CN103881950A

CN103881950A - 一种酒酒球菌及其应用

Info

Publication number: CN103881950A
Application number: CN201410116031.3A
Authority: CN
Inventors: 袁辉
Original assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明涉及一种酒酒球菌菌株及其应用，属于生物工程技术领域，该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏名称：酒酒球菌（Oenococcusoeni）JQ88，保藏日期：2013年6月28日，保藏编号为：CGMCCNO.7800，地址：中国北京；本发明通过高密度发酵获得酒酒球菌菌体，然后将酒酒球菌菌体与保护剂混合均匀获得菌体浆液，将所述菌体浆液经过冷冻干燥获得冻干粉；本发明的菌株及其冻干粉可以应用在果酒或葡萄酒的二次发酵中的应用，还可以用在植物汁或动物乳的发酵法生产酸乳中。本发明的酒酒球菌菌株苹果酸-乳酸发酵能力强，相关β-D-糖苷酶活性高，该菌株或冻干粉应用于果酒、葡萄酒的二次发酵，可以赋予果酒、葡萄酒产品浓郁的果香、花香，改善其口味。

Description

一种酒酒球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体地说是涉及一种苹果酸-乳酸发酵能力强的酒酒球菌菌株及其在果酒酿造中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡萄酒以及各种果酒的酿造分为两大部分：首先是一次发酵，由酵母等将各种糖类转化为酒精；然后是二次发酵，由乳酸菌将果酒里大量的二元酸特别是苹果酸转化成为柔和的乳酸等一元酸。这种发酵被称为苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)，MLF对葡萄酒进行降酸，不仅效果明显，而且MLF还能增加葡萄酒的风味复杂性和微生物稳定性，赋予果酒细腻，柔和协调的口感，以及浓郁的花香果香等，从而大幅度提高酒质，所以越来越引起酿造业的重视，成为酿造高端葡萄酒和果酒的关键步骤之一。

能进行MLF的细菌是乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)的一些特殊的种，主要分属于酒球菌属(Oenococcus)、明串珠菌属(Leuconostocs)、乳杆菌属(lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus)。不同种的苹果酸-乳酸菌酿酒特性不同。Sanna等在经过修饰的MRS培养基中研究Oenococcus oeni ATCC39401的L-苹果酸-乳酸发酵，发现在300h时,该菌降解了80%的L-苹果酸；[Sanna K V,Simo V L.The use of malolactic Oenococcus oeni(ATCC39401)for deacidification of media containing glucose,malic acid and citric acid[J].Eur Food Res Technol,2000,211(6):438-442.]。

葡萄酒发达国家如法国、美国、意大利、南非以及葡萄牙等国都通过对苹果酸乳酸发酵细菌的分离，筛选出酿酒适应性和酿酒特性优良的菌株，并实现商业化，向生产中推广。MLF细菌引起酿造业关注的另一个重要原因是它们在酿造环境下不断分泌的各种糖苷酶活性，这些糖苷酶，可以水解许多来自果肉的芳香前体物质。果蔬等植物将95%以上的具有自己特色花香果香的烯萜类物质与各种单糖或二糖键合成无香味的糖苷类芳香前体物质，这些糖苷键主要是β-糖苷键型，而能够水解这些β-糖苷键的酶有β-葡萄糖苷酶，β-木糖苷酶，α-鼠李糖苷酶等，其中，以β-葡萄糖苷酶最为重要，这些酶赋予葡萄酒和果酒具有原料特色的花香果香等香型，这正是高端果酒所必需的特征之一。

商品化超浓缩冷冻干燥乳酸菌发酵剂的生产始于1963年，1988年丹麦汉森中心实验室成功研制了超浓缩乳酸菌发酵剂系列产品，并于1994年推向中国市场。国外酒类-冻干粉或冷冻制品已经商品化【王霞，姜忠军.苹果酸-乳酸发酵研究进展[J].中外葡萄与葡萄酒，2005（4）：60-62.】，并在葡萄酒生产中得到普遍应用，而国内在该领域的相关研究较少。法国，意大利，澳大利亚等国家均采用商品-冻干粉来进行葡萄酒的二次发酵提升品质，如法国LAFFORT公司生产的450PreAc干粉和丹麦CHR HANSEN公司生产的OENOS干粉等。而国内还没有同类产品，急需开发。因此，为提高我国葡萄酒和果酒的品质与生产技术水平，降低生产成本，本发明选育并制备价格低廉的优质活性酒类-菌剂。

