたＣＲＭ１９７からなった。
製剤ＰＣＶ１００％は、ＤＭＳＯ中の還元的アミノ化を使用して調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆコンジュゲート体を含有した。この製剤中の総タンパク質は、６５μｇ／ｍＬであり、６５μｇ／ｍＬ、または１００％の総タンパク質がＤＭＳＯ中でポリサッカライドにコンジュゲートされたＣＲＭ１９７からなった。
水平撹拌研究を利用して、ＤＭＳＯ中のポリサッカライドにコンジュゲートされたタンパク質対全タンパク質の比が生成物安定性に及ぼす影響を評価した。この研究は、容器閉鎖系（シリンジまたはバイアル）における表面との相互作用、および最終的な容器構成要素および空気界面への製剤の曝露を通した製剤の直接撹拌を表す。製剤をシリンジに０．６４ｍＬ充填として分注し、栓をした。これらのシリンジを２〜８℃で最大２４時間水平回転した。水平撹拌下での時間の影響を、静的光散乱（ＳＬＳ）を使用して粒径分布について評価した。粒径および分布をＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｓｉｚｅｒ ２０００を使用して評価した。５μｍのＮＩＳＴ粒径標準を実行し、予想される粒径分布を作製した。図１５Ａ〜Ｅに示されるように、ＰＳ−８０は、全てのＰＣＶ含有薬物製品（ＰＣＶ２４％〜ＰＣＶ１００％）に関して凝集を制御するための効果的な安定剤ではなかった。粒径分布の増加、および集塊（粒子の外観）および凝集の可視の兆候が、ＰＳ−８０を有する全ての製剤について観察された。
驚くべきことに、ＰＳ−８０に使用される濃度と同程度の濃度のＰＳ−２０は、試験したＤＭＳＯコンジュゲートパーセンテージの範囲全体にわたって改善された安定性プロファイルを提供した。製剤緩衝液中の０．２％ＰＳ−２０の濃度を達成するためにＰＳ−２０を添加すると、試験したＤＭＳＯコンジュゲートパーセンテージの範囲全体にわたって０．０５％ＰＳ−２０と比較して優れた安定性が得られた。
実施例１４:ニュージーランド白ウサギにおける肺炎球菌コンジュゲートワクチンの安定化製剤の免疫原性
ニュージーランド白ウサギの免疫原性に及ぼす製造および輸送誘発不安定性を制御するために最適化されたＰＣＶ１５含有製剤の影響を評価した。１群あたり８匹の動物に、実施例１１に記載したように、６４ｍｇのＰｎＰｓ／ｍＬ、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ、および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０を含有する０．１ｍＬのＰＣＶ１５Ａｑ／Ｎｏｎ−Ａｑ製剤を筋肉内注射した。注射を０日目および１４日目に投与した。血清を０日目と１４日目のワクチン接種前、および２８日目にも収集した。免疫前、用量１後、用量２後の血清試料からの血清ＩｇＧレベルをＥＣＬ分析によって決定した。
図１６に示す結果は、８μｇ／ｍＬの６Ｂを除き、４μｇ／ｍＬの各サッカライドと、約６４μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７担体タンパク質とを含有する剤形として製剤化された、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドおよび水溶液中での還元的アミノ化を使用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆからのストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドを有する、２０ｍＭのヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ、０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０中の１５価肺炎球菌コンジュゲート製剤が免疫原性であることを示している。

Claims (35)

  1. （ｉ）１つまたは複数のポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体と、（ｉｉ）５．０〜７．５の範囲のｐＨを有するｐＨ緩衝食塩水と、（ｉｉ）アルミニウム塩と、（ｉｖ）ａ）ポリソルベート２０および（ｂ）１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａの範囲の分子量を有するポロクサマーならびにプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール４００から選択されるポリオールから選択される界面活性剤系とを含む製剤。
  2. 前記ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の１つまたは複数が非プロトン溶媒中で作製される、請求項１に記載の製剤。
  3. １０〜１００重量タンパク質％の前記ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体が非プロトン溶媒中で作製される、請求項１に記載の製剤。
  4. 前記非プロトン溶媒がＤＭＳＯである、請求項２または３に記載の製剤。
  5. 前記界面活性剤系が１１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａの範囲の分子量を有するポロクサマーを含む、請求項１に記載の製剤。
  6. 前記ポロクサマーが７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項５に記載の製剤。
  7. 前記ポロクサマーが７，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項５に記載の製剤。
  8. 前記ポロクサマーが、ポロクサマー１８８またはポロクサマー４０７である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
  9. 前記ポロクサマーの最終濃度が０．００１重量／体積％〜５重量／体積％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
  10. 前記ポロクサマーの最終濃度が０．０２５重量／体積％〜１重量／体積％である、請求項９に記載の製剤。
  11. 前記ポリオールがプロピレングリコールであり、１重量／体積％〜２０重量／体積％の最終濃度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
  12. 前記ポリオールがポリエチレングリコール４００であり、１重量／体積％〜２０重量／体積％の最終濃度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
  13. 前記界面活性剤系がポリソルベート２０を含む、請求項１に記載の製剤。
  14. 前記ポリソルベート２０の最終濃度が０．００１重量／体積％〜１０重量／体積％の範囲にある、請求項１３に記載の製剤。
