CN102858365A - 15价肺炎球菌多糖蛋白质缀合物疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有15种不同多糖蛋白质缀合物的多价免疫原性组合物。每种缀合物由与载体蛋白质优选CRM197缀合的荚膜多糖组成，所述荚膜多糖由肺炎链球菌的不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F)制备。优选配制为在基于铝的佐剂上的疫苗的免疫原性组合物提供了针对特别是在婴儿和幼儿中的肺炎球菌疾病的广泛覆盖。

Description

15价肺炎球菌多糖蛋白质缀合物疫苗组合物
与相关申请的交叉参考
无。
发明领域
本发明提供了具有15种不同多糖蛋白质缀合物的多价免疫原性组合物。每种缀合物由与载体蛋白质优选CRM197缀合的荚膜多糖组成，所述荚膜多糖由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F)制备。优选配制为在基于铝的佐剂上的疫苗的免疫原性组合物提供了针对特别是在婴儿和幼儿中的肺炎球菌疾病的广泛覆盖。
发明背景
肺炎链球菌是全世界的严重疾病的显著原因。在1997年，疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)估计在美国每年存在3,000个肺炎球菌性脑膜炎病例、50,000个肺炎球菌性菌血症病例、7,000,000个肺炎球菌性中耳炎病例和500,000个肺炎球菌性肺炎病例。参见Centers for Disease Control and Prevention，MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997，46(RR-8):1-13。此外，这些疾病的并发症可以是显著的，某些研究报道伴随肺炎球菌性脑膜炎的高达8%死亡率和25%神经病学后遗症。参见Arditi等人，1998，Pediatrics 102:1087-97。
已得到许可多年的多价肺炎球菌多糖疫苗已证明在预防成人特别是老年人和处于高危中的那些人中的肺炎球菌疾病中是有价值的。然而，婴儿和幼儿对未缀合的肺炎球菌多糖响应弱。肺炎球菌缀合物疫苗，即含有当时在幼儿和婴儿中引起侵入性肺炎球菌疾病的7种最频繁分离的血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的Prevnar®，首先在美国在2000年2月得到许可。在Prevnar®在美国普遍使用后，由于Prevnar®中存在的血清型，已存在儿童中侵入性肺炎球菌疾病的显著减少。参见Centers for Disease Control and Prevention，MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005，54(36):893-7。然而，在全世界的特定地区中存在由Prevnar®的血清型覆盖中的限制和在美国特定新出现血清型的某些证据(例如19A及其他)。参见O'Brien等人，2004，Am J Epidemiol 159:634-44；Whitney等人，2003，N Engl J Med 348:1737-46；Kyaw等人，2006，N Engl J Med 354:1455-63；Hicks等人，2007，J Infect Dis 196:1346-54；Traore等人，2009，Clin Infect Dis 48:S181-S189。
美国专利申请公开号US 2006/0228380 A1描述了包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的13价肺炎球菌多糖蛋白质缀合物疫苗。中国专利申请公开号CN 101590224 A描述了包括血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F的14价肺炎球菌多糖蛋白质缀合物疫苗。
其他PCVs已覆盖PCV-15中含有的血清型中的7、10、11或13种，但已观察到对于某些血清型的免疫干扰(例如在GSK的PCV-11中对于血清型3的更低保护)和在Pfizer的PCV-13中对于血清型6B的更低应答率。参见2008年10月25-28日在48th Annual ICAAC/ISDA 46th Annual Meeting，Washington DC呈现的Prymula等人，2006，Lancet 367:740-48和Kieninger等人，Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers。
发明概述
本发明提供了包含下述的免疫原性组合物：(1)由与载体蛋白质缀合的来自15种不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖组成的多价多糖蛋白质缀合物混合物，和(2)药学可接受的载体。更具体而言，本发明提供了包含下述的15价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV-15)组合物：由与载体蛋白质缀合的来自肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖组成的多价多糖蛋白质缀合物混合物；和药学可接受的载体。在一个特定实施方案中，免疫原性组合物含有来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖，并且载体蛋白质是CRM197。
在特定实施方案中，组合物进一步包含佐剂。在特定实施方案中，佐剂是基于铝的佐剂，例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝。在本发明的一个特定实施方案中，佐剂是磷酸铝。
本发明还提供了诱导针对肺炎链球菌荚膜多糖的免疫应答的方法，其包括给人施用免疫有效量的上述免疫原性组合物。
本发明进一步提供了作为单个0.5 mL剂量施用的免疫原性组合物，所述剂量配制为含有：2 μg每种多糖，除了4 μg的6B外；约32 μg CRM197载体蛋白质；0.125 mg元素铝(0.5 mg磷酸铝)佐剂；150 mM氯化钠和20 mM L-组氨酸缓冲液。
附图简述
图1：关于PCV-15相对于Prevnar®在婴儿恒河猴(Prevnar血清型，PD-2和PD-3)中的GMCs比较。误差条(Error bar)指示2个标准误。
图2：在用PCV-15免疫接种的婴儿恒河猴中针对非Prevnar®血清型的血清型特异性GMCs。误差条指示2个标准误。
图3：NZWR-1：在用PCV-15不连同(0xA)或连同APA(B1)(剂量2后)免疫接种的兔中的几何平均滴度比较。误差条指示对几何平均值倍数差异的95% CI(PCV-15不连同APA / PCV-15连同APA)。
发明详述
