CN115851444B

CN115851444B - 一种可用于肺炎球菌保存的冻干保护剂

Info

Publication number: CN115851444B
Application number: CN202310185015.9A
Authority: CN
Inventors: 曹欣; 王研研; 汪辉; 林浩卿; 徐永学; 刘艳宾; 李大成; 陈淑霞; 陈晓莹; 蒋春红
Original assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Minhai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-01
Filing date: 2023-03-01
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2043-03-01
Also published as: CN115851444A

Abstract

本发明涉及微生物保存技术领域，尤其涉及一种可用于肺炎球菌保存的冻干保护剂。冻干保护剂中不含有动物源性物质；并且冻干保护剂组分包含6±0.5%w/v酵母浸粉、2±0.25%w/v海藻糖和0.5±0.1%w/v谷氨酸钠。本发明的无动物源性冻干保护剂可在冻干过程中有效的保护肺炎球菌的活性，菌种的复苏和发酵都比动物源性冻干保护剂效果好，且保护时效优于动物源性冻干保护剂。而且本发明的冻干保护剂耐热性好，菌种冻干后高温下长时间放置仍然不会失活，保存的肺炎球菌易于复溶，便于研究和生产使用。

Description

一种可用于肺炎球菌保存的冻干保护剂

技术领域

本发明涉及微生物保存技术领域，尤其涉及一种可用于肺炎球菌保存的冻干保护剂。

背景技术

肺炎球菌是一种革兰染色阳性球菌，多呈双排列或短链排列，毒株在体内形成荚膜，普通染色时荚膜不着色，表现为菌体周围透明环，无鞭毛，不形成芽胞。菌体衰老时，或由于自溶酶的产生将细菌裂解后，可呈现革兰染色阴性，可引起肺炎、脑膜炎和菌血症等多种疾病，因此预防和控制肺炎球菌性疾病对人类的健康和生命安全至关重要。

荚膜多糖是肺炎球菌重要的毒力因子，暴露于细菌表面，具有免疫原性，能够诱发宿主的免疫应答反应，因此预防用肺炎链球菌疫苗的生产大多使用肺炎链球菌荚膜多糖。为保证多糖疫苗生产批次的均一性和稳定性，合适的菌种保存方法显得至关重要。

现有的菌种保藏方法主要是采用真空冷冻干燥，即将含有水的物质先进行降温预冻成固体，再在真空和适度温度条件下，利用水升华的原理，将物质中的固态水直接升华成气态后抽真空除去，从而达到干燥的目的。活菌制剂在储存运输过程中通常需要进行冷冻干燥处理，从而尽可能的保留菌的活性，但在冷冻和干燥的过程中会造成部分菌体的损伤和死亡，因此通常需要加入冻干保护剂来尽可能维持微生物的活性，减少菌体的损伤和死亡。冻干保护剂能够调节菌体内外渗透压，防止活性物质结构水失去和结晶而导致生物活性物质损伤，从而在细胞的保存过程中以及细胞的复苏过程中保持细胞的活力。

现有技术中，CN111849781A公开了一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括浓度10%wt脱脂奶粉、5%wt蔗糖、2%wt甘油、1%wt山梨醇、0.5%wt谷氨酸钠、5%海藻糖、0.1%wt维生素C、1%wt甘露醇以及1.5%脱纤维羊血，该冻干保护剂能使菌体冻干后的存活率为84%；但是该冻干保护剂含有较大比例的动物源成分，即脱脂奶粉和脱纤维羊血，其缺点是：成本较高且容易混入动物源的病原体或致敏原，使疫苗等产品存在安全隐患。CN113293115A公开了一种肺炎链球菌无动物源冻干保护剂，包括2%的大豆胨，2%的海藻糖，6%的甘露醇和0.6%的甘油，该冻干保护剂公开的数据表明，该配方13种血清型的种子批在25±2℃放置32周的活菌数依然下降明显，且菌种冻干后高温下长时间放置可能失活。

因此，提供一种适用于肺炎球菌保存的无动物源性且耐热的冻干保护剂，成为本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明提供了一种肺炎球菌冻干保护剂，所述肺炎球菌冻干保护剂中不含有动物源性物质；并且所述肺炎球菌冻干保护剂组分包含6±0.5% w/v酵母浸粉、2±0.25% w/v海藻糖和0.5±0.1% w/v谷氨酸钠。

