RU2805605C2 - Способы получения составов пневмококковых полисахаридов для конъюгации с белком-носителем - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области фармакологии и иммунологии, а именно к способу лиофилизации раствора, содержащего активированный полисахарид S. Pneumoniae. Раскрывается способ лиофилизации раствора, содержащего активированный полисахарид S. Pneumoniae, для получения лиофилизированного материала, где активированный полисахарид S. Pneumoniae выбран из группы, состоящей из полисахаридов из S. Pneumoniae серотипов 3, 8 и 24F, где способ включает: a) добавление сахара, выбранного из сахарозы, или трегалозы, или комбинации сахарозы и трегалозы, к раствору, содержащему активированный полисахарид S. Pneumoniae, для получения массового соотношения сахара:полисахарида по меньшей мере 40 и раствора с подходящей вязкостью; и b) лиофилизации раствора с подходящей вязкостью, содержащего активированный полисахарид S. Pneumoniae, для получения лиофилизированного материала, где лиофилизированный материал подходит для повторного растворения в диметилсульфоксиде (DMSO) и применения в реакциях конъюгации. Изобретение обеспечивает улучшение растворения полисахарида, что приводит к эффективной конъюгации. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 9 табл., 7 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ряду улучшений способов, относящихся к конъюгации капсульных полисахаридов из Streptococcus pneumoniae с белком-носителем. Конъюгаты полисахарид-белок, полученные с использованием способов по изобретению, можно включать в мультивалентные пневмококковые конъюгированные вакцины.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Streptococcus pneumoniae, один из примеров инкапсулированной бактерии, является значительной причиной серьезного заболевания в всем мире. В 1997 г., Центры контроля и профилактики заболеваний (CDC) оценивали наличие 3000 случаев пневмококкового менингита, 50000 случаев пневмококковой бактериемии, 7000000 случаев пневмококкового среднего отита и 500000 случаев пневмококковой пневмонии ежегодно в Соединенных Штатах. См. Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13. Кроме того, осложнения этих заболеваний могут являться значительными, где в некоторых исследованиях опубликовано до 8% смертности и 25% неврологических осложнений при пневмококковом менингите. См. Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97.

Доказано, что мультивалентные пневмококковые полисахаридные вакцины, лицензированные в течение многих лет, являются неоценимыми для предотвращения пневмококкового заболевания у взрослых, в частности, пожилых и подверженных высокому риску. Однако, дети грудного и раннего возраста плохо отвечают на неконъюгированные пневмококковые полисахариды. Бактериальные полисахариды представляют собой не зависимые от T-клеток иммуногены, вызывающие слабый ответ или не вызывающие ответа у детей грудного возраста. Химическая конъюгация иммуногена бактериального полисахарида с белком-носителем переводит иммунный ответ в зависимый от T-клеток ответ у детей грудного возраста. Дифтерийный анатоксин (DTx, химически детоксифицированный вариант DT) и CRM197 описаны как белки-носители для бактериальных полисахаридных иммуногенов из-за присутствия стимулирующих T-клетки эпитопов в их аминокислотных последовательностях.

Пневмококковая конъюгированная вакцина, Prevnar^®®, содержащая 7 наиболее часто выделяемых серотипов (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F), вызывающих инвазивное пневмококковое заболевание у детей раннего возраста и детей грудного возраста на тот момент, впервые лицензирована в Соединенных Штатах в феврале 2000 г. После универсального применения Prevnar^® в Соединенных Штатах, присутствовало значительное уменьшение случаев инвазивного пневмококкового заболевания у детей из-за серотипов, присутствующих в Prevnar^®. См. Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7. Однако, существуют ограничения перекрывания серотипов с использованием Prevnar^® в определенных районах мира, и некоторые доказательства появления определенных серотипов в Соединенных Штатах (например, 19A и других). См. O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159:634-44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348:1737-46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354:1455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196:1346-54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48:S181-S189.

Prevnar 13^® представляет собой 13-валентную конъюгированную вакцину пневмококковый полисахарид-белок, включающую серотипы 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F. См., например, Публикацию патентной заявки США No. US 2006/0228380 A1, Prymula et al., 2006, Lancet 367:740-48 и Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, presented at the 48^th Annual ICAAC/ISDA 46^th Annual Meeting, Washington DC, October 25-28, 2008. См. также Dagan et al., 1998, Infect Immun. 66: 2093-2098 и Fattom, 1999, Vaccine 17:126.

Современные мультивалентные пневмококковые конъюгированные вакцины являлись эффективными при уменьшении встречаемости пневмококкового заболевания, ассоциированного с теми серотипами, которые присутствуют в вакцинах. Однако, распространенность пневмококков, экспрессирующих серотипы, не присутствующие в вакцине, увеличилась. Условия способа для новых серотипов необходимо определять для каждого серотипа, для эффективности конъюгации, и для определенных серотипов это представляет уникальные задачи. Соответственно, существует необходимость улучшенных условий способа для конъюгации новых пневмококковых серотипов для включения в будущие вакцины.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ряду изменений способов при получении полисахаридов (Ps) из Streptococcus pneumoniae, которые являются уникальными для конкретных серотипов. Эти изменения способов улучшают свойства полисахарида и/или растворение полисахарида, что приводит к лучшей конъюгации.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к условиям способа получения полисахаридов S. pneumoniae из серотипов 12F, 23A, 24F и 31 с уменьшенным размером, которые при конъюгации с белком-носителем (Pr) в апротонном растворителе имеют желательные признаки конъюгации. Конкретно, уменьшение размера Ps этих серотипов посредством кислого гидролиза приводит к более низкой молекулярной массе Ps для конъюгации с белком, по сравнению с гомогенизацией, что улучшает признаки конъюгата, такие как использование лизина, свободный Ps или свободный Pr.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к условиям способа получения улучшенных признаков конъюгата полисахарид-белок после конъюгации в апротонном растворителе, таком как DMSO, с использованием хлорида натрия, в частности, для полисахаридов S. pneumoniae из серотипов 15A, 16F, 17F, 20, 24F и 35B. Конкретно, в этом варианте осуществления, включение ≥1 мМ хлорида натрия до или во время реакции конъюгации (независимо от того, когда в процессе добавляют хлорид натрия) приводит к улучшенным признакам конъюгата, таким как более крупный размер конъюгата, большее использование лизина, более низкое содержание свободного Ps или свободного Pr.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к диапазону условий получения состава до лиофилизации для полисахаридов S. pneumoniae из серотипов 3, 8 и 24F, для обеспечения полного растворения после лиофилизации. Конкретно, полисахариды включают в состав с сахарозой и водой, таким образом, что соотношение массы сахарозы и полисахарида составляет ≥ 30X, и оптимально, ≥ 40X. Например, для данной концентрации полисахарида до лиофилизации 2 мг Ps/мл, концентрация сахарозы должна минимально составлять 60 мг сахарозы/мл (6% масс./об. сахарозы), и, необязательно, составлять ≥ 80 мг сахарозы/мл (8% масс./об. сахарозы), для растворения после лиофилизации.

Полисахариды, включенные в состав этими способами, позволяют конъюгацию с белками после лиофилизации и повторное растворение, приводящие к желательным свойствам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показано влияние хлорида натрия на размер конъюгата для полисахарида S. pneumoniae из серотипа 20.

На фигуре 2 показано влияние хлорида натрия на использование лизина для полисахарида S. pneumoniae из серотипа 20.

На фигуре 3 показано влияние хлорида натрия на свободный Ps и Pr для полисахарида S. pneumoniae из серотипа 20.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ряду изменений способа при получении полисахаридов (Ps) из Streptococcus pneumoniae, которые являются уникальными для специфических серотипов. Эти изменения способов улучшают свойства полисахарида и/или растворение полисахарида, что приводит к лучшей конъюгации.

Авторы изобретения обнаружили, что уменьшение размера конкретных полисахаридов S. pneumoniae посредством кислого гидролиза до конъюгации с белком приводит к улучшенным признакам конъюгата, как показано в примерах. Без связи с конкретной теорией, один возможный механизм использования кислого гидролиза, который может объяснить наблюдаемое поведение, представляет собой то, что конъюгация с Ps более низкой молекулярной массы в результате кислого гидролиза обеспечивает меньшее стерическое несоответствие между молекулами Ps и Pr во время реакции конъюгации, что может, в свою очередь, может приводить к улучшенному взаимодействию и улучшенной конъюгации.

Авторы изобретения обнаружили, что полное растворение конкретных полисахаридов S. pneumoniae требовало присутствия сахарозы после лиофилизации, как показано в примерах. Без связи с конкретной теорией, один возможный механизм использования сахарозы, который может объяснить наблюдаемое поведение растворения, представляет собой то, что полисахариды некоторых серотипов, из-за их химической структуры, вступают в самоассоциацию легче, чем другие, в ходе лиофилизации или растворения, и что более высокие соотношения сахарозы/полисахарида ингибируют самоассоциацию, позволяя растворение после лиофилизации.

Авторы изобретения обнаружили, что включение ≥1 мМ хлорида натрия до или во время реакции конъюгации, в частности для полисахаридов S. pneumoniae из серотипов 16F, 20 и 24F (независимо от того, когда в процессе добавляют хлорид натрия), приводит к улучшенным признакам конъюгата, таким как более крупный размер конъюгата, большее использование лизина, более низкое содержание свободного Ps или свободного Pr, как показано в примерах. Без связи с конкретной теорией, один возможный механизм использования хлорида натрия, который может объяснить наблюдаемое поведение конъюгации для хлорида натрия, представляет собой то, что для полисахаридов некоторых серотипов, из-за их химической структуры и распределения заряда, хлорид натрия обеспечивает электростатическое экранирование, позволяющее улучшенное взаимодействие с белками и приводящее к улучшенной конъюгации. Хлорид натрия обеспечивает также дополнительную ионную силу для реакционной смеси, что может уменьшать экспонирование гидрофобной области белков-носителей, таким образом, уменьшая агрегацию белка.

В рамках изобретения, термин «полисахарид» (Ps) понимают как включающий любой антигенный сахаридный элемент (или антигенную единицу), общепринятый в области иммунологии и бактериальных вакцин, включая, но без ограничения, «сахарид», «олигосахарид», «полисахарид», «липосахарид», «липоолигосахарид (LOS)», «липополисахарид (LPS)», «гликозилат», «гликоконъюгат», «дериватизированный или активированный полисахарид или олигосахарид» и т.п. Если не указано иное, номенклатура полисахаридов в рамках изобретения следует рекомендациям Объединенной комиссии по биохимической номенклатуре IUB-IUPAC (JCBM) 1980. См. JCBN, 1982, J. Biol. Chem. 257:3352-3354.

В рамках изобретения, «иммуногенная композиция» относится к композиции, содержащей антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид или конъюгат полисахарид-белок, имеющий способность вызывать у хозяина, такого как млекопитающее, иммунный ответ, либо гуморальный, либо опосредованный клетками, или оба. Иммуногенная композиция может служить для сенсибилизации хозяина посредством представления антигена в ассоциации с молекулами MHC на поверхности клеток. Кроме того, можно получать антигенспецифические T-клетки или антитела, чтобы обеспечивать будущую защиту иммунизированного хозяина. Иммуногенные композиции, таким образом, могут защищать хозяина от инфекции бактерий, уменьшать тяжесть, или могут защищать хозяина от гибели из-за бактериальной инфекции. Иммуногенные композиции можно также использовать для получения поликлональных или моноклональных антител, которые можно использовать для придания пассивного иммунитета субъекту. Иммуногенные композиции можно также использовать для получения антител, которые являются функциональными, как измерено посредством уничтожения бактерий либо в модели эффективности на животных, либо посредством анализа опсонофагоцитарного уничтожения.

В рамках изобретения, термин «выделенный», применительно к полисахариду, относится к выделению специфического для серотипа S. pneumoniae капсульного полисахарида из очищенного полисахарида с использованием способов очистки, известных в данной области, включающих использование центрифугирования, глубинной фильтрации, преципитации, ультрафильтрации, обработки с использованием активированного угля, диафильтрации и/или хроматографии на колонке. Как правило, выделенный полисахарид относится к частичному удалению белков, нуклеиновых кислот и неспецифического эндогенного полисахарида (C-полисахарида). Выделенный полисахарид содержит менее 10%, 8%, 6%, 4% или 2% белковых загрязнений и/или нуклеиновых кислот. Выделенный полисахарид содержит менее 20% C-полисахарида по отношению к типоспецифическим полисахаридам.

В рамках изобретения, термин «очищенный», применительно к бактериальному капсульному полисахариду, относится к очистке полисахарида из лизата клеток посредством таких способов, как центрифугирование, преципитация и ультрафильтрация. Как правило, очищенный полисахарид относится к удалению клеточного дебриса и ДНК.

В рамках изобретения, термин «Mw» относится к средневзвешенной молекулярной массе и, как правило, она выражена в Да или кДа. Mw учитывает то, что более крупная молекула содержит большую часть общей массы образца полимера, чем более мелкие молекулы. Mw можно определять такими способами, как статическое светорассеяние, малоугловое рассеяние нейтронов, рентгеновское рассеяние и скорость седиментации.

В рамках изобретения, термин «Mn» относится к среднечисловой молекулярной массе и, как правило, она выражена в Да или кДа. Mn рассчитывают посредством получения общей массы образца, деленной на количество молекул в образце, и ее можно определять такими способами, как гель-проникающая хроматография, вискозиметрия посредством (уравнения Марка-Хаувинка), коллигативные способы, такие как осмометрия с использованием давления паров, определение концевой группы или протонный ЯМР. Mw/Mn отражает полидисперсность.

