CN104988125B - 高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用 - Google Patents

高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高耐受性β‑葡萄糖苷酶及其应用，所述β‑葡萄糖苷酶耐65‑100℃高温，耐4%氯化钠，耐3%醋酸，耐11%酒精，该β‑葡萄糖苷酶由保藏编号为CGMCC No.7799、保藏名称为曲霉（Aspergillus sp.）BG30的棘孢曲霉菌株发酵获得，其制备方法按如下步骤进行：（1）将曲霉（Aspergillus sp.）BG30接入斜面培养基进行增殖培养，用无菌生理盐水洗下斜面培养基上的孢子；（2）将孢子液接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β‑葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过盐析、透析、DEAE‑阴离子交换柱层析、脱盐和冷冻干燥纯化获得β‑葡萄糖苷酶。本发明的高耐受性β‑葡萄糖苷酶耐65‑100℃高温，耐4%氯化钠，耐3%醋酸和11%酒精，具有较强的增香功能及转糖苷酶活性，用作酶法合成烷基糖苷等。

Description

高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC 3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，这种酶存在于许多植物体，还存在于一些酵母、霉菌、木霉菌属及细菌甚至是昆虫体内。β-葡萄糖苷酶可以将水果、蔬菜、茶叶中的风味前体物质β-糖苷水解为具有浓郁天然风味的香气物质
β-葡萄糖苷酶的可运用领域广泛：可以用在果汁行业用于增香脱苦，很多果汁中含有很多风味前体物质——β-糖苷，只要通过一些酶的作用就能使这些糖苷配基挥发释放，起到增香的作用，在众多的研究中发现，棘孢曲霉产的葡萄糖苷酶对苹果汁、柠檬汁、茶汁的增香效果良好；另外在果酒中的增香目前也是研究的热点，对于脱苦的原理和增香类似，例如在青梅汁中，葡萄糖苷酶可以将其中的苦杏仁苷分解为苯甲醛及氢氰酸和两分子的葡萄糖，这就使青梅的苦味大大减少；葡萄糖苷酶的脱苦还可以用在柑橘、橄榄等具有一定苦味的水果中。
另外，还可以用于一些糖苷类前体的分解来生产分解后产物，例如低聚龙胆糖的生产、大豆异黄酮的生产，这两种产物的前体都是以结合型的糖苷形式存在。除了以上这些领域，β-葡萄糖苷酶的应用领域还很宽泛，比如制造生物酒精，通过基因技术来达到防治病虫害的目的，以及一些天然染料的生产，动物饲料的生产甚至是医药领域。
目前，国内外对于β-葡萄糖苷酶的研究不少，但现有技术中产β-葡萄糖苷酶的棘孢曲霉菌株胞外β-葡萄糖苷酶活性不高，所获得的β-葡萄糖苷酶的耐受性不佳，如不耐高温、高酒精度、高盐和高醋酸环境，导致其应用领域受限，本申请的发明人获得一株具有较高胞外β-葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株，发酵获得的β-葡萄糖苷酶能耐高温、耐高酒精度、耐高盐和高醋酸环境，应用领域广泛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由具有较高胞外β-葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株发酵获得的β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶能耐高温、耐高酒精度、耐高盐和高醋酸环境。
本发明另一个目的是提供该棘孢曲霉菌株发酵产生的β-葡萄糖苷酶的若干应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
高耐受性β-葡萄糖苷酶，所述β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4～6％的氯化钠，耐质量分数3％的醋酸，耐体积分数11％以上的酒精，该β-葡萄糖苷酶由保藏编号为CGMCC No.7799、保藏名称为曲霉(Aspergillus sp.)BG30的棘孢曲霉菌株发酵获得，其制备方法按如下步骤进行：
(1)将曲霉(Aspergillus sp.)BG30接入斜面培养基进行增殖培养，用无菌生理盐水洗下斜面培养基上的孢子；
(2)将孢子液接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过盐析、透析、DEAE-阴离子交换柱层析、脱盐和冷冻干燥纯化获得β-葡萄糖苷酶。