本发明提供了包含15种不同多糖蛋白质缀合物连同药学可接受的载体、基本上由15种不同多糖蛋白质缀合物连同药学可接受的载体组成、或可替代地由15种不同多糖蛋白质缀合物连同药学可接受的载体组成的多价免疫原性组合物，其中缀合物各自含有与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中荚膜多糖由肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F制备。在特定实施方案中，载体蛋白质是CRM197。免疫原性组合物可以进一步包含佐剂，例如基于铝的佐剂，例如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。本发明还提供了诱导针对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，其包括给人施用免疫有效量的上述多价免疫原性组合物。
如下文实施例中举例说明的，在婴儿恒河猴中的临床前研究证实针对PCV-15中的所有15种血清型的强抗体应答，这可与关于Prevnar®中的7种常见血清型的应答相当。包括含有血清型22F和33F的新多糖蛋白质缀合物添加的15价肺炎球菌缀合物疫苗提供强抗体应答的申请人的发现证实，未由现有肺炎球菌疫苗覆盖的肺炎球菌血清型的扩展覆盖的可行性。
当与本发明的免疫原性组合物一起使用时，术语“包含”指任何其他组分的包括(遭受用于抗原混合物的语言“由……组成”的限制)，例如佐剂和赋形剂。当与多价多糖蛋白质缀合物混合物一起使用时，术语“由……组成”指具有那些15种特定肺炎链球菌多糖蛋白质缀合物且不具有来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白质缀合物的混合物。
肺炎链球菌荚膜多糖 - 蛋白质缀合物
来自肺炎链球菌的荚膜多糖可以通过本领域技术人员已知的标准技术进行制备。例如，多糖可以从细菌中分离，并且可以通过已知方法(参见例如，欧洲专利号EP497524和EP497525)且优选通过微流化使大小调节至一定程度。多糖可以调节大小，以便减少多糖样品中的粘度和/或改善用于缀合产物的过滤性。在本发明中，荚膜多糖由肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F制备。
在一个实施方案中，每种肺炎球菌多糖血清型在基于大豆的培养基中生长。随后通过包括离心、沉淀和超滤的标准步骤纯化个别多糖。参见例如，美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。
载体蛋白质优选是无毒和无反应原性且以足够量和纯度可获得的蛋白质。载体蛋白质可以与肺炎链球菌多糖缀合或连接，以增强多糖的免疫原性。载体蛋白质应可顺应标准缀合程序。在本发明的一个特定实施方案中，CRM197用作载体蛋白质。在一个实施方案中，每种荚膜多糖与相同载体蛋白质缀合(每种荚膜多糖分子与单一载体蛋白质缀合)。在另一个实施方案中，荚膜多糖与两种或更多种载体蛋白质缀合(每种荚膜多糖分子与单一载体蛋白质缀合)。在此类实施方案中，相同血清型的每种荚膜多糖一般与相同载体蛋白质缀合。
CRM197是白喉毒素的无毒变体(即类毒素)。在一个实施方案中，它从在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中生长的白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)培养物中分离。在另一个实施方案中，CRM197依照美国专利号5,614,382中所述的方法重组制备。一般地，CRM197通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换层析的组合进行纯化。在某些实施方案中，CRM197使用Pfenex Expression Technology™(Pfenex Inc.，San Diego，CA)在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中进行制备。
其他合适的载体蛋白质包括另外的灭活细菌毒素例如DT(白喉类毒素)、TT(破伤风毒素)或TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如如国际专利申请公开号WO 2004/083251中描述的)、大肠杆菌(E. coli)LT、大肠杆菌ST、和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白质例如外膜复合物c(OMPC)，孔蛋白，转铁蛋白结合蛋白，肺炎球菌表面蛋白质A(PspA；参见国际申请专利公开号WO 02/091998)，肺炎球菌粘附素蛋白质(PsaA)，来自A组或B组链球菌的C5a肽酶，或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D，肺炎球菌溶血素(Kuo等人，1995，Infect Immun 63；2706-13)包括以某些形式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(参见国际专利申请公开号WO 04/081515)或dPLY-甲醛，PhtX包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE，和Pht蛋白质的融合物例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(参见国际专利申请公开号WO 01/98334和WO 03/54007)。其他蛋白质例如卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、PorB(来自脑膜炎奈瑟菌(N. meningitidis))、PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如，欧洲专利号EP 0 594 610 B)或其免疫功能等价物、合成肽(参见欧洲专利号EP0378881和EP0427347)、热休克蛋白(参见国际专利申请公开号WO 93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白质(参见国际专利申请公开号WO 98/58668和欧洲专利号EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(参见国际专利申请公开号WO 91/01146)、包含来自多种病原体衍生抗原的多重人CD4+ T细胞表位的人工蛋白质(参见Falugi等人，2001，Eur J Immunol 31:3816-3824)，例如N19蛋白质(参见Baraldoi等人，2004，Infect Immun 72:4884-7)、铁摄取蛋白质(参见国际专利申请公开号WO 01/72337)、艰难梭菌(C. difficile)的毒素A或B(参见国际专利公开号WO 00/61761)、和鞭毛蛋白(参见Ben-Yedidia等人，1998，Immunol Lett 64:9)也可以用作载体蛋白质。
可以使用其他DT突变体，例如CRM176、CRM228、CRM 45(Uchida等人，1973，J Biol Chem 218:3838-3844)；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103和CRM107和由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins，Ed：Frankel，Maecel Dekker Inc，1992中描述的其他突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突变和公开于美国专利号4,709,017或美国专利号4,950,740中的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变和公开于美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673中的其他突变；或公开于美国专利号5,843,711中的片段。