目前的MLF型细菌的利用，主要是在葡萄汁酒精发酵后进行苹果酸-乳酸发酵，其他将它们与酿酒酵母一起发酵的大多数属于探索性报道，没有单独利用MLF细菌生产纯植物酸奶饮料的报道，也没有将MLF细菌与运动发酵单胞菌混合发酵植物汁生产新型果酒，或者利用MLF细菌为无酒精的果汁饮料脱苦增香等的文章、专利以及产品等报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种酒酒球菌菌株及由其制成的冻干粉，该酒酒球菌菌株苹果酸-乳酸发酵能力强，相关β-D-糖苷酶活性高。

本发明另一个目的是提供一种酒酒球菌及其冻干粉的应用，将该菌株或冻干粉应用于果酒、葡萄酒的二次发酵，以赋予果酒、葡萄酒产品浓郁的果香、花香，改善其口味，使其口味细腻柔和。

本发明还有一个目的是将本发明的酒酒球菌菌株及其冻干粉用于植物汁或动物乳的发酵法生产酸乳。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明的酒酒球菌菌株为从中国各地植物汁，植物发酵汁等样品中分离出的具有苹果酸-乳酸发酵能力的菌株，该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏名称：酒酒球菌（Oenococcus oeni）JQ88，保藏日期：2013年6月28日，保藏编号为：CGMCC NO.7800，地址：中国北京。

本发明的酒酒球菌菌株的菌落特征如下：

菌落形态：在MRS上好氧培养3-5天直径1mm，菌落呈乳白色，表面光滑不透明，边缘齐整，继续培养则可达2-3mm。

细胞形态：球型，喜欢两两成对，有时会3-4个成链，革兰氏染色阳性，衰老时会有阴性出现，在细胞生长的不同时期呈现球形和杆状。

生理生化特征：MRS固体培养基培养兼性厌氧，接触酶实验阴性，氧化酶和接触酶阴性，喜欢植物汁等营养和还原性、偏酸性环境，适宜培养温度25-28℃，10℃-33℃范围均可存活生长，具体生理学特性见表1。

本发明的酒酒球菌的16S rDNA测序结果见序列表SEQ ID NO.1。

表1本发明的酒酒球菌的生理学特性

特性	结果	特性	结果
				明胶液化	_	麦芽糖	+
硝酸盐	_	甘露醇	+
				吲哚	_	甘露糖	_
淀粉水解	_	鼠李糖	_
				阿拉伯糖	+	核糖	+
纤维二糖	_	山梨醇	_
				果糖	+	蔗糖	+
半乳糖	+	海藻糖	_
				葡萄糖	+	木糖	_
		棉籽糖	+

本发明所采用的培养基为本领域国内外技术人员熟知和自1970年文献广为报道的改良ATB和MRS培养基，具体如下：

MRS培养基配方为：酵母浸出粉（yeast extract）5g，蛋白胨（peptone）15g，乙酸5g，柠檬酸铁2g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，葡萄糖20g，Tween800.2ml，加自来水、蒸馏水或去离子水到总体积1000ml，用HCl或NaOH调节pH至4.8±0.2，如果是制作平板或斜面等，则将pH调节到5.5及以上，然后添加12g/L-20g/L的琼脂（根据琼脂强度）。

ATB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，葡萄糖10g，硫酸镁0.2g，盐酸半胱氨酸0.5g，加自来水、蒸馏水或去离子水到总体积1000ml，用HCl或NaOH调节pH至4.8±0.2；如果是制作平板，则将pH调节到5.5及以上，然后添加12g/L-20g/L的琼脂。

改良MRS培养基：MRS培养基＋10%杨梅汁或甘蔗汁或番茄汁等果蔬汁＋30mg/L放线菌酮＋30mg/L万古霉素；

具体分离方法为：从浙江、江苏、江西、福建等地区的杨梅枇杷汁，猕猴桃汁，柚汁，柑橘汁，梨汁，苹果汁等各类果汁及其添加或不添加SO₂的相关发酵液、酒脚、滤渣等里用无菌或消毒过的移液枪或吸管等取样1ml或1g，用含1g/L吐温80的无菌生理盐水适度稀释成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8等稀释度，超净台无菌吸取100μL均匀涂布于上述添加相应抗生素的改良MRS培养基平板，或ATB培养基平板，然后覆盖9mm±4mm厚的生理盐水琼脂层用以造成适度厌氧环境，该双层平板，放于25℃培养4-10天，将所长出的乳白色菌落，直径在1mm（培养6天内）-3mm（培养6天以上），穿刺挑出并接入含或不含（其中不含苹果酸的培养基用于保存菌种以及作为对照）8g/L DL-苹果酸的10ml上述MRS培养基或ATB培养基的大试管里液体发酵和10ml琼脂试管里进行穿刺培养，通过薄板层析技术和HPLC等验证苹果酸乳酸发酵能力。