曲霉(Aspergillus sp.)BG30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.7799，保藏日期2013年6月28日。
曲霉(Aspergillus sp.)BG30的菌落形态特征：在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径60-65mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头紫褐色，初期球形，后期开裂，菌落背面浅褐色。分生孢子梗大，宽8.5-11.0μm，褐色，壁光滑，顶囊球形，直径33-42μm，全部表面可有；产孢结构单层，瓶梗6-10*μm，分生孢子椭圆形，少数球形或近球形，浅到褐色，具明显小刺，2.9-4.7*2.5-4.0μm，未见有性孢子。
培养条件影响曲霉(Aspergillus sp.)BG30的繁殖，进而影响其生产β-葡萄糖苷酶的能力，步骤(1)中增殖培养的条件为温度28～30℃，培养时间96～120h；步骤(2)中发酵培养的条件为温度28～30℃，培养时间96～120h。
β-葡萄糖苷酶作为胞外产物，发酵完成后，β-葡萄糖苷酶存在于发酵液中，通过常规的酶分离纯化方法即可分离纯化获得高酶活的β-葡萄糖苷酶。
培养基的种类也是影响棘孢曲霉菌株繁殖的重要条件，步骤(1)中斜面培养基的组成为：葡萄糖5.0g，氯化钠3.0g，硝酸钾3.0g，磷酸氢二钾0.06g，硫酸铜0.004g，麸皮10.0g，酒石酸钾钠0.005g，氯化铁0.005g，硫酸锰0.005g，琼脂20.0g，乳糖10.0g，蒸馏水1000mL，pH值5.5～6.0，所述斜面培养基配置好后于0.08Mpa灭菌20min，划线接入曲霉BG30进行培养。
步骤(2)中产酶培养基的组成以1L培养基计为：麸皮34～36g，硫酸铵1.8～2.0g，MgSO4·7H2O 0.4～0.5g，蛋白胨1.2～1.5g，FeSO4·7H2O0.008～0.01g，葡萄糖2g，pH 5.45～5.55。
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶的应用，在催化葡萄糖和抗环血酸合成抗坏血酸葡萄糖苷中的应用，催化葡萄糖和抗环血酸合成抗坏血酸葡萄糖苷的具体工艺为：每100mL以水做溶剂的反应体系中加入3-6g抗环血酸、15-25g葡萄糖和1g酶保护剂硫脲，再按0.01-0.10U/mL的添加量加入酶，于55-65℃反应2-2.5h。
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶的应用，在催化乳糖合成低聚β-半乳糖苷中的应用，催化乳糖合成低聚β-半乳糖苷的具体工艺为：每100mL以水做溶剂的反应体系中加入乳糖30-45g和酶稳定剂硫脲1g，再按0.01-0.10U/mL的添加量加入酶，于28-70℃反应5-10分钟。
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶还可以用于杨梅酒、猕猴桃酒、半甜型猕猴桃酒、干型猕猴桃酒、猕猴桃白兰地酒的脱苦去涩，以及用于杂粮酒发酵增香、洋河大曲酒增香、莲子酒增香、茶叶增香；用于调料品增香或食品增香，以及用于化妆品或护肤品的增香。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精，具有较强的增香功能及转糖苷酶活性，可以用作酶法合成烷基糖苷；还可以用于多种果酒、白酒、调料品和食品的增香以及化妆品和护肤品的增香，应用范围广，增香效果突出。
附图说明
图1：分离纯化并脱盐冻干后β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE电泳银染结果；
图2：不同pH对发酵液粗酶液的β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图3：不同pH对精酶液的β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图4：温度对发酵液粗酶液的β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图5：温度对精酶液的β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图6：β-葡萄糖苷酶对pNPG的酶动力学双倒数图；
图7：酒精作用下β-葡萄糖苷酶对pNPG的酶动力学双倒数图；
图8：β-葡萄糖苷酶催化合成抗坏血酸葡萄糖苷反应混合物薄层层析图谱；
图9：抗坏血酸葡萄糖苷合成过程还原糖浓度的变化；
图10：β-葡萄糖苷酶催化乳糖合成低聚β-半乳糖苷反应混合物的薄层层析图谱；
图11：19°白酒的判别函数分析图(LDA)；
图12：38°白酒的判别函数分析图(LDA)；