纯化的多糖化学地激活以使得糖类能够与载体蛋白质反应。一旦激活，每种荚膜多糖就与载体蛋白质分开缀合，以形成糖缀合物。多糖缀合物可以通过已知偶联技术进行制备。
在一个实施方案中，多糖的化学激活和与载体蛋白质的后续缀合通过美国专利号4,365,170、4,673,574和4,902,506中所述的方法达到。简言之，通过应用将末端羟基氧化为醛的任何氧化剂例如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸)的反应，那种化学法使得肺炎球菌多糖能够激活。反应导致糖的邻位羟基的随机氧化切割，伴随反应醛基的形成。
与蛋白质载体(例如CRM197)的偶联可以是通过经由蛋白质的赖氨酰基的直接胺化的还原胺化。例如，缀合通过激活多糖和载体蛋白质的混合物与还原剂例如氰基硼氢化钠反应执行。未反应的醛随后利用强还原剂例如硼氢化钠的添加进行加帽。
在另一个实施方案中，缀合方法可以依赖用1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸酯(CDAP)的糖类激活，以形成氰酸酯。激活糖类因此可以直接或经由间隔物(接头)基团与载体蛋白质上的氨基偶联。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺，以给出巯基化多糖，其可以经由硫醚键与载体偶联，所述硫醚键在与马来酰亚胺激活的载体蛋白质(例如使用GMBS)或卤代乙酰化载体蛋白质(例如使用碘乙酰胺[例如乙基碘乙酰胺HCl]或溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯或SIAB、或SIA、或SBAP)反应后获得。优选地，氰酸酯(任选通过CDAP化学制备)与己烷二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，并且氨基衍生的糖类与载体蛋白质缀合，其使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学经由在蛋白质载体上的羧基进行。此类缀合物在国际专利申请公开号WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094；和Chu等人，1983，Infect. Immunity 40:245-256中描述。
其他合适技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、norborane、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖类的游离羟基与CDI的反应形成(参见Bethell等人，1979，J. Biol. Chem. 254:2572-4；Hearn等人，1981，J. Chromatogr. 218:509-18)，随后为与蛋白质的反应以形成氨基甲酸酯键。这可以涉及异头末端至伯羟基的还原，伯羟基的任选保护/脱保护，伯羟基与CDI的反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体，且偶联CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基。
在一个实施方案中，在配制前，每种肺炎球菌荚膜多糖抗原由肺炎链球菌个别纯化，激活以形成反应醛，且随后使用还原胺化与载体蛋白质CRM197共价缀合。
在荚膜多糖与载体蛋白质缀合后，通过多种技术中的一种或多种纯化多糖蛋白质缀合物(就多糖蛋白质缀合物的量而言富集)。这些技术的例子是本领域技术人员众所周知的，并且包括浓缩/渗滤操作、超滤、沉淀/洗脱、柱层析和深层过滤。参见例如，美国专利号6,146,902。
药物 / 疫苗组合物
本发明进一步提供了组合物，包括药物、免疫原性和疫苗组合物，其包含15种不同多糖蛋白质缀合物连同药学可接受的载体和佐剂、基本上由15种不同多糖蛋白质缀合物连同药学可接受的载体和佐剂组成、或可替代地由15种不同多糖蛋白质缀合物连同药学可接受的载体和佐剂组成，其中缀合物各自含有与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中荚膜多糖由肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F制备。这些肺炎球菌缀合物通过分开过程制备且整体(bulk)配制成单一剂量制剂。
如本文定义的，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。免疫佐剂可以增强针对抗原的免疫应答，所述抗原当单独施用时是弱免疫原性的，例如未诱导抗体滴度或细胞介导的免疫应答或诱导弱抗体滴度或细胞介导的免疫应答，增加对于抗原的抗体滴度，和/或降低在个体中有效达到免疫应答的抗原剂量。因此，通常给予佐剂以加强免疫应答且其是本领域技术人员众所周知的。增强组合物的有效性的合适佐剂包括但不限于：
(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；
(2)水包油乳液佐剂(含或不含其他特异性免疫刺激剂例如胞壁酰肽(下文定义的)或细菌细胞壁组分)，例如(a)MF59(国际专利申请公开号WO 90/14837)，含有5% Squalene、0.5% Tween 80和0.5% Span 85(任选含有不同量的MTP-PE)，使用微射流机(microfluidizer)例如型号110Y微射流机(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有10% Squalene、0.4% Tween 80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121、和thr-MDP，微射流成亚微米乳化液或涡旋以生成较大颗粒大小的乳液(c)Ribi™佐剂系统(RAS)，(Corixa，Hamilton，MT)，含有2% Squalene、0.2% Tween 80和一种或多种细菌细胞壁组分，其来自美国专利号4,912,094中描述的3-O-脱酰化(deaylated)单磷酰脂质A(MPL™)、海藻糖二霉菌酸(TDM)、和细胞壁支架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox™)；和(d)Montanide ISA；
(3)可以使用皂苷佐剂，例如Quil A或STIMULON™ QS-21(Antigenics，Framingham，MA)(参见例如，美国专利号5,057,540)或由其生成的粒子，例如ISCOM(通过胆固醇、皂苷、磷脂和两亲蛋白质的组合形成的免疫刺激复合物)和Iscomatrix®(具有与ISCOM基本上相同的结构但不含蛋白质)；