В рамках изобретения, термин «содержит», при использовании применительно к иммуногенной композиции по изобретению, относится к включению любых других компонентов (подлежащих ограничению выражением «состоящий из» для смеси антигенов), таких как адъюванты и наполнители. Термин «состоящий из», применительно к мультивалентной смеси конъюгатов полисахарид-белок, относится к смеси, содержащей эти конкретные конъюгаты полисахарида S. pneumoniae с белком, а не другие конъюгаты с белком полисахарида S. pneumoniae из другого серотипа.

Если не указано иное, все диапазоны, представленные в настоящем описании, включают перечисленные нижние и верхние пределы.

Капсульные полисахариды

Капсульные полисахариды из Steptococcus pneumoniae из серотипа(серотипов) по изобретению (например, серотипов 23A, 24F и 31) можно получать стандартными способами, известными специалистам в данной области. Например, полисахариды можно выделять из бактерий, и можно осуществлять коррекцию размера до некоторой степени известными способами (см., например, Европейские патенты No. EP497524 и EP497525); и предпочтительно, посредством микрофлуидизации, осуществляемой с использованием гомогенизатора или посредством химического гидролиза. В одном варианте осуществления, штаммы S. pneumoniae, соответствующие каждому серотипу полисахарида, выращивают в среде на основе сои. Затем индивидуальные полисахариды очищают посредством стандартных стадий, включая центрифугирование, преципитацию и ультрафильтрацию. См., например, Публикацию патентной заявки США No. 2008/0286838 и Патент США No. 5847112. Можно корректировать размер полисахаридов для уменьшения вязкости и/или для улучшения фильтруемости последующих конъюгированных продуктов. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты. Механическую коррекцию размера можно проводить с использованием разрезания посредством гомогенизации высокого давления.

Для серотипов 12F, 23A, 24F и 31, обнаружено, что гомогенизация полисахарида из этих серотипов не приводила к желательным характеристикам. См. ПРИМЕР 3. Кислый гидролиз можно проводить посредством нагревания партии полисахарида до 80-92°C, предпочтительно, 90°C, для серотипов, отличных от 12F, добавления кислоты, такой как уксусная кислота, соляная кислота, фосфорная кислота, лимонная кислота, до конечной концентрации 50-200 мМ, затем инкубации в течение по меньшей мере 10 минут, 20 минут, 30 минут, 40 минут или 50 минут. В конкретных вариантах осуществления, кислый гидролиз проводят в течение вплоть до 90 минут, вплоть до 150 минут, или вплоть до 155 минут. В конце периода инкубации, партию нейтрализуют посредством добавления, например, концентрированного буфера фосфата калия, pH 7, до конечной концентрации 400 мМ и охлаждения до ≤22°C. Полисахарид с уменьшенным размером фильтровали через фильтр 0,2 микрон и затем концентрируют и подвергают диафильтрации против воды с использованием мембраны для проточной ультрафильтрации вдоль потока с NMWCO 5-10 кДа.

В некоторых вариантах осуществления, очищенные полисахариды до конъюгации имеют молекулярную массу между 5 кДа и 4000 кДа. Молекулярную массу можно рассчитывать посредством эксклюзионной хроматографии (SEC), в сочетании с детектором многоуглового светорассеяния (MALS) и детектором показателя преломления (RI). В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет среднюю молекулярную массу между 10 кДа и 4000 кДа; между 50 кДа и 4000 кДа; между 50 кДа и 3000 кДа; между 50 кДа и 2000 кДа; между 50 кДа и 1500 кДа; между 50 кДа и 1000 кДа; между 50 кДа и 750 кДа; между 50 кДа и 500 кДа; между 100 кДа и 4000 кДа; между 100 кДа и 3000 кДа; 100 кДа и 2000 кДа; между 100 кДа и 1500 кДа; между 100 кДа и 1000 кДа; между 100 кДа и 750 кДа; между 100 кДа и 500 кДа; между 100 и 400 кДа; между 200 кДа и 4000 кДа; между 200 кДа и 3000 кДа; между 200 кДа и 2000 кДа; между 200 кДа и 1500 кДа; между 200 кДа и 1000 кДа; или между 200 кДа и 500 кДа. В конкретных вариантах осуществления, средняя молекулярная масса составляет 50-300 кДа.

В конкретных вариантах осуществления, полисахарид имеет между 10 и 10000, 10 и 5000, 10 и 4000, или 10 и 1000 повторяющихся звеньев. В конкретных аспектах, полисахарид имеет между 20 и 400, 30 и 300, 40 и 200 или 50 и 100 повторяющихся звеньев. В конкретных аспектах, полисахарид имеет между 40 и 900 повторяющихся звеньев.

Белок-носитель

Полисахариды из одного или нескольких серотипов S. pneumoniae, описанных в настоящем описании, можно конъюгировать с белком-носителем для улучшения иммуногенности у детей, пожилых и/или субъектов с иммунной недостаточностью. Когда более одного серотипа используют в мультивалентной композиции, серотипы можно получать с одинаковым белком-носителем или различными белками-носителями. Каждый капсульный полисахарид одинакового серотипа, как правило, конъюгируют с одинаковым белком-носителем.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, CRM197 используют в качестве белка-носителя. CRM197 представляет собой нетоксичный вариант дифтерийного токсина (DT). Белок-носитель CRM197 представляет собой мутантную форму DT, который сделан нетоксичным посредством одиночной аминокислотной замены в фрагменте A в остатке 52. В одном варианте осуществления, белок-носитель CRM197 выделяют из Corynebacterium diphtheria штамма C7 (β197), выращенного в среде на основе казаминовых кислот и дрожжевого экстракта. В другом варианте осуществления, CRM197 получают рекомбинантным способом, в соответствии со способами, описанными в Патенте США No. 5614382. Как правило, CRM197 очищают посредством комбинации ультрафильтрации, преципитации сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления, CRM197 получают в Pseudomonas fluorescens с использованием технологии Pfenex Expression™ (Pfenex Inc., San Diego, CA).

Другие пригодные белки-носители включают дополнительные инактивированные бактериальные токсины, такие как DT, фрагмент B дифтерийного анатоксина (DTFB), TT (столбнячный анатоксин) или фрагмент C TT, коклюшный анатоксин, холерный анатоксин (например, как описано в Публикации международной патентной заявки No. WO 2004/083251), LT (термолабильный энтеротоксин) E. coli, ST (термостабильный энтеротоксин) E. coli и экзотоксин A из Pseudomonas aeruginosa. Можно использовать также белки наружной мембраны бактерий, такие как комплекс c наружной мембраны (OMPC), порины, связывающие трансферрин белки, пневмококковый поверхностный белок A (PspA; См. Публикацию Международной патентной заявки No. WO 02/091998), пневмококковый белок адгезин (PsaA), пептидаза C5a из стрептококка группы A или группы B, или белок D Haemophilus influenzae, пневмококковый пневмолизин (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13), включая ply, детоксифицированный каким-либо способом, например, dPLY-GMBS (См. Публикацию международной патентной заявки No. WO 04/081515) или dPLY-формол, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE и слитые с Pht белки, например, слитые с PhtDE белки, слитые с PhtBE белки (См. Публикации международных патентных заявок No. WO 01/98334 и WO 03/54007). Другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин морского блюдечка (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенное белковое производное туберкулина (PPD), PorB (из N. meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenzae; см., например, Европейский патент No. EP 0 594 610 B), или их иммунологические функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (См. Европейские патенты No. EP0378881 и EP0427347), белки теплового шока (См. Публикации международных патентных заявок No. WO 93/17712 и WO 94/03208), белки коклюша (См. Публикацию международной патентной заявки No. WO 98/58668 и Европейский патент No. EP0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (См. Публикацию международной патентной заявки No. WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множество эпитопов, узнаваемых человеческими CD4+Т-клетками, из антигенов, происходящих из различных патогенов (См. Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824) таких как белок N19 (См. Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7), белки захвата железа (См. Публикацию международной патентной заявки No. WO 01/72337), токсин A или B из C. difficile (См. Международную публикацию патента No. WO 00/61761) и флагеллин (См. Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9), также можно использовать в качестве белков-носителей.

Другие мутанты DT также можно использовать в качестве белков-носителей, такие как CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 и CRM107, и другие мутации, описанные в Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеция или мутация Glu-148 до Asp, Gln или Ser, и/или Ala 158 до Gly, и другие мутации, описанные в Патенте США No. 4709017 или Патенте США No. 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534, и другие мутации, описанные в Патенте США No. 5917017 или Патенте США No. 6455673; или фрагмент, описанный в Патенте США No. 5843711.

При использовании мультивалентных вакцин, второй белок-носитель можно использовать для одного или нескольких антигенов. Второй белок-носитель, предпочтительно, представляет собой белок, который является нетоксичным и нереактогенным, и может быть получен в достаточном количестве и с достаточной чистотой. Второй белок-носитель также конъюгируют или связывают с антигеном, например, полисахаридом S. pneumoniae, для увеличения иммуногенности антигена. Белки-носители должны являться пригодными для стандартных способов конъюгации. В одном варианте осуществления, каждый капсульный полисахарид, не конъюгированный с первым белком-носителем, конъюгируют с одинаковым вторым белком-носителем (например, каждую молекулу капсульного полисахарида конъюгируют с одним белком-носителем). В другом варианте осуществления, капсульные полисахариды, не конъюгированные с первым белком-носителем, конъюгируют с двумя или более белками-носителями (каждую молекулу капсульного полисахарида конъюгируют с одним белком-носителем). В таких вариантах осуществления, каждый капсульный полисахарид такого же серотипа, как правило, конъюгируют с таким же белком-носителем.

Конъюгация

Конъюгация пневмококковых полисахаридов с белками посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, таком как DMSO, является общепринятой. Активированные полисахариды (Ps) и белки (Pr), как правило, лиофилизируют, ресуспендируют в DMSO, затем объединяют с цианоборгидридом натрия и боргидридом натрия, добавленных для осуществления конъюгации. Детали способа представлены ниже.

Для многих пневмококковых серотипов, этим способом получают конъюгаты, удовлетворяющие целевым признакам по размеру, использованию лизина, свободному полисахариду и свободному белку. Однако обнаружено, что для некоторых серотипов целевых признаков конъюгата более трудно достигать этим способом с использованием DMSO, даже после оптимизации параметров конъюгации, таких как концентрации Ps и Pr, и время конъюгации. См. ПРИМЕРЫ. Как описано ниже, настоящее изобретение относится к нескольким решениям для преодоления этих проблем.

Перед конъюгацией, очищенные полисахариды можно химически активировать, чтобы сделать сахариды способными к реакции с белком-носителем, для получения активированного полисахарида. В рамках изобретения, термин «активированный полисахарид» относится к полисахариду, который был химически модифицированным, как описано ниже, чтобы позволять конъюгацию с линкером или белком-носителем. Очищенные полисахариды можно, необязательно, соединять с линкером. После активации или соединения с линкером, каждый капсульный полисахарид отдельно конъюгируют с белком-носителем для получения гликоконъюгата. Конъюгаты полисахаридов можно получать посредством известных способов соединения.

В конкретных вариантах осуществления, полисахарид можно присоединять к линкеру для получения промежуточного соединения полисахарид-линкер, в котором свободный конец линкера представляет собой группу сложного эфира. Линкер, таким образом, представляет собой линкер, в котором по меньшей мере один конец линкера представляет собой группу сложного эфира. Другой конец выбирают таким образом, чтобы он мог вступать в реакцию с полисахаридом для формирования промежуточного соединения полисахарид-линкер.

В конкретных вариантах осуществления, полисахарид можно присоединять к линкеру с использованием первичной аминогруппы в полисахариде. В этом случае, линкер как правило, имеет группу сложного эфира на обоих концах. Это позволяет осуществлять присоединение посредством реакции одной из групп сложного эфира с первичной аминогруппой в полисахариде посредством нуклеофильного ацильного замещения. Реакция приводит к получению промежуточного соединения полисахарид-линкер, в котором полисахарид присоединен к линкеру посредством амидной связи. Линкер, таким образом, представляет собой бифункциональный линкер, предоставляющий первую группу сложного эфира для реакции с первичной аминогруппой в полисахариде и вторую группу сложного эфира для реакции с первичной аминогруппой в молекуле носителя. Типичный линкер представляет собой N-гидроксисукцинимидный сложный диэфир адипиновой кислоты (SIDEA).

В конкретных вариантах осуществления, присоединение можно также осуществлять опосредованно, т.е., с использованием дополнительного линкера, который используют для дериватизации полисахарида перед присоединением к линкеру. Полисахарид присоединяют к дополнительному линкеру с использованием карбонильной группы на восстанавливающем конце полисахарида. Это присоединение включает две стадии: (a1) реакцию карбонильной группы с дополнительным линкером; и (a2) реакцию свободного конца дополнительного линкера с линкером. В этих вариантах осуществления, дополнительный линкер, как правило, имеет аминогруппу на обоих концах, таким образом, позволяя осуществление стадии (a1) посредством реакции одной из первичных аминогрупп с карбонильной группой в полисахариде посредством восстановительного аминирования. Используют первичную аминогруппу, которая является реакционноспособной по отношению к карбонильной группе в полисахариде. Группы гидразида или гидроксиламина являются пригодными. Одинаковая первичная аминогруппа, как правило, присутствует на обоих концах дополнительного линкера. Реакция приводит к промежуточному соединению полисахарид-дополнительный линкер, в котором полисахарид соединен с дополнительным линкером посредством связи C-N.

