CN111004792A - 一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高耐受型β‑葡萄糖苷酶的制备方法及其应用，涉及化工技术领域，从棘孢曲霉中分离所述的β‑葡萄糖苷酶，将固定化β‑葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β‑葡萄糖苷酶液，选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液,0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45‑55℃，将静置好的混合液冷却2‑3d，分装装瓶，制得保湿精华液成品，通过对制得的β‑葡萄糖苷酶进行凝胶化，保证了β‑葡萄糖苷酶的酶负载量高，从而使得β‑葡萄糖苷酶的耐受性大大提高，同时操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质，减低了生产成本。

Description

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及化工技术领域，具体为一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶是一种增香酶，又称β-D-葡萄糖苷水解酶(简称β-GC酶)，该酶不需要任何辅酶，是真正的水解酶，能够作用于大部分天然糖苷，β-葡萄糖苷酶水解释放出键合态香气物质，所以它被用于作为许多化妆品的增香酶。它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，这种酶存在于许多植物体，还存在于一些酵母、霉菌、木霉菌属及细菌甚至是昆虫体内,β-葡萄糖苷酶可以将水果、蔬菜、茶叶中的风味前体物质β-糖苷水解为具有浓郁天然风味的香气物质。

β-葡萄糖苷酶在储存以及使用的过程中酶活保留率不是很理想，因此发明人从商业和技术角度考虑，提供了一种新的β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用手段，保证β-葡萄糖苷酶的耐久性以及使用寿命，来解决β-葡萄糖苷酶酶活保留率低的技术难题，从而为降低β-葡萄糖苷酶的生产成本提供了可能。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，从棘孢曲霉中分离所述的具有增香功能的β-葡萄糖苷酶，包括以下步骤：

S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；

S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；

S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-1.2vvm下，培养3d；

S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。将发酵培养液进行检测，将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；

S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；

S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶。

进一步优化本技术方案，所述S4中使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD。

进一步优化本技术方案，所述S6中的正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2。

进一步优化本技术方案，所述高耐受性β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。

进一步优化本技术方案，所述S4中的超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃。

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，所述固定化β-葡萄糖苷酶在使用时，进行去凝胶化处理后，可以配制化妆品保湿精华液，包括以下步骤：

S1、将固定化β-葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β-葡萄糖苷酶液；

S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃。

S3、将静置好的混合液冷却2-3d，分装装瓶，制得保湿精华液成品。

有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用，具备以下有益效果：

该高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用，通过对制得的β-葡萄糖苷酶进行凝胶化，保证了β-葡萄糖苷酶的酶负载量高，显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活稳定性，从而使得β-葡萄糖苷酶的耐受性大大提高，同时操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质，减低了生产成本。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，从棘孢曲霉中分离的具有增香功能的β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶可以水解释放出键合态香气物质，而固定化β-葡萄糖苷酶能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，这些β-D-葡萄糖和相应的配基组合形成键合态香气物质，固定化β-葡萄糖苷酶的增香效果比未固定化的β-葡萄糖苷酶更好，包括以下步骤：

S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；

S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；

S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-1.2vvm下，培养3d；

S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。将发酵培养液进行检测，使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:U＝C×N/10×0.1＝C·N＝0.369·OD·N，上式中,U：酶活单位(μ/mL),10:反应时间,N:原酶液稀释倍数,0.1:取0.1mL酶液反应,C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C＝0.369·OD·N，将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃，破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；

S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；

S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，固定化β-葡萄糖苷酶在使用时，进行去凝胶化处理后，可以配制化妆品保湿精华液，包括以下步骤：

S1、将固定化β-葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β-葡萄糖苷酶液；

S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃。

S3、将静置好的混合液冷却2-3d，分装装瓶，制得保湿精华液成品。

将制得保湿精华液成品样品寄予不同年龄段的十人进行试验30天，评价结果显示，添加本酶对保湿精华液的增香效应具有剂量依赖性，儿童推荐的剂量为2U/L，成年男性推荐的剂量为6U/L，成年女性推荐的剂量为8U/L。

实施例二：

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，从棘孢曲霉中分离的具有增香功能的β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶可以水解释放出键合态香气物质，而固定化β-葡萄糖苷酶能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，这些β-D-葡萄糖和相应的配基组合形成键合态香气物质，固定化β-葡萄糖苷酶的增香效果比未固定化的β-葡萄糖苷酶更好，包括以下步骤：

S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；

S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±1℃；

S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-1.2vvm下，培养3d；

S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。菌体使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:U＝C×N/10×0.1＝C·N＝0.369·OD·N，上式中,U：酶活单位(μ/mL),10:反应时间,N:原酶液稀释倍数,0.1:取0.1mL酶液反应,C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C＝0.369·OD·N。将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃，破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；

S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；

S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至50-60℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，固定化β-葡萄糖苷酶在使用时，进行去凝胶化处理后，可以配制化妆品保湿精华液，包括以下步骤：