本发明通过大量复配实验后发现，在不采用动物源性物质的情况下，采用上述含量的大分子物质酵母浸粉和小分子物质海藻糖与谷氨酸钠复配形成的冻干保护剂，对肺炎球菌具有良好的保护作用，冻干后成型均一，易于复溶，菌种的存活率良好，经过传代培养后肺炎球菌基因序列不发生明显变异，具有极好的保护效果。而且本发明的冻干保护剂耐热性好，菌种冻干后高温下长时间放置仍然不会失活。

一些实施方案中，所述肺炎球菌冻干保护剂还包括溶剂，所述溶剂为注射用水。

一些实施方案中，所述肺炎球菌冻干保护剂的pH为7.00~7.40。

在上述pH环境下，更有利于冻干保护剂发挥较好的肺炎球菌保存效果。

进一步，本发明还提供了上述任一实施方案中肺炎球菌冻干保护剂的制备方法，包括：取酵母浸粉、海藻糖和谷氨酸钠溶于溶剂中，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.20±0.20，使用定容瓶定容，灭菌即得。

一些实施方案中，所述灭菌的条件为121℃，30min。

此外，本发明还提供了一种肺炎球菌冻干粉的制备方法，包括：将上述任一实施方案中的肺炎球菌冻干保护剂和肺炎球菌菌液混合后，制备成菌悬液，然后冷冻干燥。

优选地，所述冷冻干燥的程序包括：

预冻阶段1的温度为0℃~1℃，持续时间为60min~100min；预冻阶段2的温度为-50℃~-80℃，持续时间为240min~300min；升华阶段1的温度为-40℃~-45℃，持续时间为600min~720min，真空度为0mbar；升华阶段2的温度为-30℃~-35℃，持续时间为300min~360min，真空度为0mbar；解析干燥阶段1的温度为0℃~1℃，持续时间为120~300min，真空度为0.06mbar~0.10mbar；升华阶段2的温度为20℃~25℃，持续时间为600~780min，真空度为0.06mbar~0.10mbar。

采用本发明的冻干保护剂配合上述冷冻干燥程序时，能够更好地促进水分的升华，从而进一步提升本发明冻干保护剂的应用效果，对肺炎球菌起到更好的保护作用。

一些实施方案中，所述肺炎球菌为以下任一血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F。

一些实施方案中，所述肺炎球菌为以下任一菌号：CMCC：31404；CMCC：31427；CMCC：31441；CMCC：31448；CMCC：31457；CMCC：31476；CMCC：31490；CMCC：31510；CMCC：31532；CMCC：31540；CMCC：31547；CMCC：31218；CMCC：31572；CMCC：31586；CMCC：31608；CMCC：31638；CMCC：31663；CMCC：31688；CMCC：31709；CMCC：31693；CMCC：31727；CMCC：31244；CMCC：31760；CMCC：31847。

一些实施方案中，所述肺炎球菌冻干粉的制备方法还包括：将经冷冻干燥的菌种管进行熔封，置于-70℃下保存。

一些实施方案中，菌种管规格为8*130mm；冻干量0.2ml/支。

进一步，本发明还提供了一种肺炎球菌冻干粉，其由上述任一肺炎球菌冻干粉的制备方法制得。

此外，本发明还提供了上述任一实施方案中的肺炎球菌冻干保护剂、或上述任一实施方案中的肺炎球菌冻干粉在制备肺炎球菌疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的无动物源性冻干保护剂中各组分相互配合，可在冻干过程中有效的保护肺炎球菌的活性，菌种的复苏和发酵都比动物源性冻干保护剂效果好，且保护时效优于动物源性冻干保护剂。而且本发明的冻干保护剂耐热性好，菌种冻干后高温下长时间放置仍然不会失活。保存的肺炎球菌易于复溶，便于研究和生产使用，解决了目前肺炎球菌冻干保存后活菌率不高、不稳定等难题。

附图说明

图1是本发明实施例1的冻干保护剂的加速稳定性测试结果图。

图2是本发明实施例1-3和对比例1-5的冻干保护剂的外观试验图。

图3-图7是本发明实施例1的基因序列稳定性测试结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

下述实施例中所使用的肺炎球菌包括以下血清型，分别如表1所示。

表1 肺炎球菌血清型

实施例1

本实施例提供了一种冻干保护剂，制备方法如下：

称取6g酵母浸粉、2g海藻糖、0.5g谷氨酸钠溶于90mL注射用水中，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.20±0.20，使用定容瓶定容到100mL。然后在4h内进行灭菌，灭菌条件：121℃下灭菌30min，灭菌后待常温，放入2-8℃保存。

