CN115747071A

CN115747071A - 一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法

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Publication number: CN115747071A
Application number: CN202211549228.7A
Authority: CN
Inventors: 于永翔; 张正; 王印庚; 刘定远; 王春元; 廖梅杰; 荣小军; 李彬
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明提供了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法，属于病原微生物菌种保藏技术领域。本发明提供的美人鱼发光杆菌冻干保护剂，包括如下组分：脱脂乳、脱纤维羊血、海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮。本发明通过对冻干保护剂配比、制备方法和对病原菌冷冻干燥方法进行优化，实现了对美人鱼发光杆菌的长期保藏，最大限度减少了菌体在冻干和复苏过程中的死亡率，并可保持强致病性美人鱼发光杆菌的溶血性能稳定不变，为深远海养殖鱼类临床分离菌株的保藏提供了新的途径。

Description

一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明涉及病原微生物菌种保藏技术领域，尤其涉及一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法。

背景技术

作为当下最有效的微生物资源长期稳定保藏技术，真空冷冻干燥技术在多种微生物种质资源保藏中得以广泛应用。但由于不同微生物的生理代谢需求、生境条件、遗传稳定性等方面存在较大差异，针对不同类别和具有典型功能特性的微生物的冻干保存方法也不尽相同。同时，细菌在冻干过程中所经历的冷冻和干燥过程均会对细菌菌体产生较大的胁迫作用和结构损伤，冻干技术不当将导致细胞膜破裂、细胞质外流、质粒丢失、染色质断裂等现象的发生，进而引起细胞生理代谢和遗传信息的改变，甚至导致细胞死亡。

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)又称美人鱼弧菌(Vibrio damsela)，隶属于弧菌科，是美人鱼发光杆菌仅有的两个亚种之一。自Love等首次在美国加利福尼亚州患病斑鳍光鳃鱼(Chromispunctipinnis)皮肤病灶分离并鉴定以来，在美国、欧洲、日本、韩国等地区均有关于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种可致海水动物(包括鲸豚类等海洋哺乳动物)患病的报道，并逐渐成为该地区海水养殖常见病原菌(Sharma et al.,2017)。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染引发的水生动物疾病表现为体表溃烂严重、传染速度快、死亡率高、难治愈等特点。此外，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种可感染引发人类患病，病症主要包括流脓、败血症、肌膜炎等，发病后患者通常表现为体表溃烂或脓毒症，甚至危及生命安全(Yamane et al.,2004)。

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种通过表达一系列的毒力因子实现对宿主的感染和在宿主内存活。Rivas等在2011年首次报道了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种重要毒性质粒pPHDD1上的溶血素基因Damselysin(Dly)和Phobalysin P(PhlyP或HlyApl)(Rivas etal.,2011)。目前，已系统研究和报道的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种毒力因子包括pPHDD1质粒编码的Dly、HlyApl和染色质编码的PhlyC(或HlyAch)和phospholipase(PlpV)(Rivas etal.,2015；Vences et al.,2017)。中国水产科学研究院黄海水产研究所对具有时空差异的多株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种比较分析表明，鱼类强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株均含有毒性质粒，毒力基因分型为dly-hlyApl-hlyAch-plpV(刘潇等，2021)。且不同毒力基因型的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及其胞外产物对鱼类的致死率与毒力基因型呈正相关性(李永杰等，2022)。揭示了强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的致病性是由质粒介导的毒力基因表达与胞外产物分泌的协同作用。

由于细菌质粒具有转导特性和遗传不稳定属性，为后续持续进行美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的生物学、病原学和致病机理等方面的研究，对含有毒性质粒的强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行长期有效的保藏尤为迫切。因此，如何提供一种可以长期有效的保藏强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法。本发明通过对冻干保护剂配比、制备方法和对病原菌冷冻干燥方法进行优化，实现了对美人鱼发光杆菌的长期保藏，最大限度减少了菌体在冻干和复苏过程中的死亡率，并可保持强致病性美人鱼发光杆菌的溶血性能稳定不变，为深远海养殖鱼类临床分离菌株的保藏提供了新的途径。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂，包括如下组分：脱脂乳、脱纤维羊血、海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮。

优选的，以水为溶剂，包括如下浓度的组分：脱脂乳40～80g/L，脱纤维羊血10～40mL/L、海藻糖30～75g/L，乳糖25～60g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L。

