CN112041435A - 提供冻干的突变白喉毒素在二甲基亚砜中的均质溶液的方法 - Google Patents

提供冻干的突变白喉毒素在二甲基亚砜中的均质溶液的方法 Download PDF

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Abstract

描述了一种在二甲基亚砜中重构冻干的突变白喉毒素以用于生产肺炎球菌荚膜多糖突变白喉毒素缀合物的方法。

Description

提供冻干的突变白喉毒素在二甲基亚砜中的均质溶液的方法
背景技术
(1)发明领域
本发明涉及一种在无水二甲基亚砜中重构冻干的突变白喉毒素(mDT)以用于生产肺炎球菌荚膜多糖:mDT缀合物的方法。
(2)相关领域的描述
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种荚膜细菌，并且是全世界严重疾病的重要原因。1997年，美国疾病控制与预防中心(CDC)估计，美国每年有3,000例肺炎球菌脑膜炎、50,000例肺炎球菌菌血症、7,000,000例肺炎球菌中耳炎和500,000例肺炎球菌性肺炎。参见Centers for Disease Control and Prevention,MMWR Morb Mortal Wkly Rep1997,46(RR-8):1-13。此外，这些疾病的并发症可能很严重，一些研究报道，肺炎球菌脑膜炎的死亡率高达8％，神经系统后遗症高达25％。参见Arditi等，1998,Pediatrics 102:1087-97。
事实证明，已获许可多年的多价肺炎球菌多糖疫苗在预防成年人，尤其是老年人和高危人群的肺炎球菌疾病方面具有不可估量的价值。然而，婴幼儿对未缀合的肺炎球菌多糖反应较差。细菌多糖是不依赖T细胞的免疫原，在婴儿中引起微弱反应或无反应。细菌多糖免疫原与载体蛋白的化学缀合可将婴儿的免疫应答转化为一种依赖T细胞的免疫应答。白喉类毒素(DTx，白喉毒素(DT)的化学去毒化版本)和DT被描述为细菌多糖免疫原的载体蛋白，因为它们的氨基酸序列中存在刺激T细胞的表位。
因此，已经开发了包含与载体蛋白缀合的细菌荚膜多糖的多糖-蛋白缀合物疫苗，并且正在开发其他疫苗。已开发的缀合物疫苗的实例包括乙型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)(Hib)缀合物疫苗(例如，
Figure BDA0002750657400000011
)以及针对肺炎链球菌(例如，
Figure BDA0002750657400000012
和PREVNAR
Figure BDA0002750657400000021
)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(例如，
Figure BDA0002750657400000022
)的缀合物疫苗。
发明内容
本发明提供了一种制备突变白喉毒素(mDT)在无水二甲基亚砜(DMSO)中的均质溶液的方法，其中在制备均质溶液后长达六个小时没有如傅立叶变换红外光谱法或动态光散射法测定的可检测的β-折叠介导的mDT聚集。该均质溶液可用于制备多种肺炎链球菌多糖-mDT缀合物，每种缀合物均包含特定血清型的多糖，并且可用于生产具有用于疫苗的缀合物的特定组合的多价肺炎球菌免疫原性组合物。
本发明提供了一种制备突变白喉毒素(mDT)在无水DMSO中的均质溶液的方法，所述方法包括(a)提供mDT的干燥的组合物；和(b)通过在两分钟或更短的时间段内将所述无水DMSO添加至所述干燥的组合物并混合至少10秒在无水DMSO中重构所述干燥的组合物，以提供包含所述mDT的均质溶液。
在所述方法的特定实施方式中，通过选自冻干和辐射能真空(REV)脱水的升华干燥方法从mDT的水溶液中制备所述mDT的干燥的组合物。在一个进一步的实施方式中，所述升华干燥方法包括以饼或冻干球小珠形式冷冻所述水溶液。在另一个实施方式中，所述升华干燥是在选自以下的容器中进行批量干燥：金属托盘、塑料托盘、塑料袋和I型管瓶。
在特定实施方式中，通过升华干燥包含mDT的水溶液制备所述干燥的组合物以生产所述干燥的组合物，其中所述水溶液还包含蔗糖和缓冲剂，且所述升华干燥选自冻干和辐射能真空(REV)脱水。
在特定实施方式中，所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的组氨酸、琥珀酸盐、MES、MOPS、HEPES或乙酸盐缓冲剂。在特定实施方式中，所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
在特定实施方式中，所述水溶液包含约0.5％(w/v)或更多蔗糖。在特定实施方式中，所述水溶液包含约4％至8％(w/v)蔗糖。
在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约6％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约5％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约4％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约3％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约2％或更少的最终水分含量。
在特定实施方式中，所述水溶液包含浓度为约6至12mg/mL的mDT。在特定实施方式中，所述水溶液包含浓度为约6、9、10或12mg/mL的mDT。
在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述重构。在特定实施方式中，在六分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，在四分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，在两分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，在约两分钟内进行所述重构。在特定实施方式中，在一分钟或更短时间内进行所述重构。
在特定实施方式中，替代地在120分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述混合。在特定实施方式中，替代地在90分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，替代地在60分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，替代地在30分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，替代地在10分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在所述重构后六小时或更短时间内，将包含所述mDT的均质溶液用于缀合至活化的多糖。
本发明还提供了一种提供突变白喉毒素(mDT)在无水二甲基亚砜(DMSO)中的无可检测的β片层介导的聚集的均质溶液的方法，所述方法包括：(a)提供所述mDT的干燥的组合物；和(b)通过在两分钟或更短的时间段内将所述无水DMSO添加至所述干燥的组合物并混合在无水DMSO中重构所述干燥的组合物，以提供包含所述mDT的均质溶液，其中如通过傅里叶变换红外光谱或动态光散射所确定的，所述均质溶液不包含可检测的β片层介导的聚集。
在一个进一步的实施方式中，在重构后长达一小时所述均质溶液不包含可检测的β片层介导的聚集。在一个进一步的实施方式中，在重构后长达两小时所述均质溶液不包含可检测的β片层介导的聚集。在一个进一步的实施方式中，在重构后长达三小时所述均质溶液不包含可检测的β片层介导的聚集。在一个进一步的实施方式中，在重构后长达四小时所述均质溶液不包含可检测的β片层介导的聚集。在一个进一步的实施方式中，在重构后长达五小时所述均质溶液不包含可检测的β片层介导的聚集。在一个进一步的实施方式中，在重构后长达六小时所述均质溶液不包含可检测的β片层介导的聚集。
在所述方法的特定实施方式中，通过选自冻干和辐射能真空(REV)脱水的升华干燥方法从mDT的水溶液中制备所述mDT的干燥的组合物。在一个进一步的实施方式中，所述升华干燥方法包括在所述升华干燥方法之前以饼或冻干球小珠形式冷冻所述水溶液。在另一个实施方式中，所述升华干燥包括在选自以下的容器中进行批量干燥：金属托盘、塑料托盘、塑料袋和I型管瓶。
在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约6％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约5％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约4％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约3％或更少的最终水分含量。在特定实施方式中，所述干燥的组合物具有约2％或更少的最终水分含量。
在特定实施方式中，通过升华干燥包含mDT的水溶液制备所述干燥的组合物以生产所述干燥的组合物，其中所述水溶液还包含蔗糖和缓冲剂，且所述升华干燥选自冻干和辐射能真空(REV)脱水。
在特定实施方式中，所述水溶液包含约0.5％(w/v)或更多蔗糖。在特定实施方式中，所述水溶液包含约4％至8％(w/v)蔗糖的。
在特定实施方式中，所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的组氨酸、琥珀酸盐、MES、MOPS、HEPES或乙酸盐缓冲剂。
在特定实施方式中，所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
在特定实施方式中，所述水溶液包含浓度为约6至12mg/mL的mDT。在特定实施方式中，所述水溶液包含浓度为约6、9、10或12mg/mL的mDT。
在所述方法的特定实施方式中，替代地在八分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述重构。在特定实施方式中，替代地在六分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在四分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在二分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在约两分钟内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在一分钟或更短时间内进行所述重构。