薄板层析操作如下：硅胶G薄层平板，市购，高度0.3mm，或用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液加硅胶G灌制，110℃活化1h，展开剂（正丁醇：冰醋酸：蒸馏水按体积比80:10:10比例混合），显色剂（0.05%溴甲酚绿-乙醇溶液），上样量10μL，每上3μL，用电吹风吹干防止斑点扩散过大。

有机酸的HPLC测定方法：色谱柱:C18反相柱，流动相：2.5%NH₄H₂PO₄(pH2.5)；流速:0.5cm/min；检测波长：200nm：灵敏度：005AVFS。

β-D-糖苷酶活性测定：取样品100μL于试管，再分别取柠檬酸缓冲液（pH4.5的0.2mol·L^-1Na₂HPO₄和0.1mol·L^-1的柠檬酸为缓冲液）各900μL于试管，将50℃恒温水浴（同时水浴的还有5mmol·L^-1p-NPG溶液），各取1ml p-NPG溶液于各试管，准确反应10min，立即加入Na₂CO₃（1mol·L^-1）终止反应，在OD₄₁₀nm下测吸光值。

酶活计算：酶单位：每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力，定义为一个酶活单位。计算公式如下:U=C×N/10×0.1=C·N=0.369·OD·N。式中，U：酶活单位(μ·ml^-1)，10:反应时间，N：原酶液稀释倍数，0.1：取0.1ml酶液反应，C：对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C=0.369·OD₄₁₀nm·N。

SDS-PAGE电泳：

固定液：40%乙醇+10%乙酸+纯水（室温）；

脱色液：25%乙醇+8%乙酸+纯水（室温）；

考染液：0.02%考马斯亮蓝原液（原液配制—100mg考马斯亮蓝R-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%(w/v)磷酸）将原液用乙醇:乙酸:水=3:1:6的溶液稀释10倍，即可用于胶片染色。

30%聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺150g，甲叉双丙烯酰胺4g，去离子水500ml，加热溶解，滤纸过滤后，4℃冰箱保存于棕色瓶。

1.5mol/L Tris-base pH8.8：分离胶缓冲液：Tris碱90.75g，MilliQ水400ml，用1mol/L HCl调pH至8.8，加去离子水定容至500ml4℃冰箱保存。

1.0mol/L Tris-base pH6.8层积胶缓冲液：Tris-base12.11g，去离子水80ml，用1mol/L HCl调pH至6.8，加去离子水定容至100ml4℃冰箱保存。

10%SDS：SDS10g，去离子水100ml，室温保存。

10%过硫酸铵（Ap）：Ap0.1g，去离子水1ml溶解，4℃冰箱保存，一星期内使用。

10×电泳缓冲液（1×=25mM Tris，192mM glycine，0.1%SDS，pH8.3）：Tris碱30g，甘氨酸144g，SDS10g，去离子水1L，室温保存。2×上样缓冲液（2×Loading buffer）1.0M Tris-HCl pH6.8，1ml，甘油2ml，10%(w/v)SDS4ml，0.25%(w/v)溴酚蓝0.2ml，β-巯基乙醇1ml，去离子水定容至10ml。

Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶（ml）：水6.6，30%丙烯酰胺溶液8，1.5mol/L Tris(pH8.8)5，10%SDS0.2，10%过硫酸铵0.2，TEMED0.008。

Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶（ml）：水2.7，30%丙烯酰胺溶液0.67，1.0mol/L Tris(pH6.8)0.5，10%SDS0.04，10%过硫酸铵0.04，TEMED0.004，

电泳步骤：1、样品处理，取发酵液2ml于5ml的离心管中，4000r·min^-1离心10min，取50μl上清于2ml离心管中，加入等量的2×loading buffer；2、将离心管于沸水中煮沸5min，3、12000rpm高速离心10min，取上清转移到新管子中备用；4、搭建好蛋白质电泳的电路和玻璃板，灌胶，先灌分离胶，加保护液（0.1%SDS）静置凝聚，加保护液时，枪头应均匀扫过玻片上沿，切不可由一端注入；5、待分离胶凝固后，去除保护液，灌制浓缩胶，并插入梳齿，加少许浓缩胶，补平液面；6、电泳，拔下梳齿，在电泳槽中倒入1×电泳缓冲液，没过电极和梳齿孔，将样品液依次加入梳齿形胶孔中，每孔上样量10μl，接通电源，设为恒流10mA，待样品跑至分离胶界面后，调整电流为15mA。溴酚蓝指示剂到达胶底部或指定位置后，关闭电源，小心拆下胶片放入染色液染色30-60min，倒去染色液，再放入脱色液10ml，30-50rpm下脱色30min，换三次脱色液至背景蓝色较淡条带清晰即可，放入胶片灯下观察拍照。

