CN111849781B

CN111849781B - 肺炎链球菌冻干保护剂

Info

Publication number: CN111849781B
Application number: CN202010847600.7A
Authority: CN
Inventors: 詹晓; 朱绍荣; 张成林
Original assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: CN111849781A

Abstract

一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括浓度1wt％～20wt％脱脂奶粉和浓度1wt％～10wt％蔗糖。用本发明的冻干保护剂制备的肺炎链球菌冻干管中菌体存活率达80％以上，性状稳定，适合肺炎链球菌疫苗生产用菌种制备。

Description

肺炎链球菌冻干保护剂

技术领域

本发明涉及一种用于保护生物制品的组合物，尤其涉及一种对生物制品冻干过程中进行保护的组合物，提高生物制品的性状。

背景技术

肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和菌血症等多种疾病。据世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)统计，全球每年死于肺炎链球菌感染的5岁以下儿童占其亡总数的11％。目前，已知肺炎链球菌共有93种血清型，不同地区血清型分布存在差异，但其中10余种血清型的感染率占肺炎链球菌性疾病的2/3以上。肺炎球菌疫苗已经成为防治肺炎球菌最好的方法，在世界范围内广泛用于5岁以下儿童和65岁以上老人预防接种。为使肺炎疫苗生产过程稳定、高效，保障生产用菌种性状稳定至关重要。然而，肺炎链球菌菌种会因不合适的保藏环境而发生突变或退化，导致发酵过程生长缓慢，荚膜产量低，甚至失去免疫原性。为此，研发一种针对肺炎链球菌菌种保藏的保护剂，使菌种在保藏过程中性状稳定对肺炎疫苗生产具有重大意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种肺炎链球菌冻干保护剂，使得保存过程中的菌体存活率得到显著提高。

本发明的另一个目的在于提供一种肺炎链球菌冻干保护剂，使得菌种保存的性状稳定，有利于疫苗的生产，减少批次差异。

一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括浓度1wt％～20wt％脱脂奶粉和浓度1wt％～10wt％蔗糖。

本发明的肺炎链球菌冻干保护剂，还加入甘油、山梨醇、谷氨酸钠、海藻糖、维生素C、甘露醇和脱纤维羊血等。这些物质单独或组合应用于本发明。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入甘油，浓度为1wt％～10wt％或1wt％～5wt％，如：但不限于1wt％、2wt％、3wt％、4wt％和5％等。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入山梨醇，浓度为0.2wt％～10.0wt％或0.5wt％～2.0wt％，如：但不限于0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％和2.0wt％等。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入谷氨酸钠，浓度为0.1wt％～1.0wt％或0.2wt％～0.8wt％，如：但不限于0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％和0.8wt％等。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入海藻糖，浓度为1wt％～10wt％或2wt％～6wt％，如：但不限于2wt％、3wt％、4wt％、5wt％和6％等。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入维生素C，浓度为0.05wt％～1wt％或0.08wt％～0.12wt％，如：但不限于0.08wt％、0.09wt％、0.10wt％、0.11wt％和0.12wt％。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入甘露醇，浓度为1wt％～5wt％或1wt％～2wt％。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入脱纤维羊血，浓度为0.5wt％～5wt％或1wt％～2wt％。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，还加入水为溶剂，尤其是注射用水。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括浓度1wt％～20wt％脱脂奶粉和浓度1wt％～10wt％蔗糖，还加入1wt％～5wt％甘油、0.5wt％～2.0wt％山梨醇、0.2wt％～0.8wt％谷氨酸钠、2wt％～6wt％海藻糖、0.08wt％～0.12wt％维生素C、甘露醇1wt％～2wt％和脱纤维羊血1wt％～2wt％等一种或几种。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括浓度1wt％～20wt％脱脂奶粉和浓度1wt％～10wt％蔗糖，还加入2wt％甘油、山梨醇1％、谷氨酸钠0.5％、5wt％海藻糖、0.1wt％维生素C、1wt％甘露醇和脱纤维羊血1wt％～2wt％等一种或几种。