在特定实施方式中，在120分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述混合。在特定实施方式中，在90分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在60分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在30分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在10分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在所述重构后六小时或更短时间内，将包含所述mDT的均质溶液用于缀合至活化的多糖。
本发明还提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包含与突变的白喉毒素(mDT)共价连接的肺炎链球菌多糖，其包含以下步骤：(a)提供第一干燥的组合物和第二干燥的组合物，所述第一干燥的组合物包含来自一种或多种肺炎链球菌血清型的活化的肺炎链球菌多糖，所述第二干燥的组合物包含mDT；(b)在二甲基亚砜(DMSO)中分别重构所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物并混合，以提供第一均质溶液和第二均质溶液，所述第一均质溶液包含一种或多种活化的多糖，所述第二均质溶液包含mDT；(c)将所述第一均质溶液与所述第二均质溶液组合以提供混合物；和(d)向所述混合物中添加还原剂以生产缀合物溶液，所述缀合物包含与一种或多种肺炎链球菌血清型的一种或多种多糖缀合的mDT，其特征在于在无水DMSO中重构所述第一干燥的组合物和在两分钟或更短时间的时间段内通过将无水DMSO添加至所述第二干燥的组合物并混合在无水DMSO中重构所述第二干燥的组合物以提供包含mDT的均质溶液，或者其中改进是在无水DMSO中重构所述第一干燥的组合物和在两分钟或更短时间的时间段内通过将无水DMSO添加至所述第二干燥的组合物并混合在无水DMSO中重构所述第二干燥的组合物以提供包含mDT的均质溶液。
在所述方法的特定实施方式中，通过选自冻干和辐射能真空(REV)脱水的升华干燥方法制备所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物。在一个进一步的实施方式中，所述升华干燥方法包括在所述升华干燥方法之前以饼或冻干球小珠形式冷冻所述第一水溶液和所述第二水溶液。在另一个实施方式中，所述升华干燥包括在选自以下的容器中进行批量干燥：金属托盘、塑料托盘、塑料袋和I型管瓶。
在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物各自具有约6％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物各自具有约5％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物各自具有约4％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物各自具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物各自具有约2％或更低的最终水分含量。
在特定实施方式中，通过升华干燥第一水溶液和第二水溶液制备所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物以生产所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物，所述第一水溶液包含来自一种、两种或更多种肺炎链球菌血清型的活化的肺炎链球菌多糖，第二水溶液包含mDT，其中所述第一水溶液和所述第二水溶液还包含约0.5％(w/v)或更多的蔗糖和缓冲剂，和其中所述生化干燥选自冻干或辐射能真空(REV)脱水。
在特定实施方式中，所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的组氨酸、琥珀酸盐、MES、MOPS、HEPES或乙酸盐缓冲剂。
在特定实施方式中，所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
在特定实施方式中，所述第一水溶液和所述第二水溶液包含约0.5％(w/v)或更多的蔗糖。在特定实施方式中，所述第一水溶液包含约4％至6％(w/v)的蔗糖和所述第二水溶液包含约4％至8％(w/v)的蔗糖。
在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述第二水溶液包含浓度为约6至12mg/mL的所述mDT。在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6或9mg/mL的所述多糖和所述第二水溶液包含浓度为约6、9、10或12mg/mL的所述mDT。
在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述重构。在特定实施方式中，替代地在六分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在四分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在两分钟或更短时间内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在约两分钟内进行所述重构。在特定实施方式中，替代地在一分钟或更短时间内进行所述重构。
在特定实施方式中，在120分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述混合。在特定实施方式中，在90分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在60分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在30分钟或更短时间内进行所述混合。在特定实施方式中，在10分钟或更短时间内进行所述混合。
在特定实施方式中，每种缀合物溶液包含以重量对重量计以约0.6至约1.3的多糖与mDT的比率缀合至所述mDT的多糖。在特定实施方式中，每种缀合物溶液包含以重量对重量计以约0.9至约1.5的多糖与mDT的比率缀合至所述mDT的多糖。在特定实施方式中，每种缀合物溶液包含以重量对重量计以约0.6至约1.5的多糖与mDT的比率缀合至所述mDT的多糖。
在特定实施方式中，所述缀合物溶液包含小于所述溶液中总多糖的约15％的游离多糖浓度。在特定实施方式中，所述缀合物溶液包含小于所述溶液中总多糖的约10％的游离多糖浓度。
在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的mDT赖氨酸损失值。
在特定实施方式中，每种缀合物溶液包含以重量对重量计以约0.6至约1.3的多糖与mDT的比率缀合至所述mDT的多糖，小于所述溶液中总多糖的约15％的游离多糖浓度，以及所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的mDT赖氨酸损失值。
在特定实施方式中，一种或多种肺炎链球菌血清型选自以下的肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、6E、6G、6H、7F、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、10B、10C、11F、11A、11B、11C、11D、11E、12F、12A、12B、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A,18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20A、20B、21、22F、22A、23F、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、31、32F、32A、33F、33A、33B、33C、33D、33E、34、35F、35A、35B、35C、36、37、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A、48、CWPS1、CWPS2和CWPS3。
在特定实施方式中，通过与氧化剂反应活化所述一种或多种肺炎链球菌多糖，以在步骤(a)中提供活化的多糖。
在本文的任何一个实施方式中，突变的白喉毒素是CRM197。
在特定实施方式中，所述缀合物溶液是无菌过滤的。
附图说明
图1显示了在无水DMSO中快速(两分钟)相比于慢速(八分钟)重构的CRM197的FTIR光谱。
图2显示了在无水DMSO中中等速度(intermediate)重构(四分钟)，随后增加保持时间(30分钟；60分钟；120分钟；180分钟；240分钟；300分钟)的CRM197的FTIR光谱。
图3显示了以不同浓度(10mg/mL；30mg/mL；50mg/mL)在无水DMSO中快速重构(两分钟)的CRM197的FTIR光谱。
图4A和4B显示了以10mg/mL(图4A)和30mg/mL(图4B)在无水DMSO中快速重构(两分钟)的CRM197的动态光散射(DLS)图谱。每个样品采集三个测量值(三轨)。
图5显示了在含有不同水平水(无水DMSO；99％DMSO/水；97％DMSO/水；95％DMSO/水)的DMSO中快速重构(两分钟)的CRM197的FTIR光谱。
图6显示了在无水DMSO中快速(两分钟)相比于慢速(八分钟)重构极干燥的冻干CRM197的FTIR光谱(快速(两分钟)；慢速(八分钟))。
图7显示了CRM197：多糖血清型6B(CRM197-6B)缀合物的FTIR光谱，其中在多糖6B缀合之前，CRM197已被快速(两分钟)或缓慢(八分钟)重构。还显示了在水性条件下缀合至多糖6B的CRM197。
图8显示了制备突变的白喉毒素(mDT)多糖(Ps)缀合物的一般流程图。