单因次实验结果显示，0.4g·L^-1的硫酸镁浓度较适合高密度细胞生长。在单因次实验基础上，进行番茄粉（番茄粉是由番茄原汁25倍浓缩干燥而成）、葡萄糖、酵母膏、碳酸钙的4因素3水平正交试验,以确定本发明酒酒球菌高密度发酵的最佳培养条件。根据表2配方配制培养基（没具体说明的按ATB培养基中的使用量添加）。锥形瓶的装液量为300ml锥形瓶装50ml ATB液体培养基，每个实验做3个平行实验，接种量5%，在温度25℃，转速（200±5）r·min^-1下，摇床振荡培养3d。

表2本发明酒酒球菌高密度发酵的最佳培养条件正交实验表

由表2得到的最佳高密度发酵培养基配方为：番茄汁10g·L^-1，葡萄糖15g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，CaCO₃2.5g·L^-1,蛋白胨10g·L^-1，硫酸镁0.4g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，盐酸半胱氨酸0.5g·L^-1，该培养基以自来水、纯净水、蒸馏水或去离子为溶剂配制而成。

高密度发酵：采用上述高密度发酵优化后的培养基，7m³发酵罐，装液量80%，调节发酵液初始pH5.5，夹套和罐内两路进蒸汽，达到0.1MPa时，罐内保压20min，25℃±2℃发酵，夹套进水冷却保温，通气量0.1±0.02vvm，搅拌速度，180±30rpm，镜检计数，当pH低于pH4.5以下时，放罐。

菌体处理：放罐后的菌体经过三足式离心机，铺设离心袋和粗细食品级硅藻土比例9:1-5:5之间的滤层，1000rpm离心收集菌体，滤液再用高速旋转式离心机于10000rpm离心10min收集菌体，以提高菌体回收率，刮下菌体，与保护剂按比例混合。

真空冷冻干燥过程的细胞保护剂配方：真空冷冻干燥过程，细胞膜将受到较大伤害，谷氨酸钠，乳糖，海藻糖等被发现对细胞膜有较好的保护作用，为针对本菌优化出较好的保护剂配方，特作表3，L₁₆(4⁹)的正交优化设计实验。

表3复合保护剂正交实验配方表

结果表明：七种保护剂对菌体都有一定程度的保护效果。针对本菌的真空冷冻干燥的复合保护剂较优配方为：谷氨酸钠2g·L^-1，蔗糖6g·L^-1，甘油4g·L^-1，海藻糖4g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，该保护剂以纯净水、蒸馏水或去离子为溶剂配制而成。优化后的保护剂配方使用三次，冻干粉的活细胞密度为3.85×10¹¹cfu·ml^-1/0.33=1.67×10¹²cfu·g^-1。

存活率计算：3.85×10¹¹/(20×2.07×10¹⁰)≈93%，冻干后酒酒球菌存活率可高达93％，使酒球菌的长期储存有了可能，是菌种后期利用必不可少的一步。

真空冷冻干燥工艺：菌体浆液铺平在不锈钢方形框内，不要有凸起，和气泡，冷冻温度-50℃±5℃，真空度20±5Pa，加热温度30℃±3℃，直至所有板层温度显示30℃±3℃，通气，取料，抽真空锡箔纸包装。

冷冻干燥的工艺优化存活率检验:

冻干粉质量检验：①存活率检验：冻干粉加10倍质量无菌水混合复苏20min后经过10^-6—10^-9倍稀释，吸取100μL涂布在新鲜MRS平板上，生长良好；②耐受SO₂能力:冻干粉复苏后经过10^-3-10^-5倍稀释，涂布在含SO₂100ppm的MRS平板上，观察细胞平板上生长状况；③加急储存检验：将冻干粉保存在42℃15天，和4℃90天，测定细胞存活率。