图13：56°白酒的判别函数分析图(LDA)。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
1、菌株的分离纯化
1.1样本采集：从小竹林排水沟、野生茶树下、腐烂竹叶和枯桃树木等下的土壤中采集25个土壤样品于无菌试管中。
1.2样本处理
试剂准备：含抗生素的样本处理液配置：氨苄青霉素1g，卡那霉素0.55g，氯化钠8.5g，吐温1g溶于适量水中；1g氯霉素用4.5ml乙醇溶解；将乙醇-氯霉素溶液混入第一步所得溶液中，定容至1L得到处理液。
筛选培养基：含甲基红的察氏培养基(g/L)：CMC-Na 15.0，硝酸钠3.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1.0g，甲基红0.2g，琼脂15g，水1.0L。
样品处理：在每支含土壤样本的无菌试管中加入10mL含抗生素的样品处理液，并于高速混匀机中混匀，静置30min。
接种：分别将混合后的处理液取50μL于2mL的离心管中(第一管)，并加入950μL生理盐水(无抗生素)即稀释20倍，从第一管中取50uL于第二管并计入950μL生理盐水，以上步骤重复，最后取稀释倍数为400，8000，160000的10μL涂布于平板，于28℃霉菌培养箱中培养。
1.3平板初筛
试剂准备：PDA培养基：马铃薯(去皮)200g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂15～20g/L，制得1L培养基，分别倒试管斜面、平板。
菌落挑取：取单一霉菌接种于PDA斜面上于28℃霉菌培养箱中培养。
1.4试管摇床复筛
1.4.1试剂准备：配制10×的真菌、细菌复筛培养基浓缩液：
真菌培养基浓缩液：(NH4)2SO420g/L，KH2PO420g/L，CaCl24g/L,MgSO4·7H2O 4g/L。
细菌培养基浓缩液：KH2PO4100g/L，NaCl 20g/L，MgSO4·7H2O 2g/L浓缩液配制完成后于灭菌锅灭菌，放于无菌柜,待用。
1.4.2浓缩液配制培养基：
真菌：取浓缩液适量，加入纤维二糖0.3g/L，CMC-Na 0.5g/L，然后将体积定容到浓缩液的10倍。
细菌：取浓缩液适量，加入纤维二糖0.3g/L,蛋白胨1g/L，将溶液定容到浓缩液的10倍。
pH4.5的0.2mol/L Na2HPO4-0.1mo mol/L的柠檬酸为缓冲液的配制：0.1mol/L的柠檬酸用磷酸二氢钠滴定至pH4.5，定容。
5mmol/L的p-NPG底物溶液
Na2CO31mol·L-1(反应终止液)
1.4.3试管摇床发酵复筛
将初筛斜面上的菌落于超净台分别接种于含真菌浓缩液培养基和细菌浓缩液培养基的试管中，接种后于120r/min，30℃条件下摇床培养4d.。
1.4.4酶活测定
在OD420nm下测吸光值，空白对照为酶液用去离子水代替的混合物。
酶活测定方法：将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mL pH4.5的0.2mo/L Na2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL 5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL 1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD。
酶活计算：每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:
U＝C×N/10×0.1＝C·N＝0.369·OD·N，上式中,U：酶活单位(μ/mL),10:反应时间,N:原酶液稀释倍数,0.1:取0.1mL酶液反应,C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C＝0.369·OD·N。
1.5诱变
将步骤1.4试管摇床发酵复筛获得β-葡萄糖苷酶活性较高的棘孢曲霉菌进一步UV诱变处理，再通过EMS(甲基磺酸乙酯)和DES(硫酸二乙酯)联合诱变，获得一株β-葡萄糖苷酶酶活性最高的棘孢曲霉菌株，命名为：曲霉(Aspergillus sp.)BG30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.7799，保藏日期2013年6月28日。
2、菌株的鉴定
上述棘孢曲霉菌株的菌落特性为：在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径60-65mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头紫褐色，初期球形，后期开裂，菌落背面浅褐色。分生孢子梗大，宽8.5-11.0μm，褐色，壁光滑，顶囊球形，直径33-42μm，全部表面可有；产孢结构单层，瓶梗6-10*μm，分生孢子椭圆形，少数球形或近球形，浅到褐色，具明显小刺，2.9-4.7*2.5-4.0μm，未见有性孢子。