(4)细菌脂多糖、合成脂质A类似物例如氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得，且在美国专利号6,113,918中描述；一种此类AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3--十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡糖苷，其也称为529(以前称为RC529)，其配制为水形式或稳定乳液；
(5)合成多核苷酸例如含有一个或多个CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；和
(6)细胞因子，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；和
(7)补体，例如补体成分C3d的三聚体。
在另一个实施方案中，佐剂是上述佐剂中的2、3种或更多种的混合物，例如SBAS2(还含有3-脱酰化单磷酰脂质A和QS21的水包油乳液)。
胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-normuramyl-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在特定实施方案中，佐剂是铝盐。铝盐佐剂可以是明矾沉淀的疫苗或明矾吸附的疫苗。铝盐佐剂是本领域众所周知的，并且例如在Harlow，E.和D. Lane(1988；Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)和Nicklas，W.(1992；Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)中描述。铝盐包括但不限于水化氧化铝、水合氧化铝、三水合氧化铝(ATH)、铝的水合物、铝的三水合物、铝胶、Superfos、Amphogel、氢氧化铝(III)、羟基磷酸铝硫酸盐(磷酸铝佐剂(APA))、无定形氧化铝、三水合氧化铝或三羟基铝。
APA是羟基磷酸铝的水混悬液。APA通过将氯化铝和磷酸钠以1:1体积比掺和以沉淀羟基磷酸铝进行制造。在掺和过程后，用高剪切混合器使材料尺寸减小，以达到在2-8 μm范围的靶聚集物粒子大小。随后将产物针对生理盐水渗滤且蒸汽灭菌。
在特定实施方案中，商购可得的Al(OH)3(例如Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co.，Westbury，NY的Alhydrogel或Superfos)用于以50 - 200 g蛋白质/mg氢氧化铝的比吸附蛋白质。在另一个实施方案中，蛋白质的吸附依赖于蛋白质的pI(等电点pH)和介质的pH。具有更低pI的蛋白质比具有更高pI的蛋白质更强地吸附至带正电的铝离子。铝盐可以建立Ag贮库，其经过2-3周的时期缓慢释放，涉及巨噬细胞的非特异性激活和补体激活，和/或刺激先天性免疫机制(可能通过尿酸的刺激)。参见例如，Lambrecht等人，2009，Curr Opin Immunol 21:23。
单价整体水性缀合物一般掺和在一起，且对于除了6B外的所有血清型都稀释至目标8 μg/mL，所述6B将稀释至目标16 μg/mL。一旦稀释，该批次将过滤灭菌，且无菌加入等体积的磷酸铝佐剂至250 μg/mL的靶最终铝浓度。佐剂化的(adjuvanted)、配制的批次将填充到一次性使用的0.5 mL/剂量小瓶内。
在特定实施方案中，佐剂是含CpG核苷酸序列，例如含CpG寡核苷酸，特别是含CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在另一个实施方案中，佐剂是ODN 1826，其可以从Coley Pharmaceutical Group获得。
“含CpG核苷酸”、“含CpG寡核苷酸”、“CpG寡核苷酸”和类似术语指长度6-50个核苷酸的核苷酸分子，其含有未甲基化的CpG部分。参见例如，Wang等人，2003，Vaccine 21:4297。在另一个实施方案中，预期任何其他领域公认的术语定义。含CpG寡核苷酸包括使用任何合成核苷间键、修饰碱基和/或修饰糖的修饰寡核苷酸。
关于使用CpG寡核苷酸的方法是本领域众所周知的，并且例如在Sur等人，1999，J Immunol. 162:6284-93；Verthelyi，2006，Methods Mol Med. 127:139-58；和Yasuda等人，2006，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110中描述。
施用 / 剂量
借助于经由全身或粘膜途径施用疫苗，本发明的组合物和制剂可以用于保护或治疗对肺炎球菌感染敏感的人。在一个实施方案中，本发明提供了诱导针对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，其包括给人施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了针对肺炎球菌感染给人接种疫苗的方法，其包括给人施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物的步骤。
“有效量”的本发明的组合物指引发抗体所需的剂量，所述抗体显著减少在后续攻击过程中肺炎链球菌感染的可能性或严重性。
本发明的方法可以用于预防和/或减少由肺炎链球菌引起的原发性临床综合征，包括侵入性感染(脑膜炎、肺炎和菌血症)和非侵入性感染(急性中耳炎和鼻窦炎)。
本发明的组合物的施用可以包括下述中的一种或多种：经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经由粘膜施用于口/消化、呼吸或泌尿生殖道。在一个实施方案中，鼻内施用用于肺炎或中耳炎的治疗(因为肺炎球菌的鼻咽运输(carriage)可以更有效被预防，从而减弱在其最早阶段时的感染)。
在每个疫苗剂量中的缀合物量选择为诱导免疫保护应答而无显著不良反应的量。此类量可以取决于肺炎球菌血清型而改变。一般地，每个剂量将包含0.1 - 100 μg每种多糖，特别是0.1 - 10 μg，且更特别是1 - 5 μg。例如，每个剂量可以包含100、150、200、250、300、400、500或750 ng，或1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90或100 μg。
关于特定疫苗的组分的最佳量可以通过涉及受试者中合适免疫应答的观察的标准研究进行确定。例如，在另一个实施方案中，用于人疫苗接种的剂量通过从动物研究外推到人数据进行测定。在另一个实施方案中，剂量凭经验测定。
在一个实施方案中，铝盐的剂量是10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700 μg，或1、1.2、1.5、2、3、5 mg或更多。在另外一个实施方案中，上述铝盐的剂量是每μg重组蛋白质。