В конкретных вариантах осуществления, полисахарид можно присоединять к дополнительному линкеру с использованием другой группы в полисахариде, в частности, карбоксильной группы. Это присоединение включает две стадии: (a1) реакцию группы с дополнительным линкером; и (a2) реакцию свободного конца дополнительного линкера с линкером. В этом случае, дополнительный линкер, как правило, имеет первичную аминогруппу на обоих концах, таким образом, позволяя осуществление стадии (a1) посредством реакции одной из первичных аминогрупп с карбоксильной группой в полисахариде посредством активации EDAC. Используют первичную аминогруппу, которая является реакционноспособной по отношению к активированной EDAC карбоксильной группе в полисахариде. Группа гидразида является пригодной. Одинаковая первичная аминогруппа, как правило, присутствует на обоих концах дополнительного линкера. Реакция приводит к промежуточному соединению полисахарид-дополнительный линкер, в котором полисахарид соединен с дополнительным линкером посредством амидной связи.

В одном варианте осуществления, химическую активацию полисахаридов и последующую конъюгацию с белком-носителем посредством восстановительного аминирования можно осуществлять способами, описанными в Патентах США No. 4365170, 4673574 и 4902506, Публикациях патентных заявок США No. 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 и 2007/0184071, и Публикациях международных патентных заявок No. WO2006/110381, WO2008/079653 и WO2008/143709). Химические реакции могут включать активацию пневмококкового полисахарида посредством реакции с любым окисляющим средством с первичной гидроксильной группой с альдегидом, таким как TEMPO, в присутствии окислителя (WO2104/097099), или реакции двух вицинальных гидроксильных групп с альдегидами, такими как периодат (включая периодат натрия, периодат калия или периодную кислоту). Реакции приводят к случайному окислению первичных гидроксильных групп или случайному окислительному расщеплению вицинальных гидроксильных групп углеводов с формированием реакционноспособных альдегидных групп.

В этом варианте осуществления, присоединение к белку-носителю происходит посредством восстановительного аминирования посредством прямого аминирования лизильных групп белка. Например, конъюгацию проводят посредством реакции смеси активированного полисахарида и белка-носителя с восстанавливающим средством, таким как цианоборгидрид натрия, необязательно, в присутствии никеля, для водной конъюгации. Реакцию конъюгации можно осуществлять в водном растворе или в присутствии диметилсульфоксида (DMSO). См., например, Публикации Патентных заявок США No. US2015/0231270 и US2011/0195086, и Европейский патент No. EP 0471 177 B1. Затем не вступившие в реакцию альдегиды кэпируют с использованием добавления сильного восстанавливающего средства, такого как боргидрид натрия.

Восстановительное аминирование включает две стадии, (1) окисление полисахарида с образованием реакционноспособных альдегидов, (2) восстановление имина (шиффова основания), образованного между активированным полисахаридом и белком-носителем, с образованием стабильной аминной связи конъюгата. Перед окислением, полисахарид, необязательно, подвергают уменьшению размера. Можно использовать механические способы (например, гомогенизацию) или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты. Стадия окисления может включать реакцию с периодатом. Для целей по настоящему изобретению, термин «периодат» включает как периодат, так и периодную кислоту; термин также включает как метапериодат (IO₄ ^-), так и ортопериодат (IO₆ ^5-), и включает различные соли периодата (например, периодат натрия и периодат калия). В одном варианте осуществления, капсульный полисахарид окисляют в присутствии метапериодата, предпочтительно, в присутствии периодата натрия (NaIO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид окисляют в присутствии ортопериодата, предпочтительно, в присутствии периодной кислоты.

В одном варианте осуществления, окисляющее средство представляет собой стабильное нитроксил- или нитроксид-радикальное соединение, такое как пиперидин-N-окси- или пирролидин-N-окси-соединения, в присутствии окислителя для избирательного окисления первичных гидроксилов (как описано, например, в Публикации международной патентной заявки No. WO 2014/097099). В указанной реакции, фактическим окислителем в каталитическом цикле является N-оксоаммониевая соль. В одном аспекте, указанное стабильное нитроксил- или нитроксид-радикальное соединение представляет собой пиперидин-N-окси- или пирролидин-N-окси-соединения. В одном аспекте, указанное стабильное нитроксил- или нитроксид-радикальное соединение имеет группу TEMPO (2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси) или PROXYL (2,2,5,5-тетраметил-1-пирролидинилокси). В одном аспекте, указанное стабильное нитроксил-радикальное соединение представляет собой TEMPO или его производное. В одном аспекте, указанный окислитель представляет собой молекулу, несущую N- галогеновую группу. В одном аспекте, указанный окислитель выбран из группы, состоящей из N-хлорсукцинимида, N-бромсукцинимида, N-иодсукцинимида, дихлоризоциануровой кислоты, 1,3,5-трихлор-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дибромизоциануровой кислоты, 1,3,5-трибром-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дииодизоциануровой кислоты, 1,3,5-трииод-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона. Предпочтительно, указанный окислитель представляет собой N-хлорсукцинимид.

В конкретных аспектах, окисляющее средство представляет собой свободный радикал 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимид (NCS) в качестве coокислителя (как описано в Публикации международной патентной заявки No. WO2014/097099). Таким образом в одном аспекте гликоконъюгаты из S. pneumoniae можно получать способом, включающим стадии: a) реакции сахарида с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе для получения активированного сахарида; и b) реакции активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или несколько аминогрупп (указанный способ обозначен далее в настоящем описании как «TEMPO/NCS-восстановительное аминирование»).

Необязательно, реакцию окисления гасят посредством добавления гасящего средства. Гасящее средство может быть выбрано из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глутатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфористой кислоты (например, глицерина, этиленгликоля, пропан-1,2-диола, бутан-1,2-диола или бутан-2,3-диола, аскорбиновой кислоты).

Второй стадией способа конъюгации в случае восстановительного аминирования является восстановление иминной связи (шиффова основания) между активированным полисахаридом и белком-носителем с образованием стабильной связи конъюгата (так называемое восстановительное аминирование), с использованием восстанавливающего средства. Подходящие восстанавливающие средства включают цианоборгидриды (такие как цианоборгидрид натрия) или боргидрид натрия. В одном варианте осуществления восстанавливающее средство представляет собой цианоборгидрид натрия.

В конкретных вариантах осуществления способов по изобретению, реакцию восстановительного аминирования проводят в апротонном растворителе (или смеси апротонных растворителей). В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в растворителе DMSO (диметилсульфоксиде) или в DMF (диметилформамиде). Растворитель DMSO или DMF можно использовать для разведения активированного полисахарида и белка-носителя, если они были лиофилизированы. В одном варианте осуществления, апротонный растворитель представляет собой DMSO.

Сахарозу при вплоть до 5%, при массовом соотношении сахарозы:Ps 25X, использовали для обеспечения оптимального растворения в DMSO после лиофилизации. См., например, Публикацию международной патентной заявки No. WO2017/013548. Для полисахаридов S. pneumoniae, полученных из серотипов 3, 8 и 24F, обнаружено, что более высокие уровни сахарозы были необходимы для адекватного растворения полисахарида до конъюгации с белком в апротонном растворителе. В некоторых вариантах осуществления, для этих серотипов, используют концентрации сахарозы более, чем 5% в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления, для этих серотипов, используют массовые соотношения сахарозы:Ps более, чем 25X, например, по меньшей мере 30X, по меньшей мере 35X, или по меньшей мере 40X. В некоторых вариантах осуществления, массовое соотношение сахарозы и полисахарида до лиофилизации больше или равно 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50 или более. Можно использовать другие сахара, такие как трегалоза или маннит.

Обнаружено также, что присутствие хлорида натрия (NaCl) в способе конъюгации с белком, либо в водном растворе, либо в апротонном растворителе, можно использовать для уменьшения уровней свободного белка, увеличения молекулярной массы конъюгата, уменьшения уровня свободного полисахарида и/или увеличения использования лизина для полисахаридов S. pneumoniae, очищенных из серотипов 15A, 16F, 17F, 20, 23A, 24F и 35B. Таким образом, целью настоящего изобретения может являться способ получения конъюгата полисахарида с белком, включающий реакцию полисахарида S. pneumoniae в первом растворе с белком во втором растворе, для получения третьего раствора, в котором происходит реакция конъюгации полисахарида с белком с образованием конъюгата полисахарида с белком, где третий раствор содержит по меньшей мере 1 мМ соль.

Хлорид натрия можно добавлять на любой стадии способа конъюгации, от подготовки полисахарида и белка для лиофилизации, до собственно реакции конъюгации, например, во время реакции шиффова основания или во время восстановительного аминирования в присутствии цианоборгидрида натрия. В некоторых вариантах осуществления, полисахарид и белок лиофилизируют отдельно, и соль можно добавлять либо в раствор полисахарида (первый раствор), либо в раствор белка (второй раствор), либо в оба. В некоторых вариантах осуществления, полисахарид и белок лиофилизируют из одного и того же раствора, в который добавляют соль (т.е., первый и второй раствор являются одним и тем же). В некоторых вариантах осуществления, соль добавляют в раствор, в котором происходит реакция конъюгации полисахарида с белком (т.е., третий раствор).

Можно использовать другие соли, такие как другие соли натрия, соли калия, такие как хлорид калия, соли лития, соли магния и соли кальция. В некоторых вариантах осуществления, от 1 мМ до 100 мМ хлорид натрия добавляют в раствор для растворения для полисахарида, или во время реакции шиффова основания, или во время реакции восстановительного аминирования в присутствии цианоборгидрида натрия. В некоторых вариантах осуществления, используют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мМ хлорид натрия. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления, используют не более, чем 100, 75, или 50 мМ хлорид натрия.

В конце реакции восстановления, могут присутствовать не вступившие в реакцию альдегидные группы, оставшиеся в конъюгатах, которые можно кэпировать или гасить с использованием пригодного кэпирующего или гасящего средства. В одном варианте осуществления это кэпирующее или гасящее средство представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄). Подходящие альтернативы включают триацетоксиборгидрид натрия или боргидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминобораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборанметанол, диметиламинборан, t-BuMe'PrN-BH₃, бензиламин-BH₃ или 5-этил-2- метилпиридинборан (PEMB), или смолу для обмена боргидрида.

Гликоконъюгаты, полученные с использованием восстановительного аминирования в апротонном растворителе, как правило, используют в мультивалентных конъюгированных вакцинах с пневмококковым белком. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления мультивалентных композиций, где не все серотипы получены в апротонном растворителе, реакцию восстановления для остальных серотипов проводят в водном растворителе (например, выбранном из PBS (фосфатно-солевого буфера), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты), HEPES, (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), бис-трис, ADA (N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты), PIPES (пиперазин-N, N'-бис(2-этансульфоновой кислоты)), MOPSO (3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты), BES (N, N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), DIPSO (3-бис(2-гидроксиэтил) амино-2-гидроксипропан-1-сульфоновой кислоты), MOBS (4-(N-морфолино)бутансульфоновой кислоты), HEPPSO (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N-(2-гидроксипропансульфоновой кислоты)), POPSO (пиперазин-1,4-бис(2-гидрокси-3-пропансульфоновой кислоты)), TEA (триэтаноламина), EPPS (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновой кислоты), бицина или HEPB, при pH между 6,0 и 8,5, 7,0 и 8,0 или 7,0 и 7,5).

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгаты по настоящему изобретению содержат полисахарид, имеющий молекулярную массу между 10 кДа и 10000 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу между 25 кДа и 5000 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу между 50 кДа и 1000 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу между 70 кДа и 900 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу между 100 кДа и 800 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу между 200 кДа и 600 кДа. В других таких вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу 100 кДа - 1000 кДа; 100 кДа - 900 кДа; 100 кДа - 800 кДа; 100 кДа - 700 кДа; 100 кДа - 600 кДа; 100 кДа - 500 кДа; 100 кДа - 400 кДа; 100 кДа - 300 кДа; 150 кДа - 1000 кДа; 150 кДа - 900 кДа; 150 кДа - 800 кДа; 150 кДа - 700 кДа; 150 кДа - 600 кДа; 150 кДа - 500 кДа; 150 кДа - 400 кДа; 150 кДа - 300 кДа; 200 кДа - 1000 кДа; 200 кДа - 900 кДа; 200 кДа - 800 кДа; 200 кДа - 700 кДа; 200 кДа - 600 кДа; 200 кДа - 500 кДа; 200 кДа - 400 кДа; 200 кДа - 300; 250 кДа - 1000 кДа; 250 кДа - 900 кДа; 250 кДа - 800 кДа; 250 кДа - 700 кДа; 250 кДа - 600 кДа; 250 кДа - 500 кДа; 250 кДа - 400 кДа; 250 кДа - 350 кДа; 300 кДа - 1000 кДа; 300 кДа - 900 кДа; 300 кДа - 800 кДа; 300 кДа - 700 кДа; 300 кДа - 600 кДа; 300 кДа - 500 кДа; 300 кДа - 400 кДа; 400 кДа - 1000 кДа; 400 кДа - 900 кДа; 400 кДа - 800 кДа; 400 кДа - 700 кДа; 400 кДа - 600 кДа; или 500 кДа - 600 кДа. В конкретных вариантах осуществления, где используют кислый гидролиз, полисахарид имеет молекулярную массу между 10 кДа и 200 кДа, 25 кДа и 200 кДа, 50 кДа и 200 кДа, 10 кДа и 150 кДа, 25 кДа и 150 кДа, или 50 кДа и 150 кДа.

Пригодные альтернативные химические реакции включают активацию сахарида с использованием тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием сложного эфира цианата. Активированный сахарид можно, таким образом, присоединять напрямую или посредством группы спейсера (линкера) к аминогруппе на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин для получения тиолированного полисахарида, который можно присоединять к носителю через тиоэфирную связь, полученную после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или с галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием иодацетимида [например, этилиодацетимида HCl] или N-сукцинимидилбромацетата или SIAB, или SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (необязательно, полученный посредством химических реакций CDAP) соединяют с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием химических реакций карбодиимида (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны в Публикациях международных патентных заявок No. WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/29094; и Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256.