本发明提供各种肺炎链球菌冻干保护剂，脱脂奶粉浓度优先选择8wt％～15wt％，如：但不限于8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％和15wt％等。

本发明提供各种肺炎链球菌冻干保护剂，蔗糖浓度优先选择2wt％～8wt％，如：但不限于2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％和8wt％等。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括1wt～10wt％蔗糖、1wt％～10wt％甘油、0.2wt％～10wt％山梨醇、1wt％～20wt％脱脂奶粉、0.1wt％～1wt％谷氨酸钠、1wt％～10wt％海藻糖、0.05wt％～1wt％维生素C、1wt％～5wt％甘露醇和0.5wt％～5wt％脱纤维羊血。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括2wt～8wt％蔗糖、1wt％～5wt％甘油、0.5wt％～2wt％山梨醇、8wt％～15wt％脱脂奶粉、0.2wt％～0.8wt％谷氨酸钠、2wt％～6wt％海藻糖、0.08wt％～0.12wt％维生素C、1wt％～2wt％甘露醇和1wt％～2wt％脱纤维羊血。

另一种肺炎链球菌冻干保护剂，包括5wt％蔗糖、2wt％甘油、1wt％山梨醇、10wt％脱脂奶粉、0.5wt％谷氨酸钠、5wt％海藻糖、0.1wt％维生素C、1wt％甘露醇和1wt％～2wt％脱纤维羊血。

本发明的各种组合物作为冻干保护剂用于肺炎链球菌的冻干样品制备后，菌体存活率达到80％以上，菌体性状稳定，无退化现象。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本实施例采用的肺炎链球菌1型(CMCC31404)原始来源为中国医学细菌保藏管理中心，直接来源为中国食品药品检定研究院。

本实施例采用的肺炎链球菌4型(CMCC31448)原始来源为中国医学细菌保藏管理中心，直接来源为中国食品药品检定研究院。

本实施例采用的肺炎链球菌14型(CMCC31602)原始来源为中国医学细菌保藏管理中心，直接来源为中国食品药品检定研究院。

实施例1

将肺炎1型菌于血平板上划线，在37℃、5％二氧化碳环境下过夜培养，将长出的单菌落接种到含30mlTHB培养基中培养5小时，然后分装入2ml无菌EP管中，每管1ml。放入离心机中12000rpm，离心5min，去掉上清液，获得需要冻干的菌体。按下表冻干粉保护剂组方配制冻干保护剂后，分别取1ml保护剂重悬EP管中的菌体，制成菌悬液，每个冻干粉保护剂重悬2支EP管。冻干前分别取各种冻干粉保护剂重悬的EP管1支，梯度稀释后涂平板计算菌落数；将冻干后的各种冻干粉用1ml PBS重悬后，梯度稀释后涂平板计算菌落数，结果详见如下表1。

表1

由表1可见，10％wt脱脂奶粉+5％wt蔗糖的组合显著提高了菌体的存活率，配合其它物质后，实现了菌体存活率进一步提高。

实施例2

100ml冻干保护剂制备：称取蔗糖1g，甘油2g，山梨醇1g，脱脂奶粉10g，谷氨酸钠0.5g，海藻糖5g，维生素C 0.1g，甘露醇1g，脱纤维羊血1.5g，用注射水溶解后定容至100ml，然后用0.22μm的过滤器过滤除菌。

将1型肺炎链球菌在哥伦比亚血平板上复壮，挑取菌苔放入上述配置的冻干保护剂中制成菌悬液(菌密度约10⁹～10¹⁰cfu)，然后分装入安瓿瓶中，每个安瓿瓶0.3ml菌液。

