CN111050794A - 将肺炎球菌多糖与载体蛋白缀合的配制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了来自肺炎链球菌的荚膜多糖与载体蛋白的缀合相关的许多方法改进。这些方法是血清型特异性的，并且包括酸水解，将氯化钠添加到还原胺化反应中以及添加蔗糖以溶解多糖。使用本发明的方法制备的多糖‑蛋白缀合物可以包含在多价肺炎球菌缀合物疫苗中。

Description

将肺炎球菌多糖与载体蛋白缀合的配制方法
技术领域
本发明提供了与来自肺炎链球菌的荚膜多糖与载体蛋白的缀合相关的许多方法改进。使用本发明的方法制备的多糖-蛋白缀合物可以包含在多价肺炎球菌缀合物疫苗中。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种荚膜细菌，并且是全世界严重疾病的重要原因。1997年，美国疾病控制与预防中心(CDC)估计，美国每年有3,000例肺炎球菌脑膜炎、50,000例肺炎球菌菌血症、7,000,000例肺炎球菌中耳炎和500,000例肺炎球菌性肺炎。参见Centers for Disease Control and Prevention,MMWR Morb Mortal Wkly Rep1997,46(RR-8):1-13。此外，这些疾病的并发症可能很严重，一些研究报道，肺炎球菌脑膜炎的死亡率高达8％，神经系统后遗症高达25％。参见Arditi等,1998,Pediatrics 102:1087-97。
事实证明，已获许可多年的多价肺炎球菌多糖疫苗在预防成年人，尤其是老年人和高危人群的肺炎球菌疾病方面具有不可估量的价值。然而，婴幼儿对未缀合的肺炎球菌多糖反应较差。细菌多糖是不依赖T细胞的免疫原，在婴儿中引起微弱反应或无反应。细菌多糖免疫原与载体蛋白的化学缀合可将婴儿的免疫应答转化为一种依赖T细胞的免疫应答。白喉类毒素(DTx，DT的化学去毒版本)和CRM197被描述为细菌多糖免疫原的载体蛋白，因为它们的氨基酸序列中存在刺激T细胞的表位。
肺炎球菌缀合物疫苗
Figure BDA0002403187790000011
于2000年2月首次在美国获得许可，其含有当时在婴幼儿中引起侵袭性肺炎球菌疾病的7种最常见的血清型(4，6B，9V，14，18C，19F和23F)。在美国普遍使用
Figure BDA0002403187790000021
后，由于
Figure BDA0002403187790000022
中存在的血清型，儿童的侵袭性肺炎球菌疾病已显著减少。参见Centers for Disease Control and Prevention,MMWR Morb MortalWkly Rep 2005,54(36):893-7。但是，在世界某些地区，
Figure BDA0002403187790000023
的血清型覆盖受限，并且在美国存在某些新兴血清型的证据(例如19A等)。参见O'Brien等,2004,Am J Epidemiol159:634-44；Whitney等,2003,N Engl J Med 348:1737-46；Kyaw等,2006,N Engl J Med354:1455-63；Hicks等,2007,J Infect Dis 196:1346-54；Traore等,2009,Clin InfectDis 48:S181-S189。
Figure BDA0002403187790000024
是一种13价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，包括血清型1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A、19F和23F。参见例如，美国专利申请公开号US 2006/0228380A1、Prymula等,2006,Lancet 367:740-48和Kieninger等,Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valentPneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infantsand Toddlers,presented at the 48th Annual ICAAC/ISDA 46th Annual Meeting,Washington DC,October 25-28,2008。还参见Dagan等,1998,Infect Immun.66:2093-2098和Fattom,1999,Vaccine 17:126。
当前的多价肺炎球菌缀合物疫苗已经有效地减少了与疫苗中存在的那些血清型有关的肺炎球菌疾病的发病率。然而，表达疫苗中不存在的血清型的肺炎球菌的流行率正在增加。必须针对每种血清型就缀合效率和针对呈现独特挑战的某些血清型确定新型血清型的工艺条件。因此，需要改进的工艺条件用于缀合新的肺炎球菌血清型以包含在未来的疫苗中。
发明内容
本发明提供了在制备来自肺炎链球菌的多糖(Ps)中的许多工艺变化，所述变化对特定血清型是独特的。这些工艺变化改善了多糖的性质和/或多糖的溶解，从而导致更好的缀合。
在一个实施方式中，本发明提供了获得尺寸减小的来自血清型12F，23A，24F和31的肺炎链球菌多糖的工艺条件，当所述多糖在非质子溶剂中与载体蛋白(Pr)缀合时，显示出期望的缀合物属性。具体而言，与均质化相比，通过酸水解降低这些血清型的Ps大小，可产生用于蛋白质缀合的更低的Ps分子量，从而改善了例如赖氨酸消耗、游离Ps或游离Pr等缀合物属性。
在一个实施方式中，本发明提供了用于在非质子溶剂(例如DMSO)中使用氯化钠在缀合后获得改善的多糖-蛋白缀合物属性的工艺条件，特别是对于来自血清型15A，16F，17F，20、24F和35B的肺炎链球菌多糖。具体而言，在该实施方式中，在缀合反应之前或过程中包含≥1mM氯化钠(无论在该过程中在何处添加氯化钠)都会改善缀合物属性，例如更大的缀合物尺寸，更高的赖氨酸消耗，更低的游离PS或游离Pr。
在一个实施方式中，本发明提供了血清型3，8和24F的肺炎链球菌多糖的一系列冻干前配制条件，以确保冻干后完全溶解。具体而言，将多糖与蔗糖和水配制在一起，使得蔗糖与多糖的质量比≥30倍，最佳≥40倍。例如，对于给定的冻干前多糖浓度为2mg Ps/mL，蔗糖浓度应最低为60mg蔗糖/mL(6％w/v蔗糖)，最佳为≥80mg蔗糖/mL(8％w/v蔗糖)，用于冻干后溶解。
以这些方式配制的多糖可在冻干和再溶解后与蛋白缀合，从而产生期望的性质。
附图说明
图1显示了氯化钠对来自血清型20的肺炎链球菌多糖的缀合物尺寸的影响。
图2显示了氯化钠对来自血清型20的肺炎链球菌多糖的赖氨酸消耗的影响。
图3显示了氯化钠对来自血清型20的肺炎链球菌多糖的游离Ps和Pr的影响。
具体实施方式
本发明提供了在制备来自肺炎链球菌的多糖(Ps)中的许多工艺变化，这些变化对特定血清型是独特的。这些工艺变化改善了多糖的性质和/或多糖的溶解，从而导致更好的缀合。
发明人发现了，如实施例所示，在蛋白质缀合之前通过酸水解使某些肺炎链球菌多糖的尺寸减小，产生了改进的缀合物属性。不受任何特定理论的束缚，使用酸水解的一种可能的机理可以解释所观察到的行为，即与酸水解产生的较低分子量的Ps缀合在缀合反应过程中在Ps和Pr分子之间提供了较少的的空间位阻，这可以进而导致增强的相互作用和改善的缀合。
本发明人发现了，如实施例中所示，某些肺炎链球菌多糖的完全溶解需要冻干后存在蔗糖。不受任何特定理论的束缚，使用蔗糖的一种可能的机制可以解释观察到的溶解行为，即某些多糖血清型由于其化学结构在冻干或溶解过程中比其他血清型更易于自关联(self-associate)，并且更高的蔗糖/多糖比率抑制自关联，允许冻干后的溶解。
发明人发现了，在缀合反应之前或缀合反应中，特别是对于来自血清型16F，20和24F的肺炎链球菌多糖，无论在过程中何处添加氯化钠，加入≥1mM氯化钠都会导致改进的缀合物属性，例如更大的缀合物尺寸，更高的赖氨酸消耗，更低的游离Ps或游离Pr，如实施例中所示。不受任何特定理论的束缚，使用氯化钠的一种可能的机理可以解释所观察到的针对氯化钠的缀合行为，即对于某些多糖血清型，由于其化学结构和电荷分布，氯化钠提供了静电屏蔽，从而允许增强与蛋白的相互作用并产生改善的缀合。氯化钠还为反应混合物提供了另外的离子强度，这可以减少载体蛋白疏水区的暴露，从而减少蛋白聚集。
如本文所用，术语“多糖”(Ps)是指包括免疫和细菌疫苗领域中常用的任何抗原性糖元素(或抗原单位)，包括但不限于“糖”，“寡糖”，“多糖”，“脂糖”，“脂寡糖(LOS)”，“脂多糖(LPS)”，“糖基化物(glycosylate)”，“糖缀合物”，“衍生或活化的多糖或寡糖”，等等。除非另有说明，否则本文中使用的多糖命名法遵循IUB-IUPAC Joint Commission onBiochemical Nomenclature(JCBM)Recommendations 1980。参见JCBN,1982,J.Biol.Chem.257:3352-3354。
如本文所用，“免疫原性组合物”是指含有抗原的组合物，例如细菌荚膜多糖或多糖-蛋白缀合物，其具有在宿主例如哺乳动物中通过体液或细胞或两者介导引发免疫应答的能力。所述免疫原性组合物可通过呈递与细胞表面的MHC分子相关联的抗原而用于致敏宿主。另外，可以产生抗原特异性的T细胞或抗体，以便将来保护被免疫的宿主。因此，免疫原性组合物可以保护宿主免受细菌感染，降低严重性，或者可以保护宿主免受细菌感染导致的死亡。免疫原性组合物也可用于产生多克隆或单克隆抗体，其可用于赋予受试者被动免疫。免疫原性组合物也可用于产生具有功能性的抗体，如通过在动物功效模型中或通过调理吞噬细胞杀伤测定中细菌杀伤来测量。
如本文所用，与多糖有关的术语“分离的”是指使用本领域已知的纯化技术从纯化的多糖中分离肺炎链球菌血清型特异性荚膜多糖，包括使用离心、深度过滤、沉淀、超滤、活性炭处理、渗滤和/或柱色谱。通常，分离的多糖是指部分去除蛋白质、核酸和非特异性内源性多糖(C-多糖)。分离的多糖包含少于10％、8％、6％、4％或2％的蛋白质杂质和/或核酸。相对于类型特异性多糖，分离的多糖包含少于20％的C-多糖。
如本文所用，与细菌荚膜多糖有关的术语“纯化的”是指通过诸如离心、沉淀和超滤的方法从细胞裂解物中纯化多糖。通常，纯化的多糖是指去除细胞碎片和DNA。
如本文所用，术语“Mw”是指重均分子量(weight averaged molecular weight)，并且通常以Da或kDa表示。Mw考虑到较大的分子比较小的分子包含更多的聚合物样品总质量。Mw可以通过诸如静态光散射、小角度中子散射、X射线散射和沉降速度的技术来确定。
如本文所用，术语“Mn”是指数均分子量，并且通常以Da或kDa表示。Mn通过将样品的总重量除以样品中的分子数来计算，并且可以通过诸如凝胶渗透色谱法，通过(Mark-Houwink方程式)的粘度测定法，诸如蒸汽压渗透法的依数法，端基测定或质子NMR。Mw/Mn反映了多分散性。
如本文所用，术语“包括/包含”当与本发明的免疫原性组合物一起使用时是指包括任何其他成分(对于抗原混合物，受限于“由...组成”语言的限制)，例如佐剂和赋形剂。当与多价多糖-蛋白缀合物混合物一起使用时，术语“由...组成”是指具有那些特定的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物而没有来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的混合物。
除非另有说明，否则本文提供的所有范围均包括所列举的下限和上限。
荚膜多糖
可以通过本领域技术人员已知的标准技术来制备来自本发明血清型(例如血清型23A，24F和31)的肺炎链球菌的荚膜多糖。例如，可以从细菌中分离多糖，并且可以通过已知方法将多糖尺寸到一定程度(参见，例如，欧洲专利号EP497524和EP497525)；并且优选通过使用均质器或化学水解完成的微流化。在一个实施方式中，对应于每种多糖血清型的肺炎链球菌菌株在基于大豆的培养基中生长。然后通过标准步骤(包括离心、沉淀和超滤)纯化各种多糖。参见，例如，美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。可以对多糖进行尺寸(size)，以降低粘度和/或改善后续缀合产物的过滤性。可以使用乙酸进行化学水解。机械尺寸可使用高压均质剪切进行。
对于血清型12F，23A，24F和31，发现来自这些血清型的多糖均质化没有产生期望的特性。参见实施例3。酸水解可通过以下进行：将多糖批料加热至80-92℃(对于除12F以外的血清型，优选加热至90℃)，加入酸(例如乙酸，盐酸，磷酸，柠檬酸)至最终浓度50-200mM，然后孵育至少10分钟、20分钟、30分钟、40分钟或50分钟。在某些实施方式中，酸水解进行至多90分钟，至多150分钟或至多155分钟。在孵育期结束时，通过加入例如浓磷酸钾pH 7缓冲液至终浓度为400mM并冷却至≤22℃来中和该批料。将尺寸减小的多糖进行0.2微米过滤，然后浓缩并使用5-10kDa NMWC切向流超滤膜用水进行渗滤。