3、本发明的棘孢曲霉菌株用于β-葡萄糖苷酶生产
斜面培养基的组成为：葡萄糖5.0g，氯化钠3.0g，硝酸钾3.0g，磷酸氢二钾0.06g，硫酸铜0.004g，麸皮10.0g，酒石酸钾钠0.005g，氯化铁0.005g，硫酸锰0.005g，琼脂20.0g，乳糖10.0g，蒸馏水1000mL，pH值5.5～6.0，所述斜面培养基配置好后于0.08Mpa灭菌20min，划线接入曲霉BG30进行培养。
发酵培养基1(以1L计)：麸皮34g，硫酸铵1.8g，MgSO4·7H2O 0.4g，蛋白胨1.2g，FeSO4·7H2O 0.008g，葡萄糖2g，pH 5.45。
发酵培养基2(以1L计)：麸皮36g，硫酸铵2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨1.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，pH 5.55。
β-葡萄糖苷酶生产方法如下：
(1)将曲霉(Aspergillus sp.)BG30接入斜面培养基，于28～30℃，进行增殖培养96～120h，用无菌生理盐水洗下斜面培养基上的孢子；
(2)将孢子液按2％接种量接入产酶培养基，于28-30℃进行发酵培养96-120h，各发酵液收集并合并，4000rpm×10min，收集上清，即为粗酶液
发酵完毕后按步骤1.4.4酶活测定方法，测定发酵液中β-葡萄糖苷酶的活性，具体结果如下：发酵培养基1获得的发酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活为7.343U/mL，发酵培养基2获得的发酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活为7.543U/mL。
然后进行纯化处理：
A：盐析，在上清液中边搅拌边加入(NH4)2SO4至40％饱和度，于4℃冰箱内静置1h，12000rpm离心20min，弃去沉淀，收集上清，再向上清液中加入(NH4)2SO4至70％饱和度，搅拌均匀后于4℃冰箱内静置过夜，12500rpm，4℃离心20min，收集沉淀，弃去上清，用pH5.5的0.01mol/LC6H8O7-NaOH缓冲液，溶解沉淀；
B、透析，然后进行透析，先检查透析袋是否漏气漏水，往透析袋中倒入已溶解的沉淀，用夹子夹紧上口，将其放入已倒有冰预冷的pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的量筒中(注：液体应浸没透析袋)，有条件的磁力搅拌一段时间，更换透析液；
C：DEAE-阴离子交换柱层析，测量透析后酶液的体积、酶活性，并对其中的蛋白质浓度进行计算，上样体积则根据DEAE-阴离子交换的交换量决定，上样到用冰预冷的pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液平衡好的DEAE-阴离子交换柱(0.3×40cm，不用时于4℃，20％酒精溶液保存)，先用未含NaCl的pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，再用分别含0.1、0.3、0.6mol/L NaCl的上述缓冲液洗脱，洗脱液流速设定为6Ml/min，收集峰值最大处的洗脱液，测定其中β-葡萄糖苷酶的酶活，蛋白质浓度。
D：脱盐，层析后收集的酶液含有较高浓度的NaCl，会对酶的活性造成影响，因此要对其进行脱盐，将收集的酶液依次上样到Sephadex G-25凝胶柱(0.3×40cm)进行脱盐。用pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗脱，洗脱液流速设定为6mL/min，收集洗脱液，测定其中β-葡萄糖苷酶的酶活，蛋白质浓度。
E:冷冻干燥，对脱盐后的收集液进行真空冷冻干燥，冻干条件为30bar真空度，30℃加热。冻干样品加1.5mL 8％甘油水溶液，溶解，测定冻干样品的蛋白浓度，酶活性。
上述发酵液经40～70％(NH4)2SO4分级沉淀，透析，DEAE阴离子交换柱层析，Sephadex G-25凝胶柱脱盐，真空冷冻干燥后得到的β-葡萄糖苷酶，其比活达到521.853U/mg，纯化9.7倍，酶的回收率为66％。