本发明的有益效果是：本发明的酒酒球菌的发酵液细胞密度可达OD_600nm值=14，活菌计数为4.40×10¹¹cfu/ml数量级，高于国外大多数文献报道的水平。

附图说明

图1：薄层层析初筛野生酒球菌的苹果酸-乳酸发酵能力图谱。

图2：本发明酒酒球菌的1600倍镜检照片。

图3：本发明酒酒球菌在好氧发酵条件下的可溶性蛋白质表达图谱。

图4：本发明的酒酒球菌在不同果汁下厌氧发酵的胞外糖苷酶的SDS-PAGE图谱。

图5：本发明酒酒球菌在杨梅酒（10%酒精度）里的二次发酵薄层层析图谱。

图6：本发明的酒酒球菌用于甘蔗酒二次发酵的SDS-PAGE图谱。

图7：不同接种量下的本发明酒酒球菌的甘蔗酒二次发酵各参数变化趋势。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明从浙江各类果蔬汁、酒厂和泡菜等40余种来源中，经过富集培养和双抗生素-厌氧培养法等联合处理，采用深层静态培养，然后薄层层析技术和革兰氏染色镜检等联合筛选，获得100余种酒酒球菌，薄层层析检测苹果酸-乳酸发酵能力的筛选结果如图1所示，图1中泳道1，8g/L的乳酸，泳道2，8g/L的DL-苹果酸，泳道3-9，复筛的酒酒球菌，发酵液中添加了8g/L的DL-苹果酸，25℃发酵4天。从图1可以看出泳道3-9等对应的酒酒球菌均具有降解苹果酸的能力以及产生乳酸的能力，本实施例中因为是细胞发酵液未离心上样，因此底部有些酸性大分子斑点。

通过摇瓶复筛，根据高密度发酵能力，苹果酸降解速度和乳酸积累速度以及细胞的β-葡萄糖苷酶活性等，本发明在100余种乳酸菌中筛选出本发明的酒酒球菌菌株，该菌株具有很强的苹果酸-乳酸发酵能力，试管旋转培养下苹果酸降解速度0.2g/L/h，β-葡萄糖苷酶活性2.399U/ml（活细胞密度9.367×10⁹cfu/ml，文献报道的同类苹果酸乳酸发酵细菌的β-葡萄糖苷酶活性一般低于0.3U/ml，这也许是本菌剂促进的二次发酵酿造物香味突出的原因之一），单层/双层MRS/ATB平板生长周期3-5天，MRS/ATB摇瓶发酵周期2-3天；其菌落白色，兼性厌氧，在MRS/ATB穿刺培养中1-3天长出，平板或斜面培养也可以长出，菌落乳白色，直径1mm左右，继续培养直径可达2-3mm，光滑，无皱褶，耐10%酒精度和pH1.8以上的酸性环境，喜欢各种果汁、果酒等植物性液体，生长温度范围10-37℃。本发明筛选获得的酒酒球菌经过革兰氏染色后的1600倍生物显微镜的油镜镜检照片如图2所示。

本发明的酒酒球菌的高密度细胞发酵摇瓶优化结果：由表2得到的较优高密度发酵培养基配方为：番茄粉10g·L^-1，葡萄糖15g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，CaCO₃2.5g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，硫酸镁0.4g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，盐酸半胱氨酸0.5g·L^-1，该培养基以纯净水、蒸馏水或去离子水等为溶剂配制而成。用该配方摇瓶发酵本发明酒酒球菌三批，平均细胞密度达到了8.98×10⁹cfu·ml^-1。

采用该配方在的7m³发酵罐深层通风机械搅拌，25℃±1℃发酵2d，活细胞密度达到1.55×10¹⁰cfu·ml^-1，罐内活细胞密度的提高，可能是因为罐内环境更加温和，溶氧，pH更加稳定等原因。

实验室规模0.5㎡的真空冷冻干燥工艺的保护剂优化结果表明：七种保护剂对菌体都有一定程度的保护效果。针对本菌的真空冷冻干燥的复合保护剂较优配方为：谷氨酸钠2g·L^-1，蔗糖6g·L^-1，甘油4g·L^-1，海藻糖4g·L^-1，酵母膏2g·L^-1，该保护剂以纯净水、蒸馏水或去离子为溶剂配制而成。优化后的保护剂配方使用三次，冻干粉的活细胞密度为5.48×10¹³cfu·g^-1。这里冻干粉的活细胞密度比发酵液高，其中一个主要原因是发酵液经过离心浓缩后才去加保护剂冷冻干燥。

由于实验室规模的真空冷冻干燥是在5ml棕色安剖瓶里进行的，存活率计算就依据复水到5ml后的安瓿瓶的总活菌数与冷冻干燥前该瓶总活菌数的比值：经检测，在该保护剂作用下，真空冻干后酒酒球菌的存活率≥93％，含水量低于3%，文献报道一般在90%以下，国际同类苹果酸乳酸发酵商品标示的存活率在70%-90%之间。本发明的真空冷冻干燥制剂存活率高还可能与细胞密度高有关。本保护剂将使该菌的长期储存有了可能，是菌种后期在生产应用必不可少的一步。