本发明还提供了一种上述冻干保护剂的制备方法，将海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮溶解后灭菌，得到溶液A；将脱脂乳溶解后灭菌，过滤，得到溶液B；将所述溶液A、溶液B与脱纤维羊血混合后，得到所述冻干保护剂。

优选的，所述过滤采用微孔滤膜进行，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.3μm。

本发明还提供了一种上述冻干保护剂的使用方法，将细菌悬液与上述冻干保护剂或上述制备方法制备的冻干保护剂混合后，经冷冻、冻干、密封。

优选的，所述细菌悬液的浓度为10⁸～10¹⁰CFU/mL；所述细菌悬液与所述冻干保护剂的体积比为1：1～2。

优选的，所述冷冻的温度为-80～-60℃，时间为4～8h。

优选的，所述冻干的温度为-45℃～-25℃；真空度为0.1～0.4mbar，时间为20～24h。

优选的，所述密封是通过充入干燥二氧化碳，当气压达到0.09MPa时进行密封。

本发明提供了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法。本发明通过对冻干保护剂配比、制备方法和对病原菌冷冻干燥方法进行优化，实现了对美人鱼发光杆菌的长期保藏，最大限度减少了菌体在冻干和复苏过程中的死亡率，美人鱼发光杆菌冻干保存一年的存活率可高达59.1％，平均存活率可达50.8％，提高了对深远海养殖鱼类临床分离菌株的冻干复苏率。

本发明采用向冻干舱内充入高纯度干燥二氧化碳至常压后再进行密封，避免真空封时内外压力差导致的空气泄漏，同时在干燥二氧化碳的保护下，使得冻干菌粉的保藏时间更长，也防止因空气进入而导致的氧化变性。通过本发明的冻干保护剂搭配冷冻干燥方法，可保持强致病性美人鱼发光杆菌的致病性能稳定不变，为深远海养殖鱼类临床分离菌株的保藏提供了新的途径。

附图说明

图1为试验例1制备的美人鱼发光杆菌冻干菌粉外观图；

图2为试验例1中添加了冻干保护剂的美人鱼发光杆菌Pdd1605和Pdd0909冻干前后的溶血情况；

图3为试验例2制备的临床分离美人鱼发光杆菌冻干菌粉外观图；

图4为试验例2中添加了冻干保护剂的临床分离美人鱼发光杆菌冻干前后的溶血情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例制备了一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂，以水为溶剂，包括如下浓度的组分：脱脂乳80g/L、脱纤维羊血20mL/L、海藻糖50g/L、乳糖40g/L、聚乙烯吡咯烷酮20g/L。

具体制备过程如下：

分别称取5g海藻糖、4g乳糖和2g聚乙烯吡咯烷酮溶解于40mL无菌蒸馏水中，充分震荡溶解后置于106℃条件下灭菌30min，自然冷却后配置成溶液A。称取脱脂乳8g溶解于58mL无菌蒸馏水中，充分震荡至完全溶解，并经0.22μm滤膜过滤后配制成溶液B。在无菌条件下将溶液A和溶液B进行混合，并加入2mL脱纤维羊血，充分震荡至混合均匀，得到强致病性美人鱼发光杆菌冻干保护剂。

实施例2

本实施例制备了一种强致病性美人鱼发光杆菌冻干保护剂，以水为溶剂，包括如下浓度的组分：脱脂乳60g/L、脱纤维羊血30mL/L、海藻糖40g/L、乳糖40g/L、聚乙烯吡咯烷酮20g/L。

具体制备过程如下：

分别称取4g海藻糖、4g乳糖和2g聚乙烯吡咯烷酮溶解于40mL无菌蒸馏水中，充分震荡溶解后置于106℃条件下灭菌30min，自然冷却后配置成溶液A。称取脱脂乳6g溶解于58mL无菌蒸馏水中，充分震荡至完全溶解，并经0.22μm滤膜过滤后配制成溶液B。在无菌条件下将溶液A和溶液B进行混合，并加入3mL脱纤维羊血，充分震荡至混合均匀，得到强致病性美人鱼发光杆菌冻干保护剂。