在一些实施方式中，缀合之前的纯化的多糖的分子量为5kDa至4,000kDa之间。分子量可以通过尺寸排阻色谱法(SEC)结合多角度光散射检测器(MALS)和折射率检测器(RI)来计算。在其他这样的实施方式中，多糖的平均分子量为10kDa至4,000kDa之间；50kDa至4,000kDa之间；50kDa至3,000kDa之间；50kDa至2,000kDa之间；50kDa至1,500kDa之间；50kDa至1,000kDa之间；50kDa至750kDa之间；50kDa至500kDa之间；100kDa至4,000kDa之间；100kDa至3,000kDa之间；100kDa和2,000kDa；100kDa至1,500kDa之间；100kDa至1,000kDa之间；100kDa至750kDa之间；100kDa至500kDa之间；100至400kDa之间；200kDa至4,000kDa之间；200kDa至3,000kDa之间；200kDa至2,000kDa之间；200kDa至1,500kDa之间；200kDa至1,000kDa之间；或200kDa和500kDa之间。在某些实施方式中，平均分子量为50-300kD。
在某些实施方式中，多糖具有10至10,000、10至5,000、10至4,000，或10至1000个重复单元。在某些方面，多糖具有20至400、30至300、40至200或50至100个重复单元。在某些方面，多糖具有40至900个重复单元。
载体蛋白
可以将来自本文所述的一种或多种肺炎链球菌血清型的多糖与载体蛋白缀合，以改善在儿童、老年人和/或免疫功能低下的受试者中的免疫原性。在多价组合物中使用一种以上血清型的情况下，可以用相同的载体蛋白或不同的载体蛋白制备血清型。通常将相同血清型的每种荚膜多糖缀合至相同的载体蛋白。
在本发明的特定实施方式中，CRM197用作载体蛋白。CRM197是白喉毒素(DT)的无毒变体。CRM197载体蛋白是DT的突变形式，通过片段A中第52位残基的单个氨基酸置换使其无毒。在一个实施方式中，从在酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培养基中生长的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)菌株C7(β197)的培养物中分离得到CRM197载体蛋白。在另一个实施方式中，根据美国专利号5,614,382中描述的方法重组制备CRM197。通常，通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法组合纯化CRM197。在一些实施方式中，使用PfenexExpression TechnologyTM(Pfenex Inc.，San Diego，CA)制备荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)中的CRM197。
其他合适的载体蛋白包括另外的灭活细菌毒素，例如DT、白喉类毒素片段B(DTFB)、TT(破伤风类毒素)或TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如国际专利申请公开号WO 2004/083251中所述)、大肠杆菌LT(热不稳定性肠毒素)、大肠杆菌ST(热稳定性肠毒素)和铜绿假单胞菌的外毒素A。也可以使用细菌外膜蛋白，例如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌表面蛋白A(PspA；参见国际申请专利公开号WO 02/091998)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)、来自A组或B组链球菌的C5a肽酶、或流感嗜血杆菌蛋白D、肺炎球菌溶血素(Kuo等，1995,Infect Immun 63:2706-13)，包括以某种方式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(参见国际专利申请公开号WO 04/081515)或dPLY-formol、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE和Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(参见国际专利申请公开号WO 01/98334和WO 03/54007)。其他蛋白，例如卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)、PorB(来自脑膜炎奈瑟氏菌)、PD(流感嗜血杆菌蛋白D；例如参见欧洲专利号EP 0 594 610B)或其免疫功能等同物、合成肽(参见欧洲专利号EP0378881和EP0427347)、热激蛋白(参见国际专利申请公开号WO93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白(参见国际专利申请公开号WO 98/58668和欧洲专利号EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(参见国际专利申请公开号WO 91/01146)、包含多个来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白(参见Falugi等,2001,Eur J Immunol 31:3816-3824)，例如N19蛋白(参见Baraldoi等,2004,InfectImmun 72:4884-7)、铁摄取蛋白(参见国际专利申请公开号WO 01/72337)、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(参见国际专利公开号WO 00/61761)和鞭毛蛋白(参见Ben-Yedidia等,1998,Immunol Lett 64:9)也可用作载体蛋白。
其他DT突变体也可以用作载体蛋白，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等,1973,J Biol Chem 218:3838-3844)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107，以及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992中描述的其他突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala 158突变为Gly以及在美国专利号4,709,017或美国专利号4,950,740中描述的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及在美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673中描述的其他突变；或在美国专利号5,843,711中描述的片段。
在使用多价疫苗的情况下，第二载体蛋白可以用于一种或多种抗原。第二载体蛋白优选是无毒且无反应原性并且可以足够量和纯度获得的蛋白。第二载体蛋白也与抗原例如肺炎链球菌多糖缀合或连接，以增强抗原的免疫原性。载体蛋白应符合标准的缀合程序。在一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的每个荚膜多糖与相同的第二载体蛋白缀合(例如，每个荚膜多糖分子与单个载体蛋白缀合)。在另一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的荚膜多糖与两个或更多个载体蛋白缀合(每个荚膜多糖分子与单个载体蛋白缀合)。在这样的实施方式中，相同血清型的每个荚膜多糖通常与相同的载体蛋白缀合。
缀合
通常采用在非质子溶剂例如DMSO中通过还原胺化将肺炎球菌多糖与蛋白缀合。通常将活化多糖(Ps)和蛋白(Pr)冻干，重悬于DMSO中，然后与加入的氰基硼氢化钠和硼氢化钠混合以实现缀合。下面提供了工艺细节。
对于许多肺炎球菌血清型，此过程产生的缀合物满足尺寸、赖氨酸消耗、游离多糖和游离蛋白的目标属性。但是，对于某些血清型，发现即使通过优化例如Ps和Pr浓度和缀合时间等缀合参数，使用DMSO方法较难实现目标的缀合物属性。参见实施例。如下所述，本发明提供了克服这些问题的几种解决方案。
在缀合之前，可以将纯化的多糖化学活化以使糖能够与载体蛋白反应以形成活化多糖。如本文所用，术语“活化多糖”是指如下所述已经被化学修饰以使得能够缀合至接头或载体蛋白的多糖。纯化的多糖可以任选地连接至接头。一旦被活化或连接到接头，每个荚膜多糖分别与载体蛋白缀合以形成糖缀合物。多糖缀合物可以通过已知的偶联技术制备。
在某些实施方式中，可以将多糖偶联至接头以形成多糖-接头中间体，其中接头的自由末端为酯基。因此，接头是其中至少一个末端是酯基的接头。选择另一个末端，以使其可以与多糖反应形成多糖-接头中间体。
在某些实施方式中，可以使用多糖中的伯胺基团将多糖偶联至接头。在这种情况下，接头通常在两个末端都具有酯基。这允许通过亲核酰基取代使酯基之一与多糖中的伯胺基反应来进行偶联。该反应产生多糖-接头中间体，其中多糖通过酰胺键连接至接头。因此，接头是双官能接头，其提供用于与多糖中的伯胺基反应的第一酯基和用于与载体分子中的伯胺基反应的第二酯基。典型的接头是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)。
在某些实施方式中，偶联还可以间接发生，即在偶联至接头之前通过用于衍生多糖的另外的接头进行。在多糖的还原末端使用羰基将多糖偶联至另外的接头。该偶联包括两个步骤：(a1)使羰基与另外的接头反应；和(a2)使另外的接头的自由末端与接头反应。在这些实施方式中，另外的接头通常在两个末端均具有伯胺基，从而允许步骤(a1)通过还原胺化使伯胺基之一与多糖中的羰基反应而进行。使用与多糖中的羰基反应的伯胺基。酰肼或羟氨基是合适的。相同的伯胺基通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外接头中间体，其中多糖通过C-N键与另外的接头偶联。
在某些实施方式中，可以使用多糖中的不同基团，特别是羧基，将多糖偶联至另外的接头。该偶联包括两个步骤：(a1)使基团与另外的接头反应；和(a2)使另外的接头的自由末端与接头反应。在这种情况下，所述另外的接头通常在两个末端均具有伯胺基，从而允许步骤(a1)通过EDAC活化使所述伯胺基之一与多糖中的羧基反应而进行。使用与多糖中的EDAC活化的羧基反应的伯胺基。酰肼基是合适的。相同的伯胺基通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外的接头中间体，其中多糖通过酰胺键与另外的接头偶联。
在一个实施方式中，多糖的化学活化和随后通过还原胺化与载体蛋白的缀合可以通过美国专利号4,365,170、4,673,574和4,902,506，美国专利申请公开号2006/0228380、2007/184072、2007/0231340和2007/0184071，和国际专利申请公开号WO2006/110381，WO2008/079653和WO2008/143709中所描述的方法实现。化学反应可能需要在氧化剂存在下，通过用使伯羟基变为醛的任何氧化剂(例如TEMPO)的反应使肺炎球菌多糖活化(WO2104/097099)，或使两个邻(vicinal)羟基反应为醛，例如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸)。反应导致碳水化合物的伯羟基的随机氧化或碳水化合物的邻羟基的随机氧化裂解，形成反应性醛基。
在该实施方式中，通过直接胺化还原胺化至蛋白质的赖氨酰基来偶联至载体蛋白。例如，通过使活化多糖和载体蛋白的混合物与还原剂例如氰基硼氢化钠反应，任选地在用于水性缀合的镍的存在下进行缀合。缀合反应可以在水溶液或二甲基亚砜(DMSO)的存在下进行。参见，例如，美国专利申请公开号US2015/0231270和US2011/0195086以及欧洲专利号EP 0471177 B1。然后通过加入强还原剂(例如硼氢化钠)将未反应的醛封端。
还原胺化涉及两个步骤，(1)多糖的氧化以形成反应性醛，(2)还原在活化多糖与载体蛋白之间形成的亚胺(席夫碱)以形成稳定的胺共轭键。在氧化之前，任选地将多糖尺寸减小。可以采用机械方法(例如均质化)或化学水解。可以使用乙酸进行化学水解。氧化步骤可涉及与高碘酸盐反应。为了本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸。该术语还包括偏高碘酸盐(metaperiodate)(IO4 -)和原高碘酸盐(orthoperiodate)(IO6 5-)，并且包括高碘酸盐的各种盐(例如高碘酸钠和高碘酸钾)。在一个实施方式中，在偏高碘酸盐的存在下，优选在高碘酸钠(NaIO4)的存在下，氧化荚膜多糖。在另一个实施方式中，在原高碘酸盐存在下，优选在高碘酸存在下，氧化荚膜多糖。