中试7吨发酵和8㎡真空冷冻干燥获得的冻干粉质量检验结果：①存活率检验：冻干粉的苹果酸-乳酸发酵细菌活菌浓度不低于2.00×10¹²cfu/g，细胞存活率不低于90%；②耐受SO₂能力:真空冻干粉耐受100ppm SO₂并生长良好，耐SO₂的苹果酸-乳酸发酵细菌的活细胞密度不低于10¹⁰cfu/g，这个特性赋予本发明的酒酒球菌能适应多种级别的SO₂处理后的发酵果酒和葡萄酒，而许多进口同类苹果酸-乳酸发酵菌剂只耐受30-60ppm的SO₂；③加急储存检验：将本冻干粉保存在40℃环境下15天，细胞存活率不低于82%，储存在4℃90天，细胞存活率不低于90%；④启动二次发酵的能力：将新鲜的冻干粉按照1g/100L葡萄酒原酒的添加量加入，加入刚酒精发酵结束降温到24℃，SO₂浓度50ppm以上，添加8g/L的L-苹果酸，搅拌均匀后静置室温存放，处理72h后，苹果酸在96h的降解率不低于90%。

本发明的酒酒球菌在不同果汁下厌氧发酵的胞外糖苷酶的SDS-PAGE图谱如图3所示，其中泳道M系中分子量蛋白质标准品，对应的分子量分别为98KD，66.2KD，45KD，31KD，20KD，14.4KD，泳道1-9代表酒酒球菌在MRS培养基里分别添加天台杨梅、塘栖枇杷、常山猕猴桃、桐庐苹果、温州柚子、衢州椪柑、仙居杨梅、苍南甘蔗和桐庐雪梨等发酵7天后的发酵液，12000rpm离心20min，取上清15μL上样。

对于本发明酒酒球菌来说，其各种糖苷酶多为胞外蛋白或细胞壁连接的蛋白。从图4可以清晰地看见，泳道1和2在100.0KD附近有一条蛋白质表达条带，对应着β-D-鼠李糖苷酶（108KD）；在泳道1的26KD附近有一条蛋白质表达条带，对应着α-L-阿拉伯呋喃糖苷（arabinofuranosidase，MW25.6KD），这与测得的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性相吻合；泳道7和2在56KD附近有一条非常清晰的条带,这对应着两种不同基因编码的β-D-吡喃葡萄糖苷酶，与文献报道一致；泳道2在50KD附近有还一条不太清晰的条带,这对应着β-D-阿拉伯吡喃糖苷酶（MW50KD），泳道2在62KD附近有一条蛋白质表达条带，与α-L-鼠李糖苷酶分子量59.6KD基本符合，泳道2在70KD附近有一条条带,这对应着β-1,4-木糖苷酶（MW70KD），与测定出的木糖吡喃糖苷酶酶活相吻合；泳道1-9对应的JQ88的各种糖苷酶的比活性分别为：β-D-葡萄糖苷酶＞1×10³U/mg，β-D-木糖吡喃糖苷酶＞1×10²U/mg，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶＞1×10²U/mg，这些比活性均高于目前绝大多数的进口冷冻干燥制剂，文献报道的最高的是2011年的β-葡萄糖苷酶的比活性0.134U/mg。

本发明的酒酒球菌可用于处理某些酿造产物，如果由于原材料特征、发酵工艺控制不力或者用户不满意等原因，花香果香不足，或本身原材料的风味未体现出来，而必须进行增香提香的话，可以接种本发明涉及的酒酒球菌，利用它所分泌的胞外糖苷酶活性分解烯萜等香味物质与葡萄糖、阿拉伯糖等糖类之间的糖苷键，释放香味等风味物质，改善产品品质，具体接种量，种龄以及环境控制等需要根据各原材料和用户要求实际情况优化。

本实施例中以含酒精10%的杨梅酒为实验对象，添加不同剂量的本发明涉及的菌液，搅匀，室温（10℃-23℃）启动二次发酵，试验结果如图5所示，图5反映了本发明的酒酒球菌在杨梅酒（10%酒精度）里的二次发酵薄层层析图谱，泳道0-5的酒酒球菌的接种量（体积比体积，液体MRS培养基试管旋转培养的种子，细胞密度1.0×10⁹cfu/ml）依次为0%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，由图5可知，随着杨梅酒里的乳酸菌接种量加大，杨梅酒原有的两种有机酸（疑似某二元酸）都被代谢掉，转化为乳酸和其它有机酸，说明本发明的酒酒球菌对杨梅酒的有机酸含量具有重要影响，同时接种后二次发酵7天总酸平均下降了10.5%，口感细腻，杨梅香型突出。

发明人采用市购广东甘蔗汁（总干14%，日本AITO电子折光仪测定）为原料，设计一个正交实验L₁₆(4⁵)，见表4

表4正交试验各因素对总酸的影响直观分析

正交实验的结果发现，对总酸影响度最大分别是酒酒球菌的接种量>碳酸钙>运动发酵单胞菌（ZM）接种量>总干>酵母粉，挥发酸测定显示，酒酒球菌可以降解1.5-2.9g/L左右的挥发酸，这对以后避免商品发酵型酸乳和二次发酵产物散发出刺鼻的挥发酸具有重要的意义。对某些酿造产物，如果由于杂菌污染、发酵控制不力或用户不满意等原因，产品中挥发酸含量过高，而必须降低的话，可以接种本发明涉及的酒酒球菌处理挥发酸。