试验例1

本试验例验证了实施例1制备的冻干保护剂对美人鱼发光杆菌的保护作用，具体操作如下：

本试验例中所用到的强致病性美人鱼发光杆菌为美人鱼亚种菌株Pdd1605和无致病性美人鱼发光杆菌为美人鱼亚种菌株Pdd0909。

将美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Pdd1605和Pdd0909菌株分别接种于TSB琼脂平板上进行活化培养，并挑取单菌落进行传代2次，进一步通过PCR对菌株的16s rDNA和ureC基因鉴定分析，确保菌株活化和传代过程中菌株没有污染。经鉴定正确的菌株接种于100mL液体TSB培养基内，28℃震荡培养，待细菌增殖液的OD₆₀₀＝1.0时，于4℃条件下以12000rpm离心5min，收集菌体，并用4℃预冷的无菌PBS洗涤3次后重悬，制备成浓度分别为1.52×10⁹CFU/mL的Pdd1605细菌悬液和8.2×10⁸CFU/mL的Pdd0909的细菌悬液。

在无菌条件下将Pdd1605细菌悬液和Pdd0909细菌悬液分别与实施例1制备的冻干保护剂按体积比1:1进行混合，震荡均匀后分装于西林瓶中，每瓶分装混合菌液1.5mL，同步准备一份不添加冻干保护剂的空白对照1和空白对照2(空白对照1：Pdd1605细菌悬液与无菌PBS按体积比1:1进行混合后分装；空白对照2：Pdd0909细菌悬液与无菌PBS按体积比1:1进行混合后分装)，在瓶口放置无菌乳胶盖，随后将其一并置于-80℃超低温冰箱内冷冻6h，直至冷冻彻底。将真空冷冻干燥机提前预冷20min，预冷完成后将冷冻完成的西林瓶迅速转入冻干舱内，在0.2mbar、-36℃条件下冻干24h。冻干程序完成后关闭真空泵，并向冻干舱内充入干燥二氧化碳至内部气压为0.09MPa时进行压盖密封。添加了实施例1冻干保护剂的美人鱼发光杆菌冻干菌粉外观如图1所示。将密封后的冻干菌粉于4℃避光条件下进行长期存储。

在冻干完成后的第0天、120天、240天和360天对保存的冻干菌粉质量进行检测。每个菌种和空白对照随机挑选3个西林瓶，在无菌条件下打开密封盖并向内部加入1.5mL无菌TSB溶液，充分震荡至菌粉完全溶解。吸取复壮的细菌悬液100μL加入1.5％无菌氯化钠溶液中并进行10倍梯度稀释，随后涂布于TSB琼脂培养基上进行活菌计数，计算美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Pdd1605和Pdd0909的冻干存活率，结果如表1所示。

表1添加了冻干保护剂的美人鱼发光杆菌冻干菌粉复壮后存活率统计结果

从表1可以看出，本发明制备的美人鱼发光杆菌冻干菌粉在360天内的平均存活率均高于47.2％，对美人鱼发光杆菌菌种的长期保存效果明显。而空白对照1和2中，未添加冻干保护剂的美人鱼发光杆菌冻干菌粉，复壮后的菌种存活率均小于1％，不符合长期存储要求。

将添加了冻干保护剂的美人鱼发光杆菌冻干菌粉Pdd1605和Pdd0909复壮后，置于32℃、180rpm条件下震荡培养1h，随后涂布于含有2％(v/v)脱纤维羊血的TSB平板上，28℃培养12h，观察细菌单菌落溶血情况。冻干完成后第360天的菌种溶血情况如图2所示。从图2可以看出，复苏的强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Pdd1605菌株血平板颜色由血红色变浅形成了明显的透明圈，复苏的无致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd0909菌株血平板颜色无明显变化，均与冻干前菌株溶血能力无差异变化，说明本方法对质粒介导的强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌种的长期存储稳定性好，有效保存了菌种的致病力。

试验例2

本试验例验证了实施例2制备的冻干保护剂对临床分离的强致病性美人鱼发光杆菌的保护作用，具体操作如下：

2020年07月，山东省烟台市长岛某网箱养殖许氏平鲉发生败血性皮肤溃疡症，从患病网箱内挑选发病症状明显的许氏平鲉病鱼低温充氧打包带回实验室。在超净工作台内用无菌刀片刮取3～5条患病鱼体溃疡处肌肉，加入1mL无菌1.5％氯化钠溶液，用一次性无菌研磨棒进行低温研磨，随后吸取研磨液涂布于培养基上进行细菌分离。由于强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种具有强溶血性的代谢属性，培养基选用添加5％脱纤维羊血的TSB琼脂培养基。将涂布好的培养基置于28℃条件下培养16h后，挑取具有溶血特性的细菌单菌落，并转接至新的含5％脱纤维绵羊血的TSB琼脂培养基上进行传代培养。对具有强溶血表型的细菌分别进行16s rDNA、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异鉴别基因ureC和强致病性毒力标识基因Dly的序列比对分析，获得一株具有强溶血表型的细菌分离株为一株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种。