图9显示了使用尺寸增加的多糖从反应产生的缀合物的尺寸。图中显示了与快速添加无水DMSO相比，缓慢添加无水DMSO可以从相同尺寸的多糖中获得甚至更大的缀合物。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，术语“多糖”(Ps)旨在包括免疫和细菌疫苗领域常用的任何抗原性糖成分(element)(或抗原单位)，包括但不限于“糖”、“寡糖”、“多糖”、“脂糖”、“脂寡糖(LOS)”、“脂多糖(LPS)”、“糖基化物”、“糖缀合物”等。取决于上下文，Ps可以是单数或复数。
如本文所用，当与本发明的免疫原性组合物一起使用时，术语“包含”指包括任何其他组分(针对抗原混合物受“由……组成”用语的限制)，如佐剂和赋形剂。当与多价多糖-蛋白缀合物混合物一起使用时，术语“由……组成”指具有那些特定肺炎链球菌多糖蛋白缀合物且不具有来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的混合物。
如本文所定义，术语术语“沉淀(precipitation/precipitate)”、“颗粒形成”、“混浊”和“聚集”可以互换使用，并且是指导致多糖-蛋白缀合物聚集的任何物理相互作用或化学相互作用。聚集过程(例如，蛋白聚集)可以由多种物理化学应力诱导，包括热、压力、pH、搅拌、剪切力、冻融、脱水、重金属、酚类化合物、硅油、变性剂等。
如本文所用，术语“重构(reconstituting/reconstitution)”指将液体添加至干燥的物质中以溶解干燥的物质，以提供在其中溶解的物质的溶液。然而，通过重构提供的溶液可能具有在其中溶解的物质的浓度梯度或层。因此，重构后，将溶液物理搅拌，以提供重构物质的均质溶液。
如本文所用，术语“混合”用于指通过振荡、搅拌、摇动、旋转等进行溶液的物理搅拌。
如本文所用，术语“均质溶液”指其中所有组分被充分混合，使得溶液中组分之间没有浓度梯度或层的溶液。
如本文所用，“冻干球”是冻干物质的离散颗粒，例如呈小珠或球形或其他形状的形式。也可以将冻干球称为冻干颗粒球或冻干珠。在一些实施方式中，冻干球的直径是从约2至约12mm，优选从2至8mm，如从2.5至6mm或2.5至5mm。在一些实施方式中，冻干球的体积是从约20至550μL，优选从20至100μL，如从20至50μL。在其中冻干球基本上不是球形的实施方式中，可以相对于其长宽比描述冻干球的尺寸，所述长宽比是长径与短径的比率。冻干球的长宽比可以从0.5至2.5，优选从0.75至2，如从1至1.5。
如本文所用，“免疫原性组合物”可以是多价组合物，其含有与一种或多种mDT(例如，CRM197)缀合的一种或多种抗原。在本发明的某些实施方式中，抗原是来自包膜细菌的糖。在此类组合物中，糖由类似于某些类型细菌表面的糖分子的长链组成。包膜细菌包括但不限于肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和乙型流感嗜血杆菌。抗原可以来自相同生物或可以来自不同生物。在本发明的优选实施方式中，抗原是肺炎链球菌荚膜多糖。
如本文所用，术语“辐射能真空(REV)脱水”也称为微波真空干燥(MVD)。
II.工艺
本发明提供了一种生产可用作抗肺炎球菌疫苗的多价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物的方法或工艺，其中在2分钟或更短的一个快速时间跨度内在无水二甲基亚砜(DMSO)中重构突变的白喉毒素(mDT)，以提供均质溶液，该均质溶液与在无水DMSO中重构的活化多糖的均质溶液组合，形成的条件是导致形成的缀合物组合物具有低水平的游离多糖(例如，少于15％的游离多糖)且没有可检测的β-片层介导的聚集。
发明人发现在重构mDT期间，将有机溶剂(如DMSO)添加至干燥的mDT中的时间长度以及在缀合之前重构mDT随后贮存或保持的时间长度影响mDT的二级结构以及因此影响具有所需分子量和mDT与同其缀合的多糖的比率的缀合物的收率。发明人在本文中使用CRM197进行了示例，其是白喉毒素的无毒性变体(即，类毒素)。如图1-7中所示，如通过傅立叶变换红外光谱(FTIR)或动态光散射(DLS)确定的，在快速添加条件下在无水DMSO中重构干燥的mDT的时间(例如，在少于八分钟或在约两分钟或更短时间内向干燥的mDT中添加无水DMSO)提供了其中mDT完全展开且没有可检测的β-片层形成的重构的mDT溶液。进一步发现，在DMSO中存在任何可检测的水和/或具有mDT的终浓度大于12mg/mL的mDT时，均会导致β-片层介导的聚集。因此，在本发明的一个优选的实施方式中，在少于八分钟；优选地少于五分钟，和更优选地两分钟或更短时间的一段时间内将无水DMSO添加至干燥的mDT；并将mDT保持在浓度处于或小于10mg/mL或12mg/mL或更低，和在特定实施方式中，处于约6mg/mL。
在特定实施方式中，为了确保干燥的mDT和多糖完全溶解，可以将包含mDT的第一均质溶液和包含活化的多糖的第二均质溶液混合120分钟或更短时间。在特定实施方式中，混合可以是90分钟或更短时间。在特定实施方式中，混合可以是60分钟或更短时间。在特定实施方式中，混合可以是30分钟或更短时间。在特定实施方式中，混合可以是10分钟或更短时间。在特定实施方式中，在与包含多糖的第一均质溶液组合之前，包含mDT的第二均质溶液在DMSO溶液中约六小时或更短时间。发明人已发现将mDT在DMSO中保持超过六小时可能导致可检测的β片层介导的mDT聚集的形成。因此，在特定实施方式中，将mDT保持在DMSO中六小时或更短时间。
图8显示了制备mDT多糖缀合物的一般流程图，其中根据本文的教导制备mDT。
在通常情况下，将针对每种血清型的纯化的肺炎球菌荚膜多糖(Ps)粉末单独溶解在水中，以提供经0.45微米过滤的溶液，但包含来自血清型19A的溶液除外。除血清型19A以外，将包含来自本文公开的任何血清型的Ps的所有溶液均质化以降低Ps的分子量。通过在90℃或更高温度下进行酸水解以降低血清型18C的尺寸。由于其初始尺寸相对较低，因而未降低血清型19A的尺寸。针对血清型特异性目标控制均质压力和通过均质器的次数，以实现血清型特异性分子量。将多糖分别进行0.22-微米过滤，然后在超滤步骤1中使用具有开放通道的10kDa超滤膜(5型)浓缩并用水进行渗滤，以产生渗滤液1。
然后，可以使用缓冲液(例如，乙酸钠)将渗滤液1调节至血清型特异性温度(4–22℃之间)和pH(4-5)，以最小化活化步骤中多糖尺寸的减小。通过高碘酸盐氧化进行多糖活化。对于血清型4，在活化之前，将溶液在约50℃和pH 4下孵育，以部分去缩酮化多糖。通过添加偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量是血清型特异性的，每摩尔多糖重复单元的范围从约0.1至0.5摩尔偏高碘酸钠。选择偏高碘酸钠的血清型特异性的加入量(charge)，以实现目标水平的多糖活化(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。
在超滤步骤2中，对于除包含血清型5和7F的溶液外的所有血清型溶液，可将活化的多糖进行渗滤，然后使用具有开放通道的10kD超滤膜(类型5)通过切向流超滤进行浓缩以产生渗滤液2。在渗滤结束时，可以将渗滤液2浓缩至15g Ps/L的目标。可以使用缓冲液(例如，10mM乙酸钠)对包含血清型5和7F的溶液进行渗滤。优选地，针对所有血清型溶液的渗滤在2-8℃下进行。
然后，在含蔗糖的水中稀释渗滤液2，以制备最终浓度为约4至12mg/mL多糖和0.5％至6％(w/v)蔗糖的溶液，对其进行升华干燥方法以生产干燥的多糖，优选地最终含水量为6％或更低。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约5％或更低。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约4％或更低。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约3％或更低。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约2％或更低。冻干之前向溶液中添加的蔗糖的量是血清型特异性的，并且在冻干之前其范围可以从3.0至5.0％(w/v)。在特定实施方式中，可以将两种或更多种多糖一起干燥，以生产干燥的多糖混合物。
使用5kDa切向流超滤膜，用2mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)对包含纯化的mDT的溶液进行渗滤，然后通过0.22微米过滤器过滤。在含蔗糖的水中稀释过滤后的溶液，以使得终浓度为约6至12mg/mL mDT和4至10％(w/v)蔗糖，并进行升华干燥方法，以生产优选最终含水量为6％或更低的干燥mDT。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约5％或更低。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约4％或更低。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约3％或更低。在特定实施方式中，组合物的最终含水量为约2％或更低。
用于多糖和mDT溶液的生化干燥方法可以包括冻干或辐射能真空(REV)脱水。
将干燥的多糖或干燥的多糖混合物和干燥的mDT分别在无水二甲基亚砜(DMSO)中重构或再溶解以提供各均质溶液。在特定实施方式中，以约10至20mg/mL或约10mg/mL浓度重构mDT。发明人发现，使用CRM197作为模型，在DMSO中含1％(v/v)或更多水分将导致β-片层形成(见图5)。因此，本发明提供了其中DMSO的水分含量低于1％(v/v)或者其中DMSO不包含可检测的水分(例如，无水DMSO或100％(v/v)DMSO)的实施方式。通过在少于八分钟，优选地少于六分钟或少于四分钟，或更优选地在两分钟或更短时间，或一分钟或更短时间的一段时间内将DMSO添加至干燥的mDT中将干燥的mDT重构。
