KR20210005161A - 리오스피어로부터 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법 - Google Patents

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패트릭 레너드 알
아킬레쉬 밤바니
크리스토퍼 존 패럴
패트릭 맥휴
모리사 씨. 존스
다니엘 디. 로쓰
제시카 알. 시나콜라
저스틴 스탄브로
매튜 피. 왓슨
에밀리 웬
마이클 에이. 윈터스
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머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
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Abstract

특정한 폐렴구균 혈청형의 1종 이상의 활성화된 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 담체 단백질의 리오스피어 및 1종 이상의 폴리사카라이드의 리오스피어의 형태로 개별적으로 동결건조시키는, 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법이 기재된다. 미리 결정된 양의 담체 단백질 리오스피어 및 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어를 함께 혼합하고, 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하여 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조한다. 각각 특정한 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하는 복수의 접합체는 백신에 사용하기 위한 접합체의 조합을 갖는 다가 폐렴구균 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

Description

리오스피어로부터 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법
본 발명은 특정한 폐렴구균 혈청형의 1종 이상의 활성화된 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 담체 단백질의 리오스피어 및 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드의 리오스피어의 형태로 개별적으로 동결건조시키는, 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 미리 결정된 양의 담체 단백질 리오스피어 및 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어를 함께 혼합하고, 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하여 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조한다. 각각 특정한 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하는 복수의 접합체는 백신에 사용하기 위한 접합체의 조합을 갖는 다가 폐렴구균 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.
피막화된 박테리아의 한 예인 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)는 전세계적으로 심각한 질환의 유의한 원인이다. 1997년에, 질환 제어 및 예방 센터 (CDC)는 미국에서 매년 3,000건의 폐렴구균성 수막염 사례, 50,000건의 폐렴구균성 박테리아혈증 사례, 7,000,000건의 폐렴구균성 중이염 사례 및 500,000건의 폐렴구균성 폐렴 사례가 존재하는 것으로 추정하였다. 문헌 [Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13]을 참조한다. 추가로, 이들 질환의 합병증은 유의할 수 있으며, 일부 연구는 폐렴구균성 수막염에 의한 최대 8%의 사망률 및 25%의 신경계 후유증을 보고하고 있다. 문헌 [Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97]을 참조한다.
수년 동안 허가되어 온 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 백신은 성인, 특히 고령자 및 고위험자에서 폐렴구균성 질환을 예방하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, 영아 및 소아는 미접합 폐렴구균 폴리사카라이드에 불량하게 반응한다. 박테리아 폴리사카라이드는 T-세포-비의존성 면역원이며, 영아에서 약한 반응을 도출하거나 전혀 반응을 도출하지 않는다. 담체 단백질에 대한 박테리아 폴리사카라이드 면역원의 화학적 접합은 영아에서의 면역 반응을 T-세포-의존성 면역 반응으로 전환시킨다. 디프테리아 톡소이드 (DTx, DT의 화학적으로 해독된 버전) 및 CRM197은 그의 아미노산 서열 내 T-세포-자극 에피토프의 존재로 인해 박테리아 폴리사카라이드 면역원을 위한 담체 단백질로서 설명되어 왔다.
따라서, 담체 단백질에 접합된 박테리아 피막 폴리사카라이드를 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신이 개발되었고, 추가의 것이 개발 중이다. 개발된 접합체 백신의 예는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 유형 b (Hib) 접합체 백신 (예를 들어, Hib타이터(HIBTITER)®) 뿐만 아니라 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)에 대한 접합체 백신 (예를 들어, 프리베나르(PREVNAR)® 및 프리베나르 13®) 및 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)에 대한 접합체 백신 (예를 들어, 멘주게이트(MENJUGATE)®)을 포함한다.
담체 단백질에 대한 폴리사카라이드 항원의 접합 시, 반응 혼합물을 정제하여 접합된 단백질을 갖지 않는 유리 폴리사카라이드, 접합된 폴리사카라이드 항원을 갖지 않는 유리 담체 단백질 및 저분자량 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제거할 수 있다. 유리 폴리사카라이드, 유리 단백질 및 저분자량 접합체의 정제를 위한 다양한 방법, 예를 들어 소수성 크로마토그래피, 접선 한외여과, 투석여과 등이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO00/38711, 미국 특허 번호 6,146,902 및 문헌 [Lei et al., 2000, Dev. Biol. 103:259-264]을 참조한다. 유리 폴리사카라이드의 양을 감소시키는 방법은 미국 특허 번호 7,709,001 및 미국 공개 출원 번호 20110201791에 개시된 바와 같은 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 공동-동결건조를 추가로 포함하며, 이들 문헌은 또한, 특히 피막 폴리사카라이드 19A에 관하여, 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 공동-동결건조가 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 개별 동결건조보다 바람직하다는 것을 제시하였다. 그러나, 공동-동결건조는 덜 편리한 취급으로 개별 제제 및 사이클 파라미터를 최적화할 수 없게 하고, 목적하는 용액 크기를 갖는 담체 단백질 및 폴리사카라이드 혈청형 공급물을 생산할 수 없게 한다.
따라서, 유리 폴리사카라이드 및 저분자량 접합체와 같은 불순물이 없는 안정한 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 개선된 방법에 대한 필요성이 계속 존재한다.
본 발명은 활성화된 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 리오스피어로서 개별로 또는 개별적으로 동결건조시키는, 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 리오스피어를 미리 정의된 비로 혼합할 수 있고, 이어서 이를 유기 용매 중에서 재구성하여 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 재구성된 혼합물을 제공하고, 이어서 이를 함께 접합시켜 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조한다. 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 리오스피어로 개별 건조시키는 공정은 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 공동-동결건조에 비해 다양한 이점, 예컨대 비제한적으로, 개별 제제 및 사이클 파라미터를 최적화하는 능력, 편리한 취급, 및 목적하는 용액 크기를 갖는 개별 폴리사카라이드 및 담체 단백질 제제를 생산하는 능력을 제공한다.
본 발명은 담체 단백질에 공유 연결된 1종의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 리오스피어 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 리오스피어 조성물을 제공하는 단계;
(b) 소정량의 제1 리오스피어 조성물 및 소정량의 제2 리오스피어 조성물을 함께 조합하여 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 리오스피어 혼합물을 제공하는 단계;
(c) 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하고 혼합하여 재구성된 혼합물을 제공하는 단계; 및
(d) 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 1종의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 1종 이상의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 리오스피어 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 리오스피어 조성물을 제공하는 단계;
(b) 소정량의 제1 리오스피어 조성물 및 소정량의 제2 리오스피어 조성물을 함께 조합하여 담체 단백질에 대한 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 리오스피어 혼합물을 제공하는 단계;
(c) 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하고 혼합하여 재구성된 혼합물을 제공하는 단계; 및
(d) 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 담체 단백질에 공유 연결된 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 2종 이상의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 리오스피어 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 리오스피어 조성물을 제공하는 단계;
(b) 소정량의 제1 리오스피어 조성물 및 소정량의 제2 리오스피어 조성물을 함께 조합하여 담체 단백질에 대한 2종 이상의 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 리오스피어 혼합물을 제공하는 단계;
(c) 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하고 혼합하여 재구성된 혼합물을 제공하는 단계; 및
(d) 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나의 특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수 (마이크로웨이브 진공 건조 (MDV))로부터 선택된 승화 건조 공정에 의해 제조된다.
특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 1종, 2종 또는 그 초과의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 수용액 및 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 제2 수용액을 승화 건조시켜 제1 및 제2 건조된 조성물을 생산함으로써 제조되며, 여기서 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% 이상의 수크로스를 포함하고, 여기서 승화 건조는 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 4% 내지 6% 수크로스를 포함하고, 제2 수용액은 약 4% 내지 8% 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6, 9 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 아세톤 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 10분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는시트레이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득된다.
특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드이다. 특정한 실시양태에서, 불활성화된 박테리아 톡소이드는 CRM197이다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
본 발명은 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) (i) 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 수용액 및 (ii) 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 제2 수용액을 제공하는 단계;
(b) 제1 수용액 및 제2 수용액을 리오스피어를 생산하기 위한 승화 건조 공정에서 개별적으로 건조시켜 건조된 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 제1 리오스피어 조성물 및 건조된 담체 단백질을 포함하는 제2 리오스피어 조성물을 생산하는 단계;
(c) 소정량의 제1 리오스피어 조성물 및 소정량의 제2 리오스피어 조성물을 함께 조합하여 담체 단백질에 대한 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 리오스피어 혼합물을 제공하는 단계;
(d) 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하고 혼합하여 재구성된 혼합물을 제공하는 단계; 및
(e) 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
를 포함한다.
방법의 특정한 실시양태에서, 승화 건조 공정은 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% 이상의 수크로스를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 4% 내지 6% 수크로스를 포함하고, 제2 수용액은 약 4% 내지 8% 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6, 9 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 아세톤, 디메틸술폭시드 (DMSO) 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (d)에서의 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 10분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는시트레이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 1종 이상의 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득된다.