挑取纯化培养后的该株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种单菌落接种于液体TSB培养基内，28℃震荡培养20h，离心收集菌体，并用无菌PBS洗涤后重悬制备成细菌悬液，测定菌液浓度为2.3×10⁹CFU/mL，备用。

在无菌条件下将细菌悬液与冻干保护剂按体积比1:1进行混合，震荡均匀后分装于西林瓶中，每瓶分装混合菌液1mL并在瓶口放置无菌乳胶盖，同步准备一份不添加冻干保护剂的空白对照(细菌悬液与无菌PBS按体积比1:1进行混合后分装)，随后将其一并置于-80℃超低温冰箱内冷冻5h，直至含菌混合液冷冻彻底。将真空冷冻干燥机提前预冷20min，预冷完成后将冷冻完成的西林瓶迅速转入冻干舱内，在真空度为0.2mbar条件下冻干24h。冻干程序完成后关闭真空泵，并向冻干舱内充入干燥二氧化碳至内部气压为0.09MPa时进行压盖密封。添加了冻干保护剂的美人鱼发光杆菌冻干菌粉如图3所示。将密封后的冻干菌粉存储于4℃避光条件下进行长期存储。

在冻干完成后的第0天、120天、240天和360天对保存的冻干菌粉质量进行检测。从添加了冻干保护剂的美人鱼发光杆菌冻干菌粉与未添加冻干保护剂的空白对照中，随机挑选3个西林瓶，在无菌条件下打开密封盖并向内部加入1mL无菌TSB溶液，充分震荡至菌粉完全溶解。吸取复壮的细菌悬液100μL加入1.5％无菌氯化钠溶液中进行梯度稀释，并涂布于TSB琼脂培养基上进行活菌计数，计算该美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的冻干存活率，结果如表2所示。

表2添加了冻干保护剂的临床分离美人鱼发光杆菌冻干菌粉复壮后存活率统计结果

从表2可以看出，本发明制备的临床分离美人鱼发光杆菌冻干菌粉在360天内的平均存活率均高于48.3％。而空白对照中未添加冻干保护剂的临床分离美人鱼发光杆菌冻干菌粉，复壮后的菌种存活率均小于1％，不符合长期存储要求。

将添加了冻干保护剂的临床分离美人鱼发光杆菌冻干菌粉复壮后，置于28℃、180rpm条件下震荡培养2h，随后涂布于含有2％(v/v)脱纤维羊血的TSB平板上，28℃培养过夜，观察细菌单菌落溶血情况，冻干完成后第360天的菌种溶血情况如图4所示。从图4可以看出，复壮菌株溶血效果明显，说明本方法对临床分离的强致病性菌株的保护效果也十分显著，可长期稳定保存临床分离的强致病性美人鱼发光杆菌菌株的致病性能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种美人鱼发光杆菌冻干保护剂，其特征在于，包括如下组分：脱脂乳、脱纤维羊血、海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，以水为溶剂，包括如下浓度的组分：脱脂乳40～80g/L，脱纤维羊血10～40mL/L、海藻糖30～75g/L，乳糖25～60g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L。

3.一种权利要求1或2所述的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，将海藻糖、乳糖和聚乙烯吡咯烷酮溶解后灭菌，得到溶液A；将脱脂乳溶解后灭菌，过滤，得到溶液B；将所述溶液A、溶液B与脱纤维羊血混合后，得到所述冻干保护剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述过滤采用微孔滤膜进行，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.3μm。

5.一种权利要求1或2所述的冻干保护剂或权利要求3或4任一项制备的冻干保护剂的使用方法，其特征在于，将细菌悬液与权利要求1或2所述的冻干保护剂或权利要求3或4任一项制备的冻干保护剂混合后，经冷冻、冻干、密封。

6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述细菌悬液的浓度为10⁸～10¹⁰CFU/mL；所述细菌悬液与所述冻干保护剂的体积比为1：1～2。

7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述冷冻的温度为-80～-60℃，时间为4～8h。

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述冻干的温度为-45℃～-25℃；真空度为0.1～0.4mbar，时间为20～24h。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述密封是通过充入干燥二氧化碳，当气压达到0.09MPa时进行密封。