В других подходящих способах конъюгации используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в Публикации международной патентной заявки No. WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может образовываться посредством реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (См. Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18), с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное введение защиты/снятие защиты первичной гидроксильной группы, реакцию первичной гидроксильной группы с CDI с образованием карбаматного промежуточного соединения CDI и соединение карбаматного промежуточного соединения CDI с аминогруппой на белке.

После конъюгации (реакции восстановления и, необязательно, реакции кэпирования или гашения), гликоконъюгаты можно очищать (обогащать по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) множеством способов, известных специалисту в данной области. Эти способы включают диализ, способы концентрации/диафильтрации, проточную фильтрацию вдоль потока, ультрафильтрацию, преципитацию/элюцию, хроматографию на колонке (ионообменную хроматографию, ионообменную хроматографию в нескольких режимах, DEAE или хроматографию гидрофобного взаимодействия) и глубинную фильтрацию. См., например, Патент США No. 6146902. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты очищают посредством диафильтрации или ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии.

Один способ характеризации гликоконъюгатов по изобретению осуществляют посредством количества остатков лизина в белке-носителе (например, CRM197), которые становятся конъюгированными с сахаридом, которое может быть охарактеризовано как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгации). Доказательство лизиновой модификации белка-носителя, за счет ковалентных связей с полисахаридами, можно получать посредством анализа аминокислот с использованием общепринятых способов, известных специалисту в данной области. Конъюгация в результате приводит к уменьшению количества выделенных остатков лизина, по сравнению с исходным материалом белка-носителя, использованным для образования материалов конъюгата. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет между 2 и 15, между 2 и 13, между 2 и 10, между 2 и 8, между 2 и 6, между 2 и 5, между 2 и 4, между 3 и 15, между 3 и 13, между 3 и 10, между 3 и 8, между 3 и 6, между 3 и 5, между 3 и 4, между 5 и 15, между 5 и 10, между 8 и 15, между 8 и 12, между 10 и 15 или между 10 и 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет между 7 и 12. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM197.

Гликоконъюгаты по изобретению можно также характеризовать по соотношению (масс./масс.) сахарида и белка-носителя. В некоторых вариантах осуществления, соотношение полисахарида и белка-носителя в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет между 0,5 и 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В других вариантах осуществления, соотношение сахарида и белка-носителя (масс./масс.) составляет между 0,5 и 2,0, между 0,5 и 1,5, между 0,8 и 1,2, между 0,5 и 1,0, между 1,0 и 1,5 или между 1,0 и 2,0. В следующих вариантах осуществления, соотношение сахарида и белка-носителя (масс./масс.) составляет между 0,8 и 1,2. В предпочтительном варианте осуществления, соотношение капсульного полисахарида и белка-носителя в конъюгате составляет между 1 и 2. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM197. Гликоконъюгаты и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может являться нековалентно ассоциированным с гликоконъюгатом (т.е., нековалентно связанным с ним, адсорбированным на нем, или заключенным в него или вместе с ним).

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит менее, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит менее, чем приблизительно 25% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат содержит менее, чем приблизительно 20% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат содержит менее, чем приблизительно 15% свободного полисахарида, по сравнению с общим количеством полисахарида.

Мультивалентные вакцины на основе конъюгата полисахарид-белок

Конъюгаты полисахарид-белок, полученные с использованием способов по изобретению, можно использовать в мультивалентных вакцинах на основе конъюгата полисахарид-белок. В конкретных вариантах осуществления, мультивалентные вакцины на основе конъюгата полисахарид-белок содержат капсульные полисахариды S. pneumoniae из одного или нескольких из S. pneumoniae серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18B, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38, в форме свободных полисахаридов, компонента конъюгата полисахарид-белок или их комбинации, для получения мультивалентной пневмококковой вакцины. В конкретных вариантах осуществления, иммуногенная композиция содержит, в основном состоит из или состоит из капсульных полисахаридов S. pneumoniae из S. pneumoniae серотипов 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, индивидуально конъюгированных с одним или несколькими белками-носителями. Предпочтительно, сахариды из конкретного серотипа не конъюгированы более чем с одним белком-носителем.

После очистки индивидуальных гликоконъюгатов, получают их соединения для составления иммуногенной композиции по настоящему изобретению. Эти пневмококковые конъюгаты получают отдельными способами, и нерасфасованный препарат составляют в отдельную лекарственную форму.

Фармацевтические/вакцинные композиции

Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, включая фармацевтические, иммуногенные и вакцинные композиции, содержащие, в основном состоящие из, или альтернативно, состоящие из любой из комбинаций серотипов полисахаридов S. pneumoniae, описанных выше, вместе с фармацевтически приемлемым носителем и адъювантом.

Получение составов конъюгатов полисахарид-белок можно осуществлять с использованием известных в данной области способов. Например, составы индивидуальных пневмококковых конъюгатов можно получать с использованием физиологически приемлемого носителя для получения композиции. Примеры таких носителей включают, но без ограничения, воду, забуференный солевой раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

В предпочтительном составе, вакцинную композицию составляют в L-гистидиновом буфере с хлоридом натрия.

Как определено в настоящем описании, «адъювант» представляет собой вещество, которое служит для увеличения иммуногенности иммуногенной композиции по изобретению. Иммунный адъювант может усиливать иммунный ответ на антиген, который является слабо иммуногенным при введении отдельно, например, не индуцирует или индуцирует слабые титры антитела или опосредованный клетками иммунный ответ, может увеличивать титры антитела против антигена и/или уменьшать дозу антигена, эффективную для достижения иммунного ответа у индивидуума. Таким образом, адъюванты часто вводят для бустер-стимуляции иммунного ответа, и они хорошо известны специалисту в данной области. Пригодные адъюванты для усиления эффективности композиции включают, но без ограничения:

(1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.;

(2) эмульсионные составы масло-в-воде (в присутствии или в отсутствие других специфических иммуностимулирующих средств, таких как мурамилпептиды (определенные ниже) или компоненты клеточной стенки бактерий), например, такие как (a) MF59 (Публикация международной патентной заявки No. WO 90/14837), содержащий 5% сквален, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 (необязательно, содержащий различные количества MTP-PE), составленный в субмикронные частицы с использованием микрофлуидизатора, такого как микрофлуидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквален, 0,4% Tween 80, 5% блок-сополимер плюроник L121, и thr-MDP, либо микрофлуидизированный в субмикронной эмульсии, либо встряхиваемый для образования эмульсии с более крупным размером частиц, (c) адъювантная система Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT), содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80, и один или несколько компонентов клеточной стенки бактерий из группы, состоящей из 3-O-деацилированного монофосфориллипида A (MPL™), описанного в Патенте США No. 4912094, димиколата трегалозы (TDM) и каркаса клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL+CWS (Detox™); и (d) монтанид ISA;

(3) можно использовать сапониновые адъюванты, такие как Quil A или STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (см., например, Патент США No. 5057540), или частицы, образованные ими, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы, сформированные комбинацией холестерина, сапонина, фосфолипида и амфипатических белков) и Iscomatrix^® (имеющий в основном такую же структуру, как ISCOM, но в отсутствие белка);

(4) бактериальные липополисахариды, синтетические аналоги липида A, такие как соединения аминоалкилглюкозаминфосфата (AGP), или их производные или аналоги, которые доступны от Corixa, и которые описаны в Патенте США No. 6113918; один такой AGP представляет собой 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил-2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, также известный как 529 (ранее известный как RC529), который составлен в водной форме или в виде стабильной эмульсии

(5) синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив(ы) CpG (Патент США No. 6207646);

(6) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухоли (TNF), костимулирующие молекулы B7-1 и B7-2, и т.д.; и

(7) компоненты комплемента, такие как тример компонента комплемента C3d.

В другом варианте осуществления, адъювант представляет собой смесь из 2, 3 или более из вышеуказанных адъювантов, например, SBAS2 (эмульсия масло-в-воде, также содержащая 3-деацилированный монофосфориллипид A и QS21).

Мурамилпептиды включают, но без ограничения, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE) и т.д.

В конкретных вариантах осуществления, адъювант представляет собой соль алюминия. Адъювант на основе соли алюминия может присутствовать в преципитированной на квасцах вакцине или адсорбированной на квасцах вакцине. Адъюванты на основе соли алюминия хорошо известны в данной области и описаны, например, в Harlow, E. and D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) и Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493). Соль алюминия включает, но без ограничения, гидратированный оксид алюминия, гидрат оксида алюминия, тригидрат оксида алюминия (ATH), гидрат алюминия, тригидрат алюминия, Alhydrogel^®, Superfos, Amphogel^®, гидроксид алюминия (III), гидроксифосфатсульфат алюминия (адъювант на основе фосфата алюминия (APA)), аморфный оксид алюминия, тригидратированный оксид алюминия или тригидроксиалюминий.

APA представляет собой водную суспензию гидроксифосфата алюминия. APA изготавливают посредством смешивания хлорида алюминия и фосфата натрия в объемном соотношении 1:1 для преципитации гидроксифосфата алюминия. После процесса смешивания, материал подвергают уменьшению размера с использованием смесителя с высоким усилием сдвига для достижения монодисперсного распределения размеров частиц. Затем продукт подвергают диафильтрации против физиологического солевого раствора и стерилизации паром.

В конкретных вариантах осуществления, коммерчески доступный Al(OH)₃ (например, Alhydrogel^® или Superfos от Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) используют для адсорбции белков. Адсорбция белка является зависимой, в другом варианте осуществления, от pI (изоэлектрической точки pH) белка и pH среды. Белок с низкой pI адсорбируется на положительно заряженном ионе алюминия более сильно, чем белок с высокой pI. Соли алюминия могут образовывать депо Ag, которое медленно высвобождает его в течение периода 2-3 недель, могут быть вовлечены в неспецифическую активацию макрофагов и активацию комплемента, и/или стимулировать механизм врожденного иммунитета (возможно, посредством стимуляции образования мочевой кислоты). См., например, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.

Моновалентные нерасфасованные водные конъюгаты, как правило, смешивают и разводят. После разведения, партию стерилизуют фильтрацией. Адъювант фосфат алюминия добавляют асептически до целевой конечной концентрации 4 мкг/мл для всех серотипов S. pneumoniae, за исключением серотипа 6B, который разводят до целевой концентрации 8 мкг/мл, и конечной концентрации алюминия 250 мкг/мл. Составом партии с адъювантом можно заполнять ампулы или шприцы.

В конкретных вариантах осуществления, адъювант представляет собой содержащую CpG нуклеотидную последовательность, например, содержащий CpG олигонуклеотид, в частности, содержащий CpG олигодезоксинуклеотид (CpG ODN). В другом варианте осуществления, адъювант представляет собой ODN 1826, который можно получать из Coley Pharmaceutical Group.

«Содержащий CpG нуклеотид», «содержащий CpG олигонуклеотид», «CpG-олигонуклеотид» и сходные термины относятся к молекуле нуклеотида длиной 6-50 нуклеотидов, содержащей неметилированный мотив CpG. См., например, Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297. В другом варианте осуществления, предусмотрено любое другое принятое в данной области определение этих терминов. Содержащие CpG олигонуклеотиды включают модифицированные олигонуклеотиды с использованием любых синтетических межнуклеозидных связей, модифицированного основания и/или модифицированного сахара.

Способы использования CpG-олигонуклеотидов хорошо известны в данной области и описаны, например, в Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58; и Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110.

Введение/дозирование

Композиции и составы, описанные в настоящем описании, можно использовать для защиты или лечения человека, чувствительного к инфекции, например, пневмококковой инфекции, посредством введения вакцины системным или мукозальным способом. Например, композиции и составы, описанные в настоящем описании, можно использовать в способе индукции иммунного ответа на конъюгат капсульного полисахарида S. pneumoniae, включающем введение человеку иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции или состава, описанных в настоящем описании. В другом примере, композиции и составы, описанные в настоящем описании, можно использовать в способе вакцинации человека против пневмококковой инфекции, включающем стадию введения человеку иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции или состава, описанных в настоящем описании.

Оптимальные количества компонентов для конкретной вакцины можно определять посредством стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов. Например, в другом варианте осуществления, дозу для вакцинации человека определяют посредством экстраполяции данных исследований на животных до данных для человека. В другом варианте осуществления, дозу определяют эмпирически.

«Эффективное количество» композиции по изобретению относится к дозе, необходимой для стимуляции образования антител, значительного снижающих вероятность или тяжесть инфекции микроорганизмом, например, S. pneumoniae, во время последующего заражения.

Способы с использованием композиций и составов, описанных в настоящем описании, можно использовать для предотвращения и/или уменьшения первичных клинических синдромов, вызванных микроорганизмами, например, S. pneumoniae, включая как инвазивные инфекции (менингит, пневмонию и бактериемию), так и неинвазивные инфекции (острый средний отит и синусит).

Введение композиций и составов, описанных в настоящем описании, может включать одно или несколько из: инъекции внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным способами; или мукозального введения в ротовые/пищеварительные, дыхательные или мочеполовые пути. В одном варианте осуществления, интраназальное введение используют для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку носоглоточное носительство пневмококков можно более эффективно предотвращать, таким образом, облегчая инфекцию на ее самой ранней стадии).

Количество конъюгатов в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое индуцирует иммунопротективный ответ без значительных неблагоприятных эффектов. Такое количество можно менять в зависимости от пневмококкового серотипа. Как правило, для конъюгатов на основе полисахарида, каждая доза может содержать 0,1-100 мкг каждого полисахарида, в частности 0,1-10 мкг, и более конкретно, 1-5 мкг. Например, каждая доза может содержать 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 или 750 нг, или 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкг каждого полисахарида.

Оптимальные количества компонентов для конкретной вакцины можно определять с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов. Например, в другом варианте осуществления, дозу для вакцинации человека определяют посредством экстраполяции данных исследований на животных до данных для человека. В другом варианте осуществления, дозу определяют эмпирически.