脱盐冻干样品的SDS-PAGE电泳银染结果如图1所示，图1中，M：蛋白质标准品，对应的分子量分别为98KD，66.2KD，45KD，31KD，20KD，14.4KD；1，穿柱液，上样量0.496μg蛋白质；2，0.1M NaCl洗脱液1，上样量1.108μg蛋白质；3，0.1M NaCl洗脱液；2，上样量0.763μg蛋白质；4，0.3M NaCl洗脱液，上样量1.131μg蛋白质；5，0.6M NaCl洗脱液，图中所示A点为β-葡萄糖苷酶，根据与蛋白质标准品的对比，判断β-葡萄糖苷酶的分子量为100KDa。
关于pH值对粗酶液和精酶液的β-葡萄糖苷酶活性的影响进行了研究，结果如图2和图3所示，在pH4.5以下的范围内，β-葡萄糖苷酶的活性增强，且最高点为pH4.5。而在pH4.5以上，酶活性下降，当pH为8时，其活性基本丧失，发酵液粗酶液和冷冻干燥后的精酶液，趋势保持一致，两者的最适pH均为4.5。
关于温度对粗酶液和精酶液的β-葡萄糖苷酶活性的影响进行了研究，结果如图4和图5所示，发酵液粗酶液和精酶液对pNPG作用的温度曲线趋势相同，当温度在65℃以下时，温度升高，酶活性也随之而升高；但酶活性在温度高于65℃时急剧降低，这表明β-葡萄糖苷酶对pNPG作用的最适反应温度为65℃，本申请的发明人进一步研究发现，当温度升高到80℃时，酶仍具有60％左右的活性，当升温至100℃时，酶仍具有20-30％左右的活性。
关于温度和pH对酶活性影响图中有一个是粗酶液的(成本低)，一个是精制酶的(成本高，高纯度)，它也间接表明酶没有经过纯化，其效能在许多场合也是能保证的。
β-葡萄糖苷酶水解pNPG反应的Km和Vmax值的测定结果如图6所示，此方程为Y＝0.0116X+0.0169，其中R2＝0.9951。根据Lineweaver-Bruk作图法，利用米氏方程求得Vmax＝1/0.0169＝59.172μmol·min-1，Km＝Vmax×0.0116＝0.686mmol/L。所以，可得出本发明分离纯化出的β-葡萄糖苷酶水解pNPG酶促反应的最大反应速率Vmax为59.172μmol·min-1，米氏常数Km为0.686mmol·L-1，本发明的β-葡萄糖苷酶水解pNPG反应的米氏常数Km值与绝大多数的国外其他文献所报道的值相比而言，其值较小，所以可知该酶对底物pNPG的亲和力较强。
不同酒精度对β-葡萄糖苷酶水解pNPG的抑制作用结果如图7所示，酒精对β-葡萄糖苷酶水解pNPG反应的抑制为竞争性抑制，但一定浓度(6％～12％)的酒精又是激活剂，促进酶解反应。6％酒精和12％酒精度下的Vmax为131.579μmol/min和333.333μmol/min，比无酒精时分别增加了122.37％和463.33％。
NaCl和HAc对β-葡萄糖苷酶动力学参数的影响结果如表1所示：
表1不同浓度NaCl和HAc处理下β-葡萄糖苷酶的动力学参数
由表1可知，10g/L NaCl的盐浓度有利于保护酶活性，能促进酶解反应，Vmax比无NaCl时增加了13.76％；而HAc会抑制酶反应，反应速率随着HAc浓度的升高而下降。在60g/LNaCl的高盐和6％HAc的高酸条件下，酶作用于pNPG的Km分别为0.198mmol/L和1.634mmol/L，其值较小，说明酶活性较高，耐酸耐盐，对pNPG的亲和力较强。
应用例1：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶催化合成抗坏血酸葡萄糖苷，工艺参数为：每100ml以水做溶剂的反应体系中加入3g抗环血酸、20g葡萄糖和1g酶保护剂硫脲，再按0.05U/mL的添加量加入酶(酶的比活性为530IU/mg)，于55℃反应2.0-2.5h，反应混合物的薄层层析图谱如图8，反应过程中还原糖浓度变化曲线如图9所示，综合分析，反应在2-2.5h已经结束，继续反应加速水解，降低得率，经过离子交换层析和结晶等分离纯化，得到的AA-2G产品纯度为HPLC 98％级别，其UV扫描图谱在262nm附近有典型的吸收峰，其祛自由基特征符合文献，具有比Vc缓释的效果。
应用例2：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶催化乳糖合成低聚β-半乳糖苷，每100ml以水做溶剂的反应体系中加入乳糖40g和酶稳定剂硫脲1g，再按0.05U/mL的添加量加入酶(酶的比活性为530IU/mg)，于45℃反应5分钟，反应混合物的薄层层析图谱如图10：可以看出反应非常快，乳糖很快就被被β-葡萄糖苷酶水解掉，生成新的糖类，经过HPLC-质谱鉴定，新合成的糖含40％的低聚β-半乳糖苷，聚合度在4-10之间。
应用例3：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于杨梅酒增香脱苦去涩:
在浙江聚仙庄品牌提供的由水处理技术物理降酸的杨梅酒成品和原料酒,由于失去了大部分的营养物质,杨梅酒香不突出，酒体味咸、苦、涩，取酒厂的锡箔纸包装的原酒，倒入750ml棕色酒瓶，贴标，分别加入不同剂量的精制本酶(酶的比活性为530IU/mg)，加上橡木塞，静置存放于25℃3天。