在本发明的一个特定实施方案中，PCV-15疫苗是与CRM197个别缀合的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎球菌荚膜多糖的无菌液体制剂。每个0.5 mL剂量配制为含有：2 μg每种多糖，除了4 μg的6B外；约32 μg CRM197载体蛋白质(例如32 μg ± 5 μg、± 3 μg、± 2 μg、或± 1 μg)；0.125 mg元素铝(0.5 mg磷酸铝)佐剂；以及氯化钠和L-组氨酸缓冲液。氯化钠浓度是约150 mM(例如150 mM ± 25 mM、± 20 mM、± 15 mM、± 10 mM、或± 5 mM)和约20 mM(例如20 mM ± 5 mM、± 2.5 mM、± 2 mM、± 1 mM、或± 0.5 mM)L-组氨酸缓冲液。
根据本发明的任何方法和在一个实施方案中，受试者是人。在特定实施方案中，人患者是婴儿(小于1岁大)、刚学步的小孩(约12 – 24个月)、或幼儿(约2 – 5岁)。在其他实施方案中，人患者是老年患者(> 65岁)。本发明的组合物还适合于对于较大的儿童、青少年和成人(例如年龄18 – 45岁或18 – 65岁)使用。
在本发明的方法的一个实施方案中，本发明的组合物作为单次接种施用。在另一个实施方案中，疫苗施用足够间隔开的两次、三次或四次或更多次。例如，组合物可以以1、2、3、4、5或6个月间隔或其任何组合施用。免疫接种时间表可以遵循对于肺炎球菌疫苗设计的那种。例如，针对由肺炎链球菌引起的侵入性疾病的用于婴儿和刚学步的小孩的常规时间表是2、4、6和12-15月龄。因此，在一个优选实施方案中，组合物作为4剂量系列在2、4、6和12-15月龄时施用。
本发明的组合物还可以包括来自肺炎链球菌的一种或多种蛋白质。适合于包括的肺炎链球菌蛋白质的例子包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中鉴定的那些。
制剂
本发明的组合物可以通过本领域技术人员已知的一种或多种方法施用于受试者，例如肠胃外、经粘膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、腹膜内，且相应配制。
在一个实施方案中，本发明的组合物经由液体制备物的表皮注射，肌内注射，静脉内、动脉内、皮下注射，或呼吸道粘膜内注射进行施用。用于注射的液体制剂包括溶液等。
本发明的组合物可以配制为单剂量小瓶、多剂量小瓶或预装注射器。
在另一个实施方案中，本发明的组合物经口施用，并且因而以适合于经口施用的形式即作为固体或液体制备物进行配制。固体经口制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、丸剂(pellet)等。液体经口制剂包括溶液、悬液、分散体、乳液、油等。
用于液体制剂的药学可接受的载体是水或非水溶液、悬液、乳液或油。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。油的例子包括动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄榄油、向日葵油、鱼肝油、另外的海洋油、或来自乳或蛋的脂肪。
药物组合物可以是等渗、低渗或高渗的。然而，在将它施用时，通常优选用于输注或注射的药物组合物是基本上等渗的。因此，为了贮存，药物组合物可以优选是等渗或高渗的。如果药物组合物为了贮存是高渗的，那么它可以在施用前稀释以变成等渗溶液。
等渗试剂可以是离子等渗试剂例如盐或非离子等渗试剂例如糖。离子等渗试剂的例子包括但不限于NaCl、CaCl2、KCl和MgCl2。非离子等渗试剂的例子包括但不限于甘露醇、山梨糖醇和甘油。
还优选至少一种药学可接受的添加剂是缓冲剂。为了某些目的，例如，当药物组合物意欲用于输注或注射时，通常希望组合物包含缓冲液，其能够将溶液缓冲至在4 – 10范围中的pH，例如5 – 9，例如6 – 8。
缓冲液可以例如选自TRIS、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲液。
缓冲剂可以另外例如选自用于肠胃外使用的USP相容的缓冲液，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。例如，缓冲液可以选自一元酸例如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸和乳酸；二元酸例如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸，多元酸例如柠檬酸和磷酸；和碱例如铵、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和TRIS。
肠胃外媒介物(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格和不挥发性油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏右旋糖的那些等。例子是无菌液体例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其他药学可接受的佐剂。一般而言，水、盐水、水性右旋糖和相关糖溶液，二醇例如丙二醇或聚乙二醇，和聚山梨糖醇-80是优选液体载体，特别是用于可注射溶液。油的例子是动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄榄油、向日葵油、鱼肝油、另外的海洋油、或来自乳或蛋的脂质。
本发明的制剂还可以含有表面活性剂。优选表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为Tweens)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；在DOWFAX™商品名称下销售的，环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，例如线性EO/PO嵌段共聚物；辛苯昔醇，其可以在重复乙氧基(氧基-l,2-乙二基(ethanediyl)基团数目中不同，其中辛苯昔醇-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是特别有利的；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物例如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三甘醇单月桂基醚(Brij 30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为SPANs)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。用于包括在乳液中的优选表面活性剂是Tween 80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)。
可以使用表面活性剂的混合物，例如Tween 80/Span 85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 80)和辛苯昔醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的组合也是合适的。另一种有用的组合包含laureth 9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯昔醇。