正交实验的结果发现，对残余还原糖影响最大的是碳酸钙>接种量>总干>酵母粉>运动发酵单胞菌接种量；2%接种量降糖效果显著，与对照不添加相比，可以多降低2.55g/L的还原糖，而残余还原糖含量越低，对人体健康特别是糖尿病人的健康越有利，对于产品的微生物防腐性能越有利，因此本发明酒酒球菌可以提高产品稳定性和健康性。对于某些酿造产物，如果由于菌种活力不足或用户要求等原因，残余还原糖含量过高，而必须降低的话，可以接种本发明涉及的酒酒球菌进行降糖。

正交实验的结果发现，对发酵酒精度影响最大的是：酒酒球菌接种量>总干>运动发酵单胞菌接种量>碳酸钙=酵母粉；酒酒球菌接种显著降低了总发酵液的代谢方向，酒精合成明显减少。对于某些酿造产物，如果需要低醇含量例如要求酒精含量在6.0%以下，或其他原因而必须降低酒精浓度的话，可以通过接种本发明酒酒球菌进行降酒精，实验数据显示，可以降低3.0%左右的酒精度。但是本发明所涉及的酒酒球菌菌株只是抑制酒精的合成，而不是消耗酒精，因此适合多种环境下的酿造要求。

正交实验的结果发现，对发酵液残余总干影响最大的是酒酒球菌接种量>总干>运动发酵单胞菌接种量>酵母粉>碳酸钙；酒酒球菌的繁殖需要利用残余葡萄糖等糖类，其分泌的胞外糖苷酶等又帮助降解具有糖苷键的化合物，这是酒酒球菌对总干有影响的原因，总干和残余还原糖的浓度都下降，加上适量的乳酸积累，有利于产品的保质期和上柜期延长，同时乳酸发酵带来的乳酪香味可能赋予发酵产物高端产品才有的风味。所以，可以在发酵时适当接种本发明涉及的酒酒球菌，调控产品的质量。

本发明利用市购甘蔗汁采用运动发酵单胞菌发酵5天，酒精度7%然后加入酒酒球菌不同接种量，进行SDS-PAGE电泳结果如图6所示，图谱如下：与对照（不添加相比），不同酒酒球菌接种量的二次发酵液均在56KD，100.0KD有增厚的表达条带，这是酒酒球菌的相应糖苷酶在细胞可溶性蛋白中存在，接种量对糖苷酶占总细胞可溶性蛋白的表达量没有显著影响，接种量3%达到峰值。这种酒酒球菌与运动发酵单胞菌共同发酵的甘蔗饮料具有一种独特的香味，类似龙舌兰，即使是发酵仅仅7天的新产品，口感柔和细腻，无明显单纯酒精发酵的新鲜产品的那种刺辣感，这很可能归因于酒酒球菌细胞活动的结果，这种发现提供给酿造业的创新机遇就是将酒酒球菌与产酒精菌种共同发酵，酿造新型新口味的产品，实现创新。

本发明发现，酒酒球菌除了与运动发酵单胞菌混合发酵外，与酿酒酵母等进行混合菌发酵，也能显著降低残余还原糖的含量、抑制总干的降低，并且降低挥发酸的含量到产品无令人讨厌的刺激性酸味的阈值内，这样可以大大增加产品的微生物稳定性，而不降低产品的风味和醇厚性，这也说明所筛选的酒酒球菌确实可以改善二次发酵的质量和产品风味。

发明人还对不同酒酒球菌接种量下的甘蔗酒二次发酵情况进行了研究，如图7所示，接种量（v/v）：泳道1，0%；2，1.0%；3，2.0%；4，3.0%；5，4.0%；6，5.0%；7，6.0%；8，7.0%；9，8.0%；10，9.0%；实验甘蔗汁的酒精度为6.50%，酒酒球菌的种子液活细胞密度2.5×10⁹cfu/ml，二次发酵时间7d，结果表明酒酒球菌接种量越大，残余还原糖含量越低，而总干虽呈下降趋势，但是减少较少，意味着酒酒球菌在可以提高微生物稳定性的同时，对果酒的总风味物质影响较小，不会降低该酒饮料的醇厚度等，接种量5%时，总酸增加13.8%，pH下降了0.04，但是口感更加柔和，优雅。