发明人还发现使用CRM197作为模型，基于傅立叶变换红外光谱(FTIR)和动态光散射(DLS)分析，用于将DMSO添加到干燥的mDT中的添加时间越短，越少形成不可逆的β片层介导的聚集。如图1中所示，无水DMSO的添加时间为两分钟使得未形成可检测的β片层介导的聚集。因此，在特定实施方式中，本发明提供了在含有少于1％水分的DMSO或者不含可检测的水分的DMSO(例如，无水或100％(v/v)DMSO)中重构mDT，其中在两分钟或少于两分钟的一段时间内将添加的所述DMSO添加至干燥的mDT中，以提供浓度为20mg/mL或更低或约10mg/mL或更低的重构的mDT。在特定实施方式中，重构后，可以将混合物混合至多30分钟，以提供mDT的均质溶液。然而，在特定实施方式中，混合可以在120分钟或更短时间、90分钟或更短时间、60分钟或更短时间、30分钟或更短时间或者10分钟或更短时间段内进行。在特定实施方式中，将500mM磷酸钠缓冲剂(pH 7.2)添加到包含mDT的均质溶液中，使得终浓度为1.0mM磷酸钠。
将mDT的均质溶液和多糖或两种或更多种不同多糖的均质溶液合并，以提供同时包含mDT和多糖或两种或更多种不同多糖的缀合溶液。在DMSO中重构或重新溶解后，以获得血清型特异性最终多糖浓度和多糖与mDT的比率的方式将多糖和mDT均质溶液合并在一起。在通常情况下，以将提供从约0.6至1.3(w/w)的最终缀合的多糖：mDT比率的量将mDT和多糖混合在一起。
为进行缀合反应，制备氰基硼氢化钠的水溶液，并将1.0meq氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1.0摩尔氰基硼氢化钠)添加至缀合溶液中。氰基硼氢化钠溶液的摩尔浓度基于缀合过程中约0.5％溶液总水含量的目标量。使缀合溶液在血清型特异性温度下反应持续血清型特异性的持续时间，以产生载体蛋白：mDT缀合物中间体。
接下来，制备硼氢化钠的水溶液，并将2.0meq硼氢化钠(相对于多糖重复单元)添加至缀合溶液中。硼氢化钠溶液的摩尔浓度基于添加硼氢化钠后缀合约1.0％溶液中总水含量的目标量。使缀合溶液在室温下反应三小时(某些血清型除外，如血清型7F，其中反应时间为两小时)，以产生mDT：多糖缀合物。
为淬灭缀合反应，针对包含来自特定血清型的多糖的缀合物，通过将缀合溶液缓慢添加至含150mM氯化钠的溶液(含0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠)中，在稀释步骤中将缀合溶液稀释至20％(v/v)或更低的DMSO，以生产淬灭的缀合物溶液。在特定实施方式中，在稀释步骤中，将温度保持在15℃或更低。约1小时后，可以将1.5M磷酸钾(pH 6.0)溶液添加至溶液中，以使得终浓度为25mM磷酸钾。可以通过总多糖和mDT的消耗，缀合物多糖与mDT的比率和缀合物分子量来评估缀合性能。
在超滤步骤3中，可以将淬灭的缀合物溶液浓缩至约2.5g/L，并使用30kDa切向流超滤膜，在2-8℃下使用高达约10个渗滤体积的150mM氯化钠或含25mM磷酸钾的150mM氯化钠进行渗滤，以产生渗滤液3。可以通过高效体积排阻色谱(HPSEC)紫外多角度光散射折射率(UV-MALS-RI)确定来自超滤步骤3的渗滤液3中的多糖浓度。对于包含来自某些血清型(如血清型19F)的多糖的缀合物，可以将渗滤液3通过0.22微米过滤器过滤以产生滤液，随后将滤液在22℃下孵育约120小时。
在超滤步骤4中，可以将来自超滤步骤3的渗滤液3或滤液浓缩至约2.5g/L的多糖浓度，并使用300kDa切向流超滤膜，在2-8℃下使用20个渗滤体积的含10mM L组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)进行渗滤，以产生渗滤液4。对于包含来自某些血清型(例如，血清型7F)的多糖的缀合物，可以使用100kDa切向流超滤膜对缀合物进行渗滤；例如，包含血清型6A、6B和18C多糖的缀合物，可以浓缩至约3.5g/L，并使用300kDa切向流超滤膜，在2-8℃下使用包含150mM氯化钠和0.03％(w/v)聚山梨醇酯20的缓冲液(pH7.0)进行渗滤，以产生渗滤液4。可以将包含血清型7F、19A、19F和23F多糖的缀合物浓缩至约2.0g/L，并使用300kDa再生纤维素切向流超滤膜，在2-8℃下使用含150mM氯化钠和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的缓冲液(pH 7.0)进行渗滤，以产生渗滤液4。可以通过HPSEC UV-MALS-RI确定在渗滤液2中的多糖浓度。缓冲剂可以是10-50mM乙酸盐、磷酸盐、TRIS、HEPES或氨基酸缓冲剂(如组氨酸)。在特定实施方式中，缓冲剂是10mM L-组氨酸。
可以通过0.22微米过滤器对来自超滤步骤4的渗滤液4进行过滤以产生第二滤液。可以通过HPSEC UV-MALS-RI确定第二滤液的多糖浓度。如果第二滤液的多糖浓度大于1.0g/L，则可以使用另外的含10mM L组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)将第二滤液稀释至多糖浓度1.0g/L。这提供了单价批量缀合物中间体(MBC)或单价原料药。可以将MBC分配成等分试样，并在-60℃至-80℃下冷冻。
针对包含血清型6A、6B和18C多糖的缀合物，可以通过双膜0.5/0.2微米过滤器对来自超滤步骤4的渗滤液4进行过滤以产生第二滤液。可以通过HPSEC UV-MALS-RI确定第二滤液的多糖浓度。如果第二滤液的多糖浓度大于1.0g/L，则可以使用另外的在150mM氯化钠中的10mM L组氨酸，0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 7.0将第二滤液稀释至多糖浓度1.0g/L。这提供了MBC或单价原料药。可以将MBC分配成等分试样，并在-60℃至-80℃下冷冻。
针对包含7F、19A、19F和23F多糖的缀合物，可以通过0.22微米过滤器对渗滤液4进行过滤也产生第二滤液。可以通过HPSEC UV-MALS-RI确定第二滤液的多糖浓度。如果第二滤液的多糖浓度大于1.0g/L，则可以使用另外的在150mM氯化钠中的10mM L组氨酸，0.015％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 7.0将第二滤液稀释至多糖浓度1.0g/L。这提供了MBC或单价原料药。可以将MBC分配成等分试样，并在-60℃至-80℃下冷冻。
III.多糖
可以通过本领域技术人员已知的标准技术来制备来自肺炎链球菌的荚膜多糖。例如，可以从细菌中分离多糖，并且可以通过已知方法将多糖尺寸到一定程度(参见，例如，欧洲专利号EP497524和EP497525)；并且在特定实施方式中，通过使用均质器或化学水解完成的微流化。在一个实施方式中，将肺炎链球菌菌株在基于大豆的培养基中生长。然后通过标准步骤(包括离心、沉淀和超滤)纯化各种多糖。参见，例如，美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。可以对多糖进行尺寸(sized)，以降低粘度和/或改善后续缀合产物的过滤性。在本发明中，由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F和38的一种或多种制备荚膜多糖。
IV.突变的白喉毒素
在本发明的一个特定实施方式中，CRM197用作mDT。CRM197是白喉毒素(DT)的无毒变体(即，类毒素)。在一个实施方式中，从在酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培养基中生长的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)菌株C7(β197)的培养物中分离得到CRM197载体蛋白。在另一个实施方式中，根据美国专利号5,614,382中描述的方法重组制备CRM197。通常，通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法组合纯化CRM197。在一些实施方式中，使用PFENEX EXPRESSION TECHNOLOGY(Pfenex Inc.,San Diego,CA)制备荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的CRM197。
其他mDT也可以用作载体蛋白，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，1973,J BiolChem 218:3838-3844)、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107，以及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992中描述的其他突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala 158突变为Gly以及在美国专利号4,709,017或美国专利号4,950,740中描述的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及在美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673中描述的其他突变；或在美国专利号5,843,711中描述的片段。
V.升华干燥
可以使用升华方法将含有特定肺炎链球菌血清型的多糖的水性组合物和含有mDT的组合物分别干燥，以提供包含具有最终水分含量6％或更低的干燥的mDT的组合物和包含具有最终水分含量约6％或更低的特定肺炎链球菌血清型的干燥的多糖的组合物。例如，可以通过诸如冻干或以行波形式进行的辐射能真空(REV)脱水(微波真空干燥)的升华方法、喷雾冷冻干燥、真空干燥、RF干燥等以连续或半连续模式制备干燥的组合物。参见例如，Encyclopedia of Agriculture,Food,and Biological Engineering.Marcel Dekker,Incor Xu&Sunada,Chem Pharm Bull(Tokyo)55(11):1545-50(2007)。冻干的制剂组分可以是饼或颗粒形式，例如，冻干物质的小丸(pellet)、小珠或小球，例如冻干球。参见例如，A.S.Mujumdar(2007).Handbook of Industrial Drying.CRC Press。