表面活性剂的优选量(按重量计%)是：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如Tween 80)0.01 - 1%，特别是约0.1 %；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(polyoxyethanols)(例如Tri-n X-100，或在Tri-n系列中的其他去垢剂)0.001 - 0.1 %，特别是0.005 - 0.02%；聚氧乙烯醚(例如laureth 9)0.1 - 20 %，优选0.1 - 10 %，且特别是0.1 - 1 %或约0.5%。
在另一个实施方案中，药物组合物在控释系统中递送。例如，试剂可以使用静脉内输注、经皮贴剂、脂质体或其他施用模式进行施用。在另一个实施方案中，使用聚合材料；例如在微球体中或埋植剂中。
还由本发明包含的是通过水溶性聚合物的共价附着修饰的化合物，所述水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸。此类修饰可以增加化合物在水溶液中的可溶性，消除聚集，增强化合物的物理和化学稳定性，且极大减少化合物的反应原性。在另一个实施方案中，所需体内生物学活性通过更不频繁地或以比未修饰化合物更低的剂量施用此类聚合物-化合物加合物(abducts)来达到。
在一个优选实施方案中，疫苗组合物在具有氯化钠的L-组氨酸缓冲液中配制。
已就伴随描述和附图而言描述了本发明的多个实施方案，应当理解本发明并不限于那些精确实施方案，并且多种变化和修饰可以由本领域技术人员在其中实现，而不背离如在附加权利要求中定义的本发明的范围或精神。
下述实施例举例说明但不限制本发明。
实施例
实施例1：肺炎链球菌荚膜多糖的制备
培养肺炎球菌的方法是本领域众所周知的。参见例如，Chase，1967，Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法也是本领域众所周知的。参见例如，欧洲专利号EP0497524。肺炎球菌亚型的分离物可从ATCC获得。
该细菌鉴定为有荚膜、无运动、革兰氏阳性、柳叶刀状双球菌，其在血琼脂上是α-溶血的。亚型是在使用特异性抗血清的Quelling反应的基础上区分的。参见例如，美国专利号5,847,112。
细胞库
代表PCV-15中存在的肺炎链球菌血清型各自的细胞库以冷冻小瓶得自Merck Culture Collection(Rahway，NJ)。
接种
将解冻的种子培养物转移至含有合适的预灭菌生长培养基的种子发酵罐。
种子发酵
培养物在种子发酵罐中伴随温度和pH控制生长。将种子发酵罐的整个体积转移至含有预灭菌生长培养基的生产发酵罐。
生产发酵
生产发酵是该过程的最后细胞生长阶段。温度、pH和搅动速率是受控的。
灭活
发酵过程经由灭活剂的添加得到终止。在灭活后，将批次转移至灭活槽，在其中它保持在受控的温度和搅动下。
纯化
使用离心和过滤的组合去除细胞碎片。将批次超滤且渗滤。随后对批次实施基于溶剂的分馏，其去除杂质且回收多糖。
实施例2：肺炎球菌多糖CRM197缀合物的制备
激活过程
不同血清型糖类使用常见工艺流程个别缀合至纯化的CRM197载体蛋白质。在这个过程中，将糖类溶解，调节大小至靶分子量，化学激活且通过超滤更换缓冲液。随后用激活糖类缀合纯化的CRM197，且在最后0.2 μm膜过滤前，将所得到的缀合物通过超滤纯化。在每个步骤内的几个工艺参数，例如pH、温度、浓度和时间是血清型特异性的，如本实施例中所述。
步骤 1 ：溶解
将纯化的多糖溶解于水中至2 – 3 mg/mL的浓度。将溶解的多糖经过其压力预调为0-1000巴的机械匀浆器。在尺寸减小后，将糖类浓缩且用无菌水在10 kDa MWCO超滤器上渗滤。将渗透物弃去，并且用乙酸钠缓冲液，50 mM终浓度，将渗余物调整至pH 4.1。对于血清型4和5，使用以pH 5.0的100 mM乙酸钠。对于血清型4，将溶液在50° ± 2℃温育。通过冷却至20 - 24℃停止水解。
步骤 2 ：高碘酸盐反应
使用总糖类含量测定用于肺炎球菌糖类激活的所需高碘酸钠摩尔当量。伴随充分混合，对于除了5、7F和19F(关于其的温度是2 - 6℃)外的所有血清型，允许氧化在20 - 24℃进行3 – 20小时。
步骤 3 ：超滤
将氧化糖类浓缩，并且在10 kDa MWCO超滤器上用10 mM磷酸钾，pH 6.4(对于血清型5，10 mM乙酸钠，pH 4.3)渗滤。将渗透物弃去，并且通过添加3 M磷酸钾缓冲液，将渗余物调整至pH 6.3 – 8.4。
缀合过程
步骤 1 ：缀合反应
将浓缩糖类与CRM197载体蛋白质以0.2 – 2至1配料比混合。将掺和的糖类-CRM197混合物通过0.2 μm滤器过滤。
缀合反应通过加入氰基硼氢化钠溶液达到1.8 – 2.0摩尔氰基硼氢化钠/摩尔糖类而起始。将反应混合物在20 - 24℃(对于血清型3、5、6A、7F、19A和19F，8 - 12℃)温育48 – 120小时。
步骤 2 ：硼氢化物反应
在缀合温育结束时，用1.2 M碳酸氢钠缓冲液或3 M磷酸钾缓冲液(除了血清型5外)，将反应混合物调整至4 - 8℃，和pH 8 – 10。通过加入硼氢化钠溶液达到0.6 – 1.0摩尔硼氢化钠/摩尔糖类(对于血清型5，加入0摩尔硼氢化物)停止缀合反应。将反应混合物温育45 – 60分钟。
步骤 3 ：超滤步骤
将反应混合物在100 kDa MWCO超滤器上渗滤，使用最低限度20体积的100 mM磷酸钾，pH 8.4缓冲液。来自100 kDa超滤器的渗余物在300 kDa MWCO超滤器上渗滤，使用在20 - 24℃最低限度20透析体积(diavolumes)的150 mM氯化钠。将渗透物弃去。
步骤 4 ：无菌过滤
将来自300 kDa MWCO渗滤的渗余物通过0.2 μm滤器过滤，且填充到合适体积的硼硅玻璃容器内，用于释放测试、过程中控制(in-process control)和配制(除了血清型19F外)。将血清型19F缀合物经过0.2 μm滤器进入容纳槽内，且在20 - 24℃温育。在温育后，将缀合物在300 kDa MWCO超滤器上渗滤，使用在20 - 24℃最低限度20透析体积的150 mM氯化钠。将渗透物弃去，并且将渗余物通过0.2 μm滤器过滤，且填充到合适体积的硼硅玻璃容器内，用于释放测试、过程中控制和配制。将最终整体浓缩物贮存于2 - 8℃。
实施例3:15价肺炎球菌缀合物疫苗的配制
基于批次体积和整体糖类浓度计算整体浓缩物的所需体积。通过加入含有氯化钠和L-组氨酸、pH 5.8的缓冲液，将合并的15种缀合物进一步稀释至靶吸附浓度。在足够混合后，将掺和物通过0.2 μm膜无菌过滤。将无菌配制的整体在其与整体磷酸铝掺和的过程中和之后轻轻混合。将配制的疫苗贮存于2 – 8℃。
在可替代过程中，通过加入含有氯化钠和L-组氨酸、pH 5.8的缓冲液，将合并的15种缀合物进一步稀释至靶浓度。在无菌过滤前，向稀释的缓冲的缀合物混合物中加入聚山梨醇酯80至0.005%的终浓度。在无菌过滤后，将配制的疫苗贮存于2 – 8℃。
表1显示佐剂化和未佐剂化形式的PCV-15的最终组成。
表1：佐剂化和未佐剂化15价肺炎球菌缀合物疫苗制剂的组成
Figure 360165DEST_PATH_IMAGE001
实施例4：免疫原性研究