В одном варианте осуществления, доза соли алюминия составляет 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 или 700 мкг, или 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 мг или более. В другом варианте осуществления, доза соли алюминия, описанная выше, присутствует на мкг рекомбинантного белка.

Как правило, получают состав каждой 0,5 мл дозы, содержащий: 2 мкг каждого полисахарида S. pneumoniae, за исключением полисахарида серотипа 6B при 4 мкг; приблизительно 32 мкг белка-носителя CRM197 (например, 32 мкг±5 мкг,±3 мкг,±2 мкг или±1 мкг); адъювант 0,125 мг элементарного алюминия (0,5 мг фосфата алюминия); и хлорид натрия и L-гистидиновый буфер. Концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 150 мМ (например, 150 мМ±25 мМ,±20 мМ,±15 мМ,±10 мМ, или±5 мМ), и приблизительно 20 мМ (например, 20 мМ±5 мМ,±2,5 мМ,±2 мМ,±1 мМ, или±0,5 мМ) L-гистидиновый буфер.

В соответствии с любыми способами использования композиции или состава, описанных в настоящем описании, и в одном варианте осуществления, субъект представляет собой человека. В конкретных вариантах осуществления, пациент-человек представляет собой грудного ребенка (в возрасте менее 1 года), ребенка преддошкольного возраста (приблизительно 12-24 месяца), или ребенка дошкольного возраста (приблизительно 2-5 лет). В других вариантах осуществления, пациент-человек представляет собой пожилого пациента (> 65 лет). Композиции по этому изобретению являются также пригодными для использования для более старших детей, подростков и взрослых (например, в возрасте 18-45 лет или 18-65 лет).

В одном варианте осуществления способов использования композиции или состава, описанных в настоящем описании, композицию или состав вводят в форме однократной инокуляции. В другом варианте осуществления, композицию или состав вводят два раза, три раза или четыре раза, или более, с адекватными промежутками. Например, композицию или состав можно вводить с интервалами 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев, или в любой их комбинации. Можно следовать расписанию иммунизации, разработанному для пневмококковых вакцин. Например, общепринятое расписание для детей грудного возраста и детей преддошкольного возраста против инвазивного заболевания, вызванного S. pneumoniae, представляет собой введение в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, композицию вводят в сериях из 4 доз в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

Композиции, описанные в настоящем описании, могут также включать один или несколько белков из S. pneumoniae. Примеры белков S. pneumoniae, пригодных для включения, включают белки, идентифицированные в Публикациях международных патентных заявок No. WO 02/083855 и WO 02/053761.

Составы

Композиции, описанные в настоящем описании, можно вводить субъекту одним или несколькими способами, известным специалисту в данной области, например, парентерально, трансмукозально, чрескожно, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, интраназально, подкожно, внутрибрюшинно, и составлять соответственно.

В одном варианте осуществления, композиции, описанные в настоящем описании, вводят посредством эпидермальной инъекции, внутримышечной инъекции, внутривенной, внутриартериальной, подкожной инъекции, или мукозальной инъекции жидкого препарата в дыхательные пути. Жидкие составы для инъекции включают растворы и т.п.

Композицию можно составлять в форме ампул с однократными дозами, флаконов с множественными дозами или предварительно заполненных шприцев.

В другом варианте осуществления, композиции вводят перорально, и таким образом, составляют в форме, пригодной для перорального введения, т.е., в форме твердого или жидкого препарата. Твердые пероральные составы включают таблетки, капсулы, пилюли, гранулы, драже и т.п. Жидкие пероральные составы включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и т.п.

Фармацевтически приемлемые носители для жидких составов представляют собой водные или неводные растворы, суспензии, эмульсии или масла. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. Примерами масел являются масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, рыбий жир, другой жир морских животных или липид из молока или яиц.

Фармацевтическая композиция может являться изотоничной, гипертоничной или гипотоничной. Однако, часто является предпочтительным, чтобы фармацевтическая композиция для инфузии или инъекции в основном являлась изотоничной при ее введении. Таким образом, для хранения фармацевтическая композиция может, предпочтительно, являться изотоничной или гипертоничной. Если фармацевтическая композиция является гипертоничной для хранения, ее можно разбавлять до изотоничного раствора перед введением.

Регулирующее тоничность средство может представлять собой ионное регулирующее тоничность средство, такое как соль, или неионное регулирующее тоничность средство, такое как углевод. Неограничивающие примеры ионных регулирующих тоничность средств включают NaCl, CaCl₂, KCl и MgCl₂. Неограничивающие примеры неионных регулирующих тоничность средств включают сахарозу, трегалозу, маннит, сорбит и глицерин.

Является также предпочтительным, чтобы по меньшей мере одна фармацевтически приемлемая добавка представляла собой буфер. Для некоторых целей, например, когда фармацевтическая композиция предназначена для инфузии или инъекции, часто является желательным, чтобы композиция содержала буфер, способный забуферивать раствор при pH в диапазоне 4-10, например, 5-9, например, 6-8.

Буфер можно, например, выбирать из группы, состоящей из Трис, ацетатного, глутаматного, лактатного, малеатного, тартратного, фосфатного, цитратного, карбонатного, глицинатного, L-гистидинового, глицинового, сукцинатного и триэтаноламинного буфера.

Буфер может, кроме того, являться выбранным, например, из приемлемых с точки зрения USP буферов для парентерального использования, в частности, когда фармацевтический состав предназначен для парентерального использования. Например, буфер может быть выбран из группы, состоящей из одноосновных кислот, таких как уксусная, бензойная, глюконовая, глицериновая и молочная кислота; двухосновных кислот, таких как аконитовая, адипиновая, аскорбиновая, угольная, глутаминовая, яблочная, янтарная и виннокаменная кислота, многоосновных кислот, таких как лимонная и фосфорная кислота; и оснований, таких как аммиак, диэтаноламин, глицин, триэтаноламин и Трис.

Носители для парентерального введения (для подкожной, внутривенной, внутриартериальной или внутримышечной инъекции) включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом и жирные масла. Носители для внутривенного введения включают жидкости и питательные добавки, добавки электролитов, например, на основе раствора Рингера с декстрозой и т.п. Примерами являются стерильные жидкости, такие как вода и масла, с добавлением или без добавления поверхностно-активного вещества и других фармацевтически приемлемых адъювантов. Как правило, вода, солевой раствор, водные растворы декстрозы и родственных сахаров, гликоли, такие как пропиленгликоли или полиэтиленгликоль, полисорбат 80 (PS-80), полисорбат 20 (PS-20), и полоксамер 188 (P188), являются предпочтительными жидкими носителями, в частности, для пригодных для инъекции растворов. Примерами масел являются масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, рыбий жир, другой жир морских животных или липид из молока или яиц.

Составы могут также содержать поверхностно-активное вещество. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения: поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно обозначаемых как Tween), особенно PS-20 и PS-80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемые под торговым наименованием DOWFAX™, такие как линейные блок-сополимеры EO/PO; октоксинолы, которые могут являться изменчивыми по количеству повторяющихся групп этокси(окси-l,2-этандиила), при этом особенный интерес представляет октоксинол-9 (тритон X-100, или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенолэтоксилаты, такие как серии Tergitol™ NP; жирные эфиры полиоксиэтилена, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (общеизвестные как SPAN), такие как триолеат сорбитана (Span 85) и монолаурат сорбитана. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются PS-20 или PS-80.

Можно использовать смеси поверхностно-активных веществ, например смеси PS-80/Span 85. Также подходящей является комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (PS-80), и октоксинола, такого как т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (тритон X-100). Другая комбинация, которую можно использовать, включает лаурет 9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.

Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ составляют: сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (такие как PS-80) 0,01-1% масс./об., в частности, приблизительно 0,1% масс./об.; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как тритон X-100, или другие детергенты в серии тритона) 0,001-0,1% масс./об., в частности, 0,005-0,02% масс./об.; эфиры полиоксиэтилена (такие как лаурет 9) 0,1-20% масс./об., предпочтительно, 0,1-10% масс./об. и в частности, 0,1-1% масс./об. или приблизительно 0,5% масс./об.

В конкретных вариантах осуществления, композиция в основном состоит из L-гистидина (20 мМ), солевого раствора (150 мМ) и 0,2% масс./об. PS-20 при pH 5,8 с 250 мкг/мл APA (адъюванта фосфата алюминия). PS-20 может лежать в диапазоне 0,005-0,1% масс./об., где присутствие PS-20 или PS-80 в составе контролирует агрегацию в ходе имитации изготовления и транспортировки с использованием первичной упаковки. Способ состоит из объединения смеси из вплоть до 44 серотипов полисахаридов S. pneumoniae в L-гистидине, хлориде натрия и PS-20, затем объединения смешанного материала с APA и хлоридом натрия в присутствии или в отсутствие противомикробных консервантов.

Выбор поверхностно-активного вещества может нуждаться в оптимизации для различных продуктов лекарственных средств и веществ лекарственных средств. Для мультивалентных вакцин, содержащих 15 или более серотипов полисахаридов S. pneumoniae, PS-20 и P188 являются предпочтительными. Выбор химических реакций, использованных для получения конъюгата, также может влиять на стабилизацию состава. В частности, как проиллюстрировано ниже, для конъюгатов пневмококковый полисахарид-белок, полученных в водном растворителе или растворителе на основе DMSO и объединенных в мультивалентную композицию, показаны значительные различия стабильности, в зависимости от конкретных систем поверхностно-активных веществ, использованных для получения состава.

Для составов, описанных в настоящем описании, полоксамер обычно имеет молекулярную массу в диапазоне от 1100 Да до 17400 Да, от 7500 Да до 15000 Да или от 7500 Да до 10000 Да. Полоксамер может быть выбран из полоксамера 188 или полоксамера 407. Конечная концентрация полоксамера в составах по изобретению составляет от 0,001 до 5% масс./об., или от 0,025 до 1% масс./об. Система поверхностно-активного вещества, содержащая полоксамер, должна дополнительно содержать полиол. В конкретных аспектах, полиол представляет собой пропиленгликоль и присутствует при конечной концентрации от 1 до 20% масс./об. В конкретных аспектах, полиол представляет собой полиэтиленгликоль 400 и присутствует при конечной концентрации от 1 до 20% масс./об.

Подходящими полиолами для составов являются полимерные полиолы, в частности полиэфирдиолы, включая, но без ограничения, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, монометильные эфиры полиэтиленгликоля. Пропиленгликоль является доступным в диапазоне молекулярных масс мономера от ~425 Да до ~2700 Да. Полиэтиленгликоль и монометильные эфиры полиэтиленгликоля также являются доступными в диапазоне молекулярных масс от ~200 Да до ~35000 Да включая, но без ограничения, PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 и PEG MME 4000. Предпочтительным полиэтиленгликолем является полиэтиленгликоль 400. Конечная концентрация полиола в составах может составлять 1-20% масс./об. или 6-20% масс./об.

Состав содержит также солевой раствор с забуференным pH. Буфер может, например, являться выбранным из группы, состоящей из буфера на основе Трис, ацетата, глутамата, лактата, малеата, тартрата, фосфата, цитрата, карбоната, глицината, L-гистидина, глицина, сукцината, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты) и триэтаноламина. Буфер является способным забуферивать раствор до pH в диапазоне 4-10, 5,2-7,5 или 5,8-7,0. В конкретных аспектах, буфер является выбранным из группы, состоящей из фосфата, сукцината, L-гистидина, MES, MOPS, HEPES, ацетата или цитрата. Буфер может, кроме того, являться выбранным, например, из приемлемых с точки зрения USP буферов для парентерального использования, в частности, когда фармацевтический состав предназначен для парентерального использования. Концентрации буфера могут лежать в диапазоне от 1 мМ до 50 мМ или от 5 мМ до 50 мМ. В конкретных аспектах, буфер представляет собой L-гистидин в конечной концентрации 5 мМ-50 мМ, или сукцинат в конечной концентрации 1 мМ-10 мМ. В конкретных аспектах, L-гистидин присутствует в конечной концентрации 20 мМ±2 мМ.

В то время как солевой раствор (т.е., раствор, содержащий NaCl) является предпочтительным, другие соли, пригодные для состава, включают, но без ограничения, CaCl₂, KCl и MgCl₂, и их комбинации. Неионные регулирующие тоничность средства, включая, но без ограничения, сахарозу, трегалозу, маннит, сорбит и глицерин, можно использовать вместо соли. Подходящие диапазоны концентрации соли включают, но без ограничения, от 25 мМ до 500 мМ или от 40 мМ до 170 мМ. В одном аспекте солевой раствор представляет собой NaCl, необязательно, присутствующий в концентрации от 20 мМ до 170 мМ.

В предпочтительном варианте осуществления, составы содержат L-гистидиновый буфер с хлоридом натрия.

В другом варианте осуществления, фармацевтическую композицию доставляют в системе с контролируемым высвобождением. Например, средство можно вводить с использованием внутривенной инфузии, чрескожного пластыря, липосом или других способов введения. В другом варианте осуществления, используют полимерные материалы; например, в микросферах или имплантате.

Композиции, описанные в настоящем описании, могут также включать один или несколько белков из S. pneumoniae. Примеры белков S. pneumoniae, пригодных для включения, включают белки, идентифицированные в Публикациях международной патентной заявки No. WO 02/083855 и WO 02/053761.