在一个实施方式中，氧化剂(oxidizing agent)是稳定的硝酰基或硝基氧(nitroxide)自由基化合物，例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物，在氧化剂(oxidant)存在下选择性氧化伯羟基(例如，国际专利申请公开号WO 2014/097099所述)。在所述反应中，在催化循环中，实际的氧化剂是N-氧代铵盐。在一方面，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。在一个方面，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物带有TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷基氧基)部分。在一个方面，所述稳定的硝酰基自由基化合物是TEMPO或其衍生物。在一个方面，所述氧化剂是带有N-卤代部分的分子。在一个方面，所述氧化剂选自N-氯琥珀酰亚胺，N-溴琥珀酰亚胺，N-碘琥珀酰亚胺，二氯异氰尿酸，1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮，二溴异氰尿酸，1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮，二碘异氰尿酸和1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮。优选地，所述氧化剂是N-氯代琥珀酰亚胺。
在某些方面，氧化剂是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)游离自由基和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)作为助氧化剂(如国际专利申请公开号WO2014/097099中所述)。因此，在一个方面，来自肺炎链球菌的糖缀合物可通过包括以下步骤的方法获得：a)使糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应产生活化的糖；b)使活化的糖与包含一个或多个胺基的载体蛋白反应(所述方法下文称为“TEMPO/NCS-还原胺化”)。
任选地，通过添加淬灭剂来淬灭氧化反应。淬灭剂可以选自邻二醇，1,2-氨基醇，氨基酸，谷胱甘肽，亚硫酸盐，硫酸氢盐，连二亚硫酸盐，偏亚硫酸氢盐，硫代硫酸盐，亚磷酸盐，次磷酸盐或亚磷酸(例如甘油，乙二醇，丙-1,2-二醇，丁-1,2二醇或丁-2,3-二醇，抗坏血酸)。
还原胺化的缀合过程的第二步是使用还原剂还原活化多糖和载体蛋白之间的亚胺(席夫碱)键以形成稳定的共轭键(所谓的还原胺化)。合适的还原剂包括氰基硼氢化物(例如氰基硼氢化钠)或硼氢化钠。在一个实施方式中，还原剂是氰基硼氢化钠。
在本发明方法的某些实施方式中，还原胺化反应在非质子溶剂(或非质子溶剂的混合物)中进行。在一个实施方式中，还原反应在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。如果冻干，则可以使用DMSO或DMF溶剂重构活化多糖和载体蛋白。在一个实施方式中，非质子溶剂是DMSO。
蔗糖：Ps的质量比为25倍时，已使用至多5％的蔗糖以在冻干后在DMSO中实现最佳溶解。参见例如国际专利申请公开号WO2017/013548。对于从血清型3、8和24F获得的肺炎链球菌多糖，发现在非质子溶剂中的蛋白缀合之前，需要更高水平的蔗糖以充分溶解多糖。在一些实施方式中，对于这些血清型，使用水溶液中大于5％的蔗糖浓度。在一些实施方式中，对于这些血清型，使用大于25倍的蔗糖∶Ps质量比，例如至少30倍，至少35倍或至少40倍。在一些实施方式中，蔗糖与多糖的冻干前质量比大于或等于30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50或更大。可以使用其他糖，例如海藻糖或甘露醇。
还发现无论是在水溶液中还是在非质子溶剂中，在蛋白缀合过程中氯化钠(NaCl)的存在均可用于降低游离蛋白水平，增加缀合物分子量，降低游离多糖和/或增加从15A，16F，17F，20，23A，24F和35B血清型纯化的肺炎链球菌多糖的赖氨酸消耗。因此，本发明可以保护用于制备多糖蛋白缀合物的方法，所述方法包括使第一溶液中的肺炎链球菌多糖与第二溶液中的蛋白反应以形成第三溶液，其中多糖蛋白缀合物反应发生以形成多糖蛋白缀合物，其中第三溶液包含至少1mM盐。
氯化钠可以在缀合过程中的任何地方添加，从在缀合反应之前制备用于冻干的多糖和蛋白到缀合反应本身，例如在席夫碱反应期间或在氰基硼氢化钠存在下的还原胺化过程中。在一些实施方式中，将多糖和蛋白分别冻干，并且可以将盐加入到多糖溶液(第一溶液)或蛋白溶液(第二溶液)或两者中。在一些实施方式中，将多糖和蛋白从添加了盐的相同溶液中冻干(即，第一溶液和第二溶液相同)。在一些实施方式中，将盐添加到其中发生多糖蛋白缀合反应的溶液(即第三溶液)中。
可以使用其他盐，例如其他钠盐，钾盐例如氯化钾，锂盐，镁盐和钙盐。在一些实施方式中，在氰基硼氢化钠的存在下，在席夫碱反应期间或在还原胺化反应期间，将1mM至100mM的氯化钠添加至多糖的溶解溶液中。在一些实施方式中，使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或10mM氯化钠。在这些实施方式的一些方面，使用不超过100、75或50mM的氯化钠。
在还原反应结束时，缀合物中可能残留有未反应的醛基，可以使用合适的封端剂或淬灭剂将其封端或淬灭。在一个实施方式中，该封端剂或淬灭剂是硼氢化钠(NaBH4)。合适的替代物包括在布朗斯台德酸或路易斯酸存在下的三乙酰氧基硼氢化钠或硼氢化钠或硼氢化锌，胺硼烷，例如吡啶硼烷，2-吡啶啉硼烷，2,6-二硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，t-BuMe'PrN-BH3，苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)或硼氢化物交换树脂。
在非质子溶剂中使用还原胺化制备的糖缀合物通常用于多价肺炎球菌蛋白缀合物疫苗中。因此，在某些实施方式中，对于不是所有血清型都在非质子溶剂中制备的多价组合物，其余血清型的还原反应是在水性溶剂中进行(例如，选自PBS(磷酸盐缓冲盐水)，MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，HEPES，(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，Bis-tris，ADA(N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸)，PIPES(哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸))，MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙烷磺酸)，BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，DIPSO(3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙烷-1-磺酸)，MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)，HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-羟基丙磺酸))，POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙烷磺酸))，TEA(三乙醇胺)，EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸酸)，N-二甘氨酸或HEPB，pH在6.0和8.5，7.0和8.0或7.0和7.5之间)。
在一些实施方式中，本发明的糖缀合物包含分子量为10kDa至10,000kDa之间的多糖。在其他这样的实施方式中，多糖的分子量在25kDa和5,000kDa之间。在其他这样的实施方式中，多糖的分子量在50kDa和1,000kDa之间。在其他这样的实施方式中，多糖的分子量在70kDa和900kDa之间。在其他这样的实施方式中，多糖的分子量在100kDa和800kDa之间。在其他这样的实施方式中，多糖的分子量在200kDa和600kDa之间。在进一步的这样的实施方式中，多糖的分子量为100kDa至1000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1,000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；或500kDa至600kDa。在采用酸水解的某些实施方式中，多糖的分子量为10kDa至200kDa，25kDa至200kDa，50kDa至200kDa，10kDa至150kDa，25kDa至150kDa或50kDa至150kDa。
合适的替代化学方法包括用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸酯(CDAP)活化糖以形成氰酸酯。因此，活化的糖可以直接或通过间隔子(接头)基团与载体蛋白上的氨基偶联。例如，间隔子可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化的多糖，其可以通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如，使用GMBS)或卤代乙酰化的载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺(例如盐酸碘乙乙酰胺)或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯或SIAB，或SIA或SBAP))反应后获得的硫醚键与载体偶联。优选地，将氰酸酯(任选地通过CDAP化学方法制得)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，并且使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学方法经由蛋白载体上的羧基将氨基衍生的糖缀合至载体蛋白。在国际专利申请公开号WO 93/15760，WO 95/08348和WO 96/29094；和Chu等,1983,Infect.Immunity 40:245-256中描述了这样的缀合物。
其他合适的技术使用碳二亚胺，酰肼，活性酯，降硼烷，对硝基苯甲酸，N-羟基琥珀酰亚胺，S-NHS，EDC，TSTU。在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述了许多。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应形成(参见Bethell等,1979,J.Biol.Chem.254:2572-4；Hearn等,1981,J.Chromatogr.218:509-18)，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可能涉及将端基(anomeric terminus)还原为伯羟基，任选地伯羟基的保护/脱保护，伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基偶联。
缀合(还原反应和任选的加帽或淬灭反应)后，可以通过技术人员已知的多种技术纯化糖缀合物(相对于多糖-蛋白缀合物的量富集)。这些技术包括渗析，浓缩/渗滤操作，切向流过滤，超滤，沉淀/洗脱，柱色谱(离子交换色谱，多峰离子交换色谱，DEAE或疏水相互作用色谱)和深度过滤。参见例如美国专利号6,146,902。在一个实施方式中，通过渗滤或离子交换色谱或尺寸排阻色谱纯化糖缀合物。
表征本发明的糖缀合物的一种方法是通过载体蛋白(例如，CRM197)中变得与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可以表征为一系列缀合的赖氨酸(缀合度)。由于与多糖的共价键合，对载体蛋白进行赖氨酸修饰的证据可以使用本领域技术人员已知的常规方法通过氨基酸分析获得。与用于产生缀合物材料的载体蛋白起始材料相比，缀合导致回收的赖氨酸残基数量减少。在一个优选的实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度为2至15之间，2至13之间，2至10之间，2至8之间，2至6之间，2至5之间，2至4之间，3与15之间，3与13之间，3与10之间，3与8之间，3与6之间，3与5之间，3与4之间，5与15之间，5与10之间，8与15之间，8至12之间，10至15之间，或10至12之间。在一个实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度为约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14或约15。在一个优选的实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度在7至12之间。在一些这样的实施方式中，载体蛋白是CRM197。
本发明的糖缀合物还可以通过糖与载体蛋白的比率(重量/重量)来表征。在一些实施方式中，糖缀合物中多糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5至3.0(例如，约0.5，约0.6，约0.7，约0.8，约0.9，约1.0，约1.1，约1.2，约1.3，约1.4，约1.5，约1.6，约1.7，约1.8，约1.9，约2.0，约2.1，约2.2，约2.3，约2.4，约2.5，约2.6，约2.7，约2.8，约2.9，或约3.0)。在其他实施方式中，糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5至2.0，0.5至1.5，0.8至1.2，0.5至1.0，1.0至1.5或1.0至2.0。在其他实施方式中，糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.8至1.2。在一个优选的实施方式中，缀合物中荚膜多糖与载体蛋白的比率为1-2。在一些这样的实施方式中，载体蛋白为CRM197。本发明的糖缀合物和免疫原性组合物可包含未与载体蛋白共价缀合但仍存在于糖缀合物组合物中的游离糖。游离糖可以与糖缀合物非共价关联(即，非共价结合，吸附或捕获于其中或与之捕获)。