设计实验以评价肺炎球菌缀合物疫苗的多重制剂在婴儿恒河猴(IRM)和新西兰白兔(NZWR)动物模型中的免疫原性。在婴儿恒河猴中的实验设计为紧密匹配在美国用于肺炎球菌缀合物疫苗的推荐时间表，使用在2、4和6月龄时给予的婴儿系列。因此，婴儿恒河猴在2-3月龄时开始免疫接种，并且以2个月间隔施用疫苗。不施用第4个剂量，其也是用于美国儿童的推荐时间表的部分。成年兔(NZWR)用于评价多重疫苗制剂。使用在加速(2周间隔)免疫接种方案中给出的两个疫苗剂量执行NZWR研究。对于免疫应答的临床前评价，将全人剂量递送给兔，而婴儿猴接受一半人剂量。关于选择一半人剂量用于婴儿猴的原理是由于可以在单个肌内部位施用于婴儿恒河猴的体积中的限制。
血清型特异性 IgG 应答的评估
基于使用Meso Scale Discovery(MSD)技术(其使用在电化学刺激后发光的SULFO-TAG™标记)的人测定，开发多路化电化学发光(ECL)测定用于与兔和恒河猴血清一起使用。参见Marchese等人，2009，Clin Vaccine Immunol 16:387-96。使用专用的ECL板阅读器，将电流置于板结合的电极上，导致一系列电诱导的反应，导致发光信号。在开发和验证中使用的多斑点配置是在96孔板形式中的10个斑点/孔，并且每个孔用5 ng肺炎球菌(Pn)多糖(Ps)/斑点包被。两种板形式用于确保在分开板中测试交叉反应多糖(即6A和6B、以及19A和19F)。板形式1含有血清型3、4、6B、9V、14、18C、19F和23F，而板形式2含有血清型1、5、6A、7F、19A、22F和33F。每个孔还含有两个牛血清白蛋白(BSA)斑点，其用于评估测定的本底反应性(即在不存在PnPs的情况下，与血清和标记的二次抗体相关的应答)。将测定标准(89SF-2)、对照和测试血清在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至合适水平，所述PBS含有0.05% Tween 20、1% BSA、5 μg/ml C-多糖(CPs)、10 μg/ml血清型25多糖(PnPs25)和10 μg/ml血清型72多糖(PnPs72)，并且在4℃(2 – 8℃)温育过夜或在环境温度温育45分钟。当测试婴儿猴样品时，使用人抗体试剂和标准，而当测试兔血清样品时，SULFO-TAG™标记的抗兔IgG用作二次抗体。将每一抗原包被的板在环境温度在振荡器平台上与封闭剂一起温育1小时。将板用0.05% PBS-T洗涤，并且加入25 μL/孔预吸附且稀释的测试血清，并且在环境温度在振荡器平台上温育45分钟。将板用0.05% PBS-T洗涤，并且随后将MSD SULFO-TAG™标记的山羊抗人IgG二次抗体(用于恒河猴血清)和标记的山羊抗兔IgG二次抗体(用于兔血清)加入每个孔中，并且在环境温度在振荡器平台上温育1小时。将板用0.05% PBS-T洗涤，并且将在水中1:4稀释的150μL MSD Read Buffer-T 4X(含表面活性剂)加入每个孔中。使用MSD Sector Imager型号编号2400或6000阅读板。对于兔研究，结果呈现为几何平均滴度(GMTs)或GMTs的比。对于婴儿恒河猴研究，结果表示为由使用对人参考标准(89 SF-2)指定的血清型特异性IgG浓度的标准曲线阅读的几何平均浓度。
功能 ( 调理吞噬 (Opsonophagocytic)) 应答的评估
来自婴儿恒河猴研究2的样品在4路化MOPA测定(MOPA-4)中进行测试。参见Burton等人，2006，Clin Vaccine Immunol 13:1004-9。该测定使用选择为对于4种抗生素之一是抗性的细菌菌株，从而使得测定的第一部分(调理素作用和摄取到分化的HL-60细胞内)可以一次对高达4种血清型执行。关于细菌杀死的读出在相应菌株对于其是抗性的4种抗生素各自的存在下平行完成，以便测定关于每种特异性血清型的杀死滴度。结果表示为在其下观察到50%杀死的倒数稀释度(在内插法后)。
用于临床前研究的统计方法学
两种动物模型都具有与样品大小有关的限制。一般而言，8只婴儿猴或8只兔用于每个研究臂(arm)。应用8只动物/臂，在处理臂之间在几何平均滴度中2.5倍的临界倍数差异视为有意义的应答阈值。基于下述假设测定2.5倍差异：对于每种血清型，在处理臂内天然对数转化的滴度的标准差是ln(2)。假设(Letting)
Figure 339622DEST_PATH_IMAGE002
指示在i th处理臂中ln转化的滴度的平均值，ni 指示在i th处理臂内的动物数目，σ i 2指示在i th处理臂内的动物中ln转化的滴度的已知方差，并且对于所有i设定ni = 8和σ i 2 =(ln(2))2，随后通过求出
Figure 119359DEST_PATH_IMAGE003
获得2.5的值，其中
Figure 514569DEST_PATH_IMAGE004
，并且Z 0.995指示标准正常累积分布的倒数(inverse)，具有0.995的概率(即，Z 0.995= 2.576)。应当指出将2.44的计算值四舍五入为2.5，因为2.5也提供以0.4的方便倒数(reciprocal)。
婴儿恒河猴 (IRMs) 针对 PCV-15 的血清特异性 IgG 应答
进行预备免疫原性研究(IRM-1)，以测定婴儿恒河猴(IRMs)是否是在其中评价Pn多糖CRM197缀合物疫苗的良好模型。该实验的初步目标是测定IRMs(如同人婴儿)是否对游离Pn多糖无应答，但对缀合物疫苗应答良好。在2-3月龄时开始，将5个IRMs的组用Pn多糖、Prevnar®或PCV-15注射。将疫苗的三个剂量以2个月间隔肌内(IM)施用，并且在第一个剂量前和在剂量2后1个月时和在剂量3后1个月时，使用多阵列(multiarray)电化学发光(ECL)测定(数据未显示)测量血清型特异性IgG应答。
结果指示IRMs对游离Pn多糖应答弱，如果存在应答的话(if at all)，但对缀合物疫苗应答非常良好。结果指示在婴儿恒河猴中针对Pn多糖的IgG应答的诱导依赖于多糖与载体蛋白质的缀合，并且因此是经典T细胞依赖性应答。因此，IRM模型测定为适合于评价PCV-15制剂。
进行第二个研究(IRM-2)，以评价使用整体缀合工艺的PCV-15制剂，所述整体缀合工艺使游离(未缀合的)多糖和未缀合的CRM197降到最低。图1显示对于Prevnar®中含有的7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F、23F)，针对PCV-15与Prevnar®比较的剂量2后(PD-2)和剂量3后(PD-3)IgG应答。对于几乎所有血清型，针对PCV-15的PD-2应答等价于或略微低于针对Prevnar®的相应应答，而针对PCV-15的PD-3应答稍微高于由Prevnar®引发的那些。
针对PCV-15中的非Prevnar血清型的IRM应答显示于图2中。针对PCV-15中的非Prevnar血清型的PD-2应答都是基线(疫苗接种前)IgG浓度的至少10倍高，并且滴度在PD-3继续升高。
结果指示针对PCV-15和Prevnar®的抗体应答对于7种常见血清型是类似的(comparable)，并且对于8种添加的血清型，针对PCV-15的疫苗接种后应答为基线的> 10倍高。
IRMs 针对 PCV-15 的功能 ( 调理吞噬 ) 免疫应答