특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드이다. 특정한 실시양태에서, 불활성화된 박테리아 톡소이드는 CRM197이다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
본 발명은 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은
(a) (i) 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액; 또는
(ii) 각각 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액
을 제공하는 단계;
(b) 각각 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 2종 이상의 제2 수용액을 제공하고, 여기서 2종 이상의 제2 수용액의 양은 적어도 2종 이상의 제1 수용액의 양에 상응하는 것인 단계;
(c) 2종 이상의 제1 수용액 및 2종 이상의 제2 수용액을 리오스피어를 생산하기 위한 승화 건조 공정에서 개별적으로 건조시켜, 각각 건조된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 리오스피어 조성물 및 각각 건조된 담체 단백질을 포함하는 2종 이상의 제2 리오스피어 조성물을 생산하는 단계;
(d) 소정량의 제1 리오스피어 조성물 및 소정량의 제2 리오스피어 조성물을 독립적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 복수의 리오스피어 혼합물을 제공하는 단계;
(e) 복수의 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 제공하는 단계;
(f) 복수의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여 복수의 접합체 용액을 생산하는 단계; 및
(g) 복수의 접합체 용액 중 2종 이상을 조합하여, 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 포함한다.
방법의 특정한 실시양태에서, 승화 건조 공정은 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% 이상의 수크로스를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 4% 내지 6% 수크로스를 포함하고, 제2 수용액은 약 4% 내지 8% 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 수용액은 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 제2 수용액은 약 6, 9 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 아세톤, 디메틸술폭시드 (DMSO) 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (e)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (e)에서의 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 10분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 완충제는 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는시트레이트 완충제이다.
특정한 실시양태에서, 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득된다.
특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드이다. 특정한 실시양태에서, 불활성화된 박테리아 톡소이드는 CRM197이다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
본 발명은 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법을 추가로 포함하며, 이 방법은
(a) 23종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 23종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 각각의 23종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 23종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 23종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 23종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(c) 각각의 23종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 23종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 23종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 23종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 23종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 23종의 접합체 용액을 조합하여 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F에 대한 다가 면역원성 복합체 또는 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F에 대한 다가 면역원성 복합체 또는 백신을 제조하는 방법을 추가로 포함하며, 이 방법은
(a) 15종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 15종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 각각의 15종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 15종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 15종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 15종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(c) 각각의 15종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 15종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 15종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 15종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 15종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 15종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은
(a) 13종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 13종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 각각의 13종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 13종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 13종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 13종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(c) 각각의 13종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 13종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 13종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 13종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 13종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 13종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은
(a) 10종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 10종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(b) 각각의 10종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 10종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 10종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 10종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(c) 각각의 10종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 10종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
(d) 각각의 10종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 10종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 10종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(e) 10종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 리오스피어 조성물은 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
방법의 특정한 실시양태에서, 승화 건조 공정은 담체 단백질을 포함하는 각각의 수용액 및 폴리사카라이드를 포함하는 각각의 수용액을 리오스피어 비드의 형태로 개별적으로 동결시키는 것을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 리오스피어 담체 단백질 및 리오스피어 폴리사카라이드 조성물은 각각 상기 언급된 바와 같은 특정한 열거된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 복수의 개별 수성 폴리사카라이드 용액 및 각각 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 다수의 수성 담체 단백질 용액을 승화 건조시켜 건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질 조성물을 생산함으로써 제조되며, 여기서 수성 담체 단백질 용액의 수는 적어도 수성 폴리사카라이드 용액의 수에 상응하고, 여기서 수성 폴리사카라이드 및 담체 단백질 용액은 각각 약 0.5% 이상의 수크로스를 포함하고, 여기서 승화 건조는 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 수성 폴리사카라이드 용액은 각각 약 4% 내지 6% 수크로스를 포함하고, 수성 담체 단백질 용액은 각각 약 4% 내지 8% 수크로스를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 수성 폴리사카라이드 용액은 각각 약 6 내지 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 수성 담체 단백질 용액은 각각 약 6 내지 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 수성 폴리사카라이드 용액은 각각 약 6 또는 9 mg/mL의 농도의 폴리사카라이드를 포함하고, 수성 담체 단백질 용액은 각각 약 6, 9 또는 12 mg/mL의 농도의 담체 단백질을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유기 용매는 비양성자성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 (DMSO), 아세톤 또는 헥사메틸인산 트리아미드이다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 DMSO이다.
방법의 특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 재구성은 8분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 6분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 4분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 2분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 약 2분 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 재구성은 1분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 단계 (c)에서의 혼합은 120분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 90분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 60분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 30분 이하 내에 수행된다. 특정한 실시양태에서, 혼합은 10분 이하 내에 수행된다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.9 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 10% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 각각의 접합체 용액은 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비의 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드, 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 농도를 포함하고, 접합체는 5 (몰/몰) 초과의 담체 단백질 리신 손실 값을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드이다. 특정한 실시양태에서, 불활성화된 박테리아 톡소이드는 CRM197이다. 특정한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드는 산화제와의 반응에 의해 활성화된다.
특정한 실시양태에서, 접합체 용액은 멸균 여과된다.
도 1은 담체 단백질 (Pr) 폴리사카라이드 (Ps) 접합체를 제조하는 개략도를 보여준다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "폴리사카라이드" (Ps)는 "사카라이드", "올리고사카라이드", "폴리사카라이드", "리포사카라이드", "리포-올리고사카라이드 (LOS)", "리포폴리사카라이드 (LPS)", "글리코실레이트", "당접합체" 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 면역학적 및 박테리아 백신 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 항원성 사카라이드 요소 (또는 항원성 단위)를 포함하는 것으로 의도된다. 문맥에 따라, Ps는 단수형 또는 복수형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "포함하다"는 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용되는 경우에 임의의 다른 성분 (항원 혼합물에 대해 "로 이루어진"이라는 표현의 제한을 받음), 예컨대 아주반트 및 부형제를 포함함을 지칭한다. 용어 "이루어진"은 다가 폴리사카라이드-단백질 접합체 혼합물과 함께 사용되는 경우에 상기 특정한 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 갖고 상이한 혈청형으로부터의 다른 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체는 갖지 않는 혼합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "재구성하는" 또는 "재구성"은 건조된 물질에 액체를 첨가하여 건조된 물질을 용해시켜 그 안에 용해된 물질의 용액을 제공하는 것을 지칭한다. 그러나, 재구성에 의해 제공되는 용액은 그 안에 용해된 물질의 농도 구배 또는 층을 가질 수 있다. 따라서, 재구성 후에, 용액을 물리적으로 교반하여 재구성된 물질의 균질 용액을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "혼합"은 진탕, 교반, 요동, 회전 등에 의한 용액의 물리적 교반을 지칭하는 것으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "균질 용액"은 용액 중 성분들 사이에 농도 구배 또는 층이 없도록 모든 성분이 완전히 혼합된 용액을 지칭한다.
본원에 정의된 용어 "침전", "침전물", "미립자 형성", "혼탁" 및 "응집"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 폴리사카라이드-단백질 접합체의 응집을 유발하는 임의의 물리적 상호작용 또는 화학 반응을 지칭하는 것으로 의도된다. 응집 (예를 들어, 단백질 응집) 과정은 열, 압력, pH, 교반, 전단력, 동결-해동, 탈수, 중금속, 페놀계 화합물, 실리콘 오일, 변성제 등을 포함한 수많은 물리화학적 스트레스에 의해 유도될 수 있다.
본원에 사용된 "리오스피어"는, 예를 들어 비드 또는 구체 또는 다른 형상의 형태를 취하는 동결건조된 물질의 개별 입자이다. 리오스피어는 또한 동결건조입자 구체 또는 리오비드로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리오스피어 직경은 약 2 내지 약 12 mm, 바람직하게는 2 내지 8 mm, 예컨대 2.5 내지 6 mm 또는 2.5 내지 5 mm이다. 일부 실시양태에서, 리오스피어의 부피는 약 20 내지 550 μL, 바람직하게는 20 내지 100 μL, 예컨대 20 내지 50 μL이다. 리오스피어가 실질적으로 구형이 아닌 실시양태에서, 리오스피어의 크기는 더 짧은 치수에 대한 더 긴 치수의 비인 종횡비와 관련하여 기재될 수 있다. 리오스피어의 종횡비는 0.5 내지 2.5, 바람직하게는 0.75 내지 2, 예컨대 1 내지 1.5일 수 있다.
본원에 사용된 "면역원성 조성물"은 1종 이상의 담체 단백질에 접합된 1종 이상의 항원을 함유하는 다가 조성물일 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항원은 피막화된 박테리아로부터의 사카라이드이다. 이러한 조성물에서, 사카라이드는 특정 유형의 박테리아의 표면과 유사한 당 분자의 장쇄로 구성된다. 피막화된 박테리아는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 네이세리아 메닌기티데스 및 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항원은 동일한 유기체로부터의 것일 수 있거나 또는 상이한 유기체로부터의 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항원은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드이다.
본원에 사용된 용어 "방사 에너지 진공 (REV) 탈수"는 또한 마이크로웨이브 진공 건조 (MVD)를 지칭한다.