Аналитические способы

Анализ молекулярной массы и концентрации конъюгатов с использованием анализа HPSEC/УФ/MALS/RI

Образцы конъюгатов инъецируют и разделяют посредством высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (HPSEC). Детекцию осуществляют с использованием серий детекторов ультрафиолетового света (УФ), многоуглового светорассеяния (MALS) и показателя преломления (RI). Концентрацию белка рассчитывают по УФ280 с использованием коэффициента экстинкции. Концентрацию полисахарида подвергают деконволюции из сигнала RI (в который вносят вклад как белок, так и полисахарид) с использованием факторов dn/dc, представляющих собой изменение показателя преломления раствора при изменении концентрации растворенного вещества, выраженной в мл/г. Среднюю молекулярную массу образцов рассчитывают посредством программного обеспечения Astra (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) с использованием информации для измеренных концентрации и светорассеяния для всего пика образца. Существует множество форм средних значений молекулярной массы для полидисперсных молекул. Например, среднечисловая молекулярная масса Mn, средневзвешенная молекулярная масса Mw, и z-средняя молекулярная масса Mz (Molecules, 2015, 20:10313-10341). Если не указано иное, термин «молекулярная масса», как используют на протяжении этого описания, представляет собой средневзвешенную молекулярную массу.

Определение использования лизина в конъюгированном белке в качестве показателя количества ковалентных связей между полисахаридом и белком-носителем

Анализ аминокислот AccQ-Tag (AAA) от Waters используют для измерения степени конъюгации в образцах конъюгата. Образцы гидролизуют с использованием кислого гидролиза в газовой фазе в рабочей станции Eldex, для расщепления белков-носителей на компоненты их аминокислот. Свободные аминокислоты дериватизируют с использованием 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC). Затем дериватизированные образцы анализируют с использованием UPLC с детекцией в УФ на колонке C18. Среднюю концентрацию белка получают с использованием репрезентативных аминокислот, отличных от лизина. Использование лизина во время конъюгации (т.е., потерю лизина) определяют по различию между средним измеренным количеством лизина в конъюгате и ожидаемым количеством лизина в исходном белке.

Тестирование свободного полисахарида

Свободный полисахарид (т.е., полисахарид, не конъюгированный с CRM197) в конъюгате, измеряют посредством сначала преципитации свободного белка и конъюгатов с использованием дезоксихолата (DOC) и соляной кислоты. Затем преципитаты отфильтровывают, и фильтраты анализируют по концентрации свободного полисахарида посредством HPSEC/УФ/MALS/RI. Свободный полисахарид рассчитывают как процент общего полисахарида, измеренный посредством HPSEC/УФ/MALS/RI.

Тестирование свободного белка

Свободный полисахарид, конъюгат полисахарид-CRM197 и свободный CRM197 в образцах конъюгата разделяют посредством капиллярного электрофореза в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (MEKC). Кратко, образцы смешивают с рабочим буфером MEKC, содержащим 25 мМ борат, 100 мМ SDS, pH 9,3, и разделяют в предварительно подготовленных капиллярах из плавленого диоксида кремния без покрытия. Разделение мониторируют при 200 нм, и свободный CRM197 оценивают количественно с использованием стандартной кривой CRM197. Результаты для свободного белка регистрируют как процент от общего содержания белка, определенного способом HPSEC/УФ/MALS/RI.

При наличии описанных различных вариантов осуществления изобретения со ссылкой на сопутствующее описание и чертежи, следует понимать, что изобретение не является ограниченным этими точными вариантами осуществления, и что специалист в данной области может вносить различные изменения и модификации без отклонения от объема или содержания изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Следующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Получение капсульных полисахаридов S. pneumoniae

Способы культивирования пневмококков хорошо известны в данной области. См., например, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Способы получения пневмококковых капсульных полисахаридов также хорошо известны в данной области. См., например, Европейский патент No. EP 0 497 524 B1. Процесс, описанный ниже, в основном следует способу, описанному в Европейском патенте No. EP 0 497 524 B1, и является в основном применимым ко всем пневмококковым серотипам, за исключением специфически модифицированных.

Изоляты пневмококковых серотипов 3, 8, 12F получены из University of Pennsylvania (от Dr. Robert Austrian). Изоляты пневмококковых серотипов 15A, 16F, 23A, 24F, 35B получены из Merck Culture Collection. Изоляты пневмококковых серотипов 23B и 31 получены из Центров контроля и профилактики заболеваний (Atlanta, GA). Изолят пневмококкового серотипа 17F получен из FDA Office of Biologics (Dr. John Robbins). Изолят пневмококкового серотипа 20 получен из ATCC. При необходимости, подтипы можно дифференцировать на основании реакции набухания с использованием специфических антисывороток. См., например, Патент США No. 5847112. Полученные изоляты дополнительно подвергали клональному выделению посредством серийного рассева в две стадии на чашки с агаром, состоящим из свободной от компонентов животного происхождения среды, содержащей соевый пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу без гемина. Клональные изоляты для каждого серотипа далее размножали в жидкой культуре с использованием свободных от компонентов животного происхождения сред, содержащих соевый пептон, дрожжевой экстракт, HEPES, хлорид натрия, бикарбонат натрия, фосфат калия, глюкозу и глицерин, для получения предварительных главных банков клеток.

Получение каждого серотипа пневмококкового полисахарида состояло из размножения клеток и продукции посредством периодической ферментации, с последующей химической инактивацией перед нижестоящей очисткой. Ампулу с размороженным банком клеток для каждого серотипа подвергали размножению с использованием встряхиваемой колбы или культуральной бутыли, содержащей предварительно стерилизованные свободные от компонентов животного происхождения среды для роста, содержащие соевый пептон или ультрафильтрат соевого пептона, дрожжевой экстракт или ультрафильтрат дрожжевого экстракта, HEPES, хлорид натрия, бикарбонат натрия, фосфат калия и глюкозу. Культуру для размножения клеток выращивали в герметично закрытой встряхиваемой колбе или бутыли для минимизации газообмена, с контролем температуры и встряхивания. После достижения указанной плотности культуры, как измерено по оптической плотности при 600 нм, часть культуры для размножения клеток переносили в ферментер для продукции, содержащий предварительно стерилизованные свободные от компонентов животного происхождения среды для роста, содержащие соевый пептон или ультрафильтрат соевого пептона, дрожжевой экстракт или ультрафильтрат дрожжевого экстракта, хлорид натрия, фосфат калия и глюкозу. Температуру, pH, давление и встряхивание контролировали. Обтекание потоком воздуха также контролировали, поскольку барботаж не использовали.

Периодическую ферментацию останавливали посредством добавления химического инактивирующего средства, фенола, когда глюкоза была почти истощена. Чистый фенол добавляли до конечной концентрации 0,8-1,2% для инактивации клеток и высвобождения капсульного полисахарида из клеточной стенки. Первичная инактивация происходит в течение определенного времени внутри ферментера, где необходимо продолжать контролировать температуру и встряхивание. После первичной инактивации, партию переносили в другой сосуд, где ее поддерживали в течение дополнительного определенного времени при контролируемых температуре и встряхивании для полной инактивации. Это подтверждали либо посредством способов рассева микроорганизмов, либо посредством проверки концентрации фенола и указанного времени. Затем инактивированный бульон подвергали очистке.

Очистка Ps

Очистка пневмококкового полисахарида состоит из нескольких операций центрифугирования, глубинной фильтрации, концентрации/диафильтрациии и стадий преципитации. Все способы осуществляли при комнатной температуре если не указано иное.

Инактивированный бульон из культур S. pneumoniae из ферментера подвергали флокуляции с катионным полимером (таким как BPA-1000, петролит «Tretolite» и «Spectrum 8160», и поли(этиленимин), «Millipore pDADMAC»). Катионные полимеры связывались с загрязняющими белками, нуклеиновыми кислотами и клеточным дебрисом. После стадии флокуляции и периода выдержки, флокулированные твердые вещества удаляли посредством центрифугирования и множества стадий глубинной фильтрации. Осветленный бульон концентрировали и подвергали диафильтрации с использованием фильтра с MWCO (отсечением по молекулярной массе) 100 кДа - 500 кДа. Диафильтрацию осуществляли с использованием буфера Трис, MgCl₂ и буфера фосфата натрия. Диафильтрация удаляла остаточную нуклеиновую кислоту и белок.

Дополнительное удаление загрязнений осуществляли посредством повторной преципитации полисахарида в ацетате натрия и феноле с денатурированным спиртом и/или изопропанолом. В ходе стадии преципитации фенолом, ацетат натрия в фосфатно-солевом натриевом буфере и фенол (разжиженные фенолы или твердые фенолы) загружали в ретентат после диафильтрации. Затем спиртовое фракционирование полисахарида проводили в две стадии. На первой стадии низкий процент спирта добавляли к препарату для преципитации клеточного дебриса и других нежелательных загрязнений, в то время как неочищенный полисахарид оставался в растворе. Загрязнения удаляли посредством стадии глубинной фильтрации. Затем полисахарид выделяли из раствора посредством добавления дополнительного изопропанола или денатурированного спирта к партии. Преципитированный осадок полисахарида выделяли посредством центрифугирования, растирали в порошок и высушивали в форме порошка, и хранили замороженным при -70°C.

ПРИМЕР 2: ОБЩИЕ СПОСОБЫ КОНЪЮГАЦИИ

Уменьшение размера и окисление полисахарида

Порошок очищенного пневмококкового капсульного полисахарида растворяли в воде и фильтровали через фильтр 0,45 микрон. Если не указано иное, полисахариды гомогенизировали для уменьшения молекулярной массы полисахарида. Давление для гомогенизации и количество проходов через гомогенизатор контролировали для специфических для серотипа мишеней (150-1000 бар (15-100 МПа); 4-7 проходов).

Полисахарид с уменьшенным размером фильтровали через фильтр 0,2 микрон и затем концентрировали и подвергали диафильтрации против дистиллированной воды с использованием мембраны для проточной ультрафильтрации вдоль потока с NMWCO 5 кДа или 10 кДа.

Затем раствор полисахарида доводили до 22°C и pH 5 с использованием буфера ацетата натрия для минимизации уменьшения размера полисахарида из-за активации.

Очищенные полисахариды подготавливали для конъюгации, т.е., активировали, с использованием окисления метапериодатом натрия (См. Anderson et al., 1986, J. Immunol. 137:1181-1186; и Публикацию патентной заявки США No. US20110195086). Раствор 100 мМ метапериодата натрия добавляли к раствору полисахарида в 50 мМ ацетате натрия. Количество добавленного метапериодата натрия являлось специфическим для серотипа, находясь в диапазоне приблизительно от 0,1 до 0,5 моль метапериодата натрия на моль повторяющегося звена полисахарида, для достижения целевого уровня активации полисахарида (моль альдегида на моль повторяющегося звена полисахарида). Образец перемешивали в течение намеченного времени инкубации с защитой от света.

Активированный продукт подвергали диафильтрации против 10 мМ фосфата калия, pH 6,4, затем против дистиллированной воды, с использованием мембраны для проточной ультрафильтрации вдоль потока с NMWCO 5 кДа или 10 кДа, с последующей дополнительной диафильтрацией против воды. Ультрафильтрацию для всех серотипов проводили при 2-8°C.

Конъюгация

Очищенный CRM197, полученный посредством экспрессии в Pseudomonas fluorescens, как описано ранее (WO 2012/173876 A1), подвергали диафильтрации против буфера 2 мМ фосфата, pH 7,2, с использованием мембраны для проточной ультрафильтрации вдоль потока с NMWCO 5 кДа и фильтровали через фильтр 0,2 микрон.

Получали состав активированных полисахаридов для лиофилизации при 1-6 мг Ps/мл с концентрацией сахарозы 0,5-30% масс./об. Получали состав CRM197 для лиофилизации при 6 мг Pr/мл с концентрацией сахарозы 1% масс./об.

Растворы составов Ps и CRM197 индивидуально лиофилизировали. Лиофилизированные материалы Ps и CRM197 повторно растворяли индивидуально в равных объемах DMSO. Растворы полисахарида и CRM197 смешивали для достижения целевых концентрации полисахарида и массового соотношения полисахарида и CRM197. Массовое соотношение выбирали для контроля соотношения полисахарида и CRM197 в полученном конъюгате. Добавляли цианоборгидрид натрия (1 моль на моль повторяющегося звена полисахарида), и конъюгацию продолжали в течение целевого времени инкубации при 22°C.

Восстановление с использованием боргидрида натрия

Боргидрид натрия (2 моль на моль повторяющегося звена полисахарида) добавляли после реакции конъюгации. Партию разводили в 150 мМ хлориде натрия с приблизительно 0,025% (масс./об.) полисорбата 20, при приблизительно 4°C. Затем буфер фосфат калия добавляли для нейтрализации pH.

Конечная фильтрация и хранение продукта

Затем конъюгаты подвергали диализу против 150 мМ хлорида натрия с 0,05% (масс./об.) полисорбата 20 при приблизительно 4°C с использованием мембраны с NMWCO 300 кДа, или подвергали диафильтрации против 150 мМ хлорида натрия, в присутствии или в отсутствие 25 мМ фосфата калия, pH 7, с использованием мембраны для проточной ультрафильтрации вдоль потока с NMWCO 30 кДа, с последующей концентрацией и диафильтрацией против 10 мМ гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, с 0,015% (масс./об.) полисорбата 20, при 4°C с использованием мембраны для проточной ультрафильтрации вдоль потока с NMWCO 300 кДа. Партию ретентата разводили с использованием дополнительного 10 мМ гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, и фильтровали через фильтр 0,2 микрон. Конечный раствор конъюгата распределяли по аликвотам и замораживали при ≤ -60°C.