在一个优选的实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约25％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约20％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约15％的游离多糖。
多价多糖-蛋白缀合疫苗
使用本发明方法制备的多糖-蛋白缀合物可用于多价多糖-蛋白缀合物疫苗。在某些实施方式中，多价多糖-蛋白缀合物疫苗包含来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18B，18C，19A，19F，20，21、22A，22F，23A，23B，23F，24B，24F，27，28A，31，33F，34，35A，35B，35F和38中一种或多种的肺炎链球菌荚膜多糖作为游离多糖，多糖-蛋白缀合物的组分或其组合提供多价肺炎球菌疫苗。在某些实施方式中，免疫原性组合物包含各自与一种或多种载体蛋白缀合的来自2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43或44肺炎链球菌血清型的肺炎链球菌荚膜多糖，基本由以上组成，或由以上组成。优选地，来自特定血清型的糖不与一种以上载体蛋白缀合。
在纯化各种糖缀合物之后，将它们复合以配制本发明的免疫原性组合物。这些肺炎球菌缀合物是通过分别的方法制备的，并大量配制成单剂量制剂。
药物/疫苗组合物
本发明还提供了组合物，其包括药物、免疫原性和疫苗组合物，其包含上述任何多糖肺炎链球菌血清型组合以及药学上可接受的载体和佐剂，基本上由以上组成，或由以上组成。
多糖-蛋白缀合物的配制可以使用本领域公认的方法来完成。例如，可以将各自的肺炎球菌缀合物与生理上可接受的载剂一起配制以制备组合物。这样的载剂的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)和葡萄糖溶液。
在优选的制剂中，疫苗组合物在含氯化钠的L-组氨酸缓冲液中配制。
如本文所定义，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。单独施用时，免疫佐剂可以增强对免疫原性弱的抗原的免疫应答，例如，不诱导抗体滴度或细胞介导的免疫应答或诱导弱的抗体滴度或细胞介导的免疫应答，增加抗体对抗原的滴度和/或降低有效实现个体免疫应答的抗原剂量。因此，佐剂通常用以增强免疫应答，并且是技术人员众所周知的。增强组合物有效性的合适佐剂包括但不限于：
(1)铝盐(铝)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；
(2)水包油乳剂制剂(有或没有其他特定的免疫刺激剂，例如鼠酰胺基肽(以下定义)或细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59(国际专利申请公开号WO 90/14837)，其包含5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(任选地包含各种量的MTP-PE)，并使用微射流仪，例如110Y型微射流仪(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗，(b)SAF，其包含10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％pluronic嵌段的聚合物L121和thr-MDP，它们被微流化成亚微米乳剂或涡流产生更大粒径的乳剂，(c)RibiTM佐剂体系(RAS)，(Corixa，Hamilton，MT)，其包含2％角鲨烯、0.2％Tween 80和一种或多种选自以下的细菌细胞壁成分：美国专利号4,912,094中描述的3-O-脱酰基的单磷脂A(MPLTM)、海藻糖二甲酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(d)Montanide ISA；
(3)可以使用皂苷佐剂，例如Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics，Framingham，MA)(参见例如，美国专利号5,057,540)，或由其产生的颗粒，例如ISCOM(由胆固醇、皂素、磷脂和两亲性蛋白组合形成的免疫刺激复合物)和
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(与ISCOM具有基本相同的结构，但没有蛋白)；
(4)细菌脂多糖、合成脂质A类似物，例如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得并在美国专利号6,113,918中描述；一种AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰]-2-[(R)-3-十四烷氧基氧基十四烷酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，也称为529(以前称为RC529)，其被配制成水性形式或稳定的乳剂；
(5)合成的多核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；
(6)细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；和
(7)补体，例如补体成分C3d的三聚体。
在另一个实施方式中，佐剂是2种、3种或更多种上述佐剂的混合物，例如SBAS2(一种水包油乳液，也包含3-脱酰基单磷酰基脂质A和QS21)。
胞壁酰基肽包括但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在某些实施方式中，佐剂是铝盐。铝盐佐剂可以是明矾沉淀的疫苗或明矾吸附的疫苗。铝盐佐剂在本领域中是众所周知的，并且描述于例如Harlow,E.and D.Lane(1988；Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)和Nicklas,W.(1992；Aluminum salts.Research in Immunology 143:489-493)。铝盐包括但不限于水合氧化铝、氧化铝水合物、三水合氧化铝(ATH)、水合铝、三水合铝、
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Superfos、
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氢氧化铝(III)、羟基磷酸铝(磷酸铝助剂(APA))、无定形氧化铝、三水合氧化铝或三羟基铝。
APA是羟基磷酸铝的水性悬浮液。通过将氯化铝和磷酸钠以1：1的体积比混合以沉淀羟基磷酸铝来制造APA。在共混过程后，用高剪切混合器减小物料的尺寸，以获得单分散的粒径分布。然后生理盐水对产品进行渗滤，并进行蒸汽灭菌。
在某些实施方式中，使用市售的Al(OH)3(例如，
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或丹麦/AccurateChemical and Scientific Co.，Westbury，NY的Superhydros或Superfos)吸附蛋白质。在另一个实施方式中，蛋白质的吸附取决于蛋白质的pI(等电pH)和培养基的pH。pI较低的蛋白质比pI较高的蛋白质更强烈地吸附带正电的铝离子。铝盐可以建立一个Ag储备库，该储备库会在2-3周内缓慢释放，参与巨噬细胞的非特异性激活和补体激活，和/或刺激先天免疫机制(可能通过刺激尿酸)。参见例如，Lambrecht等,2009,Curr Opin Immunol 21:23。
通常将单价大量水性缀合物混合在一起并稀释。稀释后，将批料进行无菌过滤。无菌添加磷酸铝佐剂，以使除血清型6B(将其稀释至目标8μg/mL)外的所有肺炎链球菌血清型的终浓度均为4μg/mL，铝的终浓度为250μg/mL。将佐剂配制好的批次装入小瓶或注射器中。
在某些实施方式中，佐剂是含CpG的核苷酸序列，例如含CpG的寡核苷酸，特别是含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在另一个实施方式中，佐剂是ODN 1826，其可以获自ColeyPharmaceutical Group。
“含CpG的核苷酸”、“含CpG的寡核苷酸”、“CpG寡核苷酸”和类似术语是指长度为6-50个核苷酸且包含未甲基化的CpG部分的核苷酸分子。参见例如，Wang等，2003，Vaccine21：4297。在另一个实施方式中，包括任何其他本领域可接受的对该术语的定义。含CpG的寡核苷酸包括使用任何合成的核苷间键、修饰的碱基和/或修饰的糖的修饰的寡核苷酸。
使用CpG寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且描述于例如Sur等,1999,JImmunol.162:6284-93；Verthelyi,2006,Methods Mol Med.127:139-58；和Yasuda等,2006,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:89-110。
施用/剂量
通过经由全身或粘膜途径施用疫苗，本文所述的组合物和制剂可用于保护或治疗易于感染(例如肺炎球菌感染)的人。例如，本文所述的组合物和制剂可以用于诱导针对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，所述方法包括向人施用免疫有效量的本文所述的免疫原性组合物或制剂。在另一个实例中，本文所述的组合物和制剂可以用于疫苗接种人以抵抗肺炎球菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：向人施用免疫有效量的本文所述的免疫原性组合物或制剂。
可以通过包括在受试者中观察适当的免疫应答的标准研究确定特定疫苗的成分的最佳量。例如，在另一个实施方式中，通过从动物研究到人类数据的外推法确定用于人类疫苗接种的剂量。在另一个实施方式中，剂量根据经验确定。
本发明的组合物的“有效量”是指在随后的攻击过程中引发显著降低了微生物例如肺炎链球菌的感染可能性或严重性的抗体的剂量。
使用本文所述的组合物和制剂的方法可用于预防和/或减少由微生物例如肺炎链球菌引起的原发性临床综合症，包括侵入性感染(脑膜炎，肺炎和菌血症)和非侵入性感染(急性中耳炎和鼻窦炎)。
本文所述的组合物和制剂的施用可以包括以下一种或多种：通过肌内，腹膜内，皮内或皮下途径注射；或通过粘膜施用到口腔/消化道，呼吸道或泌尿生殖道。在一个实施方式中，鼻内施用用于治疗肺炎或中耳炎(因为可以更有效地预防肺炎球菌的鼻咽运送，因此可以在早期减轻感染)。
选择每种疫苗剂量中的缀合物的量作为诱导免疫保护应答而无明显不利影响的量。这样的量可以根据肺炎球菌血清型而变化。通常，对于基于多糖的缀合物，每个剂量将包含0.1至100μg的每种多糖，特别是0.1至10μg，并且更特别地是1至5μg。例如，每个剂量可包含100、150、200、250、300、400、500或750ng或1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90或100μg的每种多糖。
可以通过包括在受试者中观察适当的免疫应答的标准研究确定特定疫苗的成分最佳量。例如，在另一个实施方式中，通过从动物研究到人类数据的外推法确定用于人类疫苗接种的剂量。在另一个实施方式中，剂量根据经验确定。
在一个实施方式中，铝盐的剂量为10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700μg，或1、1.2、1.5、2、3、5mg或更多。在另一个实施方式中，上述铝盐的剂量是基于每微克重组蛋白。
通常，每0.5ml剂量配制为包含：2μg的每种肺炎链球菌多糖，但血清型6B多糖是4μg；约32μg CRM197载体蛋白(例如32μg±5μg，±3μg，±2μg或±1μg)；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；氯化钠和L-组氨酸缓冲液。氯化钠浓度为约150mM(例如150mM±25mM，±20mM，±15mM，±10mM或±5mM)和约20mM(例如20mM±5mM，±2.5mM，±2mM，±1mM或±0.5mM)L-组氨酸缓冲液。
根据使用本文所述的组合物或制剂的任何方法，并且在一个实施方式中，所述受试者是人。在某些实施方式中，人患者是婴儿(小于1岁)，学步儿童(约12至24个月)或幼儿(约2至5岁)。在其他实施方式中，人患者是老年患者(＞65岁)。本发明的组合物也适用于年龄较大的儿童、青少年和成人(例如18至45岁或18至65岁)。