II. 방법
본 발명은 항-폐렴구균 백신으로서 사용될 수 있는 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 다양한 승화 공정을 사용하여 폐렴구균 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 개별 (또는 개별적) 동결건조시키고, 이어서 개별로 동결건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 낮은 수준의 유리 폴리사카라이드 (예를 들어, 15% 미만의 유리 폴리사카라이드)를 갖는 접합체 조성물을 형성하는 조건 하에 혼합한다.
본 발명은 낮은 수준의 유리 폴리사카라이드를 갖는 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는 선행 기술의 방법에 비해 개선된 것이다. 미국 특허 번호 7,709,001 및 미국 공개 출원 번호 20110201791에 개시된 것과 같은 선행 기술 방법은 담체 단백질 및 폴리사카라이드의 공동-동결건조를 사용하는데, 이는 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 함께 공동-동결건조시키는 것이 낮은 유리 폴리사카라이드 (18% 미만)를 갖는 접합체 조성물을 생성하는 것으로 제시된 반면에, 개별로 동결건조된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 조합함으로써 제제화된 접합체 조성물은 미국 공개 출원 번호 20110201791의 표 1에 제시된 결과에 의해 예시된 바와 같이 약 31% 유리 폴리사카라이드를 갖는 조성물을 생성하기 때문이다.
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그러나, 본 발명의 발명자들은 특정 조건 하에서 개별적으로 (또는 개별로) 동결건조된 담체 단백질 및 활성화된 폴리사카라이드를 접합시켜 고분자량 접합체를 포함하는 조성물을 제조할 수 있으며 미국 공개 출원 번호 20110201791에서와 달리 이러한 조성물이 낮은 수준의 유리 폴리사카라이드를 갖는다는 것을 발견하였다. 이들 특정 조건은 미리 결정된 양의 담체 단백질 리오스피어 및 미리 결정된 양의 폴리사카라이드 리오스피어를 함께 조합하여 리오스피어 혼합물을 형성하는 단계 및 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에 재구성하고 혼합하여 접합체 용액을 제공하는 단계를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 유기 용매는 디메틸술폭시드 (DMSO)이다. 담체 단백질 및 폴리사카라이드 리오스피어를 개별적으로 재구성하는 대신 이들 리오스피어 혼합물을 재구성하는 것은, 하나의 용액을 다른 용액에 첨가하거나 건조된 물질을 용액에 용해시킴으로써 두 용액을 조합할 때 전형적으로 발생하는 농도 구배를 실질적으로 감소시키거나 제거한다. 농도 구배의 감소 또는 제거는 고분자량 접합체 및 소량의 유리 폴리사카라이드 (예를 들어, 15% 이하의 유리 폴리사카라이드)를 포함하는 조성물의 수율을 증가시킨다. 본 발명은 단일 조성물로의 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 공동-동결건조에 비해 다양한 이점, 예컨대 비제한적으로, 개별 제제 및 사이클 파라미터를 최적화하는 능력, 편리한 취급, 및 목적하는 용액 크기를 갖는 개별 폴리사카라이드 및 담체 단백질 제제를 생산하는 능력을 제공한다.
도 1은 담체 단백질 및 폴리사카라이드를 본원에 교시된 바와 같이 건조된 리오스피어로서 혼합하는, 담체 단백질 폴리사카라이드 접합체를 제조하는 개략도를 보여준다.
일반적으로, 정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 (Ps) 분말을 개별적으로 물 중에 용해시키고, 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 0.45-마이크로미터 여과한다. 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 균질화하여 Ps의 분자 질량을 감소시킨다. 혈청형 18C를 90℃ 이상에서의 산 가수분해에 의해 크기-감소시킨다. 혈청형 19A는 그의 비교적 낮은 출발 크기로 인해 크기 감소시키지 않는다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 혈청형-특이적 표적에 대해 제어하여 혈청형-특이적 분자 질량을 달성한다. 폴리사카라이드를 각각 0.22-마이크로미터 여과한 다음, 농축시키고, 개방 채널 (유형 5)을 갖는 10 kD 한외여과 막을 사용하여 한외여과 단계 1에서 물에 대해 투석여과하여 투석여과물 1을 생산한다.
이어서 투석여과물 1을 아세트산나트륨 완충제에 의해 혈청형-특이적 온도 (4-22℃ 사이) 및 pH (4-5)로 조정하여 활성화 단계 동안 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화할 수 있다. 퍼아이오데이트 산화를 통해 폴리사카라이드 활성화를 수행한다. 혈청형 4의 경우, 활성화 전에, 용액을 대략 50℃ 및 pH 4에서 인큐베이션하여 폴리사카라이드를 부분적으로 탈케탈화한다. 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시한다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 혈청형-특이적이며, 폴리사카라이드 반복 단위 몰당 소듐 메타퍼아이오데이트 대략 0.1 내지 0.5 몰의 범위이다. 소듐 메타퍼아이오데이트의 혈청형-특이적 전하는 폴리사카라이드 활성화의 표적 수준 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 알데히드 몰)을 달성하도록 선택된다.
한외여과 단계 2에서, 모든 혈청형에 대해 활성화된 폴리사카라이드를 투석여과한 다음, 개방 채널을 갖는 10 kD 한외여과 막을 사용하여 접선 흐름 한외여과에 의해 농축시켜 투석여과물 2를 생성할 수 있다. 투석여과의 종료 시에, 투석여과물 2를 15 g Ps/L의 표적으로 농축시킬 수 있다. 바람직하게는, 모든 혈청형에 대한 한외여과를 2-8℃에서 수행한다.
이어서 투석여과물 2를 수크로스가 첨가된 물 중에 희석하여 약 4 내지 12 mg/mL 폴리사카라이드 및 0.5% 내지 6% (V/V) 수크로스의 최종 농도를 만들고, 리오스피어를 생산하기 위한 공정에서 승화 건조시켜 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는 건조된 폴리사카라이드의 리오스피어를 생산한다. 동결건조 전에 용액에 첨가되는 수크로스의 양은 혈청형 특이적이다. 특정한 실시양태에서, 2종 이상의 폴리사카라이드를 함께 건조시켜 건조된 폴리사카라이드 혼합물을 생산할 수 있다.
정제된 담체 단백질을 5 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.0 완충제에 대해 투석여과한 다음, 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과한다. 여과된 용액을 수크로스 함유 물 중에 약 6 내지 12 mg/mL 담체 단백질 및 4 내지 10% (v/v) 수크로스의 최종 농도로 희석하고, 리오스피어를 생산하기 위한 공정에서 승화 건조시켜 6% 이하의 최종 수분 함량을 갖는 건조된 담체 단백질의 리오스피어를 생산한다. 리오스피어를 생산하는 승화 건조 공정은 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수를 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 리오스피어는 약 5% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 리오스피어는 약 4% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 리오스피어는 약 3% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 리오스피어는 약 2% 이하의 최종 수분 함량을 갖는다.
건조된 폴리사카라이드 리오스피어 및 건조된 폴리사카라이드 리오스피어를 조합하여 폴리사카라이드 리오스피어 및 담체 단백질 리오스피어를 포함하는 리오스피어 혼합물을 제공한다. 폴리사카라이드 리오스피어 및 담체 단백질 리오스피어는 혈청형-특이적 최종 폴리사카라이드 농도 및 폴리사카라이드:단백질 비를 표적으로 하여 조합된다. 일반적으로, 담체 단백질 및 폴리사카라이드는 약 0.6 내지 1.3 (w/w)의 최종 접합된 폴리사카라이드:단백질 비를 제공할 양으로 혼합된다. 리오스피어 혼합물은 유기 용매, 예를 들어 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 재용해 또는 재구성되어 재구성된 혼합물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 유기 용매는 무수이고, 특정한 실시양태에서, 무수 유기 용매는 무수 DMSO이다.
특정한 실시양태에서, 재구성 후에, 재구성된 혼합물을 30분 이하 동안 혼합하여 담체 단백질의 균질 용액 및 폴리사카라이드의 균질 용액을 제공할 수 있다. 그러나, 특정한 실시양태에서, 혼합은 120분 이하, 90분 이하, 60분 이하, 30분 이하 또는 10분 이하의 기간에 걸쳐 일어날 수 있다. 특정한 실시양태에서, 500 mM 인산나트륨, pH 7.2 완충제를 재구성된 혼합물에 1.0 mM 인산나트륨의 최종 농도로 첨가한다.
접합 반응을 수행하기 위해, 물 중 소듐 시아노보로히드라이드의 용액을 제조하고, 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 meq (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 몰)를 재구성된 혼합물에 첨가하여 접합 용액을 제공한다. 소듐 시아노보로히드라이드 용액의 몰농도는 접합 동안 용액의 약 0.5% 총 물 함량의 표적 양을 기준으로 한다. 접합 용액을 혈청형-특이적 온도에서 혈청형-특이적 지속기간 동안 반응하도록 하여 담체 단백질:폴리사카라이드 접합체 중간체를 생산한다.
이어서 물 중 소듐 보로히드라이드의 용액을 제조하고, (폴리사카라이드 반복 단위에 대해) 소듐 보로히드라이드 2.0 meq를 접합 용액에 첨가한다. 소듐 보로히드라이드 용액의 몰농도는 보로히드라이드 첨가 후 접합 용액 중 약 1.0% 총 물 함량의 표적 양을 기준으로 한다. 접합 용액을 주위 온도에서 3시간 동안 반응하도록 하여 (2시간 동안 반응하도록 한 특정 혈청형, 예컨대 혈청형 7F 제외) 담체 단백질:폴리사카라이드 접합체를 생산한다.