实施例2

本实施例提供了一种冻干保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：配方为5.5g酵母浸粉、1.75g海藻糖、0.4g谷氨酸钠。

实施例3

本实施例提供了一种冻干保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：配方为6.5g酵母浸粉、2.25g海藻糖、0.6g谷氨酸钠。

对比例1

本对比例提供了一种冻干保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：配方为6g酵母浸粉、2g海藻糖、1g谷氨酸钠。

对比例2

本对比例提供了一种冻干保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：配方为6g酵母浸粉、4g海藻糖、0.5g谷氨酸钠。

对比例3

本对比例提供了一种冻干保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：配方为6g酵母浸粉、0.5g海藻糖、0.5g谷氨酸钠。

对比例4

本对比例提供了一种冻干保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：配方为8g酵母浸粉、2g海藻糖、0.5g谷氨酸钠。

对比例5

本对比例提供了一种冻干保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：配方为4g酵母浸粉、2g海藻糖、0.5g谷氨酸钠。

试验例

采用上述制备的冻干保护剂保存表1中的肺炎球菌，对冻干保护剂的性能进行测试。

1、冻干存活率

将菌种置于固体培养基中培养，待培养生长至对数期时，进行传代培养，待培养生长至对数期时，取10ml冻干保护剂冲洗菌种并混合，制备成菌悬液，分装至菌种管中，每支装量为0.2ml，活菌数为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/支，放入冻干机中进行冻干，冻干程序如表2所示。

表2冻干过程参数

取每种血清型的菌种冻干粉各3支，用0.5ml生理盐水溶解后，置于固体培养基中培养复溶并传代培养，至对数期时，用10ml生理盐水冲洗后，做10倍梯度稀释，将适宜稀释后的菌液滴入至羊血固体培养皿中并涂布均匀，放入二氧化碳培养箱中36℃，10%二氧化碳浓度下培养12-24小时，长出单菌落后，进行计数，计算菌浓度（活菌数(CFU)＝平板菌落数之和/平板个数×10×稀释倍数)，计算存活率(冻干后活菌数÷冻干前活菌数)。

实施例1的测试结果如表3所示。

表3 菌种存活率

实施例2-3以及对比例的测试结果如表4所示。

表4 菌种存活率

2、加速稳定性

根据肺炎球菌荚膜多糖的合成机制的不同和其合成基因的同源性分析，将24株肺炎球菌分为5类，每一类中各选取一个血清型（3、4、9V、18C和20）进行稳定性实验。

取上述3、4、9V、18C和20五种血清型肺炎球菌冻干后的菌种冻干粉各15支，放置到37±1℃的恒温箱中放置一个月，按照上述菌种计数方法测得第0、7、14、21和28天的活菌数。

实施例1的测试结果如图1所示，可见在37℃下放置一个月，本发明的冻干保护剂对冻干后的肺炎球菌仍能起到保护作用，并且活菌数趋于在一个稳定范围值，即1.2×10⁹CFU/支内。

3、外观试验结果

对实施例和对比例中的冻干保护剂进行冻干试验，结果如图2所示，本发明的实施例1-3中的冻干保护剂外观成形良好，无坍塌，无蜂窝状，而对比例中的冻干保护剂固体形态均出现了不同程度的塌缩或溶干，成形率较差。以上结果表明，本发明的冻干保护剂在冻干过程中能够很好的对肺炎球菌进行有效保护。

4、传代稳定性

在菌种传代过程中，菌种的培养特性与遗传基因很有可能会因为冻干保护剂的组分与冻干条件的不同而发生变化，因此，用上述实施例的冻干保护剂对肺炎球菌进行传代培养，并对终末代次的菌种进行稳定性检定与基因测序。

（1）稳定性检定

以实施例1为例，分别对3、4、9V、18C和20型肺炎球菌菌种第15代菌种进行检定，以羊血冻干菌种为对照组。检定项目包括培养特性、染色镜检、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、荚膜肿胀试验，检定结果如表5。结果表明，实施例与对照组的菌种检定结果均合格，经测试其他实施例的检测结果也均合格，说明本发明的冻干保护剂对肺炎球菌菌种的复苏和传代无任何不良影响。