在使用本文所述的组合物或制剂的方法的一个实施方式中，将组合物或制剂作为单次接种施用。在另一个实施方式中，将所述组合物或制剂施用两次、三次或四次或更多次，并充分间隔开。例如，组合物或制剂可以1、2、3、4、5或6个月的间隔或其任何组合施用。免疫时间表可以遵循针对肺炎球菌疫苗指定的时间表。例如，针对由肺炎链球菌引起的侵袭性疾病的婴幼儿的常规时间表是2、4、6和12-15个月大。因此，在一个优选的实施方式中，该组合物在2、4、6和12-15个月大时以4剂量系列施用。
本文所述的组合物还可包含一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白。适于包含的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中鉴定的那些。
制剂
可以通过本领域技术人员已知的一种或多种方法施用本文所述的组合物，例如肠胃外、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、腹膜内，并据此配制。
在一个实施方式中，本文所述的组合物通过表皮注射、肌内注射、静脉内、动脉内、皮下注射或呼吸内粘膜注射液体制剂施用。用于注射的液体制剂包括溶液等。
组合物可以配制成单剂量小瓶、多剂量小瓶或预填充注射器。
在另一个实施方式中，组合物经口服施用，并因此被配制成适于口服施用的形式，即固体或液体制剂。固体口服制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒、小丸等。液体口服制剂包括溶液、悬浮液、分散剂、乳剂、油剂等。
用于液体制剂的药学上可接受的载体是水性或非水性溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、橄榄油、葵花籽油、鱼肝油，另一种海产油或来自牛奶或鸡蛋的脂质。
药物组合物可以是等渗的、低渗的或高渗的。然而，通常优选用于输注或注射的药物组合物在施用时基本上是等渗的。因此，为了储存，药物组合物可以优选是等渗的或高渗的。如果药物组合物是高渗性的，则可以在施用前将其稀释成等渗溶液。
等渗剂可以是离子等渗剂(例如盐)或非离子等渗剂(例如碳水化合物)。离子等渗剂的实例包括但不限于NaCl，CaCl2，KCl和MgCl2。非离子等渗剂的实例包括但不限于蔗糖，海藻糖，甘露醇，山梨糖醇和甘油。
还优选至少一种药学上可接受的添加剂是缓冲剂。出于某些目的，例如，当药物组合物用于输注或注射时，通常期望该组合物包含缓冲剂，该缓冲剂能够将溶液缓冲至4-10，例如5-9，例如6-8的pH。
缓冲液可以例如选自Tris、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、L-组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲液。
缓冲液还可以例如选自用于肠胃外用途的USP兼容缓冲液，特别是当药物制剂用于肠胃外用途时。例如，缓冲液可以选自一元酸，例如乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甘油和乳酸；二元酸，例如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸，多元酸，例如柠檬酸和磷酸；和碱，例如氨水、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和Tris。
肠胃外载剂(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发性油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。实例是添加或不添加表面活性剂和其他药学上可接受的佐剂的无菌液体，例如水和油。通常，水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液，乙二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、聚山梨醇酯80(PS-80)、聚山梨醇酯20(PS-20)和泊洛沙姆188(P188)是优选的液体载体，特别是用于注射溶液。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、橄榄油、葵花籽油、鱼肝油，另一种海产(marine)油或来自牛奶或鸡蛋的脂质。
制剂还可包含表面活性剂。优选的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂(通常称为Tween)，特别是PS-20和PS-80；以DOWFAXTM商标出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，例如线性EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚醇，其乙氧基(氧基-1,2-乙二基)的重复数目可以变化，其中辛苯聚醇-9(Triton X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)特别令人感兴趣；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物，例如TergitolTM NP系列；衍生自月桂基、鲸蜡基、硬脂基和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙二醇单月桂基醚(Brij 30)；脱水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。用于包括在乳剂中的优选表面活性剂是PS-20或PS-80。
可以使用表面活性剂的混合物，例如PS-80/Span 85混合物。聚氧乙烯脱水山梨醇酯例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(PS-80)和辛醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的组合也是合适的。另一种有用的组合包括月桂酸酯9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛醇。
表面活性剂的优选量为：聚氧乙烯脱水山梨醇酯(例如PS-80)为0.01-1％w/v，特别是约0.1％w/v；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如Triton X-100或Triton系列中的其他去污剂)为0.001-0.1％w/v，特别是0.005-0.02％w/v；聚氧乙烯醚(例如月桂酸酯9)为0.1-20％w/v，优选0.1-10％w/v，特别是0.1-1％w/v或约0.5％w/v。
在某些实施方式中，所述组合物基本上由L-组氨酸(20mM)，盐水(150mM)和0.2％w/v PS-20(在5.8的pH下)与250μg/mL的APA(磷酸铝佐剂)组成。在模拟制备过程中以及在使用初级包装运输的过程中，在控制制剂聚集中在存在PS-20或PS-80的情况下，PS-20的范围可以为0.005％至0.1％w/v。该方法由以下组成：在L-组氨酸、氯化钠和PS-20中混合至多44种肺炎链球菌多糖血清型的共混物，然后将这种共混物质与APA和氯化钠混合，并添加或不添加抗菌防腐剂。
表面活性剂的选择可能需要针对不同的药物产品和药物物质进行优化。对于含有15种或更多种肺炎链球菌多糖血清型的多价疫苗，PS-20和P188是优选的。用于制备缀合物的化学方法的选择也会影响制剂的稳定性。特别地，如下文所例举的，在水性或DMSO溶剂中制备并组合为多价组合物的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物在稳定性方面存在显著差异，取决于用于制剂的特定表面活性剂体系。
对于本文所述的制剂，泊洛沙姆的分子量通常为1,100Da至1,7400Da，7,500Da至15,000Da，或7,500Da至10,000Da。泊洛沙姆可选自泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。泊洛沙姆在本发明制剂中的最终浓度为0.001至5％w/v，或0.025至1％w/v。包含泊洛沙姆的表面活性剂体系必须还包含多元醇。在某些方面，多元醇为丙二醇，且终浓度为1至20％w/v。在某些方面，多元醇为聚乙二醇400，且终浓度为1至20％w/v。
用于制剂的合适的多元醇是聚合多元醇，特别是聚醚二醇，包括但不限于丙二醇和聚乙二醇，聚乙二醇单甲基醚。丙二醇的单体分子量范围为～425Da至～2,700Da。也可以获得分子量为～200Da至～35,000Da的聚乙二醇和聚乙二醇单甲醚，包括但不限于PEG200，PEG300，PEG400，PEG1000，PEG MME 550，PEG MME 600，PEG MME 2000，PEG MME 3350和PEGMME4000。优选的聚乙二醇是聚乙二醇400。制剂中多元醇的最终浓度可以为1至20％w/v或6至20％w/v。
制剂还包含pH缓冲盐水溶液。缓冲液可以例如选自Tris、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、L-组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)和三乙醇胺缓冲液。缓冲液能够将溶液缓冲至pH为4-10、5.2-7.5或5.8-7.0的范围。在某些方面，缓冲液选自磷酸盐、琥珀酸盐、L-组氨酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸盐或柠檬酸盐。缓冲液还可以例如选自肠胃外使用的USP兼容缓冲液，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。缓冲液的浓度范围为1mM-50mM或5mM-50mM。在某些方面，缓冲液是终浓度为5mM-50mM的L-组氨酸，或终浓度为1mM-10mM的琥珀酸盐。在某些方面，L-组氨酸的终浓度为20mM±2mM。
尽管盐溶液(即，含有NaCl的溶液)是优选的，但其他适合制剂的盐包括但不限于CaCl2，KCl和MgCl2及其组合。可以使用非离子等渗剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇和甘油来代替盐。合适的盐范围包括但不限于25mM至500mM或40mM至170mM。在一个方面，盐水是NaCl，任选地以20mM至170mM的浓度存在。
在一个优选的实施方式中，所述制剂包含含有氯化钠的L-组氨酸缓冲液。
在另一个实施方式中，药物组合物以控释系统递送。例如，可以使用静脉内输注、透皮贴剂，脂质体或其他施用方式来施用。在另一个实施方式中，使用聚合物材料，例如在微球中或在植入物中。
本文所述的组合物还可包含一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白。适于包含的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中鉴定的那些。
分析方法
使用HPSEC/UV/MALS/RI测定分析缀合物的分子量和浓度
注入缀合物样品，并通过高性能尺寸排阻色谱法(HPSEC)进行分离。检测是通过串联的紫外线(UV)、多角度光散射(MALS)和折射率(RI)检测器完成的。使用消光系数由UV280计算蛋白质浓度。使用dn/dc因子(这是溶液折射率的变化，溶质浓度的变化以mL/g表示)从RI信号(由蛋白质和多糖共同贡献)中反褶积多糖浓度。样品的平均分子量通过Astra软件(Wyatt Technology Corporation,Santa Barbara,CA)使用整个样品峰上测得的浓度和光散射信息进行计算。多分散分子的分子量平均值有多种形式。例如，数均分子量Mn，重均分子量Mw和z均分子量Mz(Molecules,2015,20:10313-10341)。除非另有说明，否则在整个说明书中使用的术语“分子量”是重均分子量。
测定缀合蛋白中赖氨酸的消耗，以衡量多糖和载体蛋白之间共价连接的数量
Waters AccQ-Tag氨基酸分析(AAA)用于测量缀合物样品中的缀合程度。在Eldex工作站中使用气相酸水解法水解样品，以将载体蛋白分解成其组分氨基酸。游离氨基酸使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生化。然后使用UPLC在C18色谱柱上进行紫外检测，分析衍生样品。使用赖氨酸以外的代表性氨基酸获得平均蛋白质浓度。缀合过程中赖氨酸的消耗量(即赖氨酸损失)由缀合物中赖氨酸的平均测得量与起始蛋白中预期赖氨酸的量之差确定。
游离多糖的测试
缀合物样品中的游离多糖(即未与CRM197缀合的多糖)是通过首先将游离蛋白和缀合物与脱氧胆酸盐(DOC)和盐酸沉淀而测定的。然后滤出沉淀物，并通过HPSEC/UV/MALS/RI分析滤液中游离多糖的浓度。游离多糖计算为通过HPSEC/UV/MALS/RI测量的总多糖的百分比。
游离蛋白的测试