请10位无感冒症状受过品酒训练的健康人，盲评打分取感官平均值，结果如表2所示：
表2杨梅酒增香脱苦去涩结果
应用例4：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于猕猴桃酒增香脱苦去涩:
在雅安提供的猕猴桃酒(成品),由于失去了猕猴桃香型,请我们来处理,处理方法,超净台无菌状态下打开750ml棕色酒瓶的橡木塞,加入不同剂量的精制本酶(酶的比活性为530IU/mg)，轻轻混匀，盖回原橡木塞，静置存放于25℃,3天.请10位无感冒症状受过品酒训练的健康人，盲评打分取感官平均值见表3、4、5和6:
表3 12°甜型猕猴桃酒处理效果
表4 12°半甜型猕猴桃酒处理效果
表5 12°干型猕猴桃酒处理效果
表6 28°猕猴桃白兰地酒处理效果
应用例5：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于杂粮酒发酵增香
在杂粮发酵加入酒曲时同时加入本β-糖苷酶发酵粗酶液100U/kg(酶的活性为7.4U/mL),盖上草垫或塑料布等发酵14-21天，将本酒依照常规的吊酒工艺吊酒，比较中酒，十位受过训练的酿酒师评价认为经过本酶酿造的杂粮酒其杂粮味道更突出。
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于洋河大曲56°酒增香，结果见图11、12和图13
图11中是19度白酒(真露)添加不同的β-葡萄糖苷酶酶活性做的电子鼻检测结果，其中1号是没有加酶的，2号的酶的活性是0.05U/100ml，3号的酶的活性是0.25U/100ml，4号的酶的活性是0.50U/100ml，由图11可知添加酶的与没有添加酶的白酒有明确的区分，而且添加酶的量的不同也会有较明显的差异。
图12中是38度白酒(绵竹大曲)添加不同的酶量做的电子鼻检测结果,其中5号是没有加酶的，6号的酶的活性是0.05U/100ml，7号的酶的活性是0.25U/100ml，8号的酶的活性是0.50U/100ml，由图12可知添加酶的与没有添加酶的白酒有明确的区分，而且添加酶的量的不同也会有较明显的差异。
图13中是56度白酒(二锅头)添加不同的酶量做的电子鼻检测结果,其中9号是没有加酶的，10号的酶的活性是0.05U/100ml，11号的酶的活性是0.25U/100ml，12号的酶的活性是0.50U/100ml，由图13可知添加酶的与没有添加酶的白酒有明确的区分，而且添加酶的量的不同也会有较明显的差异。
由此可见，本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶可在高度酒例如56°白酒中为产品增香，其他中度酒、低度酒都具有明显的增香效果，并且增香具有剂量效应。
应用例7：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于莲子酒增香:
浙江龙游生产硒莲，当地不少企业酿造莲子酒，但是由于技术等原因，蒸馏酒的莲子香型不突出，在其成酒：28°和56°莲子酒中添加粗酶液0.1ml/500mL(酶的活性为7.4U/mL),放置3天，与未添加粗酶液的对照比，十人盲评取平均值，本酶处理后的两种酒精度的莲子酒的莲子香型突出。
应用例8：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于茶叶增香:
新采摘的茶叶，其晾晒等处理工艺同现有技术，在50℃-70℃炒制的过程中，添加0,10,20,50，100U/kg的本酶(酶的比活性为530IU/mg),常规翻炒30min-1h不等，然后按照同样的工艺检测水分含量后锡箔纸封口，储存在50℃气候箱，60天后，10人盲评，评价结果显示，添加本酶对茶叶在50℃储存具有剂量依赖型的增香效应，储存180天时，盲品结果依然显示，添加本酶对茶叶在50℃储存具有剂量依赖型的增香效应，不过剂量之间香气浓度差异减弱。
应用例9：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于食用醋增香：
普通安琪商用酵母发酵的米酒，酒精度7°，添加沪酿一号醋用粉状菌种，同时分别添加0,10,20,50，100U/kg的本酶(酶的比活性为530IU/mg),发酵7天，90℃高温瞬时杀菌10min，分装350ml/500ml玻璃瓶，50℃保存60天，十人盲评，评价结果显示，添加本酶对米醋在50℃储存具有剂量依赖型的增香效应，并且没有杂味出现，无酵母发酵过头造成的后苦味。
应用例10：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于火腿肠增香:取猪五花肉与2％的食盐混合均匀后，同时分别添加0,10,20,50，100U/kg的本酶(酶的比活性为530IU/mg),灌制在洁净的猪大肠里，放置在30℃发酵15天，十人盲评，评价结果显示，添加本酶对火腿肠的增香效应具有剂量依赖型，并且可以降低常规火腿肠腌制发酵带来的后苦味。