表5菌种检定结果

注：A为实施例1的冻干保护剂；B为羊血保护剂。

（2）基因序列稳定性

以实施例1为例，以羊血冻干菌种为对照组，对3、4、9V、18C、20型第15代肺炎球菌进行基因测序，并对靶位点基因序列进行对比，使用NCBI网站的BLAST进行基因序列比对获得比对点阵图，该点阵图显示了基于BLAST结果的相似区域。结果如图3~7所示，A批为实施例1的冻干保护菌种，B批为羊血冻干保护菌种，对比的相似度均为100%。由此可知，本发明的冻干保护剂对肺炎球菌的靶位点基因序列无影响。

5、生产适用性

（1）发酵多糖表达量

将3、4、9V、18C和20型肺炎球菌分别用本发明实施例1的冻干保护菌种（A批）与羊血冻干保护菌种（B批）复苏后，用相同的发酵培养基与发酵条件进行发酵，并对3、4、9V、18C和20型肺炎球菌发酵液进行多糖含量检测，并对A批与B批多糖的表达量进行计算，结果如表6所示，实施例1的冻干保护菌种（A批）复苏培养发酵的表达量高于对照组（B批）。

表6发酵多糖表达量的对比

（2）多糖检测项目

肺炎球菌荚膜多糖作为保护性抗原，安全性和有效性是疫苗产品最重要的两个基本属性，肺炎球菌多糖疫苗中蛋白杂质含量、核酸含量是影响安全性的重要因素之一，而特异糖或特异基团决定了疫苗的免疫原性，是保证疫苗有效性的前提条件。对3、4、9V、18C和20型肺炎球菌的A批与B批多糖原液进行检测，检测项目有蛋白质含量、核酸含量、分子大小及特异多糖。检测结果如表7，各检测项目指标均符合药典标准。

表7肺炎球菌多糖原液检测结果

结果表明，本发明的冻干保护剂不仅仅能够在冻干过程中发挥保护菌种活性的作用，也在菌种的复苏和扩增生产过程中，维持稳定着肺炎球菌的特异性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种肺炎球菌冻干保护剂，其特征在于，所述肺炎球菌冻干保护剂中不含有动物源性物质；并且所述肺炎球菌冻干保护剂组分为6±0.5% w/v酵母浸粉、2±0.25% w/v海藻糖和0.5±0.1% w/v谷氨酸钠，且溶剂为注射用水；所述肺炎球菌冻干保护剂的pH为7.00~7.40。

2.权利要求1所述肺炎球菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括：取酵母浸粉、海藻糖和谷氨酸钠溶于溶剂中，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.20±0.20，使用定容瓶定容，灭菌即得。

3.一种肺炎球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的肺炎球菌冻干保护剂和肺炎球菌菌液混合后，制备成菌悬液，然后冷冻干燥。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的程序包括：

预冻阶段1的温度为0℃~1℃，持续时间为60min~100min；预冻阶段2的温度为-50℃~-80℃，持续时间为240min~300min；升华阶段1的温度为-40℃~-45℃，持续时间为600min~720min，真空度为0mbar；升华阶段2的温度为-30℃~-35℃，持续时间为300min~360min，真空度为0mbar；解析干燥阶段1的温度为0℃~1℃，持续时间为120~300min，真空度为0.06mbar~0.10mbar；解析干燥阶段2的温度为20℃~25℃，持续时间为600~780min，真空度为0.06mbar~0.10mbar。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述肺炎球菌为以下任一血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述肺炎球菌为以下任一菌号：CMCC：31404；CMCC：31427；CMCC：31441；CMCC：31448；CMCC：31457；CMCC：31476；CMCC：31490；CMCC：31510；CMCC：31532；CMCC：31540；CMCC：31547；CMCC：31218；CMCC：31572；CMCC：31586；CMCC：31608；CMCC：31638；CMCC：31663；CMCC：31688；CMCC：31709；CMCC：31693；CMCC：31727；CMCC：31244；CMCC：31760；CMCC：31847。

7.一种肺炎球菌冻干粉，其特征在于，其由权利要求3~6中任一项所述的制备方法制得。

8.权利要求1所述的肺炎球菌冻干保护剂、或权利要求7所述的肺炎球菌冻干粉在制备肺炎球菌疫苗中的应用。