通过胶束电动色谱(MEKC)模式下的毛细管电泳分离缀合物样品中的游离多糖，多糖-CRM197缀合物和游离CRM197。简而言之，将样品与含有25mM硼酸盐，100mM SDS，pH 9.3的MEKC运行缓冲液混合，并在预处理的裸露石英毛细管中分离。在200nm处监测分离，并用CRM197标准曲线对游离CRM197进行定量。游离蛋白结果报告为通过HPSEC/UV/MALS/RI方法测定的总蛋白含量的百分比。
已经参考所附描述和附图描述了本发明的各种实施方式，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方式，并且在不背离所附权利要求书中所限定的本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中进行各种改变和修改。
下列实施例说明但不限制本发明。
实施例
实施例1：肺炎链球菌荚膜多糖的制备
培养肺炎球菌的方法是本领域众所周知的。参见例如Chase，1967，Methods ofImmunology and Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法也是本领域众所周知的。参见例如欧洲专利号EP 0 497 524 B1。下文所述的方法通常遵循欧洲专利号EP 0497 524 B1中所述的方法，并且通常适用于所有肺炎球菌血清型，除非被特别修饰。
肺炎球菌血清型3，8，12F的分离株(isolate)是从宾夕法尼亚大学(Dr.RobertAustrian博士)获得的。肺炎球菌血清型15A，16F，23A，24F，35B的分离株是从MerckCulture Collection获得的。肺炎球菌血清型23B和31的分离株是从疾病控制和预防中心(Atlanta，GA)获得的。肺炎球菌血清型17F的分离株是从FDA生物制剂办公室(FDA Officeof Biologics)(John Robbins博士)获得的。肺炎球菌血清型20的分离株是从ATCC获得的。如果需要，可以使用特定的抗血清根据Quelling反应区分亚型。参见例如，美国专利号5,847,112。通过在琼脂平板上分两个阶段连续铺板来进一步克隆分离所获得的分离株，琼脂平板由无动物成分的培养基组成，所述培养基含有大豆蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖而不含血红素(hemin)。使用含有大豆蛋白胨、酵母提取物、HEPES、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钾、葡萄糖和甘油的无动物成分培养基在液体培养中进一步扩增每种血清型的克隆分离株以制备预主细胞库(pre-master cell banks)。
每种血清型的肺炎球菌多糖的产生由细胞扩增和分批生产发酵组成，然后在下游纯化前进行化学灭活。使用装有预先消毒的无动物成分的生长培养基的摇瓶或培养瓶扩增来自各种血清型的解冻的细胞库小瓶，所述培养基含有大豆蛋白胨或大豆蛋白胨超滤液，酵母提取物或酵母提取物超滤液，HEPES，氯化钠，碳酸氢钠，磷酸钾和葡萄糖。细胞扩增培养物在密封的摇瓶或培养瓶中生长，以在温度和搅拌控制下最小化气体交换。在达到指定的培养密度后(通过600nm的光密度测量)，将一部分细胞扩增培养物转移至含有预先灭菌的无动物成分的生长培养基的生产发酵罐中，所述培养基含有大豆蛋白胨或大豆蛋白胨超滤液，酵母提取物或酵母提取物超滤液，氯化钠，磷酸钾和葡萄糖。控制温度、pH、压力和搅拌。气流覆盖也得到控制，因为不使用鼓泡(sparging)。
当葡萄糖几乎耗尽时，通过添加化学灭活剂苯酚终止分批发酵。加入纯苯酚至终浓度为0.8-1.2％，以灭活细胞并从细胞壁释放荚膜多糖。初级(primary)灭活发生在发酵罐中指定的时间内，其中继续控制温度和搅拌。在初级灭活后，将批料转移到另一个容器中，其中在受控的温度和搅拌下持续另外的指定时间以完全失活。这可以通过微生物铺板技术或通过验证苯酚浓度和指定的时间来确认。然后纯化灭活的培养基(broth)。
Ps的纯化
肺炎球菌多糖的纯化由多次离心、深度过滤、浓缩/渗滤操作和沉淀步骤组成。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
用阳离子聚合物(例如BPA-1000，Petrolite“Tretolite”和“Spectrum 8160”和聚(乙烯亚胺)，“Millipore pDADMAC”)将来自肺炎链球菌的发酵罐培养物的灭活培养基絮凝。阳离子聚合物与杂质蛋白、核酸和细胞碎片结合。在絮凝步骤和老化阶段之后，通过离心和多次深度过滤步骤除去絮凝的固体。浓缩澄清的培养基，并使用100kDa至500kDa MWCO(分子量截留值)过滤器进行渗滤。渗滤是使用Tris，MgCl2缓冲液和磷酸钠缓冲液完成的。渗滤去除了残留的核酸和蛋白质。
通过用变性的醇和/或异丙醇使乙酸钠和苯酚中的多糖再沉淀，可以进一步去除杂质。在苯酚沉淀步骤中，将磷酸钠盐水缓冲液中的乙酸钠和苯酚(液化酚或固体酚)装入渗滤过的渗余物(retentate)中。然后分两个阶段进行多糖的酒精分馏。在第一阶段中，将低百分比的乙醇添加到制剂中，以沉淀细胞碎片和其他有害杂质，而粗多糖保留在溶液中。经由深度过滤步骤除去杂质。然后通过向批料中添加另外的异丙醇或变性醇从溶液中回收多糖。通过离心回收沉淀的多糖沉淀，将其研磨并干燥为粉末，并在-70℃下冷冻保存。
实施例2：一般的缀合方法
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。除非另有说明，否则将多糖均质化以降低多糖分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为血清型特定目标(150-1000bar；通过4-7次)。
将尺寸减小的多糖进行0.2微米过滤，然后浓缩，并使用5kDa或10kDa NMWCO切向流超滤膜用蒸馏水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。
使用偏高碘酸钠氧化制备纯化的多糖用于缀合，即活化(参见Anderson等,1986,J.Immunol.137:1181-1186；和美国专利申请公开号US20110195086)。将100mM偏高碘酸钠溶液添加到50mM乙酸钠中的多糖溶液中。偏高碘酸钠的添加量是血清型特定的，范围为每摩尔多糖重复单元约0.1至0.5摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。将样品混合避光持续目标孵育时间。
用5kDa或10kDa NMWCO切向流超滤膜对活化的产品用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用蒸馏水进行渗滤，然后用水进行另外的渗滤。所有血清型的超滤均在2-8℃下进行。
缀合
如前所述(WO 2012/173876 A1)，通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化的CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以1-6mgPs/mL、蔗糖浓度为0.5-30％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mgPr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。混合多糖和CRM197溶液以达到目标多糖浓度和多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下在目标温育时间内进行缀合。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)。将批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后添加磷酸钾缓冲液以中和pH。
最终过滤和产品存储
然后使用300kDa NMWC膜在约4℃下用含0.05％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠渗析缀合物，或使用30kDa NMWC切向流超滤膜用150mM氯化钠(含或不含25mM磷酸钾pH7)渗滤缀合物，然后浓缩并使用300kDa NMWCO切向流超滤膜在4℃下用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。用另外的在150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释渗余物批料，并进行0.2微米过滤。将最终的缀合物溶液分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例3：来自血清型12F，23A，24F和31的多糖的酸水解
先前已经描述了通过在非质子溶剂如DMSO中的还原胺化将肺炎球菌多糖与蛋白缀合。通常将活化多糖(Ps)和蛋白(Pr)冻干，重悬于DMSO中，然后混合并与氰基硼氢化钠和硼氢化钠孵育以实现缀合。可以在氧化之前将多糖机械地减小尺寸(例如通过均质化)以减小Ps分子量并提供用于缀合的一致的Ps尺寸。对于许多肺炎球菌血清型，机械地减小尺寸和氧化的Ps的缀合产生的缀合物满足尺寸、赖氨酸消耗、游离多糖和游离蛋白的目标属性。但是，对于某些血清型，发现即使在优化工艺参数之后，使用此工艺也很难实现目标缀合属性。
减小Ps尺寸
将来自血清型23A，24F和31的纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中。通过均质化机械处理或通过酸水解化学处理不同的实验组，以降低Ps的分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为血清型特定目标(150-1000bar；通过4-7次)。通过将批料加热至90-92℃，加入浓乙酸至终浓度为200mM，然后孵育至多90分钟来进行酸水解。在孵育期结束时，通过添加浓磷酸钾pH 7缓冲液至终浓度为400mM并冷却至≤22℃来中和该批料。将尺寸减小的多糖进行0.2微米过滤，然后浓缩，并使用5kDa或10kDa NMWC切向流超滤膜用水进行渗滤。
如实施例2中所述缀合多糖。
实验条件和结果总结在表1中。
表1.对于肺炎链球菌血清型23A，24F和31，通过均质化相比于酸水解的Ps尺寸减小的实验组总结
Figure BDA0002403187790000361
如表1所示，与均质化相比，通过酸水解的尺寸减小提供了实现更高的赖氨酸损失(血清型23A)，更低的游离Ps(血清型24F和31)或更低的游离Pr(血清型23A，24F和31)的手段。对于血清型23A和24F，针对均质化的较高的游离蛋白水平可能与聚集形式相关，聚集形式反过来又可导致更高的测量的缀合物Mw水平。
不受任何特定理论的束缚，数据表明通过酸水解获得的较低分子量的氧化多糖(优选小于150KDa)有助于改善缀合(较少的游离Ps或游离Pr)。据信，可以使用替代的尺寸减小方法(例如，通过酸水解)来获得该优选尺寸范围的多糖以实现类似的缀合益处。
保持恒定pH值时酸的类型对血清型12F的酸水解的影响
为了确定酸的类型是否对多糖尺寸有影响，将使用盐酸的酸水解与乙酸进行了比较。将来自肺炎链球菌血清型12F的纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45μm过滤。将该批料稀释至2.5gPs/L，并分成两组(arm)。首先将两组加热至80℃，以对两组进行酸水解。加入酸以保持两个组之间的pH相似。向一组中加入冰醋酸至终浓度为200mM，pH值为2.6。向另一组中加入1N盐酸至终浓度为2.5mM，pH值为2.7。然后将两组孵育155分钟。在孵育期结束时，通过添加浓磷酸钾pH 7缓冲液至终浓度约为400mM并冷却至4℃来中和组。结果示于表2。
表2：用盐酸对肺炎链球菌12F多糖进行酸水解
Figure BDA0002403187790000371
两种酸水解条件均产生相似尺寸的多糖。
实施例4：蔗糖与多糖的质量比对来自肺炎链球菌血清型3，8和24F的多糖在DMSO中的溶解的影响
为了在非质子溶剂中制备多糖与蛋白质的缀合，通常将多糖和蛋白溶液冻干。对于大多数肺炎球菌血清型，在水溶液中以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v(50mg蔗糖/mL)配制活化多糖(Ps)用于冻干，使得冻干的材料适合再溶解于DMSO和缀合。对于血清型3，8和24F，发现该制剂(6mg Ps/mL，50mg蔗糖/mL，蔗糖：Ps质量比＝8.3)产生的冻干物质不溶于DMSO。
进行实验以优化活化多糖冻干制剂用于在DMSO中溶解。在聚丙烯容器中，在一定范围的多糖浓度(1-6mg Ps/mL)和蔗糖浓度(50-300mg蔗糖/mL)之间配制活化多糖。将溶液冻干以除去水，然后在环境温度下添加DMSO并混合以再溶解多糖。通过视觉观察确定溶解成功。
表3、4和5分别显示了血清型3，24F和8的结果。
表3 血清型3冻干制剂和溶解实验
Figure BDA0002403187790000381
Figure BDA0002403187790000391
表4 血清型24F冻干制剂和溶解实验
Figure BDA0002403187790000392
*在实验条件4中，观察到单个小的可见颗粒，认为这不是由于溶解不完全所致。