접합 반응을 켄칭하기 위해, 접합 용액을 특정한 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하는 접합체의 경우에 150 mM 염화나트륨 (0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨)의 용액에 느리게 첨가함으로써 접합 용액을 희석 단계에서 20% (v/v) 이하의 유기 용매로 희석하여 켄칭된 접합체 용액을 생산한다. 특정한 실시양태에서, 온도를 희석 단계 동안 15℃ 이하에서 유지한다. 약 1시간 후, 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0을 용액에 25 mM 인산칼륨의 최종 농도로 첨가하였다. 접합 성능은 전체 폴리사카라이드 및 담체 단백질 소비, 접합체 폴리사카라이드 대 담체 단백질 비, 및 접합체 분자량에 의해 평가할 수 있다.
한외여과 단계 3에서, 켄칭된 접합체 용액을 약 2.5 g/L로 농축시키고, 30 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 또는 150 mM 염화나트륨 중 25 mM 인산칼륨의 최대 약 10 디아볼륨에 대해 투석여과하여 투석여과물 3을 생산할 수 있다. 한외여과 단계 3으로부터의 투석여과물 3 중의 폴리사카라이드 농도는 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC) 자외선 다중-각도 광 산란 굴절률 (UV-MALS-RI)에 의해 결정할 수 있다. 일부 혈청형, 예컨대 혈청형 19F로부터의 폴리사카라이드를 포함하는 접합체의 경우, 투석여과물 3을 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 여과물을 생산할 수 있고, 이를 후속적으로 22℃에서 약 120시간 동안 인큐베이션한다.
한외여과 단계 4에서, 투석여과물 3 또는 한외여과 단계 3으로부터의 여과물을 약 2.5 g/L의 폴리사카라이드 농도로 농축시키고, 300 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘의 20 디아볼륨에 대해 투석여과하여 투석여과물 4를 생산할 수 있다. 특정 혈청형, 예를 들어 혈청형 7F로부터의 폴리사카라이드를 포함하는 접합체의 경우, 접합체를 100 kDa 접선 흐름 한외여과 막에 대해 투석여과할 수 있으며; 예를 들어 혈청형 6A, 6B 및 18C 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 약 3.5 g/L로 농축시키고, 300 kDa 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 및 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0을 포함하는 완충제에 대해 투석여과하여 투석여과물 4를 생산할 수 있다. 혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 약 2.0 g/L로 농축시키고, 300 kDa 재생 셀룰로스 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 및 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0을 포함하는 완충제에 대해 투석여과하여 투석여과물 4를 생산할 수 있다. 투석여과물 2 중의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 완충제는 10-50 mM 아세테이트, 포스페이트, TRIS, HEPES 또는 아미노산 완충제, 예컨대 히스티딘일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 완충제는 10 mM L-히스티딘이다.
한외여과 단계 4로부터의 투석여과물 4를 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 제2 여과물을 생산할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 제2 여과물을 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석할 수 있다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC) 또는 1가 약물 물질을 제공한다. MBC를 분취물로 분배하고 -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
혈청형 6A, 6B 및 18C 폴리사카라이드를 포함하는 접합체에 대한 한외여과 단계 4로부터의 투석여과물 4를 이중-막 0.5/0.2-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 제2 여과물을 생산할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 제2 여과물을 150 mM 염화나트륨, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석할 수 있다. 이는 MBC 또는 1가 약물 물질을 제공한다. MBC를 분취물로 분배하고 -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F 폴리사카라이드를 포함하는 접합체에 대한 투석여과물 4를 0.22-마이크로미터 필터를 통해 여과하여 제2 여과물을 생산할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도는 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정할 수 있다. 제2 여과물의 폴리사카라이드 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 제2 여과물을 150 mM 염화나트륨, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석할 수 있다. 이는 MBC 또는 1가 약물 물질을 제공한다. MBC를 분취물로 분배하고 -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
III. 폴리사카라이드
스트렙토코쿠스 뉴모니아에로부터의 피막 폴리사카라이드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리사카라이드는 박테리아로부터 단리될 수 있고, 공지된 방법에 의해 어느 정도 크기조정될 수 있고 (예를 들어, 유럽 특허 번호 EP497524 및 EP497525 참조); 특정한 실시양태에서, 균질화기를 사용하여 미세유동화에 의해 또는 화학적 가수분해에 의해 달성된다. 한 실시양태에서, 각각의 폴리사카라이드 혈청형에 상응하는 에스. 뉴모니아에 균주는 대두-기재 배지에서 성장된다. 이어서 개별 폴리사카라이드는 원심분리, 침전 및 한외여과를 포함한 표준 단계를 통해 정제된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0286838 및 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다. 폴리사카라이드는 점도를 감소시키고/거나 후속 접합된 생성물의 여과성을 개선시키기 위해 크기조정될 수 있다. 본 발명에서, 피막 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 및 38 중 1종 이상으로부터 제조된다.
IV. 담체 단백질
본 발명의 특정한 실시양태에서, CRM197이 담체 단백질로서 사용된다. CRM197은 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다. 한 실시양태에서, 이는 카사미노산 및 효모 추출물-기재 배지에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, CRM197은 미국 특허 번호 5,614,382에 기재된 방법에 따라 재조합적으로 제조된다. 전형적으로, CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온-교환 크로마토그래피의 조합을 통해 정제된다. 일부 실시양태에서, CRM197은 페넥스 발현 기술 (페넥스 인크. (Pfenex Inc.), 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 제조된다.
다른 적합한 담체 단백질은 추가의 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 DT (디프테리아 톡소이드), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이(E. coli) LT, 이. 콜라이 ST 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A를 포함한다. 박테리아 외막 단백질, 예컨대 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균 표면 단백질 A (PspA; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/091998 참조), 폐렴구균 어드헤신 단백질 (PsaA), A군 또는 B군 스트렙토코쿠스로부터의 C5a 펩티다제, 또는 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D, 폐렴구균 뉴모리신 (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13), 예를 들어 일부 방식으로 해독된 플라이, 예를 들어 dPLY-GMBS (국제 특허 출원 공개 번호 WO 04/081515 참조) 또는 dPLY-포르몰, PhtX, 예를 들어 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE 및 Pht 단백질의 융합체, 예를 들어 PhtDE 융합체, PhtBE 융합체 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/98334 및 WO 03/54007 참조)가 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예컨대 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD), PorB (엔. 메닌기티디스로부터의 것), PD (헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D; 예를 들어 유럽 특허 번호 EP 0 594 610 B 참조) 또는 그의 면역학상 기능적 등가물, 합성 펩티드 (유럽 특허 번호 EP0378881 및 EP0427347 참조), 열 쇼크 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/17712 및 WO 94/03208 참조), 백일해 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/58668 및 유럽 특허 번호 EP0471177 참조), 시토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 91/01146 참조), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (문헌 [Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824] 참조), 예컨대 N19 단백질 (문헌 [Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7] 참조), 철 흡수 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/72337 참조), 씨. 디피실레(C. difficile)의 독소 A 또는 B (국제 특허 공개 번호 WO 00/61761 참조), 및 플라젤린 (문헌 [Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9] 참조)이 또한 담체 단백질로서 사용될 수 있다.
다른 DT 돌연변이체, 예컨대 CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 및 CRM107 및 문헌 [Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기재된 다른 돌연변이; Glu-148의 결실 또는 Asp, Gln 또는 Ser로의 돌연변이 및/또는 Ala 158의 Gly로의 돌연변이 및 미국 특허 번호 4,709,017 또는 미국 특허 번호 4,950,740에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 1개 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 미국 특허 번호 5,917,017 또는 미국 특허 번호 6,455,673에 개시된 다른 돌연변이; 또는 미국 특허 번호 5,843,711에 개시된 단편이 사용될 수 있다.
V. 승화 건조
리오스피어는, 예를 들어 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수 (마이크로웨이브 진공-건조)에 의해 이동파 포맷, 분무 동결건조, 진공 건조, RF 건조 등으로 연속 또는 반-연속 모드로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Encyclopedia of Agriculture, Food, and Biological Engineering. Marcel Dekker, Inc or Xu & Sunada, Chem Pharm Bull (Tokyo) 55(11):1545-50 (2007)]을 참조한다.