例如，可以通过以液滴形式(例如，约20、50、100或250微升)将包含一种或多种多糖血清型的水溶液的等分试样加载到固体平面上来制备冻干球，以这种方式液滴仍保持完整。在本发明的一个实施方式中，表面是板，例如金属板，例如在约-180℃至约-196℃或约-180℃至约-273℃的温度下。例如，在本发明的一个实施方式中，通过分配尖端(tip)将水溶液加载到表面上。在本发明的一个实施方式中，以约3ml/min至约75ml/min、约5ml/min至约75ml/min、约3ml/min至约60ml/min、约20ml/min至约75ml/min和约20ml/min至约60ml/min的分配速度分配水溶液。在本发明的一个实施方式中，分配的水溶液为250微升，分配速度为约5mL/min至约75mL/min之间，或者其中等分试样为100微升，分配速度为约3mL/min至约60mL/min之间。在本发明的一个实施方式中，分配尖端与分配水溶液的表面之间的间隙为约0.1cm或更大(例如，约0.5cm或0.1cm至1cm之间或0.1cm至0.75cm之间)。一旦在表面上，水溶液被冷冻，然后通过冻干进行升华干燥。制备冻干球的方法是本领域公知的。参见例如，US5656597；WO2013066769；WO2014093206；WO2015057540；WO2015057541或WO2015057548。
在本发明的一个实施方式中，通过辐射能真空(REV)脱水(微波真空干燥)将水溶液冻干。REV脱水是一种在减压条件下进行的干燥方法，其中水的沸点和大气中的氧含量降低。例如，在本发明的一个实施方式中，将等分试样的水溶液以单个液滴的形式沉积在固体表面上，其中表面温度为约-90℃或更低，当接触并作为冷冻小球在表面上冻结时，将液滴保持为单个液滴的方式；在低于大气压的压力下将微波辐射施加到冷冻的小球上，以产生干燥的小球，例如球形。在另一个实例中，将水溶液提供在托盘上，并在低于大气压的压力下进行微波辐射，以产生干燥的饼。参见，例如，美国专利号4,389,794；4,664,924；4,809,596；4,882,851。
VI.多糖-蛋白缀合
对纯化的多糖进行化学活化，以引入能够与mDT反应的官能团。一旦活化，根据本发明的方法，将每个荚膜多糖分别与mDT缀合以形成糖缀合物。
在一个实施方式中，可以通过美国专利号4,365,170；4,673,574；和4,902,506中所述的方法实现多糖的化学活化。简言之，将肺炎球菌多糖与氧化剂(例如，诸如高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸的高碘酸盐基氧化剂)反应，导致邻位羟基随机氧化裂解，以生成反应性醛基。可以通过还原胺化实现氧化的多糖与mDT上的伯胺基团(主要是赖氨酸残基)的直接胺偶联。例如，可以在水溶液或在有机溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)中进行缀合。参见，例如，US2015/0231270A1、EP 0471 177B1、US2011/0195086A1。在缀合反应结束时，通过添加强还原剂(如硼氢化钠)将未反应的醛封端。
在一个实施方式中，通过在美国专利号4,365,170、4,673,574和4,902,506中描述的方法实现多糖的化学活化和随后缀合至mDT。简言之，将多糖与诸如高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸的高碘酸盐基氧化剂反应，导致邻位羟基随机氧化裂解，以生成反应性醛基。然后，可以通过还原胺化实现氧化的多糖与mDT上的伯胺基团(主要是赖氨酸残基)的直接胺偶联。例如，在镍存在下，通过使活化的多糖和mDT的混合物与还原剂如氰基硼氢化钠反应来进行缀合。可以在水溶液或在有机溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)中进行缀合反应。参见，例如，US2015/0231270 A1、EP 0471 177 B1、US2011/0195086 A1。在缀合反应结束时，通过添加强还原剂(如硼氢化钠)任选地将未反应的醛还原。
在一个实施方式中，在制剂之前，将每种肺炎球菌荚膜多糖分别从肺炎链球菌中纯化，活化形成反应性醛，然后在镍存在下，使用氰基硼氢化钠进行还原胺化，共价缀合到mDT上。镍与来自用于还原胺化的氰基硼氢化钠还原剂的残留的、干扰氰化物形成络合物。因此，可以将镍用于本文的方法中，以提高缀合反应效率并有助于去除游离氰化物。
已知过渡金属可与氰化物形成稳定的络合物，并且已知可改善蛋白氨基和甲醛与氰基硼氢化钠的还原甲基化。参见Gidley等，Biochem J.1982,203:331-334；Jentoft等，Anal Biochem.1980,106:186-190。然而，申请人吃惊地发现，通过络合残留的、干扰氰化物，镍的添加增加了缀合过程中蛋白的消耗并导致形成更大的、可能更具免疫原性的缀合物。
市售氰基硼氢化钠试剂批次中游离氰化物水平的变化可能导致缀合性能不一致，从而导致缀合物属性变化，包括分子量和多糖与蛋白的比率。将镍添加至缀合反应降低了游离氰化物的水平，从而提高了批次间缀合物的一致性程度。
在另一个实施方式中，缀合方法可以采用使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸酯(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。可以将活化的糖直接偶联至mDT上的氨基。
在一个替代实施方式中，通过使氰酸酯与几种可用方式中的任何一种反应，可以将反应性同双功能或异双功能基团引入至活化的多糖上。例如，可以将胱胺或半胱胺用于制备硫醇化多糖，其能够通过与马来酰亚胺活化的mDT(例如使用GMBS)或卤代乙酰化的mDT(例如使用碘乙酰亚胺[例如，碘乙酰亚胺乙酯HCl]或溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯或SIAB、或SIA、或SBAP)反应后获得的硫醚键偶联至mDT。在国际专利申请公开号WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094；以及Chu等，1983,Infect.Immunity 40:245-256中描述了此类缀合物。
其他适宜的缀合方法使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。在国际专利申请公开号WO98/42721中描述了很多。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应形成(参见，Bethell等，1979,J.Biol.Chem.254:2572-4；Hearn等，1981,J.Chromatogr.218:509-18)，随后通过与mDT反应以形成氨基甲酸酯键。该化学反应包括还原碳水化合物的端基末端以形成伯羟基，然后使伯羟基与CDI反应形成氨基甲酸酯中间体，然后偶联至mDT的氨基上。反应可能需要对糖上其他伯羟基进行任选的保护/去保护。
以下实施例旨在促进对本发明的进一步理解。
实施例1
肺炎链球菌荚膜多糖6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F的制备。
培养肺炎球菌的方法是本领域熟知的。参见，例如，Chase,1967,Methods ofImmunology and Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法是本领域熟知的。参见，例如，欧洲专利号EP0497524。肺炎球菌亚型的分离株可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得。该细菌被鉴定为在血琼脂上具有α-溶血作用的有包膜、非运动的、革兰氏阳性的、柳叶刀状(lancet-shaped)双球菌。可以使用特定的抗血清根据Quelling反应来区分亚型。参见，例如，美国专利号5,847,112。
代表存在的每种肺炎链球菌血清型的细胞库是从Merck Culture Collection(Rahway,NJ)的冷冻小瓶(vial)中获得的。将解冻的种子培养物转移至含有适合于肺炎链球菌的预灭菌生长培养基的种子发酵罐中。该培养物在具有温度和pH值控制的种子发酵罐中生长。将种子发酵罐的整个体积转移到包含预先灭菌的生长培养基的生产发酵罐中。生产发酵是该过程的最终细胞生长阶段。控制温度、pH和搅拌速率。
通过添加灭活剂终止发酵过程。灭活后，将溶液转移至灭活罐中，在其中将溶液保持在受控的温度和搅拌下。使用离心与过滤的组合除去细胞碎片。将溶液超滤和渗滤。然后，对溶液进行基于溶剂的分馏，以除去杂质并回收多糖。
实施例2
按照如下所示进行多糖尺寸减小和活化。
在室温下，将约6g纯化的肺炎球菌荚膜多糖(Ps)粉末溶解在注射用水(WFI)中，使其目标浓度约为4g/L。然后，将溶液进行0.45微米过滤以降低生物负荷。通过HPSEC UV-MALS-RI确定过滤的Ps溶液的Ps浓度。
对于血清型18C和19A以外的本文公开的所有血清型，将包含Ps的溶液稀释至约2.5g/L，然后使用GEA-Niro Soavi Panda 2K均质器均质化以降低Ps的分子量。针对血清型特异性值控制均质器压力和通过均质器的次数(表1)。在均质过程中，使用向均质器出口处的热交换器供应的冷却水控制温度。
Figure BDA0002750657400000231
使用酸水解代替均质，以降低血清型18C Ps的分子量。针对批次A和批次B，分别将过滤的血清型18C Ps溶液的温度增加至约96℃和90℃。然后用冰乙酸(17.4M)调节溶液，使其最终浓度达到0.2M，并且针对批次A和批次B分别保持约180分钟和160分钟。添加1.5M磷酸钾(pH 7.0)至终浓度0.46M，以通过增加溶液pH来终止酸水解，然后将溶液冷却至室温。
未对血清型19A进行0.45微米过滤和降低尺寸。由于其具有相对较低的初始尺寸，因而不需要降低尺寸。溶解后，将血清型19A进行0.22微米过滤，如下一段所述。
然后，在进行超滤1步骤之前，使用0.22微米过滤器对每种溶液进行过滤以降低生物负荷。使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将过滤的Ps浓缩至约10g/L，然后在室温下使用6倍渗滤体积的WFI进行渗滤，得到超滤1工艺中间体(UF1-FR)。血清型18C使用5kDa NMWCO膜代替10kDa NMWCO膜，通过保留酸水解产生的较低分子量Ps来提高Ps回收率。通过HPSEC UV-MALS-RI确定UF1-FR的Ps浓度。在活化Ps之前，将WFI添加到UF1-FR中，以达到约10g/L的Ps浓度。
然后，添加2M乙酸钠缓冲剂以控制活化反应步骤的pH。针对每种血清型，将Ps活化反应期间的乙酸钠浓度和pH以及温度控制为特定值(表2)。