ПРИМЕР 3: Кислый гидролиз полисахаридов из серотипов 12F, 23A, 24F и 31

Конъюгация пневмококковых полисахаридов с белками посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, таком как DMSO, описана ранее. Активированные полисахариды (Ps) и белки (Pr), как правило, лиофилизируют, ресуспендируют в DMSO, затем смешивают и инкубируют с цианоборгидридом натрия и боргидридом натрия для осуществления конъюгации. Можно механически уменьшать размер полисахаридов (например, посредством гомогенизации) перед окислением, для уменьшения молекулярной массы Ps и обеспечения единообразного размера Ps для конъюгации. Для многих пневмококковых серотипов, конъюгация подвергнутых механическому уменьшению размера и окислению Ps приводит к получению конъюгатов, удовлетворяющих целевым признакам по размеру, использованию лизина, свободному полисахариду и свободному белку. Однако обнаружено, что для некоторых серотипов целевых признаков конъюгата трудно достигать с использованием этого способа, даже после оптимизации параметров способа.

Уменьшение размера Ps

Порошок очищенного пневмококкового капсульного полисахарида из серотипов 23A, 24F и 31 разводили в воде. Различные экспериментальные фракции обрабатывали либо механически посредством гомогенизации, либо химически посредством кислого гидролиза, для уменьшения молекулярной массы Ps. Давление для гомогенизации и количество проходов через гомогенизатор контролировали для специфических для серотипа мишеней (150-1000 бар (15-100 МПа); 4-7 проходов). Кислый гидролиз проводили посредством нагревания партии до 90-92°C, добавления концентрированной уксусной кислоты до конечной концентрации 200 мМ, затем инкубации в течение вплоть до 90 минут. В конце периода инкубации, партию нейтрализовали посредством добавления концентрированного буфера фосфата калия, pH 7, до конечной концентрации 400 мМ и охлаждения до ≤22°C. Полисахарид с уменьшенным размером фильтровали через фильтр 0,2 микрон и затем концентрировали, и подвергали диафильтрации против воды с использованием мембраны для проточной ультрафильтрации вдоль потока с NMWCO 5 кДа или 10 кДа.

Полисахариды подвергали конъюгации, как описано в примере 2.

Условия и результаты эксперимента обобщены в таблице 1.

Таблица 1. Обобщение экспериментальных фракций, уменьшения размера Ps посредством гомогенизации, по сравнению с кислым гидролизом, для S. pneumoniae серотипов 23A, 24F и 31

Серотип	Способы уменьшения размера	Условия уменьшения размера	Загрузка NaIO4 (мЭкв)	Mw окисленного Ps (кДа)	Условия конъюгации, [Ps] (мг/мл)/Ps:Pr/время (час)/[NaCl] (мМ)	Mw конъюгата (кДа)	Потеря Lys для конъюгата (моль/моль)	Фракция свободного Ps/ свободного Pr для конъюгат
23A	Гомогенизация	600 бар (60 МПа)/3 прохода	0,20	319	3/1,5/3/25	6774	8,4	7%/18%
	Кислый гидролиз	90°C/90 мин	0,20	97	3/1,5/2/25	2996	12,6	11%/<3%
24F	Гомогенизация	600 бар (60 МПа)/5 проходов	0,18	227	2/1,5/17/25	8727	10,6	51%/15%
	Кислый гидролиз	92°C/90 мин	0,18	100	2/1,5/ 15/25	5816	9,0	22%/2%
31	Гомогенизация	400 бар (40 МПа)/5 проходов	0,12	186	4/1,5/4/25	3323	11,5	18%/3%
	Кислый гидролиз	90°C/30 мин	0,16	119	4/1,2/4/25	3201	13,3	2%/<2%

Как видно в таблице 1, уменьшение размера посредством кислого гидролиза обеспечивает средства для достижения более высокой потери лизина (серотип 23A), более низкого уровня свободного Ps (серотип 24F и 31) или более низкого уровня свободного Pr (серотипы 23A, 24F и 31), по сравнению с гомогенизацией. Для серотипов 23A и 24F, более высокие уровни свободного белка в случае гомогенизации могут быть ассоциированы с агрегированными формами, которые могут, в свою очередь, вносить вклад в более высокие измеренные уровни Mw конъюгата.

Без связи с конкретной теорией, эти данные позволяют предполагать, что более низкая молекулярная масса окисленного полисахарида (предпочтительно, менее 150 кДа), достигнутая посредством кислого гидролиза, способствовала улучшению конъюгации (меньшему количеству свободного Ps или свободного Pr). Считают, что альтернативные способы уменьшения размера (например, посредством кислого гидролиза) можно использовать для получения полисахарида в этом предпочтительном диапазоне размеров для достижения сходных преимуществ для конъюгации.

Влияние типа кислоты при поддержании постоянного pH, на кислый гидролиз серотипа 12F

Для определения того, влияет ли тип кислоты на размер полисахарида, сравнивали кислый гидролиз с использованием соляной кислоты и уксусной кислоты. Порошок очищенного пневмококкового капсульного полисахарида из S. pneumoniae серотипа 12F растворяли в воде и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Партию разводили до 2,5 г Ps/л и разделяли на две фракции. Кислый гидролиз проводили для обеих фракций посредством их первоначального нагревания до 80°C. Кислоту добавляли для поддержания сходного pH для обеих фракций. К одной фракции добавляли ледяную уксусную кислоту до конечной концентрации 200 мМ, pH 2,6. К другой фракции добавляли 1 Н соляную кислоту до конечной концентрации 2,5 мМ, pH 2,7. Затем обе фракции инкубировали в течение 155 минут. В конце периода инкубации, фракции нейтрализовали посредством добавления концентрированного буфера фосфата калия, pH 7, до конечной концентрации приблизительно 400 мМ и охлаждали до 4°C. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2: Кислый гидролиз полисахарида S. pneumoniae 12F с использованием соляной кислоты

Описание	Температура кислого гидролиза (°C)	Время кислого гидролиза (мин)	pH кислого гидролиза	Mn (кДа)	Mw (кДа)	Полидисперсность	Конц. Ps (мг/мл)
Подпитка кислого гидролиза	N/A	N/A	N/A	349,7	448,6	1,283	2,496
После кислого гидролиза с использованием 200 мМ уксусной кислоты	80,0 +/- 0,5	155	2,64	75,2	104,4	1,388	1,866
После кислого гидролиза с использованием 2,5 мМ соляной кислоты	80,0 +/- 0,5	155	2,70	76,5	106,6	1,393	1,856

Для обоих условий кислого гидролиза получили полисахариды сходных размеров.

ПРИМЕР 4: Влияние массового соотношения сахарозы и полисахарида на растворение полисахаридов из S. pneumoniae серотипов 3, 8 и 24F в DMSO

При подготовке для конъюгации полисахаридов с белками в апротонном растворителе, растворы полисахарида и белка, как правило, лиофилизируют. Для большинства пневмококковых серотипов, получение составов активированных полисахаридов (Ps) для лиофилизации в водном растворе при 6 мг Ps/мл с концентрацией сахарозы 5% масс./об. (50 мг сахарозы/мл) обеспечивает лиофилизированный материал, пригодный для повторного растворения в DMSO и конъюгации. Для серотипов 3, 8, и 24F, обнаружено, при таком получении состава (6 мг Ps/мл, 50 мг сахарозы/мл, массовое соотношение сахарозы:Ps=8,3) получали лиофилизированный материал, который не растворялся в DMSO.

Проводили эксперименты для оптимизации лиофилизации состава активированного полисахарида для растворения в DMSO. Получали составы активированных полисахаридов в диапазоне концентраций полисахарида (1-6 мг Ps/мл) и концентраций сахарозы (50-300 мг сахарозы/мл) в полипропиленовых контейнерах. Растворы лиофилизировали для удаления воды, затем DMSO добавляли при температуре окружающей среды, при перемешивании, для повторного растворения полисахаридов. Успешное растворение определяли посредством визуального наблюдения.

Результаты для серотипов 3, 24F и 8 показаны в таблицах 3, 4 и 5, соответственно.

Таблица 3. Эксперименты по лиофилизации состава и растворению для серотипа 3

Условия эксперимента	Полисахарид	Условия получения состава перед лиофилизацией			Добавление DMSO после лиофилизации
	Mw (кДа)	[Ps], (мг/мл)	[сахароза], (мг/мл)	Массовое соотношение сахарозы:Ps	[Ps], мг/мл	Растворение
1	211	6,0	30	5,0	2,0	Нет
2	211	6,0	40	6,7	4,0	Нет
3	211	6,0	50	8,3	6,0	Нет
4	212	1,0	5,0	5,0	2,0	Нет
5	212	1,0	10	10	2,0	Нет
6	212	1,0	20	20	2,0	Нет
7	212	1,0	50	50	2,0	Да
8	212	1,0	100	100	2,0	Да
9	212	6,0	50	8,3	6,0	Нет
10	212	4,0	200	50	6,0	Да
11	212	3,0	150	50	6,0	Да
12	212	2,0	100	50	6,0	Да
13	212	4,0	200	50	3,0	Да
14	257	2,0	100	50	2,0-5,0 (множество фракций)	Да (все фракции)
15	253	2,0	40	20	3,0	Нет
16	253	2,0	60	30	3,0	Да
17	253	2,0	80	40	3,0	Да
18	253	2,0	100	50	3,0	Да
19	253	4,0	80	20	3,0	Нет
20	253	4,0	120	30	3,0	Неполное растворение
21	253	4,0	160	40	3,0	Да
22	253	4,0	200	50	3,0	Да

Таблица 4. Эксперименты по лиофилизации состава и растворению для серотипа 24F

Условия эксперимента	Полисахарид	Условия получения состава перед лиофилизацией			Добавление DMSO после лиофилизации
	Mw (кДа)	[Ps], (мг/мл)	[сахароза], (мг/мл)	Массовое соотношение сахарозы:Ps	[Ps], мг/мл	Растворение
1	142	6	50	8,3	2,0-8,0 (множество фракций)	Нет
2	142	6	50	8,3	4,0	Нет
3	142	6	300	50	6,0	Да
4	142	4	200	50	4,0	Да*
5	142	3	150	50	4,0	Да
6	142	2	100	50	4,0	Да
7	142	2	100	50	4,0-8,0 (множество фракций)	Да
8	132	6	50	8,3	4,0-8,0 (множество фракций)	Нет
9	132	2	100	50	4,0-8,0 (множество фракций)	Да
10	142	2	100	50	3,0-4,0 (множество фракций)	Да
11	227	2	100	50	2,0-6,0 (множество фракций)	Да
12	63	6	50	8,3	3,0-4,0 (множество фракций)	Нет
13	63	2	100	50	3,0-5,0 (множество фракций)	Да

* При условиях эксперимента 4, наблюдали единичную небольшую видимую частицу, которую считали не обусловленной неполным растворением

Таблица 5: Эксперименты по лиофилизации состава и растворению для серотипа 8

Условия эксперимента	Полисахарид	Условия получения состава перед лиофилизацией			Добавление DMSO после лиофилизации
	Mw (кДа)	[Ps], (мг/мл)	[сахароза], (мг/мл)	Массовое соотношение сахарозы:Ps	[Ps], мг/мл	Растворение
1	233	6,0	50	8,3	4,0-8,0 (множество фракций)	No
2	233	2,0	100	50	4,0-8,0 (множество фракций)	Да
3	252	2,0	100	50	4,0-8,0 (множество фракций)	Да

Для этих серотипов, полное растворение наблюдали в пределах исследованного диапазона концентраций полисахарида (как для лиофилизации, так и для растворения), однако растворение являлось зависимым от концентраций как полисахарида, так и сахарозы. Конкретно, когда массовое соотношение сахарозы составляло менее 30X по отношению к полисахариду, растворения в DMSO после лиофилизации не достигали. Наиболее единообразные результаты растворения обнаружены, когда массовое соотношение сахарозы составляло по меньшей мере 40X по отношению к полисахариду.

Несколько фракций для положительных по растворению условий успешно подвергали конъюгации с CRM197, как описано в примере 2.

Влияние типа сахара и массового соотношения сахара и полисахарида на растворение полисахарида из S. pneumoniae серотипа 3 в DMSO

Проводили эксперименты для оценки влияния типа сахара и массового соотношения сахара:полисахарида на растворение лиофилизированного активированного полисахарида в DMSO. Получали состав активированного полисахарида серотипа 3 либо при 2,5, либо при 6 мг Ps/мл, и в диапазоне концентраций сахара (50-150 мг сахара/мл) в полипропиленовых контейнерах. Тестированные сахара представляли собой сахарозу, трегалозу и маннит. Растворы лиофилизировали для удаления воды, затем DMSO добавляли при температуре окружающей среды при перемешивании для повторного растворения полисахаридов. Успешное растворение определяли посредством визуального наблюдения. Результаты показаны в таблице 6.

Таблица 6: Влияние типа сахара на полисахарид серотипа 3

Условия эксперимента	Полисахарид	Условия получения состава перед лиофилизацией				Добавление DMSO после лиофилизации
	Mw (кДа)	[Ps], (мг/мл)	Тип сахара	[сахар], (мг/мл)	массовое соотношение сахара:Ps	[Ps], мг/мл	Растворение
A1	171	6,0	Сахароза	50	8,3	4,4	Нет
A2	171	2,5	Сахароза	50	20	4,4	Нет
A3	171	2,5	Сахароза	75	30	4,4	Да
A4	171	2,5	Сахароза	100	40	4,4	Да
A5	171	2,5	Сахароза	125	50	4,4	Да
A6	171	2,5	Сахароза	150	60	4,4	Да
B1	171	6,0	Трегалоза	50	8,3	4,4	Нет
B2	171	2,5	Трегалоза	50	20	4,4	Нет
B3	171	2,5	Трегалоза	75	30	4,4	Да
B4	171	2,5	Трегалоза	100	40	4,4	Да
B5	171	2,5	Трегалоза	125	50	4,4	Да
B6	171	2,5	Трегалоза	150	60	4,4	Да
C1	171	6,0	Маннит	50	8,3	4,4	Нет
C2	171	2,5	Маннит	50	20	4,4	Нет
C3	171	2,5	Маннит	75	30	4,4	Да*
C4	171	2,5	Маннит	100	40	4,4	Да
C5	171	2,5	Маннит	125	50	4,4	Да
C6	171	2,5	Маннит	150	60	4,4	Нет

* вязкий

Для всех использованных сахаров, растворения в DMSO достигали для массовых соотношений сахара 30X и выше, за исключением маннита, который, по-видимому, достигал предела растворимости в DMSO при 60X. Наиболее единообразные результаты растворения обнаружены, когда массовое соотношение сахара составляло по меньшей мере 40X относительно полисахарида.