리오스피어는, 예를 들어 액적 (예를 들어, 약 20, 50, 100 또는 250 마이크로리터) 형태의 1종 이상의 폴리사카라이드 혈청형 또는 담체 단백질을 포함하는 수용액의 분취물을 액적이 무손상 상태로 유지되도록 하는 방식으로 고체의 편평 표면 상에 로딩함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표면은, 예를 들어 약 -180℃ 내지 약 -196℃ 또는 약 -180℃ 내지 약 -273℃의 온도의 플레이트, 예를 들어 금속 플레이트이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 수용액은 분배 팁에 의해 표면 상에 로딩된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 수용액은 약 3 ml/분 내지 약 75 ml/분, 약 5 ml/분 내지 약 75 ml/분; 약 3 ml/분 내지 약 60 ml/분, 약 20 ml/분 내지 약 75 ml/분; 및 약 20 ml/분 내지 약 60 ml/분의 분배 속도로 분배된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분배되는 수용액은 250 마이크로리터이고, 분배 속도는 약 5 mL/분 내지 약 75 mL/분이거나, 또는 분취물은 100 마이크로리터이고, 분배 속도는 약 3 mL/분 내지 약 60 mL/분이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분배 팁과 수용액이 분배되는 표면 사이의 갭은 약 0.1 cm 이상 (예를 들어, 약 0.5 cm 또는 0.1 cm 내지 1 cm 또는 0.1 cm 내지 0.75 cm)이다. 표면 상에 놓이면, 수용액을 동결시킨 다음, 동결건조에 의해 승화 건조시킨다. 리오스피어를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US5656597; WO2013066769; WO2014093206; WO2015057540; WO2015057541 또는 WO2015057548을 참조한다.
VI. 폴리사카라이드-단백질 접합
정제된 폴리사카라이드를 화학적으로 활성화시켜 담체 단백질과 반응할 수 있는 관능기를 도입한다. 활성화되면, 각각의 피막 폴리사카라이드를 개별적으로 담체 단백질에 접합시켜 본 발명의 방법에 따른 당접합체를 형성한다.
한 실시양태에서, 폴리사카라이드의 화학적 활성화는 미국 특허 번호 4,365,170; 4,673,574; 및 4,902,506에 기재된 수단에 의해 달성할 수 있다. 간략하게, 폐렴구균 폴리사카라이드를 산화제, 예를 들어 퍼아이오데이트-기재 산화제, 예컨대 과아이오딘산나트륨, 과아이오딘산칼륨 또는 과아이오딘산과 반응시켜 이웃자리 히드록실 기의 무작위 산화성 절단을 유발하여 반응성 알데히드 기를 생성한다. 산화된 폴리사카라이드를 단백질 담체 상의 1급 아민 기 (주로 리신 잔기)에 직접 아미노화 커플링시키는 것은 환원성 아미노화에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 접합을 수용액 또는 유기 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 수행할 수 있다. 예를 들어, US2015/0231270 A1, EP 0471 177 B1, US2011/0195086 A1을 참조한다. 접합 반응의 종결 시에, 미반응 알데히드를 강한 환원제, 예컨대 소듐 보로히드라이드의 첨가에 의해 캡핑한다.
한 실시양태에서, 폴리사카라이드의 화학적 활성화 및 후속하여 담체 단백질에의 접합은 미국 특허 번호 4,365,170, 4,673,574 및 4,902,506에 기재된 수단에 의해 달성한다. 간략하게, 폴리사카라이드를 퍼아이오데이트-기재 산화제, 예컨대 과아이오딘산나트륨, 과아이오딘산칼륨 또는 과아이오딘산과 반응시켜 이웃자리 히드록실 기의 무작위 산화성 절단을 유발하여 반응성 알데히드 기를 생성한다. 이어서 산화된 폴리사카라이드를 단백질 담체 상의 1급 아민 기 (주로 리신 잔기)에 직접 아미노화 커플링시키는 것은 환원성 아미노화에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 혼합물을 니켈의 존재 하에 환원제, 예컨대 소듐 시아노보로히드라이드와 반응시킴으로써 접합을 수행한다. 접합 반응은 수용액 또는 유기 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 수행할 수 있다. 예를 들어, US2015/0231270 A1, EP 0471 177 B1, US2011/0195086 A1을 참조한다. 접합 반응의 종결 시에, 미반응 알데히드를 강한 환원제, 예컨대 소듐 보로히드라이드의 첨가에 의해 임의로 환원시킨다.
한 실시양태에서, 제제화 전에, 각각의 폐렴구균 피막 폴리사카라이드를 에스. 뉴모니아에로부터 개별적으로 정제하고, 활성화시켜 반응성 알데히드를 형성하고, 이어서 니켈의 존재 하에 소듐 시아노보로히드라이드에 의한 환원성 아미노화를 사용하여 담체 단백질에 공유 접합시킨다. 니켈은 환원성 아미노화에 사용되는 소듐 시아노보로히드라이드 환원제로부터의 잔류 간섭 시아나이드와 착물을 형성한다. 따라서, 니켈은 보다 큰 접합 반응 효율을 위해 및 유리 시아나이드 제거를 보조하기 위해 본원의 방법에 사용할 수 있다.
전이 금속은 시아나이드와 안정한 착물을 형성하는 것으로 공지되어 있고, 소듐 시아노보로히드라이드에 의한 단백질 아미노 기 및 포름알데히드의 환원성 메틸화를 개선시키는 것으로 공지되어 있다. 문헌 [Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190]을 참조한다. 그러나, 본 출원인은 놀랍게도 잔류 간섭 시아나이드와 착물을 형성함으로써, 니켈의 첨가가 접합 동안 단백질의 소비를 증가시키고 보다 큰, 잠재적으로 보다 면역원성인 접합체의 형성을 유도한다는 것을 발견하였다.
상업용 소듐 시아노보로히드라이드 시약 로트에서의 유리 시아나이드 수준의 변동성은 일관되지 않은 접합 성능을 유도할 수 있으며, 이는 분자 질량 및 폴리사카라이드-대-단백질 비를 포함한 다양한 접합체 속성을 생성한다. 접합 반응에 대한 니켈의 첨가는 유리 시아나이드의 수준을 감소시키고, 따라서 로트-대-로트 접합체 일관성의 정도를 개선시킨다.
또 다른 실시양태에서, 접합 방법은 시아네이트 에스테르를 형성하기 위해 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)에 의한 폴리사카라이드의 활성화를 사용할 수 있다. 활성화된 사카라이드는 담체 단백질 상의 아미노 기에 직접 커플링될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 반응성 동종이관능성 또는 이종이관능성 기는 시아네이트 에스테르를 여러 이용가능한 양식 중 임의의 것과 반응시킴으로써 활성화된 폴리사카라이드 상에 도입될 수 있다. 예를 들어, 시스타민 또는 시스테아민을 사용하여 티올화된 폴리사카라이드를 제조할 수 있으며, 이는 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들어 GMBS를 사용함) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질 (예를 들어 아이오도아세트이미드 [예를 들어, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB 또는 SIA 또는 SBAP를 사용함)과의 반응 후에 수득된 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있다. 이러한 접합체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/29094; 및 문헌 [Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256]에 기재되어 있다.
다른 적합한 접합 방법은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC 및/또는 TSTU를 사용한다. 국제 특허 출원 공개 공보 번호 WO98/42721에 다수가 기재되어 있다. 접합은 사카라이드의 유리 히드록실 기와 CDI의 반응에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 수반할 수 있고 (문헌 [Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18] 참조), 이에 이어서 담체 단백질과 반응하여 카르바메이트 연결을 형성할 수 있다. 이러한 화학은 탄수화물의 아노머 말단의 환원으로 1급 히드록실 기를 형성하고, 이어서 1급 히드록실과 CDI의 반응으로 카르바메이트 중간체를 형성하고, 이어서 단백질 담체 아미노 기에 커플링하는 것으로 이루어진다. 반응은 사카라이드 상의 다른 1급 히드록실 기의 임의적인 보호/탈보호를 필요로 할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 추가의 이해를 촉진하도록 의도된다.
실시예 1
에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F 및 23F의 제조.
폐렴구균의 배양 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52]을 참조한다. 폐렴구균 피막 폴리사카라이드의 제조 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 번호 EP0497524를 참조한다. 폐렴구균 하위유형의 단리물은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능하다. 박테리아는 혈액-한천 상에서 알파-용혈성인 피막화된, 비-운동성, 그람-양성, 란셋-형상 쌍구균으로서 확인된다. 하위유형은 특이적 항혈청을 사용하는 팽화 반응에 기초하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다.
존재하는 에스. 뉴모코쿠스 혈청형 각각을 나타내는 세포 은행을 동결 바이알 내의 것으로 머크 컬쳐 콜렉션(Merck Culture Collection) (뉴저지주 라웨이)으로부터 입수한다. 해동된 시드 배양물을 에스. 뉴모니아에에 적절한 사전-멸균된 성장 배지를 함유하는 시드 발효기로 옮긴다. 배양물을 온도 및 pH 제어 하의 시드 발효기에서 성장시킨다. 시드 발효기의 전체 부피를 사전-멸균된 성장 배지를 함유하는 생산 발효기로 옮긴다. 생산 발효는 공정의 최종 세포 성장 단계이다. 온도, pH 및 교반 속도를 제어한다.
불활성화제의 첨가를 통해 발효 공정을 종결시킨다. 불활성화 후에, 용액을 불활성화 탱크로 옮기고, 여기서 제어된 온도 및 교반 하에 유지한다. 세포 파편을 원심분리 및 여과의 조합을 사용하여 제거한다. 용액을 한외여과하고 투석여과한다. 이어서 용액에 대해 용매-기반 분획화를 실시하여 불순물을 제거하고 폴리사카라이드를 회수한다.