应用例11：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于酱油增香:在蒸熟豆鼓,按照常规添加曲和10-18％的盐,再加入本粗酶液0,10,20,50，100U/L(粗酶液的酶活为7.4U/mL),进行高盐发酵,室温发酵30天，十人盲评，评价结果显示，添加本酶对火腿肠的增香效应具有剂量依赖型，并且大豆的香型突出,口感细腻,并且降低大豆多肽水解后带来的后苦味。
应用例11：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于化妆品保湿精华液增香:
配制植物保湿精华液:芦荟的10％酒精提取液1％,透明质酸0.1％,其余去离子水,分别添加DEAE层析后0.3M氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,混合均匀,静置50℃,50天,产品无变色发混等现象,十人盲评，评价结果显示，添加本酶对植物保湿精华液的增香效应具有剂量依赖型，推荐的剂量为0.5-10U/L。
应用例12：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于对褐藻茶美白保湿水的增香：褐藻美白保湿水(含褐藻水提取物5％，透明质酸0.1g/L)，对预灌装的该产品(不含化学香精)分别添加0，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10.0U/L的发酵粗酶液，每个试验点3瓶，30ml玻璃瓶封装，,混合均匀,静置50℃,50天,产品无变色发混等现象,十人盲评，评价结果显示，添加本酶增加了产品的海藻气息,增香效应具有剂量依赖型，推荐的剂量为0.2U/L。
应用例13：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于面膜增香，配制面膜(质量百分比):时令果蔬的榨汁滤液3％,硅酮0.5％,硅酸铝镁0.2％，防腐剂如山梨酸钾0.05％和苯甲酸钠0.05％,溶解并混合均匀并杀酶，分别添加本DEAE层析后0.1M氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,静置50℃,50天,产品无变色发混以及霉斑出现等现象,十人盲评，评价结果显示，添加本酶对增加了产品的原料气息,增香效应具有剂量依赖型，推荐的剂量为0.5-10U/L。
应用例14：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于化妆品霜剂增香:制备海藻精华美白霜(质量百分比):硅酸铝镁2％，单甘酯6％，褐藻的海洋单胞菌发酵粗提液2％，十八烷醇2％，茶油1％，甘油10％，熊果苷2.5％，透明质酸2.5％，防腐剂0.2％，乳化混匀后，分别加入本DEAE层析后0.1M氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,静置50℃,50天,产品无变色发混以及霉斑出现等现象,十人盲评，评价结果显示，添加本酶对增加了产品的原料气息,增香效应具有剂量依赖型，推荐的剂量为10-20U/L。
应用例15：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于洗发液里的增香作用：洗发水配方为(质量百分数)：椰油酰基甲基牛磺酸钠10％、月桂基二甲基氧化胺6％、椰油酸二乙酰胺5％、表面活性剂2.5％、聚乙二醇2.0％、橄榄油2％、羧甲基纤维素1.5％、珠光剂1.5％、苦瓜提取液1％、茶油1.0％、丙酮酸钾0.5％、芦荟提取液0.5％、水杨酸0.5％、防腐剂0.5％、用柠檬酸调pH至4.5。乳化后，分别添加本DEAE层析后0.1M氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,静置50℃,50天,产品无变色发混以及霉斑出现等现象,十人盲评，评价结果显示，添加本酶对增加了产品的原料气息,苦瓜、芦荟等的植物香型的增香效应具有剂量依赖型，推荐的剂量为20U/L。
应用例16：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于酸奶发酵增香：
无抗牛乳,添加3％-6％的白砂糖和乳酸菌适量,以及本酶的DEAE层析后0.1M氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,37℃-42℃发酵6h,低温后熟16h,盲评,结果显示酶活性的添加使得酸奶的动物乳香型呈现剂量递增效应,并且香型细腻.