S1、将固定化β-葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β-葡萄糖苷酶液；

S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃。

S3、将静置好的混合液冷却2-3d，分装装瓶，制得保湿精华液成品。

将制得保湿精华液成品样品寄予不同年龄段的十人进行试验30天，评价结果显示，添加本酶对保湿精华液的增香效应具有剂量依赖性，儿童推荐的剂量为1U/L，成年男性推荐的剂量为4U/L，成年女性推荐的剂量为6U/L。

实施例三：

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，从棘孢曲霉中分离的具有增香功能的β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶可以水解释放出键合态香气物质，而固定化β-葡萄糖苷酶能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，这些β-D-葡萄糖和相应的配基组合形成键合态香气物质，固定化β-葡萄糖苷酶的增香效果比未固定化的β-葡萄糖苷酶更好，包括以下步骤：

S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；

S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；

S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-1.2vvm下，培养3d；

S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体。将发酵培养液进行检测，使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD，每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:U＝C×N/10×0.1＝C·N＝0.369·OD·N，上式中,U：酶活单位(μ/mL),10:反应时间,N:原酶液稀释倍数,0.1:取0.1mL酶液反应,C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C＝0.369·OD·N。将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎。超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃，破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；

S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；

S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。

一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，固定化β-葡萄糖苷酶在使用时，进行去凝胶化处理后，可以配制化妆品保湿精华液，包括以下步骤：

S1、将固定化β-葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β-葡萄糖苷酶液；

S2、选取占比为10％芦荟，1％酒精提取液, 0.1％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃。

S3、将静置好的混合液冷却1-2d，分装装瓶，制得保湿精华液成品。

将制得保湿精华液成品样品寄予不同年龄段的十人进行试验30天，评价结果显示，添加本酶对保湿精华液的增香效应具有剂量依赖性，儿童推荐的剂量为4U/L，成年男性推荐的剂量为8U/L，成年女性推荐的剂量为10U/L。

本发明的有益效果是：该高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法及其应用，通过对制得的β-葡萄糖苷酶进行凝胶化，保证了β-葡萄糖苷酶的酶负载量高，显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活稳定性，从而使得β-葡萄糖苷酶的耐受性大大提高，同时操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质，减低了生产成本。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，从棘孢曲霉中分离所述的具有增香功能的β-葡萄糖苷酶，包括以下步骤：

S1、将选取的棘孢曲霉接入PDB培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml稀释）进行活化培养3d，活化培养的环境温度保持在28℃±2℃；

S2、将活化培养后的棘孢曲霉放至摇床内进行发酵摇床培养，培养时间8d，摇床培养的环境温度保持在26℃±2℃；

S3、将发酵摇床培养的棘孢曲霉菌株转接入1000mL三角瓶，28℃的培育环境下，220r/min下液体发酵培养36h，按1％接种量接入50L发酵罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7-1.2vvm下，培养3d；

S4、取发酵阶段的棘孢曲霉发酵液40ml在4℃、10000g条件下离心10min，弃上清液，收集菌体；

将发酵培养液进行检测，将装有菌悬液的离心管置于冰浴中，实施超声波破碎；

破碎的细胞溶液在4℃、5000g环境条件下离心15min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，取得棘孢曲霉胞内粗酶液；

S5、从棘孢曲霉胞内粗酶液中提取蛋白质，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗分子筛凝胶层析柱，随后对提取的蛋白质使用DEAE-阴离子交换柱层析进行分离，得到初步得到的β-葡萄糖苷酶，备用；

S6、将正硅酸乙酯与水混合，其中正硅酸乙酯与水的比例为1：500，混合均匀后加入盐酸搅拌，将温度升至55-65℃回流1-2h，之后冷却至室温，得到反应混合液，加入初步得到的β-葡萄糖苷酶，低温静置下凝胶化，得到固定化β-葡萄糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述S4中使用的检测方法为将发酵培养液于3000r/min离心10min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1mL适度稀释的粗酶液，加入0.9mLpH4.5的0.2mo/LNa2HPO4-0.1mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10min,再加入已预热5～10min的1mL5mmol·L/L的p-NPG溶液，用秒表精确计时,10min后立即加入1mL1mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于4420nm处测光吸收值OD。

3.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述S6中的正硅酸乙酯与水的摩尔比为1:2。

4.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述高耐受性β-葡萄糖苷酶耐65-100℃高温，耐质量浓度4-6％的氯化钠，耐质量分数3％醋酸和体积分数11％以上的酒精。

5.根据权利要求1所述的一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述S4中的超声波破碎条件为：超声仪探头置于液面下1cm，功率455W，超声时间4s，工作间隔为4s，工作总时间为30min，工作环境温度为0-4℃。

6.一种高耐受型β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述固定化β-葡萄糖苷酶在使用时，进行去凝胶化处理后，可以配制化妆品保湿精华液，包括以下步骤：

S1、将固定化β-葡萄糖苷酶进行去凝胶化处理，得到β-葡萄糖苷酶液；

S2、选取占比为15％芦荟，1.5％酒精提取液, 0.2％透明质酸,其余占比的去离子水,分别添加DEAE层析后0.25氯化钠梯度洗脱的分布收集酶液0,10,20,30,40U/L,将混合液静置40天,静置的环境温度在45-55℃；

S3、将静置好的混合液冷却2-3d，分装装瓶，制得保湿精华液成品。