실시예 2
폴리사카라이드 크기 감소 및 활성화를 하기와 같이 수행한다.
약 6 g의 정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 (Ps) 분말을 주사용수 (WFI) 중에 대략 4 g/L의 표적 농도로 실온에서 용해시킨다. 이어서 용액을 0.45-마이크로미터 여과하여 바이오버든을 감소시킨다. 여과된 Ps 용액의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다.
혈청형 18C 및 19A를 제외한 모든 혈청형의 경우, 용액을 대략 2.5 g/L로 희석한 다음, GEA-니로 소아비 판다(Niro Soavi Panda) 2K 균질화기를 사용하여 균질화하여 Ps의 분자 질량을 감소시킨다. 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 균질화하여 폴리사카라이드의 분자 질량을 감소시켰다. 혈청형 19A는 그의 비교적 낮은 출발 크기로 인해 크기 감소시키지 않았다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 혈청형-특이적 표적에 대해 제어하여 (150-1000 bar; 4-7회 통과) 혈청형-특이적 분자 질량을 달성하였다. 크기-감소된 폴리사카라이드를 0.2-마이크로미터 여과한 다음, 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다. 균질화 동안 균질화기의 유출구에 있는 열 교환기로의 냉각수 공급을 사용하여 온도를 제어한다.
균질화 대신 산 가수분해를 사용하여 혈청형 18C Ps의 분자 질량을 감소시킨다. 여과된 혈청형 18C Ps 용액의 온도를 로트 A의 경우 대략 96℃ 및 로트 B의 경우 90℃로 증가시킨다. 이어서 용액을 빙초산 (17.4 M)으로 조정하여 0.2 M의 최종 농도로 표적화하고, 로트 A의 경우 대략 180분 및 로트 B의 경우 160분 동안 유지한다. 1.5 M 인산칼륨, pH 7.0을 0.46 M의 최종 농도로 첨가하여 용액 pH를 증가시킴으로써 산 가수분해를 정지시킨 다음, 용액을 실온으로 냉각시킨다.
혈청형 19A는 0.45-마이크로미터 여과하거나 크기-감소시키지 않는다. 그의 비교적 낮은 출발 크기 때문에, 크기 감소가 요구되지 않는다. 용해 후, 혈청형 19A를 다음 단락에 기재된 바와 같이 0.22-마이크로미터 여과한다.
이어서 한외여과 1 단계 전에, 각각의 용액을 0.22-마이크로미터 필터를 사용하여 여과하여 바이오버든을 감소시킨다. 여과된 Ps를 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 대략 10 g/L로 농축시킨 다음, 주위 온도에서 6 디아볼륨의 WFI에 대해 투석여과하여 한외여과 1 공정 중간체 (UF1-FR)를 생성한다. 혈청형 18C는 10 kDa NMWCO 막 대신에 5 kDa NMWCO 막을 사용하여 산 가수분해에 의해 생성된 보다 저분자량의 Ps를 보유함으로써 Ps 회수를 개선시켰다. UF1-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. WFI를 UF1-FR에 첨가하여 Ps 활성화 전에 대략 10 g/L의 Ps 농도를 달성한다.
이어서 2 M 아세트산나트륨 완충제를 첨가하여 활성화 반응 단계의 pH를 제어한다. Ps 활성화 반응 동안 아세트산나트륨 농도 및 pH 및 온도를 각각의 혈청형에 대한 특이적 값으로 제어한다 (표 2).
퍼아이오데이트 활성화는 PnPs 반복 단위 (RU)의 몰당 퍼아이오데이트의 몰에 기초하여 용액에 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가함으로써 개시한다. 활성화 동안, 이웃자리 디올은 혈청형-특이적 반응 시간에 걸쳐 반응성 알데히드로 산화된다. 이 반응은 활성화된 생성물 (AP) 공정 중간체를 생성하였다. 하전된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양 및 반응 시간을 각각의 혈청형에 대한 특이적 값으로 제어한다 (표 1).
Figure pct00002
Ps 활성화 후에, 용액을 2-8℃에서 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 6 디아볼륨의 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 이어서 추가로 6 디아볼륨의 WFI에 대해 투석여과한다. 혈청형 18C는 10 kDa NMWCO 막 대신에 5 kDa NMWCO 막을 사용하여 산 가수분해에 의해 생성된 보다 저분자량의 Ps를 보유함으로써 Ps 회수를 개선시켰다. 이어서 용액을 농축시켜 한외여과 2 공정 중간체 (UF2-FR)를 생성한다. UF2-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 활성화 정도는 UF2-FR 샘플을 티오세미카르바지드로 유도체화한 다음, UV 검출을 동반한 HPSEC에 의해 티오세미카르바존을 검출함으로써 결정한다.
실시예 3
CRM197 담체 단백질의 제조는 하기와 같이 수행할 수 있다.
이전에 기재된 바와 같이 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/173876 참조) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 동결된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 디아볼륨의 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고 0.22-마이크로미터 여과한다. 특정한 실시양태에서, 5 mM 인산칼륨, pH 6.4 (5 mM 인산나트륨, pH 7.0)를 혈청형 18C에 사용한다. 투석여과된 용액을 수크로스 함유 물 중에 1.0 내지 5.3% (w/v)의 최종 농도로 희석한다. 하기 표 3은 특정한 혈청형 폴리사카라이드에의 접합을 위한 CRM197에 대한 대표적인 수크로스 농도를 제공한다.
실시예 4
폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr)의 리오스피어 생산은 하기와 같다.
동결건조 전에, CRM197 및 Ps 용액을 하기 기재된 바와 같이 희석한다.
일부 실시양태에서, CRM197 용액을 WFI, 5 mM 인산나트륨, pH 6.4 (혈청형 18C의 경우 pH 7.0), 및 새로 제조된 WFI 중의 30% w/v 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 단백질 농도로 희석한다. UF2-FR Ps 용액을 WFI 및 새로 제조된 WFI 중의 30% w/v 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 Ps 농도로 희석한다.
일부 실시양태에서, CRM197 용액을 WFI, 2 mM 인산나트륨, pH 7.2, 및 새로 제조된 WFI 중의 50% w/v 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 단백질 농도로 희석한다. UF2-FR Ps 용액을 WFI 및 새로 제조된 WFI 중의 50% w/v 수크로스 용액을 사용하여 6.0 mg/mL의 Ps 농도로 희석한다.
혈청형-특이적 수크로스 및 포스페이트 농도를 사용한다 (표 3). 희석된 CRM197 및 UF2-FR 용액을 하기와 같이 리오스피어로 가공한다.
Figure pct00003
실시예 5
본 실시예는 폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr; CRM) 리오스피어를 생산하기 위한 동결건조기 조건의 개발을 보여준다.
CRM 및 혈청형 6A 및 23F로부터의 활성화된 폴리사카라이드의 개별 용액을 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 및 본 실시예의 표에 제시된 바와 같이 Ps, CRM 및 수크로스 농도를 갖도록 제조하였다.
변형된 바이오멕 FX 피펫팅 로봇 (크리오멕(Cryomek))을 사용하여 크리오멕의 편평 동결 표면 상에 용액의 50 μL 분취물을 분배한다. 임의의 균열을 유발하지 않으면서 작은 차가운 용기 상에 비드를 분배하는데 셔블링 메카니즘을 사용할 수 있다. 각각의 상이한 용액에 대해 사이클을 완료한 후에, 비드를 중간 저장 용기 내로 옮기고, 동결건조기에서의 승화 건조까지 또는 마이크로웨이브 진공 건조에 의할 때까지 -70℃에서 유지한다. 동결건조기 건조를 위해, 비드를 건조 트레이 내에 단일 층으로 분배한다. 캐비넷 압력, 선반 온도 및 사이클 시간을 설정한다. 비드를 건조시킨 후, 리오스피어를 2 내지 8℃에서 저장한다. (특정 파라미터에 대해서는 실시예 5 참조)
예비 건조 사이클 (Lyo1)은 표 4.1에 제시된 바와 같이 18시간이 소요되었다. 칼 피셔 적정에 의해 측정된 리오스피어의 잔류 수분 함량이 표 4.2에 제시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
결과는 리오스피어 중 높은 수분 함량을 보여준다. 추가로, 리오스피어는 매우 취약하고 흡습성이었다. 고체 함량은 표 5.2에 제시된 바와 같이 폴리사카라이드, 단백질 및 수크로스 농도를 증가시킴으로써 증가되었다. 표 5.1에 제시된 바와 같이, 2차 건조 사이클을 추가하고 1차 건조 시간을 증가시킴으로써 건조 사이클을 변형시켰다 (Lyo 2).
Figure pct00006
Figure pct00007
개선된 건조 사이클로 인해 Lyo2로부터의 잔류 수분 함량은 Lyo1보다 유의하게 더 낮았다. 2차 건조는 모든 얼음이 승화된 후에도 생성물에 여전히 존재하는 결합된 수분의 제거를 개선시킨다. 2차 건조는 1차 건조 (15℃)보다 더 높은 온도 (30℃)를 요구하였다.