Проводили другой эксперимент, исследующий использование комбинаций сахаров в составах для лиофилизации активированного полисахарида серотипа 3. Составы всех фракций получали с общим массовым соотношением сахара 40X, поскольку при этом соотношении получали единообразное растворение в DMSO. Молекулярная масса полисахарида составляла 171 кДа. Во всех фракциях использовали сахарозу, отдельно, с трегалозой или с маннитом. Растворы лиофилизировали для удаления воды, затем DMSO добавляли при температуре окружающей среды при перемешивании для повторного растворения полисахаридов. Успешное растворение определяли посредством визуального наблюдения. Результаты показаны в таблице 7.

Таблица 7: Комбинации сахаров для растворения полисахаридов в DMSO

Условия получения состава перед лиофилизацией							Добавление DMSO после лиофилизации
[Ps], (мг/мл)	[Сахароза](мг/мл)	Массовое соотношение сахарозы:Ps	Сахар типа 2	[сахар 2] (мг/мл)	массовое соотношение сахара 2:Ps	Общее массовое соотношение сахара: Ps	[Ps], мг/мл	Растворение
2,5	100	40	N/A	0	0	40	4,4	Да
2,5	75	30	Трегалоза	25	10	40	4,4	Да
2,5	50	20	Трегалоза	50	20	40	4,4	Да
2,5	75	30	Маннит	25	10	40	4,4	Да

Растворения в DMSO достигали для всех тестированных фракций.

ПРИМЕР 5: Эффект хлорида натрия на конъюгацию S. pneumoniae серотипов 15A, 16F, 17F, 20, 24F и 35B с использованием восстановительного аминирования в DMSO

Получали составы активированных полисахаридов для лиофилизации при 2-6 мг Ps/мл с концентрациями сахарозы 5-10% масс./об. в полипропиленовых контейнерах. Получали состав CRM197 для лиофилизации при 6 мг Pr/мл с концентрацией сахарозы 1% масс./об.

Растворы составов Ps и CRM197 индивидуально лиофилизировали. Лиофилизированные материалы Ps и CRM197 повторно растворяли в DMSO. Для некоторых фракций, 5 M раствор для хранения хлорида натрия использовали для добавления в раствор CRM197 до лиофилизации или в раствор Ps после повторного растворения для достижения конечных концентраций во время конъюгации 10-100 мМ хлорида натрия. Другие параметры способа сохраняли постоянными в этих экспериментах.

Растворы Ps и CRM197 после повторного растворения смешивали и перемешивали до целевых концентраций специфического для серотипа полисахарида и белка. Добавляли цианоборгидрид натрия (1 моль на моль повторяющегося звена полисахарида), и конъюгацию продолжали со специфической для серотипа длительностью. Восстановление с использованием боргидрида натрия и конечную фильтрацию проводили, как описано в примере 2.

Результаты

Результаты экспериментов для полисахарида из S. pneumoniae серотипа 20, показывающие влияние хлорида натрия во время конъюгации на признаки конъюгата, показаны на фигурах 1, 2 и 3. Результаты экспериментов для S. pneumoniae серотипов 16F и 24F показаны в таблице 8.

Как показано на фигуре 1 для серотипа 20, увеличение концентрации хлорида натрия во время конъюгации (вплоть до приблизительно 50 мМ) увеличивало размер конъюгата. Как показано на фигуре 2, увеличение концентрации хлорида натрия (вплоть до приблизительно 25 мМ) увеличивало использование лизина, и как показано на фигуре 3, увеличение концентрации хлорида натрия (вплоть до приблизительно 50 мМ) уменьшало уровень свободного Ps и свободного Pr.

Таблица 8. Влияние хлорида натрия на признаки конъюгата для S. pneumoniae серотипов 16F и 24F

Серотип	Концентрация NaCl во время конъюгации (мМ)	Mn/Mw конъюгата (кДа)	Использование лизина (моль/моль)	Фракция свободного Ps	Фракция свободного Pr
16F	0	438/1040	9,3	23%	7%
	25	1161/3944	11,0	7%	4%
24F	0	2534/6478	1,8	85%	24%
	25	2059/3402	4,5	59%	10%
15A	0	954/1343	7,8	51%	23%
	25	1748/3371	8,9	23%	7%
35B	0			N/R	>32%
	25			32%	5%

Как показано в таблице 8 для серотипа 16F, включение 25 мМ хлорида натрия во время конъюгации увеличивало размер конъюгата и использование лизина, в то же время уменьшая уровень свободного Ps и свободного Pr. Как показано в таблице 8 для серотипа 24F, включение 25 мМ хлорида натрия во время конъюгации увеличивало использование лизина, в то же время уменьшая уровень свободного Ps и свободного Pr.

Сходные результаты обнаружены для серотипов 15A и 35B. Для серотипа 15A, включение 25 мМ хлорида натрия во время конъюгации увеличивало размер конъюгата и использование лизина, в то же время уменьшая уровень свободного полисахарида и свободного белка, по сравнению с отсутствием соли во время конъюгации. Для серотипа 35B, включение 25 мМ хлорида натрия во время конъюгации увеличивало размер конъюгата и использование лизина (данные не представлены), в то же время уменьшая уровень свободного белка по сравнению с отсутствием соли во время конъюгации.

Эффект типа и концентрации соли на конъюгацию S. pneumoniae серотипа 17F с использованием восстановительного аминирования в DMSO

Получали состав активированного полисахарида серотипа 17F для лиофилизации при 6 мг Ps/мл с концентрациями сахарозы 5% масс./об. в полипропиленовых контейнерах. Получали состав CRM197 для лиофилизации при 6 мг Pr/мл с концентрацией сахарозы 1% масс./об.

Растворы составов Ps и CRM197 индивидуально лиофилизировали. Лиофилизированные материалы Ps и CRM197 повторно растворяли в DMSO. Для некоторых фракций, концентрированные растворы солей добавляли в раствор Ps после повторного растворения или в смесь Ps-CRM для достижения конечных концентраций во время конъюгации 1-100 мМ соли. Использованные растворы для хранения включали 1M или 5M хлорид натрия, 1M или 3M хлорид калия и 1M хлорид магния. Другие параметры способа сохраняли постоянными в этих экспериментах.

Растворы Ps и CRM197 после повторного растворения смешивали и перемешивали до 2,7 г Ps/мл и 1,8 мг CRM197/мл. Добавляли цианоборгидрид натрия (1 моль на моль повторяющегося звена полисахарида), и конъюгацию продолжали в течение 1 час. Боргидрид натрия (2 моль на моль повторяющегося звена полисахарида) добавляли после реакции конъюгации. Партию разводили в 150 мМ хлориде натрия с приблизительно 0,025% (масс./об.) полисорбата 20, при приблизительно 4°C. Затем добавляли буфер фосфат калия для нейтрализации pH.

Затем конъюгаты подвергали диализу против 150 мМ хлорида натрия с 0,05% (масс./об.) полисорбата 20 при приблизительно 4°C с использованием мембраны с NMWCO 300 кДа. Конечный раствор конъюгата распределяли по аликвотам и хранили при 4°C.

Результаты

Результаты показаны в таблице 9. 2% представляет собой предел детекции.

Конц. соли (мМ)	Тип соли	Mn конъюгата (кДа)	Mw конъюгата (кДа)	% свободного Ps	Использование лизина (моль/моль)	% свободного белка
0	N/A	966	1419	8%	6,5	7%
1	NaCl	1041	1671	10%	8,1	6%
2	NaCl	1318	2113	10%	7,8	5%
5	NaCl	1964	2933	5%	8,8	3%
10	NaCl	2407	3640	8%	9,4	2%
12,5	NaCl	2529	3749	7%	9,6	< 2%
25	NaCl	2657	3772	4%	8,8	4%
50	NaCl	3036	4198	3%	9,5	< 2%
100	NaCl	3031	4249	3%	9,4	< 2%
0	N/A	1012	1339	9%	6,8	7%
1	KCl	1189	1653	9%	7,0	6%
2	KCl	1533	2018	5%	7,5	4%
5	KCl	1862	2474	4%	8,7	3%
10	KCl	2416	3278	6%	9,1	3%
12,5	KCl	2654	3532	4%	9,2	2%
25	KCl	2641	3446	3%	9,6	3%
0	N/A	900	1335	9%	6,3	7%
25	MgCl2	2878	4361	9%	8,2	16%
50	MgCl2	1374	1994	12%	6,6	18%
100	MgCl2	798	1175	29%	4,0	34%

Для условий с использованием хлорида натрия и хлорида калия, увеличение концентрации соли во время конъюгации увеличивало размер конъюгата и использование лизина и уменьшало уровень свободного Ps и свободного Pr. Эти эффекты достигали плато при приблизительно 12,5 мМ для обоих типов соли. Для 25 мМ и 50 мМ хлорида магния показано увеличение размера конъюгата и использования лизина, по сравнению с условиями в отсутствие соли. Однако, по-видимому, присутствовали увеличение уровней свободного полисахарида и свободного белка, и уменьшение степени конъюгации (измеренное по потере лизина и размеру конъюгата) при увеличении концентрации хлорида магния от 25 мМ до 100 мМ. Таким образом, может являться предпочтительным поддержание хлорида магния в диапазоне концентраций 0-50 мМ.

ПРИМЕР 6: Получение составов моновалентных конъюгатов

Конъюгаты пневмококкового полисахарида-CRM197 получали, как описано в примерах 2-5. Требуемый объем нерасфасованных конъюгатов, необходимый для получения целевой концентрации индивидуальных серотипов, рассчитывали на основании объема партии и концентраций индивидуальных нерасфасованных полисахаридов. Индивидуальные серотипы (12F, 15A, 16F, 17F, 23A, 23B, 24F, 31 и 35B) объединяли с наполнителями, стерилизовали фильтрацией и добавляли к APA в условиях перемешивания. Конечная концентрация каждой моновалентной конъюгированной вакцины составляла 4 мкг/мл (масс./об. PnPs) с 20 мМ гистидином, 150 мМ NaCl, 0,2% (масс./об.) PS-20 и 0,250 мг/мл (масс./об. Al) в форме APA.

ПРИМЕР 7: Исследование иммуногенности моновалентного конъюгата (15A, 16F, 17F, 23A, 23B, 24F, 31 и 35B) у новозеландских кроликов-альбиносов

Иммуногенность моновалентных конъюгатов оценивали в модели на новозеландских кроликах-альбиносах (NZWR). Взрослых новозеландских кроликов-альбиносов (NZWR, n=3/группу) внутримышечно (IM) иммунизировали с использованием 0,25 мл соответствующей моновалентной конъюгированной вакцины на сутки 0 и сутки 14 (меняя бок). Моновалентную пневмококковую вакцину дозировали при 1 мкг PnPs (15A, 16F, 17F, 23A, 23B, 24F, 31 или 35B, каждый конъюгированный с CRM197) с 62,5 мкг адъюванта фосфата алюминия (APA) для иммунизации. Сыворотки собирали до начала исследования (до иммунизации) и на сутки 14 (после дозирования 1, PD1) и 28 (после дозирования 2, PD2). NZWR обследовал по меньшей мере ежесуточно квалифицированный специалист по уходу за животными, по любым признакам заболевания или недомогания. Вакцинные составы у NZWR, по-видимому, являлись безопасными и хорошо переносимыми. Все эксперименты на животных проводили в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол эксперимента на NZWR был одобрен Комитетами по содержанию и использованию лабораторных животных как Merck & Co., Inc (Kenilworth, NJ), так и Covance (Denver, PA).

Сыворотки NZWR тестировали в анализах ELISA для оценки иммуногенности IgG с использованием для покрытия концентрации 1-2 мг/мл соответствующего PnPs. Функциональное антитело определяли посредством анализов опсонофагоцитоза (OPA), на основании описанных ранее способов. См., например, Caro-Aguilar et al., 2017, Vaccine 35:865-72 и Burton et al., 2006, Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9.

Обнаружено, что все моновалентные пневмококковые конъюгированные вакцины являлись иммуногенными у кроликов и приводили к образованию функционального антитела, уничтожающего соответствующий бактериальный штамм (данные не представлены). Обнаружено, что серотип 12F являлся иммуногенным у мышей (данные не представлены).

Claims (4)

1. Способ лиофилизации раствора, содержащего активированный полисахарид S. Pneumoniae, для получения лиофилизированного материала, где активированный полисахарид S. Pneumoniae выбран из группы, состоящей из полисахаридов из S. pneumoniae серотипов 3, 8 и 24F, где способ включает:

a) добавление сахара, выбранного из сахарозы, или трегалозы, или комбинации сахарозы и трегалозы, к раствору, содержащему активированный полисахарид S. Pneumoniae, для получения массового соотношения сахара:полисахарида по меньшей мере 40 и раствора с подходящей вязкостью; и

b) лиофилизацию раствора с подходящей вязкостью, содержащего активированный полисахарид S. Pneumoniae, для получения лиофилизированного материала, где лиофилизированный материал подходит для повторного растворения в диметилсульфоксиде (DMSO) и применения в реакциях конъюгации.

2. Способ по п. 1, где концентрация сахара составляет более чем 5% масс./об.

Images