为了测定PCV-15是否在婴儿猴中诱导功能抗体应答，对来自IRM-2的血清执行调理吞噬杀死(OPA)测定。针对PCV-15和Prevnar®的疫苗接种前、PD-2和PD-3应答显示于表2中。显示的结果是来自一式两份测定的7-8只猴/时间点的血清样品的GMTs。还显示的是在PD-3时间点的应答者百分比(即具有OPA滴度≥ 8的那些)。对于除了1和33F型外的所有血清型，PCV-15诱导高PD-2 GMT。在3个疫苗剂量后，PCV-15诱导针对每种血清型的高OPA GMTs，和对于疫苗中含有的所有15种血清型的100% OPA应答率。值得注意的是，PCV-15还诱导针对血清型6C的良好交叉反应性OPA应答，所述血清型6C不在疫苗中。Prevnar®诱导高OPA滴度，和对于那种疫苗中含有的所有血清型的100% OPA应答率，但它在一部分猴中仅诱导针对血清型6A和6C的弱交叉反应性应答。
表2：在用PCV-15或Prevnar®接种疫苗后在婴儿恒河猴中的血清型特异性OPA GMTs(疫苗接种前、PD-2和PD-3几何平均滴度和具有≥8滴度的PD-3应答者百分比)
Figure 328941DEST_PATH_IMAGE005
在新西兰白兔中的 PCV-15 制剂评价
使用其中兔在第0天和第14天时接受疫苗的全人剂量的压缩免疫接种方案，在成体新西兰白兔(NZWRs)的4个研究中评价PCV-15制剂，并且在第0、14和28天收集血清用于分析。所有研究用Prevnar®作为基准，并且概括于表3中(NZWR实验1-4)。
结果显示于表3中，关于新西兰白兔的剂量2后应答表示为对于在疫苗之间共同的血清型，针对Merck PCV-15相对于Prevnar®的几何平均IgG应答比。
表3 在NZWR中测试的引导PCV-15制剂的剂量2后IgG应答比(PCV-15:Prevnar™)
血清型 NZWR-1 NZWR-2 NZWR-3 NZWR-4
4 0.70 0.59 0.63 1.06
6B 1.35 0.49 1.53 0.45
9V 2.07 1.79 1.70 1.31
14 2.37 0.58 2.32 2.55
18C 0.87 0.6 0.52 0.27
19F 0.66 0.76 2.70 1.25
23F 0.36 0.30 1.22 0.41
血清型特异性IgG应答一般在针对Prevnar®的相应应答的2.5倍内。例外是血清型(23F)，其在4个实验的2个中低于针对Prevnar®那种的> 2.5倍。从第0天到第28天(剂量2后，PD-2)针对非Prevnar®血清型的抗体水平中的倍数升高概括于表4中。
表4 在NZWR中测试的PCV-15引导制剂(Lead Formulation)针对非Prevnar™血清型的IgG应答中的倍数升高(剂量2后:剂量1前)
血清型 NZWR-1 NZWR-2 NZWR-3 NZWR-4
1 14.9 30.5 55.1 59.9
3 33.6 16.2 61.5 28.5
5 12.8 70.2 112.0 134.0
6A 21.3 77.8 143.0 123.0
7F 42.0 83.8 194.0 108.0
19A 40.5 79.1 450.0 314.0
22F 45.7 87.8 243.0 135.0
33F 21.7 47.9 98.8 69.4
多糖缀合物疫苗剂量对NZWRs中的免疫原性的作用
与疫苗的计划人剂量(1×)相比较，还对于PCV-15中含有的所有血清型评价增加剂量(双剂量，2×)的多糖缀合物的免疫原性。对于2×多糖缀合物制剂，将APA浓度增加至1.5×，以便确保大多数缀合物将结合至铝佐剂。如表5中所示，看起来在增加疫苗中的多糖缀合物量中没有显著益处。跨越所有血清型的差异在2倍内，并且几何平均倍数比(1×PCV-15/2X PCV-15 +1.5X APA)是1.1。
表5 在NZWR中对于Prevnar®、PCV-15的1×人剂量*或PCV-15的2×人剂量†的几何平均IgG滴度(95%置信区间)
*用1×铝佐剂(APA)配制
† 用1.5×APA配制。
铝佐剂对PCV-15在NZWRs中的免疫原性的作用
铝佐剂(APA)对抗体应答的影响在一个兔研究中进行评价。测试由APA的计划人剂量配制(PCV-15 1×APA)、由APA的加倍计划人剂量配制(PCV-15 2×APA)、和不含任何铝佐剂(PCV-15 0×APA)的PCV-15。Prevnar®组也包括在这个研究中。
PD-2结果指示加倍APA的浓度对针对PCV-15的血清型特异性IgG应答具有很少影响。滴度(1×APA/2×APA)中的倍数差异范围为0.6(血清型6B)到2.3(血清型22F)，并且跨越15种血清型的几何平均倍数比是1.1。在不存在铝佐剂的情况下，相对于具有1×APA的PCV-15，抗体滴度对于许多血清型看起来较低。滴度(1×/0×)中的倍数差异范围为0.5(血清型5)到2.9(血清型23F)，并且跨越15种血清型的几何平均倍数比是1.4。总之，加倍铝佐剂的水平看起来不显示真正优点，并且在这个动物模型中消除佐剂(表6)看起来是不利的。
PD-2结果指示当与含有APA的PCV-15(图3)相比较时，在不含有磷酸铝佐剂(APA)的臂中的许多血清型存在抗体滴度中的减少，指示对于兔中的最佳PCV-15免疫原性而言对铝佐剂的包含的需求。另外，当加倍的APA量包括在疫苗中时，未发现益处(数据未显示)。
Figure 231486DEST_PATH_IMAGE007
Figure 430386DEST_PATH_IMAGE008
讨论和结论
临床前数据证实PCV-15的制剂(在APA上配制的)在两个物种(婴儿恒河猴和兔)中是高度免疫原性的。对于在疫苗之间共同的7种血清型，针对PCV-15的血清型特异性应答与由Prevnar®引起的那些相当。对于PCV-15中的8种新血清型，存在在婴儿恒河猴和兔中都引发的强应答，在两个物种中在2个疫苗剂量后对于所有血清型在IgG应答中具有≥10倍升高。有限剂量范围实验指示在多糖缀合物量中的2倍增加不导致增加的抗体应答。类似地，在铝佐剂浓度中的2倍增加看起来不显著改善PCV-15的免疫原性概况。然而，佐剂的消除的确导致针对某些血清型的更低应答，暗示在人中对于佐剂的潜在需要。功能(OPA)抗体应答由PCV-15针对疫苗中的所有15种血清型以及并非PCV-15组分的血清型6C引发。

Claims (8)

1.一种免疫原性组合物，其包含：
(1)由与载体蛋白质缀合的来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖组成的多价多糖蛋白质缀合物混合物，和
(2)药学可接受的载体。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白质是CRM197。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
4.权利要求3的免疫原性组合物，其中所述佐剂是基于铝的佐剂。
5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述佐剂是磷酸铝。
7.一种诱导针对肺炎链球菌荚膜多糖的免疫应答的方法，其包括给人施用免疫有效量的权利要求1的免疫原性组合物。
8.权利要求7的方法，其中施用的所述免疫原性组合物是配制为含有下述的单个0.5 mL剂量：2 μg每种多糖，除了4 μg的6B外；约32 μg CRM197载体蛋白质；0.125 mg元素铝(0.5 mg磷酸铝)佐剂；150 mM氯化钠和20 mM L-组氨酸缓冲液。
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