本发明酒酒球菌冻干粉的应用：

1、处理病酒的效果：

2013年，某酒厂发酵型生产的10°-12°酒精度的杨梅酒由于缺乏降酸技术，采用化学渗透的技术处理酒精发酵后的原酒，酸度降低了，但是带来较为严重的咸味，以及苦味涩味，接入本菌10ppm（g/100L），25℃，处理15天，酒体明显增香，涩味苦味降低，咸味减淡，整体口感好多了。分析原因：由于本酒酒球菌的活动，其所产生的β-葡萄糖苷酶等酶分解了酒体里的单宁等涩味物质，柚皮苷等苦味物质，降低了苦味和涩味，而形成的乳酸等中和了其中由于渗透降酸法带来的盐离子，形成了乳酸盐降低了咸味，同时β-葡萄糖苷酶从杨梅酒中水解β-糖苷键，释放出杨梅烯等杨梅特有的香味分子，赋予该酒花香果香，增加了食欲，从而整体上改善了病酒的品质。

2、二次发酵处理苹果醋的效果：

烟台某苹果醋企业，在苹果汁的酒精发酵结束后，将醋酸菌（该企业自备）与10ppm（g/100L）的本冷冻干燥菌制剂共同发酵，生产苹果醋，30℃，15天，产品的苹果香型突出，口感更柔和细腻。

3、发酵生产酸笋

龙泉某笋制品企业，提供了新鲜的水煮笋产品，一款是白笋片，一种是玉笋片，开袋品尝，寡淡无味，无法激起食欲，总体打分10-15分。将该笋片按100g/300ml酸奶瓶子分装，超净台里分别单独添加（%，质量分数）0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0不等浓度的葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖等，统一再加入500ppm的酒酒球菌冻干粉制剂和10g/L的NaCl，混合均匀，25℃恒温培养，48h后，添加量5.0%蔗糖的白笋片品尝出有适当的酸度，总体风味打分65分，其余添加了葡萄糖，麦芽糖和乳糖等的风味较差或寡淡，显示不适合作为酸笋制造的添加剂，5天后，添加了5-7%蔗糖的酸笋酸甜可口，味道全部浸入笋片，风味打分90分。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体。

Claims

1.一种酒酒球菌，其特征在于：该酒酒球菌的保藏名称为：酒酒球菌（Oenococcus oeni）JQ88，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC NO.7800。

2.一种权利要求1所述的酒酒球菌的冻干粉，其特征在于：所述冻干粉的制备方法如下：通过高密度发酵获得酒酒球菌菌体，然后将酒酒球菌菌体与保护剂混合均匀获得菌体浆液，将所述菌体浆液经过冷冻干燥获得冻干粉。

3.根据权利要求2所述的酒酒球菌的冻干粉，其特征在于：所述保护剂的组成如下：谷氨酸钠 2g∙L^-1，蔗糖6g∙L^-1，甘油 4g∙L^-1，海藻糖4g∙L^-1，酵母膏2g∙L^-1，该保护剂以纯净水、蒸馏水或去离子为溶剂配制而成。

4.根据权利要求2或3所述的酒酒球菌的冻干粉，其特征在于：所述高密度发酵的培养基组成为：番茄粉10g•L^-1，葡萄糖15g•L^-1，酵母膏5g•L^-1，CaCO₃ 2.5g•L^-1，蛋白胨10g•L^-1，硫酸镁0.4g•L^-1，硫酸锰0.05g•L^-1，盐酸半胱氨酸0.5g•L^-1，该培养基以纯净水、蒸馏水或去离子为溶剂配制而成，培养基初始pH值为5.5，发酵温度25±2℃，当pH值低于4.5时放罐。

5.根据权利要求2或3所述的酒酒球菌的冻干粉，其特征在于：所述冷冻干燥的冷冻温度为-50℃±5℃，真空度20±10Pa，加热温度30℃±3℃，直至所有板层温度显示30℃。

6.一种权利要求1所述的酒酒球菌的应用，其特征在于：所述酒酒球菌在果酒或葡萄酒的二次发酵中的应用。

7.一种权利要求2或3所述的酒酒球菌冻干粉的应用，其特征在于：所述酒酒球菌冻干粉在果酒或葡萄酒的二次发酵中的应用。

8.一种权利要求1所述的酒酒球菌的应用，其特征在于：所述酒酒球菌在植物汁或动物乳的发酵法生产酸乳中的应用。

9.根据权利要求8所述的酒酒球菌的应用，其特征在于：所述酒酒球菌与运动发酵单胞菌或酿酒酵母混合发酵在植物汁或动物乳的发酵法生产酸乳中的应用。

10.一种权利要求2或3所述的酒酒球菌冻干粉，其特征在于：所述酒酒球菌冻干粉在植物汁或动物乳的发酵法生产酸乳中的应用。