이 시점에서, 동결건조기 총 건조 사이클 시간은 45시간이었다. 건조 사이클 시간을 훨씬 더 감소시키기 위해 여러 파라미터, 예컨대 압력 및 온도를 변화시켰다 (방법: Lyo 3) 표 6.1 및 6.2.
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 6
본 실시예는 폴리사카라이드 (Ps) 및 CRM197 (Pr; CRM) 리오스피어를 생산하기 위한 방사 에너지 진공 (REV) 탈수 (마이크로웨이브 진공 건조 (MVD)) 조건의 개발을 보여준다.
CRM 및 혈청형 6A 및 23F로부터의 활성화된 폴리사카라이드의 용액을 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 및 표 7.1 및 7.2에 제시된 바와 같은 Ps, CRM 및 수크로스 농도를 갖도록 제조하였다.
변형된 바이오멕 FX 피펫팅 로봇 (크리오멕)을 사용하여 크리오멕의 편평 동결 표면 상에 용액의 50 μL 분취물을 분배한다. 임의의 균열을 유발하지 않으면서 작은 차가운 용기 상에 비드를 분배하는데 셔블링 메카니즘을 사용할 수 있다. 각각의 상이한 용액에 대해 사이클을 완료한 후에, 비드를 중간 저장 용기 내로 옮기고, 동결건조기에서의 승화 건조까지 또는 마이크로웨이브 진공 건조에 의할 때까지 -70℃에서 유지한다. 마이크로웨이브 건조를 위해, 비드를 용기 내에 단일 층으로 분배하였다. 전력, 압력 및 사이클 시간을 설정하였다. 비드를 건조시킨 후, 리오스피어를 2 내지 8℃에서 저장하였다. (특정 파라미터에 대해 실시예 6 참조).
비드를 건조시키기 위해 2가지 상이한 MVD 사이클을 시험하였다. 두 사이클에서, 압력을 50 내지 60 mTorr의 범위로 유지하였다. 온도는 25 내지 30℃의 범위에 머무르면서 얼마나 많은 전력이 인가되는지에 좌우되었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
MVD1 사이클은 4시간 30분이 소요되었지만 잔류 수분 함량을 2%까지 감소시키기에는 충분하지 않았다. MVD2 사이클은 더 높은 전력에서 더 오래 소요되었으며, 따라서 유의하게 더 낮은 잔류 수분 함량을 제공하였다.
실시예 7
접합을 위한 준비로, 폴리사카라이드 (Ps) 리오스피어 및 CRM197 단백질 (Pr) 리오스피어를 특정 Ps 대 Pr의 비 (Ps:Pr) 및 최종 Ps 농도를 표적으로 하여 조합함으로써 리오스피어 혼합물을 제공하고, 이를 상기와 같이 무수 DMSO 중에 용해시킨다. 소듐 시아노보로히드라이드를 이 Ps:Pr 블렌드에 첨가하고, 용액을 요구되는 접합 온도에서 적절한 반응 시간 동안 인큐베이션하며, 이들 둘 다는 Pr에 접합되는 Ps 혈청형에 대해 특이적이다. 생성된 접합체 크기의 크기는 Ps 농도에 의해 유의하게 영향을 받는 것으로 나타났다.
WFI 중 소듐 시아노보로히드라이드의 용액을 제조하고, 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 meq (Ps 반복 단위 몰당 소듐 시아노보로히드라이드 1.0 몰)를 용액에 첨가한다. 소듐 시아노보로히드라이드 용액의 몰농도 (표 8)는 접합 동안 용액의 대략 0.5% 총 물 함량의 표적을 기준으로 한다. 용액을 혈청형-특이적 온도에서 혈청형-특이적 지속기간 (표 8) 동안 반응시켜, 접합된 생성물 중간체 (CP)를 생성한다.
WFI 중 소듐 보로히드라이드의 용액을 제조하고, (Ps 반복 단위에 대해) 소듐 보로히드라이드 2.0 meq를 용액에 첨가한다. 소듐 보로히드라이드 용액의 몰농도 (표 2)는 보로히드라이드 첨가 후 용액 중 대략 1.0% 총 물 함량의 표적을 기준으로 한다. 용액을 주위 온도에서 3시간 동안 (2시간 동안 반응하도록 한 V1147FPB1401은 제외) 반응하도록 하여, 접합체 생성물 켄칭된 중간체 (CPQ)를 생성한다.
Figure pct00012
이어서 접합 용액을 150 mM 염화나트륨 (일부 실시양태에서 접합체의 경우 0.025% w/v 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨)에 느리게 첨가함으로써 접합 용액을 20% 이하 (v/v)의 무수 DMSO로 희석한다. 용액 온도를 희석 단계 동안 15℃ 미만으로 유지한다. 약 1시간 후, 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0을 용액에 25 mM 인산칼륨의 최종 농도로 첨가한다. 접합 성능을 전체 Ps 및 CRM197 소비, 접합체 Ps 대 CRM197 비 및 접합체 분자량에 의해 평가한다.
접합 용액을 대략 2.5 g/L로 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨 (WL00067190에서의 로트의 경우) 또는 150 mM 염화나트륨 중 25 mM 인산칼륨 (WL00067191에서의 로트의 경우)의 10 디아볼륨에 대해 투석여과한다. 이는 한외여과 3 공정 중간체 (UF3-FR)를 생성하였다. UF3-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다.
19F의 경우, 일부 실시양태에서, UF3-FR을 0.22-마이크로미터 여과하고, 이어서 22℃에서 대략 120시간 동안 인큐베이션한다.
이어서 UF3-FR 용액을 한외여과 4 단계에서 처리한다. 한외여과 4 단계 동안, 일부 실시양태에서, 용액을 대략 2.5 g/L의 Ps 농도로 농축시키고, 300 kDa NMWCO 바이오맥스 PES 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘의 20 디아볼륨에 대해 투석여과한다. 혈청형 7F는 한외여과 4 단계에 100 kDa NMWCO 막을 사용하였다. 혈청형 6A, 6B 및 18C가 사용되는 경우, UF3-FR 용액을 대략 3.5 g/L로 농축시키고, 300 kDa NMWCO 바이오맥스 PES 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, 0.03% w/v PS-20, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과한다. 일부 실시양태에서, 혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F UF3-FR 용액을 대략 2.0 g/L로 농축시키고, 300 kDa NMWCO 울트라셀, 재생 셀룰로스, 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 150 mM 염화나트륨, 0.015% w/v PS-20, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과한다. 이는 한외여과 4 공정 중간체 (UF4-FR)를 생성하였다. UF4-FR의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다.
UF4-FR을 PVDF 필터를 통해 0.22-마이크로미터 여과한다. 여과물의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 여과물의 Ps 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 여과물을 이어서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘을 사용하여 1.0 g/L의 Ps 농도로 희석한다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC)를 생성하였다. MBC를 분취물로 분배하고, -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킨다.
혈청형 6A, 6B 및 18C에 대한 UF4-FR을 이중-막 PES 필터를 통해 0.5/0.2-마이크로미터 여과한다. 여과물의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 여과물의 Ps 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 여과물을 이어서 150 mM 염화나트륨, 0.03% w/v PS-20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘을 사용하여 1.0 g/L의 Ps 농도로 희석한다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC)를 생성하였다. MBC를 분취물로 분배하고, -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킨다.
혈청형 7F, 19A, 19F 및 23F에 대한 UF4-FR을 PVDF 필터를 통해 0.22-마이크로미터 여과한다. 여과물의 Ps 농도를 HPSEC UV-MALS-RI에 의해 결정한다. 여과물의 Ps 농도가 1.0 g/L 초과인 경우에, 여과물을 이어서 150 mM 염화나트륨, 0.015% w/v PS-20, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘을 사용하여 1.0 g/L의 Ps 농도로 희석한다. 이는 1가 벌크 접합체 중간체 (MBC)를 생성하였다. MBC를 분취물로 분배하고, -60℃ 내지 -80℃에서 동결시킨다.
실시예 8
본 실시예는 무수 DMSO 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 또는 38로부터의 Ps를 CRM197 (Pr)에 접합시키는 방법을 보여준다. 상이한 혈청형 폴리사카라이드를 공통 공정 흐름을 사용하여 정제된 CRM197 담체 단백질에 개별적으로 접합시킨다.
폴리사카라이드 (Ps) 리오스피어 및 CRM197 단백질 (Pr) 리오스피어를 특정 Ps 대 Pr의 비 (Ps:Pr) 및 최종 Ps 농도를 표적으로 하여 조합함으로써 리오스피어 혼합물을 제공하고, 이를 상기와 같이 무수 DMSO 중에 용해시킨다. 소듐 시아노보로히드라이드를 이 Ps:Pr 재구성된 혼합물에 첨가하고, 용액을 요구되는 접합 온도에서 적절한 반응 시간 동안 인큐베이션하며, 이들 둘 다는 Pr에 접합되는 Ps 혈청형에 대해 특이적이다. 생성된 접합체 크기의 크기는 Ps 농도에 의해 유의하게 영향을 받는 것으로 나타났다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
접합 반응 후에 소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 2 몰)를 첨가하고, 용액을 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 용액을 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨, 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20 중으로 희석한다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시킨다. 용액을 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨에 대해 대략 4℃에서 투석여과한다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 각각의 용액을 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과한다. 보유물 용액을 0.22-마이크로미터 여과한다.