通过基于每摩尔PnPs重复单元(RU)的高碘酸盐摩尔数向溶液中添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发高碘酸盐活化。在活化期间，邻位二醇在血清型特异性反应时间内氧化为反应性醛。该反应产生了活化产物(AP)工艺中间体。针对每种血清型，将高碘酸钠的加入量和反应时间控制为特定值(表2)。
Figure BDA0002750657400000251
Ps活化后，将溶液用6倍渗滤体积的10mM磷酸钾(pH 6.4)渗滤，随后在2-8℃下使用10kDa NMWCO切向流超滤膜使用另外6倍渗滤体积的WFI。血清型18C使用5kDa NMWCO膜代替10kDa NMWCO膜，通过保留酸水解产生的较低分子量Ps来提高Ps回收率。然后浓缩该溶液，产生超滤2工艺中间体(UF2-FR)。通过HPSEC UV-MALS-RI确定UF2-FR的Ps浓度。活化程度通过以下确定：用氨基硫脲(thiosemicarbazide)衍生UF2-FR样品，然后通过具有UV检测的HPSEC检测缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)。
实施例3
可以按照如下所示进行CRM197的制备。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜，用10倍渗滤体积的2mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)对通过如此前所述(参见国际专利申请公开号WO 2012/173876)在荧光假单胞菌中表达获得的冷冻、纯化的CRM197进行渗滤，并进行0.22微米过滤。在特定实施方式中，当旨在与血清型18C缀合时，将使用5mM磷酸钾pH 6.4(5mM磷酸钠，pH 7.0)。在含蔗糖的水中将渗滤的溶液稀释至终浓度在1.0至5.3％(w/v)之间，并冻干以生产最终水分含量为6％或更低的干燥的CRM197。下表3提供了与特定血清型的多糖缀合的CRM197的代表性蔗糖浓度。
实施例4
按照如下所示，冻干多糖(Ps)和CRM197(Pr)。
在冻干之前，按照如下所示稀释CRM197和Ps溶液。
在一些实施方式中，使用WFI，5mM磷酸钠，pH 6.4(对于血清型18C为pH 7.0)和在WFI中新鲜配制的30％(w/v)蔗糖溶液将CRM197溶液稀释至蛋白浓度为6.0mg/mL。使用WFI和在WFI中新鲜配制的30％w/v蔗糖溶液将UF2-FR Ps溶液稀释至Ps浓度为6.0mg/mL。
在一些实施方式中，使用WFI、2mM磷酸钠(pH 7.2)和在WFI中新鲜配制的50％(w/v)蔗糖溶液将CRM197溶液稀释至蛋白浓度为6.0mg/mL。使用WFI和在WFI中新鲜配制的50％(w/v)蔗糖溶液将UF2-FR Ps溶液稀释至Ps浓度为6.0mg/mL。
使用血清型特异性蔗糖和磷酸盐浓度(参见例如，表3)。使用Virtis Genesis冷冻干燥机将稀释的CRM197和UF2-FR溶液冻干。
Figure BDA0002750657400000271
实施例5
本实施例显示了如通过傅立叶变换红外光谱(FTIR)所测量的CRM197在DMSO中的重构时间影响二级结构。
使用慢速(八分钟)或快速重构(两分钟)在DMSO(来自Sigma-Aldrich的无水DMSO，27655-100mL)中重构已在6mg/mL，5％(w/v)蔗糖，1.25mM磷酸钠，pH 7.2中冻干的冻干CRM197至终浓度10mg/mL，然后混合以生产均质溶液。通过每30秒添加适当体积的DMSO进行重构直至到达时间点。使用带有50mm CaF2窗口的透射模式，在受控温度(25℃)下，用BioTools PROTA-3S采集FTIR光谱。可以以4cm-1的分辨率采集五十次扫描，取平均值，减去缓冲液并校正水蒸气。
使用快速添加(两分钟)在DMSO中重构冻干的CRM197显示出在1660cm-1处预计的游离羰基酰胺I峰，这表明CRM197在DMSO中完全展开(图1)。当使用慢速添加时间(八分钟)在DMSO中重构CRM197时，在酰胺I区域出现第二个峰(1626cm-1)。该第二个峰归因于形成分子间β-片层。
实施例6
该实施例表明，在中间重构时间(四分钟)重构CRM197并保持长达300分钟，导致分子间β-片层的比例随着保持时间的增加而增加。
在4分钟内在DMSO(无水DMSO可以来自Sigma-Aldrich，27655-100mL)中重构已在6mg/mL，5％(w/v)蔗糖，1.25mM磷酸钠，pH 7.2中冻干的冻干CRM197至终浓度10mg/mL。通过每30秒添加适当体积的DMSO进行重构直至到达时间点。在采集初始时间点(T0)之后，将样品保持在FTIR，并采集进一步的时间点(30、60、120、180、240、300分钟)。使用带有50mmCaF2窗口的透射模式，在受控温度(25℃)下，用BioTools PROTA-3S采集FTIR光谱。可以以4cm-1的分辨率采集五十次扫描，取平均值，减去缓冲液并校正水蒸气。
如存在分子间β-片层酰胺I峰所示(图2)，在中间时间(4分钟)在DMSO中重构CRM197导致蛋白聚集。增加保持时间(高达300分钟)导致分子间β-片层的量成比例增加，而游离羰基酰胺I峰的量减少(图2)。
实施例7
该实施例表明，分子间β-片层的形成是浓度依赖性的。
在两分钟内在DMSO(无水DMSO可以来自Sigma-Aldrich，27655-100mL)中重构已在6mg/mL，5％(w/v)蔗糖，1.25mM磷酸钠，pH 7.2中冻干的冻干CRM197至终浓度10、30或50mg/mL。通过每30秒添加适当体积的DMSO进行重构直至到达时间点。
使用带有50mm CaF2窗口的透射模式，在受控温度(25℃)下，用BioTools PROTA-3S采集FTIR光谱。可以以4cm-1的分辨率采集五十次扫描，取平均值，减去缓冲液并校正水蒸气。使用Malvern Zetasizer ZS在受控温度(25℃)下以1.996cP的粘度在制备的浓度下收集动态光散射(DLS)测量值。
当以10mg/mL快速重构CRM197(图3，两分钟)时，没有证据表明形成了分子间β-片层，证实了早期的观察结果(图1)。在更高浓度下(30mg/mL，50mg/mL)，即使在快速重构时间(两分钟)下，也会形成分子间β-片层。这支持了这样的假设，即在缓慢重构过程中存在的增加的CRM197浓度是形成分子间β-片层的原因之一。DLS数据也支持这种浓度假说，该数据表明与较低浓度(图4A)相比，较高浓度(图4B)重构的CRM197中较大颗粒的比例增加，这与蛋白聚集一致。
实施例8
用于重构CRM197的DMSO中水的浓度增加导致分子间β-片层的形成增加。
在两分钟内在DMSO(无水DMSO可以来自Sigma-Aldrich，27655-100mL)中重构已在6mg/mL，5％(w/v)蔗糖，1.25mM磷酸钠，pH 7.2中冻干的冻干CRM197至终浓度10mg/mL，所述DMSO为95％、97％、99％(v/v)的DMSO/水或无水DMSO。无水DMSO可以是Sigma-AldrichD2438-50mL。通过每30秒添加适当体积的DMSO进行重构直至到达时间点。使用带有50mmCaF2窗口的透射模式，在受控温度(25℃)下，用BioTools PROTA-3S采集FTIR光谱。可以以4cm-1的分辨率采集五十次扫描，取平均值，减去缓冲液并校正水蒸气。
当在无水DMSO中以10mg/mL快速重构CRM197时(图5)，没有证据表明形成了分子间β-片层，证实了早期的观察结果(图1，图3)。极少量的水(99％DMSO/水)显示出较小的分子间β-片层肩峰，其随着水的增加而增加(97％，95％DMSO/水)。这支持了下述假设，在重构过程中水量增加会导致分子间β-片层形成的量增加。
实施例9
降低冻干的CRM197中的水分含量不会降低对慢速重构的敏感性。
CRM197是以减少滤饼中存在的水分的方式冻干的(干燥循环更长，填充体积更低)(在含1％(w/v)蔗糖的1.25mM磷酸盐(pH7.2)中约6mg/mL)。在DMSO中(例如，来自Sigma-Aldrich的无水DMSO，D2438-50mL)，在两分钟或八分钟期内将冻干的CMR197重构至终浓度10mg/mL。通过每30秒添加适当体积的DMSO进行重构直至到达时间点。使用带有50mm CaF2窗口的透射模式，在受控温度(25℃)下，用BioTools PROTA-3S采集FTIR光谱。可以以4cm-1的分辨率采集五十次扫描，取平均值，减去缓冲液并校正水蒸气。
CRM197的DMSO重构中水的增加导致分子间β-片层形成比例的增加(图5)。以两种不同速率快速(两分钟)和慢速(八分钟)在无水DMSO中重构已经以降低水分含量的方式冻干的CRM197。降低冻干的CRM197中的水分含量不会在重构时间内降低CRM197对形成分子间β-片层的敏感性(图6)。
实施例11
在室温下使用等体积无水DMSO将冻干的Ps和CRM197(Pr)重新溶解，以制备Ps和Pr均质溶液。以2分钟的较快速率重新溶解CRM197。在一些实施方式中，将500mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)加标(spike)至DMSO重新溶解的蛋白溶液中，至终浓度为1.0mM磷酸钠。在DMSO中重新溶解后，如上文所述，将Ps和CRM197溶液合并，以达到血清型特异性最终Ps浓度和Ps:CRM197比率(表4)。
制备氰基硼氢化钠在WFI中的溶液，并将1.0meq的氰基硼氢化钠(每摩尔Ps重复单元1.0摩尔氰基硼氢化钠)添加到该溶液中。氰基硼氢化钠溶液(表5)的摩尔浓度基于缀合期间约0.5％溶液总水含量的目标值。使溶液在血清型特异性温度下反应持续血清型特异性的持续时间(表5)，生成缀合产物中间体(CP)。
制备硼氢化钠在WFI中的溶液，并将2.0meq的硼氢化钠(相对于Ps重复单元)添加到该溶液中。硼氢化钠溶液(表5)的摩尔浓度基于添加硼氢化物后约1.0％溶液总水含量的目标值。使溶液在室温下反应2-3小时，产生缀合物产物淬灭中间体(CPQ)。
Figure BDA0002750657400000311
然后，通过将溶液缓慢加入150mM氯化钠(，针对在一些实施方式中的缀合物，为150mM氯化钠加0.025％w/v聚山梨醇酯20)中，将缀合溶液稀释至20％或更低(v/v)无水DMSO。在稀释步骤期间，将溶液温度保持在低于15℃。约一小时后，将1.5M磷酸钾(pH 6.0)添加到溶液中，使得最终浓度为25mM磷酸钾。可以通过总Ps和CRM197的消耗，缀合物Ps与CRM197的比率和缀合物分子量来评估缀合性能。