  15. 前記ポリソルベート２０の最終濃度が０．０２５重量／体積％〜２．５重量／体積％の範囲にある、請求項１３に記載の製剤。
  16. 前記ポリソルベート２０の最終濃度が０．０２５重量／体積％〜０．１重量／体積％の範囲にある、請求項１３に記載の製剤。
  17. プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールから選択されるポリオールをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の製剤。
  18. 前記ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールが６重量／体積％〜２０重量／体積％の最終濃度である、請求項１７に記載の製剤。
  19. 前記ポリエチレングリコールがポリエチレングリコール４００である、請求項１８に記載の製剤。
  20. 前記ｐＨ緩衝食塩水が５．０〜７．０の範囲のｐＨを有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
  21. 前記緩衝剤が、リン酸塩、コハク酸塩、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される、請求項２０に記載の製剤。
  22. 前記緩衝剤が５ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度のＬーヒスチジン、または１ｍＭ〜１０ｍＭの最終濃度のコハク酸塩である、請求項２１に記載の製剤。
  23. 前記Ｌ−ヒスチジンが２０ｍＭ±２ｍＭの最終濃度である、請求項２２に記載の製剤。
  24. 前記ｐＨ緩衝食塩水中の塩が塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、またはその組合せである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の製剤。
  25. 前記ｐＨ緩衝食塩水中の塩が塩化ナトリウムである、請求項２４に記載の製剤。
  26. 前記食塩水が２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の製剤。
  27. 前記ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体が担体タンパク質にコンジュゲートされた１つまたは複数の肺炎球菌ポリサッカライドを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の製剤。
  28. 前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素フラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢ Ｃ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、エシェリキア・コリＬＴ、エシェリキア・コリＳＴ、シュードモナス・エルジノーサからの外毒素Ａ、およびその組合せから選択される、請求項２７に記載の製剤。
  29. 前記ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の１つまたは複数がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている、請求項２８に記載の製剤。
  30. 前記ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート製剤がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆからのストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドから本質的になる１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤である、請求項２９に記載の製剤。
  31. 前記ポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体の１つまたは複数がＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を使用して調製される、請求項３０に記載の製剤。
  32. 血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体がＤＭＳＯ条件下で調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体が水性条件を使用して調製される、請求項３１に記載の製剤。
  33. 各用量が、８μｇ／ｍＬまたは１６μｇ／ｍＬの６Ｂを除き、４μｇ／ｍＬまたは８μｇ／ｍＬの各サッカライド、および約６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７担体タンパク質を含有するように製剤化される、請求項３２に記載の製剤。
  34. ２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．２５ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）、および０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０をさらに含む、請求項３３に記載の製剤。
  35. ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆからのストレプトコッカス・ニューモニエポリサッカライドから本質的になる１５価肺炎球菌コンジュゲート組成物と、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．８と、１５０ｍＭのＮａＣｌと、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡと、０．２ｗ／ｖ％のＰＳ−２０とを含む製剤であって、前記製剤が８μｇ／ｍＬの６Ｂを除き、４μｇ／ｍＬの各サッカライド、および約６４μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７担体タンパク質を含有する剤形として製剤化されており、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、ＤＭＳＯ条件下で調製され、および血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆ、および３３Ｆからのポリサッカライド−タンパク質コンジュゲート体は、水性条件を使用して調製される、製剤。
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