拿出一支分装好的安瓿瓶，将菌液适当梯度稀释后涂平板，放入二氧化碳培养箱中37℃过夜培养，长出菌落后计数。

将其它安瓿瓶放入冻干机中冻干，取一支冻干后的安瓿瓶，加生理盐水复溶后，梯度稀释，并涂平板，放入二氧化碳培养箱中37℃过夜培养，长出菌落后计数，结果详见如下表2。

表2

实施例3

100ml冻干保护剂制备：称取蔗糖5g，甘油2g，山梨醇1g，脱脂奶粉12g，谷氨酸钠0.5g，海藻糖5g，维生素C 0.1g，甘露醇1g，脱纤维羊血1.5g，用注射水溶解后定容至100ml，然后用0.22μm的过滤器过滤除菌。

将14型肺炎链球菌在哥伦比亚血平板上复壮，挑取菌苔放入上述配置的冻干保护剂中制成菌悬液(菌密度约10⁹～10¹⁰cfu)，然后分装入安瓿瓶中，每个安瓿瓶0.3ml菌液。

将其它安瓿瓶放入冻干机中冻干，取一支冻干的安瓿瓶，加生理盐水复溶后，梯度稀释，并涂平板，放入二氧化碳培养箱中37℃过夜培养，长出菌落后计数，结果详见如下表3。

表3

实施例4

100ml冻干保护剂制备：称取蔗糖5g，甘油2g，山梨醇1g，脱脂奶粉10g，谷氨酸钠0.5g，海藻糖5g，维生素C 0.1g，甘露醇1g，脱纤维羊血1.5g，用注射水溶解后定容至100ml，然后用0.22μm的过滤器过滤除菌。

将4型肺炎链球菌在哥伦比亚血平板上复壮，挑取菌苔放入上述配置的冻干保护剂中制成菌悬液(菌密度约10⁹～10¹⁰cfu)，然后分装入安瓿瓶中，每个安瓿瓶0.3ml菌液。

将其它安瓿瓶放入冻干机中冻干，取一支冻干的安瓿瓶，加生理盐水复溶后，梯度稀释，并涂平板，放入二氧化碳培养箱中37℃过夜培养，长出菌落后计数，结果详见如下表4。

表4

实施例5

低温冷冻过程中会因低温、冰晶形成等恶劣环境对细菌膜、遗传物质等造成一定的损害，甚者会使菌体性状发生改变，导致退化，为此冻干后对菌体性状稳定性的评价非常重要。肺炎链球菌生产用菌是一类通过筛选而获得的生长快速，荚膜厚实的菌株，肺炎链球菌性状稳定性一般用限定接种量、培养基和培养时间的条件下，考察获得的菌体浓度(OD600)，和荚膜厚度来评价。

将实施例1、实施例2和实施3中冻干前和冻干后的菌株涂布在血平板上，培养16h后，将长出来的菌苔分别用PBS悬浮制成菌悬液，菌浓度(OD600)控制在0.6，然后取1ml接种到含50mlTHB培养液的锥形瓶中，放入二氧化碳培养箱培养5h(培养温度37℃、二氧化碳浓度5％)，取培养液3ml，12000rpm离心3min，然后用3mlPBS重悬菌体，用紫外分光光度计在波长600nm测菌浓；另将血平板上长出的菌苔进行荚膜染色，在显微镜下观察荚膜厚度，用电脑中的测量软件对荚膜厚度进行测量，取视野下5个菌体平均荚膜厚度为测量值。实验结果如下表5。

表5

由表5可知，菌种在冻干前后菌体的生长状况和荚膜厚度相差不大，说明菌种在冻干后菌种性状稳定，无退化现象。

Claims

1.一种肺炎链球菌冻干保护剂，其特征在于所述冻干保护剂由浓度10wt%脱脂奶粉、浓度5wt%蔗糖、浓度1.5wt%脱纤维羊血、浓度2wt%甘油、浓度1wt%山梨醇、浓度0.5wt%谷氨酸钠、浓度5wt%海藻糖、浓度0.1wt%维生素C、浓度1wt%甘露醇组成。