혈청형 19F를 대략 5일 동안 인큐베이션하고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하고, 0.22-마이크로미터 여과한다. 혈청형 18C를 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하고, 0.22-마이크로미터 여과한다.
용액을 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘으로 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시킨다.
실시예 9
본 실시예는 상이한 계면활성제 및 안정화제를 사용한 15가 폐렴구균 접합체 백신의 제제화를 보여준다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 갖는 15가 폐렴구균 접합체 백신 (PCV15)의 제제화에 사용한다.
이전에 논의된 바와 같이 DMSO 중에서 환원성 아미노화에 의해 생성된 폐렴구균 폴리사카라이드-CRM197 접합체를 사용하여 제제를 제조한다. 개별 혈청형의 표적 최종 농도를 수득하는데 필요한 벌크 접합체의 요구되는 부피를 용액 부피 및 벌크 폴리사카라이드 농도에 기초하여 계산한다. 15종의 접합체를 염화나트륨, L-히스티딘, pH 5.8 완충제와 폴리소르베이트 (PS)-20, PS-80 또는 폴록사머 (P)188로부터 선택된 부형제와 조합한다.
멸균 제제화된 벌크를 벌크 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)와 프로필렌 글리콜 (PG) 및 폴리에틸렌 글리콜 400 (PEG400)의 존재 또는 부재 하에 블렌딩하는 동안 및 그 후에 부드럽게 혼합한다. 다양한 제제에서 2가지 농도의 접합체 및 APA를 연구한다. 하나는 8 μg/mL 혈청형 6B 폴리사카라이드, 모든 다른 혈청형에 대해서는 4μg/mL 폴리사카라이드 및 250 μg/mL APA를 함유하였다. 다른 것은 16 μg/mL 혈청형 6B 폴리사카라이드, 모든 다른 혈청형에 대해서는 8 μg/mL 폴리사카라이드 및 500 μg/mL APA를 함유하였다. 제제화된 백신을 2-8℃에서 저장한다.
APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 수성 현탁액이다. APA는 염화알루미늄 및 인산나트륨을 1:1 부피 비로 블렌딩하여 알루미늄 히드록시포스페이트를 침전시킴으로써 제조한다. 블렌딩 공정 후에, 물질을 고-전단 혼합기로 크기-감소시켜 단분산 입자 크기 분포를 달성한다. 이어서 생성물을 생리 염수에 대해 투석여과하고, 증기 멸균한다.
본 발명은 예시된 실시양태를 참조하여 본원에 기재되어 있으나, 본 발명이 이에 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술을 갖고 본원의 교시에 접근할 수 있는 자는 추가의 변형 및 그의 범주 내의 실시양태를 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (32)

  1. 담체 단백질에 공유 연결된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 폴리사카라이드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며,
    (a) 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 1종 이상의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 리오스피어 조성물 및 담체 단백질을 포함하는 제2 리오스피어 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 소정량의 제1 리오스피어 조성물 및 소정량의 제2 리오스피어 조성물을 함께 조합하여 담체 단백질에 대한 1종 이상의 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 리오스피어 혼합물을 제공하는 단계;
    (c) 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하고 혼합하여 재구성된 혼합물을 제공하는 단계; 및
    (d) 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 접합체 용액을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 리오스피어 조성물이 동결건조 및 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된 승화 건조 공정에 의해 제조되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 리오스피어 조성물이 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택된 승화 건조 공정에 의해 제조되며, 이는 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 제1 수용액 및 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 제2 수용액을 제공하고, 여기서 제1 및 제2 수용액은 약 0.5% 이상의 수크로스를 포함하는 것인 단계, 및 제1 및 제2 수용액을 승화 건조 공정에 적용하여 제1 및 제2 리오스피어 조성물을 생산하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는 시트레이트 완충제인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 리오스피어 조성물이 6% 미만의 수분 함량을 갖는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 유기 용매가 디메틸술폭시드 (DMSO)인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 재구성이 8분 이하 내에 수행되고, 혼합이 120분 이하 내에 수행되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 접합체 용액이 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.5의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 접합체 용액이 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 양을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 1종 이상의 폴리사카라이드가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3으로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 불활성화된 박테리아 톡소이드가 CRM197인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 접합체 용액이 멸균 여과되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드가 산화제와의 반응에 의해 활성화되는 것인 방법.
  16. 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며,
    (a) (i) 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액; 또는
    (ii) 각각 2종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 수용액이며, 여기서 폴리사카라이드는 산화제와 반응하여 활성화된 폴리사카라이드를 제공하고, 여기서 2종 이상의 제1 수용액은 동일하지 않은 것인, 2종 이상의 제1 수용액
    을 제공하는 단계;
    (b) 각각 담체 단백질 및 완충제를 포함하는 2종 이상의 제2 수용액을 제공하고, 여기서 2종 이상의 제2 수용액의 양은 적어도 2종 이상의 제1 수용액의 양에 상응하는 것인 단계;
    (c) 2종 이상의 제1 수용액 및 2종 이상의 제2 수용액을 리오스피어를 생산하기 위한 승화 건조 공정에서 개별적으로 건조시켜, 각각 건조된 폴리사카라이드를 포함하는 2종 이상의 제1 리오스피어 조성물 및 각각 건조된 담체 단백질을 포함하는 2종 이상의 제2 리오스피어 조성물을 생산하는 단계;
    (d) 소정량의 제1 리오스피어 조성물 및 소정량의 제2 리오스피어 조성물을 독립적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 복수의 리오스피어 혼합물을 제공하는 단계;
    (e) 복수의 리오스피어 혼합물을 유기 용매 중에서 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 제공하는 단계;
    (f) 복수의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여 복수의 접합체 용액을 생산하는 단계; 및
    (g) 복수의 접합체 용액 중 2종 이상을 조합하여, 각각 담체 단백질에 공유 연결된 1종 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드를 갖는 2종 이상의 접합체를 포함하는 조성물을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 승화 건조 공정이 동결건조 또는 방사 에너지 진공 (REV) 탈수로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 제1 및 제2 수용액이 약 0.5% 이상의 수크로스를 포함하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 유기 용매가 디메틸술폭시드 (DMSO)인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 재구성이 8분 이하 내에 수행되고, 혼합이 120분 이하 내에 수행되는 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 각각의 접합체 용액이 담체 단백질에 접합된 폴리사카라이드를 중량 대 중량 기준으로 약 0.6 내지 약 1.3의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비로 포함하는 것인 방법.
  22. 제16항에 있어서, 각각의 접합체 용액이 용액 중 총 폴리사카라이드의 약 15% 미만인 유리 폴리사카라이드 양을 포함하는 것인 방법.
  23. 제16항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 히스티딘, 숙시네이트, MES, MOPS, HEPES 또는 아세테이트 완충제인 방법.
  24. 제16항에 있어서, 완충제가 5.0-7.0의 pH 범위의 포스페이트 또는 시트레이트 완충제인 방법.
  25. 제16항에 있어서, 1종 이상의 폴리사카라이드가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2 및 CWPS3 중 적어도 1종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터 수득되는 것인 방법.
  26. 제16항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드, 박테리아 세포용해소 또는 뉴모리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 불활성화된 박테리아 톡소이드인 방법.
  27. 제28항에 있어서, 불활성화된 박테리아 톡소이드가 CRM197인 방법.
  28. 제16항에 있어서, 접합체 용액이 멸균 여과되는 것인 방법.
  29. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 23종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 23종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 23종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 각각의 23종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 23종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 23종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 23종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (c) 각각의 23종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 23종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 23종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 23종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 23종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 23종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  30. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 15종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 15종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 15종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 각각의 15종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 15종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 15종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 15종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (c) 각각의 15종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 15종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 15종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 15종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 15종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 15종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  31. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 13종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 13종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 13종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 각각의 13종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 13종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 13종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 13종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (c) 각각의 13종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 13종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 13종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 13종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 13종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 13종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
  32. 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제조하는 방법이며,
    (a) 10종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터 선택된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 건조된 활성화된 폴리사카라이드를 포함하는 10종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 제공하고, 여기서 10종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 각각의 10종의 담체 단백질 리오스피어 조성물 및 각각의 10종의 활성화된 폴리사카라이드 리오스피어 조성물을 개별적으로 조합하여, 각각 담체 단백질에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 미리 결정된 비를 갖는 10종의 리오스피어 혼합물을 제공하고, 여기서 10종의 리오스피어 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (c) 각각의 10종의 리오스피어 혼합물을 유기 용매로 개별적으로 재구성하고 혼합하여 복수의 재구성된 혼합물을 생산하고, 여기서 10종의 재구성된 혼합물 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계;
    (d) 각각의 10종의 재구성된 혼합물에 환원제를 첨가하여, 각각 특정 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질을 포함하는 10종의 접합체 용액을 생산하고, 여기서 10종의 접합체 용액 중 어느 것도 동일한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형으로부터의 활성화된 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (e) 10종의 접합체 용액을 조합하여, 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 폴리사카라이드 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유하는 다가 폐렴구균 접합체 백신을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법.
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