表5 血清型8冻干制剂和溶解实验
Figure BDA0002403187790000401
对于这些血清型，在研究的多糖浓度范围内(冻干和溶解两者)均观察到完全溶解，然而溶解取决于多糖和蔗糖浓度两者。具体而言，当蔗糖的质量比小于多糖的质量比的30倍时，无法实现冻干后在DMSO中的溶解。当蔗糖质量比是多糖的质量比的至少40倍时，发现最一致的溶出结果。
如实施例2中所述，来自阳性溶解条件的几个组成功缀合至CRM197。
糖类型和糖与多糖的质量比对来自血清型3的肺炎链球菌多糖在DMSO中溶解的影响
进行实验以评估糖类型和糖与多糖的质量比对冻干的活化多糖在DMSO中溶解的影响。在聚丙烯容器中以2.5或6mg Ps/mL和一定范围的糖浓度(50-150mg糖/mL)配制活化的血清型3多糖。测试的糖是蔗糖、海藻糖和甘露醇。将溶液冻干以除去水，然后在环境温度下添加DMSO并混合以再溶解多糖。通过视觉观察确定溶解成功。结果示于表6。
表6：糖的类型对血清型3多糖的影响
Figure BDA0002403187790000411
*粘性的
对于所有使用的糖，糖质量比为30倍或更高时，可以实现在DMSO中的溶解，但甘露醇除外，甘露醇似乎在60倍时达到DMSO中的溶解度极限。当糖质量比为多糖的糖质量比的至少40倍时，发现最一致的溶解结果。
进行了另一个实验，研究了在活化的血清型3多糖冻干制剂中使用糖的组合。所有组均配制成总糖质量比为40倍，因为该比率可在DMSO中产生稳定的溶解度。多糖的分子量为171kD。所有组单独或与海藻糖或与甘露醇一起使用蔗糖。将溶液冻干以除去水，然后在环境温度下添加DMSO并混合以再溶解多糖。通过视觉观察确定溶解成功。结果示于表7。
表7 用于在DMSO中溶解多糖的糖的组合
Figure BDA0002403187790000421
所有测试组均实现在DMSO中的溶解。
实施例5：氯化钠对在DMSO中使用还原胺化缀合肺炎链球菌血清型15A，16F，17F，20、24F和35B的影响
在聚丙烯容器中以2-6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5-10％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料再溶解在DMSO中。对于某些组，在冻干前使用5M氯化钠储备溶液加标(spike)CRM197溶液，或在再溶解的Ps溶液中以在缀合过程中达到10-100mM氯化钠的终浓度。在这些实验中，其他工艺参数保持不变。
将再溶解的Ps和CRM197溶液共混并混合至血清型特定多糖和蛋白的目标浓度。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在血清型特定持续时间内进行缀合。如实施例2中所述，用硼氢化钠还原并最终过滤。
结果
图1、2和3显示了来自肺炎链球菌血清型20的多糖的实验结果，表明缀合过程中氯化钠对缀合物属性的影响。表8显示肺炎链球菌血清型16F和24F的实验结果。
如图1所示，对于血清型20，在缀合过程中增加氯化钠浓度(至多至约50mM)会增加缀合物尺寸。如图2所示，增加氯化钠浓度(至多至约25mM)会增加赖氨酸的消耗，如图3所示，增加氯化钠浓度(至多至约50mM)会降低游离Ps和游离Pr。
表8 氯化钠对肺炎链球菌血清型16F和24F的缀合物属性的影响
Figure BDA0002403187790000431
如表8所示，对于血清型16F，在缀合过程中包含25mM氯化钠增加了缀合物的尺寸和赖氨酸的消耗，同时减少了游离Ps和游离Pr。如表8中所示，对于血清型24F，在缀合过程中包含25mM氯化钠增加了赖氨酸消耗，同时减少了游离Ps和游离Pr。
对于血清型15A和35B，发现了相似的结果。对于血清型15A，在缀合过程中加入25mM氯化钠会增加缀合物的尺寸和赖氨酸的消耗，而与缀合过程中不含盐相比，会减少游离多糖和游离蛋白。对于血清型35B，在缀合过程中加入25mM氯化钠会增加缀合物的尺寸和赖氨酸的消耗(数据未显示)，而与缀合过程中不含盐相比，会减少游离蛋白。
盐的类型和浓度对在DMSO中使用还原胺化对肺炎链球菌血清型17F的缀合的影响
在聚丙烯容器中以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5-10％w/v配制活化血清型17F多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料再溶解于DMSO中。对于某些组，将浓缩的盐溶液加标到再溶解的Ps溶液或Ps-CRM共混物中，以在缀合过程中达到1-100mM盐的终浓度。使用的储备溶液包括1M或5M氯化钠，1M或3M氯化钾和1M氯化镁。在这些实验中，其他工艺参数保持不变。
将再溶解的Ps和CRM197溶液共混并混合至2.7g Ps/mL和1.8mg CRM197/mL。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并进行缀合1小时。缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。
然后使用300kDa NMWC膜在约4℃下用含0.05％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠渗析缀合物。将最终的缀合物溶液分配成等分试样，并保持在4℃。
结果
结果示于表9中。2％是检测极限。
Figure BDA0002403187790000441
Figure BDA0002403187790000451
对于氯化钠和氯化钾条件，在缀合过程中增加盐浓度会增加缀合物尺寸和赖氨酸消耗，并减少游离Ps和游离Pr。对于两种盐类型，在约12.5mM这些效应均稳定。与不含盐条件相比，25mM和50mM氯化镁显示出缀合物尺寸和赖氨酸消耗的增加。然而，随着氯化镁浓度从25mM增加到100mM，游离多糖和游离蛋白水平似乎增加，缀合程度降低(通过赖氨酸损失和缀合物尺寸来衡量)。因此，可能优选将氯化镁的浓度保持在0-50mM。
实施例6：单价缀合物的配制
如实施例2-5所述制备肺炎球菌多糖-CRM197缀合物。基于批料体积和各种大(bulk)的多糖的浓度，计算获得各种血清型的目标浓度所需的大的缀合物的期望体积。将各种血清型(12F，15A，16F，17F，23A，23B，24F，31和35B)与赋形剂组合，无菌过滤并在混合条件下添加到APA中。每种单价缀合物疫苗的终浓度为4μg/mL(w/v PnPs)，其中含有20mM组氨酸，150mM NaCl，0.2％(w/v)PS-20和0.250mg/mL(w/v Al)以APA的形式。
实施例7：单价缀合物新西兰白兔免疫原性研究(15A，16F，17F，23A，23B，24F，31和35B)
在新西兰白兔(NZWR)模型中评估了单价缀合物的免疫原性。在第0天和第14天(交替侧)用0.25ml相应的单价缀合物疫苗肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝3/组)。单价肺炎球菌疫苗以每次免疫1μg PnPs(15A，16F，17F，23A，23B，24F，31或35B，各自均与CRM197缀合)与62.5μg磷酸铝佐剂(APA)给药。在研究开始前(免疫前)和第14天(给药1后，PD1)和第28天(给药2后，PD2)收集血清。至少每天由训练有素的动物护理人员观察NZWR，看是否有任何疾病或困扰的迹象。NZWR中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。NZWR实验方案得到了Merck&Co.,Inc(Kenilworth,NJ)和Covance(Denver,PA)两者的机构动物护理和使用委员会的批准。
使用1-2mg/ml的相应PnPs包被浓度在ELISA测定中测试NZWR血清，以评估IgG的免疫原性。根据前述方案，通过调理吞噬作用测定法(OPA)确定功能性抗体。参见例如Caro-Aguilar等,2017,Vaccine 35:865-72和Burton等,2006,Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9。
发现所有单价肺炎球菌缀合物疫苗在兔中均具有免疫原性，并产生杀死相应细菌菌株的功能性抗体(数据未显示)。发现血清型12F在小鼠中具有免疫原性(数据未显示)。

Claims (47)

1.一种用于减小来自血清型12F，23A，24F或31的肺炎链球菌多糖的尺寸的方法，所述方法包括使所述多糖进行酸水解反应以获得尺寸减小的多糖产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸水解在至少一种酸的存在下进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酸水解反应的pH为1.0至5.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述pH为2.0至4.0。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述pH为2.5至3.0。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述酸是乙酸、盐酸、磷酸或柠檬酸或其混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酸是乙酸。
8.根据权利要求6所述的方法，其中乙酸的浓度为50至200mM或盐酸的浓度为1至5mM。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述酸水解在80℃至92℃的温度下进行。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中通过添加磷酸钾中和减小尺寸的多糖反应。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中尺寸减小的多糖反应产物进行无菌过滤和/或渗滤。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述尺寸减小的多糖反应产物包含平均分子量低于150kDa的多糖。
13.一种制备多糖-蛋白缀合物的方法，所述方法包括使第一溶液中的多糖与第二溶液中的蛋白反应以形成第三溶液，在所述第三溶液中发生多糖蛋白缀合反应以形成所述多糖蛋白缀合物，其中所述第三溶液包含至少1mM盐。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述盐包含一价或二价阳离子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述盐是钠盐、钾盐、锂盐、镁盐或钙盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述盐是氯化钠。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第三溶液中氯化钠的浓度为1至100mM。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述盐存在于所述第一溶液中。
19.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述盐存在于包含所述蛋白的所述第二溶液中。
20.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述第一溶液和所述第二溶液是相同的。
21.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中将所述盐添加到所述第三溶液中。
22.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述第三溶液是水溶液。
23.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述第三溶液包含非质子溶剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述非质子溶剂是DMSO。
25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中所述缀合反应是席夫碱还原或还原胺化。
26.根据权利要求13至25中任一项所述的方法，其中所述多糖来自肺炎链球菌。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述多糖来自肺炎链球菌血清型15A，16F，17F，20、23A，24F或35B。
28.根据权利要求13至27中任一项所述的方法，其中所述蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白是CRM197。
30.一种冻干包含多糖的溶液的方法，所述方法包括：
a)将糖添加到包含多糖的溶液中以得到糖与多糖的质量比为至少30；和