无抗牛乳,植物原料,例如草莓,芦荟汁等3％-5％,白砂糖3％-6％,和植物乳酸菌适量,以及本酶的DEAE层析后0.1M氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,28℃-32℃发酵24h,低温后熟16h,盲评,结果显示酶活性的添加使得酸奶的植物来源的花香果香突出,并呈现剂量递增效应.
应用例17：
本发明的高耐受性β-葡萄糖苷酶用于能增加人体体香的护肤乳：
护肤乳(质量百分比组成)：清爽型乳化剂1％,绿色茶油10％,去离子水89％,复合防腐剂0.1％,乳化均匀后,添加本酶的DEAE层析后0.1M氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,37℃-42℃发酵6h,低温后熟16h,10人盲评,结果显示酶活性的添加使得酸奶的动物乳香型呈现剂量递增效应,当酶量大于30U/L时,使用该护肤乳的手背和脸部,可以在半小时内闻到区别于对照的人体香型，原理在于，人体的香型来自自身释放的烯萜和一些醛醇等物质,这些烯萜许多也是与体内的单糖键合以非香型物质呈现,当本β-葡萄糖苷酶的量足够大的时候,可以水解这些香味前体物质并释放出足以让人类鼻子可以察觉的体香。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种曲霉，其特征在于：该曲霉的保藏编号为CGMCC No.7799，保藏名称为曲霉（Aspergillus sp.）BG30。
2.一种权利要求1所述曲霉的应用，其特征在于，用于产β-葡萄糖苷酶，具体步骤为：
（1）将曲霉（Aspergillus sp.）BG30接入斜面培养基进行增殖培养，用无菌生理盐水洗下斜面培养基上的孢子；
（2）将孢子液接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过盐析、透析、DEAE-阴离子交换柱层析、脱盐和冷冻干燥纯化获得β-葡萄糖苷酶；
所述β-葡萄糖苷酶水解pNPG酶促反应的最大反应速率Vmax为59.172μmol∙ min-1，米氏常数Km为0.686 mmol∙ L-1。
3.根据权利要求2所述曲霉的应用，其特征在于：步骤（1）中斜面培养基的组成为：葡萄糖 5.0g，氯化钠3.0g，硝酸钾3.0g，磷酸氢二钾0.06g，硫酸铜0.004g，麸皮10.0g，酒石酸钾钠0.005g，氯化铁0.005g，硫酸锰0.005g，琼脂20.0g，乳糖10.0g，蒸馏水1000mL， pH值5.5~6.0，所述斜面培养基配置好后于0.08Mpa灭菌20min，划线接入曲霉BG30进行培养。
4.根据权利要求2所述曲霉的应用，其特征在于：步骤（2）中产酶培养基的组成以1L培养基计为：麸皮34~36g，硫酸铵1.8~2.0g，MgSO4·7H2O 0.4~0.5g，蛋白胨1.2~1.5g，FeSO4·7H2O 0.008~0.01g ，葡萄糖2g，pH 5.45~5.55。
5.根据权利要求2所述曲霉的应用，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶用于催化葡萄糖和抗环血酸合成抗坏血酸葡萄糖苷。
6.根据权利要求5所述曲霉的应用，其特征在于，催化葡萄糖和抗环血酸合成抗坏血酸葡萄糖苷的具体工艺为：每100ml以水做溶剂的反应体系中加入3-6g抗环血酸、15-25g葡萄糖和1g酶保护剂硫脲，再按0.01-0.10U/mL的添加量加入酶，于55-65℃反应2-2.5h。
7.根据权利要求2所述曲霉的应用，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶用于催化乳糖合成低聚β-半乳糖苷。
8.根据权利要求7所述曲霉的应用，其特征在于，催化乳糖合成低聚β-半乳糖苷的具体工艺为：每100ml以水做溶剂的反应体系中加入乳糖 30-45g和酶稳定剂硫脲1g，再按0.01-0.10U/mL的添加量加入酶，于28-70℃反应5-10分钟。
9.根据权利要求2所述曲霉的应用，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶用于杨梅酒和猕猴桃酒的脱苦去涩，以及用于杂粮酒、洋河大曲酒、莲子酒或茶叶的增香。
10.根据权利要求2所述曲霉的应用，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶用于调料品增香或饮食品增香，或者用于化妆品的增香。
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