将缀合溶液浓缩至约2.5g/L，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜，在2-8℃下使用10个渗滤体积的150mM氯化钠或含25mM磷酸钾的150mM氯化钠进行渗滤。这产生了超滤3工艺中间体(UF3-FR)。通过HPSEC UV-MALS-RI确定UF3-FR的Ps浓度。
对于在一些实施方式中的19F，将UF3-FR进行0.22微米过滤，并且随后在22℃下孵育约120小时。
然后，在超滤4步骤中处理UF3-FR溶液。在在一些实施方式中的超滤4步骤期间，将溶液浓缩至Ps浓度约2.5g/L，并使用300kDa NMWCO Biomax PES切向流超滤膜，在2-8℃下使用20倍渗滤体积的含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。血清型7F使用100kDa NMWCO膜进行超滤4步骤。对于血清型6A、6B和18C，将UF3-FR溶液浓缩至约3.5g/L，并使用300kDa NMWCO Biomax PES切向流超滤膜，在2-8℃下使用在150mM氯化钠中的10mML-组氨酸，0.03％(w/v)PS-20，pH 7.0进行渗滤。在一些实施方式中，将血清型7F、19A、19F和23F UF3-FR溶液浓缩至约2.0g/L，并使用300kDa NMWCO UltraCel再生纤维素切向流超滤膜，在2-8℃下使用在150mM氯化钠中的10mM L-组氨酸，0.015％(w/v)PS-20，pH 7.0进行渗滤。这产生了超滤4工艺中间体(UF4-FR)。通过HPSEC UV-MALS-RI确定UF4-FR的Ps浓度。
通过PVDF过滤器对UF4-FR进行0.22微米过滤。通过HPSEC UV-MALS-RI确定滤液的Ps浓度。如果滤液的Ps浓度大于1.0g/L，则使用另外的含10mM L组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)将滤液稀释至Ps浓度1.0g/L。这产生了单价批量缀合物中间体(MBC)。将MBC分配成等分试样，并在-60℃至-80℃下冷冻。
针对血清型6A、6B和18C，通过双膜PES过滤器，对UF4-FR进行0.5/0.2微米过滤。通过HPSEC UV-MALS-RI确定滤液的Ps浓度。如果滤液的Ps浓度大于1.0g/L，则使用另外的在150mM氯化钠中的10mM L组氨酸，0.03％w/v PS-20，pH 7.0将滤液稀释至Ps浓度1.0g/L。这产生了单价批量缀合物中间体(MBC)。将MBC分配成等分试样，并在-60℃至-80℃下冷冻。
针对血清型7F、19A、19F和23F，通过PVDF过滤器对UF4-FR进行0.22微米过滤。通过HPSEC UV-MALS-RI确定滤液的PS浓度。如果滤液的Ps浓度大于1.0g/L，则使用另外的在150mM氯化钠中的10mM L组氨酸，0.015％w/v PS-20，pH 7.0将滤液稀释至Ps浓度1.0g/L。这产生了单价批量缀合物中间体(MBC)。将MBC分配成等分试样，并在-60℃至-80℃下冷冻。
实施例12
当CRM197在无水DMSO中缓慢重构(八分钟)并且随后缀合至6B多糖时，缀合后存在的分子间β-片层。
如此前所讨论的在DMSO中快速(两分钟)或缓慢(八分钟)重构CRM197并随后缀合至6B多糖，如此前所述进行纯化，并且在(10mM组氨酸，150mM NaCl pH7)中渗滤至浓度为约1mg/mL。然后使用Amicon Ultra 11K MWCO过滤器浓缩样品，以使其能够进行FTIR测量。使用带有50mm CaF2窗口的透射模式，在受控温度(25℃)下，用BioTools PROTA-3S采集FTIR光谱。可以以4cm-1的分辨率采集五十次扫描，取平均值，减去缓冲液并校正水蒸气。随后使用Omic软件(ThermoFisher)对数据进行分析。
使用已在DMSO中缓慢重构的CRM197制备的CRM197-6B缀合物(图7)显示了分子间β-片层形成的证据，表明即使重构后仍存在CRM197聚集体。使用已快速重构的CRM197制备的CRM197-6B(图7)显示出预计的游离C＝O酰胺，并且未显示出β-片层形成。
实施例13
该实施例显示了用于在无水DMSO中使用还原胺化将来自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F或38的Ps与CRM197(Pr)缀合的方法。使用常见工艺流程将不同血清型多糖分别缀合至纯化的CRM197。
通过在两分钟内将无水DMSO快速添加到干燥的CRM197中，在无水DMSO中重构如此前所述制备的干燥的CRM197，并且分别将Ps单独在无水DMSO中重构，以制备Pr和Ps均质溶液。将Ps和Pr分别以总缀合反应体积的一半重构。因此，缀合过程中，DMSO重构后Ps的浓度是2x Ps浓度，根据表4计算得到其范围为2.2至7.6g/L。DMSO重构后，Pr浓度为2x(缀合过程中的Ps浓度/Ps:Pr比率)，其范围为1.5至5.7g/L。然后，将Pr均质溶液与Ps均质溶液合并。然后将氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)添加到混合物中，并且以血清性特异性持续时间进行缀合(1至48小时)，以达到目标缀合尺寸。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并且溶液在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将溶液稀释至150mM氯化钠，0.025％(w/v)聚山梨醇酯20。然后添加磷酸盐缓冲液以中和pH。将溶液浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜，在约4℃下使用150mM氯化钠进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将每种溶液浓缩，并使用300kDa NMWCO切向流超滤膜，在4℃下在含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)中进行渗滤。对截留溶液进行0.22微米过滤。
将血清型19F孵育约5天，使用300kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下在含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)中进行渗滤，并进行0.22微米过滤。
使用300kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下在含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)中对血清型18C进行渗滤，并进行0.22微米过滤。
使用另外的含10mM L组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)稀释溶液，将其分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例14
该实施例显示了具有不同表面活性剂和稳定剂的15价肺炎球菌缀合物疫苗的制剂。
将如上文所述制备的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物用于配制具有血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的15价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV15)。
如此前所讨论的，使用通过在无水DMSO中的还原胺化产生的肺炎球菌多糖-CRM197缀合物来制备制剂。基于溶液体积和批量多糖浓度计算为获得单个血清型的目标最终浓度所需的批量缀合物的体积。将15种缀合物与选自含聚山梨醇酯(PS)-20、PS-80或泊洛沙姆(P)188的氯化钠、L-组氨酸、pH 5.8缓冲剂的赋形剂组合在一起。
在此期间将无菌配制的物料轻柔混合，随后将其与批量磷酸铝佐剂(APA)混合，可以含有或不含丙二醇(PG)和聚乙二醇400(PEG400)。在各种处方中研究了两种浓度的缀合物和APA。一种含有8μg/mL血清型6B多糖，针对所有其他血清型含有4μg/mL多糖，和250μg/mL APA。另一种含有16μg/mL血清型6B多糖，针对所有其他血清型含有8μg/mL多糖，和500μg/mL APA。将配制的疫苗在2–8℃下保存。
APA是羟基磷酸铝的水性混悬液。APA是通过将氯化铝和磷酸钠以1:1的体积比混合以沉淀羟基磷酸铝而制备的。在混合过程之后，用高剪切混合器缩小物料的尺寸，以实现单分散的粒径分布。然后，使用生理盐水对产品进行渗滤，并进行蒸汽灭菌。
实施例15
在该实施例中，通过REV离散地冻干如上文所讨论的制备的6B多糖(Ps)和CRM197(Pr)，以形成干燥的饼。如本文所讨论的，在无水DMSO中重构干燥的饼并缀合。
目标Ps:Pr比率(w/w)为0.9至1.5，且缀合物的目标分子量(MW)为1500至3500kDa。目标游离Ps为15％或更低，且游离赖氨酸损失大于5摩尔/摩尔。结果如表5中所示。根据本发明制备的REV干燥的物质具有在目标范围内的缀合物MW、在目标范围内的Ps:Pr比率、在目标范围内的游离Ps和在目标范围内的游离赖氨酸。
Figure BDA0002750657400000361
表5中缀合物Mw、缀合物Mn、缀合物Ps:Pr的测定。
使用HPSEC/UV/MALS/RI测定确定缀合物的分子量和浓度分析。将缀合物样品进样，并通过高效体积排阻色谱(HPSEC)分离。使用串联的紫外(UV)、多角度光散射(MALS)和折射率(RI)检测器完成检测。使用消光系数由UV280计算蛋白浓度。使用dn/dc因子从RI信号(由蛋白和多糖两者贡献)反卷积多糖浓度，dn/dc因子是溶液折射率的变化以及溶质浓度的变化(以mL/g计)。样品的平均分子量通过Astra软件(Wyatt TechnologyCorporation,Santa Barbara,CA)使用整个样品峰上测得的浓度和光散射信息进行计算。
表5中赖氨酸损失的测定。
按照如下所示，以多糖和mDT之间共价连接的数量为指标确定缀合蛋白中的赖氨酸消耗量。