b)冻干所述包含多糖的溶液。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述糖是非还原糖。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述糖是单糖或二糖。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述糖是甘露醇、蔗糖，海藻糖或其组合。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述多糖选自脑膜炎球菌多糖、肺炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、伤寒沙门氏菌的Vi多糖和B族链球菌多糖。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多糖是肺炎链球菌多糖。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述肺炎链球菌多糖在所述糖与多糖的质量比为25的条件下不溶解。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述肺炎链球菌多糖来自血清型3，8或24F。
38.根据权利要求30至37中任一项所述的方法，其中所述糖与多糖的质量比为至少40或至少50。
39.根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中糖浓度大于5％。
40.根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述包含多糖的溶液还包含蛋白。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM197。
42.根据权利要求30至41中任一项所述的方法，其还包括使所述多糖与蛋白缀合。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM197。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述蛋白是CRM197。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述缀合是通过还原胺化。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述还原胺化是在水性条件下进行。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述还原胺化是在二甲基亚砜(DMSO)中进行。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110225757A (zh) * 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
WO2018126229A2 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Sutrovax, Inc. Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
CN116870144A (zh) 2017-01-31 2023-10-13 默沙东有限责任公司 制备多糖-蛋白缀合物的方法
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
BR112019017560A2 (pt) * 2017-02-24 2020-04-07 Merck Sharp & Dohme intensificação da imunogenicidade dos conjugados de polissacarídeo-proteína de streptococcus pneumoniae
CN111065387B (zh) 2017-09-07 2023-08-25 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
US11524076B2 (en) 2017-09-07 2022-12-13 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
MX2020002557A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina.
US11491216B2 (en) 2017-09-07 2022-11-08 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
CN111093650B (zh) * 2017-09-07 2024-03-01 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
GEP20227420B (en) 2017-12-06 2022-10-10 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
AU2019215216A1 (en) 2018-02-05 2020-07-23 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
BR112020021296A2 (pt) 2018-04-18 2021-01-26 Sk Bioscience Co., Ltd. polissacarídeo capsular de streptococcus pneumoniae e conjugado imunogênico do mesmo
US11896656B2 (en) 2018-04-30 2024-02-13 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
EP3787673A4 (en) 2018-04-30 2022-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. METHODS FOR PRODUCING CAPSULAR CARRIER PROTEIN-POLYSACCHARIDE CONJUGATES OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
JOP20210148A1 (ar) 2018-12-19 2023-01-30 Merck Sharp & Dohme تركيبات تشتمل على متقارنات بولي سكاريد-بروتين للمكورات العقدية الرئوية وطرق استخدامها
WO2024110839A2 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711779A (en) * 1985-07-05 1987-12-08 Sclavo S.P.A. Glycoproteinic conjugates having trivalent immunogenic activity
WO1996040225A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Alberta Research Council Immunogenic and immunostimulatory oligosaccharide compositions and methods of making and using them
CN1993141A (zh) * 2004-06-04 2007-07-04 法麦克萨有限公司 诱导针对肺炎链球菌多糖的免疫应答
CN101374548A (zh) * 2005-12-22 2009-02-25 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
CN101460193A (zh) * 2006-04-07 2009-06-17 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 缀合疫苗
CN102858365A (zh) * 2010-02-09 2013-01-02 默沙东公司 15价肺炎球菌多糖蛋白质缀合物疫苗组合物
CN103599529A (zh) * 2006-12-22 2014-02-26 惠氏公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
US20170021006A1 (en) * 2015-07-21 2017-01-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2059693C (en) * 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2153733A1 (en) * 1995-07-12 1997-01-13 Andrew J. Malcolm Immunogenic oligosaccharide compositions
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
JP2012530785A (ja) * 2009-06-22 2012-12-06 ワイス・エルエルシー 組成物および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法
IL297740A (en) 2015-05-04 2022-12-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing the conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711779A (en) * 1985-07-05 1987-12-08 Sclavo S.P.A. Glycoproteinic conjugates having trivalent immunogenic activity
WO1996040225A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Alberta Research Council Immunogenic and immunostimulatory oligosaccharide compositions and methods of making and using them
CN1993141A (zh) * 2004-06-04 2007-07-04 法麦克萨有限公司 诱导针对肺炎链球菌多糖的免疫应答
CN101374548A (zh) * 2005-12-22 2009-02-25 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 含有肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的疫苗
CN101460193A (zh) * 2006-04-07 2009-06-17 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 缀合疫苗
CN103599529A (zh) * 2006-12-22 2014-02-26 惠氏公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
CN102858365A (zh) * 2010-02-09 2013-01-02 默沙东公司 15价肺炎球菌多糖蛋白质缀合物疫苗组合物
US20170021006A1 (en) * 2015-07-21 2017-01-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KELLY SACKETT等: "Identification of a Novel Keto Sugar Component in Streptococcus pneumoniae Serotype 12F Capsular Polysaccharide and Impact on Vaccine Immunogenicity" *
乔瑞洁等: "18C型肺炎球菌荚膜多糖的水解及水解片段的特性" *
张萍等: "1型和14型肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗中糖链长度与免疫原性的相关性" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110225757A (zh) * 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法
US11883502B2 (en) 2017-01-31 2024-01-30 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from Streptococcus pneumoniae serotype 19F

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Publication number Publication date
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