将Waters AccQ-Tag氨基酸分析(AAAaa)用于测量缀合物样品中缀合的程度。在Eldex工作站中使用气相酸水解法水解样品，以将mDT分解成其组成氨基酸。使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生化游离氨基酸。然后在C18柱上使用带有UV检测的UPLC分析衍生化的样品。使用赖氨酸以外的代表性氨基酸获得平均蛋白浓度。通过缀合物中赖氨酸的平均测量值与初始蛋白中预期的赖氨酸的量之差确定缀合过程中赖氨酸的消耗量(即，赖氨酸损失)。
表5中游离Ps的测定
通过使用脱氧胆酸盐(DOC)和盐酸先沉淀游离蛋白和缀合物测量游离多糖(未与CRM197缀合的多糖)。然后滤出沉淀物，并通过HPSEC/UV/MALS/RI分析滤液中游离多糖的浓度。根据通过HPSEC/UV/MALS/RI测量的总多糖的百分比计算游离多糖。
表5中游离Pr的测定
通过胶束电动色谱(MEKC)模式下的毛细管电泳分离缀合物样品中的游离多糖、多糖CRM197缀合物和游离CRM197。简言之，将样品与包含25mM硼酸盐、100mM SDS，pH 9.3的MEKC运行缓冲液混合，并在预处理的裸露熔融20石英毛细管中分离。在200nm处监测分离，并用CRM197标准曲线对游离CRM197进行定量。将游离蛋白结果报告为通过HPSEC/UV/MALS/RI程序确定的总蛋白含量百分比。
实施例16
在该实施例中，23F多糖(Ps)和CRM197(Pr)样品根据本发明分别(离散)制备和冻干或者合并和冻干。如本文所讨论的，随后在无水DMSO中重构冻干的样品并缀合。
目标Ps:Pr比率(w/w)为0.9至1.5，且缀合物的目标分子量(MW)为1500至3500kDa。结果如表6中所示，其中显示了针对分别冻干的样品Ps和Pr平均均处于预期目标，但样品B2除外，其比率为2.4。
Figure BDA0002750657400000381
实施例17
该实施例显示了将无水DMSO添加至冻干的CRM197(Pr)的时间对使用6A多糖(Ps)的缀合物尺寸的影响。如此前所讨论的，将无水DMSO快速(两分钟)和慢速(八分钟)添加至冻干的Pr中，混合，然后缀合至在无水DMSO中重构的活化多糖。
图9显示了使用尺寸增加的多糖从缀合反应产生的缀合物的尺寸。通常的关系是缀合反应使用的多糖越大(UF2尺寸)，由此得到的缀合物就越大。对于每种多糖尺寸，对慢速和快速将无水DMSO添加至冻干后的Pr进行了比较。该图表明，与快速添加无水DMSO相比，缓慢添加无水DMSO甚至可使相同尺寸的多糖产生甚至更大的缀合物。
实施例5
该实施例显示了用于生产多糖(Ps)和CRM197(Pr；CRM)冻干球的冻干机条件的开发。
如实施例3和4中所述制备CRM和来自血清型6A和23F的活化多糖的离散溶液，并且其具有如本实施例中的表中所示的Ps、CRM和蔗糖浓度。
将改良的Biomek FX移液机器人(Cryomek)用于将溶液的50μL等分试样分配到Cryomek平坦的冷冻表面上。可以使用铲机构(shoveling mechanism)将小珠分配到小的冷容器中，而不会引起任何破裂。在完成每个不同溶液的循环之后，将小珠转移至中间储存容器中，并保持在-70℃下，直至在冻干机中或通过微波真空干燥进行升华干燥。对于冻干机干燥，将小珠单层分配到干燥托盘中。设置机柜压力、搁板温度和循环时间。干燥小珠后，将冻干球储存在2-8℃下。(特定参数参见实施例5)
初步干燥循环(Lyo1)耗时18小时，如表7.1中所示。通过Karl Fisher滴定法确定的冻干球的残留水分含量，如表7.2中所示。
Figure BDA0002750657400000391
Figure BDA0002750657400000401
结果表明在冻干球中的水分含量很高。此外，冻干球非常脆弱且吸湿。通过增加多糖、蛋白和蔗糖浓度增加固体含量，如表8.2中所示。通过添加二次干燥循环和增加一次干燥时间，改进干燥循环(Lyo 2)，如表8.1中所示。
Figure BDA0002750657400000402
Figure BDA0002750657400000403
由于改进了干燥循环，因而Lyo2的残留水分含量显著低于Lyo1。即使在所有冰升华后，二次干燥也可以改善产品中仍存在的结合水分的去除。二次干燥需要比一次干燥(15℃)更高的温度(30℃)。
此时，冻干机的总干燥循环时间为45小时。改变一些参数，如压力和温度，以进一步缩短干燥循环时间(方法：Lyo 3)，如表9.1和9.2所示。
Figure BDA0002750657400000411
Figure BDA0002750657400000412
实施例6
该实施例显示了用于生产多糖(Ps)和CRM197(Pr；CRM)冻干球的辐射能真空(REV)脱水(微波真空干燥(MVD))条件的开发。
如实施例3和4中所述制备CRM和来自血清型6A和23F的活化多糖的溶液，并且其具有如表10.1和10.2中所示的Ps、CRM和蔗糖浓度。
将改良的Biomek FX移液机器人(Cryomek)用于将溶液的50μL等分试样分配到Cryomek平坦的冷冻表面上。可以使用铲机构(shoveling mechanism)将小珠分配到小的冷容器中，而不会引起任何破裂。在完成每个不同溶液的循环之后，将小珠转移至中间储存容器中，并保持在-70℃下，直至在冻干机中或通过微波真空干燥进行升华干燥。对于微波干燥，将小珠单层分配到容器中。设置功率、压力和循环时间。干燥小珠后，将冻干球储存在2-8℃下(特定参数参见实施例6)。
检测了两个不同MVD循环，以干燥小珠。对于这两个循环，压力均保持在50至60mTorr范围内。温度取决于所施加的功率多少，保持在25至30℃范围内。
Figure BDA0002750657400000421
Figure BDA0002750657400000422
MVD1循环耗时4小时30分钟，但其不足以将残留水分含量降至至多2％。MVD2循环耗费更长时间和更高功率，因此，其提供的残留水分含量显著降低。
尽管本文参照示出的实施方式描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于此。本领域普通技术人员和获得本文教导的人将认识到在其范围内的其他修改和实施方式。因此，本发明仅由本文所附的权利要求所限定。

Claims (20)

1.一种制备突变白喉毒素(mDT)在无水二甲基亚砜(DMSO)中的均质溶液的方法，所述方法包括：
(a)提供mDT的干燥的组合物；和
(b)通过在两分钟或更短的时间段内将所述无水DMSO添加至所述干燥的组合物并混合至少10秒在无水DMSO中重构所述干燥的组合物，以提供包含所述mDT的均质溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过升华干燥包含所述mDT的水溶液制备所述干燥的组合物，其中所述升华干燥选自冻干和辐射能真空(REV)脱水。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述升华干燥包括以饼或冻干球小珠形式冷冻所述水溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述升华干燥方法包括在选自以下的容器中进行批量干燥：金属托盘、塑料托盘、塑料袋和I型管瓶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过升华干燥包含mDT的水溶液制备所述干燥的组合物以生产所述干燥的组合物，其中所述水溶液还包含约0.5％(w/v)或更多蔗糖和缓冲剂，且所述升华干燥选自冻干和辐射能真空(REV)脱水。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的组氨酸、琥珀酸盐、MES、MOPS、HEPES或乙酸盐缓冲剂。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述干燥的组合物具有小于6％的水分含量。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在120分钟或更短时间内进行在步骤(b)中的所述混合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在所述重构后六小时或更短时间将包含所述mDT的所述均质溶液缀合至活化的多糖。
11.一种提供突变白喉毒素(mDT)在无水二甲基亚砜(DMSO)中的无可检测的β片层介导的聚集的均质溶液的方法，所述方法包括：
(a)提供mDT的干燥的组合物；和
(b)通过在两分钟或更短的时间段内将所述无水DMSO添加至所述干燥的组合物并混合在无水DMSO中重构所述干燥的组合物，以提供包含所述mDT的均质溶液，其中如通过傅里叶变换红外光谱或动态光散射所确定的，所述均质溶液不包含可检测的聚集。
12.根据权利要求11所述的方法，其中通过选自冻干和辐射能真空(REV)脱水的升华干燥方法制备所述干燥的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述升华干燥包括在所述升华干燥方法之前以饼或冻干球小珠形式冷冻所述mDT的水溶液。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述升华干燥方法是在选自以下的容器中进行批量干燥：金属托盘、塑料托盘、塑料袋和I型管瓶。
15.根据权利要求11所述的方法，其中通过升华干燥包含mDT的水溶液制备所述干燥的组合物以生产所述干燥的组合物，其中所述水溶液还包含约0.5％(w/v)或更多蔗糖和缓冲剂，且所述升华干燥选自冻干和辐射能真空(REV)脱水。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的组氨酸、琥珀酸盐、MES、MOPS、HEPES或乙酸盐缓冲剂。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述缓冲剂是pH范围为5.0-7.0的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述干燥的组合物具有小于6％的水分含量。
19.根据权利要求11所述的方法，其中在120分钟或更短时间内进行在步骤(b)中的所述混合。
20.根据权利要求11所述的方法，其中在所述重构后六小时或更短时间将包含所述mDT的所述均质溶液缀合至活化的多糖。
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